University of Groningen

Aggregation properties of amphiphilic DNA-carriers for gene deliveryScarzello, Marco

IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite fromit. Please check the document version below.

Document VersionPublisher's PDF, also known as Version of record

Publication date:2006

Link to publication in University of Groningen/UMCG research database

Citation for published version (APA):Scarzello, M. (2006). Aggregation properties of amphiphilic DNA-carriers for gene delivery. s.n.

CopyrightOther than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of theauthor(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).

Take-down policyIf you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediatelyand investigate your claim.

Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons thenumber of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.

Download date: 20-10-2020

SAMENVATTING

AGGREGRATIE- EIGENSCHAPPEN VAN AMFIFIELE

DNA TRANSPORTMIDDELEN IN GENTHERAPIE

Genen zijn DNA segmenten welke de code bevatten die nodig is voor de biosynthese van

eiwitten (de ‘expressie’ van het gen), macromoleculen die een belangrijke rol hebben in een

groot aantal biologische structuren en essentieel zijn voor de levensfuncties. Fouten in deze

codes kunnen aanleiding geven tot de productie van eiwitten welke niet in staat zijn hun

normale functies te vervullen en aldus aanleiding kunnen geven tot het ontstaan van

genetisch bepaalde afwijkingen en ziektes. Gentherapie, als een mogelijke oplossing voor dit

probleem, berust op de introductie van een correcte copie van het defecte gen in de celkern

als vervanging van het incorrecte exemplaar. Daar veel eiwitten ook als medicijn worden

aangewend, wordt gentherapie ook gezien als een veelbelovende aanpak van afwijkingen

waarvoor geen (geschikte) medicatie bestaat.

Er is een groot aantal technieken ontwikkeld om een therapeutisch gen in de cellulaire

kern te introduceren, met name op virus gebaseerde methodes hebben een enorme vlucht

genomen maar, mede gezien de lage transfectiedoeltreffendheid en zwaarwegende risico’s

inzake de veiligheid, heeft gen- therapie (nog) niet de ontwikkeling doorgemaakt welke

verwacht was. Het werk dat in dit proefschrift gepresenteerd wordt levert een bijdrage aan

de wereldwijde pogingen (nieuwe) transportmethodologiën te ontwikkelen welke in staat

zijn deze bezwaren weg te nemen.

Amfifielen zijn moleculen die zijn opgebouwd uit een polaire (hydrofiele of

waterminnende) kopgroep en een apolaire (hydrofobe of vetminnende) staart, meestal een

lange alkylketen. Amfifiele moleculen zijn in staat om in water via een proces van zelf-

assemblage een grote varieteit aan macromoleculaire structuren te vormen. De

macromoleculare structuur, de morfologie, zal voor een groot deel worden bepaald door de

moleculaire geometrie van het amfifiel.

SAMENVATTING

160

Synthetische, kationische amfifielen worden algemeen gezien als veelbelovende

transportmiddelen voor de introductie van genetisch materiaal in de cellulaire kern. Ze

kunnen genen transfecteren en, na complexatie met het DNA (lipoplexvorming),

introduceren in de cel, hetgeen uiteindelijk tot de expressie van het gen kan leiden. Over het

algemeen worden ze gekenmerkt door een lage cytotoxiciteit en een relatief lage

doeltreffendheid van transfectie. Voor klinische toepassing zijn verbeteringen dus zeker

noodzakelijk.

Lipoplexen worden gevormd door DNA aan een vesiculaire oplossing van het kationische

amfifiel toe te voegen, dikwijls in combinatie met een electrisch neutraal (zwitterionisch)

‘helper’ lipide zoals bijvoorbeeld het fosfolipide dioleylfosfatidylethanolamine (DOPE). De

A B

C D

E F

A B

C D

E F

Figuur 1 Schematische weergave van enkele aggregaten van amfifielen: bolvormige (A) en worm-vormige

(B) micellen; lamellaire fases in een vlakke bilaag (C) en een vesiicle (D); een kubische fase (E)

en een geïnverteerde hexagonale fase (F).

