US 7,354,576-Nov 19
-
Upload
blackbeetle63 -
Category
Documents
-
view
221 -
download
0
Transcript of US 7,354,576-Nov 19
8/10/2019 US 7,354,576-Nov 19
http://slidepdf.com/reader/full/us-7354576-nov-19 1/36
( 1 2 ) United S t a t e s
Patent
Kakkis
US007354576B2
US 7 , 3 5 4 , 5 7 6 B2
* A p r .
8 ,
2 0 0 8
( 1 0 )
Patent
N 0 . :
( 4 5 ) Date o f P a t e n t :
( 5 4 )
( 7 5 )
( 7 3 )
( 2 1 )
( 2 2 )
( 6 5 )
( 6 3 )
( 5 1 )
METHODS
OF
TREATING
DISEASES
CAUSED BY
DEFICIENCIES OF
RECOMBINANT X-L-IDURONIDASE
I n v e n t o r : Emil
D . K a k k i s , N o v a t o ,
CA U S )
A s s i g n e e :
B i o m a r i n P h a r m a c e u t i c a l I n c . ,
N o v a t o ,
CA
( U S )
N o t i c e : S u b j e c t t o a n y d i s c l a i m e r , t h e
t e r m
o f h i s
p a t e n t i s e x t e n d e d o r a d j u s t e d u n d e r 3 5
U . S . C . 1 5 4 ( b ) b y 2 6 9 d a y s .
T h i s p a t e n t
i s
s u b j e c t
t o
a t e r m i n a l
d i s
c l a i m e r .
A p p l .
N 0 . :
1 0 / 8 9 5 , 0 1 1
F i l e d : J u l . 2 0 , 2004
Prior P u b l i c a t i o n
Data
US 005/0281804 A1
D e c .
2 2 ,
2005
R e l a t e d US. A p p l i c a t i o n
Data
C o n t i n u a t i o n
o f a p p l i c a t i o n N o . 0 9 / 9 3 , 2 4 1 , ? l e d on
Nov.
1 3 , 2 0 0 1 , noW P a t . No. 6 , 8 5 8 , 2 0 6 , Which i s
a
c o n t i n u a t i o n - i n - p a r t o f
a p p l i c a t i o n N o .
0 9 / 7 1 1 , 2 0 5 ,
? l e d
o n Nov. 9 ,
2 0 0 0 ,
noW P a t .
No. 6 , 5 8 5 , 9 7 1 , Which
i s a c o n t i n u a t i o n - i n - p a r t
o f
a p p l i c a t i o n N o . 0 9 / 4 3 9 ,
9 2 3 , ? l e d
on
N o v . 1 2 , 1 9 9 9 , noW a t .
No.
6 , 4 2 6 , 2 0 8 .
I n t . C l .
A61K 8 / 4 7
( 2 0 0 6 . 0 1 )
C12N 1 5 / 5 6 ( 2 0 0 6 . 0 1 )
CIZN
9 / 2 4 ( 2 0 0 6 . 0 1 )
( 5 2 )
US.
l .
. . . . . . . . . . . . . . . . .
. . 424/94.61;
435/200;
536 / 2 3 2
(58) Field
of Classi?catio n
S e a r c h
. . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . 435/4,
4 3 5 / 6 , 6 9 . 1 ,
1 8 3 ,
2 0 0 , 2 5 2 4 3 , 3 2 0 . 1 ; 4 2 4 / 9 4 . 1 ,
4 2 4 / 9 4 . 6 1 , 9 4 3 ;
5 3 6 / 2 3 2
S e e
a p p l i c a t i o n ? l e
f o r c o m p l e t e
s e a r c h h i s t o r y .
( 5 6 )
R e f e r e n c e s C i t e d
U. . PATENT DOCUMENTS
6 , 5 8 5 , 9 7 1
B1*
7 / 2003
K a k k i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
424 / 9 4. 6 1
6 , 8 5 8 , 206
B2* 2 / 2005 K a k k i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
424/94.1
7 , 04 1 , 4 8 7
B2 5 / 2006 K a k k i s e t a 1 . . . . . . . . . . . . . . . 4 3 5 /2 0 1
2005/0048047 A1* 3 / 2005 Kakkis . . . . . . . . . . 4 2 4 / 9 4 . 6 1
2005/0260185 A1* 1 1 / 2 0 0 5
Kakkis . . . . . . . .
. . 4 2 4 / 9 4 . 6 1
2 0 0 6 / 0 2 8 6 0 8 7 A1* 1 2 /2 0 0 6 K a k k i s e t a 1 . . . . . . . . . . . . 424 / 9 4. 6 1
*
c i t e d by
examiner
P r i m a r y
E x a m i n e r i R e b e c c a P r o u t y
( 7 4 ) A t t o r n e y , A g e n t ,
o r
F
rmiMarshall
G e r s t e i n
&
orun
LLP
( 5 7 )
ABSTRACT
The p r e s e n t i n v e n t i o n p r o v i d e s
a
f o r m u l a t i o n c o m p r i s i n g
a
p h a r m a c e u t i c a l
c o m p o s i t i o n c o m p r i s i n g
a
human
r e c o m b i
nant o t - L - i d u r o n i d a s e o r b i o l o g i c al l y a c t i v e
o r
muteins
t h e r e o f
W i t h
a p u r i t y o f g r e a t e r t h a n 99%, o r i n c o m b i n a t i o n
W i t h a p h a r m a c e u t i c a l l y a c c e p t ab l e c a r r i e r . T h e
p r e s e n t
i n v e n t i o n
f u r t h e r
p r o v i d e s
m e t h o d s t o t r e a t c e r t a i n g e n e t i c
d i s o r d e r s
i n c l u d i n g
o t - L - i d u r o n i d a s e d e ? c i e n c y a n d m u c o
p o l y s a c c h a r i d o s i s
1 (MPS 1 ) b y a d m i n i s t e r i n g
s a i d
f o r m u
l a t i o n .
1 1
C l a i m s , 1 4
Drawing
S h e e t s
8/10/2019 US 7,354,576-Nov 19
http://slidepdf.com/reader/full/us-7354576-nov-19 3/36
U.S.
Patent A p r . 8 ,
2 0 0 8 S h e e t
2
o f 1 4 US , 3 5 4 , 5 7 6 B2
F I G .
7 - 2
1 2 0 0
1 2 1 0 1 2 2 0 1 2 3 0 1 2 4 0 1 2 5 0
1 2 6 0
* *
“ k
‘ k
‘ k
‘ k
‘ k
k ‘ k
‘ k ‘ k ‘ k
" k “ k
1 1 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0101001101
0 1 0 1 0 0 0 1 1 1 1
1 1 0 1 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 0 1 1 0 0 1
0 1 0 1 1 1 1 0 1 1 0 0 1
1000100001
1 2 7 0 1 2 8 0
1 2 9 0 1 3 0 0 1 3 1 0 1 3 2 0 1 3 3 0
*
1 1
~ 1 1 * ~ 1 1
~ 1 - 1 1 ~ 1 1 *
~ 1 1
~ 1 1
~ 1 1
~ 1 1
~ 1 1
0 0 1 0 0 1 1 0 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0
0010001001
0010000010
1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 1 0 1
1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0
1 3 1 1 0
1 3 5 0
1 3 0 0
1 3 7 0
1 3 8 0 1 3 9 0 1 1 1 0 0
*
' k
*
* i’
‘ k *
i
‘ k
* ‘ k
' k
‘k
*
0 0 1 1 0 0 1 1 1 0 1 1
1 1 0 0 0 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0
1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1
0 0 1 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 1
1410
1 1 1 2 0 1 4 3 0 1 4 4 0 1 1 1 5 0 1 4 0 0
1470
* ‘ k *
*
*
*
i1 *
‘ k *
*
‘ k
5 %
1 1 0 0 1 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0
0 1 1 0 0 1 1 0 0 1 1 1 0
0 1 0 0 1 0 1 1 0 1 1 1 1 0001011000
1 4 8 0
1 1 1 9 0 1 5 0 0 1 5 1 0 1 5 2 0 1 5 3 0
1 5 4 0
*
‘ k
* * ' k ‘ k ' k
‘ k
*
i’
‘ k
‘ k * 1
1 0 1 1 1 1 0 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0
1 5 5 0 1 5 0 0 1 5 7 0 1 5 8 0 1 5 9 0
* ‘ k ‘ k ‘ k ‘ k k
‘ k
‘ k ‘ k ‘ k
CCCGAGCACG
CGTGGCC ATG CGT C C C CTG CGC C C C C G C GCC GCG CTG CTG GCG CTC
CTG
Met
Arg Pro Leu
Arg
Pro
Arg
A l a
Ala Leu Leu A l
a
Leu
Leu
1 6 0 0 1610 1620
1 6 3 0 1 6 4 0
1 6 5 0
, 1 ~ 1 1 ~ 1 1 - 1 1
* *
1 1 ~ 1 1 ~ 1 1
*
~ 1 1 ~ 1 1
GCC
TCG
CTC
CTG GCC GCG ( I C C 000 GTG GCC CCG GCC GAG GCC CCG CAC CTG GTG CAT
A l a Ser Leu Leu
A l
a Ala Pro Pro V a l Ala Pro Ala Glu Ala Pro His Leu
V a l
His
1 6 6 0 1 6 7 0 1 6 8 0 1 6 9 0 1 7 0 0 1 7 1 0
*
*
~ k
*
* 1 1 '
i
‘ k
' k ‘ k *
GTG GAC GCG
GCC CGC
GCG
CTG
TGG CCC
CTG CGG
CGC TTC
TGG
AGG
AGC
ACA
GGC TTC
V a l
A s p
A l a
A l a
A r g A l a L e u
T r p
P r o L e u A r g A r g P h e
T r p
A r g
S e r
T h r
G l y
P h e
1 7 2 0 1 7 3 0 1 7 4 0 1 7 5 0 1 7 6 0 1 7 7 0
* i ‘ k i ‘ k ‘ k ‘ k * ‘ k t
T G C
CCC CCG
CTG CCA CAC AGC CAG GCT GAC CAG TAC GTC
CTC
AGC TGG
GAC
GAG CAG
C y s
Pro Pro Leu Pro H i s
Ser
G 1 1 Ala Asp
Gln
Tyr V a l
Leu
Ser
Trp Asp Gln
Gln
1780 1 7 9 0 1 8 0 0 1810 1 8 2 0
‘ k * ‘ k
i
* ‘ k
C T C
AAC C T C GCC TAT
GTG
GGC GCC GTC
CCT CAC
CGC GGC ATC
AAG CAG
GTC CGG ACC
L e u
A s n L e u A l a T y r
V a l
G l y A l a V a l P r o H i s A r g G l y
I l e
L y s G l n V a l A r g T h r
1 8 3 0 1 8 4 0
1 8 5 0 1 8 6 0 1 8 7 0
1 8 8 0
* ‘ k * i
* i - “ k *
*
* ~ k
C A C
T G G C T G C T G GAG C T T G T C ACC ACC AGG GGG TCC ACT
GGA
CGG G G C C T G AGC TAC
H i s
T r p
L e u
L e u G l
u L e u
V a l
T h r
T h r
A r g G l y
S e r T h r G l y
A r g
G l y L e u
S e r
T y r
1 8 9 0 1 9 0 0
1 9 1 0 1 9 2 0
1 9 3 0 1 9 4 0
,1
* 1 1
~ 1 1
= 1
~ 1 1
*
~ 1 1 ~ 1 1 ~ 1 1
~ 1 1
A A C T T C A C C
C A C CTG G A C G G G T A C C T G G A C C T T C T C AGG GAG AAC C A G
C T C
C T C CCA
A s n P h e T h r H i s L e u
A s p G l y
Tyr
L e u
Asp L e u
L e u
Arg G l
u
Asn Gln L e u L e u
P r o
1 9 5 0 1 9 6 0
1 9 7 0 1 9 8 0
1 9 9 0
,1
~ 1 1 ~ 1 1
11
~ 1 1 ~ 1 1
* k 1 1
6 6 6 T T T G A G CTG
ATG
G G C
AGC GCC TCG GGC
C A C TTC
ACT
GAC TTT GAG G A C A A G
CAG
G l y P h e G l
u L e u M e t G l y S e r A l a Ser Gly
H i s
P h e Thr Asp P h e
G l
u A s p L y s 0 1 n
8/10/2019 US 7,354,576-Nov 19
http://slidepdf.com/reader/full/us-7354576-nov-19 4/36
U.S.
Patent A p r . 8 ,
2 0 0 8
S h e e t 3
0 f 1 4 US , 3 5 4 , 5 7 6 B2
F I G .
