UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI PISA FACOLTA’ DI FARMACIA · Heat shock proteins: nuovi target per...
Transcript of UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI PISA FACOLTA’ DI FARMACIA · Heat shock proteins: nuovi target per...
UNIVERSITArsquo DEGLI STUDI DI PISA
FACOLTArsquo DI FARMACIA
Corso di Laurea Specialistica in Farmacia
Tesi di Laurea
Heat shock proteins nuovi target per vari tipi di farmaci
Relatore Profssa Annalina Lapucci
Candidato
GIANFRANCO PERRI
ANNO ACCADEMICO 2010-2011
2
ldquoso please donrsquot cry I will always be your light
we will meet again one day I will shine on for everyonerdquo
The Jet ndash Shine on (Shine on ndash 2006)
3
INTRODUZIONE
Proteine dello shock termico (Hsp)
Le proteine dello shock termico (Hsp) sono una famiglia di proteine
indotte nelle cellule esposte a differenti insulti [1] Questa induzione di
Hsp permette alle cellule di sopravvivere in condizioni di stress Le Hsp
dei mammiferi sono state classificate in sei famiglie a seconda del peso
molecolare Hsp100 Hsp20 Hsp70 Hsp60 Hsp40 e piccole Hsp (da 15
a 30 KDa) comprese Hsp27 Queste proteine agiscono come chaperoni
molecolari sia nel ripiegamento di proteine mal ripiegate che nella loro
eliminazione se risultano irrimediabilmente danneggiate
bull Hsp 100 (100-110 kDa)
I membri della famiglia delle Hsp100 sono proteine altamente
conservate scoperte per la prima volta nei batteri come sistema
proteasico a due subunitagrave detto Clp La subunitagrave piugrave grande detta ClpA
ha attivitagrave di unfolding ATP-dipendente e proteine correlate ad essa
sono state rilevate sia nei batteri che negli eucarioti dove svolgono
attivitagrave antiaggregante La subunitagrave piugrave piccola ClpP egrave una proteasi ed egrave
stata invece trovata solo nei batteri associata a ClpA
La funzione principale delle Hsp100 egrave quella di promuovere la
rimozione di aggregati proteici formatisi in condizioni di stress in una
modalitagrave ATP-dipendente La ClpA favorisce il defolding
(denaturazione) dellrsquoaggregato che puograve andare incontro ad un processo
di refolding (rinaturazione) o essere idrolizzato dalla subunitagrave ClpP
4
bull Hsp 90 (85-90 kDa)
Sono proteine dimeriche con un sito di dimerizzazione localizzato nella
regione C-terminale Nella regione N-terminale contengono invece un
sito di legame per lrsquoATP La rottura delle Hsp90 in un dominio N-
terminale e in uno C-terminale rivela che entrambi i frammenti possono
sopprimere lrsquoaggregazione
Questi risultati suggeriscono che le Hsp90 contengono due siti che
contribuiscono indipendentemente alla sua attivitagrave di chaperone
molecolare
I due siti inoltre mostrano specificitagrave diversa per il substrato e
dipendenza o meno dallrsquoATP
Il sito N-terminale interagisce con proteine e peptidi non ripiegati in
modo ATP-dipendente mentre il sito C-terminale sembra agire come un
chaperone generale in modo ATP-indipendente
Le Hsp90 sembrano essere coinvolte nella trasduzione del segnale date
le loro interazioni con i recettori degli ormoni steroidei e con varie
chinasi del ciclo cellulare
bull Hsp 70 (66-78 kDa)
Le proteine Hsp70 si ritrovano in tutte le specie e la loro funzione egrave
quella di favorire lrsquoassemblaggio di complessi multimerici proteici e
come chaperone molecolari di facilitare il folding intracellulare delle
proteine Queste sono costituite da due domini funzionali un dominio
carbossiterminale (circa 25 kDa) contenente il sito di legame per il
polipeptide ed un dominio amminoterminale (circa 40 kDa) contenente
il sito di legame per ADPATP e che ha attivitagrave ATPasica Funzionano
come monomeri o come dimeri riconoscendo porzioni di 7-8 residui
amminoacidici Un esempio egrave la DnaK di Ecoli che egrave un membro
stress-inducibile della famiglia delle Hsp70 e coopera con DnaJ (una
5
Hsp40) e GrpE nel formare un sistema chaperone ATP-dipendente
coinvolto nei processi cellulari
bull Hsp 60
Molte Hsp60 appartengono alla famiglia delle chaperonine complessi
proteici oligomerici costituiti da due anelli sovrapposti di 7-9 subunitagrave
che formano una cavitagrave centrale in cui vengono accolte proteine in uno
stato non nativo
Il sistema GroEL presente nei batteri egrave un esempio di Hsp60 Esso egrave
costituito da 14 subunitagrave identiche che si articolano tra loro a costituire
una complessa struttura quaternaria formata da due anelli eptamerici
sovrapposti
Ciascun anello presenta una cavitagrave interna di 50 Aring di diametro che
ospiteragrave la proteina parzialmente denaturata GroEL richiede per la sua
attivitagrave di chaperone anche il legame e lrsquoidrolisi dellrsquoATP
bull Hsp 40
Le Hsp40 come le Hsp60 sono coinvolte in processi di stabilizzazione
e di corretto ripiegamento delle proteine nascenti La piugrave studiata e
caratterizzata egrave DnaJ di Ecoli che agisce come co-chaperone con DnaK
(Hsp70)
bull Hsp a basso peso molecolare
Hanno diverse funzioni che sono specie-specifiche ed egrave stato proposto
che esse agiscano da chaperoni molecolari e impediscano lrsquoaggregazione
proteica irreversibile
bull Hsp stress ossidativo e patologie
Come noto le HSP sono state riscontrate nelle cellule sottoposte ad
unrsquoampia varietagrave di condizioni di stress Lo stress ossidativo egrave coinvolto
in una serie di condizioni patologiche compresa la neurodegenerazione
le malattie cardiovascolari e lrsquoictus e nellrsquoinvecchiamento naturale
6
In queste condizioni lo stress ossidativo si verifica come conseguenza
dello squilibrio tra la produzione di specie reattive dellossigeno (ROS) e
la capacitagrave del corpo di disintossicarsi dagli intermedi reattivi di queste
Questo squilibrio puograve portare come conseguenza una eccessiva
produzione di ROS come osservato nelle malattie ischemiche o puograve
causare una diminuzione della capacitagrave degli enzimi antiossidanti
Come risultato il normale ambiente intracellulare egrave compromesso si
osserva ossidazione e aggregazione delle proteine e del DNA vitale che
si traduce nel fallimento della normale funzione cellulare
Le proteine ossidate si accumulano causando cosigrave infiammazioni acute
Tuttavia i cambiamenti nello stato redox cellulare possono anche essere
un segnale per lattivazione della cascata apoptotica
Fra i vari cambiamenti nellrsquoattivitagrave cellulare e nella fisiologia lrsquoevento
piugrave importante nelle cellule stressate egrave la produzione di un certo numero
di proteine altamente conservate le proteine dello shock termico o da
stress [2] Negli ultimi ventrsquoanni sono state eseguite numerose ricerche
sulla struttura e sulla funzione delle proteine da shock termico o Hsp
[3] Queste proteine sono risultate molto interessanti in quanto giocano
un ruolo fondamentale nella progressione del ciclo cellulare e
nellrsquoapoptosi (o morte programmata della cellula) e sono coinvolte in
molte malattie La risposta allo shock termico o di stress egrave una risposta
di adattamento cellulare che aiuta al mantenimento dellrsquoomeostasi
cellulare in condizioni di stress Ersquo stato osservato che subito dopo un
improvviso aumento di temperatura tutte le cellule mostrano
lrsquoespressione indotta di una famiglia di geni conosciuti come geni Hsp
La sequenza del DNA che costituisce questa famiglia di geni egrave
altamente conservata tra le specie Questa famiglia di geni era stata
originariamente chiamata cosigrave a causa della loro espressione dopo
7
lrsquoesposizione al calore Tuttavia la stessa risposta si ottiene dopo
differenti insulti inclusi stress ambientali e metabolici come ipossie
ischemie iperossie anossie esposizione alla luce UV e sostanze
chimiche nicotina stress chirurgico deficienze nutrizionali (per es
privazione del glucosio) stress emozionale e meccanico lesioni
meccaniche e agenti virali o altri tipi di stress come esposizione a
radicali tossici o ad agenti cancerogeni [4 abc] In condizioni di stress
come lo shock termico e alcuni stati fisiologici le proteine da stress
sono rapidamente indotte attraverso meccanismi di trascrizione e
trasduzione (figura 1)
Figura 1 Meccanismo di attivazione delle Hsp e riparazione delle proteine denaturate(DP)
(1) Condizioni di stress portano alla denaturazione delle proteine (2) La presenza DP
stimola la dissociazione del complesso Hsp-HSF Questo complesso limita il processo di
trascrizione in assenza di DP (3) mentre le Hsp sono libere di legarsi a DP HSF viene
attivato attraverso la fosforilazione e
La risposta inducibile allo shock termico genera un segnale che porta
allrsquoattivazione di un fattore di trascrizione [5] La trascrizione del gene
Hsp egrave sotto il controllo di una famiglia di fattori di trascrizione dello
shock termico (HSF) Membri differenti della famiglia di HSF possono
8
essere attivati da specifici stress diversi Nonostante siano stati scoperti
varie HSF HSF-1 ha dimostrato di essere il regolatore principale di una
breve induzione termica di Hsp Le Hsp giocano un importante ruolo
regolatore nella trascrizione dei geni Se le Hsp fossero sovraespresse in
assenza di stress si legherebbero direttamente al dominio di trans-
attivazione di HSF-1 determinando cosigrave la sua soppressione Le Hsp
sono proteine ubiquitarie sia nelle cellule eucariote che in quelle
procariote Come suggerisce il nome le Hsp sono indotte in cellule
esposte al calore sebbene le proteine dello stress (Chaperoni) possono
essere attivate da alcuni differenti tipi di insulti facendo in modo che le
cellule sopravvivano in condizioni altrimenti letali La tabella 1 presenta
un sommario di queste proteine la loro locazione cellulare e la loro
funzione Le Hsp ad alto peso molecolare sono ATP-dipendenti mentre
