UNIVERSIT DU QUBEC MONTRAL

RGULATION DE LA SYNTHTASE DES ACIDES GRAS PAR L'INSULINE

ET LA T3 : MISE EN VIDENCE DE L'ACTION GNOMIQUE ET NON

GNOMIQUE DE LA T3

MMOIRE

PRSENT

COMME EXIGENCE PARTIELLE

DE LA MATRISE EN BIOLOGIE

PAR

ANNE RADENNE

Novembre 2008

UNIVERSIT DU QUBEC MONTRAL Service des bibliothques

Avertissement

La diffusion de ce mmoire se fait dans le respect des droits de son auteur, qui a sign le formulaire Autorisation de reproduire et de diffuser un travail de recherche de cycles suprieurs (SDU-522 - Rv.01-2006). Cette autorisation stipule que conformment l'article 11 du Rglement no 8 des tudes de cycles suprieurs, [l'auteur] concde l'Universit du Qubec Montral une licence non exclusive d'utilisation et de publication de la totalit ou d'une partie importante de [son] travail de recherche pour des fins pdagogiques et non commerciales. Plus prcisment, [l'auteur] autorise l'Universit du Qubec Montral reproduire, diffuser, prter, distribuer ou vendre des copies de [son] travail de recherche des fins non commerciales sur quelque support que ce soit, y compris l'Internet. Cette licence et cette autorisation n'entranent pas une renonciation de [la] part [de l'auteur] [ses] droits moraux ni [ses] droits de proprit intellectuelle. Sauf entente contraire, [l'auteur] conserve la libert de diffuser et de commercialiser ou non ce travail dont [il] possde un exemplaire.

REMERCIEMENTS

Je souhaite tout d'abord remercier ma directrice de recherche Catherine Mounier. Un

grand merci, puisque c'est toi qui m'as vraiment donn l'envie de faire de la

recherche lors de mon premier stage, cela fait dj quelques annes. J'ai

normment appris sous ta direction, tu nous as appris tre autonome tout en

restant disponible pour nos questions.

Et puis nous allons remettre a pour une paire d'annes encore!!!!

Un grand merci toute l'quipe du laboratoire: toutes les personnes qui ont travaill

sur le projet FAS, Caroline, Sabine et Murielle, sans oublier l'quipe SCD, Daniel,

Michle, Omar et Gab.

Merci, aux professeurs Julie Lafond, Benot Barbeau, Eric Rassart et Franois

Dragon pour le prt du materiel, cela nous a beaucoup aid.

Merci tous mes amis et collgues du 3 me tage pour vos conseils et votre aide.

Pardonnez moi de ne pas vous nommez un un mais vous tes assez nombreux.

Et puis bien sr, merci mille fois mes parents qui m'ont toujours soutenu dans mes

projets. Je sais que a n'a pas t facile pour vous de me laisser partir aussi loin!

--------------------------

TABLE DES MATIRES

LISTE DES FIGURES Vl

LISTE DES ABRVIATIONS, SIGLES ET ACRONYMES Vlll

AVANT-PROPOS XII

RSUM XIV

INTRODUCTION _

CHAPITRE l 3

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE

1.1 Mtabolisme des acides gras 3

1.1.1 Origine des acides gras 4

1.1.2 Synthse de novo des acides gras 4

\.1.3 Transformations mtaboliques des acides gras 7

1.1.4 Lieux de synthse des acides gras de novo 8

\.1.5 Rgulation de la lipogense 9

1.1.5.1 Rgulation nutritionnelle de la lipogense 9

1. 1.5.2 Rgulation hormonale de la lipogense 9

).2 Le complexe de l'acide gras synthase 1l

\.2.\ Organisation structurelle Il

1.2.2 Ractions effectues par la FAS 12

1.2.3 Le gne FAS et sa rgion promotrice ]4

1.2.4 Expression tissulaire de la FAS 16

1.3 Rgulation de l'expression de la FAS ]6

1.3.1 Rgulation hormonale de la FAS 17

---------

IV

1.3.1.1 Rgulation de la FAS par la T3 _ 17

1.3.1.1.1 Synthse des hormones thyrodiennes _ 17

1.3.1.1.2 Mcanisme gnral d'action des hormones thyrodiennes _ 20

1.3.1.1.3 Les rcepteurs aux hormones thyrodiennes _ 22

1.3.1.1.4 Modulation du mcanisme d'action des TRs 25

1.3.1.1.5 Modifications posttraductionnelles des TRs _ 27

1.3.1.1.6 Action non gnomique des THs _ 29

1.3.1.1.7 Le TRE sur le promoteur FAS _ 30

1.3.1.2 Rgulation de la FAS par l'insuline _ 31

1.3.2 Rgulation nutritionnelle de la FAS _ 33

1.3.2.1 Rgulation de la FAS par le glucose _ 33

1.3.2.2 Rgulation de la FAS par les PUFAs _ 34

1.3.2.3 Rgulation de la FAS par les MCFAs _ 34

CHAPITRE II 36

ARTICLE SCIENTIFIQUE

2.] Abstracts 38

2.2 Introduction 39

2.3 Materials and methods 42

2.3.1 Materials 42

2.3.2 Plasmid constructs 42

2.3.3 Cell culture and transfection 43

2.3.4 FAS activity 43

2.3.5 Analysis of mRN A expression level 44

2.3.6 Analysis ofpromoter activity 45

2.3.7 Gel electromobility shift assay 45

2.3.8 Western blot 45

2.4 Results 47

2.4.1 Role ofT3 and insulin on FAS enzymatic activity, protein and mRNA level __ 47

2.4.2 Effects of insulin and T3 at the transcriptionnallevel 47

2.4.3 Role ofphosphorylation in the regulation offAS 49

2.4.4 Role of the PB-kinase and Erkl/2 MAPK pathways in the regulation ofFAS in

response to T3 and insulin 49

v

2.5 Discussion 52

2.6 References 57

2.7 Figure legends 68

CHAPITRE II! 83

DISCUSSION

CONCLUSION 90

REFERENCES 91

LISTE DES FIGURES

Figure 1.1: Principales tapes de la synthse de novo des acides gras 6

Figure 1.4: Comparaison des squences promotrices du gne FAS de l'humain,

Figure 1.8: Comparaison des diffrentes isoformes des rcepteurs aux honnones

Figure 1.10: Reprsentation shmatique du domaine en doigts de zinc localis

Figure 1.12: Shma rcapitulatif du mcanisme d'action gnomique et non

Figure 2.1: Effects ofT3 and insulin on FAS enzymatic activity,protein and

Figure 2.3: Mobility shift assays using the fragment Jocated between

Figure 2.4: Role of phosphorylation in the regulation of FAS activity and

Figure 2.5: Effects ofLY294002 and PD98059 on FAS activity and

Figure 1.2: Famille des acides gras polyinsaturs 8

Figure 1.3: Le complexe de l'acide gras synthase 13

de la souris, du rat, du poulet et de l'oie. 15

Figure 1.5: La synthse des hormones thyrodiennes 19

Figure 1.6: Modle gnral d'action des hormones thyrodiennes 21

Figure 1.7: Organisation des diffrents TREs 21

thyrodiennes 23

Figure 1.9: Structure gnrale des rcepteurs nuclaires 24

sur le TR~ humain 25

Figure 1.11 : Modle molculaire de la rpression basale en absence de T3 et de

l'activation de la transcription en prsence de T3 27

gnomique des THs 30

mRNA levels 73

Figure 2.2: Localization of the TRE on the goose FAS gene promoter 74

-732 and -692 bp of the goose FAS gene 75

transcription in response to T3 and insulin treatments 76

VII

TRE-mediated transcription in response to T3 and insulin treatments 78

Figure 2.6: Effect ofT3and insulin on the level of Erk1l2 MAPK

Figure 2.7: Effect ofPD98059, U0126 and LY294002 on T3 and

Figure 2.9: Shematic representation of the FAS transcriptional regulation

phosphorylation 79

insulin-induced Erk1/2 MAPK phosphorylation 80

Figure 2.8: Effect ofT3 and insulin on the leveJ of Akt phosphorylation 81

in response to T3 and insulin 82

LISTE DES ABRVIATIONS, SIGLES ET ACRONYMES

ACC: Acetyl-coA carboxylase

ACP: Acyl carrier protein

ADN: Acide dsoxyribonuclique

AGRP: Agouti-related peptide

AMPc: Adnosine monophosphate cyclique

AMPK : AMP Kinase

ARNm: Acide ribonuclique messager

ATF2: Activating transcription factor 2

CART: cocaine-amphetamine related transcript

CBP: CREB Binding protein

CEH: Chick embryo hepatocytes

ChIP: Chromatin Immunoprecipitation

ChREBP: Carbohydrate Responsive Element Binding Prote in

CPT-1: Carnitine palmitoyl transfrase

DBD: DNA binding domain

DIT: Diiodo-tyrosine

DR4: Direct Repeat 4

DRlPs: Vitamin D receptor interacting proteins

eNOS: Endothelialnitric oxide synthase

IX

ERK: Extracellular signal regulated kinase

GH: Growth Hormone

GPCR: Gprotein-coupled receptor

HAT: Histone acetyltransferase

HDAC: Histone deacetylase

HDL: High density lipoprotein

HPRT-1: Hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1

IP: Invert palindrome

IMC: Indice de masse corporel

IR: Insulin receptor

IRE: Insulin response element

IRS : Insulin Receptor substrate

Kpb: Kilo paire de base

kD: Kilo Dalton

LBD: Ligand binding do main

MAPK: Mitogen activated protein kinase

MCFA: Medium chainfattyacid

ME: Malic enzyme

MEK: Map-erk kinase

MIT: Monoiodo-tyrosine

mTOR: Mammalian targe/ ofrapamycin

x

NAOPH: Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate

NCor: Nuclear co-repressor

NF-Y: Nuclearfaclor Y

OMS: Organisation mondiale de la sant

Pal: Palindrome

pb: Paire de base

POK 1 : Pyruvate dehydrogenase kinase l

PCAF: p300 CBP associaledfaclor

PKA: ProIein kinase A

PKB: ProIe in kinase B

PKC: ProIe in kinase C

PB-Kinase: Phosphatidyl-inositol-3 phosphate kinase

PIP2: Phosphoinositol di-phosphate

PIP3: Phosphoinositol tri-phosphate

POMC: Pro-opiomelanocorlin

PUFA: Polyunsaluraledfalty acid

SCAP : SREBP cleaving-activating prolein

SCO : Stearyl-CoA dsaturase

SFI: Sleroidogenicfaclor-i

SMRT: Sifencing mediator ofRAR and TR

SRC: Sleroid receplor co-activators

Xl

SRE: Sterol response element

SREBP-I: Sterol response element binding protein 1

rT3: Reverse T3

STAT: Signal Transducers and Activator ofTranscription

RT: Reverse transcriptase

RXR: Retinoid X receptor

T3: Triiodothyronine

T4: Thyroxine

Tg: Thyroglobuline

TH: Thyroid hormone

TK: Thymidine kinase

TRAPs: TR-associated proteins

TRE: T3 response element

USf: Upstream stimulatory factors

VLOL: Very low density lipoprotein

AVANT-PROPOS

1. Contribution de l'tudiant l'exprimentation et la rdaction.

o Ce qui a t ralis par l'tudiante ./ Les transfections et les mesures des activits CAI

./ Les expriences d' immunobuvardage

./ Les expriences de retards sur gel

./ La mise au point des RI-PCR FAS

./ Participation la rdaction de l'article scientifique

~ Ce qui n'a pas t ralis par l'tudiante

x La localisation du IRE

x Les clonages du IRE, DR4 et 1,6FAS dans diffrents vecteurs

x La mesure des activits FAS

2. Liste des auteurs de l'article scientifique

Raderme A, Akpa M, Martel C, Sawadogo S, Mauvoisin D et Mounier C

3. Statut de la publication

Article accept dans American Journal of Physiology-Endocrino1ogy and

Metabolism.