SAMENVATTING

161

relevantie van de aggregatie-eigenschappen van de amfifiel-DNA complexen voor een

efficiente transfectie is reeds vroegtijdig gesignaleerd. Met name lipoplexen die een

geïnverteerde hexagonale morfologie (HII) onder fysiologisch relevante condities kunnen

vormen geven dikwijls aanleiding tot goede transfectieresultaten. Het helperlipide DOPE

beïnvloedt de doelmatigheid van de transfectie zeer waarschijnlijk door zijn eigen

moleculaire geometrie, welke de vorming van geïnverteerde hexagonale fases bevordert.

Het doel van de gepresenteerde studie is tevens inzage te verkrijgen in de correlaties

tussen de moleculaire transporterstructuur, de aggregatie-eigenschappen en de transfectie-

efficienties in het door de amfifielen gemedieerde gentransport en, uiteindelijk, de cellulaire

introductie van voornoemd gen. Een schematische weergave van het voorgestelde

mechanisme is gegeven in Figuur 2. Algemeen wordt verondersteld dat de vorming van een

geïnverteerde hexagonale fase een positieve invloed heeft op de transfectie omdat het de

endosomale ontsnapping van het gen bevordert, hetgeen de degradatie in een lysosoom

voorkomt.

Figuur 2 Schematische weergave van de kritische stappen in het transfectieproces: 1) vorming van het

lipoplex bij lage ionsterkte; 2) de oplossingscondities (pH, ionogene concentratie, etc) worden

aangepast tot fysiologisch relevante waarden; 3) het lipoplex treedt in interactie met het

celmembraan; 4) het lipoplex wordt opgenomen door de cel (dmv endocytose); 5) indien het

lipoplex blijft steken in het endosoom zal degradatie in een lysosoom plaatsvinden; 6) enkele

lipoplexen ontsnappen aan het endosoom en het DNA wordt afgegegeven aan het cytosol; 7)

het vrije DNA beweegt zich naar de celkern en wordt tot expressie gebracht na opname in de

celkern.

Nucleicacid

Cationicliposome

Lipoplex formationin H2O

Lipoplex at physiological conditions

(NaCl(aq) 150 mM)

Interaction withthe cell surface

Endocytosis

Early endosome

Lysosome:hydrolytic

degradation

Nucleus:transgene expression

-----

-

+++

+

+++

1 2

3

4

5

67

Nucleicacid

Cationicliposome

Lipoplex formationin H2O

Lipoplex at physiological conditions

(NaCl(aq) 150 mM)

Interaction withthe cell surface

Endocytosis

Early endosome

Lysosome:hydrolytic

degradation

Nucleus:transgene expression

-----

-

+++

+

+++

1 2

3

4

5

67

SAMENVATTING

162

Een vergelijkende studie naar de gedragingen van twee SAINT amfifielen (Figuur 3A,

SAINT-2 en SAINT-5), welke slechts verschillen in de mate van onverzadiging in de

alkylketens, wordt gepresenteerd in hoofdstuk 2. De aanwezigheid van een cis-dubbele

binding in de alkylketens van SAINT-2, dat een hogere transfectie efficientie geeft in

vergelijking met SAINT-5 en dan met name bij gebruik van DOPE als helper- lipide,

verhoogt de vloeibaarheid van de bilaag (door verstoring van de ketenpakking) en geeft

tevens aanleiding tot een volledig homogene menging met het helperlipide. Door deze

menging worden stabiele HII fases gevormd bij fysiologisch relevante ionsterkte.

De verkregen resultaten bieden een éénduidige verklaring voor de positieve invloed van

het gebruik van DOPE als helperlipide in de transfecties m.b.v. SAINT-2 in vergelijking met

SAINT-5. Deze conclusies zijn gebaseerd op gedetaileerde NMR studies; de combinatie van 2H en 31P NMR ‘broad-line’ experimenten, niet eerder gebruikt in een transfectie gerelateerde

context, boden de mogelijkheid om onafhankelijk het aggregatiegedrag van de N-

methylgedeutereerde kationische amfifilelen te bestuderen naast de gedragingen van het

helperlipide in de mengsels.