le Hsp a basso peso molecolare agiscono in maniera ATP-indipendente
[6]
9
Tabella 1 Hsp umanepeso molecolare localizzazione e funzione
10
Ogni famiglia di Hsp egrave composta da membri espressi sia in maniera
costitutiva che induttiva e si rivolge a diversi scomparti subcellulari [7]
Lrsquoattivazione costitutiva delle Hsp puograve verificarsi nelle cellule anche in
assenza di fattori di stress ambientali Per esempio Hsp90 puograve costituire
fino allrsquo1 del totale delle proteine cellulari in cellule non stressate [3]
indicando che queste proteine hanno un ruolo nel mantenimento della
conformazione delle proteine anche in condizioni normali In
condizioni di stress i dimeri di Hsp90 tendono ad associarsi in tetra-
esa- e ottameri ed oligomeri ancora piugrave elevati [8] In condizioni
fisiologiche Hsp90 si trova in associazione con diverse proteine
intracellulari tra cui calmodulina actina tubulina diverse chinasi e
qualche proteina recettore [9] I componenti dei complessi di Hsp90
come proteine kinasi e recettori steroidei possono mediare il trasporto
nucleare dellrsquoHsp90 specialmente sotto stress da calore Probabilmente
Hsp90 forma complessi stabili con filamenti di actina e si lega alla
tubulina per proteggere i microtubuli quindi puograve mediare
lrsquoorganizzazione strutturale del proteasoma un complesso
multicatalitico quando i livelli di ATP cellulari diminuiscono [5] Allo
stesso modo Hsp27 tende a oligomerizzarsi in condizioni di stress ed egrave
stato precedentemente dimostrato che nelle cellule tumorali endogene
Hsp27 egrave la piugrave importante proteina argpirimidina modificata e che
questa modifica comporta lrsquooligomerizzazione di Hsp27 [10]
Argpirimidina egrave un addotto metilgliossale-arginina che risulta dalla
glicazione non enzimatica di residui di arginina delle proteine nelle
cellule tumorali mostrando un aumento della glicolisi [11] Hsp27 e
Hsp70 sono fortemente ed universalmente indotte da diverse
sollecitazioni mentre la loro espressione egrave bassa in condizioni
fisiologiche permettendo ad attivitagrave costitutive cellulari di procedere
11
[12] A prescindere dalla loro localizzazione intracellulare le Hsp70
sono state trovate anche sulla membrana plasmatica delle cellule
trasformate malignamente e nello spazio extracellulare [13] Hsp70
Hsp90 e la proteina GP96 chaperone residente nel reticolo
endoplasmatico (RE) appartenente alla famiglia di Hsp90 [14] sono
state trovate nel mezzo cellulare Questo mette in considerazione la
duplce funzione delle Hsp la funzione citoprotettivaantiapoptotica
intracellulare e la funzione immunogenica extracellulare [7] Le Hsp
intracellulari sono importanti in quanto assicurano il ripiegamento delle
proteine nella loro corretta struttra terziaria lrsquoincorporazione di
polipeptidi nelle membrane intracellulari o nel trasporto delle proteine
attreverso le membrane [9] mentre la funzione delle Hsp extracellulari egrave
immunogenica attreverso lo chaperoning di peptidi antigenici I membri
della famiglia di Hsp70 e Hsp90 sono stati rilevati nel mezzo delle
cellule presentanti lrsquoantigene (APC) Ersquo stato osservato che lrsquouptake di
complessi Hsp-peptidi da parte delle APC egrave specifico saturabile e
concentrazione dipendente e quindi egrave stata ipotizzata lrsquoesistenza di
recettori Hsp specifici [7] Quindi il potenziale coinvolgimento delle
Hsp in molti tipi di malattie le ha rese particolarmente importanti per lo
sviluppo di nuove terapie
12
CHAPERONINE MOLECOLARI E CONTROLLO
QUALITArsquo DELLE PROTEINE
Nelle cellule viventi sia le catene polipeptidiche di nuova sintesi che le
preesistenti sono a rischio costante di mal ripiegamento
(MISFOLDING) o aggregazione In conformitagrave con lrsquoampia diversitagrave di
forme mal ripiegate lrsquoelaborazione di strategie di controllo qualitagrave si
sono evolute per opporsi a questa inevitabile disavventura Recenti studi
descrivono la rimozione di aggregati dal citosol rivelano meccanismi di
controllo di qualitagrave per proteine nel reticolo endoplasmatico (RE) e
forniscono nuove intuizioni in due classi di chaperoni molecolari
lrsquoHsp70 (Heat Shock Protein 70) e lrsquoAAA+ (Hsp100) [15]
FOLDING DI PROTEINE NEL RETICOLO
ENDOPLASMATICO RICONOSCERE IL GIUSTO
DALLO SBAGLIATO
Il reticolo endoplasmatico (ER) un organulo presente sia nelle cellule
animali che vegetali svolge un ruolo premimente in numerosi processi
di fondamentale importanza per la sopravvivenza e per il normale
funzionamento cellulare LER occupa circa il 10 del volume della
cellula e la metagrave della superficie coperta da tutte le membrane della
cellula (endomembrane piugrave membrana plasmatica) [16]
Il reticolo endoplasmatico (RE) riveste numerose funzioni vitali per la
cellula Tra le tante egrave la stazione iniziale della via secretoria ed egrave quindi
il luogo nel quale circa un terzo di tutte le proteine di una cellula viene
sintetizzato e ripiegato correttamente [17] in secondo luogo lrsquoER egrave il
13
punto di partenza dal quale numerose proteine vengono smistate e
indirizzate verso la loro destinazione finale [18]
LrsquoER egrave quindi la sede della sintesi del ripiegamento (ldquofoldingrdquo) e delle
modificazioni post-traduzionali delle proteine di membrana e secrete ed
egrave responsabile della maturazione strutturale di un quarto del proteasoma
che attraversa le vie secretorie
Il ripiegamento delle proteine secretorie fornisce una serie di sfide
uniche in quanto egrave accompagnato e dipendente dalla formazione di ponti
disolfuro ed inserzioni nel doppio strato lipidico con entrambi gli eventi
che si verificano piugrave lentamente di tipici cambi conformazionali che
accompagnano il ripiegamento Conseguentemente il RE fornisce le
condizioni ottimali per fronteggiare queste sfide includendo unrsquoalta
concentrazione di chaperoni generici oltre a una gamma di specifiche
strategie fatte su misura per favorire il ripiegamento delle proteine
secretorie Inoltre esiste un sofisticato sistema di controllo-qualitagrave nel
RE per trattenere e riparare proteine che non hanno raggiunto ancora il
loro stato naturale Malgrado la lunghezza con la quale le cellule vanno
a fornire un ambiente ottimale nel RE il ripiegamento delle proteine
secretorie puograve avvenire o manca a volte ad un ritmo allarmante Il RE
adopera due meccanismi di risposta in presenza di forme mal ripegate Il
primo meccanismo egrave una risposta allo stress RE-dedicato definito UPR
(risposta alla non corretta conformazione delle proteine) che attua il
rimodellamento del RE cosigrave da aumentare la sua capacitagrave di
ripiegamento [16] Una proteina malfunzionante rimane sequestrata nel
reticolo endoplasmatico quindi un eccesso di proteine mal strutturate
attiva la risposta da proteine con folding scorretto (Unfolded Protein
Response) Questo tipo di risposta inizia con il riconoscimento del
segnale di stress da parte di un recettore nel reticolo endoplasmatico e
14
prosegue con il blocco della sintesi proteica per permettere al
proteasoma di eliminare lrsquoeccesso di proteine mentre viene stimolata la
produzione di fattori di trascrizione Il secondo meccanismo chiamato
degradazione RE-associata (ERAD) riconosce in modo specifico le
parti terminali di proteine mal ripiegate e le loro retrotraslocazioni
attraverso la membrana del reticolo endoplasmatico nel citosol dove
possono essere degradate dal sistema di degradazione ubiquitina-
proteosoma [17] Questi due meccanismi sono intimamente collegati
lrsquoinduzione UPR aumenta la capacitagrave dellrsquoERAD una diminuzione
dellrsquoERAD comporta unrsquoinduzione dellrsquoUPR costitutivo e
contemporaneamente la diminuzione di ERAD e UPR fa diminuire di
molto la viabilitagrave delle cellule I sistemi UPR ed ERAD fronteggiano
anche il comune problema del riconoscimento che richiede
lrsquoidentificazione delle forme mal ripiegate potenzialmente patologiche
nellrsquoambiente del RE La sorveglianza di UPR ed ERAD deve garantire
un buon equilibrio proteggendo le cellule dalle pericolose specie mal
ripiegate evitando la sovra vigilanza (come accade con forme mutate di
regolatori trans membrana della fibrosi cistica CFTR) che puograve portare
allrsquoeliminazione di forme potenzialmente sanabili Recenti studi hanno
rivelato come ERAD ed UPR identifichino forme mal ripiegate
Pertanto il RE rappresenta un preciso sistema di controllo di qualitagrave atto
ad assicurare che solo le proteine correttamente ripiegate e funzionanti
possano essere rilasciate dallrsquoER e raggiungere la loro destinazione
finale mentre le proteine malripiegate o non funzionanti sono trattenute
nel ER e in seguito traslocate nel citosol per la degradazione
15
RISPOSTA ALLA NON CORRETTA
CONFORMAZIONE DELLE PROTEINE
Le proteine designate per il riconoscimento dei segnali di stress
provenienti dal reticolo endoplasmatico sono generalmente IRE1
(Inositol Requiring Kinase 1) ATF6 (Activation of Transcription Factor
6) e PERK (PKR-like Endoplasmic Reticulum Kinase)
Nel lievito la capacitagrave di ripiegarsi del RE egrave monitorata da IRE1 una
chinasi trans membrana altamente conservata che contiene un dominio
luminale responsabile del riconoscimento delle forme mal ripiegate
chinasi citosoliche e domini ribonucleasici Lrsquoaccumularsi delle proteine
mal ripiegate nel RE porta allrsquoattivazione delle chinasi IRE
Lrsquoattivazione delle IRE-chinasi promuove lo splicing non convenzionale
dei messaggi per un fattore di traduzione b-ZIP (Hac1 nel lievito e XBP-
1 nei metazoi) attraverso il suo dominio ribonucleasico La traduzione
del messaggio Hac 1 spliced crea un fattore attivo di trascrizione che