2008 Oct; 295(4):E884-94. Epub 2008 Aug 5.PMID: 18682535

[PubMed - in process]

Xlll

4. Autres travaux raliss par l'tudiante pendant la matrise

Raie of the PI3-kinase1nTOR pathway in the regulation of stearayl CoA desaturase

(SCD1) gene expression by insulin in liver.

Mauvoisin D, Rocque G, Arfa 0, Radenne A, Boissier P, Mounier C.

] Cell Commun Signal. 2007 Sep;I(2):113-25. Epub 2007 Oct 6.

PMID: 18481202 [PubMed - in process]

o Ce gui a t ralis par l'tudiante ./ Les expriences de retard sur gel

RSUM

La synthtase des acides gras (FAS) est une enzyme clef de la lipogense hpatique responsable de la synthse des acides gras saturs longue chane. Cette enzyme est rgule au niveau transcriptionel par les nutriments et les honnones. Ainsi, le glucose, l'insuline et la T3 augmentent son activit alors que les acides gras moyennes chnes (MCFAs), les acides gras poly-insaturs (PUFAs) et le glucagon la diminuent. Dans des cellules hpatiques, nous avons mis en vidence que la T3 et l'insuline taient capables d'activer de faon synergique l'activit enzymatique et le niveau d'expression des ARNm de la FAS (14 fois). L'analyse du promoteur a pennis de dmontrer que cette activation tait aussi transcriptionnelle. Par la suite l'lment de rponse la T3 (TRE) a t localis dans la rgion promotrice du gne FAS. Ce TRE fixe un htrodimre TRlRXR en absence d'honnone et cette fixation est augmente en prsence d'insuline et/ou de T3. L'utilisation de H7, un inhibiteur gnral des serines/thronines kinases, nous a pennis de mettre en vidence que des mcanismes de phosphorylation sont impliqus dans la rgulation transcriptionelle de la FAS par ces deux hormones. En fait, nous avons dmontr que la voie de signalisation cellulaire PI3Kinase/ERK1I2-MAPK est implique dans la rgulation de la FAS par la T3 via le TRE. De plus, nous avons aussi mis en vidence un effet de l'insuline sur ce TRE qui impliquerait la mme voie de signalisation ainsi qu'une voie qui pourrait aussi impliquer Akt. Les mmes effets non gnomiques de la T3 et de l'insuline sont aussi observs au niveau d'un TRE consensus de type DR4. En conclusion, nos rsultats suggrent que la T3 rgule la transcription par un mcanisme d'action la fois gnomique et non gnomique impliquant la voie PI3Kinse/MAPK et que l'insuline est aussi capable de cibler ce TRE par des voies de signalisation spcifiques.

Mots cls: FAS, T3, Insuline, PI3-Kinase, Erk1l2-MAPK

INTRODUCTION

Le surpoids et l'obsit ne cessent de progresser dans le monde.

L'organisation mondiale de la sant (OMS) utilise le terme de globsit pour

dsigner la pandmie croissante d'obsit. D'aprs l'OMS, plus de 1 milliard

d'adultes prsentent un excs de poids et au moins 300 millions d'entre eux sont

obses. Aux Etat-Unis, 30% des amricains sont obses et plus de 65% prsentent

une surcharge pondrale. La situation au Canada n'est gure plus rjouissante (45%

de la population prsente un surpoids). Cet excs de poids est principalement due

une modification du rgime alimentaire dont une augmentation du ratio calorique et

notamment une augmentation de l'apport en graisse, en sel et en sucre. De plus,

l'augmentation gnrale de la sdentarit amplifie ce phnomne. Ces kilos superflus

constituent une vritable menace pour la sant. L'augmentation de l'indice de masse

corporelle est un facteur de risque majeur pour le dveloppement des maladies

cardiovasculaires, le diabte de type 2 ainsi que certains types de cancers. Le surpoids

et l'obsit sont donc des fardeaux conomiques importants pour le systme de sant

canadien.

Des tudes rcentes ont mis en vidence une implication directe de la synthse

de novo des lipides (lipogense) dans le dveloppement de l'obsit (Kusunoki,

Kanatani et al. 2006). La synthtase des acides gras (FAS) (EC 2.3.1.85) est une des

enzymes clefs de la lipogense hpatique. Cette enzyme est implique dans la

formation des acides gras saturs longue chane (Wakil 1989). Le traitement

d'animaux avec un inhibiteur spcifique de la FAS, le C75, induit une perte de poids

importante, cependant cet inhibiteur de graves effets anorxiques (Loftus, Jaworsky

et al. 2000). Ces tudes dmontrent que la FAS pourrait tre une cible thrapeutique

intressante pour lutter contre l'obsit. C'est pour cette raison qu'il est important de

comprendre les mcanismes molculaires impliqus dans la rgulation de l'activit et

de l'expression de cette enzyme.

2

La FAS est rgule par les nutriments et les hormones dont les concentrations

varient au cours de la prise alimentaire. La T3 (Stapleton, Mitchell et al. 1990) et

l'insuline (Sul, Wang 1998), deux hormones fortement augmentes aprs la prise

alimentaire augmentent l'activit de la FAS. Par contre, les MCFAs (acides gras

moyerJ1es chanes) (Roncero et Goodridge 1992), les PUFAs (acides gras

polyinsaturs) (Moon, Latasa et al. 2002) et le glucagon (Lakshmanan, Nepokroeff et

al. 1972) diminuent l'activit de cette enzyme.

L'objectif de ce projet de matrise est de caractriser les mcanismes molculaires

d'action de la T3 et de l'insuline (Kusunoki, Kanatani et al. 2006) sur la rgulation de

l'activit et de l'expression de la FAS dans des cellules hpatiques.

CHAPITRE 1

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE

1.1 Mtabolisme des acides gras

Le mtabolisme lipidique reprsente un ensemble de processus anaboliques et

cataboliques visant la production de divers composs, tels que les phospholipides

(principaux constituants des membranes cellulaires), certaines hormones (hormones

strodiennes), ainsi que la production et le stockage d'nergie sous forme de

triacylglycrols. Les graisses (triacylglycrols) constituent les plus importantes

rserves d'nergie chez les animaux et constituent des formes de stockage d'nergie

hautement concentre. Elles sont en particulier mises en rserve dans les cellules du

tissu adipeux, les adipocytes, o elles subissent un cycle permanent de synthse et de

dgradation.

La synthse de novo des triacylglycrols aussi appele lipogense, peut tre

dfinie comme l'ensemble des activits cellulaires visant la formation des acides

4

gras partir de divers prcurseurs tels que les acides gras eux-mmes, les sucres, les

protines et leurs mises en rserve sous forme de triacylglycrols.

1.1.1 Origine des acides gras

Le principal prcurseur impliqu dans la voie de biosynthse des acides gras

est l'actyl-CoA (Lynen et Ochoa 1953). Il reprsente la source de tous les atomes de

carbone des acides gras. L'origine de l'actyl-CoA est diverse. Il provient soit de la

dcarboxylation oxydative du pyruvate, soit de la dgradation de certains acides

amins ou encore de la ~-oxydation des acides gras longue chane.

1.1.2 Synthse de novo des acides gras

La synthse de novo des acides gras se droule en 2 tapes distinctes (figure

1.1). La premire tape est la carboxylation de l'actyl-CoA en malonyl-CoA. Cette

raction est catalyse dans le cytoplasme de la cellule par une enzyme clef de la

synthse des acides gras: l'actyl-CoA carboxylase (ACC) (Munday 2002).

CH3-CO-S-CoA + CO2 ~ COOH-CH2-CO-S-CoA

Acetyl-Co Malonyl-CoAr+ ATP ADP+Pi

Par la suite, la synthse des acides gras s'effectue grce l'acide gras synthase

(FAS). Cette enzyme multifonctionnelle fixe une molcule d'actyl-CoA et l'allonge

en utilisant des groupements malonyl au cours de 7 cycles de raction pour aboutir au

palmitate (C16 :0). Le malonyl-CoA, substrat de cette raction d'longation, libre

son groupement carboxyl sous forme de CO2 lors de la raction de condensation.

Cette raction requiert la prsence d'un agent rducteur le NADPH, cofacteur gnr

5

par l'enzyme malique (ME) lors de la dcarboxylation oxydative du malate en

pyruvate (Wakil, Stoops et al. 1983; Wakil 1989). L'allongement des acides gras

catalyss par l'acide gras synthase s'arrte C16 librant ainsi l'acide palmitique

(C 16 :0). Cependant, le starate (C18 :0), le myristate (C 14 :0) mais galement des

acides gras plus courte chane peuvent tre synthtiss (Semenkovich 1997). Par

exemple, des acides gras moyelU1e chane sont synthtiss par la synthtase des

acides gras de la glande mammaire et sont retrouvs au niveau du lait excrt (Tai,

Chirala et al. 1993).

Actyl-CoA + 7 Malonyl-CoA --...... Acide palmitique + 8 CoA-SH +~

14 NADPH + 14 H+ 14 NADP+ + 7 CO2 + 6 CO2

6

MITOCHONDRIE

~ GLYCOLYSE i ~----j4- Pyruvate ( Glucose

-?:J\~maIl0 \ / NNJI'< Malate GI~ 6P dnyd",~

~ioactate h ~ ~......

Citrate" ~

Isocitrate acides gras

acides amins

a ctoglutarate 'if

Actyl-CoA

j~~ CYTOPLASME

Malonyl-CoA j....".. ....

~defadd~j ~-

Acides gras non estrifis saturs

Acides gras dsaturs 1 ESTERIFICATION 1

PhospholipidesTriglycrides

FOIE t- Apollpoprotln~s VLDL====================

PLASMA

1 -v Dpot des lipides

TISSU ADIPEUX

Figure 1.1: Principales tapes de la synthse de novo des acides gras

(Mounier 1994)

7

1.1.3 Transformations mtaboliques des acides gras

A partir du palmitate ainsi form, des acides gras trs longues chanes et des

acides dsaturs vont pouvoir tre gnrs. Les acides gras C 16 :0 et C 18 :0 peuvent

tre allongs nouveau, soit au niveau de la mitochondrie, soit dans le rticulum

endoplasmique. Dans la mitochondrie, les acides gras saturs possant 12 16

carbones peuvent subir une longation par une addition successive de molcules

d'actyl-CoA, ce qui conduit la formation d'acides gras chanes trs longues (C18

C26). Dans le rticulum endoplasmique, ces acides gras saturs ou non saturs

peuvent aussi subir une longation supplmentaire par une addition successive de

malonyl-CoA. La raction est la mme que pour la synthse du palmitate (Jakobsson,

Westerberg et al. 2006).

Les acides gras saturs longue chane peuvent tre dsaturs par

l'introduction d'une double liaison. Cette raction est catalyse par des dsaturases.