In hoofdstuk 3 worden de aggregatie eigenschappen van zes Sunfishamfifielen met

verschillende alkyl- ketens vergeleken. De afhankelijkheid van de menging met het

helperlipide en de neiging om HII fases te vormen als functie van de lipideketens zijn in

SpacerN N

Alky

lCha

in

Alky

lCha

in

Red

uced

Suga

r

Red

uced

Suga

r

A

B

C

N+

Alkyl chain Alkyl chain

N+

Alkyl chain

Alkyl chain

SpacerN N

Alky

lCha

in

Alky

lCha

in

Red

uced

Suga

r

Red

uced

Suga

r

A

B

C

N+

Alkyl chain Alkyl chain

N+

Alkyl chain

Alkyl chain

Figuur 3 Schematische weergave van de moleculaire structuren van de drie klassen van kationische

amfifielen welke zijn bestudeerd: SAINT (A); Sunfish (B) en suiker- gebaseerde gemini

amfifielen (C).

SAMENVATTING

163

overeenstemming met de resultaten gevonden voor de SAINT amfifilielen, ondanks de

significante verschillen in de moleculaire structuur. Bovendien blijkt dat ook de eerste

cruciale stap in het transfectie proces, de vorming van het lipoplex (Figuur 2) sterk

afhankelijk is van de aard van de alkylketens (lengte, aanwezigheid van onverzadiging etc).

Door de resultaten van de Langmuir-Blodgett film balans, gel retardatie electroforese, DSC

en DLS experimenten te combineren, bleek het mogelijk om te concluderen dat de optimale

lipolexvorming alleen maar kan worden bereikt met amfifielen die vloeibare

bilaagmorfologieën vormen in water. Dit is een sterke indicatie dat lange, verzadigde ketens

niet geschikt zijn als structuurelement in het ontwerp van efficiente transfectie- systemen. De

resultaten verkregen met de Sunfishamfifielen zijn aldus grotendeels in overeenstemming

met gegevens voor de SAINT amfifielen en literatuurdata, waar gesuggereerd wordt dat

genen in lipoplexen welke een HII morfologie kunnen aannemen onder fysiologische

condities betere transfectie-agentia zijn.

De op suiker gebaseerde gemini amfifielen welke het onderwerp van studie zijn in de

hoofdstukken 4 en 5, zijn een interessant voorbeeld van ‘smart-design’ moleculen, waarbij

een unieke combinatie van structuurelementen in één molecuul zijn samengebracht om

bepaalde/gewenste zelf-assemblerende eigenschappen te verkrijgen. De tertiaire amines in

de kopgroep van het molecuul induceren een sterk pH-afhankelijk morfologisch gedrag,

hetgeen endosomale ontsnapping van DNA fragmenten kan bevorderen (Figuur 2). De

suikergroepen hebben een tweeledige functie. Ten eerste verhogen ze de oplosbaarheid van

de amfifielen in water door de polariteit van de kopgroep te vergroten door hydratatie en

waterstofbrugvorming. Bij afwezigheid van een suikergroep of bij gebruik van zeer kleine

suiker- eenheden gedragen de moleculen zich als olie in plaats van dat ze het morfologisch

gedrag van een amfifiel vertonen (Hoofdstuk 5). Ten tweede worden suikers dikwijls

gebruikt in biomoleculaire herkenningsprocessen, hetgeen tot een hernieuwde interesse in

de fysisch-chemische eigenschappen van dit soort moleculen heeft geleid. Tot slot kunnen

variaties in de verbindingseenheid, de ’spacer’, aanleiding geven tot sterke veranderingen in

de aard van de aggregatie-eigenschappen door de beïnvloeding van de gemiddelde

doorsnede van het kopgroepoppervlak, het volume van het hydrofobe deel en de hydratatie-

eigenschappen in de nabijheid van de kopgroepen. In de Hoofdstukken 4 en 5 wordt ook het

zeer interessante pH-afhankelijke fasegedrag getoond en de wijze waarop dit gedrag kan

worden beïnvloed door verschillende externe condities zoals de ionsterkte, de toevoeging

van surfactanten met verschillende moleculaire geometrieën (Hoofdstuk 4), structurele

modificaties in de suikereenheden en de eigenschappen en de lengte van de spacereenheid