1 - 3
2 0 0 0 2 0 1 0 2 0 2 0 2 0 3 0 2 0 4 0
2 0 5 0
*
ir
*
1 '
: 1 ’ *
1 : 1 ' k
*
‘ k
*
C A G
GTG TTT
G A G T G G A A G G A C T T G G T C
T C C
A G C C T G G C C
AGG AGA T A G
A T C
GGT AGG
G l n
V a l P h e G l u T r p
L y s
A s p
L e u V a l S e r
S e r L e u
A l a
A r g
A r g T y r I l e G l y A r g
2 0 6 0 2 0 7 0 2 0 8 0
2 0 9 0
2 1 0 0 2 1 1 0
‘ k
‘ J r
~ k
k t k i i’ i ‘ k
T A E GGA C T G G C G
C A T G T T T C C A A G T G G A A C
T T C
G A G
A C G T G G A A T GAG
CCA
GAC GAC
T y r
G l y
L e u A l a H i s V a l
S e r
L y s T r p A s n P h e G l u
T h r
T r p
A s n
G l u
P r o
A s p
H i s
2 1 2 0 2 1 3 0
2 1 4 0 2 1 5 0 2 1 6 0
, 1 * * * * * * * *
C A C
G A C T T T G A C A A C G T C T C C A T G A C C
A T G
C A A G G C
T T C
C T G A A C T A C T A C G A T G C C
H i s
A s p P h e A s p A s n
V a l
S e r M e t T h r M e t G l n G l y P h e L e u A s n
T y r
T y r A s p
A l a
2170 2180
2190
2200 2210
2220
i i
- A -
t * *
1 '
T G C TCG GAG GGT
C T G C G C GCC
G C C AGC C C C G C C
C T G
CGG
CTG GGA GGC CCC GGC GAC
C y s S e r G l u G l y L e u
A r g
A l a A l a
S e r
P r o A l a L e u
A r g
L e u G l y Gly P r o G l y A s p
2 2 3 0 2 2 4 0
2250
2 2 6 0
2270 2280
* * *
" k
T C C T T C C A C A C C C C A C C G
CGA
T C C C C G C T G AGC T G G GGC C T C C T G CGC C A C T G C CAC
S e r
P h e
H i s T h r
P r o
P r o A r g S e r P r o L e u S e r T r p G l y L e u L e u
A r g
H i s C y s H i s
2 2 9 0
2 3 0 0
2 3 1 0 2 3 2 0
2330 2340
* *
*
*
* * * *
* *
*
*
G A C G G T A C C A A C T T C T T C
ACT
G G G G A G G C G G G C GTG CGG CTG GAC TAC ATC T C C CTC
A s p G l y T h r A s n P h e P h e T h r G l y G l u A l a G l y
V a l
A r g L e u A s p Tyr
I l e
S e r L e u
2350 2360 2370 2380 2390
‘ k
~ k 1 :
it
C A C
AGG AAG GGT GCG CGC AGC TCC
ATC TCC
ATC CTG GAG
CAG
GAG AAG GTC GTC GCG
H i s A r g L y s Gly A l a A r g
Ser
Ser I l e Ser l l e L e u G l u Gln Glu L y s V a l V a l Ala
2400 2410 2420
2430 2440 2450
' k
‘ k
C A G C A G A T C C G G
CAG
C T C
TTC
C C C
AAG
T T C G C G
GAC
ACC
CCC
ATT TAC
AAC GAC
GAG
G l n
G 1
n l l e A r g G l n L e u
P h e
P r o L y s
P h e
A l a Asp Thr Pro
I l e
Tyr Asn Asp Glu
2 4 6 0 2 4 7 0 2 4 8 0
2490 2500 2510
* i ‘ k 1 r ‘ 1 '
‘ k
i ’ " k ‘ k * *
G C G G A C
C C G
C T G G T G G G C T G G T C C C T G C C A
C A G
CCG TGG AGG
G C G G A C G T G A C C
TAC
A l a
A s p P r o
L e u
V a l
G l y T r p S e r
L e u
P r o G l
n P r o
T r p A r g A l
a A s p V a l
T h r
T y r
2 5 2 0
2 5 3 0 2 5 4 0 2550 2560
~ * 1 *
* i 1 r 1 ' * 1 E
G C G G C C
A T G
G T G G T G A A G G T C A T C GCG C A G
C A T
C A G
AAC
C T G CTA CTG G C C A A C AC6
A l a
A l
a
M e t
V a l V a l
L y s
V a l
I l e
Ala G l
n H i s
Gln
Asn
Leu Leu Leu Ala Asn Thr
2 5 7 0
2580 2590 2600 2610 2620
* *
3 i ’
* *
‘ A ’ ‘ k
ACC
T C C G C C TTC
CCC
T A C GCG CTC CTG
AGC
A A C GAC
AAT
GCC
TTC CTG
AGC
TAC CAC
Thr
Ser A l a Phe
Pro
Tyr
A l a
Leu Leu Ser
Asn Asp
Asn
A l a Phe
Leu Ser
Tyr
His
2630 2640 2650 2660 2670 2680
* ir ‘ k * 1 : ‘ k * ‘ k * ‘ A * *
C C G . C A C
C C C
T T C GCG CAG CGC ACG CTC ACC G C G CGC TTC CAG GTC AAC AAC ACC CGC
P r o H i s P r o
Phe
Ala
G l n Arg
Thr
Leu Thr Ala
Arg
Phe G l
n
V a l Asn Asn Thr
Arg
8/10/2019 US 7,354,576-Nov 19
http://slidepdf.com/reader/full/us-7354576-nov-19 5/36
U.S.
Patent A p r . 8 ,
2 0 0 8 S h e e t 4 o f 1 4 US , 3 5 4 , 5 7 6 B2
F I G .
7 - 4
2690
2 7 0 0
2 7 1 0
2 7 2 0
* ' k
2 7 3 0
‘ k
*
C C G CCG C A C GTG C A G C T G TTG
C G C
A A G C C G
G T G
C T C A C G GCC ATG GGG CTG
CTG GCG
P r o P r o H i s V a l
G l n
L e u
L e u
A r g L y s P r o V a l L e u
T h r
A l a Met Gly
L e u
Leu Ala
2 7 4 0
2 7 5 0
2760 2 7 7 0 2780
2 7 9 0
* *
* * ' A -
1 ‘
* * ~ k
*
a -
*
C T G CTG GAT GAG GAG CAG CTC
T G G
G C C GAA G T G T C G CAG GCC GGG
ACC
GTC CTG GAC
Leu
Leu
Asp
G l u G l u
Gln Leu Trp
Ala
6 1
u
V a l Ser G l
n
Ala
Gly Thr V a l
Leu
Asp
2800 2810 2 8 2 0 2 8 3 0 2840
2850
' k
*
AGC AAC CAC ACG GTG GGC GTC
CTG GCC
AGC G C C
CAC
CGC CCC CAG
GGC
CCG GCC
GAC
Ser Asn H i s Thr
V a l
Gly V a l L e u A l a Ser A l a H i s Arg Pro Gln
Gly
Pro A l
a
Asp
2860 2870 2 8 8 0 2890 2900 2910
GCC
TGG
CGC GCC
GCG GTG CTG
ATC TAC GCG A G C
GAC GAC
ACC
CGC GCC
CAC
CCC AAC
Ala
Trp
Arg A l a
A l
a V a l Leu I l e
Tyr
A l
a
S e r
Asp Asp
Thr
Arg
Ala
H i s
Pro
Asn
2920
2930
2 9 4 0
2950
2960
*
*
*
‘ k
‘ k
i
- k
i * *
C G C
AGC
GTC
GCG GTG ACC CTG
CGG
CTG
C G C G G G
GTG CCC CCC GGC CCG GGC CTG GTC
A r g
Ser
V a l A l
a V a l
T h r L e u A r g L e u A r g G l y V a l P r o P r o
Gly
P r o G l y
Leu V a l
2 9 7 0
2980
2990 3 0 0 0
3010 3020
* ‘ k
* *
*
T A C
GTC ACG CGC T A C CTG
GAC
AAC
GGG
C T C
l G C
AGC CCC GAC GGC
GAG TGG CGG CGC
T y r V a l T h r A r g T y r L e u A s p A s n
G l y
L e u C y s S e r P r o
A s p
G l y G l u T r p A r g A r g
3 0 3 0 3 0 4 0 3050 3060 3070 3080
*
‘ k
*
‘ k
‘ k
i ’
*
~ k
C T G
GGC CGG CCC GTC
TTC
CCC ACG GCA
GAG C A G
TTC
. C G G
CGC ATG CGC GCG GCT GAG
L e u Gly
A r g
P r o V a l P h e Pro T h r Ala
6 1 u G l n Phe
Arg
Arg Met
Arg
A l a
Ala
Glu
3 0 9 0 3100 3 1 1 0 3120 3 1 3 0
* * * * * * *
G A C CCG GTG GCC GCG
GCG
CCC CGC CCC TTA
C C C GCC GGC GGC CGC CTG
ACC
CTG CGC
A s p P r o
V a l
A l
a
A l a
A l a P r o
A r g
P r o L e u P r o A l a Gly Gly
Arg L e u T h r L e u
A r g
3 1 4 0 3150 3160 3 1 7 0 3180 3 1 9 0
* ‘ k i :
i * i ’
C C C G C G
C T G
C G G C T G C C G T C G C T T T T G C T G
G T G
C A C GTG T G T GCG C G C
C C C
G A G AAG
P r o A l a L e u A r g L e u P r o Ser L e u Leu L e u V a l H i s V a l C y s Ala Arg P r o G l
u
L y s
3200 3210
3220 3230
3240 3250
*
' k
* ‘ k ‘ k ' k ‘ k
‘ k ' k
t
*
C C G C C C G G G
C A G
G T C
A C G C G G
C T C
CGC
G C C C T G
C C C
CTG
A C C CAA
GGG
C A G C T G
GTT
P r o P r o G l y G l n
V a l Thr Arg
L e u
Arg
Ala
L e u Pro Leu Thr
G l n
Gly
G l n Leu V a l
3 2 6 0 3270 3280 3290
3300
‘ k ‘ k
" k i ’
*
C T G
G T C T G G
TCG GAT
GAA
CAC GTG GGC T C C A A G TGC CTG TGG ACA
TAC
GAG A T C CAG
L e u V a l l r p
S e r
A s p G l
u
H i s V a l
G l y
S e r L y s C y s L e u T r p
T h r
T y r G l u I l e
G l
n
3 3 1 0
3 3 2 0 3330
3 3 4 0 3 3 5 0 3 3 6 0
1 1 '
k
**
i i * *
i:
* *
T T C T C T C A G GAC G G T AAG GCG T A C ACC C C G G T C AGC AGG AAG C C A T C G A C C T T C AAC
P h e
S e r 6 1
n A s p
G l y
L y s A l a
T y r
Thr
P r o
V a l Ser Arg
L y s P r o S e r T h r P h e
A s n
8/10/2019 US 7,354,576-Nov 19
http://slidepdf.com/reader/full/us-7354576-nov-19 9/36
U.S.
Patent A p r . 8 ,
2 0 0 8
S h e e t 8
0 f 1 4 US , 3 5 4 , 5 7 6 B2
t
i d a s e 3 pg
nm
I d u r o n
C o n t a m i n a n
7234
L a n e
4
G a l / i
P r o c e s s E n z y m e
t h
few c o n t a m i n a n t s
i
8/10/2019 US 7,354,576-Nov 19
http://slidepdf.com/reader/full/us-7354576-nov-19 10/36
U.S.
Patent A p r . 8 ,
2 0 0 8
S h e e t 9
0 f 1 4 US , 3 5 4 , 5 7 6 B2
—
r o d u c t i v i t y
( m g / d a y )
I d u r o n i d o s e E n z y m e A c t i v i t y
D u r i n g
P r o d u c t i o n
2 5 0 0 . 0 0
1 %
2 0 0 0 . 0 0
3
U‘
5 A
3
1 5 0 0 0 0
B e g i n P e r f u s i o n P e o k p e r f u s i o n r o t e
1 ; , ( i . e . c t l o n g e o ’ u t f r o m
s e r u m
8 0 p r o em r e e
1 : 1000.00
5 l /_l/ K
5 0 0 . 0 0
0 00
f I I
7
l f I l I I
l?’
l | l I
I I I
0 9 2 6 0 0 0 9 2 9 0 0
1 0 0 2 0 0
1 0 0 5 0 0
1 0 0 8 0 0
1 0 1
1 0 0
1 0 1 4 0 0 1 0 1 7 0 0
D a t e
5 0 0 0 I d u r o n i d o s e P r o d u c t i o n
L e v e l i n
P r o d u c t i o n
R u n P 0 2
E +36 i t e r F l o s k A
3
4 0 0 0 - -<>-36 L i t e r
F l o s k B
3
9 ?
E 3 0 0 0
“ 6
g
2 0 0 0
E
1 0 0 0
G)
g 0-
.
.
E
S e r u m
I
P r o t e i n - F r e e M e d i u m I
§
— 1 0 0 0 '
|
" ‘ C e l l G r o w t h
S t a b l e C e l l
M a s s
w i t h
P r o d u c t i o n
“ 6 — 2 0 0 0 ' P h a s e
E 4 0 0 -
llllllllll
B u t y r o t e
I n d u c t i o n E v e n t s
I I I | I I
5 1 0
1
5
2 0 2 5 3 0 3 5
D a y s
o f P r o d u c t i o n
F I G .
5 8
C D 4
8/10/2019 US 7,354,576-Nov 19
http://slidepdf.com/reader/full/us-7354576-nov-19 12/36
U . S .
Patent
A p r . 8 ,
2 0 0 8 S h e e t
1 1 0 f
1 4 US
, 3 5 4 , 5 7 6 B2
F /G° 6
E l b o w
0 n d
K n e e
E x t e n s i o n i n H A C O 0 2
1 8 0
1 7 5 '
1 7 0 “
1 6 5 i
g
1 5 0 l
E ‘ 1 5 5
1 5 0 '
1 4 5 ' — < > -
R i g h t
E i b o w
1 4 0 W 0 ' - L e f t E l b o w
—v— R i g h t
K n e e
1 5 5 1 —v—
R i g h t
K n e e
0
T o
2 ' 0 3 ' 0 4 0 5 b
s o
1 5 D
1 4 0 ‘
1 3 0 '
1 2 0 '
1 1 0 1
e g r e e s
1 0 0 +
s o l
8 0
F / G . 7
1 ' 0
2 b
5 0 4 b 5 0 6 b
7 ? a 5 9 E 1
1 6 0 1 1 6 1 1 2
W e e k s
0 . .
8/10/2019 US 7,354,576-Nov 19
http://slidepdf.com/reader/full/us-7354576-nov-19 13/36
U.S. Patent
A p r . 8 ,
2 0 0 8 S h e e t 1 2
0 f
1 4 US , 3 5 4 , 5 7 6 B2
S l e e p
A p n e a
I m p r o v e s
1 0 0
8 0
0
w e e k s
S A O Z
A p n e o s
+
H y p o p n e o s D u r i n g S l e e p
P r e
a n d
P o s t
T r e a t m e n t
[ 3
P r e t r e a t m e n t ‘ 2 . ?