La staroyl-CoA dsaturase (SCDl) encore appele la ~9 dsaturase, localise dans

le rticulum endoplasmique, est une des enzymes clefs de la dsaturation. Elle

dsature les acides gras en ajoutant une double liaison en position 9. L'acide

palmitolique (C16 :1) et l'acide olique (C18 :1) sont produits par dsaturation

respectivement de l'acide palmitique (C16 :0) et de l'acide starique (C18 :0) (figure

1.2).

La biosynthse des triacylglycrols s'effectue alors partir d'acides gras

activs (acyl-CoA) et de glycrol-3-phosphate issus de la glycolyse ou encore de la

phosphorylation du glycrol. Les triacylglycrols seront ensuite intgrs par les

hpatocytes dans des lipoprotines (VLDL) et librs dans le sang pour alimenter les

autres tissus ou tre mis en rserve dans les adipocytes (figure 1.1).

8

1 Animaux 1 Animaux, Vgtaux,

Bactries arobies 1'------'1

/19 I.M E /1 5 E /1 6 ~ 16:0 -16:1:-16:2 -18:2 -18:3 -20:3 -->20:4 ~

1/19 :.66 E /15 18:0 - 18:1 :--18:2------1

.6 12 1: 1/16 E

- 20:2

.65

- 20:3

E

24:4

t .66 --24:5

1

1 Vgtaux 1

18:2 t- 18:3 1

1

- 20:3 - 20:~ l

-.,,__.

22:4 22:~ .... ~..__.....__,

1

.615 1 1 24:5

.66 - 24:6

:.66 E AS E t 1 ~ 18:3,- 18:4 - 20:4 - 20:? - 22:5 22:,6 ~

1 1. -1

Figure 1.2: Famille des acides gras polyinsaturs (www.jle.com)

1.1.4 Lieux de synthse des acides gras de novo

Chez l'homme, la synthse de novo des acides gras a lieu principalement au

niveau hpatique. Cependant, une faible synthse est mesure dans le tissu adipeux,

les reins, les poumons et les glandes mammaires (Kusakabe, Maeda et al. 2000; Tai,

Chirala et al. 1993). Chez les oiseaux, la plupart des tudes suggrent galement que

le foie est le principal site de la synthse des acides gras (Leveille, Q'Hea et al. 1968).

Chez les mammifres ( l'exception de l'homme), la biosynthse des acides gras a

lieu la fois dans le tissu adipeux et dans le foie. Chez le rat en croissance, on

observe une lipogense intense dans le tissu adipeux, alors que chez le rat adulte, la

lipogense a lieu aussi principalement dans le foie (Gandemer, Pascal et al. 1980).

9

1.1.5 Rgulation de la lipogense

1.1.5.1 Rgulation nutritionnelle de la lipogense

La lipogense est trs sensible aux modifications alimentaires. Les acides gras

polyinsaturs (PUFAs) diminuent la lipogense hpatique en inhibant l'expression de

diffrents gnes, telle que la FAS, spot 14 et SCD 1 (lump, Clarke et al. 1994). Par

contre, une alimentation riche en sucres va stimuler la lipogense la fois dans le foie

et le tissu adipeux, entranant une augmentation postprandiale du niveau de

triglycrides plasmatiques (Kersten 2001). La diminution de la lipogense induite par

une restriction alimentaire peut s'expliquer en partie par une diminution plasmatique

du glucose, ainsi que par une augmentation des PUFAs libres circulants (Kersten

2001).

Le glucose plasmatique va stimuler la lipogense via diffrents mcanismes.

Premirement, le glucose est le principal substrat de la lipogense, puisqu'il y est

rapidement converti en acetyl-CoA par la glycolyse (Kersten 2001). De plus, le

glucose est capable de rguler directement la transcription des gnes lipogniques

(Kersten 2001), notamment grce l'activation et la fixation sur des squences

promotrices du facteur de transcription ChREBP (Charbohydrate Responsive Element

Binding Protein). Des squences de fixation de ce facteur de transcription sont

d'ailleurs retrouves sur le promoteur de la FAS, de la fructose 6 phosphate 2 kinase/

fructose-2,6- bisphosphatase et de l'ACC (Uyeda, Yamashita et al. 2002). Enfin, le

glucose stimule la lipogense en augmentant la libration d'insuline et en inhibant la

libration de glucagon par le pancras (Kersten 2001).

1.1.5.2 Rgulation hormonale de la lipogense

Une restriction alimentaire est associe une importante modification de la

concentration des hormones plasmatiques, notamment une diminution du niveau

d'insuline, de T3 et de leptine ainsi qu'une augmentation du niveau d'hormone de

10

crOlssance (GH) et de glucagon (Kersten 2001). L'insuline est l'hormone qui a

probablement la plus grande influence sur la lipogense (Kersten 2001). L'insuline

augmente l'entre de glucose dans la cellule en favorisant la translocation du

transporteur au glucose (GLUT4) la surface des cellules hpatiques (Kersten 2001).

L'insuline est galement implique dans les modifications post-traductionnelles des

enzymes glycolytiques et lipogniques. L'insuline stimule la lipogense en modifiant

les liaisons covalentes de ces enzymes (Kersten 2001). Enfin, l'insuline est capable

d'activer diffrentes voies de signalisation cellulaire en se fixant sur son rcepteur

membranaire (Nakae et Accili 1999) modulant ainsi la transcription des gnes

lipogniques. La T3 est bien connue pour stimuler la lipogense, son action est

mdie par la fixation d'un complexe hormone/rcepteur sur les squences

promotrices de certains gnes impliqus dans le lipogense (Stapleton, Mitchell et al.

1990; Thurmond et Goodridge 1998).

L'hormone de croissance (GH) est une hormone qui a une grande importance

dans la rgulation de la lipogense. Cette hormone rduit de faon trs importante la

lipogense au niveau du tissu adipeux et induit un important gain de masse

musculaire (Kersten 2001) (Etherton 2000). La leptine est une hormone produite par

le tissu adipeux dcouverte rcemment (Zhang, Proenca et al. 1994). La leptine

diminue le stockage de graisse en rgulant la prise alimentaire mais galement en

agissant au niveau du mtabolisme nergtique dans de nombreux tissus, notamment

le tissu adipeux et le foie (Kersten 2001). Par exemple, il a t mis en vidence que la

leptine est implique dans l'inhibition des gnes impliqus dans la synthse des

acides gras ainsi que dans la synthse des triglycrides (Wang, Lee et al. 1999). Le

facteur de transcription SREBP-l est galement une cible potentielle de la leptine par

lequel elle inhiberait le transcription des gnes lipogniques (Kakuma, Lee et al.

2000). Le glucagon est impliqu dans l'inhibition de la transcription de nombreux

gnes lipogniques (FAS, ME). Cette hormone induit une augmentation de l'AMPc,

ce qui entrane l'activation de la PKA qui par la suite va modifier la fixation de

Il

facteurs de transcription. c-Jun et ATF2 sur un lment de rponse ngatif l' AMPc

localis sur le promoteur de l'enzyme malique (Mounier, Chen et al. 1997).

1.2 Le complexe de l'acide gras synthase

1.2.1 Organisation structurelle

La biosynthse des acides gras requiert une srie de ractions enzymatiques. Chez

les organismes conune la bactrie, chaque tape est catalyse par des enzymes

indpendantes (Wakil 1983). Chez les manunifres et les oiseaux, ces diffrentes

tapes sont ralises au sein d'une mme protine formant un complexe

multicatalytique. Cette protine multifonctionelle est le produit d'un gne unique. La

FAS des vertbrs est fonctionnelle sous forme d'un homodimre constitu de 2

chanes peptidiques de 250 kDa (Stoops, Arslanian et al. 1975). Chacune de ces

units peut catalyser 7 ractions paI1ielles distinctes, ncessaires la synthse du

palmitate. Le rapprochement spatial de plusieurs ractions enchanes l'une derrire

l'autre, prsente un avantage par rapport des enzymes spares. La comptition

entre les ractions est vite, la raction se droule sous forme coordonne et cette

raction est trs efficace grce la concentration leve en substrat.

Chaque moiti de l'acide gras synthase peut lier le substrat (rsidu acyl ou actyl)

sous forme d'un thioester au niveau de 2 groupements SH particuliers: un sur un

rsidu cystine (Cys-SH) et un autre sur un groupement 4'phosphopantthine (Pan

SH). La Pan-SH est associe un fragment du complexe que l'on nonune ACP (Acy]

Carrier Protein). Cette partie de l'enzyme fonctionne comme un long bras qui fixe le

substrat et le dplace ensuite d'un centre actif un autre. Les 2 moitis de l'acide gras

synthase cooprent dans ce domaine. Le complexe enzymatique n'est donc

fonctionnel que sous forme dimrique. La dissociation de l'enzyme en monomres

conduit l'inactivation de la FAS (Stoops, Arslanian et al. 1975; Lornitzo, Qureshi et

al. 1975). De faon spatiale, les activits enzymatiques sont rparties en 3 domaines

12

distincts. Le premier domaine catalyse l'introduction du substrat, acty1-CoA et

malonyl-CoA, grce aux activits [ACP]-S-actyl transfrase (figure l.3.A.]) et

[ACP]-S-malonyl-transfrase (figure 1.3.A.2) qui sont par la suite condenss via la 3

cto-acyl-[ACP]-synthase (figure ] .3.A.3). Le deuxime domaine rduit la chane

d'acide gras au cours de la synthse l'aide de la 3-ctoacyl-[ACP]-rductase (figure

1.3.AA), de la 3 hydroxyacyJ-[ACP]-dehydratase (figure 1.3.A.5), et de l'noyl

[ACP]-rductase (figure 1.3.A.6). Le troisime domaine sert librer le produit fini

aprs sept tapes d'allongement de la chane grce l'activit acyl-[ACP]-hydrolase

(figure 1.3.A.7) (Koolman, Rohm 1999).

1.2.2 Ractions effectues par la FAS

La premire raction ralise par la FAS est le transfert d'un groupement

actyl sur le rsidu cystine (figure].3 .B.l) et le transfert d'un rsidu ma10nyl sur la

4-phosphopantthine (Pan-SH) de l'ACP (figure 1.3.B.2). Par la suite, l'longation a

lieu par le transfert d'un groupement actyl en C-2 du rsidu malonyl. Le groupement

carboxyl libre est alors cliv et forme du CO2 (figure 1.3.B.3). Par la suite, il y a

rduction du groupement 3-cto (figure 1.3.BA), limination de l'eau (figure

1.3.B.5), puis rduction (figure 1.3.B.6). L'ensemble de ces ractions aboutit la

formation d'un acide gras 4 carbones. Ce produit est par la suite transfr de l'ACP

sur le rsidu cystine par l'acyl-transfrase (figure 1.3 .B.]) afin qu'un nouveau cycle

puisse recommencer aprs un nouveau chargement de l'ACP par du malonyl-CoA.

Au bout de 7 cycles, l'acyl-[ACP]-hydrolase (figure 1.3.B.7) libre le produit final:

le palmitate (C16 :0) (Koolman, Rohm 1999).