SAMENVATTING

164

(Hoofdstuk 5). Het onverwachte inhiberende effect van het helperlipide DOPE op de GS-1

geïnduceerde transfectie kan worden verklaard door recente resultaten waarbij een HI

morfologie (in plaats de HII morfologie) van het GS-1 lipoplex onder zwak zure condities

gevonden is. Deze resultaten suggeren dat de neiging om wormvormige micellen te vormen

afneemt in de aanwezigheid van DOPE. De waarneming dat lyso-PC en OTAC geen

positieve invloed hebben op de transfectie eigenschappen is eveneens in overeenstemming

met de resultaten welke gepresenteerd zijn in Hoofdstuk 4, daar deze micelvormende

additieven geen significante overgang naar wormvormige micellen bewerkstelligen. Zonder

de medische implicaties te kort te willen doen, is dit fasegedrag op zichzelf al interessant en

fascinerend. Uitzonderlijk intrigerend is de onverwachte ladings-omkering van de vesicles

onder basische condities, hetgeen een onderzoek waard was ondanks het gegeven dat de

condities verre van fysiologisch relevant zijn. De waarnemingen, verzameld in Hoofdstuk 5,

onderbouwen de hypothese dat het mechanisme van de OH- ion binding aan de GS vesicles

analoog is aan de OH- ion binding aan hydrofobe oppervlakken, namelijk dat het haar

oorsprong vindt in de preferentiële oriëntatie van de water moleculen in de eerste twee

hydratatielagen aan het oppervlak. Het gegeven dat de orientatie van de watermoleculen in

de nabijheid van een hydrofoob oppervlak overeenkomt met de situatie in de nabijheid van

een GS vesicle is echter contra-intuïtief, vanwege de aanwezigheid van polaire groepen op

het vesiculaire oppervlak. Een mogelijke verklaring is dat de preferentiële oriëntatie van

watermoleculen aan een oppervlak, benodigd voor OH- binding, aanwezig is als de

onderlinge interacties tussen water- moleculen sterk genoeg zijn in vergelijking met de

interacties van watermoleculen met de polaire delen aan het oppervlak. Als een gevolg

hiervan blokkeert de substantiële hydratatie Gibbsenergie van zwitterionische fosfolipiden

de OH- binding aan liposomen zoals experimenteel waargenomen. Het moet echter worden

opgemerkt dat moleculaire dynamica simulaties en verder experimenteel werk noodzakelijk

zijn om een definitief en gedetaileerd beeld te vormen van het preciese mechanisme van de

pH-geïnduceerde ladings- omkering van de suiker-gebaseerde GS vesicles.

Een interessant fenomeen dat sommige materialen uit de drie klassen van amfifielen

vertonen en, dat niet is waargenomen in eerdere studies, betreft de ongebruikelijke vorming

van kubische fasen in de aanwezigheid van een overmaat aan water. Door de hoge

biocompatibiliteit van de SAINT, Sunfish en suiker-gebaseerde gemini surfactanten, kan

verder onderzoek naar de vorming van stabiele dispersies van deze kubische fases

aanleiding geven tot belangrijke toepassingen van deze verbindingen op het gebied van de

gecontroleerde medicijnafgifte.

RIASSUNTO

PROPRIETÁ DI AGGREGAZIONE DI VETTORI

ANFIFILICI DI DNA PER LA TERAPIA GENICA

I geni sono segmenti di DNA che codificano le informazioni necessarie agli organismi

viventi per la biosintesi di proteine (‘’espressione’’ del gene), macromolecole che svolgono

un ruolo essenziale in una varietá di strutture biologiche e in funzioni vitali fondamentali.

Errori in questi codici possono portare alla produzione di proteine che sono incapaci di

svolgere la loro normale funzione e causare malattie genetiche. Il principio della terapia

genica consiste nell’introduzione nel nucleo cellulare di una copia corretta del gene difettivo,

al fine di eradicare le cause della malattia genetica. Inoltre, dal momento che molte proteine

possono agire come farmaci, la terapia genica é considerata un vantaggioso e promettente

approccio anche per la cura di malattie acquisite.