E ]
2 6
w e e k s
T r e a t m e n t
N L I J - P ~ U I O I \ I C D
D O O O O O O
0 5 : 7 5 : : 5 1 5 ? 1 . . 2
T i ; r - a f - ‘ l é
O M 0 0 1
R C D O U 3 S W D O Q 5 J A N O O 7 C E L O O Q
A H C D D Z S S H O O 4 CMDOOB N-M008 B 8 6 0 1 0
F / G . 9
8/10/2019 US 7,354,576-Nov 19
http://slidepdf.com/reader/full/us-7354576-nov-19 14/36
U.S. Patent
A p r . 8 ,
2 0 0 8
S h e e t 1 3 o f
1 4 US , 3 5 4 , 5 7 6 B2
P u l m o n a r y F u n c t i o n T e s t s i n G M D O O G
1 . 6
5 2 w k s
1
. 4
2 3 0 %
I m p r o v e m e n t
0 . 8
0.4
0 . 2 4
F
V 1 F E V 3
F I G ,
7 0
I n c r e a s e d
H e i g h t
G r o w t h
V e l o c i t y
85% M e a n I n c r e a s e i n G r o w t h R a t e
1 10 Post-treatment
O
o
I d g r o w t h r a t e
e r c e n t
r i g i n a le i g h t
5
r
9 6 *
P r e t r e a t m e n t
8 8
F I G . 7 7
8/10/2019 US 7,354,576-Nov 19
http://slidepdf.com/reader/full/us-7354576-nov-19 15/36
U.S. Patent
A p r . 8 ,
2 0 0 8 S h e e t 1 4
0 f
1 4 US , 3 5 4 , 5 7 6 B2
C h i n z s ‘ e z H a m s t e r O v a r y H o s t P r o t e i n C o n t a m i n a t i o n
b y
E L I S A A s s a y
S O U R C E
A N D B A T C H 8 8 3 0 1 1 1 1 1 1 5 1 1
P E R C E N T
C H O P
2 1 1 2 5 1 5 0 5 1 1 3 0
N U M B E R ( m i c r o g m m p e r
m m i g m m )
C O N T A M I N A T I O N
C H O P
P r i o r P r o c e s s ( C a r s o n / R E D
0 9 0 0 2
1 4 1 . 4 2 »
9 8 . 6 %
0 9 0 0 3 2 4 2 . 4 %
9 7 . 6 %
0 9 0 0 4 1 6 1
. 6 2 5
9 8 . 4 %
N e w P r o c e s s
( G a l l i )
P 1 0 0 3 ( 1 . 3
< 0 . 1 3 %
> 9 9 . 9 %
P 1 0 0 6
1 . 2 0 . 1 2 %
9 9 . 9 %
P 1 0 0 7 <06 < 0 . 0 6 % > 9 9 . 9 %
P 1 0 0 8 < 0 . 6 7 < 0 . 0 6 7 %
> 9 9 . 9 %
C o m p a r i s o n
o f G a l l i
a n d C a r s o n
M a t e r i a l
1 2 3
1 7 5 1 7 5
8 3 8 3
6 2 6 2
4 8 4 8
3 3 3 3
2 5 2 5
1 7 1 7
a n t i - I D U W e s t e r n b l o t S D S - P A G E s i l v e r s t a i n
1 : 5 0 , 0 0 0
1 M a r k e r
2 6 0 1 1 5
R e f e r e n c e d - 0 2 0 1
3
C a r s o n C 9 0 0 2
8/10/2019 US 7,354,576-Nov 19
http://slidepdf.com/reader/full/us-7354576-nov-19 16/36
US
7 , 3 5 4 , 5 7 6
B2
1
METHODS
OF TREATING DISEASES
CAUSED
BYDEFICIENCIES OF
RECOMBINANT t-L-IDURONIDASE
T h i s a p p l i c a t i o n i s a c o n t i n u a t i o n o f
US.
p a t e n t a p p l i c a
t i o n S e r .
No.
0 9 / 9 9 3 , 2 4 1 , ? l e d N o v . 1 3 , 2 0 0 1 , now US.
P a t .
N o . 6 , 8 5 8 , 2 0 6 ,
Which
s
a c o n t i n u a t i o n - i n - p a r t
o f US.
a t e n t
a p p l i c a t i o n
S e r .
N o . 0 9 / 7 1 1 , 2 0 5 , ? l e d
N o v .
9 , 2 0 0 0 , n o w
US. P a t .
No. 6 , 5 8 5 , 9 7 1 , Which
i s a
c o n t i n u a t i o n - i n - p a r t
o f
US.
p a t e n t a p p l i c a t i o n
S e r . N o .
0 9 / 4 3 9 , 9 2 3 ,
? l e d N o v .
1 2 ,
1 9 9 9 ,
n o w
US. P a t . No. 6 , 4 2 6 , 2 0 8 .
FIELD
OF THE INVENTION
The p r e s e n t i n v e n t i o n
i s i n t h e
? e l d
o f m o l e c u l a r b i o l o g y ,
e n Z y m o l o g y , b i o c h e m i s t r y
a n d
c l i n i c a l m e d i c i n e .
I n p a r t i c u
l a r ,
t h e p r e s e n t
i n v e n t i o n
p r o v i d e s a human r e c o m b i n a n t
o t - L - i d u r o n i d a s e , m e t h o d s o f
l a r g e - s c a l e p r o d u c t i o n
a n d
p u r i ? c a t i o n o f c o m m e r c i a l g r a d e human r e c o m b i n a n t
o t - L
i d u r o n i d a s e
enzyme,
and methods
t o
t r e a t
c e r t a i n
g e n e t i c
d i s o r d e r s i n c l u d i n g o t - L - i d u r o n i d a s e
d e ? c i e n c y a n d
m u c o
p o l y s a c c h a r i d o s i s I ( M P S I ) .
BACKGROUNDOF THE INVENTION
C a r b o h y d r a t e s
p l a y a number
o f
i m p o r t a n t
r o l e s i n
t h e
f u n c t i o n i n g o f l i v i n g
o r g a n i s m s . I n a d d i t i o n
t o
t h e i r m e t a
b o l i c
r o l e s , c a r b o h y d r a t e s
a r e
s t r u c t u r a l
c o m p o n e n t s
o f t h e
human
body c o v a l e n t l y a t t a c h e d t o numerous o t h e r e n t i t i e s
s u c h a s p r o t e i n s a n d l i p i d s ( c a l l e d g l y c o c o n j u g a t e s ) .
F o r
e x a m p l e ,
h uman c o n n e c t i v e t i s s u e s
a n d c e l l
membranes
c o m p r i s e p r o t e i n s , c a r b o h y d r a t e s
a n d a p r o t e o g l y c a n a t r i x .
T h e
c a r b o h y d r a t e p o r t i o n
o f
t h i s p r o t e o g l y c a n m a t r i x p r o
v i d e s i m p o r t a n t p r o p e r t i e s t o t h e b o d y ’ s s t r u c t u r e .
A
e n e t i c
d e ? c i e n c y o f
t h e c a r b o h y d r a t e - c l e a v i n g , l y s o
somal enZyme o t - L - i d u r o n i d a s e c a u s e s a
lysosomal
s t o r a g e
d i s o r d e r
knoWn s m u c o p o l y s a c c h a r i d o s i s I (MPS ) ( N e u
f e l d
a n d M u e n Z e r ,
p p .
1 5 6 5 - 1 5 8 7 ,
i n
T h e
M e t a b o l i c B a s i s
o f
I n h e r i t e d
D i s e a s e ,
E d s . , C . R .
S c r i v e r , A .
L .
B e a u d e t , W. S .
S l y ,
a n d D . V a l l e , M c G r a W - H i l l ,
NeW York
( 1 9 8 9 ) )
I n a
s e v e r e f o r m , MPS i s
c o m m o n l y
knoWn s H u r l e r syndrome
a n d i s a s s o c i a t e d W i t h m u l t i p l e p r o b l e m s s u c h a s m e n t a l
r e t a r d a t i o n ,
c l o u d i n g
o f t h e
c o r n e a ,
c o a r s e n e d
f a c i a l
f e a
t u r e s , c a r d i a c d i s e a s e ,
r e s p i r a t o r y
d i s e a s e , l i v e r a n d
s p l e e n
e n l a r g e m e n t , h e r n i a s ,
a n d
j o i n t
s t i f f n e s s . P a t i e n t s s u f f e r i n g
from H u r l e r
syndrome u s u a l l y d i e b e f o r e a g e 1 0 . I n a n
i n t e r m e d i a t e fo r m k n oWn a s
H u r l e r - S c h e i e syndrome,
men
t a l
f u n c t i o n i s g e n e r a l l y n o t s e v e r e l y a f f e c t e d , b u t p h y s i c a l
problems m a y
l e a d
t o d e a t h by t h e t e e n s
o r
t W e n t i e s . S c h e i e
syndrome s t h e
m i l d e s t
f o r m o f MPS .
I t
i s c o m p a t i b l e W i t h
a
n o r m a l
l i f e s p a n ,
b u t
j o i n t s t i f f n e s s ,
c o r n e a l c l o u d i n g a n d
h e a r t v a l v e d i s e a s e c a u s e s i g n i ? c a n t p r o b l e m s .
The
f r e q u e n c y o f MPS i s
e s t i m a t e d
t o b e 1 : 1 0 0 , 0 0 0
a c c o r d i n g
t o
a
B r i t i s h
Columbia s u r v e y
of a l l neWboms
( L o W r y ,
e t
a l . , H u m a n
G e n e t i c s 8 5 : 3 8 9 - 3 9 0
( 1 9 9 0 ) ) a n d
1 : 7 0 , 0 0 0
a c c o r d i n g
t o a n r i s h s t u d y ( N e l s o n , H u m a n G e n e t
i c s 101:355-358
( 1 9 9 0 ) ) .
There a p p e a r s t o be no e t h n i c
p r e d i l e c t i o n
f o r
t h i s
d i s e a s e .
I t i s l i k e l y t h a t W o r l d W i d e t h e
d i s e a s e
i s
u n d e r d i a g n o s e d
e i t h e r b e c a u s e t h e p a t i e n t d i e s
o f
a
c o m p l i c a t i o n
b e f o r e t h e d i a g n o s i s
i s made
o r
b e c a u s e
t h e
m i l d e r f o r m s o f t h e syndrome m a y b e m i s t a k e n f o r a r t h r i t i s
o r
m i s s e d e n t i r e l y . E f f e c t i v e
neWbo m s c r e e n i n g
f o r MPS
Would
l i k e l y ?nd some
p r e v i o u s l y
u n d e t e c t e d p a t i e n t s .
E x c e p t
f o r a feW p a t i e n t s Which q u a l i f y f o r bone
marroW
t r a n s p l a n t a t i o n , t h e r e a r e n o s i g n i ? c a n t t h e r a p i e s a v a i l a b l e
f o r a l l MPS p a t i e n t s .
H o b b s , e t
a l .
( L a n c e t
2 :
7 0 9 - 7 1 2
( 1 9 8 1 ) )
? r s t
r e p o r t e d t h a t
bone
marroW
t r a n s p l a n t a t i o n s u c
20
25
30
35
40
45
50
55
60
6 5
2
c e s s f u l l y t r e a t e d
a H u r l e r p a t i e n t . S i n c e t h a t t i m e ,
c l i n i c a l
s t u d i e s a t s e v e r a l t r a n s p l a n t c e n t e r s
h a v e
shoWn i m p r o v e
ment
i n
p h y s i c a l d i s e a s e a n d s l o W i n g o r s t a b i l i Z i n g o f
d e v e l o p m e n t a l d e c l i n e i f p e r f o r m e d e a r l y . ( W h i t l e y , e t a l . ,
Am. . Med. G e n e t .
4 6 :
2 0 9 - 2 1 8
( 1 9 9 3 ) ; V e ll o d i,
e t
a l . , A r c h .
D i s . C h i l d . 7 6 : 9 2 - 9 9 ( 1 9 9 7 ) ; P e t e r s , e t a l . ,
Blood
9 1 :
2 6 0 1 - 2 6 0 8
( 1 9 9 8 ) ; G u l f o n , e t a l . , J . P e d i a t r i c s
1 3 3 : 1 1 9 - 1 2 5
( 1 9 9 8 ) ) H o W e v e r ,
t h e
s i g n i ? c a n t
m o r b i d i t y a n d m o r t a l i t y ,
and t h e
need
f o r matched d o n o r m a r r o W ,
l i m i t s
t h e u t i l i t y
o f
bone marroW t r a n s p l a n t s . An
l t e r n a t i v e
t h e r a p y a v a i l a b l e t o
a l l
a f f e c t e d
p a t i e n t s
Would
p r o v i d e a n i m p o r t a n t
b r e a k
t h r o u g h
i n
t r e a t i n g
a n d m a n a g i n g t h i s
d i s e a s e .
EnZyme r e p l a c e m e n t
t h e r a p y
h a s b e e n c o n s i d e r e d
a
p o t e n t i a l
t h e r a p y
f o r M P S
I f o l l o W i n g
t h e
d i s c o v e r y
t h a t
o t - L - i d u r o n i d a s e
can c o r r e c t
t h e
e n z y m a t i c
d e f e c t i n H u r l e r
c e l l s
i n c u l t u r e ,
b u t t h e d e v e l o p m e n t
o f
human
t h e r a p y
h a s
been
t e c h n i c a l l y u n f e a s i b l e u n t i l noW. I n t h e c o r r e c t iv e
p r o c e s s ,
t h e
enZyme
c o n t a i n i n g a m a n n o s e - 6 - p h o s p h a t e
r e s i d u e i s t a k e n u p
i n t o
c e l l s t h r o u g h
r e c e p t o r - m e d i a t e d
e n d o c y t o s i s
a n d t r a n s p o r t e d
t o t h e l y s o s o m e s W h e r e
t
c l e a r s
t h e s t o r e d s u b s t r a t e s ,
h e p a r a n
s u l f a t e a n d d e r m a t an
s u l f a t e .
A p p l i c a t i o n o f
t h i s
t h e r a p y t o
humans h a s
p r e v i o u s l y
n o t
been
p o s s i b l e
due
t o
i n a d e q u a t e s o u r c e s
o f
o t - L - i d u r o n i d a s e
i n t i s s u e s .