13

G) 0 entre du substrat o limination d'eau palmitate o allongement CD rduction '\.....~._----,

de la chaine ; libration o rduction (2) libration du produit 1du produit o H H H

palmitate 11111 ~ Pan-8 - C - C - C - C - H ~

r 1 1 1 Cys-SH H H H NADPH 7

I~~hine l ACP @] ..~/ Crs SH S{"i SH / SH Cys

ACP 0 / ~ ~ ~ Pan-S - C - C = - -H ~ trans-nOYI-! p,_SH :r

H O

o H OH Hactyl -ls~ Il 1 1 1 ,Pan-S -C-C-C-C- H 1 1 1

malonyl -1 S ~ Cys-SH H H H NADPH

A. Acide gras synthase

'1l (ACP]-S-actyl~ transfrase 2.3. 7.38

i2l [ACP]-S-malonyl o H 0 H ~ transfrase 2.3. 7.39 Il 1 Il 1

,Pan-S - C - C - C - C - H ~ 3-ctoacyl 1 7x - 1 1f3 3-ctoacyl-[ACP]

Cys-$'H H H~ synthase 2.3. 7.47

f4l 3-ctoacyl-[ACP] ~C02 L2J rductase 7.7. 7. 700

f5l 3-hydroxypalmitoyl-(ACP] T--H ~ dshydratase 4.2. 7.67 o H

1\ 1

f6l noyl-[ACP]- Pan-S - C - ~ f C01-& ~ rductase (NADPH) 7.3.1.70

7 acyl-[ACP] ~ H Is~ hydrolase 3. 7.2. 74

Acys-s-C-9- H

,----1 _H_ 2 rsidu acyl malonyl -1 5 ~Araction de dpart _ouac~

B. Ractions de l'acide gras synthase

Figure 1.3: Le complexe de l'acide gras synthase (Koolman, Rhm 1999)

14

1.2.3 Le gne FAS et sa rgion promotrice

Chez les vertbrs, la FAS est code par un gne unIque localis sur le

chromosome 17q25 chez l'humain et sur le chromosome Il chez la souns

(Semenkovich, Coleman et al. 1995). En dpit de la taille importante de sa protine,

le gne FAS est relativement petit. La rgion codante reprsente environ 50 kpb chez

l'oie, 18 kpb chez le rat et moins de 40 kpb chez l'homme (Semenkovich 1997). Le

gne FAS est bien conserv entre les espces avec une homologie d'environ 80%

(Amy, Witkowski et al. 1989; Holzer, Liu et al. 1989).

Le gne FAS gnre un seul ARNm chez la souris et 2 ARNm chez le rat et le

poulet suite un pissage alternatif (Sul et Wang 1998). Chez le rat, on retrouve 43

exons et 42 introns espacs par des squences GT/AG, squences universelles

connues servant l' pissage alternatif (Amy, Williams-Ahlf et al. 1992). Il est

important de noter que les introns correspondent aux zones charnires situes entre

chacune des sous units catalytiques du complexe multienzymatique de la FAS. Chez

les plantes et les bactries, les acides gras saturs longues chanes sont synthtiss

par une succession d'enzymes monofonctionnelles codes par des gnes

indpendants. L'ensemble de ces observations suggrent donc que la FAS des

vertbrs est issue de la fusion de plusieurs gnes ancestraux (Amy, Williams-Ahlf et

al. 1992).

Les lments ncessaires la rgulation transcriptionnelle de la FAS semblent

tre situs dans les premiers 2,1 kpb du promoteur (Wang, Jones Voy et al. 2004).

Une analyse informatique de cette rgion promotrice chez diffrentes espces a

permis d'identifier de nombreux lments consensus (Wang, Jones Voy et al. 2004)

(figure lA) dont certains IREs (Elements de rponses l'insuline) dj bien

caractriss (Sul et Wang 1998).

15

-1000 ~----'I'CC ~:.... --------- ---~.--- -,~ ~ -1000 -lOOtl .1000

C"~GA CMG7C'l'"JC ,cn,":'i'(;,;-.... --CGC'ivil.C7 TT,c.------.----- ----1'CTCTC 7CTiT':'i'Ci --c~.,..;,\(:! 'i1"Ta---- 1AAA----- ------- -----.~~ Gl"J\!"oG"l'G.AA':' lcrr.ACA:;~ ~:~~ ~~~1!11 ~~~~~~ ~~~~~~ ~~~~~~

-)83 .-.- . _- -.-----~ c;;:=ccr. ---~ccw-. 'Ho C"oC"'.>CoC'GM..-~ ~ ---- ---jC':GT l;:;:::':CG-~~- --C'X~CGC

Il~'

-!'l'l -9~2

TWcca:; C-""CC'CAUTT CG'*'TJ"AC\.. nt.---- -itAMGAQ.;>' !'OI'fCT'CCCG T~~TT C:;;'TAACCC: 'ITc---- -AAM.CI.!XJ" fT'C"l'A1U.TC ~,.t.7 TAACAMTAG T,CA":'':'GilTC 7~CN'i

L~ CCCGl:~CCJ,Ci C(CGC':"~:: GCD.C(.-,JCT -------.---_. ---. --------- ccn;: C":'lCt:'TCJCCii'. G(;.v.~C'cc;' c.crG:::GC:::: -~81 GC'TC!"TCCC:C C:C':';'::'C~C ~ArGc:t."T" ...c.v.C""...cCCA ::c-.:cox:--.....-c-30" ~ ex.l7'OC

16

1.2.4 Expression tissulaire de la FAS

Chez l'homme, l'expression de l'ARNm FAS est ubiquitaire. Cependant, son

niveau d'expression varie d'un tissu l'autre (Semenkovich 1997). Le plus haut

niveau d'expression de l'ARNm FAS est retrouv au niveau du foie et des poumons

chez l'humain (Semenkovich, Coleman et al. 1995). Chez les rongeurs, la lipogense

a lieu en grande partie au niveau du tissu adipeux, ce qui n'est pas le cas chez

l'humain. Cependant, un haut niveau d'expression de l'ARNm FAS est retrouv chez

l'humain au niveau du tissu adipeux intra abdominal (Semenkovich, Coleman et al.

1995), suggrant que son niveau d'expression pourrait varier et dpendre de l'origine

du tissu adipeux (Semenkovich 1997).

1.3 Rgulation de l'expression de la FAS

La FAS, enzyme clef de la lipogense hpatique est rgule par les hormones et

les nutriments. Au niveau hpatique, son activit est inhibe par une dite et

augmente par une ralimentation riche en sucre (Burton, Collins et al. 1969)

(Goodridge, Back et al. 1986). La FAS est rgule la fois au niveau transcriptionnel

(Katsurada, Iritani et al. 1990; Back, Goldman et al. 1986; Iritani, Nishimoto et al.

1992) et post-transcriptionnel (Wilson, Back et al. 1986; Moustaid and Sul 1991;

Semenkovich, Coleman et al. 1993). La T3 (Stapleton, Mitchell et al. 1990) et

l'insuline (Paulauskis et Sul 1989) augmentent le niveau d'expression des ARNm de

la FAS. Quand les 2 hormones sont ajoutes en mme temps, un effet synergique est

observ (Stapleton, Mitchell et al. 1990). De faon trs intressante, l'ajout de

MCFAs (hexanoate et octanoate) induit une inhibition de la FAS au niveau

transcriptionnel (Roncero et Goodridge 1992). Cette inhibition est spcifique et

rversible.

17

1.3.1 Rgulation hormonale de la FAS

1.3.1.1 Rgulation de la FAS par la T3

Il est connu que la T3 augmente le niveau d'expression des ARNm FAS

(Stapleton, Mitchell et al. 1990), mais le mcanisme molculaire de rgulation n'est

pas encore caractris et c'est le but prcis de notre tude. Nous allons donc nous

attarder dans cette partie sur le mcanisme gnral d'action des hormones

thyrodiennes.

1.3.1.1.1 Synthse des hormones thyrodiennes

Les hormones thyrodiennes (TI--Is) sont synthtises au niveau de la glande

thyrode qui est situe juste en avant de la trache. Cette glande est forme de 2 lobes

latraux runis par l'isthme et un petit lobe pyramidal. Au niveau microscopique, on

trouve des structures particulires: les follicules thyrodiens. Ces follicules sont bien

individualiss par des traves de tissu conjonctif et sont constitus par un pithlium

pavimenteux qui dlimite une lumire: le collode. On trouve un autre type de cellules

appeles cellules C (cellules calcitonine) ou cellules parafol1iculaires, qui sont

impliques dans le mtabolisme phosphocalcique.

Les hOlmones thyrodiennes sont synthtises au nIveau des follicules

thyrodiens partir d'un acide amin la tyrosine. L'iode est indispensable la

synthse de ces honnones. Il est capt au niveau du ple basal des cellules par un

mcanisme actif (pompe Na/I) (Dai, Levy et al. 1996), puis il traverse les cellules

pour rejoindre le ple apical et tre transform en iode inorganique (I2) par la thyrode

peroxydase en prsence de peroxyde d 'hydrogne (Yen 2001). L'iode inorganique va

par la suite tre incorpor au niveau d'un rsidu tyrosine d'une glycoprotine de 660

kDa: la thyroglobuline (Tg). La Tg peut fixer un deux atomes d'iodes formant ainsi

des MIT (monoiodo-tyrosines) ou des DIT (diiodo-tyrosines) qui vont par la suite se

18

coupler grce une enzyme; la thyroperoxydase pour former la T3 et la T4

(thyroxine) (figure 1.5). Les Tg contenant les MIT, les DIT, la T3 et la T4 sont

stockes au niveau du collode dans la lumire des follicules thyrodiens, ce qui

constitue la principale rserve en hormones thyrodiennes. Par la suite, la scretion

des hormones THs ncessite l'endocy10Se des Tg iodes (contenant les MIT, les DIT,

la T3 et la T4) au niveau de la surface apicale des cellules folliculaires thyrodiemles.

Les Tg internalises sont ensuite incorpores dans des phagolysosomes et soumises

une digestion protolytique afin d'aboutir la libration dans la cellule des MIT, des

DIT, de la T3 et de la T4. Les MIT et les DIT sont par la suite recapturs au niveau

apical alors que la T3 et la T4 sont libres dans la circulation sanguine au niveau du

ple basal de la cellule folliculaire. La grande majorit des THs produites par les

follicules thyrodiens est libre sous forme de T4.

La T4 secrte par les follicules thyrodiens possde une activit biologique

faible alors que la T3 qui possde une activit biologique leve est produite dans les

tissus cibles partir de la T4. La T3 est produite dans le majorit des cas, via un

mcanisme de diodination en 5' de la T4 et fait intervenir des slnoenzymes : les

diodases (Kohrle 2000; Larsen et Berry 1995).

19

Portion do foll.cula Ihyro'~dIOn

ColloYdo ~lIulO

1O

20

1.3.1.1.2 Mcanisme gnral d'action des hormones thyrodiennes

Les hormones thyrodiennes sont des hormones ,nuclaires et Jusque

rcemment taient considres comme ne possdant pas de rcepteurs membranaires.

Elles pntrent dans la cellule par diffusion travers la membrane cellulaire puis sont

exportes jusqu'au noyau. De nombreuses tudes ont mis en vidence que les

rcepteurs nuclaires aux hormones thyrodiennes (TRs) sont impliqus dans la

rgulation gnique induite par la T3. En prsence de T3, ces rcepteurs sont capables

de fixer l'hormone et de s'associer la chromatine avec une grande affinit et

spcificit (Oppenheimer, Schwartz et al. 1987; Samuels, Forman et al. 1988). Le

complexe fOlm par le rcepteur et son ligand va reconnatre des lments spcifiques

de rponse aux hormones thyrodielU1es (TREs) localiss sur le promoteur de certains

gnes cibles. Le TR peut se fixer sur son lment de rponse sous forme de

monomre, d'homodimre ou encore d'htrodimre (Forman, Casanova et al. 1992).