Nonostante siano state sviluppate diverse tecnologie (in particolare basate su vettori virali)

atte all’introduzione di un gene terapeutico nel nucleo cellulare, i requisiti di efficienza e

sicurezza necessari per fare della terapia genica un potente strumento medico non sono stati

ancora raggiunti. Il lavoro presentato in questa tesi é un contributo allo sforzo globale che

mira alla realizzazione di tecnologie di trasferimento genico che soddisfino questi requisiti.

Le molecole anfifiliche (o surfattanti) contengono una parte polare (idrofilica), chiamata

‘’testa’’, e una apolare (idrofobica), che generalmente é costitutita da lunghe catene alchiliche.

Le molecole anfifiliche si aggregano in acqua per formare una varietá di strutture (Figura 1),

con morfologie che dipendono dalla geometria molecolare complessiva.

Surfattanti cationici sintetici sono considerati promettenti candidati per il trasferimento di

geni in applicazioni biomediche, dal momento che sono in grado di indurre trasfezione del

gene, i.e. una volta che il complesso surfattante-DNA (lipoplesso) é formato, sono in grado di

trasferire i geni all’interno delle cellule e di indurne l’espressione. Spesso i lipoplessi

RIASSUNTO

166

presentano basse citotossicitá. Tuttavia, l’efficienza di questi sistemi é, a tuttoggi,

insoddisfacente.

I lipoplessi sono in genere preparati aggiungendo DNA ad una dispersione vescicolare del

surfattante cationico, spesso in combinazione con un ‘’lipide ausiliario’’ elettricamente

neutro (come, ad esempio, il fosfolipide zwitterionico DOPE). L’importanza delle proprietá

di aggregazione dei vettori anfifilici di DNA per un’efficiente trasferimento di geni é nota da

tempo. In particolare, geni in lipoplessi che possono assumere una morfologia esagonale

inversa (HII) in condizioni fisiologiche presentano efficienze di trasfezione piu’elevate.

Probabilmente, il ‘’lipide ausiliario’’ DOPE migliora l’efficienza di trasfezione poiché, a cause

della sua geometria molecolare, favorisce la fomazione di fasi esagonali inverse.

A B

C D

E F

A B

C D

E F

Figura 1 Rappresentazione schematica di aggregati anfifilici: micella sferica (A) e cilindrica (B); fase lamellare nella forma di un doppio strato (C) e di una vescicola (D); una fase cubica (E); e una fase esagonale inversa (F).

RIASSUNTO

167

Scopo del presente studio é stato la determinazione di ulteriori correlazioni tra le strutture

molecolari dei vettori anfifilici, le loro proprietá di aggregazione e le rispettive efficienze di

trasfezione.

In Figura 2 é riportata una rappresentazione schematica del meccanismo di trasferimento

di geni mediato da molecole anfifiliche. É stato ipotizzato che la formazione di fasi esagonali

inverse favorisca la trasfezione del gene in quanto questa morfologia faciliterebbe il suo

rilascio dall’ endosoma, prevenedone la degradazione nel lisosoma.

Nel Capitolo 2 é descritto uno studio comparativo condotto su due molecole anfifiliche

appartenenti alla famiglia dei SAINT (Figura 3A), SAINT-2 e SAINT-5, che differiscono

solamente per il grado di insaturazione delle catene alchiliche.

I risultati dimostrano che la presenza di un doppio legame cis nelle catene alchiliche di

SAINT-2, che presenta una maggiore efficienza di trasfezione rispetto a SAINT-5, in

particolare in combinazione con il lipide ausiliario DOPE, non solo aumenta la fluiditá del

Figura 2 Rappresentazione schematica dei passaggi critici nel processo di trasfezione: (1) il lipoplesso é preparato in condizioni di bassa forza ionica; (2) pH e forza ionica sono aggiustati a valori fisiologici; (3) il lipoplesso interagisce con la membrana cellulare; (4) il lipoplesso entra nella cellula, generalmente via endocitosi; (5) quando rimane intappolato nell’endosoma, il lipoplesso viene degradato nel lisosoma; (6) alcuni lipoplessi vengono rilasciati dall’ endosoma; (7) il DNA raggiunge il nucleo dove puo’essere espresso.