For
o t - L - i d u r o n i d a s e enZyme
t h e r a p y i n MPS , a recom
b i n a n t
s o u r c e
of
enZyme h a s
been
needed i n o r d e r t o o b t a i n
t h e r a p e u t i c a l l y
s u ? i c i e n t s u p p l i e s
o f
t h e
e n Z y m e . The
cDNA
f o r
t h e c a n i n e enZyme Was
c l o n e d
i n
1 9 9 1
( S t o l t Z f u s , e t a l . ,
J . B i o l .
Chem.
2 6 7 : 6 5 7 0 - 6 5 7 5 ( 1 9 9 2 ) a n d f o r
t h e
h uman
enZyme i n
t h e
same y e a r . ( S c o t t , e t
a l . ,
P r o c . N a t l . A c a d . S c i .
USA.
8 8 : 9 6 9 5 - 9 6 9 9
( 1 9 9 1 ) ,
M o s k o W i t Z ,
e t a l . ,
FASEB
J
6 : A 7 7
( 1 9 9 2 ) ) . F o l l o w i n g t h e
c l o n i n g
o f
cDNA f o r
o t - L
i d u r o n i d a s e ,
t h e
p r o d u c t i o n
o f a d e q u a t e q u a n t i t i e s o f r e c o m
b i n a n t
o t - L - i d u r o n i d a s e
a l l o W e d
t h e
s t u d y
o f
enZyme
r e p l a c e m e n t
t h e r a p y i n c a n i n e
M P S
. ( K a k k i s , e t a l . ,
P r o t e i n
E x p r . P u r i f : 2 2 5 - 2 3 2
( 1 9 9 4 ) )
E n Z y m e r e p l a c e m e n t s t u d i e s
i n t h e
c a n i n e
MPS
model d e m o n s t r a t e d
t h a t
i n t r a v e n o u s l y
a d m i n i s t e r e d
r e c o m b i n a n t
o t - L - i d u r o n i d a s e
d i s t r i b u t e d
W i d e l y
a n d
r e d u c e d l y s os o m al s t o r a g e
f r o m
many t i s s u e s .
( S h u l l ,
e t
a l . , P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA. 9 1 : 1 2 9 3 7 - 1 2 9 4 1
( 1 9 9 4 ) ; K a k k i s ,
e t
a l . ,
B i o c h e m . M o l .
M e d . 5 8 : 1 5 6 - 1 6 7
( 1 9 9 6 ) )
BRIEF
SUMMARY OF THE INVENTION
I n one a s p e c t , t h e p r e s e n t
i n v e n t i o n
f e a t u r e s a
method
t o
mass
p r o d u c e
human
r e c o m b i n a n t
o t - L - i d u r o n i d a s e
i n l a r g e
s c a l e a m o u n t s W i t h
a p p r o p r i a t e
p u r i t y t o
e n a b l e
l a r g e s c a l e
p r o d u c t i o n f o r l o n g t e r m p a t i e n t u s e o f
t h e enZyme
t h e r a p y .
I n a b r o a d
e m b o d i m e n t ,
t h e
method c o m p r i s e s
t h e s t e p o f
t r a n s f e c t i n g a
cDNA
ncoding
f o r
a l l o r p a r t
o f an
o t - L
i d u r o n i d a s e
i n t o
a c e l l s u i t a b l e f o r t h e e x p r e s s i o n t h e r e o f . I n
s o m e
embodiments,
a cDNA ncoding f o r a complete
o t - L
i d u r o n i d a s e i s u s e d , p r e f e r a b l y a h uman
o t - L - i d u r o n i d a s e .
HoWever, i n o t h e r embodiments, a cDNA n c o d i n g f o r a
b i o l o g i c a l l y a c t i v e
f r a g m e n t o r m u t e i n t h e r e o f m a y b e u s e d .
S p e c i ? c a l l y , one
o r
m o r e
amino a c i d s u b s t i t u t i o n s
may e
made
W h i l e p r e s e r v i n g o r e n h a n c i n g t h e b i o l o g i c a l
a c t i v i t y
o f t h e enZyme. I n o t h e r p r e f e r r e d
e m b o d i m e n t s ,
an e x p r e s
s i o n v e c t o r i s used to t r a n s f e r t h e cDNA n t o a s u i t a b l e c e l l
o r c e l l l i n e f o r
e x p r e s s i o n t h e r e o f .
I n
one
p a r t i c u l a r l y
p r e
f e r r e d embodiment, t h e cDNA s t r a n s f e c t e d i n t o a
C h i n e s e
hamster o v a r y
c e l l
t o c r e a t e c e l l l i n e
2 . 1 3 1 .
I n
y e t o t h e r
p r e f e r r e d e m b o d i m e n t s , t h e
p r o d u c t i o n p r o c e d u r e f e a t u r e s
one o r m o r e of t h e folloWing c h a r a c t e r i s t i c s
Which
have
d e m o n s t r a t e d
p a r t i c u l a r l y h i g h p r o d u c t i o n l e v e l s : ( a )
t h e
pH
o f t h e c e l l
groWth
c u l t u r e m a y e l o W e r e d t o a b o u t 6 . 5 t o
7 . 0 ,
8/10/2019 US 7,354,576-Nov 19
http://slidepdf.com/reader/full/us-7354576-nov-19 17/36
US
7 , 3 5 4 , 5 7 6
B2
3
p r e f e r a b l y
t o
a b o u t 6 . 8 - 7 . 0
d u r i n g t h e
p r o d u c t i o n
p r o c e s s ,
( b ) a s m a ny a s 2
t o
3 . 5
c u l t u r e v o l umes
of h e m e d i u m may
b e c h a n g e d d u r i n g e a c h 2 4 - h o u r p e r i o d b y
c o n t i n u o u s
p e r f u s i o n , ( c ) o x y g e n s a t u r a t i o n
may b e
o p t i m i Z e d
t o
a b o u t
40
u t m a y
be
a s
h i g h
a s
80%,
( d )
macroporous
c e l l u l o s e
m i c r o c a r r i e r s
W i t h a b o u t
5 erum i n t h e
m e d i u m n i t i a l l y ,
m a y be u s e d t o p r o d u c e
c e l l mass
f o l l o W e d
by a r a p i d
W a s h o u t s h i f t
t o
p r o t e i n - f r e e medium
f o r
p r o d u c t i o n , ( e ) a
p r o t e i n - f r e e
o r loW protein-medium such a s a JRH Bio
s c i e n c e s PF-CHO p r o d u c t
may
b e o p t i m i Z e d t o
i n c l u d e
supplemental
amounts
of one o r m o r e
i n g r e d i e n t s s el e c t e d
f r o m
t h e g r o u p c o n s i s t i n g
o f : g l u t a m a t e , a s p a r t a t e , g l y c i n e ,
r i b o n u c l e o s i d e s , a n d d e o x y r i b o n u c l e o s i d e s ;
( f )
a s t i r r e d
t a n k
s u s p e n s i o n
c u l t u r e m a y b e
p e r f u s e d
i n a
c o n t i n u o u s
p r o c e s s
t o
p r o d u c e i d u r o n i d a s e .
I n a
s e c o n d
a s p e c t , t h e p r e s e n t i n v e n t i o n p r o v i d e s a
t r a n s f e c t e d c e l l
l i n e , W h i c h f e a t u r e s
t h e a b i l i t y t o
p r o d u c e
o t - L - i d u r o n i d a s e i n
a m o u n t s ,
Which e n a b l e u s i n g t h e enZyme
t h e r a p e u t i c a l l y .
I n p r e f e r r e d e m b o d i m e n t s , t h e p r e s e n t
i n v e n t i o n
f e a t u r e s a recombinant Chinese hamster ovary c e l l
l i n e s u c h a s
t h e
2 . 1 3 1
c e l l
l i n e
t h a t
s t a b l y a n d
r e l i a b l y
p r o d u c e s a m o u n t s o f o t - L - i d u r o n i d a s e W h i c h e n a b l e
u s i n g
t h e
enZyme
h e r a p e u t i c a l l y . I n
some
r e f e r r e d
e m b o d i m e n t s ,
t h e c e l l l i n e m a y
c o n t a i n
m o r e t h a n 1
copy
of an e x p r e s s i o n
c o n s t r u c t . I n
even
m o re
r e f e r r e d embodiments, t h e c e l l l i n e
e x p r e s s e s
recombinant o t - L - i d u r o n i d a s e i n amounts of a t
l e a s t
2 0
m i c r o g r a m s
p e r 1 0 7 c e l l s p e r d a y .
I n a t h i r d a s p e c t , t h e p r e s e n t i n v e n t i o n
p r o v i d e s
n o v e l
v e c t o r s s u i t a b l e
t o produce
o t - L - i d u r o n i d a s e
i n
amounts
W h i c h e n a b l e u s i n g t h e enZyme h e r a p e u t i c a l l y .
I n p r e f e r r e d
e m b o d i m e n t s ,
t h e p r e s e n t i n v e n t i o n
f e a t u r e s a n
e x p r e s s i o n
v e c t o r
c o m p r i s i n g a c y t o m e g a l o v i r u s p r o m o t e r / e n h a n c e r
e l e m e n t , a
5 '
i n t r o n c o n s i s t i n g of a
murine
C O . i n t r o n , a
cDNA ncoding a l l
o r
a fragment
o r mutein of an
o t - L
i d u r o n i d a s e , a n d a 3 ' b o v i n e g r o W t h hormone p o l y a d e n y l a
t i o n s i t e . A l s o , p r e f e r a b l y
t h e
cDNA n c o d i n g
a l l
o r
a
fragment o r mutein
o f
an o t - L - i d u r o n i d a s e i s
a b o u t
2 . 2 kb
i n
l e n g t h .
T h i s e x p r e s s i o n v e c t o r
may
b e
t r a n s f e c t e d
a t ,
f o r
e x a m p l e , a 50 t o 1 r a t i o With any
a p p r o p r i a t e common
s e l e c t i o n
v e c t o r
s u c h a s pSV2NEO, t o enhance
m u l t i p l e
c o p y i n s e r t i o n s .
A l t e r n a t i v e l y , g e n e a m p l i ? c a t i o n may b e
u s e d t o
i n d u c e
m u l t i p l e copy
i n s e r t i o n s .
I n a f o u r t h a s p e c t , t h e p r e s e n t i n v e n t i o n
p r o v i d e s
n o v e l
o t - L - i d u r o n i d a s e p r o d u c e d i n
a c c o r d a n c e
W i t h t h e m e t h o d s
o f t h e p r e s e n t i n v e n t i o n a n d t h e r e b y p r e s e n t i n a m o u n t s
W h i c h e n a b l e u s i n g
t h e
e n Z y m e
t h e r a p e u t i c a l l y . T h e s p e c i ? c
a c t i v i t y o f t h e o t - L - i d u r o n i d a s e a c c o r d i n g t o
t h e
p r e s e n t
i n v e n t i o n i s i n
e x c e s s
o f
2 0 0 , 0 0 0
u n i t s p e r m i l l i g r a m p r o t e i n .
P r e f e r a b l y ,
i t
i s i n e x c e s s o f
a b o u t
2 4 0 , 0 0 0 u n i t s p e r m i l l i
gram r o t e i n . The m o l e c u l a r
W e i g h t o f
t h e o t - L - i d u r o n i d a s e
o f
t h e
p r e s e n t i n v e n t i o n i s a b o u t 8 2 , 0 0 0 d a l t o n s , a b o u t
7 0 , 0 0 0 d a l t o n s
b e i n g
a m i n o a c i d ,
a n d
a b o u t 1 2 , 0 0 0
d a l t o n s
b e i n g c a r b o h y d r a t e s .
I n a ? f t h
a s p e c t ,
t h e p r e s e n t i n v e n t i o n
f e a t u r e s
a n o v e l
method
to p u r i f y
o t - L - i d u r o n i d a s e .
According t o a ? r s t
embodiment, a c e l l mass may be groWn
i n
about
5
s e r u m - c o n t a i n i n g
medium,
f o l l o W e d by a s W i t c h t o a
modi
? e d p r o t e i n - f r e e p r o d u c t i o n medium W i t h o u t a n y s i g n i ? c a n t
a d a p t a t i o n t o p r o d u c e a
h i g h
s p e c i ? c
a c t i v i t y s t a r t i n g
m a t e
r i a l
f o r p u r i ? c a t i o n . I n o n e p r e f e r r e d e m b o d i m e n t , a
t h r e e
s t e p
column
c h r o m a t o g r a p h y
may
b e u s e d t o
p u r i f y t h e
enZyme. Such a t h r e e s t e p
column
c h r o m a t o g r a p h y m a y
i n c l u d e u s i n g a b l u e s e p h a r o s e
F F ,
a
Cu++
c h e l a t i n g
s e p h a r o s e
c h r o m a t o g r a p h y
a n d a p h e n y l
s e p h a r o s e
H P h r o
m a t o g r a p h y . I n a n o t h e r p r e f e r r e d
e m b o d i m e n t ,
a n
a c i d
p H
t r e a t m e n t
s t e p
i s u s e d
t o i n a c t i v a t e p o t e n t i a l v i r u s e s
W i t h o u t
h a r m i n g
t h e e n Z y m e . C o n c a n a v a l i n A - S e p h a r o s e , H e p a r i n
20
25
30
35
40
45
50
55
60
6 5
4
S e p h a r o s e a n d
S e p h a c r y l 200
c o l u m n s
a r e
removed a n d
B l u e - S e p h a r o s e
a n d
c o p p e r
c h e l a t i n g
c o l u m n s a d d e d t o
i n c r e a s e
t h e
c a p a c i t y
o f t h e
l a r g e
s c a l e p u r i ? c a t i o n p r o c e s s ,
t o r e d u c e u n d e s i r a b l e
l e a c h a b l e s i n a p p r o p r i a t e
f o r
l o n g t e r m
p a t i e n t u s e , a n d
t o
i m p r o v e t h e p u r i t y o f t h e p r o d u c t .