Il a t mis en vidence que le TR forme un htrodimre avec des protines

nuclaires du foie (Murray et Towle 1989). Ces protines isoles ont t appeles les

protines auxiliaires (TRAPs) et ont la proprit d'augmenter la fixation du TR sur le

TRE (Murray et Towle 1989) (Darling, Burnside et al. 1989). Par la suite, il a t

dmontr que les RXRs (rcepteurs l'acide rtinoque) taient les principaux

TRAPs (Sugawara, Yen et al. 1993). En prsence de T3, le taux d 'homodimre

TRJTR tend diminuer alors que l'htrodimre TRJRXR forme un complexe stable

et se fixe sur le TRE rgulant ainsi la transcription (Yen, Sugawara et al. 1992)

(figure 1.6).

21

T3

T4

Figure 1.6: Modle gnral d'action des hormones thyrodiennes (Yen 2001).

Les TRE sont forms de squences consensus et sont localiss dans la

majorit des cas en amont du promoteur minimal mais peuvent parfois tre situs en

3' de la squence codante (Bigler et Eisenrnan 1995). En comparant diffrents TREs,

une demi squence consensuelle hexamrique a t dfinie 5'-(G/A)GGT(C/G)A-3'.

Cette squence peut s'organiser en palindrome (TREpal), en rptition directe (ORs)

ou encore en palindrome invers (lPs). Ces demi-squences peuvent tre spares

respectivement par 0, 4 ou 6 nuclotides (figure 1.7). L'heterodimre TRlRXR se fixe

majoritairement sur des TRE organiss en OR4 (Andersson, Nordstrom et al. 1992;

Kurokawa, Yu et al. 1993).

REPETITION DIRECTE AGGTAXXXXAGGTA

PALINDROME TGACCTXXXXXXAGGTA

---~. 141--PALINDROME INVERSE AGGTCATGACCT

Figure 1.7: Organisation des diffrents TREs (Yen 2001)

22

1.3.1.1.3 Les rcepteurs aux hormones thyrodiennes.

Les TRs sont des rcepteurs nuclaires qui appmtiennent la super famille des

rcepteurs incluant les hormones stroidiennes, la vitamine D et l'acide rtinoque. Il

existe 2 gnes diffrents qui vont coder pour 2 isofonnes distinctes, TRa et TRp. Ces

gnes sont localiss respectivement sur les chromosomes humains 17 et 3 (Lazar

1993). Ces isoformes existent chez diffrentes espces, comme chez les amphibiens,

le poulet et la souris (Lazar 1993). De plus, il existe un mcanisme d' pissage

alternatif, ce qui aboutit une htrognit encore plus impOltante des TRs. Selon le

type cellulaire, 5 diffrentes formes majeures de rcepteurs vont pouvoir tre

synthtises: TRal, TRa2, TR~1, TR~2, TR~3. Les rcepteurs TRal, TRp1, TRp2,

TR~3 diffrent en taille et dans la squence d'acides amins en N-terminal alors que

TRa2 diffre en C-tenninal. Ce dernier ne peut fixer la T3 et son rle est encore

mconnu (Flamant et Samarut 2003) (figure 1.8). L'ARNm TRal est hautement

exprim dans le muscle squelettique, dans le tissu adipeux brun, alors que l'ARNm

TRp 1 est plutt exprim dans le cerveau, dans le foie et au niveau du rein (Hodin,

Lazar et al. 1990). L'ARNm TRp2 et sa protine ont une expression tissulaire trs

spcifique. Il est produit au niveau de la glande pituitaire antrieure, et dans des aires

spcifiques de l 'hypothalamus (Cook, Kakucska et al. 1992).

23

T~~ Isoforms: 1 ~ 13 1- 481

132 t::-:-:::.~: :::-4 100 ;00 ~ 5~4

f,3 100 100 ;.-1 ~:t~ ~390

TRa lsoforms: al

a2

Il 86 , Il 86

82

82

III 4\10...

1 492

Domaln: Ale c OIE 1 1 DNA Il Hormone

Figure 1.8: Comparaison des diffrentes isoformes des rcepteurs aux hormones thyrodiennes (Yen 2001)

Les TRs ont la mme organisation structurale qui est retrouve chez

l'ensemble des rcepteurs nuclaires (Lazar 1993). On distingue 4 domaines: un

domaine ami no-terminal A/B, un domaine central de fixation l'ADN contenant 2

motifs en doigt de zinc (DNA Binding Domain, DBD), une zone charnire contenant

le signal de localisation nuclaire et un domaine C terminal de fixation au ligand

(Ligand Binding Domain, LBD) (figure 1.8 et 1.9).

24

Nt -f'--__-:-Al_B_-:-__ l.-..-,----J

AF-1

l Domaine: de fixation du ligand,

Domaine d'interaction avec de dimrisation et d'activation de les T3 response element (TRE) la transcription (AF-2)

AF-2 est le domaine d'interaction avec les Co-Activateurs/Rpresseurs

Figure 1.9: Structure gnrale des rcepteurs nuclaires

(Modifi de Yen 2001 par A.Radenne)

Le domaine de fixation l'ADN est situ dans la rgion centrale du TR et est

compos de 2 motifs en doigt de zinc. A l'intrieur du premier doigt de zinc, on trouve

une bote p qui joue un rle critique dans la reconnaissance du TRE (Nelson,

Hendy et al. 1995) (figure 1.10). Les TRs vont se fixer majoritairement au niveau du

TRE organis en DR4. L'htrodimrisation du TR avec le RXR est essentielle et

permet de stabiliser la fixation du complexe au niveau du TRE (Kurokawa, Yu et al.

1993).

Le LBD permet la fixation de l'honnone thyrodienne maiS intervient

galement dans les mcanismes de dimrisation, de transactivation et de rpression en

absence du ligand (Yen 2001). Cette rgion forme une poche hydrophobe o va venir

se fixer les hormones thyrodiennes.

Le domaine amino-terminal (AlB) est la rgion la moins conserve et son rle

n'est pas bien connu. Il interviendrait dans la transactivation de la transcription mais

cette thorie reste controverse (Thompson et Evans 1989).

25

Figure 1.10: Reprsentation shmatique du domaine en doigt de zinc localis sur le TRP humain (Yen 2001)

1.3.1.1.4 Modulation du mcanisme d'action des TRs

De nombreuses protines nuclaires vont pouvoir interagir avec le TR et

moduler la rgulation de la transcription des gnes cibles. Ces protines vont former

des complexes et vont rguler le niveau d'actylation des histones ou les interactions

avec la machinerie transcriptionnelle de base. On peut distinguer les co-rpresseurs

qui vont exercer une rpression basale et les co-activateurs qui vont activer la

transcri ption.

Contrairement aux rcepteurs des hormones strodiennes qui sont inactifs en

absence de ligand, en absence de T3, les TRs peuvent se fixer sur les TREs et

moduler la transcription des gnes. Les TRs sans ligand vont diminuer la transcription

basale des gnes positivement rguls par la T3 (Brent, Dunn et al. 1989). Il a t mis

en vidence que le TR sans ligand tait capable d'interagir avec TFIIB, un lment

clef de la machinerie transcriptionnelle et donc interfrait avec la formation d'un

complexe de prinitiation de la transcription (Baniahmad, Ha et al. 1993). Il est

important de noter que certains gnes sont rguls ngativement en prsence de T3 et

qu'en absence de T3, le complexe TR/RXR induirait une augmentation de la

transcri ption (Yen 2001 ).

26

Plusieurs co-rpresseurs ont dj t isols; le co-rpresseur NCor (nuclear co

repressor) (Horlein, Naar et al. 1995) qui est capable d'interagir avec TFIIB et le co

rpresseur SMRT (Silencing mediator ofRAR and TR). Ces 2 protines sont capables

de former des complexes avec d'autres co-rpresseurs comme sinl ou avec des

histones desactylases (l-lDACs) et jouer un rle clef dans la rpssion de la

transcription. Les HDAC sont des enzymes qui vont enlever les groupements actyles

situs sur les rsidus lysines des histones, ce qui va bloquer l'accs des facteurs de

transcription au niveau de l'ADN est donc inhiber la transcription. (Hu et Lazar 1999)

(figure 1.11).

Lors de la fixation du ligand, il se produit un changement conformationnel,

ce qui entrane la dissociation des co-represseurs et permet la fixation des co

activateurs. Ces co-activateurs en association avec diverses protines adaptatrices

vont former un complexe permettant de mettre en contact la machinerie

transcriptionnelle avec l'htrodimre TRJRXR. Un des co-activateurs bien

caractris est la protine p 160/SRC1 (Steroid Receptor Co-activator). Cette protine

possde une activit histone actyltransfrase (HAT) intrinsque et est galement

implique dans le recrutement de diffrentes HAT et d'histones mthyltransfrases. Il

est important de noter que SRC-l peut tre phosphoryl par les MAPK et donc peut

tre rgul par des effecteurs comme des hormones se fixant sur des rcepteurs

membranaires (Rowan, Garrison et al. 2000). Suite cette phosphorylation, SRC-l va

recruter le complexe p300/CBP (CREB Binding Protrein) qui va lui-mme recruter le

complexe PCAF (p3GGICBP Associated Factor). Ces protines servent d'adaptateurs

aux rcepteurs nuclaires pour la machinerie transcriptionel1e et possdent une

activit HAT (ce qui permet le remodelage de l'ADN) (Bassett, Harvey et al. 2003).

Il existe d'autres protines activatrices telles que les protines TRAPs (TR associated

proleins) et les DRIPs (Vitamin D receptor inleracling proteins). Ces protines vont

permettre la fixation et la stabilisation de l'ARN polymrase II. L'existence de 2

groupes diffrents de protines co-activatrices suggre que le TR rgule l'activation

de la transcription en 2 tapes. Dans un premier temps, il y a remodelage de l'ADN

27

avec la fixation du complexe p160/SRC l, suivi de la fixation des protines

TRAP/DRIP qui vont moduler la transcription des gnes (Bassett, Harvey et al. 2003)

(figure 1.11).

- T3

TRE TATA

------~------------------

+T3 DRIPfTRI\P complex

HI$~one ACtylatlon

GTFs

TRE TATA

Figure LU: Modle molculaire de la rpression basale en absence de T3 et de l'activation de la transcription en prsence de T3 (Yen 2001)

1.3.1.1.5 Modifications post-traductionnelles des TRs

Diffrents groupes de recherche ont montr que des modifications post

traductionnelles des TRs telles que la phosphoryiation (Jones, Brubaker et ai. 1994)

ou encore l'actylation (Fu, Rao et al. 2003) peuvent moduler la transcription des

gnes rguls par les THs.

L'augmentation du niveau de phosphorylation de la cellule par des inhibiteurs

de phosphatase accrot l'action induite par la T3 en activant la transcription de divers

28

gnes cibles (Swierczynski, Mitchell et al. 1991; Lin, Ashizawa et al. 1992; Jones,

Brubaker et al. 1994). Le TR, le RXR ou encore les co-activateurs pourraient tre des

cibles potentielles de phosphorylation. La voie de signalisation cellulaire des MAPK

semble tre implique dans ces modifications posttraductionnelles. Davis et son

quipe ont montr que le TR~l est capable de s'associer avec ERK1/2, ce qui aboutit

la phosphorylation du rcepteur (Davis, Shih et al. 2000). La phosphorylation du

TR favoriserait son htrodimrisation avec le R.XR et donc induirait l'augmentation

de la fixation du complexe TRJRXR au niveau du TRE (Bhat, Ashizawa et al. 1994).