Nucleicacid

Cationicliposome

Lipoplex formationin H2O

Lipoplex at physiological conditions

(NaCl(aq) 150 mM)

Interaction withthe cell surface

Endocytosis

Early endosome

Lysosome:hydrolytic

degradation

Nucleus:transgene expression

-----

-

+++

+

+++

1 2

3

4

5

67

Nucleicacid

Cationicliposome

Lipoplex formationin H2O

Lipoplex at physiological conditions

(NaCl(aq) 150 mM)

Interaction withthe cell surface

Endocytosis

Early endosome

Lysosome:hydrolytic

degradation

Nucleus:transgene expression

-----

-

+++

+

+++

1 2

3

4

5

67

RIASSUNTO

168

doppio-strato lipidico (perturbando l’impaccamento delle catene), ma ne favorisce anche il

mescolamento omogeneo con DOPE. Inoltre, il mescolamento omogeneo di SAINT-2 con il

‘’lipide ausiliario’’ porta alla formazione di un fase esagonale inversa, stabile in condizioni

fisiologiche di forza ionica.

I risultati ottenuti forniscono una chiara spiegazione del maggiore effetto di DOPE nel

trasferimento di geni mediato da SAINT-2, rispetto a quello mediato da SAINT-5. Queste

conclusioni sono state raggiunte mediante un dettagliato studio di NMR. La combinazione di

esperimenti di 2H- e 31P- broad-line NMR, mai usata prima in un contesto di trasfezione, ha

fornito la possibilitá di monitorare indipendentemente il comportamento di aggregazione

del composto cationico anfifilico N-metil-deuterato e del ‘’lipide ausiliario’’, rispettivamente,

nelle loro misture.

Nel Capitolo 3 sono state confrontate le proprietá di aggregazione di sei molecole

anfifiliche Sunfish (Figura 3B), caratterizzate da diverse catene alchiliche. La dipendenza del

mescolamento con il ‘’lipide ausiliario’’ dalla struttura delle catene alchiliche e della

tendenza a formare fasi esagonali inverse é stata confermata dai dati ottenuti su questa

seconda classe di vettori anfifilici. Inoltre, i risultati provano che anche il primo passaggio

critico del pocesso di trasfezione, la formazione del lipoplesso (Figura 2), dipende in maniera

critica dalla natura delle catene alchiliche. Combinando i risultati da misure di Langmuir-

Blodgett film balance, gel-elettroforesi, DSC e DLS, abbiamo potuto concludere che la

SpacerN N

Alky

lCha

in

Alky

lCha

in

Red

uced

Suga

r

Red

uced

Suga

r

A

B

C

N+

Alkyl chain Alkyl chain

N+

Alkyl chain

Alkyl chain

SpacerN N

Alky

lCha

in

Alky

lCha

in

Red

uced

Suga

r

Red

uced

Suga

r

A

B

C

N+

Alkyl chain Alkyl chain

N+

Alkyl chain

Alkyl chain

Figura 3 Rappresentazione schematica delle strutture molecolari delle tre classi di surfattanti oggetto di questo studio: SAINT (A); Sunfish (B); surfattanti gemini a base di zucchero (C)

RIASSUNTO

169

formazione ottimale di lipoplessi avviene esclusivamente se le molecole anfifiliche sono in

grado di formare doppi-strati fluidi in acqua. Lunghe catene alchiliche insature non sono

quindi elementi strutturali addatti per ottenere alte efficienze di trasfezione. In accordo con i

risultati ottenuti per le molecole SAINT e con dati di letteratura, lo studio condotto sulle

molecole Sunfish ha confermato che geni in lipoplessi che possono assumere un morfologia

HII in condizioni fisiologiche presentano efficienze di trasfezione piu’elevate.

I surfattanti gemini a base di zucchero (Figura 3C), descritti nei Capitoli 4 e 5, sono un

esempio particolarmente interessante di design molecolare ‘’intelligente’’, nel quale una

combinazione unica di elementi strutturali viene utilizzata per ottenere aggregati con le

proprietá desiderate. I gruppi amminici terziari nella testa del surfattante conferiscono un

comportamento di aggregazione che dipende dal pH, caratteristica che dovrebbe favorire il

rilascio del materiale genetico dall’endosoma (Figura 3). Gli zuccheri hanno una duplice

funzione. In primo luogo aumentano la solubilitá della molecola anfifilica in acqua,

aumentando la polaritá della testa e favorendone l’idratazione via legami ponte idrogeno. In

fatti, in assenza di zucchero o in presenza di zuccheri corti nella molecola, i composti

elettricamente neutri si comportano come olii e non come molecole anfifiliche (vedi Capitolo