media direttamente la trascrizione dei target di UPR includendo
chaperoni del RE macchinario ERAD e tante altre proteine secretorie
In aggiunta alla IRE-1 gli eucarioti piugrave sviluppati utilizzano due altri
sensori le chinasi trans membrana del RE PERK ed il fattore di
trascrizione trans membrana del RE ATF6 (Figura 2) PERK contiene
un sensore luminale che egrave altamente correlato a quello di IRE-1 il
dominio citoplasmatico di PERK consiste in una chinasi elF2α
16
Figura 2 Struttura dei principali sensori dello stress nel reticolo endoplasmatico IRE1
ATF6 PERK
Lrsquoattivazione delle chinasi dovuta alla presenza di proteine mal
ripiegate determina unrsquoinibizione generalizzata della traduzione come
pure la up-regulation del fattore di trascrizione specifico ATF4
Lrsquoaccumulo di proteine mal ripiegate permette inoltre ad ATF6 di
raggiungere lrsquoapparato del Golgi dove le proteasi trans membrana
rilasciano il dominio citoplasmatico del fattore di trascrizione
permettendogli di entrare nel nucleo e mediare lrsquoinduzione genetica
Lrsquoesistenza di molteplici sensori UPR negli eucarioti piugrave avanzati
permette per lo piugrave una risposta piugrave sfumata alle proteine mal ripiegate
Per esempio una risposta iniziale alle proteine mal ripiegate potrebbe
portare ad una down-regulation generalizzata della traduzione seguita in
sequenza da unrsquoinduzione di chaperoni lrsquoinduzione del macchinario
17
ERAD ed infine contro lo stress prolungato lrsquoattivazione della morte
cellulare tramite apoptosi Molto recentemente ci sono stati notevoli
progressi nelle nostre conoscenze molecolari di come IRE-1 (e per
deduzione PERK) riconosce le proteine mal ripiegate Studi precedenti
avevano dimostrato che BIP (Binding Immunoglobulin Protein) lrsquo
omologo principale delle Hsp70 presente nel reticolo endoplasmatico si
lega in modo specifico con IRE1 e che questa interazione scompare in
condizioni di stress del RE Inoltre lrsquoiperespressione di BiP puograve
sopprimere lrsquoinduzione dellrsquoUPR Questo aveva suggerito un modello di
titolazione in cui BiP agisce come un regolatore negativo di IRE1 e
lrsquoaccumularsi di forme mal ripiegate porta indirettamente allrsquoattivazione
dellrsquoIRE1 attraverso il sequestro di BiP da parte proteine mal ripiegate
Tuttavia recenti studi hanno dimostrato che anche se il legame del BiP
possa avere un ruolo importante nella down-regulation di IRE1 ci sono
altri fattori importanti Analisi mutazionali hanno trovato che la
delezione della regione di IRE1 responsabile del legame con BiP non
altera la regolazione di IRE1 in risposta alle proteine unfolded [18] Piugrave
drammaticamente la struttura cristallina del core del dominio luminale
conservato (cLD) di IRE1 nel lievito rivela una profonda scanalatura
idrofobica che ricorda la tasca legante dei maggiori complessi di
istocompatibilitagrave (MHCs) che sono i responsabili per il riconoscimento
peptidico Che IRE1 possa legarsi direttamente a polipeptidi mal
ripiegati egrave unrsquoidea interessante (Figura 3) [19]
18
Figura 3 Un modello ipotetico descrive lrsquoattivazione di Ire1 attraverso la oligomerizzazione
determinata dal legame di proteine unfolded (indicate in rosso) Le interazioni dirette o
indirette fra le catene delle proteine unfolded possono contribuire allrsquoattivazione Sul lato
luminale della membrana del RE le proteine unfolded si legano alla scanalatura (indicata in
grigio) formata dalla dimerizzazione del core del dominio luminale di Ire1 attraverso
linterfaccia 1 Sul lato citoplasmaticodella membrana del RE la oligmerizzazione accosta i
domini della chinasi Ire 1 che subiscono un cambiamento conformazionale in seguito ad
autofosforilazione che porta allrsquoattivazione della funzione di RNA-ribonucleasi di Ire1
Attraverso il riconoscimento diretto delle forme mal ripiegate
lrsquoinduzione di IRE1 potrebbe verificarsi prima della completa titolazione
di BiP che data lrsquoestrema abbondanza di questrsquoultimo nel RE potrebbe
verificarsi solo dopo un catastrofico accumulo di proteine mal ripiegate
Inoltre il riconoscimento diretto di forme mal ripiegate da parte di IRE1
(e PERK) potrebbe consentire una serie di risposte piugrave sfumate in cui
diverse forme mal ripiegate potrebbero essere preferenzialmente
riconosciute da sensori diversi quali BiP IRE1 o PERK Cosigrave in linea
di principio la natura (per esempio traslazionale contro transcrizionale)
ed il ciclo di UPR potrebbe essere su misura per la classe specifica di
forme mal ripiegate che sono prevalenti nel RE [20]
19
DEGRADAZIONE DELLE PROTEINE ASSOCIATA AL
RETICOLO ENDOPLASMATICO
Come ci si poteva aspettare dalla diversitagrave delle proteine che si
ripiegano NEL RE studi recenti hanno dimostrato che la degradazione
ER-associata (ER-Associated Degradation ERAD) comprende una
serie di sistemi diversi ciascuno responsabile della degradazione di
sottoinsiemi di proteine che condividono proprietagrave fisiche comuni
Esistono anche regioni dedicate allrsquo ER Associated Degradation
(ERAD) nelle quali proteine che non raggiungono il corretto
ripiegamento vengono retrotraslocate al citosol e quindi degradate dal
proteasoma [21]
Ciograve forse egrave piugrave chiaramente dimostrato nel lievito dove ci sono almeno
due distinti meccanismi di sorveglianza per identificare le proteine mal
ripiegate del RE Il primo meccanismo chiamato ERAD-L analizza le
proteine che contengono domini luminali mal ripiegati (solubili o trans
membrana) chiamati CPY una forma mutante della proteina CPY
endogena che egrave incapace di folding Il secondo denominato ERAD-C
rileva domini mal ripiegati citosolici di proteine trans membrana [22]
Sebbene entrambe queste vie in ultima analisi convergano sul sistema
di degradazione ubiquitina-proteosoma esse dipendono da diversi
insiemi di componenti RE-associati per rivelare e fornire specie mal
ripiegate al citosol Nel caso di ERAD-C (e non di ERAD-L) la
degradazione egrave in genere dipendente da uno specifico sottoinsieme di
chaperoni citosolici inclusi i membri Hsp40 e Hsp70 Ciograve suggerisce
che queste proteine possono essere direttamente responsabili per il
riconoscimento di domini citosolici mal ripiegati di proteine trans
membrana Tuttavia le caratteristiche esatte che vengono monitorate e
20
come i substrati vengano consegnati al macchinario di
retrotranslocazione restano importanti questioni aperte per la maggior
parte dei substrati Il riconoscimento di una proteina contenente un
dominio luminale mal ripiegato dipende in modo determinante dallo
stato di glicosilazione della proteina Infatti anche piccole modifiche di
glicani N-linked puograve provocare danni gravi nella degradazione di
numerosi substrati Questo puograve effettivamente lasciare le proteine in un
limbo impossibile raggiungere lo stato nativo ma non riconosciuto dal
macchinario ERAD esse restano mal ripiegate nel RE a tempo
indeterminato A prima vista questa dipendenza dalla glicosilazione
sembra essere un miglioramento non necessario Tuttavia egrave ormai chiaro
che lo spettro di porzioni di zucchero presenti in una proteina egrave un
segnale fondamentale nel marcare il suo status di ripiegamento Infatti
dato che diverse proteine altamente abbondanti nel RE tra cui BiP e
PDI spesso non sono glicosilate la presenza e la natura covalente di
molto mannosio in un polipeptide puograve fornire un segnale importante che
aiuta il macchinario di controllo-qualitagrave del RE a distinguere le specie
ripiegate destinate ad altri scomparti da quelle piugrave abbondanti e
permanenti del RE Lrsquointuizione nel ruolo della glicosilazione nella
discriminazione tra le specie in via di ripiegamento e le proteine
terminali mal ripiegate nel RE egrave venuta dalla constatazione che
glicoproteine mal ripiegate subiscono un taglio dei loro N-glicani da una
varietagrave di glicosidasi tra cui una mannossidasi specifica In aggiunta a
proteine mal ripiegate persistenti si egrave pensato che il rimodellamento
dipendente dal tempo di N-glicani porti ad un segnale per la
degradazione del macchinario ERAD Questo permette intermedi
ripiegati in un periodo di tempo prima del rimodellamento dei loro N-
glicani in cui il polipeptide egrave immune dalla sorveglianza ERAD Egrave
21
interessante notare che un recente studio suggerisce che anche per i
polipeptidi citosolici vi egrave un periodo durante e subito dopo la sintesi in
cui le specie mal ripiegate sono immuni alla degradazione del
proteasoma [23] Recenti studi hanno identificato due differenti lettine
localizzate nel RE che svolgono un ruolo critico nellrsquoERAD La prima egrave
correlata alla proteina mannossidasi responsabile del taglio di N-glicani
nel RE ma sembra aver perso la sua attivitagrave catalitica Nel lievito si
chiama Htm1pMnl1p e nei mammiferi egrave chiamato EDEM Studi
condotti su cellule di mammifero suggeriscono che EDEM aiuta le
glicoproteine mal ripiegate a lasciare il ciclo calnexinacalreticulina del
chaperone lectina dove stanno cercando di ripiegarsi e cosigrave entrare nel
ciclo di degradazione [24 ab] Tuttavia nel lievito Htm1p egrave richiesto
per la degradazione efficiente di substrati come CPY che non
dipendono da calnexina Quindi sembra probabile che Htm1pEDEM
ricopra altri ruoli in ERAD La seconda lectina Yos9p forma un
complesso stabile con proteine mal ripiegate e la perdita di questa
lectina conduce ad un profondo e specifico difetto nella degradazione di
glicoproteine mal ripiegate [25] Sorprendentemente mentre mutazioni
puntiformi nella tasca di Yos9p legante il mannosio eliminano la sua
capacitagrave di supportare ERAD i mutanti stessi di Yos9p mostrano una