Le co-activateur SRC-1 est galement une cible potentielle de phosphorylation par

ERKl/2 (Rowan, Garrison et al. 2000) et peut donc aussi moduler l'activation des

rcepteurs nuclaires. De plus, la phosphorylation du rcepteur TRa.l du rat semble

tre implique dans la localisation et la rtention du rcepteur dans le compartiment

nuclaire (Nicoll, Gwinn et al. 2003), ce qui favoriserait une induction de la

transcription des gnes cibles. L'ensemble de ces rsultats laisse suggrer que la

phosphorylation pourrait jouer un rle important dans la rgulation des gnes par la

TI mais par un mcanisme encore mconnus.

Les rcepteurs nuclaires et notamment les TRs sont aussi des cibles

potentielles d'actylation (Fu, Rao et al. 2004; Fu, Wang et al. 2004; Lin, Hopkins et

al. 2005). La protine CBP/p300 qui possde une activit HAT intrinsque semble

tre directement implique dans ce mcanisme d'actylation (Wang, Fu et al. 2001;

Lin, Hopkins et al. 2005). L'actylation des rcepteurs nuclaires induit une

augmentation de l'activit transcriptionnelle en favorisant le libration des co

rpresseurs et la fixation des co-activateurs (Fu, Rao et al. 2003). La voie MAPK

semble aussi tre implique dans la modulation de ce mcanisme d'actylation (Lin,

Hopkins et al. 2005).

29

1.3.1.1.6 Action non gnomique des THs

Il apparat de plus en plus vident que les hormones thyrodiennes pourraient

agir via un mcanisme d'action diffrent appel mcanisme d'action non gnomique

(Bassett, Harvey et al. 2003; Losel, Falkenstein et al. 2003) (figure 1.12). Comme

pralablement dcrit, les THs peuvent agir directement au niveau des gnes via la

fixation d'un complexe hormone/rcepteur au niveau d'un TRE (action gnomique).

Cependant, elles peuvent galement agir via l'activation de diffrentes cascades de

signalisation intracellulaire telle que la voie Pl3-Kinase/Akt et la voie MAPK (Davis,

Leonard et al. 200S). L'quipe de Cao a mis en vidence, dans des cellules

fibroblastiques humaines, que la T3 tait capable d'activer la voie Pl3 -Kinase/Akt

PKB/mTor/p70s6K via une interaction directe dans le cytosol entre le TR~ 1 et la sous

unit rgulatrice de Pl3kinase (pS5a). Ceci induirait une augmentation de la

transciption du gne de la calcineurine (ZAKI-4a) (Cao, Kambe et al. 2005). Dans

des cellules endothliales vasculaires aortiques, la T3 est aussi capable d'activer la

voie PB -Kinase/Akt via galement une interaction directe entre le TRa1 et la sous

unit pS5a de PB-Kinase. L'activation de cette voie induit l'activation de eNOS

induisant un effet vasodilatateur et neuroprotecteur au mveau cardiovasculaire.

L'activation de la voie PB-Kinase/Akt par la T3 ne semble pas induire une

modulation de la transcription du gne eNOS mais module l'activit de eNOS au

niveau post-traductionnel via un mcanisme de phosphorylation (Hiroi, Kim et al.

2006). De plus, l'quipe de Davis a rcemment mis en vidence que la thyroxine (T4)

tait capable de se fixer sur un rcepteur membranaire aux intgrines (Lin, Davis et

al. 1999; Davis, Davis et al. 2005), ce qui induit l'activation de PKC, Ras, Rafl,

MEK et de ERK. L'activation de ces kinases entrane la translocation dans le noyau

de ERK (Davis, Shih et al. 2000; Shih, Lin et al. 2001) et subsquemment la

phosphorylation du TR. Il est important de noter que le TR (Davis, Shih et al. 2000),

le RXR (Torra, Ismaili et al. 2008) ou encore les co-activateurs comme SRC-]

(Rowan, Garrison et al. 2000) sont des cibles potentielles de phosphorylation par ces

30

kinases et sont impliqus dans la modulation de la transcription des gnes rguls par

la T3.

Figure 1.12: Shma rcapitulatif du mcanisme d'action gnomique et non gnomique des THs (Davis, Davis et al. 2005)

1.3.1.1.7 Le TRE sur le promoteur FAS

Le mcanisme de rgulation de la FAS par la T3 n'a pas encore t bien

caractris. Cependant, un site consensus de fixation la T3 (TRE) a t localis sur

le promoteur FAS de diffrentes espces grce des analyses informatiques (Wang,

Jones Voy et al. 2004). Ce TRE a t localis entre -771 pb et -598 pb chez l'humain,

la souris, le rat et le poulet. Cet lment est organis en squence directe spare par

4 nuclotides (DR4) et est fortement conserv entre ces diffrentes espces (Wang,

Jones Voy et al. 2004). Ces analyses ont permis C. Martel, tudiante la matrise

31

dans le laboratoire du professeur C. Mounier, de localiser un TRE sur le promoteur

FAS de l'oie entre -902 et -577 pb.

Plusieurs TREs prsents sur le promoteur aviaire de l'enzyme malique ont

dj t bien caractriss. L'enzyme malique est une enzyme lipognique rgule de

faon similai que la f AS (Wilson, Back et al. 1986; Swierczynski, Mitchell et al.

1991). En prsence de T3, ces TRE organiss en DR4 fixent l'htrodimre TRlRXR

ce qui induit une augmentation de la transcription (Thurmond et Goodridge 1998).

Ces rsultats laissent donc suggrer que la T3 induit la transcription de la FAS via la

fixation d'un complexe hormone/rcepteur sur un TRE localis sur le promoteur

FAS.

1.3.1.2 Rgulation de la FAS par l'insuline

Le mcanisme de rgulation transcriptionnelle de la FAS par l'insuline a dj

t bien caractris. L'insuline agit en se fixant sur son rcepteur membranaire (IR:

!nsulin receptor) localis la surface des cellules. La fixation de l'hormone sur l'IR

induit l'activation de l'activit tyrosine kinase du rcepteur, ce qui aboutit une

autophosphorylation puis une transphosphorylation de l'IR sur des rsidus tyrosines.

Les rsidus tyrosines phosphoryls de l'IR vont permettre le recrutement puis la

phosphorylation des protines adaptatrices telles que les IRS, Gab 1 ou CAP, ce qui

aboutit en aval l'activation de diffrentes voies de signalisation intracellulaire.

(Nakae et Accili 1999). La voie PI3-kinase/Akt a dj t bien caractrise: la

phosphorylation des IRS induit le recrutement de la sous-unit p85 (unit rgulatrice)

de la PI3-kinase qui par la suite va recruter la sous unit p110. L'activation de PI3

kinase induit la transformation du PIP2 en PIP3 au niveau membranaire aboutissant

la phosphorylation de PDKl. L'activation de PDKI va entraner en aval la

phosphorylation de Akt, kinase capable de moduler la transcription en phosphorylant

diffrents facteurs de transcription. La voie des MAPK (mitogen activated prolein

kinase) constitue aussi l'une des principales voies de signalisation active par

32

l'insuline. Aprs activation des rcepteurs l'insuline, cette voie implique par

l'intermdiaire de protines adaptatrices l'activation de la protine Ras. Cette protine

est l'origine d'une cascade de phosphorylation impliquant Raf (MAP kinase kinase

kinase), MEK (MAP kinase kinase) et ERK (MAP kinase). Cette dernire, transloque

dans le noyau de la cellule, phosphoryle alors des facteurs de transcription modulant

ainsi la transcription (Avruch 1998).

L'insuline rgule la FAS en modifiant la fixation de plusieurs facteurs de

transcription au niveau d'une unit de rponse l'insuline localise sur le promoteur.

Cette rgulation implique spcifiquement l'activation de la voie PB-kinase/Akt

(Wang et Sul 1998).

Le premier IRE (Element de rponse l'insuline) localis - 65 pb sur le

promoteur de la FAS est une E-box qui fixe les facteurs de transcription ubiquitaires

USF-l et USF-2 (Upstream Stimulatory Factor) (Moustaid, Beyer et al. 1994; Wang

et Sul 1995). Deux sites de fixation des facteurs SREBP-l c ont t localiss sur le

promoteur FAS: le premier SRE (Sterol response element) est localis entre -150 et

141 pb (Latasa, Griffin et al. 2003), Je second est plus atypique, il se situe -65 pb et

entoure la E-box (Kim, Sarraf et al. 1998). De plus, l'insuline peut galement

augmenter la transcription de la FAS en augmentant la synthse de la protine

SREBP-l c et cela par un mcanisme transcriptioneI (Shimomura, Bashmakov et al.

1999). Les protines SREBPs sont des facteurs de transcription regroupant 3

isoformes (SREBP-la, SREBP-lc, SREBP-2). SREBP-lc est l'isoforme qui rgule

principalement les gnes impliqus dans la synthse des lipides (Eberle, Hegarty et al.

2004). Les SREBPs sont synthtiss sous forme d'un prcurseur associ des

protines SCAP (SREBP C!eaving-activating proteins) au niveau du rticulum

endoplasmique (Nohturfft, Brown et al. 1998). Le niveau du facteur de transcription

SREBP mature et transcriptionellement actif est donc dtermin par le niveau de

synthse mais galement par le clivage protolytique du prcurseur. L'insuline

augmente la transcription du gne SREBP-1c dans le foie (Kim, Sarraf et al. 1998)

33

via l'activation de la vOIe de signalisation PI3-kinase et Akt (Azzout-Marniche,

Becard et al. 2000).

Il a galement t mis en vidence en rponse l'insuline un site de fixation

pour le facteur de transcription nuclaire NF-Y. Ce facteur stimule la transcription de

nombreux gnes en se fixant sur un motif CCAAT. Il existe un dernier site de

rgulation par l'insuline. Il fixe le facteur Sp 1 qui est un facteur de transcription

ubiquitaire ciblant une rgion riche en GC (Mounier et Posner 2006).

1.3.2 Rgulation nutritionnelle de la FAS

1.3.2.1 Rgulation de la FAS par le glucose

Une alimentation riche en sucre la suite d'une priode de dite induit une

augmentation importante du niveau de la protine FAS (Back, Goldman et al. 1986).

Cette rgulation aussi lieu au niveau transcriptionnel. Il a t mis en vidence dans

des cellules HepG2 (cellules issue d'un hpatocarcinome humain), que le glucose

induit une augmentation de l'expression de la FAS (Semenkovich, Coleman et al.

1993). Cette rgulation de la FAS par le glucose s'effectue via la fixation du facteur

de transcription ChREBP (Carbohydrate Responsive Element Binding Protein)

(Uyeda, Yamashita et al. 2002; Yamashita, Takenoshita et al. 2001; Ma, Robinson et

al. 2006) sur son lment de rponse localis sur le promoteur FAS. De plus, il est

noter qu'une alimentation riche en sucre stimule aussi la production d'insuline par les

cell ules ~ du pancras. L'insuline est bien connue pour rguler la FAS via la fixation

de diffrents facteurs de transcription, comme notamment les SREBP (Latasa, Griffin

et al. 2003) sur des IREs localiss sur le promoteur FAS. Il est donc relativement

difficile de diffrencier les effets activateurs induits par l'augmentation du taux de

sucre circulant ou par la production de l'insuline (Uyeda, Yamashita et al. 2002). Le

glucose est galement capable de rguler la FAS au niveau post-transcriptionnel, soit

34

en rgulant la stabilit des ARNm FAS (Li, Chua et al. 1998; Semenkovich, Coleman

et al. 1993).