I n
a s i x t h a s p e c t , t h e
p r e s e n t
i n v e n t i o n f e a t u r e s n o v e l
methods
o f
t r e a ti n g d i s e a s e s
c a u s e d
a l l
o r i n p a r t
by
a
d e ? c i e n c y i n
o t - L - i d u r o n i d a s e .
I n o n e e m b o d i m e n t ,
t h i s
method
f e a t u r e s
a d m i n i s t e r i n g a r e c o m b i n a n t o t - L - i d u
r o n i d a s e o r a b i o l o g i c a l l y a c t i v e fragment
o r
mutein t h e r e o f
a l o n e o r
i n
combination With a p h a r m a c e u t i c a l l y s u i t a b l e
c a r r i e r .
I n
o t h e r
e m b o d i m e n t s ,
t h i s method f e a t u r e s
t r a n s
f e r r i n g
a
n u c l e i c a c i d
encoding a l l o r a
p a r t
of
an o t - L
iduronidase
i n t o one
o r m o r e h o s t
c e l l s i n
v i v o . P r e f e r r e d
e m b o d i m e n t s i n c l u d e o p t i m i Z i n g t h e d o s a g e t o t h e n e e d s o f
t h e
o r g a n i s m
t o
b e
t r e a t e d , p r e f e r a b l y
mammals o r
h u m a n s ,
t o e f f e c t i v e l y a m e l i o r a t e t h e d i s e a s e s y m p t o m s . I n p r e f e r r e d
e m b o d i m e n t s , t h e
d i s e a s e i s M u c o p o l y s a c c h a r i d o s i s I (MPS
I ) ,
H u r l e r s y n d r o m e , H u r l e r - S c h e i e
s y n d r o m e o r S c h e i e
s y n d r o m e .
I n a s e v e n t h a s p e c t , t h e p r e s e n t i n v e n t i o n
f e a t u r e s
n o v e l
p h a r m a c e u t i c a l c o m p o s i t i o n s
c o m p r i s i n g
o t - L - i d u r o n i d a s e
u s e f u l f o r t r e a t i n g a d i s e a s e
c a u s e d a l l
o r
i n
p a r t by a
d e ? c i e n c y
i n o t - L - i d u r o n i d a s e . S u c h c o m p o s i t i o n s may b e
s u i t a b l e
f o r a d m i n i s t r a t i o n
i n a n u mbe r
of
Ways
such a s
p a r e n t e r a l , t o p i c a l , i n t r a n a s a l ,
i n h a l a t i o n
o r o r a l a d m i n i s t r a
t i o n . Within
t h e
s c o p e of t h i s
a s p e c t
a r e embodiments
f e a t u r i n g
n u c l e i c
a c i d s e q u e n c e s encoding l l o r a
p a r t
of an
o t - L - i d u r o n i d a s e , Which
m a y b e a d m i n i s t e r e d i n v i v o i n t o
c e l l s ,
a f f e c t e d
w i t h
a n
o t - L - i d u r o n i d a s e d e ? c i e n c y .
DESCRIPTION
OF
THE FIGURES
F I G .
1 r e p r e s e n t s t h e
n u c l e o t i d e and deduced
amino
a c i d
s e q u e n c e s o f
cDNA
n c o d i n g o t - L - i d u r o n i d a s e (SEQ I D
NOS:1 a n d
2 ) .
N u c l e o t i d e s 1
t h r o u g h
6200 a r e p r o v i d e d .
Amino a c i d s a r e
p r o v i d e d s t a r t i n g W i t h
t h e ? r s t
m e t h i o n i n e
i n
t h e o p e n r e a d i n g
f r a m e .
FIG.
2
r e p r e s e n t s t h e r e s u l t s from
S DS-PAGE
r u n s of
e l u a t e o b t a i n ed a c c o r d i n g
t o t h e
p r o c e d u r e s a s d e s c r i b e d
b e l o W .
The
t o p p a n e l s h o W s t h e SDS-PAGE r e s u l t s o f
p u r i ? e d o t - L - i d u r o n i d a s e
( 3 m i c r o g r a m s )
a n d
c o n t a m i n a n t s
f r o m t h e
p r o d u c t i o n / p u r i ? c a t i o n scheme d i s c l o s e d
i n Kak
k i s ,
e t
a l . ,
P r o t e i n E x p } : P u r i f . ‘ 5 : 2 2 5 - 2 3 2 ( 1 9 9 4 ) . I n t h e
b o t t o m p a n e l , SDS-PAGE r e s u l t s
o f p u r i ? e d
o t - L - i d u
r o n i d a s e W i t h
c o n t a m i n a n t s f r o m a n
u n p u b l i s h e d
p r i o r
p r o
d u c t i o n / p u r i ? c a t i o n p r o c e s s
( U S . p a t e n t a p p l i c a t i o n
S e r .
N o s . 0 9 / 0 7 8 , 2 0 9
and
0 9 / 1 7 0 , 9 7 7 )
r e f e r r e d t o a s t h e
Carson
method i n L a n e s
2
( 7 . 5
m i c r o g r a m o t - L - i d u r o n i d a s e )
a n d
L a n e 3 ( 5 . 0 m i c r o g r a m o t - L - i d u r o n i d a s e )
a r e
c o m p a r e d
t o
t h a t
o f
t h e
p r o d u c t i o n / p u r i ? c a t i o n
p r o c e s s o f t h e p r e s e n t
i n v e n t i o n r e f e r r e d t o a s t h e G a l l i
P r o c e s s
(Lane
4
5 micro
g r a m s
o t - L - i d u r o n i d a s e ) .
Lane 1
c o n t a i n s t h e
m o l e c u l a r
W e i g h t m a r k e r . F I G . 2 s h o W s t h a t t h e
G a l l i
p r o d u c t i o n /
p u r i ? c a t i o n method o f t h e p r e s e n t i n v e n t i o n y i e l d s a h i g h l y
p u r i ? e d
o t - L - i d u r o n i d a s e p r o d u c t
W i t h f e W e r
c o n t a m i n a n t s
i n c o m p a r i s o n
W i t h
p r i o r p r o d u c t i o n / p u r i ? c a t i o n
s c h e m e s .
F I G .
3 d e m o n s t r a t e s t h e o t - i d u r o n i d a s e p r o d u c t i o n l e v e l
o v e r a
3 0 - d a y
p e r i o d , d u r i n g Which t i m e c e l l s a r e s W i t c h e d
at day 5 from a serum4containing m e d i u m
t o
a s e r u m - f r e e
medium.
o t - I d u r o n i d a s e p r o d u c t i o n Was c h a r a c t e r i Z e d b y :
( 1 ) a b s e n c e
o f a
need
f o r a d a p t a t i o n When e l l s a r e
s W i t c h e d
from s e r u m - c o n t a i n i n g t o s e r u m - f r e e m e d i u m a t 100200
( t o p
a n d b o t t o m p a n e l s )
W i t h a n
u n i n t e r r u p t e d i n c r e a s e
i n
p r o d u c t i v i t y
( t o p
p a n e l ) ;
( 2 ) a h i g h l e v e l o f
p r o d u c t i o n
i n
e x c e s s o f 4 mg e r l i t e r ( 1 0 0 0 p e r mL)
i n
a p r o t e i n - f r e e
8/10/2019 US 7,354,576-Nov 19
http://slidepdf.com/reader/full/us-7354576-nov-19 18/36
US
7 , 3 5 4 , 5 7 6
B2
5
medium ( b o t t o m p a n e l ) ; a n d ( 3 ) a b o o s t i n o t - i d u r o n i d a s e
p r o d u c t i o n W i t h
b u t y r a t e i n d u c t i o n e v e n t s ( b o t t o m p a n e l ) .
F I G .
4
d e m o n s t r a t e s
a d e c r e a s e i n
l i v e r v o l u m e
d u r i n g
enZyme
t h e r a p y
i n
M P S
p a t i e n t s .
F I G .
5
d e m o n s t r a t e s u r i n a r y GAG e x c r e t i o n
d u r i n g
e n Z y m e
t h e r a p y .
F I G .
6 d e m o n s t r a t e s elbow and
knee
e x t e n s i o n
i n
HAC002 d u r i n g e n Z y m e
t h e r a p y .
F I G .
7
d e m o n s t r a t e s s h o u l d e r
?exion
to
104
Weeks
i n
f o u r
p a t i e n t s
W i t h
t h e m o s t r e s t r i c t i o n d u r i n g enZyme t h e r a p y .
F I G . 8 d e m o n s t r a t e s i m p r o v e m e n t i n s l e e p a p n e a b e f o r e
a n d a f t e r s i x
Weeks
o f t h e r a p y .
F I G . 9
d e m o n s t r a t e s
t h e improvement i n
a p n e a s
and
h y p o p n e a s
d u r i n g s l e e p
W i t h
e n Z y m e t h e r a p y
i n e a c h
i n d i
v i d u a l
p a t i e n t .
F I G .
1 0
d e m o n s t r a t e s t h e i m p r o v e m e n t i n p u l m o n a r y
f u n c t i o n t e s t s
b e f o r e
and a f t e r
1 2
and 52 Weeks of
enZyme
t h e r a p y
i n o n e
p a t i e n t .
F I G . 1 1
d e m o n s t r a t e s
i n c r e a s e d h e i g h t g r o W t h
v e l o c i t y
W i t h
enZyme t h e r a p y .
F I G . 1 2 s h o W s t h e
d e g r e e
o f c o n t a m i n a t i o n
by
C h i n e s e
H a m s te r O v a r y P r o t e i n (CHOP)
a n d d e g r e e o f p u r i t y o f
o t - L - i d u r o n i d a s e ,
p r o d u c e d
b y
( 1 )
t h e
C a r s o n
m e t h o d ,
a n
u n p u b l i s h e d
p r i o r p r o d u c t i o n / p u r i ? c a t i o n p r o c e s s
( U S .
p a t e n t a p p l i c a t i o n S e r . N o s . 0 9 / 0 7 8 , 2 0 9 a n d 0 9 / 1 7 0 , 9 7 7 a n d
( 2 ) t h e G a l l i m e t h o d , t h e p r o d u c t i o n / p u r i ? c a ti o n p r o c e s s o f
t h e p r e s e n t i n v e n t i o n .
T h u s ,
F I G . 1 2 s h o W s t h a t
o t - L - i d u
r o n i d a s e
p r o d u c e d
a n d p u r i ? e d
by
t h e
G a l l i
method
h a s a
h i g h e r
d e g r e e o f u r i t y a n d l o W e r d e g r e e o f
CHOP
o n t a m i
n a t i o n i n
c o m p a r i s o n t o
t h a t o f
t h e
C a r s o n m e t h o d .
F I G . 1 3
shoWs a c o m p a r i s o n
o f
o t - L - i d u r o n i d a s e
p r o d u c e d
by t h e G a l l i
method v e r s u s
t h e
C a r s o n
m e t h o d . On t h e l e f t
s i d e o f t h e F i g u r e ,
r e s u l t s
from a Western B l o t shoW t h a t t h e
G a l l i m a t e r i a l ( l e f t s i d e , c o l u m n 2 ) c o m p r i s e f e W e r c o n t a m i
n a t i n g p r o t e i n
b a n d s ( b e t W e e n 4 8
kDa
a n d
1 7 k D a ) i n
c o m p a r i s o n W i t h
t h e
C a r s o n m a t e r i a l ( l e f t s i d e , c o l u m n 3 ) .
On t h e
r i g h t s i d e o f
t h e F i g u r e ,
r e s u l t s from a n
SDS-PAGE
s i l v e r s t a i n
shoW
t h e
a b s e n c e of
a
band
t
t h e
62
kDa
i n
t h e
G a l l i
m a t e r i a l
( c o l u m n 2 ) i n c o m p a r i s o n t o t h e p r e s e n c e
o f
s u c h a band i n t h e C a r s o n m a t e r i a l ( c o l u m n 3 ) .
DETAILED
DESCRIPTION
OF THE
INVENTION
I n
one a s p e c t ,
t h e
p r e s e n t i n v e n t i o n f e a t u r e s
a
method t o
p r o d u c e
o t - L - i d u r o n i d a s e i n
a m o u n t s
W h i c h e n a b l e u s i n g t h e
enZyme t h e r a p e u t i c a l l y .
I n
g e n e r a l ,
t h e
method f e a t u r e s
t r a n s f o r m i n g
a
s u i t a b l e c e l l l i n e W i t h
t h e cDNA
n c o d i n g f o r
a l l
of o t - L - i d u r o n i d a s e o r a
b i o l o g i c a l l y a c t i v e fragment o r
mutein t h e r e o f . Those
o f s k i l l
i n
t h e
a r t
m a y r e p a r e e x p r e s
s i o n c o n s t r u c t s o t h e r
t h a n t h o s e e x p r e s s l y d e s c r i b e d h e r e i n
f o r o p t i m a l p r o d u c t i o n
o f
o t - L - i d u r o n i d a s e i n
s u i t a b l e c e l l
l i n e s
t r a n s f e c t e d t h e r e W i t h .
M o r e o v e r ,
s k i l l e d a r t i s a n s m a y
e a s i l y
d e s i g n
f r a g m e n t s
o f
cDNA
e n c o d i n g
b i o l o g i c a l l y
a c t i v e
f r a g m e n t s a n d m u t e i n s o f t h e
n a t u r a l l y
o c c u r r i n g
o t - L - i d u r o n i d a s e Which
p o s s e s s t h e
same o r s i m i l a r
b i o l o g i
c a l a c t i v i t y
t o
t h e n a t u r a l l y
o c c u r r i n g
f u l l - l e n g t h e n Z y m e .
To c r e a t e
a recombinant source
f o r
o t - L - i d u r o n i d a s e, a
l a r g e
s e r i e s
o f e x p r e s s i o n v e c t o r s m a y
b e
c o n s t r u c t e d a n d
t e s t e d
f o r
e x p r e s s i o n of
o t - L - i d u r o n i d a s e cDNA.