maggior interazione con i substrati Ciograve indica la possibilitagrave che la
lectina Yos9p svolga un ruolo piugrave informativo interrogando lo stato
dello zucchero di forme mal ripiegate per determinare se debbano essere
passate al macchinario di retrotranslocazione Tuttavia come con
ERAD-C sebbene ci siano stati grandi progressi nella caratterizzazione
del macchinario di retrotranslocazione [26] le caratteristiche strutturali
delle proteine mal ripiegate sono in fase di monitoraggio e sono ancora
22
limitate le conoscenzedi come le forme mal ripiegate sono passate a
questo macchinario
CLEARENCE DI AGGREGATI ATTRAVERSO
LrsquoAUTOFAGIA
Egrave sempre piugrave evidente che ci sono una varietagrave di condizioni in vivo che
anche con chaperoni e macchinari proteolitici presenti nello stesso
compartimento come proteine mal ripiegate questi meccanismi di
controllo-qualitagrave falliscono e le proteine mal ripiegate avanzano
formando aggregati Inoltre tali aggregati intracellulari sono associati
con una serie di malattie neurodegenerative come il morbo di
Huntington e di Parkinson La natura e la sorte di aggregati di proteine
nelle cellule eucariotiche egrave stata poco compresa Recentemente egrave stata
sempre piugrave sostenuta unrsquoazione protettiva della formazione di aggregati
piuttosto che unrsquoimmediata azione patogena Per esempio nel caso del
morbo di Huntington lrsquoesame di cellule neuronali in coltura
sovrapproducenti una fusione di poliglutamina espansa e huntingtina-
GFP rivelano che queste cellule contenenti aggregati fluorescenti
morfologicamente visibili esibiscono una migliore viabilitagrave rispetto a
quelle aventi per via diffusionale materiale fluorescente [27] Questo
sembra in accordo con il concetto che si tratta di piccoli assemblati di
proteine mal ripiegate inclusioni non morfologicamente visibili che
esercitano effetti tossici sulle cellule Analogamente un recente
confronto delle dimensioni rispetto a tossicitagrave per gli aggregati di
proteina prionica PrP suggerisce che piccoli aggregati contenenti da una
a due dozzine di molecole sono risultati i piugrave tossici per le cellule [28]
23
Ma le cellule dispongono di meccanismi di compensazione per questi
piccoli aggregati Studi recenti hanno suggerito che la via ubiquitina-
proteosoma possa essere il pilastro della rimozione di specie inclini
allrsquoaggregazione Infatti gli aggregati rilevati nel contesto di
neurodegenerazione di solito sono reattivi con gli anticorpi anti-
ubiquitina il che implica che le specie mal ripiegate sono state
riconosciute dal sistema di coniugazione dellubiquitina Eppure vari
studi di questi ultimi anni indicano che queste proteine modificate
rappresentano una sfida particolare per proteasomi che possono portare
alla loro inibizione [29 ab] Il meccanismo di questa inattivazione
rimane sconosciuto ma puograve coinvolgere il soffocamento della camera
del proteasoma [30]
Anatomia del proteasoma Il proteasoma egrave una macromolecola proteica del peso di circa 2 milioni
di Daltons Ersquo formata da ununitagrave base centrale (core) e 2 cappucci agli estremi (cap) Il core egrave
formato a sua volta da 4 anelli ciascuno costituito da 7 unitagrave proteiche I due ldquocaprdquo attaccati alle
due estremitagrave del core cilindrico consistono ciascuno di 20 subunitagrave
24
Ora sembra che la modifica dellrsquoubiquitina possa reclutare specie
aggregate mediante una via indipendente lrsquoAUTOFAGIA Lrsquoautofagia
implica il riconoscimento e lrsquoimpacchettamentofagocitazione di
proteine specifiche o organelli in vescicole autofagosomiche che si
fondono con i lisosomi in cui sia le vescicole che il loro contenuto sono
scomposti Piugrave di 20 componenti cosiddetti Atg (geni coinvolti
nellrsquoautofagia) mediano questo processo straordinario Recenti studi
hanno dimostrato che componenti centrali della formazione di autosomi
nei topi hanno attivitagrave nei tessuti dei mammiferi Per esempio carenza
di atg5 ha portato alla morte di animali appena nati a causa
dellrsquoincapacitagrave di fornire un apporto di aminoacidi attraverso la
degradazione di proteine del corpo durante la condizione di fame
relativa allrsquoimmediato periodo post-natale Sorprendentemente in un
altro studio in cui egrave stata indotta una carenza di atg7 piugrave avanti nella
vita con un gene ldquofloxedrdquo lrsquoaccumulo di aggregati positivi
allrsquoubiquitina egrave stata osservata nel fegato degli animali che sono stati
disabilitati nella produzione di autofagosomi La funzione del
proteasoma in questi animali egrave rimasta inalterata contenente specie mal
ripiegate etichettate con ubiquitina e possono essere eliminate attraverso
autofagia Egrave stato poi scoperto un componente denominato p62 (o
sequestosoma1) che costituisce un guscio attorno agli aggregati di
huntingtina [31] Questa proteina contiene un dominio C-terminale
associato allrsquoubiquitina (UBA) che puograve legare poliubiquitine in modo
tale che p62 si collochi con lrsquoubiquitina quando espressa in cellule
HeLa Inoltre nelle cellule che esprimono huntigtina p62 si associa con
LC3 una proteina localizzata negli autofagosomi In accordo con quanto
riportato e cioegrave che lrsquoautofagia riduce i livelli di aggregati di
huntingtina e con un ruolo critico di p62 in questo processo lrsquoinibizione
25
antisenso mediata dallrsquoesperessione di p62 aumenta lrsquoapoptosi delle
cellule che esprimono huntungtina Quindi sembra che la modifica
dellrsquoubiquitina delle proteine difettose possa offrire un ingresso sia al
sistema proteasoma o in contesti dove lrsquoaggregazione egrave in corso al
sistema autofagia
SISTEMI CHAPERONI HSP70
Le Hsp70 proteine dello shock termico di 70 KDa sono impegnate in
una serie di processi tra cui il ripiegamento di proteine di nuova sintesi
il trasporto delle proteine attraverso membrane il ripiegamento di
proteine mal ripiegate ed aggregate e il controllo delle attivitagrave delle
proteine regolatrici Questa versatilitagrave egrave ottenuta attraverso
lampliamento e la diversificazione evolutiva di geni hsp70 che ha
generato sia chaperoni Hsp70 specifici Hsp110 e proteine Hsp170 La
versatilitagrave egrave determinata attraverso lrsquoimpiego di cochaperoni proteine J
e fattori di scambio di nucleotide (NEF) che regolano lrsquoattivitagrave di Hsp70
(Figura 4)
26
Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame
del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una
Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)
Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la
proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato
allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del
substrato
Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre
specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb
Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di
legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un
numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame
dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi
Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina
Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni
Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali
di Hsp70 con se stesso
27
INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70
Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di
proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura
xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding
appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide
N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD
adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio
elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con
lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante
chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco
tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini
di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di
comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura
di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione
La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la
tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo
coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture
precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una
proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da
una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β
ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica
compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio
elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di
legame del substrato (Figura 5)
28
Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo
substrato
La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra
domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che
collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo
solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi
residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame
allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A
dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso
Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un
legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in
nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano
completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve
entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo
fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui
coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del
segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti
integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A
29
capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il
quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di
ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a
idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di
DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro
catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente
arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia
drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete
crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la
barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK
costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina
superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura
della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera
attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della
prolina
DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-
NUCLEOTIDE
Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi
meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono
fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la
liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del
substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la
dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine
BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave
dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con
30
funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S
cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1
(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la
disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e
HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70
fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi
della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente
indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene
GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg
di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei
nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte
posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i
nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario
BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in
modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del
complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si
compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo
Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva
[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con
conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve
indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca
di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di
convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la
reazione di scambio nucleotidica di Hsp70
31
LEGAMI Hsp70-Hsp70
Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro
della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In
particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce
come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola
lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di
questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento
Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il
cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che
sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi
eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente
lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se
non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di
complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di
nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di
scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione
importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto
di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel
folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle
Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza
proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa
con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere
coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di
traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina
Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come
sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le
interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di
32
Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi
SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua
attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano
legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di
idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede
possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano
lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina
stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che
Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami
con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina
J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di
stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega
bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o
Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non
limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che
la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-
associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con
Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito
meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande
aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante
per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70
AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP
Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli
AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione
disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]
33
Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un
anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del
proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico
20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA
svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP
Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104
nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico
per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste
attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come
una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-
etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE
per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla
fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il
meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere
tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria
per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli
anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una
parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali
suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata
assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando
una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a
spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad
entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel
caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro
che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti
dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una
proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In
parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno
34
individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi
domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre
interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta
apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati
che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la
questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)
Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97
Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da
proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad
entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro
efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non
devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati
dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte
lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono
piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte
superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine
adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il
35
movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori
p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su
proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di
proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la
retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e
reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo
anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite
adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente
il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente
forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei
canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]
LrsquoAZIONE DELLrsquoATP
La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico
al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco
affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad
esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello
Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che
ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo
di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli
wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli
mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori
dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di
ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di
un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di
quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda
36
subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino
al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave
significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o
sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti
differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra
essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che
attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave
adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non
vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a
cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di
subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico
Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un
substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di
queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un
meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da
F1-ATPasi non sembra escluso
HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE
NEURODEGENERATIVE
RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE
Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel
mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una
pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi
associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione
37
di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di
Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta
promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]
Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90
nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave
funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi
permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]
HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico
Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono
mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)
accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock
citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata
da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante
di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo
stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si
lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei
geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-
shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via
multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di
transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-
translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90
[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e
mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo
shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con
Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)
38
attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da
shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni
Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che
i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro
sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock
termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su
attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato
che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi
di insulti
Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90
e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con
shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La
somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a
topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello
39
Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge
contro aggregati tossici
Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un
aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave
egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di
chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione
incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste
molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente
diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su
espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative
Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie
neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a
mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei
neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia
muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-
pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma
mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme
nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che
Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in
oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza
attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili
[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di
Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt
mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore
di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo
suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro
effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi
40
indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando
monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono
probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono
essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di
atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70
permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]
Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare
spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo
nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un
miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina
[62]
Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il
riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso
lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido
dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli
di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i
motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione
acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni
Riluzolo
Arimoclomol
41
Nei vari modelli cellulari della malattia di Alzheimer (AD) vi egrave un
incremento dei livelli di Hsp70 promossa dalla solubilitagrave e dal legame ai
microtubuli delle proteine tau [63] Hsp70 ha anche inibito la
propensione di aggregazione di Aβ [64] e ridotto la tossicitagrave di Aβ su
culture neuronali [65] Inoltre la proteina precursore dellrsquoamiloide
(APP) eo il suo Aβ amiloide derivato sono bersagli di chaperoni
mediati da clearence [66-67] Nella Drosophila melanogaster e nei
modelli di lievito della malattia di Parkinson (PD) lrsquoespressione diretta
di Hsp70 o la modulazione farmacologica di Hsp ha impedito la perdita
di neuroni causata da alfa-sinucleina [68-69] Huang et al hanno
riportato che questi effetti di Hsp70 si manifestano con lrsquoinibizione della
formazione di fibrille di alfa-sinucleina prevenendo la formazione di
alfa-sinucleina prefibrillare [70] Usando delezioni mutanti di alfa-
sinucleina Luk et al hanno indicato che le interazioni tra il dominio
legante il substrato Hsp70 e la regione del core idrofobico dellrsquoalfa-
sinucleina mediano lrsquoinibizione dellrsquoassemblaggio e che questo
processo di assemblaggio egrave inibito prima della fase di allungamento
[71] Nel complesso in diversi modelli di malattia neurodegenerativa la
sovra espressione di Hsp70 ha migliorato la gravitagrave della malattia di
fenotipi diversi senza incidere visibilmente sulla formazione di
aggregati suggerendo che i chaperoni non impediscono lrsquoaggregazione
di per seacute bensigrave reindirizzano gli aggregati preferibilmente in depositi
amorfi quindi sequestrando specie potenzialmente tossiche dalla
maggior parte della soluzione
42
Lrsquoespressione di Hsp70 e di altre Hsp egrave indotta dallrsquoinibizione
farmacologica di Hsp90
Come riportato sopra lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal
complesso con Hsp90 con susseguente produzione di Hsp (Figura 7) e
lrsquoinduzione di Hsp70 da parte di inibitori di Hsp90 egrave ben documentata
nei modelli di malattie neurodegenerative La geldanamicina (GM) un
inibitore di Hsp90 induce un aumento dose dipendente di Hsp70 nei
modelli di cellule di AD (Alzhaimer) cosigrave come nei neuroni della
corteccia primaria del ratto e riduce la quantitagrave di tau insolubili e dei
livelli basali di acido okadaico indotto da tau fosforilazione [63] Il
trattamento di neuroni primari corticali con lrsquoinibitore di Hsp90 con
struttura purinica il PU24FCI ha portato ad un aumento di Hsp70 dose-
dipendente [72]
PU24FCI
KU32
43
Allo stesso modo la somministrazione di due derivati di PU24FCI
CNS-permeabili il PU-DZ8 [72] ed il EC102 [73] a topi tau transgenici
(htau e JNPL3) ha determinato induzione di Hsp70 nel cervello e
mantenuto gli effetti per 24 ore dopo la somministrazione KU32 un
inibitore di Hsp90 di diversa natura chimica ha indotto Hsp70 in culture
SH-SY5Y di neuroblastoma e la ha protetta da tossicitagrave indotta da Aβ
GM ha attivato una risposta da shock termico ed inibito lrsquoaggregazione
di htt in un modello di coltura cellulare di HD ed ha indotto Hsp70 in
maniera tempo e concentrazione-dipendente ed ha impedito
lrsquoaggregazione di alfa-sinucleina e protetto contro la tossicitagrave in un
modello di aggregazione cellulare di alfa-sinucleina Auluck et al hanno
segnalato che il trattamento di un modello volante di PD con GM ha
protetto completamente contro tossicitagrave per alfa-sinucleina [74] GM ha
