Validasi Metode Spektrofotometri pada Uji Kadar Sediaan ...Secure Site...
Transcript of Validasi Metode Spektrofotometri pada Uji Kadar Sediaan ...Secure Site...
JSV 31 (2), Desember 2013 .JURNALSAINVETERINER
ISSN : 0126 - 0421
Validasi Metode Spektrofotometri pada Uji Kadar SediaanInjeksi Obat Hewan Enrofloksasin
Validation of the Spectrophotometry method on the concentration assessment ofEnrofloxacine as the animal drug
Ambarwati" Novida AriyaDil daD Maria Fatima Palupi'
I Balai Besar Pengujian Mutu dan Sertifikasi Obat Hewan, Gunungsindur Bogor 16340Email: [email protected]
Abstract
Validation for analysis of enrofloxacin injection method using spectrophotometry has been conducted.Enrofloksasin in a solution ofNaOH (sodium hydroxide) 0.1 N, measured at the maximum wavelength (A)271nm. The parameters of validation that were carried out are precision, accuracy, linearity, limit of detection andlimit of quantitation. Precision showed good results with coefficien variation (CV) results smaller than that ofCV Horwitz. Accuracy parameters calculated by the method of analysis to determine levels of analyte in a knownactive ingredient purity and yielded 0.449%. Linearity parameters showed good results with r = 0.9996. Limit ofdetection value was obtained for 0.757 flg / mL and limit of quantification of 2.522 flg / mL. The results ofvalidation test of enrofloxacin injection analysis using spectrophotometric method can be used as a good methodto provide a valid test of quality assurance veterinary drugs.
Key words: validation, enrofloxacin, spectrophotometry, precision, accuracy
Abstrak
Telahdilakukanvalidasi terhadap metode uji kadar obat hewan enrofloksasin dalam bentuk sediaan injeksi,digunakan metode spektrofotometri. Enrofloksasin dalam larutan NaOH (natrium hidroksida) 0,1 N, diukurpada panjang gelombang maksimum (A)271nm. Parameter validasiyang digunakan antara lain: presisi, akurasi,linearitas, batas deteksi dan batas kuantitasi. Parameter presisi menunjukkan hasil yang baik, dengan nilaikoefisien variasi (CV) hasil uji lebih kecil daripada CV Horwitz. Parameter akurasi dihitung dengan metodeanalisis untuk menetapkan kadar analit dalam bahan aktifyang diketahui kemumiannya dan memberikan hasil0,449 %. Parameter linearitas menunjukkanhasil yang baik dengan nilai r = 0,9996.Nilai batas deteksi diperolehsebesar 0,757 flg/mL dan nilai batas kuantitasi sebesar 2,522 flg/mL. Hasil validasi uji kadar enrofloksasinbentuk sediaan injeksi dengan metode spektrofotometri memberikan hasi1 yang dapat diterima dan dapatdigunakan sebagai metodeyang valid untuk menjamin mutu hasiluji obat hewan.
Kata kUDCi:validasi, enrofloksasin, spektrofotometri, presisi, akurasi
266
-- - ---- -- ---
Ambarwati et al.
Pendahuluan
Salah satu misi, tugas dan fungsi Balai Besar
Pengujian Mutu dan Sertifikasi Obat Hewan
(BBPMSOH) dalam SK Menteri Pertanian No.
628/Kpts/OT.140/12/2003 adalah melaksanakan
pengembangan tehnik dan metoda pengujian mutu
obat hewan. Balai Besar Pengujian Mutu dan
SertifikasiObat Hewan, selaku laboratoriumpenguji
harus melakukan validasi terhadap metode baku
yang dimodifikasi, dengan berpedoman pada ISO
SNI/IEC 17025:2008.
Menurut ISO IEC 17025:2008,validasi adalah
konfirmasi melalui pengujian dan penyediaan bukti
obyektif bahwa persyaratan tertentu untuk suatu
maksud terpenuhi (Hadi, 2007). Salah satu jenis
validasi adalah validasi metode analisis/pengujian
(Aswad dkk., 2011). Metode pengujian ialah
prosedur tertentu untuk melaksanakan pengujian.