Based
o n
t r a n s i e n t
t r a n s f e c t i o n
e x p e r i m e n t s , a s W e l l
a s s t a b l e t r a n s
f e c t i o n s ,
an
e x p r e s s i o n c o n s t r u c t m a y
be
i d e n t i ? e d t h a t
p r o v i d e s a p a r t i c u l a r l y h i g h l e v e l o f e x p r e s s i o n . I n o n e
embodiment o f t h e
p r e s e n t
i n v e n t i o n , a C h i n e s e h a m s t e r e l l
l i n e
2 . 1 3 1 d e v e l o p e d b y t r a n s f e c t i o n o f
t h e
o t - L - i d u r o n i d a s e
e x p r e s s i o n
c o n s t r u c t
a n d s e l e c t i o n f o r a h i g h e x p r e s s i o n
c l o n e
p r o v i d e s p a r t i c u l a r l y h i g h l e v e l
e x p r e s s i o n . S u c h
a
20
25
30
35
40
45
50
55
60
6 5
6
C h i n e s e h a m s t e r c e l l l i n e a c c o r d i n g t o t h i s embodiment o f
t h e p r e s e n t i n v e n t i o n m a y s e c r e t e a b o u t 5 , 0 0 0 t o 7 , 0 0 0 f o l d
m o r e o t - L - i d u r o n i d a s e t h a n n o r m a l . The o t - L - i d u r o n i d a s e
p r o d u c e d
t h e r e b y
may b e
p r o p e r l y
p r o c e s s e d , t a k e n u p i n t o
c e l l s W i t h h i g h
a f ? n i t y
a n d i s
c o r r e c t i v e
f o r o t - L - i d u r o n i d a s e
d e ? c i e n t
c e l l s , s u c h
a s
t h o s e
f r o m
p a t i e n t s s u f f e r i n g
f r o m
H u r l e r ’ s
S y n d r o m e .
The method
f o r
p r o d u c i n g
o t - L - i d u r o n i d a s e i n
amounts
t h a t
e n a b l e u s i n g t h e enZyme
t h e r a p e u t i c a l l y
f e a t u r e s
a
p r o d u c t i o n
p r o c e s s s p e c i ? c a l l y
d e s i g n e d
t o m a s s p r o d u c e
c o m m e r c i a l g r a d e e n Z y m e , W h e r e i n t h e q u a l i t y o f t h e
enZyme h a s
been
deemed
a c c e p t a b l e f o r a d m i n i s t r a t i o n t o
humans
b y
r e g u l a t o r y
a u t h o r i t i e s
o f
v a r i o u s
c o u n t r i e s .
The
l a r g e s c a l e p r o d u c t i o n o f c o m m e r c i a l g r a d e
enZyme
n e c e s
s i t a t e s
m o d i ? c a t i o n s
o f t h e
c e l l
c u l t u r e s c a l e ,
m i c r o c a r r i e r
s y s t e m s ,
a n d
p u r i ? c a t i o n s c h e m e . I n
p r e f e r r e d e m b o d i
m e n t s , t h e
c e l l
c u l t u r e s c a l e
i s
i n c r e a s e d from 4 5 l i t e r s t o
1 1 0
l i t e r s o r m o r e ,
W i t h
a change t o
c o n t i n u o u s
p e r f u s i o n . The
i n c r e a s e
i n s c a l e i s n e c e s s a r y t o p r o d u c e
s u f ? c i e n t m a t e r i a l
f o r p o t e n t i a l l a r g e s c a l e p r o d u c t i o n f o r l o n g
t e r m
p a t i e n t u s e .
A c c o r d i n g
t o
p r e f e r r e d
embodiments o f s u c h
a
p r o c e s s ,
microcarriers are
us ed
a s
a
l oW
cost scalable surface
o n
Which t o groW a d h e r e n t c e l l s . I n
p a r t i c u l a r l y
p r e f e r r e d
embodiments, such
m i c r o c a r r i e r s
a r e macroporo us and a r e
s p e c i ? c a l l y composed
o f modi?ed c a r b o h y d r a t e s s u c h
as
c e l l u l o s e ,
e . g . , C y t o p o r e
b e a d s
m a n u f a c t u r e d
b y P h a r m a c i a .
M a c r o p o r o u s c e l l u l o s e m i c r o c a r r i e r s a l l o W
i m p r o v e d
c e l l
a t t a c h m e n t
and
p r o v i d e
a
l a r g e r
s u r f a c e
a r e a f o r a t t a c h m e n t ,
W h i c h i s
e x p e c t e d
t o
y i e l d
a n
i n c r e a s e d c e l l
d e n s i t y d u r i n g
t h e c u l t u r e p r o c e s s . H i g h e r c e l l
d e n s i t i e s
a r e
e x p e c t e d
t o
i n c r e a s e
p r o d u c t i v i t y .
I n p r e f e r r e d e m b o d i m e n t s , h e p a r i n
S e p h a r o s e
a n d S e p h a c r y l
2 0 0 c o l u m n s a r e r e p l a c e d
W i t h
B l u e - S e p h a r o s e a n d
C o p p e r
c h e l a t i n g c o l u m n s t o
i n c r e a s e
t h e
c a p a c i t y o f
t h e l a r g e s c a l e p u r i ? c a t i o n p r o c e s s a n d t o
i m p r o v e t h e p u r i t y o f t h e p r o d u c t . I n a p a r t i c u l a r l y p r e f e r r e d
e m b o d i m e n t , t h e c o p p e r c h e l a t i n g
column s
u s e d
t o r e d u c e
C h i n e s e h a m s t e r
o v a r y
c e l l p r o t e i n
c o n t a m i n a n t s
t o
v e r y loW
l e v e l s
a p p r o p r i a t e
f o r
l a r g e s c a l e d i s t r i b u t i o n . U s i n g
e m b o d i m e n t s o f t h e
p r e s e n t
method f e a t u r i n g m o d i ? c a t i o n s
a n d i n d u c t i o n d e s c r i b e d b e l o W , a p p r o x i m a t e l y
1 5
mg
e r
l i t e r o f
c u l t u r e p e r d a y , o r m o re t peak c u l t u r i n g
d e n s i t y
c a n
b e
p r o d u c e d s t a r t i n g
W i t h a 1 1 0 l i t e r c u l t u r e
s y s t e m .
A c c o r d i n g t o o t h e r p r e f e r r e d e m b o d i m e n t s o f t h e
method
f o r p r o d u c i n g o t - L - i d u r o n i d a s e a c c o r d i n g t o t h e p r e s e n t
i n v e n t i o n , a c u l t u r e s y s t e m
i s
o p t i m i Ze d . I n a ? r s t
embodi
m e n t , t h e
c u l t u r e p H
s l o W e r e d t o a b o u t 6 . 5 t o 7 . 0 , p r e f e r
a b l y
t o a b o u t
6 . 7 - 7 . 0
d u r i n g
t h e
p r o d u c t i o n
p r o c e s s .
One
a d v a n t a g e o f s u c h a p H
i s
t o
e n h a n c e
a c c u m u l a t i o n o f
lysosomal
enZymes
t h a t a r e
m o r e
s t a b l e a t a c i d i c pH.
I n
a
second
embodiment, a s m a n y a s
2
t o
3 . 5
c u l t u r e v o l umes
of
t h e medium may b e
c h a n g e d
d u r i n g
e a c h 2 4 - h o u r
p e r i o d
b y
c o n t i n u o u s p e r f u s i o n . One
a d v a n t a g e o f
h i s p r o c e d u r e
i s
t o
enhance
t h e
s e c r e t i o n r a t e of r e c o m b i n a n t
o t - L - i d u r o n i d a s e
and t o c a p t u r e
m o r e
a c t i v e enZyme.
I n a t h i r d
embodiment,
oxygen s a t u r a t i o n i s o p t i m i Z e d a t a b o u t 40%. I n a f o u r t h
e m b o d i m e n t, m a c r o p o r o u s m i c r o c a r r i e r s W i t h
a b o u t
5
serum i n i t i a l l y i n t h e
medium,
a r e used t o produce a c e l l
mass f o l l o W e d by
a
r a p i d Washout s h i f t
t o a
p r o t e i n - f r e e
medium
f o r
p r o d u c t i o n ( F I G . 3 ) . I n a ? f t h
e m b o d i m e n t ,
a
p r o t e i n - f r e e g r o W t h medium, s u c h
a s
a JRH
B i o s c i e n c e s
PF-CHO
r o d u c t , may
e
o p t i m i Z e d
o i n c l u d e
s u p p l e m e n t a l
amounts o f one
o r
m o r e
i n g r e d i e n t s
s e l e c t e d f r o m t h e group
c o n s i s t i n g o f :
g l u t a m a t e ,
a s p a r t a t e ,
g l y c i n e , r i b o n u c l e o s i d e s
and d e o x y r i b o n u c l e o s i d e s . I n a s i x t h embodiment, a s m a n y
a s 2
t o
3 . 5
c u l t u r e volumes
o f t h e
m edi u m m a y
be
changed
d u r i n g
e a c h
2 4 - h o u r p e r i o d
b y
c o n t i n u o u s
p e r f u s i o n . S u c h
8/10/2019 US 7,354,576-Nov 19
http://slidepdf.com/reader/full/us-7354576-nov-19 19/36
US
7 , 3 5 4 , 5 7 6
B2
7
an
i n d u c t i o n p r o c e s s
m a y
p r o v i d e
a b o u t
a t W o - f o l d i n c r e a s e
i n p r o d u c t i o n W i t h o u t
s i g n i ? c a n t l y
a l t e r i n g
p o s t - t r a n s l a
t i o n a l
p r o c e s s i n g .
P a r t i c u l a r l y p r e f e r r e d e m b o d i m e n t s o f t h e m e t h o d f o r
p r o d u c i n g
o t - L - i d u r o n i d a s e a c c o r d i n g
t o t h e
p r e s e n t i n v e n
t i o n f e a t u r e
o n e , m o r e
t h a n
o n e , o r a l l of t h e
o p t i m i Z a t i o n s
d e s c r i b e d
h e r e i n
and m a y be employed a s d e s c r i b e d i n m o r e
d e t a i l b e l o W . The p r o d u c t i o n
method
o f
t h e p r e s e n t i n v e n
t i o n m a y , t h e r e f o r e ,
p r o v i d e a p r o d u c t i o n
c u l t u r e p r o c e s s
h a v i n g t h e f o l l o W i n g
f e a t u r e s :
1 . A i c r o c a r r i e r b a s e d c u l t u r e u s i n g m a c r o p o r o u s m i c r o
c a r r i e r beads made of modi?ed c e l l u l o s e
o r
an
e q u i v a l e n t
t h e r e o f
i s
p r e f e r a b l y
u s e d i n l a r g e s c a l e c u l t u r e ? a s k s
W i t h
o v e r h e a d s t i r r i n g o r an e q u i v a l e n t t h e r e o f . Attachment
o f
c e l l s t o
t h e s e
b e a d s
m a y be a c h i e v e d by
c u l t u r e i n
a
5
e t a l
bovine serum may
e
added t o DME/F12 : 1 o r a p r o t e i n
f r e e medium
modi?ed W i t h i n g r e d i e n t s i n c l u d i n g r i b o
n u c l e o s i d e s ,
d e o x y r i b o n u c l e o s i d e s ,
p y r u v a t e ,
n o n - e s s e n t i a l
amino
a c i d s ,
a n d HEPES. A f t e r a b o u t
3 - 6
d a y s
i n
t h i s
m e d i u m , a W a s h o u t
p r o c e d u r e
s b e g u n
i n
W h i c h p r o t e i n - f r e e
medium r e p l a c e s t h e
s e r u m - c o n t a i n i n g medium
a t a n
i n c r e a s i n g p e r f u s i o n
r a t e
d e p e n d e n t
o n
t h e
g l u c o s e
c o n t e n t
a n d
c u l t u r e c o n d i t i o n .
S u b s e q u e n t l y ,
a n d
t h r o u g h o u t
t h e
e n t i r e
r e m a i n i n g c u l t u r e
p e r i o d , t h e c e l l s a r e c u l t i v a t e d i n a
p r o t e i n - f r e e medium. The u s e o f a p r o t e i n - f r e e m e d i u m i n
enZyme
p r o d u c t i o n i s
b e n e ? c i a l
i n r e d u c i n g
t h e e x p o s u r e
r i s k o f b o v i n e s p o n g i f o r m
e n c e p h a l o p a t h y
( B S E ) a n d
o t h e r
i n f e c t i o u s
b i o l o g i c
a g e n t s s u c h a s
v i r u s e s
t o p a t i e n t s b e i n g
t r e a t e d
With t h e enZyme, Wherein
t h e
r i s k of BSE
r o t h e r
h a r m f u l a g e n t s
i s d e p e n d e n t
on t h e amount o f p o t e n t i a l
s e r u m
e x p o s u r e . I n
p r i o r
p u b l i s h e d s t u d i e s ,
t h e c a r r i e r s
u s e d
t o groW t h e c e l l s Were b o v i n e g e l a t i n
m i c r o c a r r i e r s ,
u s e d a t
1
gr a m p e r
l i t e r
o r
100
t i m e s t h e p r o d u c t c o n c e n t r a t i o n .
L e a c h i n g
o f
1 %
o f t h e g e l a t i n
p r o t e i n f r o m
t h e
m i c r o c a r r i e r s
Would r e p r e s e n t
a
r e l a t i v e
10 0 % c o n t a m i n a t i o n
and t h e r e b y
c o n t r i b u t e to t h e
r i s k
of BSE. T h u s , neW c a r r i e r s a r e e i t h e r
d e x t r a n
o r c e l l u l o s e - b a s e d
and
c o n s i s t o f c a r b o h y d r a t e s , and
n o t a n i m a l - d e r i v e d
m a t e r i a l s .
FIG.
3 shoWs t h a t t h e c e l l s a r e groWn to a d e n s i t y i n
5
serum
c o n t a i n i n g
medium and t h e n s W i t c h e d W i t h o u t any
a d a p t a t i o n
t o a p r o t e i n - f r e e
medium. F I G .