1.3.2.2 Rgulation de la FAS par les PUFAs

Les acides gras poly insaturs diminuent la transcription de la FAS au niveau

hpatique (Blake et Clarke 1990), alors que dans le tissu adipeux, les PUFAs ont peu

d'effet (Sul et Wang 1998). Le mcanisme molculaire d'action des PUFAs n'est pas

encore bien caractris. Il a clairement t mis en vidence que les PUFAs peuvent

diminuer l'expression de la FAS via la diminution du facteur de transcription

SREBP-1. (Moon, Latasa et al. 2002). Les PUFAs pourraient galement agir en

inhibant la fixation de la T3 sur son rcepteur nuclaire, ce qui induirait une

diminution de la transcription (Inoue, Yamamoto et al. 1989). Enfin, la transcription

de la FAS pourrait tre module par les PUFAs via les facteurs de transcription PPAR

(peroxisome proliferator-activated receptor) (Bocos, Gottlicher et al. 1995).

1.3.2.3 Rgulation de la FAS par les MCFAs

Il a dj t mis en vidence que les acides gras saturs de 6 ou 8 carbones taient

capables d'inhiber l'effet synergique de la T3 et de l'insuline au niveau de la

transcription et de l'activit de la FAS (Roncero et Goodridge 1992) (Thurrnond,

Baillie et al. 1998). Cependant le mcanisme d'action des MCFAs sur la transcription

de la FAS reste encore tre lucid. Cette rgulation semble avoir lieu au niveau du

TRE (Thurmond, Baillie etaI. 1998). Cependant, les MCFAs ne semblent pas

moduler la fixation de l'hormone sur son rcepteur, ni du TR sur le TRE (Thurrnond,

Baillie et al. 1998). Diffrentes hypothses peuvent tre envisageables: (i) les

MCFAs ou leurs mtabolites pourraient moduler la maturation de la protine SREBP

1 entranant une inhibition de la transcription induite par la T3 et l'insuline (Zhang,

Yin et al. 2003), les MCFAs pourraient galement agir directement via leur fixation

35

sur un rcepteur de type GPCR (Brown, Jupe et al. 2005) et activer diffrentes voies

de signalisation qui pourraient moduler le niveau de phosphorylation ou d'actylation

du complexe TRJRXR ou encore des diffrents co-activateurs ou co-represseurs (Yen

2001).

L'objectif de ce travail de matrise est de mettre en vidence les mcanismes

molculaires par lesquels la T3 et l'insuline rgule la transcription de la FAS.

CHAPITRE II

ARTICLE SCIENTIFIQUE

37

HEPATIC REGULATION OF FATTY ACID SYNTHASE BY INSULIN AND

T3: EVIDENCE FOR T3 GENOMIC AND NON-GENOMIC ACTIONS.

Abbreviation titie: Insulin and T3 regulation of FAS gene expression

Anne Radenne, Murielle Akpa, Caroline Martel, Sabine Sawadogo, Daniel Mauvoisin

and Catherine Mounier*.

Dpartement des Sciences Biologiques, Centre de recherche BioMed, Universit du

Qubec, Montral, Qubec, Canada, H3C 3P8.

Correspondent footnote. *To whom correspondence should be addressed:

Dpartement des Sciences Biologiques, Centre de recherche BioMed, Universit du

Qubec. C.P. 8888, Succursale Centre-ville, Montral, Canada, H3C 3P8. Tel. 1-514

987-3000, Ext 8912; Fax: 1-514-987-4647; E-mail: mounier.catherine(),ugam.ca

38

2.1 Abstract

Fatty acid synthase (FAS) is a key enzyme of hepatic lipogenesis responsible

for the synthesis of long chain saturated fatty acids. This enzyme is mainly regulated

at the transcriptional level by nutrients and hormones. In particular, glucose, insulin

and T3 increase FAS activity whereas glucagon, saturated and polyunsaturated fatty

acids decrease il.

In the present study, we show that, in liver, T3 and insulin were able to activate FAS

enzymatic activity, mRNA expression and gene transcription. We have localized the

T3 response element (TRE) that mediates the T3 genomic effect, on the FAS

promoter between -741 and -696 bp that med iates the T3 genomic effect. We show

that both T3 and insulin regulate FAS transcription via this sequence. The TRE binds

a TR/RXR heterodimer, even in the absence of hormone and this binding is increased

in response to T3 and/or insulin treatment.

The use of H7, a serine/threonine kinase inhibitor, reveals that a phosphorylation

mechanism is implicated in the transcriptional regulation of FAS in response to both

hormones. Specifically, we show that T3 is able to modulate FAS transcription via a

non-genomic action targeting the TRE through the activation of a PI3-kinase-Erk ]/2

MAPK dependent pathway. Insulin also targets the TRE sequence, probably via the

activation of two parallel pathways: Ras/Erkl/2 MAPK and PI3-kinase/Akt. Finally,

our data suggest that the non-genomic actions of T3 and insulin are probably common

to several TREs, as we observed similar effects on a classical DR4 consensus

sequence.

Key words: Fatty acid synthase, triiodothyroninc, insulin, TRE, PB-kinasc, Erkl/2

MAPK.

39

2.2 Introduction

Lipogenesis converts dietary carbohydrates to fatty acids primarily in liver

(28). Insulin and triiodothyronine (T3) are involved in mediating the effects of diet on

lipogenesis in vivo (34). Hepatic lipogenesis is increased in hyperthyroid states or in

response to T3 injection (10, 15, 19, 24, 25, 28, 61, 70, 75, 82) as weil as in

hyperinsulinemic subjects (79). ln vivo, these two hormones are also involved in the

long-term regulation oflipogenic enzymes activities such as fatty acid synthase (37).

Farty acid synthase (FAS) (EC.2.3.1.85) is a key enzyme in hepatic

Iipogenesis. In presence of NADPH, this multifunctional enzyme catalyses the

conversion of acetyl-CoA and malonyl-CoA into long chain saturated fatty acids such

as palmitate and stearate (92). The de novo synthesis of fatty acids in human and

chicken mainly takes place in the liver (30, 58), whereas in rodents the adipose tissue

is also lipogenic (30). In vertebrates, FAS is a homodimer made of two identical

peptide chains of about 26kD (84, 91), located in the cytoplasm of the cell (31). FAS

is encoded by a unique gene that generates only one mRNA in mOllse (72) and two in

chicken and rat, as a result of alternative splicing (3). In the liver, the activity of FAS,

as most lipogenic enzymes (96), is regulated through nutrients and hormones.

Starvation causes decrease in the activity of the enzyme, and refeeding restores it (3,

66). A similar effect of refeeding is also observed on the mRNA expression level and

stability, as weil as on the transcription (3, 41, 48, 52, 65). It was also shown that

insulin (73) and T3 (83, 96) increase the FAS mRNA expression level, whereas

glucagon (50, 73, 81), medium chain fatty acids (MCFA) (76) and polyunsaturated

fatty acids (PUFA) decrease it (9, ]7,43,64).

lnsulin increases FAS transcription by modifying the binding of various

transcription factors on the insulin response element (IRE) located on the promoter

(73). The effect of insulin is mediated by the activation of the PI3-kinase/Akt

pathway (93). The first IRE characterized is an E-box, that binds the ubiquitous

transcription factors USFI and USF2 (Upstream Stimulatory Factors), located at

40

65bp on the FAS promoter (68, 94). lnsulin also increases transcription of FAS by

inducing the binding of SREBP-l c to two different SREs (Sterol Regulatory

Element), one located around -150bp (51) and the other at -65bp (51). Finally, insulin

also regulates FAS transcription by increasing the binding of NF-Y and SpI to the

103 bp 10 -53bp region (63).

Various studies from the AG. Goodridge's laboratory showed that T3 is able

to potentiate the effect of insulin on FAS transcription through an unknown

mechanism (83, 96). T3 is known to regulate gene transcription via the binding of

hormone/receptor complexes to T3 response elements (TRE) located on the promoter

of a variety of genes (97). The TREs are located, for the most part, upstream of the

minimal promoter, but can sometimes be 10cated on the 3' end of the coding sequence

(8). A consensual hexameric sequence, (GIA)GGT(CIG)A, was defined. This

sequence can be a palindrome (TREpal), a direct repeat (DRs) or an inverted

palindrome (IPs) (32). These TREs bind the T3 receptors (TR) belonging to the

nuclear receptor super-family (53). The latter can form homodimers or interact with

other nuclear receptors, such as RXR (retinoid X receptor) to forro heterodimers (lI,

27). The heterodimers bind preferentially to DRs separated by four nucleotides (DR4)

(74). This increases the transcriptional activity in response to T3, in a more efficient

manner than the TRJTR homodimers (39, 47). ln regard to the FAS gene, the

sequence alignment of different species (mouse, rat and chicken) suggests the

presence of a DR4-type TRE on the promoter (95).

Previous studies suggest that a general increase in the phosphorylation state of

the cell would maximize the T3 action by activating the transcription of target genes

(42, 60, 88). The TR nd RXR receptors, as well as different co-activators, can be

targets of these phosphorylation events. ln pmiicular, TR can be phosphorylated in

the cytosol (33) by casein kinase Il but a1so in the nucleus (85). This phosphorylation

would initiate TR heterodimerization with RXR (7), or could also protect it from

degradation, which in turn would increase transcription (89). It has also been shown

41

that SRC 1, a TR coactivtor, can be phosphory lated by MAP-kinase through the

activation of membrane bound receptors (77).

It becomes more apparent that thyroid hormones (THs) regulate transcription

via a non-genomic mechanism (5, 62), by activating different intracellular signaling

cascades. Cao and collaborators showed that in human. fibroblasts, T3 was able to

activate the PI3-kinase/PKB/mToRJp70s6K pathway via a direct cytosolic interaction

between TR and the PI3-kinase regulatory subunit, p85a. (14). Moreover, previous

studies have demonstrated that thyroid hormone is able to bind an integrin

alpha(V)beta(3) cell surface receptor leading to the activation of a PKCa. (1, 6, 21,

59). Subsequently, Erkl/2 MAPK is activated and translocated into the nucleus (22,

80) where it can phosphorylate the TR (22, 80).

In the present study, we have shown that at the hepatic level, insulin and T3

act synergistically to stimulate FAS activity. The effect of T3 on FAS is mainly

transcriptional and mediated by the binding of a TRJRXR heterodimer on a DR4-type

TRE. On top of that, our study reveals that the T3 action on the TRE also involved a

non-genomic action through the activation of a PB-kinase and Erkl/2 MAPK

dependent signaling pathway. Finally, our study also suggests that insulin is able to

modulate the transcriptional activity of the TRE either through the activation of a PI3

kinase/Akt and/or a Ras/Raf-Erkl/2MAPK signaling pathway.

42

2.3 Materials and methods

2.3.1 MateriaIs

The restriction enzymes, the T4 DNA ligase and the T4 polynucleotide kinase

were obtained from New England Biolabs (Pickering, CA). The Taq polymerase was

acquired from Perkin Elmer (Wellesley, MA). Eggs from white Leghorn chickens

were purchased from Couvoir Simentin (Mirabel, Quebec). HepG2 cells were

purchased from ATCC (Manassas, VA). Minimum Essential Medium (MEM),

Waymouth medium, 3,5,3-L-triiodothyronine, insulin, H7 and genistein were

obtained from Sigma. LY294002, PD98059 and UOl26 inhibitors were purchased

from Calbiochem (EMD Biosciences, San Diego, CA). [y_32p]_ATP was purchased

from Perkin Elmer (Wellesley, MA). Fugene HD transfecting agent, CAT-ELISA kit,

Collagenase H and Klenow enzyme were obtained from Roche Diagnostic (Laval,

Quebec). Fetal bovine serum was purchased from Cansera (Etobicoke, Ontario).