Validasi metode pengujian adalah suatu tindakan
penilaian terhadap parameter tertentu, berdasarkan
percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa
parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk
penggunaannya (Harmita, 2004). Parameter unjuk
kerja pengujian antara lain adalah presisi
(keseksamaanlrepitabilitas), akurasi (kecermatan)
(Shelke dkk., 2009), spesifisitas (selektifitas), batas
deteksi, batas kuantitasi, rentang linearitas, kekuatan
(robustness) dan ketangguhan (rudgedness) (Hadi,
2007; Harmita, 2004). Pemilihan parameter yang
akan diuji tergantung dari jenis dan metode
pengujian yang akan divalidasi.
Penggunaan metode yang valid memegang
peranan yang penting guna mendapatkan data yang
valid dari suatu laboratorium, di samping pengujian
dilakukan oleh personel yang kompeten, dengan
267
instrumentasi yang telah terkalibrasi serta sumber
daya laboratorium yang mendukung. Tujuan
memvalidasi metode adalah untuk mengetahui
sejauh mana penyimpangan metode tidak dapat
dihindari pada kondisi normal, dengan seluruh
elemen terkait telah terlaksana dengan baik dan
benar (Hadi, 2007).
Validasi metode sangat diperlukan oleh
laboratorium, karena dapat mengetahui tingkat
kepercayaan yang dihasilkan dari suatu metode
pengujian (Hadi, 2007). Hasil validasi metode
analisis dapat digunakan sebagai bahan acuan untuk
menentukan apakah metode terse but dapat
digunakan untuk pengujian mutu secara rutin atau
tidak. Validasi ulang perlu dilakukan meskipun
validasi sebelumnya menghasilkan data yang sesuai
dengan kriteria penerimaan, karena metode yang
dinyatakan valid pada kondisi tertentu belum pasti
valid pada kondisi lain dikarenakan perbedaan
peralatan dan pereaksi yang digunakan, analis yang
mengerjakan, waktu dan sebagainya (Oktavia,
2006). Selain itu, validasi metode merupakan salah
satu bentuk jaminan mutu hasil kepada pelanggan,
dengan metode yang digunakan telah terbukti baik,
maka hasil yang dikeluarkan oleh BBPMSOH
adalah valid.
Enrofloksasin merupakan fluorokuinolon
pertama yang diperkenalkan dan digunakan sebagai
obat hewan (Zahid dan Isnindar, 2013).
Kemoterapeutika ini adalah senyawa quinolon
pertama yang digunakan dalam veteriner, yang
mempunyai aktivitas antibakterisidal dan
berspektrum antimikrobial luas terhadap
mikroorganisme Gram positif dan Gram negatif
(Dimitrova dkk., 2006) serta aktif baik pada fase
diam maupun fase pertumbuhan dari replikasi
bakteri dengan absorbsi yang lebih baik dan dapat
mencapai jaringan lebih cepat (Zahid dan Isnindar,
2013).
Enrofloksasin secara kimia dikenal sebagai 3-
kuinolin asam karboksilat, l-siklopropil- 7-(4-etil-l-
piperazinil)-6- fluoro-1 ,4-dihidro-4-okso, dengan
rumus empiris C9H22FN303dan berat molekul dari
359,4 g/mol (Gambar I). Serbuk kristal berbentuk
jarum berwama putih atau agak kuning, tidak berbau
dan berasa dan tersedia dalam garam hidroklorida,
laktat dan sodium. Enrofloksasin sangat larut dalam
as am at au bas a media, larut dalam
dimetilformamida, sedikit larut dalam kloroform,
metanol dan tidak larut dalam air (Zahid dan
Isnindar,2013).
o 0
...0F
Nl
~N1CH]
Gambar 1. Struktur kimia enrofloksasin
Enrofloksasin memiliki aktivitas antibakteri
berspektrum luas terhadap bakteri Gram negatif dan
Gram positif dan aktif baik pada fase diam maupun
pertumbuhan dari replikasi bakteri. Enrofloksasin
tidak membentuk ikatan komplek dengan protein
plasma, sehingga memungkinkan metabolit secara
bebas melewati membran plasma (Mitchell, 2006).