3
s p e c i ? c a l l y
s h o W s
t h a t :
1 )
C e l l s
s u r v i v e
a n d c o n t i n u e
t o p r o d u c e i d u
r o n i d a s e When
s h i f t e d
W i t h o u t
a d a p t a t i o n . I n c o n t r a s t ,
o t h e r
s t u d i e s
Would
s u g g e s t t h a t a d a p t a t i o n t o a p r o t e i n - f r e e
medium s n e c e s s a r y . I n t h e method
o f
t h e p r e s e n t
i n v e n t i o n ,
enZyme p r o d u c t i o n
c o n t i n u e s
a t l e v e l s comparable t o serum
c o n t a i n i n g m e d i u m .
2 ) o t - L - l d u r o n i d a s e p r o d u c e d i n
a p r o
t e i n - f r e e m edi u m r e t a i n s a l e v e l of
r o d u c t i o n i n
e x c e s s of
4 mg e r l i t e r
o r
1 , 0 0 0 u n i t s p e r
m l . 3 ) o t - L - i d u r o n i d a s e
p r o d u c e d
i n
a p r o t e i n - f r e e
medium
h a s h i g h
u p t a k e
i n d i c a t
i n g t h a t t h e
s h i f t
i n
medium
a n d ,
h e n c e ,
a
s h i f t
i n
c a r b o h y
d r a t e s b e i n g f e d t o c e l l s ,
d o e s
n o t a d v e r s e l y a f f e c t t h e
h i g h
u p t a k e
c h a r a c t e r
o f
t h e
e n Z y m e .
E i g h t l o t s
o f o t - L - i d u
r o n i d a s e have been produced
and
r e l e a s e d i n
t h i s manner
W i t h
an u p t a k e
h a l f
maximal v a l u e o f l e s s t h a n 2
nM
n
a l l
l o t s .
2 .
The c u l t u r e c o n d i t i o n s a r e p r e f e r a b l y
maintained a t
a
d i s s o l v e d oxygen
of
40
f
i r s a t u r a t i o n a t a
pH
f a b o u t
6 . 8 - 7 . 0
and at a
t e m p e r at u r e o f a b o u t 3 5 - 3 7 0 C .
T h i s m a y be
a c h i e v e d
u s i n g a c o n t r o l u n i t , m o n i t o r i n g
u n i t
a n d a p p r o
p r i a t e p r o b e s s u c h a s t h o s e
p r o d u c e d b y
A p p l i k o n ® o r
M e t t l e r ® . H o W e v e r , s k i l l e d a r t i s a n s
W i l l
r e a d i l y a p p r e c i a t e
t h a t t h i s c a n
e a s i l y b e a c h i e v e d
by e q u i v a l e n t
c o n t r o l s y s
t e m s
p r o d u c e d
by
o t h e r m a n u f a c t u r e r s . An i r s a t u r a t i o n o f
a b o u t 4 0 %
r e s u l t s
i n
i m p r o v e d o t - L - i d u r o n i d a s e s e c r e t i o n
t h o u g h up t o 80 i r s a t u r a t i o n m a y
b e
u s e d .
HoWever,
f u r t h e r i n c r e a s e s
i n
oxygen
t o ,
f o r
e x a m p l e ,
9 0 %
a i r
s a t u
20
25
30
35
40
45
50
55
60
6 5
8
r a t i o n ,
d o n o t p r o v i d e s i g n i ? c a n t l y e n h a n c e d s e c r e t i o n
o v e r
8 0 % a i r
s a t u r a t i o n . The d i s s o l v e d
oxygen m a y b e
s u p p l i e d
by i n t e r m i t t e n t o r
c o n t i n u o u s
oxygen
s p a r g i n g u s i n g
a
5
m i c r o n s t a i n l e s s
s t e e l o r l a r g e r
o p e n i n g
s p a r g e r , o r e q u i v a
l e n t t h e r e o f . A
p H o f a b o u t
68-70
i s
o p t i m a l f o r
t h e
a c c u m u l a t i o n o f
t h e o t - L - i d u r o n i d a s e enZyme. The enZyme
i s p a r t i c u l a r l y u n s t a b l e
a t
pHs a b o v e a b o u t 7 . 0 .
BeloW
a
p H
o f
a b o u t
6 . 7 , t h e s e c r e t i o n r a t e may d e c r e a s e , p a r t i c u l a r l y
beloW a
pH
f a b o u t
6 . 5 .
The c u l t u r e i s t h e r e f o r e m a i n t a i n e d
o p t i m a l l y
betWeen a
p H
o f
a b o u t
6 . 8 - 7 . 0 .
3 .
The
p r o d u c t i o n c u l t u r e
m e d i u m
m a y
be
a modi?ed
f o r m
o f t h e c o m m e r c i a l l y
a v a i l a b l e
p r o p r i e t a r y medium
from JRH B i o s c i e n c e s c a l l e d
E x c e l l
PF CHO. T h i s medium
s u p p o r t s l e v e l s
o f s e c r e t i o n
e q u i v a l e n t t o
t h a t o f serum
s i n g
a c e l l
l i n e
such a s t h e 2 . 1 3 1 c e l l l i n e . I t m a y
be
p r e f e r a b l y
modi?ed o
i n c l u d e
an
a c i d i c
p H o f a b o u t 68-70 ( 1 0 . 1 ) ,
and
b u f f e r e d
With HEPES t
7 . 5 mM r 1 5 mM. The m e d i u m
m a y c o n t a i n
0 . 0 5
t o 0.1% of
P l u r o n i c s
F-68
(BASF),
a
n o n - i o n i c s u r f a c t a n t o r an e q u i v a l e n t t h e r e o f Which f e a t u r e s
t h e a d v a n t a g e
o f
p r o t e c t i n g
c e l l s
f r o m s h e a r f o r c e s a s s o c i
a t e d
W i t h
s p a r g i n g . The
m e d i u m
m a y
f u r t h e r
c o n t a i n a
p r o p r i e t a r y s u p p l e m e n t
t h a t
i s i m p o r t a n t i n
i n c r e a s i n g t h e
p r o d u c t i v i t y
o f
t h e
medium
o v e r
o t h e r p r o t e i n - f r e e
media
t h a t a r e
p r e s e n t l y a v a i l a b l e .
Those s k i l l e d i n
t h e a r t W i l l
r e a d i l y u n d e r s t a n d t h a t t h e
c h o i c e
o f c u l t u r e medium m a y e
o p t i m i Z e d c o n t i n u a l l y a c c o r d i n g t o p a r t i c u l a r c o m m e r c i a l
e m b o d i m e n t s a v a i l a b l e a t p a r t i c u l a r p o i n t s i n t i m e .
S u c h
c h a n g e s encompass
no m o re
t h a n
r o u t i n e e x p e r i m e n t a t i o n
and a r e i n t e n d e d
t o be
W i t h i n
t h e
s c o p e
of t h e
p r e s e n t
i n v e n t i o n .
4 .
The p r o d u c t i o n
medium may
b e a n a l y Z e d u s i n g a n
a m i n o a c i d
a n a l y z e r c o m p a r i n g s p e n t medium W i t h s t a r t i n g
medium. Such a n a l y s e s h a v e d e m o n s t r a t e d
t h a t
t h e 2 . 1 3 1
c e l l l i n e
d e p l e t e s a
s t a n d a r d
PF
CHO edium o f g l y c i n e ,
g l u t a m a t e
and
a s p a r t a t e t o a l e v e l o f around 1 0 % o f t h e
s t a r t i n g
c o n c e n t r a t i o n . S u p p l e m e n t a t i o n o f
t h e s e
a m i n o
a c i d s
t o
h i g h e r l e v e l s m a y e s u l t i n e n h a n c e d c u l t u r e d e n s i t y
a n d
p r o d u c t i v i t y
t h a t
m a y
l e a d
t o
a 2 - 3 f o l d h i g h e r
p r o d u c
t i o n
t h a n
a t b a s e l i n e . S k i l l e d
a r t i s a n s
W i l l a p p r e c i a t e
t h a t
o t h e r c e l l l i n e s W i t h i n t h e
s c o p e o f
t h e p r e s e n t i n v e n t i o n m a y
b e
e q u a l l y
u s e f u l
f o r
p r o d u c i n g o t - L - i d u r o n i d a s e a c c o r d i n g
t o t h e p r e s e n t
method. Hence,
m o re o r
l e s s
s u p p l e m e n t a l
n u t r i e n t s may b e
r e q u i r e d t o o p t i m i Z e
t h e
medium. Such
o p t i m i Z a t i o n s
a r e
i n t e n d e d t o be W i t h i n t h e s c o p e
of
t h e
p r e s e n t
i n v e n t i o n
a n d m a y b e p r a c t i c e d W i t h o u t u n d u e
e x p e r i m e n t a t i o n .
5 . The medium m a y b e s u p p l e m e n t e d W i t h t h e f o u r
r i b o n u c l e o s i d e s a n d f o u r
d e o x y r i b o n u c l e o s i d e s e a c h
a t
a b o u t 1 0
m g / l i t e r
t o
s u p p o r t t h e
d i h y d r o f o l a t e
r e d u c t a s e
d e ? c i e n t
c e l l
l i n e
2 . 1 3 1 . S k i ll e d a r t i s a n s W i l l a p p r e c i a t e t h a t
o t h e r c e l l l i n e s W i t h i n t h e
s c o p e o f
t h e p r e s e n t i n v e n t i o n m a y
b e
e q u a l l y u s e f u l
f o r
p r o d u c i n g o t - L - i d u r o n i d a s e a c c o r d i n g
t o
t h e
p r e s e n t
method. Hence,
m o r e
o r
l e s s r i b o n u c l e o s i d e s
a n d d e o x y r i b o n u c l e o s i d e s may b e
r e q u i r e d
t o
o p t i m i Z e t h e
medium,
a n d a l t e r n a t i v e s o u r c e s
o f
p u r i n e s a n d p y r m i d i n e s
f o r n u c l e i c a c i d
s y n t h e s i s
m a y e u s e d s u c h a s h y p o x a n t h i n e
a n d
t h y m i d i n e .
Such o p t i m i Z a t i o n s a r e
i n t e n d e d W i t h i n
t h e
s c o p e
o f
t h e p r e s e n t i n v e n t i o n
a n d m a y
b e
p r a c t i c e d W i t h o u t
u n d u e e x p e r i m e n t a t i o n .
6 . A f t e r r e a c h i n g c o n ? u e n c e a t a b o u t 3 - 6 d a y s o f u l t u r e ,
an
i n c r e a s i n g
r a t e o f c o n t i n u o u s p e r f u s i o n i s i n i t i a t e d . A
c h a n g e o f medium may
e
a c c o m p l i s h e d , f o r
e x a m p l e ,
u s i n g
a s l a n t
f e e d
t u b e
c o n s t r u c t e d
and
p o s i t i o n e d to a l l o W t h e
u p t a k e
o f
m e d i u m
i t h o u t removal o f t h e m i c r o c a r r i e r s e v e n
W h i l e t h e c u l t u r e i s s t i r r e d .
By
pumping o u t medium h r o u g h
t h e s l a n t f e e d
t u b e ,
m i c r o c a r r i e r s s e t t l e W i t h i n t h e
body
o f
t h e t u b e
i n s i d e
t h e
c u l t u r e
and a r e n o t removed from
t h e
8/10/2019 US 7,354,576-Nov 19
http://slidepdf.com/reader/full/us-7354576-nov-19 20/36
US
7 , 3 5 4 , 5 7 6
B2
9
c u l t u r e d u r i n g
t h e
c h a n g e
on medium.
I n
t h i s m a n n e r ,
t h e
m i c r o c a r r i e r s With t h e c e l l mass a r e s e p a r a t e d
fr o m
s u p e r
n a t a n t
c o n t a i n i n g t h e e n z y m e .
7 .
The r a p i d
a n d
f r e q u e n t
t u r n o v e r o f t h e
medium h a s
b e e n shown
b y
p r o d u c t i v i t y s t u d i e s t o r e s u l t i n
i m p r o v e d
o v e r a l l
c o l l e c t i o n
o f enZyme from t h e
c e l l
c u l t u r e . L e s s
t u r n o v e r o f
medium
r e s u l t s i n l e s s t o t a l
p r o d u c t i o n
o f
enZyme on
a
d a i l y b a s i s . Using t h e p e r f u s i o n o f
2 - 3 . 5
c u l t u r e
volumes p e r
d a y , t h e c e l l s
m a y
b e m a i n t a i n e d i n e x c e l l e n t
c o n d i t i o n
W i t h h i g h d e g r e e s
o f
v i a b i l i t y
a n d a
h i g h
l e v e l
o f
p r o d u c t i v i t y .
8 .
P r o d u c t i o n
o f
o t - L - i d u r o n i d a s e m a y
e e n h a n c e d
by t h e
u s e
o f s o d i u m b u t y r a t e i n d u c t i o n o f
g e n e
e x p r e s s i o n
( F I G .
3 ) . T W e n t y l o t s o f
o t - L - i d u r o n i d a s e
W e r e p r o d u c e d
u s i n g
b u t y r a t e i n d u c t i o n a t
2 nM
o n c e n t r a t i o n W i t h
2 / 3
Washout
e v e r y
1 2
h o u r s
a f t e r
i n d u c t i o n
and r e i n d u c t i o n
e v e r y
48
h o u r s f o r
a
2 1 - d a y p r o d u c t i o n
p e r i o d
i n F I G . 3 ,
t h e v e r t i c a l
a r r o W s a t t h e
bottom
i n d i c a t e
b u t y r a t e
i n d u c t i o n e v e n t s .
Each i n d u c t i o n t r i g g e r e d a b o o s t i n o t - L - i d u r o n i d a s e
con
c e n t r a t i o n i n t h e medium.