Antibodies (Akt, anti-phospho-Akt (Ser273), p42/44 MAPK, anti-phospho-p42/44

MAPK (Thr 2021204)) were acquired from Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers,

MA). Anti-TRa.lITr~1 and anti-RXRa./~/y antibodies were obtained from Santa Cruz

Biotechnology (Santa Cruz, CA). Unless otherwise stated in the text, ail other

chemicals were purchased from Sigma.

2.3.2 Plasmid Constructs

The goose fatty acid synthase promoter was graciously provided by Dr. A.G.

Goodridge (44). This cosmid contained 46kb of the FAS gene including 12kb

downstream of th.e transcription initiation site. The first 1.6kb of the FAS promoter

were cloned into the pJFCATI vector, which incorporates the Chloramphenicol

acetyl tranferase (29) reporter gene. The -902bp to -577bp fragment, containing the

FAS TRE, was PCR amplified using specifie primers containing HindIII and BamHI

restriction sites at their extremities. The amplified fragment was subsequently

inserted into the pBLCAT2 vector upstream of the thymidine kinase (88) minimal

43

promoter and the CAT reporter gene. The synthetic sequence of the classical TRE

DR4 (AGCTTAGCTTCAGGTCACAGGAGGTCAGAGAGG) was cloned into the

pBLCAT2 vector using the Hind III and SaI l restriction sites.

2.3.3 Ce!! culture and transfection.

Chick embryo hepatocytes (CEH) were isolated from livers of 19-day-old

chick embryos (35) (protocol # 590approved by the University animal care comity).

2.5 x 106 ceIls were plated in 35mm tissue dishes and cultured at 40 C under 5% CO2,

in Waymouth medium supplemented with streptomycin (100Ilg/mL) and penicillin

(60llg/mL). After 24h, the medium was removed by aspiration and replaced by

medium supplemented with T3 and/or insulin, and incubated for different periods of

time as indicated in the figure legends. For the experiment using kinase inhibitors, the

CEH were incubated with the hormones after a 30 min pre-incubation period with the

various inhibitors (DMSO 0.5%, 51lM genistein, 251lM H7, 50llM PD98059, SOIlM

LY294002, and 20llM U0126). The human hepatocarcinoma cells (HepG2) were

cultured in MEM medium supplemented with streptomycin Cl OOllg/mL), penicillin

(60llg/mL), FBS (10%) and glutamine (4mM final). The day before transfection, the

ceIls were plated at 80% confluence (about 6 x 105 cells per weIl). The cells were

then incubated for 24h with 71lL of Fugene HD, 1.Sllg of the different DNA

constructs tested and O.5llg of pRSV-~-galactosidase, in absence of serum and

antibiotics. The medium was then replaced with one containing antibiotics and serum,

and hormones were added as indicated in the figure legends. After 24h of culture, the

cells were harvested and the different cellular extracts were prepared.

2.3.4 FAS activity.

FAS activity was measured by tracking the decrease of absorbance at 340nm,

which is the result of NADPH disappearance due to the conversion of malonyl-CoA

and acetyl-CoA into long chain fatty acids (36). Following hormonal stimulation, 2 to

3 plates of treated cells (about 10 x 106 cells) were harvested in 1X PBS. After a short

44

centrifugation, the cells were re-suspended in cold homogenization butTer (0.1 M KPi,

pH 7; 3mM EDTA, pH 7 and ImM OTT). The cytosolic extracts were prepared

through homogenization of the cells with a Dounce homogenizer. The lysates were

subsequently centrifuged at 3000 rpm for 15 min at 4C. The FAS activi ties was

evaluated by mixing, in a Quartz cuvette, 50lJ,L of cell Iysate, O.IM KPi, pH 7;

0.0025mM acetyl-CoA; 0.18mM NADPH; 3mM EDTA and 1mM OTT. The reaction

was initialized by adding O.lmM of malonyl-CoA. The 00 at 340nm was then

recorded for a 15 min period, at 4oC in a Cary-lOO spectrophotometer (Varian,

Quebec).

2.3.5 Analysis of rnRNA expression level.

Total RNA was extracted from chick embryo hepatocytes as previously

described (16). UV-quantified RNA were diluted in DEPC-treated water at a final

concentration of 1!-Lg/fll. Reverse transcription (RT) was perfonned using the

Omniscript enzyme kit of Qiagen (Montreal, Quebec) and Oligo-dT (Roche

Diagnostics, Quebec) for 1hOO at 37C, with a 5 min inactivation step at 93C.

qPCRs were then performed using the QuantiTect SYBR Green PCR Kit from

Qiagen (Montreal, Quebec) and the LightCycler device (Roche Diagnostics, Quebec).

The HPRT-1 gene was used as reference. The relative quantification was then

performed using the RelQuant software (Roche Diagnostics, Laval, Canada). For the

FAS gene, primers were defined on goose sequences:

AGGAAATGAGGCTGCGTTG (sense) and CTGAGTGCTTCACGGTTGATG

(antisense) and for the HPRT-1 gene primers were defined on human sequences:

ATGACCTCTCAACCTTGACTGG (sense) and GGCCACTTTCACCATCTTTG

(antisense).

45

2.3.6 Analysis of promoter activity.

HepG2 cells were Iysed at room temperature in 500jlL of CAl' Elisa Iysis

buffer (Roche Diagnostics, Laval, Quebec). Protein concentration (12) and ~

galactosidase activity (78) \vere measured by the indicated methods. The CAT

activity was evaluated using the CAT-ELISA kit according to the manufacturer's

instructions (Roche Diagnostics). The results were expressed as CAT activity per

milligram of soluble protein, and then norrnalized for transfection efficiency using the

~-galactosidase activity.

2.3.7 Gel electrophoretic mobility shift assay.

HepG2 cells were incubated for 24h in serum free MEM with or without

IOOmM insulin, 1.6jlM 1'3 or both hormones and nuclear extracts were prepared as

previously described (2). A 40bp double stranded oligonucleotide corresponding to

the TRE sequence of the goose FAS gene

(TGCCCTGCCCGCCGCCCTGTGGTAACCTCGGGACCGCGCT) was labeled

with [y)2p]_ATP using the 1'4 polynucleotide kinase. 5jlg of nuclear extract were

incubated with 2111 of binding buffer containing 20,000cpm of 32p labeled probe,

lOng ofpoly(dI-dC), Ijll ofBSA, 4% (v/v) glycerol and 1% (v/v) ficol/. The reaction

was then incubated for 15 min at room temperature. For supershift experiments,

nuclear extracts were pre-incubated for 15 min at room temperature with 2jlg of

specifie antibody or with IgG. The reaction mixtures were then subjected to

electrophoresis on a 6% polyacrylamide gel at 150 V in 25mM Tris-HCl, 0.19M

glycine, 1mM EDTA. Gels were dried and visualized by autoradiography using the

phospho-imager system (Molecular imager FX, Biorad, Mississauga, Canada).

2.3.8 Western blot.

After treatment with the test agents, for the time and the concentration

indicated in the figure legends, CEH were rinsed twice with ice-cold phosphate

buffered saline (pH 7.4) and solubilized with lysis buffer (50mM Hepes, pH

46

7.S, lS0mM NaCI, 10mM sodium pyrophosphate, 100mM sodium fluoride, l.SmM

MgCb, 1mM EGTA, 200!lM sodium orthovanadate, 1mM phenylmethylsulfonyl

fluoride, tablet of EDTA free complete mini (Roche Diagnostics, Laval, Quebec),

10% glycerol, and 1% Triton X-100). Celllysates were c1arified by centrifugation at

10 000 x g for 20 min at 4 oC, and protein concentrations, in the resulting

supematants, were determined using the Bradford method (l2). 20!lg of protein from

cell Iysates were mixed with 4!l1 of 3x Laemmli sample buffer (2% SDS, 2% ~

mercaptoethanol, 10% VN glycerol and SOmg/ml bromophenol blue in 0.1 M Tris

HCI buffer, pH 6.8), heated at 100DC for S min, subjected to SDS-PAGE and then

transferred to Immobilon-P membranes (Millipore) for immunoblotting. Membranes

were incubated for 1h in blocking buffer (lX TBS, 0,1% Tween-20: TBST)

containing S% milk, and then overnight at 4C in TBST/5% BSA with the various

antibodies: FAS (l: 1000), GAPDH (1: 1000), Akt (1: 1000), phospho-Akt (l: 1000),

p42/44 MAPK (l: 1000), phospho-p42/44 MAPK (1: 1000)). After 3 consecutive

washes in IX TBST, the membranes were incubated in IX TBST with 5% milk in

presence of an anti-rabbit IgG bound to the horseradish peroxidase (1: 10000). SignaIs

were revealed using the ECL plus Western blotting detection reagent according to the

manufacturer's instructions (GE Healthcare, Baie d'Urf, Quebec). The appropriate

bands were quantified using the a-phospho-imager system (Molecular imager FX,

Biorad, Mississauga, Canada).

47

2.4 Results

2.4.1 Roles ofT3 and insulin on FAS enzyrnatic activity, protein and

rnRNA levels.

Various swdies have already demonstrated that in liver T3 and insulin are able

to increase FAS enzymatic activity and mRNA expression (86, 88, 96). Incubation of

the human hepatocarcinoma cells (HepG2) with 10nM, 100nM or 1.6~M T3 for 24h

significantly increases the level of the FAS protein expression. Addition of 100nM

insulin leads also to a similar level of increase while combination of the two

hormones is synergistic (Fig. 2.1 A). Most of the subsequent experiments will be

perfonned using 1.6~M T3 and 100nM insulin. In CEH, insulin and T3 are able to

increase FAS enzymatic activity by about 3 fold (Fig. 2.1 B) and in presence of both

honnones, an important synergistic effect is also observed, increasing the activity by

14 fold. Similar honnonal effects are observed on mRNA expression level (2.5 fold

increase with T3 or insulin, and 10 fold with both hormones, Fig. 2.1 C). Taken

together, these results suggest that T3 and insulin regulate FAS expression through a

pre-translational mechanism.

2.4.2 Effects of insulin and T3 at the transcriptionallevel

In order to evaluate if the effects of T3 and insulin are the result of a

modulation of the FAS promoter's transcriptional activity, we c10ned the proximal

fragment (around 1.5kb upstream of the cap site, -1450 to +133bp) of the goose FAS

promoter upstream of the Chloramphenicol Acetyl Tranferase (29) reporter gene.

Subsequently, this DNA construct (TRE-TK-CAT) was transiently transfected into

HepG2 cells, and the CAT activity was evaluated in presence or not of the two

honnones. As depicted in Fig. 2.2A, having T3 in- the medium increases the

transcription of the FAS gene about 3 fold. This suggests that a T3 response element

(TRE) is 'present in the first 1450bp of the FAS promoter. By 5' seriaI deletions, we

localized the TRE between -902 and -577bp (data no! shawn). This sequence,

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containing the TRE, was then inserted upstream of the minimal promoter of

thymidine kinase and the CAT reporter gene, and transiently transfected into the

ceUs. When the cells were treated with T3, we observed about a 3 fold increase in

CAT activity. Comparing the goose FAS se