Enrofloksasin merupakan antimikrobia yang
cukup luas dikenal di dunia veteriner. Jumlah obat
hewan yang mengandung enrofloksasin dan telah
terdaftar di Indonesia terus meningkat dari 62
produk enrofloksasin pada tahun 2009 menjadi 73
produk enrofloksasin pada tahun 2012 (Anonim,
- --
Validasi Metode Spektrofotometri pada Uji Kadar Sediaan Injeksi Obat
2012). Peningkatan jumlah sampel yang cukup
signifikan dan pentingnya memberikan jaminan
mutu hasil pengujian obat hewan dengan hasil uji
yang valid maka perlu dilakukan validasi terhadap
metode pengujian. Penelitian ini bertujuan untuk
memvalidasi metode analisis kadar enrofloksasin
sediaan injeksi menggunakan spektrofotometer
dengan cara melakukan dan menguraikan tehnik
validasi metode analisis.
Materi dan Metode
Bahan yang disiapkan yaitu sampel obat hewan
injeksi yang mengandung enrofloksasin, natrium
hidroksida/N aOH (Merck) dan standar
enrofloksasin (Sigma-Fluka). Alat yang dipakai
dalam pengujian adalah sebagai berikut: neraca
digital (Libror), magnetic stirrer, vortex mixer
(Iuchi), labu ukur 50 mL, 100 mL, 1000 mL (Scott-
Duran), pipet volumetrik (Pyrex-Iwaki-A), kuvet
dan spektrofotometer UV-Vis double beam
(Shimadzu).
Uji Presisi
Sejumlah sampel setara dengan 50-100 mg
enrofloksasin dipipet dan dimasukkan ke dalam labu
ukur 50 mL dan diencerkan dengan pelarut NaOH
0,1 N. Pengenceran bertingkat dibuat menggunakan
pelarut NaOH 0,1 N sehingga diperoleh konsentrasi
akhir 10 ~g/mL (Anonim, 2009).
Standar enrofloksasin ditimbang dengan tepat
10 mg, kemudian dibuat pengenceran bertingkat
digunakan pelarut NaOH 0,1 N sehingga diperoleh
konsentrasi akhir 10 ~g!mL. Absorbansi sampel
diukur dengan spektrofotometer UV/Vis pada
268
-- - - -
-- --- ----
Ambarwati et at.
panjang gelombang maksimum 271 nm (Anonim,
2009).
Kadar yang didapat dari sampel dihitung dan
pengujian sampel di atas diulang sebanyak 7 kali,
kemudian dihitung koefisien variasi (CV) (BPOM,
2009; Harmita, 2004). Rumus untuk menghitung
persentase kadar enrofloksasin adalah sebagai
berikut (Rumus 1):
Aspl CsXXd-x x 100%Astd Cspl
AsplAstdCstdCspl
=absorbansi sampel= absorbansi standar= konsentrasi standar= konsentrasi sampel
Nilai CV diperoleh dengan menghitung standar
deviasi (SD) dan relatif standar deviasi (RSD)
dengan rumus sebagai berikut (Rumus 2)
(Kantasubrata,2011):
SD =
SDRSD =
x
CV = RSD x 100 %
n =jumlah pengulanganx = kadar enrofloksasinpengujian ke-xx' = reratakadar enrofloksasin
Nilai CV hitung ini, kemudian dibandingkan
dengan CV Horwitz (Rumus 3) (Kantasubrata,
2011):
269
CV Horwitz (%) = t-O.510gC
CV hitung (%) < ; xCV Horwitz
C = konsentasi analit saat diukur
UjiAkurasi
Penghitungan untuk kerja akurasi
digunakan metode analisis dalam menetapkan kadar
analit dalam bahan aktif yang diketahui
kemumiannya (BPOM, 2009). Sejumlah 10 mg
standar enrofloksasin ditimbang dan dilakukan
pengenceran hingga diperoleh konsentrasi akhir 10
)lg/mL. Absorbansi larutan terse but diukur
menggunakan spektrofotometer UV/Vis pada
panjang gelombang maksimum 271 nm. Penetapan
kadar seperti di atas diulang sebanyak 7 kali (Hadi,
2007). Nilai perolehan kembali dihitung dengan
rumus (Rumus4) (Kantasubrata,2011):
1 nilai benar - n nilai hitung 1Akurasi (%)= x 100%
nilai benar
Uji Linearitas
Sejumlah 10 mg standar enrofIoksasin
ditimbang dan dibuat pengenceran bertingkat pada 5
konsentrasi (BPOM, 2009) digunakan NaOH 0,1 N
sehingga didapatkan konsentrasi 1,25; 2,5; 5,0; 10
dan 20 )lg/mL.Absorbansi tiap konsentrasi tersebut
diukur menggunakan spektrofotometer UVNis
pada panjang gelombang 271 nm dan nilai koefisien
korelasi (r) dihitung. Nilai r didapat dari analisis
regresl linier dengan (Rumus 5) (Kantasubrata,
2011):y = bx + a
a = intersepb = slopex = absprbansi
HasH dan Pembahasan
Uji Presisi
Keseksarnaan (presisi) rnerupakan ukuran
yang rnenunjukkan derajat kesesuaian antara hasil
uji individual, diukur rnelalui sebaran hasil
individual dari reratajika prosedur diterapkan secara
berulang-ulang pada sarnpel yang diarnbil dari
carnpuran yang hornogen (Harrnita, 2004).