S y s t e m a t i c s t u d i e s o f a
2 . 1 3 1
c e l l l i n e d e m o n s t r a t e d t h a t
a b o u t
2 mM
u t y r a t e c a n be
a p p l i e d and
r e s u l t i n a b o u t
a
t W o - f o l d o r
g r e a t e r
i n d u c t i o n
o f
enZyme
p r o d u c t i o n
W i t h
m i n i m a l e f f e c t s on c a r b o h y d r a t e p r o c e s s i n g . LoWer e v e l s o f
b u t y r a t e have
n o t
been
shoWn t o
i n d u c e
a s
W e l l ,
and
s u b s t a n t i a l l y
h i g h e r
l e v e l s may r e s u l t i n
h i g h e r
i n d u c t i o n ,
b u t d e c l i n i n g a f f i n i t y o f t h e p r o d u c e d enZyme o r c e l l s
f r o m
p a t i e n t s s u f f e r i n g f r o m o t - L - i d u r o n i d a s e
d e ? c i e n c y . B u t y r a t e
i n d u c t i o n performed i n
v i t r o
a t 2 mM o r 24 h o u r s o r 5 mM,
a m o re
c o m m o n l y used
c o n c e n t r a t i o n r e s u l t e d
i n
u p t a k e s
i n
excess of 3 nM
r
40 U/ml, o r an
average
o f
h r e e
times t h e
v a l u e
o b s e r v e d i n
p r o d u c t i o n l o t s . I n a d d i t i o n , commonly
used t i m e s of 24 hours o r m o r e and c o n c e n t r a t i o n of
5
mM
Were t o x i c t o o t - L - i d u r o n i d a s e p r o d u c i n g
c e l l s
and r e s u l t e d
i n detachment
and
l o s s
of
c e l l
m a s s .
R e s u l t s s u g g e s t t h a t t W o - f o l d
o r
g r e a t e r i n d u c t i o n r e s u l t s
i n l e s s p r o c e s s i n g o f t h e c a r b o h y d r a t e s a n d l e s s p h o s p h a t e
a d d i t i o n
to
t h e
enZyme,
a s
W e l l
a s
i n c r e a s i n g
t o x i c i t y .
With
r e s p e c t
t o
c a r b o h y d r a t e p r o c e s s i n g
a n d t h e
a d d i t i o n o f
p h o s p h a t e
g r o u p s ,
t h e i m p o r t a n c e o f m a n n o s e - 6 - p h o s p h a t e
i n e n Z y m e r e p l a c e m e n t t h e r a p y i s d e m o n s t r a t e d b y t h e
o b s e r v a t i o n s t h a t
r e m o v a l
o f t h e p h o s p h a t e
o f
t W o
l y s o s o m a l
e n Z y m e s ,
g l u c o s i d a s e a n d
g a l a c t o s a m i n e
4 - s u l f a t a s e l e a d s t o
d e c r e a s e d
u p t a k e
( V a n d e r P l o e g , e t a l . , J . C l i n . I n v e s t . 8 7 :
5 1 3 - 5 1 8 ( 1 9 9 1 ) ;
C r a W l e y ,
e t a l . , J
C l i n . I n v e s t .
9 7 : 1 8 6 4
1 8 7 3 ( 1 9 9 6 ) ) . I n
a d d i t i o n , e n Z y m e W i t h l o W p h o s p h a t e
( V a n
H o v e , e t
a l . , P r o c .
N a t l .
A c a d .
S c i .
USA
9 3 : 6 5 - 7 0 ( 1 9 9 6 )
r e q u i r e s 1 , 0 0 0 u n i t s p e r
m l
f o r
u p t a k e
e x p e r i m e n t s ( n e a r l y
1 0 0
t i m e s
u s e d
f o r
i d u r o n i d a s e ) a n d e f f e c t i v e d o s e s i n
a n i m a l models r e q u i r e
1 4 m g / k g ,
o r 2 8
t i m e s
t h e d o s e u s e d
W i t h h i g h p h o s p h a t e c o n t a i ni n g i d u r o n i d a s e ( K i k u c h i , e t a l . ,
J .
C l i n . I n v e s t .
1 0 1 :
8 2 7 - 8 3 3 ( 1 9 9 8 ) ) .
One a r t i c u l a r l y
p r e f e r r e d a s p e c t
o f
t h e
i n v e n t i o n m e t h o d
u s e s
2 mM u t y r a t e a d d i t i o n e v e r y 48 h o u r s
t o t h e
c u l t u r e
s y s t e m .
T h i s
embodiment r e s u l t s i n a b o u t
a t W o - f o ld i n d u c
t i o n o f e n Z y m e p r o d u c t i o n u s i n g
t h i s
m e t h o d
W i t h o u t
s i g
n i ? c a n t e f f e c t o n t h e
u p t a k e
a f f i n i t y o f t h e enZyme
( K - u p t a k e
o f
l e s s t h a n 30 U/m l
o r
2 . 0 m M ) .
I n a
s e c o n d
a s p e c t , t h e
p r e s e n t
i n v e n t i o n p r o v i d e s a
t r a n s f e c t e d c e l l l i n e , W h i c h p o s s e s s e s t h e
u n i q u e
a b i l i t y t o
p r o d u c e o t - L - i d u r o n i d a s e
i n a m o u n t s ,
W h i c h e n a b l e
u s i n g
t h e
e n Z y m e
t h e r a p e u t i c a l l y .
I n p r e f e r r e d
e m b o d i m e n t s , t h e
p r e s e n t i n v e n t i o n f e a t u r e s a recom binant Chinese hamster
o v a r y c e l l l i n e s u c h a s t h e
2 . 1 3 1
c e l l l i n e
t h a t
s t a b l y
and
r e l i a b l y
p r o d u c e s
a m o u n t s o f o t - L - i d u r o n i d a se . I n
p r e f e r r e d
embodiments, t h e
c e l l l i n e
m a y
c o n t a i n
m o re t h a n
1 copy of
an e x p r e s s i o n c o n s t r u c t
comprising
a CMV
r o m o t e r ,
a
C O .
20
25
30
35
40
45
50
55
60
6 5
1 0
i n t r o n ,
a h u m a n
o t - L - i d u r o n i d a s e cDNA, and
a
bovine
groWth hormone p o l y a d e n y l a t i o n
s e q u e n c e .
I n even m o re
p r e f e r r e d
e m b o d i m e n t s , t h e c e l l l i n e e x p r e s s e s o t - L - i d u
r o n i d a s e
a t amounts
of
t l e a s t a b o u t
20-40
micrograms p e r
1 0 7 c e l l s p e r d a y
i n
a p r o p e r l y p r o c e s s e d , h i g h u p t a k e
f o r m
a p p r o p r i a t e
f o r
e n Z y m e
r e p l a c e m e n t
t h e r a p y .
A c c o r d i n g t o
p r e f e r r e d
e m b o d i m e n t s
o f t h i s a s p e c t o f t h e i n v e n t i o n , t h e
t r a n s f e c t e d c e l l l i n e a d a p t e d t o
p r o d u c e
o t - L - i d u r o n i d a s e
i n
a m o u n t s Which e n a b l e u s i n g t h e enZyme
t h e r a p e u t i c a l l y ,
possesses
one o r m o r e o f t h e folloWing
f e a t u r e s :
1 . The
e l l
l i n e
o f
p r e f e r r e d embodiments
s
d e r i v e d
from
a p a r e n t c e l l l i n e Wherein t h e
c e l l s
a r e
passaged
i n
c u l t u r e
u n t i l
t h e y
h a v e
a c q u i r e d
a s m a l l e r
s i Z e
a n d
more
r a p i d
g r o W t h r a t e a n d u n t i l
t h e y
r e a d i l y a t t a c h t o s u b s t r a t e s .
2 .
The
c e l l
l i n e
o f p r e f e r r e d embodiments
i s
t r a n s f e c t e d
W i t h a n
e x p r e s s i o n
v e c t o r c o n t a i n i n g
t h e
c y t o m e g a l o v i r u s
p r o m o t e r / e n h a n c e r
e l e m e n t ,
a 5 ' i n t r o n c o n s i s t i n g o f t h e
murine
C O . i n t r o n
betWeen
exons 2
and ,
a h u m a n cDNA f
a b o u t
2 . 2 kb i n l e n g t h , and
a
3 ' b o v i n e g r o W t h hormone
p o l y a d e n y l a t i o n
s i t e . T h i s e x p r e s s i o n
v e c t o r m a y b e t r a n s
f e c t e d
a t ,
f o r
e x a m p l e , a
50 to
1
r a t i o W i t h
a n y
a p p r o p r i a t e
common e l e c t i o n v e c t o r such a s pSV2NEO. he s e l e c t i o n
v e c t o r
pSV2NEO
n
t u r n c o n f e r s
G 4 1 8
r e s i s t a n c e
o n
s u c
c e s s f u l l y t r a n s f e c t e d
c e l l s . I n p a r t i c u l a r l y
p r e f e r r e d e m b o d i
m e n t s , a r a t i o of
a b o u t
50 t o
1 i s
used
s i n c e
t h i s r a t i o
e n h a n c e s
t h e a c q u i s i t i o n
o f
m u l t i p l e c o p y number i n s e r t s .
According
t o
one embodiment
Wherein
t h e
Chinese hams ter
o v a r y
c e l l l i n e 2 . 1 3 1 i s p r o v i d e d , t h e r e
i s
a t l e a s t 1 copy o f
t h e e x p r e s s i o n v e c t o r f o r o t - L - i d u r o n i d a s e . Such a c e l l l i n e
h a s
d e m o n s t r a t e d
t h e
a b i l i t y
t o
p r o d u c e l a r g e q u a n t i t i e s o f
human o t - L - i d u r o n i d a s e (minimum 2 0 m i c r o g r a m s p e r 1 0
m i l l i o n c e l l s p e r
d a y ) . P a r t i c u l a r l y
p r e f e r r e d
e m b o d i m e n t s
s u c h a s t h e 2 . 1 3 1
c e l l
l i n e p o s s e s s t h e a b i l i t y
t o
p r o d u c e
p r o p e r l y
p r o c e s s e d e n Z y m e t h a t c o n t a i n s N - l i n k e d o l i g o s a c
c h a r i d e s c o n t a i n i n g
h i g h
mannose c h a i n s
modi?ed
W i t h
p h o s p h a t e a t t h e 6 p o s i t i o n i n s u ? i c i e n t q u a n t i t y t o p r o d u c e
a n enZyme
W i t h h i g h a f ? n i t y
( K - u p t a k e o f l e s s t h a n
3 n M ) .
3 .
The enZyme
p r o d u c e d
from
t h e
c e l l l i n e s
o f
t h e p r e s e n t
i n v e n t i o n such a s
a
Chinese hams ter ovary
c e l l
l i n e
2 . 1 3 1
i s
r a p i d l y a s s i m i l a t e d
i n t o
c e l l s , e l i m i n a t e s g l y c o s a m i n o g l y c a n
s t o r a g e and h a s a
h a l f - l i f e
o f
a b o u t 5
d a y s
i n c e l l s from
p a t i e n t s
s u f f e r i n g f r o m o t - L - i d u r o n i d a s e d e ? c i e n c y .
4 . The e l l l i n e of r e f e r r e d embodiments such
a s
a 2 . 1 3 1
c e l l
l i n e
a d a p t s
t o l a r g e s c a l e c u l t u r e a n d s t a b l y p r o d u c e s
h u m a n
o t - L - i d u r o n i d a s e
u n d e r t h e s e c o n d i t i o n s . The e l l s o f
p r e f e r r e d
embodiments a r e
a b l e t o
groW
and s e c r e t e o t - L
i d u r o n i d a s e
a t
t h e
a c i d pH of a b o u t 6 . 6 t o
7 . 0
a t Which
enhanced accumulation of
o t - L - i d u r o n i d a s e
can
o c c u r .
5 .
P a r t i c u l a r l y p r e f e r r e d
e m b o d i m e n t s
o f t h e
c e l l l i n e
a c c o r d i n g
t o
t h e
i n v e n t i o n ,
such
a s
a 2 . 1 3 1 c e l l
l i n e
a r e a b l e
t o s e c r e t e
h u m a n
o t - L - i d u r o n i d a s e a t
l e v e l s e x c e ed i n g 2 , 0 0 0
u n i t s p e r m l ( 8
m i c r o g r a m s
p e r m l ) h a r v e s t e d t W i c e p e r d a y
o r
e x c e e d i n g
1 5
mg e r l i t e r o f
c u l t u r e
p e r
day
u s i n g a
s p e c i a l l y
f o r m u l a t e d
p r o t e i n - f r e e
m e d i u m .
I n a t h i r d a s p e c t , t h e p r e s e n t i n v e n t i o n p r o v i d e s n o v e l
v e c t o r s
s u i t a b l e t o produce o t - L - i d u r o n i d a s e i n amounts
W h i c h e n a b l e u s i n g
t h e e n Z y m e t h e r a p e u t i c a l l y .
T h e
p r o d u c
t i o n o f a d e q u a t e q u a n t i t i e s o f r e c o m b i n a n t
o t - L - i d u r o n i d a s e
i s a c r i t i c a l
p r e r e q u i s i t e f o r s t u d i e s o n
t h e
s t r u c t u r e
of
t h e
enZyme
a s
W e l l
a s f o r
enZyme
e p l a c e m e n t t h e r a p y . The e l l
l i n e s
a c c o r d i n g t o
t h e
p r e s e n t i n v e n t i o n p e r m i t
t h e p r o d u c
t i o n o f s i g n i ? c a n t q u a n t i t i e s o f r e c o m b i n a n t o t - L - i d u
r o n i d a s e
t h a t i s a p p r o p r i a t e l y p r o c e s s e d
f o r
u p t a k e . O v e r
e x p r e s s i o n i n
C h i n e s e h a m s t e r
o v a r y (CHO) c e l l s h a s b e e n
d e s c r i b e d f o r
t h r e e o t h e r
l y s o s o m a l
e n Z y m e s , o t - g a l a c t o s i
d a s e ( I o a n n o u , e t a l . ,
J
e l l . B i o l . 1 1 9 : 1 1 3 7 - 1 1 5 0 ( 1 9 9 2 ) ) ,
i d u r o n a t e
2 - s u l f a t a s e
( B i e l i c k i , e t
a l . ,
B i o c h e m . J . 2 8 9 :