5). Inoltre, l’importanza dei carboidrati in processi di riconoscimento biomolecolare é stata

riconosciuta e ha stimolato un rinnovato interesse nello studio della chimica fisica-organica

di questi composti. In fine, variazioni nello spaziatore consentono di modificare le

caratteristiche di aggregazione variando l’area effettiva della testa e l’idratazione in

prossimitá della testa. I Capitoli 4 e 5 mostrano come il ricco comportamento di fase di

surfattanti gemini a base di zucchero possa essere modificato variando le condizioni di forza

ionica, aggiungendo surfattanti caratterizzati da diverse geometrie molecolari (Capitolo 4) o

apportando variazioni agli zuccheri o alla natura o lunghezza dello spaziatore (Capitolo 5).

L’inattesa inibizione della trasfezione mediata da surfattanti gemini a base di zucchero ad

opera del ‘’lipide ausiliario’’ DOPE puo’essere spiegata alla luce di recenti scoperte

riguardanti la morfologia HI (invece di HII) del lipoplesso formato da GS1 in condizioni

leggermente acide. In fatti, i risultati presentati nel Capitolo 4 dimostrano che la tendenza

alla formazione di micelle cilindriche é diminuta in presenza di DOPE. Inoltre, anche l’

osservazione che lyso-PC e OTAC non favoriscono la trasfezione é consistente con i dati

presentati nel Capitolo 4, poiché l’aggiunta di questi additivi non favorisce

significativamente la transizione verso micelle cilindriche.

Anche senza considerare le applicazioni biomediche, le transizioni di fase dei surfattanti

gemini a base di zucchero sono estremamente interessanti e affascinanti per se.

RIASSUNTO

170

Particolarmenti intrigante é l’inaspettata inversione di carica osservata per le vescicole in

condizioni basiche, fenomeno che abbiamo voluto studiare ulteriormente, nonstante avvenga

in condizioni che non sono immediatamente rilevanti per il processo di trasfezione. Le

osservazioni raccolte nel Capitolo 5 supportano l’ipotesi che il meccansimo con il quale gli

ioni OH- si legano a vescicole di GS sia analogo a quello con il quale ioni OH- si legano a

superfici idrofobiche, i.e. che il fenomeno derivi dall’orientazione preferenziale delle

molecole d’acqua nei primi due strati di idratazione della superficie. Il fatto che

l’orientazione delle molecole d’acqua in prossimitá di una superficie idrofobica e in

prossimitá della superficie di una vescicola di GS siano simili é contro-intuitivo, a causa della

presenza di gruppi polari sulla superficie vescicolare. Una possibile spiegazione per questa

analogia é che l’orientazione preferenziale dell’acqua richiesta per l’adsorbimento di ioni

OH- sia presente quando le interazioni tra le molecole d’acqua sono sufficientemente forti

rispetto alle interazioni delle molecole d’acqua con i siti polari presenti sulla superficie.

Consistentemente, la sostanziale energia di Gibbs per l’idratazione di fosfolipidi

zwitterionici impedisce l’adsorbimento di ioni OH-. Tuttavia, per ottenere un’immagine

dettagliata e definitiva del meccanismo di inversione di carica indotto dal pH in vescicole di

GS a base di zucchero, simulazioni di dinamica molecolare e ulteriore lavoro sperimentale

sembrano necessari.

Un’interessante caratteristica di alcuni membri delle tre classi di composti anfifilici

descritte in questa tesi, che non era stata notata in studi precedenti, consiste nella inusuale

formazione di fasi cubiche in presenza di acqua in eccesso. A causa dell’elevata

biocompatibilitá dei composti SAINT, Sunfish e dei surfattanti gemini a base di zucchereo,

ulteriore ricerca sulla possibilitá di ottenere dispersioni stabili di queste fasi cubiche potrebbe

portare a importanti applicazioni di questi composti nel campo della somministrazione

controllata di farmaci.