Pengujian presisi dilakukan dengan cara
keterulangan yang dilaksanakan oleh penguji yang
sarna. Hasil pengujian kadar enrofloksasin
rnenggunakan spektrofotorneter UVNis adalah
sebagai berikut: Nilai CV pengujian ini adalah 0,934
%, sedangkan CV Horwitz yang terhitung adalah
11,314 %. CV hasil pengujian dengan rnetode ini
Validasi Metode Spektrofotometri pada Uji Kadar Sediaan Injeksi Obat
lebih kecil daripada CV Horwitz. Menurut Harmita
(2004), suatu rnetode pengujian dikatakan seksarna
jika rnetode rnernberikan simpangan baku relatif
(RSD) atau CV 2 % atau kurang. Sedangkanrnenurut
Kantasubrata (2011), persyaratan repitabilitas
adalah baikjika nilai CVhitung lebih kecil atau sarna
dengan CV Horwitz, sehingga dapat dikatakan
bahwa rnetode uji enrofloksasin rnenggunakan
spektrofotornetri ini rnernpunyai presisi yang baik
(Tabell dan 2).
UjiAkurasi
Nilai akurasi dihitung rnelalui penetapan
kadar standar untuk rnenernukan perolehan kernbali
terhadap nilai kadar standar sebenamya.
Tabel 1. Hasil Uji Kadar Enrofloksasin dengan Spektrofotorneter
Pengulanganke:
1234567
RerataSD
RSD
Kadar Enrofloksasin(%)
102,64102,50102,24103,96104,75103,96102,64
103,240,965
9,345 x 10-3
Tabel 2. Nilai Perolehan Kembali Standar Enrofloksasin
Pengulanganke:
1234567
RerataSD
CV (%)
Kadar Enrofloksasin (%)
100,7798,6998,99100,6898,099100,0898,79
99,441,0571,063
270
- -- - -- - ----- - - - - --
--------
Ambarwati et al.
Akurasi penghitungan kadar enrofloksasin di
atas adalah 0,449 %. Semakin kecil nilai akurasi,
maka semakin mendekati nilai kebenaran suatu zat
(semakin akurat) (Kantasubrata, 2011). Sedangkan,
menurut Harmita (2004), selisih kadar pada berbagai
penentuan harus 5 % atau kurang pada setiap
konsentrasi anal it dengan prosedur yang dilakukan.
Oleh sebab itu, metode ini memiliki akurasi yang
baik.
Uji Linearitas
Linearitas merupakan kemampuan metode
Tabel 3. HasH Absorbansi untuk Uji Linearitas
untuk mendatangkan hasil uji yang secara langsung
sebanding dengan konsentrasi analit dalam suatu
rentang kerja yang diberikan (Harmita, 2004). HasH
absorbansi pada uji linearitas terdapat dalam Tabel3,
Gambar 2.
Dari data Tabel 3. Nilai r yang didapatkan
adalah 0,9996, sedangkan syarat suatu metode uji
mempunyai linearitas yang baik jika nilai r lebih
besar 0,98 (BPOM, 2009). Hal ini membuktikan
bahwa metode uji enrofloksasin dengan metode
spektrofotometrimempunyai linearitas yang baik.
Std Enrofloksasin(~g/mL)0,001,252,505,0010,0020,00
IntersepSlope
R
Absorbansi
0,0000,1180,2350,4910,9891,872
0,009860,094080,9996
10 20
kons8ntrasl
y = O,094lx + 0.0097RJ= 0.9991
~kurvastandar enro
-Linear (kurvastandar enro)
30
Gambar 2. Kurva kalibrasi larutan standar enrofloksasin
271
2.0
.- 1.541'
'iof 1.05t
it 0.5
0.0
0
Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi
Definisi batas deteksi menurut Rarmita (2004)
adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang
dapat dideteksi dan masih memberikan respon
signifikan dibandingkan dengan blanko.
Berdasarkan perhitungan, diperoleh batas deteksi
pada konsentrasi 0,757 flg/mL untuk pengujian
enrofloksasin dengan metode spektrofotometri. Ini
berarti bahwa enrofloksasin pada konsentrasi
tersebut masih dapat terbaca absorbansinya, namun
tidak dapat digunakan dalam perhitungan, karena
dapat membuat bias perhitungan.
Batas kuantitasi merupakan parameter pada
analisis renik dan diartikan sebagai kuantitas terkecil
analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi
kriteria cermat dan seksama. Nilai batas kuantitasi
pada pengujian ini sebesar 2,522 flg/mL.
Konsentrasi tersebut merupakan konsentrasi terkecil
yang tidak menimbulkan bias perhitungan.
Metode uji kadar obat hewan enrofloksasin
menggunakan spektrofotometer telah divalidasi
dengan presisi, akurasi dan linearitas yang baik.
Nilai batas deteksinya yaitu 0,757 flg/mL dan batas
kuantitasinya yaitu 2,522 flg/mL. Berdasarkan hasil
validasi ini, maka metode uji kadar enrofloksasin
bentuk sediaan injeksi dengan spektrofotometri
dapat digunakan sebagai metode uji yang baik,
karena mampu memberikan jaminan mutu hasil uji
yang valid.
Ucapan Terima Kasih
Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada
Emi Rusmiati yang telah membantu selama proses
pembuatan tulisan ini.
Validasi Metode Spektrofotometri pada Uji Kadar Sediaan Injeksi Obat
Daftar Pustaka
Anonim. (2009) Farmakope Obat Rewan Indonesia.Jilid II. Edisi IV. Direktorat Jenderal Petemakandan Kesehatan Rewan. Jakarta.
Anonim. (2012) Indeks Obat Rewan Indonesia.Edisi VII. Asosiasi Obat Rewan Indonesia.Jakarta. 56-58, 81-85,89-90, 132-135.
Aswad, M., Fatmawaty, A., Nursamsiar,Rahmawanti. (2011) Validasi MetodeSpektrofotometri Sinar Tampak untuk AnalisisFormalin dalam Tahu. Majalah Farmasi danFarmakologi. 15:26-29.
BPOM. (2009) Petunjuk Operasional PenerapanCara Pembuatan Obat yang Baik. BadanPengawas Obat dan Makanan RepublikIndonesia. 583-609.
Dimitrova, D.J., Lashev, L.D., Yaney, St.G.,Pandova, V.T. (2006) Pharmacokinetics ofEnrofloxacin and Its Metabolite Ciprofloxacinin Male and Female turkeys followingIntravenous and Oral Administration. V.Research Com. 30:415.
Radi, A. (2007) Pemahaman dan PenerapanISO/IEC 17025: Persyaratan UmumKompetensi Laboratorium Pengujian danLaboratorium Kalibrasi. PT. Gramedia PustakaUtama.259-274.
Rarmita. (2004) Petunjuk Pelaksanaan ValidasiMetode dan Cara Perhitungannya. MajalahIlmuKefarmasian.I: 117-135.
Kantasubrata, J.K. (2011) Pelatihan Validasi danVerifikasi Metode Pengujian. Disampaikandalam Pelatihan Validasidan Verifikasi.BadanStandardisasiNasional.
Mitchell, M. A. (2006) Enrofloxacin: TherapeuticReview..!.Exotic Pet. Med. 15:66-69.
Oktavia, E. (2006) Tehnik Validasi Metode AnalisisKadar Ketoprofen secara Kromatografi CairKinerja Tinggi. Buletin Tehnik Pertanian. 11:23 - 28.
272
---
Ambarwati et al.
Shelke, S., Dongre, S., Rathi, A., Dhamecha, D.,Maria, S., Dehghan, M.H.G. (2009) ResearchArticle: Development and Validation of UVSpectrophotometric Method of CefuroximeAxetil in Bulk and Phrmaceutical Formulation.AsianJ. Research Chern.2: 222-224.
273
Zahid, M. dan Isnindar. (2013) Ulasan Ilmiah:Penggunaan Antibiotik FluorokuinolonSebagai Obat Hewan. Buletin Pengujian MutuObatHewan 12:13-22.