protetto anche contro la neurotossicitagrave dopaminergica indotta da 1-metil-
4-fenil-1236-tetraidropiridina (MPTP) in un modello di topo di PD Il
pretrattamento con GM mediante iniezione ventricolare intracerebrale
prima del trattamento con MPTP ha indotto le Hsp70 ed incrementato il
contenuto residuale di dopamina e lrsquoimmuno reattivitagrave della tirosina
idrolasi nel corpo striato [75] Lrsquoinduzione di Hsp70 nel midollo spinale
egrave stata osservata in seguito ad iniezione intraperitoneale di un derivato
della GM il 17-AAG in un modello di SBMA topo [76] Il 17-AAG egrave
stato anche efficace contro la nuerodegenerazione in altre malattie
poliQ Vale a dire ha soppresso la degenerazione dellrsquoocchio e la
formazione di inclusioni del corpo e salvato dalla letalitagrave in un modello
di SCA di Drosophila Ha inoltre soppresso la neurodegenerazione in un
modello volante di HD La riduzione di HSF-1 ha abolito lrsquoinduzione di
chaperoni molecolari e gli effeti terapeutici di 17-AAG sulla
neurodegenerazione poliQ indotta nei modelli di Drosophila facendo
44
arguire che lrsquoeffetto terapeutico di 17-AAG egrave essenzialmente mediato da
HSF-1 [77] Riassumendo lrsquoattivazione di HSF-1 da inibitori di Hsp90
egrave stata notata specificamente in modelli in vivo ed in vitro di malattie
neurodegenerative suggerendo che lrsquoinibizione di Hsp90 puograve essere un
mezzo per modulare i livelli di Hsp in cervelli malati con lrsquoobbiettivo di
proteggere contro le proteine tossiche che si presentano nel corso del
processo neurodegenerativo
Lrsquoinibizione di Hsp90 riduce lrsquoattivitagrave e lrsquoespressione di proteine
neuronali aberranti
In aggiunta alla regolazione di HSF-1 evidenze recenti suggeriscono un
ruolo addizionale per Hsp90 nel mantenimento della stabilitagrave funzionale
della capacitagrave aberrante di proteine neuronali (Figura 8A)
La SBMA egrave una malattia ereditaria dei motoneuroni causata
dallrsquoaccrescimento di un tratto di poliglutamina allrsquointerno del recettore
androgeno (AR) [57]
Le caratteristiche patologiche di SBMA sono perdita dei motoneuroni
nel midollo spinale e nel tronco cerebrale diffusione dellrsquoaccumulo
nucleare inclusioni nucleari di mutanti AR (mAR) nei motoneuroni
residui e in alcuni organi viscerali Waza et al hanno dimostrato che
mAR presente in SBMA egrave una delle proteine regolate da Hsp90 (Figura
8A) [76]
45
Figura 8 Le Hsp90 riparano le proteine neuronali aberranti (A) Proteine neuronali
aberranti regolate da Hsp90 (B) Lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90porta allrsquoinattivazione
o degradazione delle proteine regulate da Hsp90 probabilmente attraverso la via del
proteasoma
Le Hsp90 formano un complesso molecolare con mAR per il
mantenimento della sua stabilitagrave funzionale Sia in modelli cellulari di
SBMA che in topi transgenici lrsquoinibizione di Hsp90 da parte di 17-
AAG il derivato 17 allilammino-17-demetossi della geldanamicina ha
46
portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal
macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati
disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da
destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione
dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di
SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave
rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati
[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori
hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo
sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa
(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni
Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]
Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo
egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali
sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al
hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina
(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi
familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un
complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data
da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto
47
lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della
stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave
dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita
neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei
neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che
codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a
PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson
familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson
suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente
associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che
Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate
con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente
diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina
egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille
ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno
recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di
alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che
sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina
[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce
lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari
Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-
dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento
tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-
sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da
chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di
mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il
macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD
associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-
48
sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative
caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave
caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di
tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD
lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da
unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina
chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta
(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si
era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero
netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un
gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e
Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave
causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma
17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau
[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine
neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso
portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina
mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da
Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei
modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave
patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-
dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla
settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad
una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di
tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno
dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una
diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di
AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le
49
relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la
degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90
[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al
(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave
stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da
GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β
effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi
GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di
Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe
portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in
strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati
indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone
biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione
di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da
parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi
proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di
queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)
Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie
neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio
approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare
dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la
formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione
potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di
Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare
terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare
malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo
centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90
puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione
50
successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti
neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti
clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto
che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono
tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in
modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni
nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati
promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio
spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in
modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di
Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a
lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse
da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase
esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora
rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori
dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per
mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie
neurodegenerative
51
SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-
ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-
METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE
(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE
MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO
SULLA FRAMMENTAZIONE
Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in
risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta
nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine
regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il
ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai
loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine
client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro
cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire
su molti percorsi oncogenici
Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il
nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che
lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati
composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP
attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del
processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono
emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i
tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule
normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina
(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una
maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto
che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una
piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
2
ldquoso please donrsquot cry I will always be your light
we will meet again one day I will shine on for everyonerdquo
The Jet ndash Shine on (Shine on ndash 2006)
3
INTRODUZIONE
Proteine dello shock termico (Hsp)
Le proteine dello shock termico (Hsp) sono una famiglia di proteine
indotte nelle cellule esposte a differenti insulti [1] Questa induzione di
Hsp permette alle cellule di sopravvivere in condizioni di stress Le Hsp
dei mammiferi sono state classificate in sei famiglie a seconda del peso
molecolare Hsp100 Hsp20 Hsp70 Hsp60 Hsp40 e piccole Hsp (da 15
a 30 KDa) comprese Hsp27 Queste proteine agiscono come chaperoni
molecolari sia nel ripiegamento di proteine mal ripiegate che nella loro
eliminazione se risultano irrimediabilmente danneggiate
bull Hsp 100 (100-110 kDa)
I membri della famiglia delle Hsp100 sono proteine altamente
conservate scoperte per la prima volta nei batteri come sistema
proteasico a due subunitagrave detto Clp La subunitagrave piugrave grande detta ClpA
ha attivitagrave di unfolding ATP-dipendente e proteine correlate ad essa
sono state rilevate sia nei batteri che negli eucarioti dove svolgono
attivitagrave antiaggregante La subunitagrave piugrave piccola ClpP egrave una proteasi ed egrave
stata invece trovata solo nei batteri associata a ClpA
La funzione principale delle Hsp100 egrave quella di promuovere la
rimozione di aggregati proteici formatisi in condizioni di stress in una
modalitagrave ATP-dipendente La ClpA favorisce il defolding
(denaturazione) dellrsquoaggregato che puograve andare incontro ad un processo
di refolding (rinaturazione) o essere idrolizzato dalla subunitagrave ClpP
4
bull Hsp 90 (85-90 kDa)
Sono proteine dimeriche con un sito di dimerizzazione localizzato nella
regione C-terminale Nella regione N-terminale contengono invece un
sito di legame per lrsquoATP La rottura delle Hsp90 in un dominio N-
terminale e in uno C-terminale rivela che entrambi i frammenti possono
sopprimere lrsquoaggregazione
Questi risultati suggeriscono che le Hsp90 contengono due siti che
contribuiscono indipendentemente alla sua attivitagrave di chaperone
molecolare
I due siti inoltre mostrano specificitagrave diversa per il substrato e
dipendenza o meno dallrsquoATP
Il sito N-terminale interagisce con proteine e peptidi non ripiegati in
modo ATP-dipendente mentre il sito C-terminale sembra agire come un
chaperone generale in modo ATP-indipendente
Le Hsp90 sembrano essere coinvolte nella trasduzione del segnale date
le loro interazioni con i recettori degli ormoni steroidei e con varie
chinasi del ciclo cellulare
bull Hsp 70 (66-78 kDa)
Le proteine Hsp70 si ritrovano in tutte le specie e la loro funzione egrave
quella di favorire lrsquoassemblaggio di complessi multimerici proteici e
come chaperone molecolari di facilitare il folding intracellulare delle
proteine Queste sono costituite da due domini funzionali un dominio
carbossiterminale (circa 25 kDa) contenente il sito di legame per il
polipeptide ed un dominio amminoterminale (circa 40 kDa) contenente
il sito di legame per ADPATP e che ha attivitagrave ATPasica Funzionano
come monomeri o come dimeri riconoscendo porzioni di 7-8 residui
amminoacidici Un esempio egrave la DnaK di Ecoli che egrave un membro
stress-inducibile della famiglia delle Hsp70 e coopera con DnaJ (una
5
Hsp40) e GrpE nel formare un sistema chaperone ATP-dipendente
coinvolto nei processi cellulari
bull Hsp 60
Molte Hsp60 appartengono alla famiglia delle chaperonine complessi
proteici oligomerici costituiti da due anelli sovrapposti di 7-9 subunitagrave
che formano una cavitagrave centrale in cui vengono accolte proteine in uno
stato non nativo
Il sistema GroEL presente nei batteri egrave un esempio di Hsp60 Esso egrave
costituito da 14 subunitagrave identiche che si articolano tra loro a costituire
una complessa struttura quaternaria formata da due anelli eptamerici
sovrapposti
Ciascun anello presenta una cavitagrave interna di 50 Aring di diametro che
ospiteragrave la proteina parzialmente denaturata GroEL richiede per la sua
attivitagrave di chaperone anche il legame e lrsquoidrolisi dellrsquoATP
bull Hsp 40
Le Hsp40 come le Hsp60 sono coinvolte in processi di stabilizzazione
e di corretto ripiegamento delle proteine nascenti La piugrave studiata e
caratterizzata egrave DnaJ di Ecoli che agisce come co-chaperone con DnaK
(Hsp70)
bull Hsp a basso peso molecolare
Hanno diverse funzioni che sono specie-specifiche ed egrave stato proposto
che esse agiscano da chaperoni molecolari e impediscano lrsquoaggregazione
proteica irreversibile
bull Hsp stress ossidativo e patologie
Come noto le HSP sono state riscontrate nelle cellule sottoposte ad
unrsquoampia varietagrave di condizioni di stress Lo stress ossidativo egrave coinvolto
in una serie di condizioni patologiche compresa la neurodegenerazione
le malattie cardiovascolari e lrsquoictus e nellrsquoinvecchiamento naturale
6
In queste condizioni lo stress ossidativo si verifica come conseguenza
dello squilibrio tra la produzione di specie reattive dellossigeno (ROS) e
la capacitagrave del corpo di disintossicarsi dagli intermedi reattivi di queste
Questo squilibrio puograve portare come conseguenza una eccessiva
produzione di ROS come osservato nelle malattie ischemiche o puograve
causare una diminuzione della capacitagrave degli enzimi antiossidanti
Come risultato il normale ambiente intracellulare egrave compromesso si
osserva ossidazione e aggregazione delle proteine e del DNA vitale che
si traduce nel fallimento della normale funzione cellulare
Le proteine ossidate si accumulano causando cosigrave infiammazioni acute
Tuttavia i cambiamenti nello stato redox cellulare possono anche essere
un segnale per lattivazione della cascata apoptotica
Fra i vari cambiamenti nellrsquoattivitagrave cellulare e nella fisiologia lrsquoevento
piugrave importante nelle cellule stressate egrave la produzione di un certo numero
di proteine altamente conservate le proteine dello shock termico o da
stress [2] Negli ultimi ventrsquoanni sono state eseguite numerose ricerche
sulla struttura e sulla funzione delle proteine da shock termico o Hsp
[3] Queste proteine sono risultate molto interessanti in quanto giocano
un ruolo fondamentale nella progressione del ciclo cellulare e
nellrsquoapoptosi (o morte programmata della cellula) e sono coinvolte in
molte malattie La risposta allo shock termico o di stress egrave una risposta
di adattamento cellulare che aiuta al mantenimento dellrsquoomeostasi
cellulare in condizioni di stress Ersquo stato osservato che subito dopo un
improvviso aumento di temperatura tutte le cellule mostrano
lrsquoespressione indotta di una famiglia di geni conosciuti come geni Hsp
La sequenza del DNA che costituisce questa famiglia di geni egrave
altamente conservata tra le specie Questa famiglia di geni era stata
originariamente chiamata cosigrave a causa della loro espressione dopo
7
lrsquoesposizione al calore Tuttavia la stessa risposta si ottiene dopo
differenti insulti inclusi stress ambientali e metabolici come ipossie
ischemie iperossie anossie esposizione alla luce UV e sostanze
chimiche nicotina stress chirurgico deficienze nutrizionali (per es
privazione del glucosio) stress emozionale e meccanico lesioni
meccaniche e agenti virali o altri tipi di stress come esposizione a
radicali tossici o ad agenti cancerogeni [4 abc] In condizioni di stress
come lo shock termico e alcuni stati fisiologici le proteine da stress
sono rapidamente indotte attraverso meccanismi di trascrizione e
trasduzione (figura 1)
Figura 1 Meccanismo di attivazione delle Hsp e riparazione delle proteine denaturate(DP)
(1) Condizioni di stress portano alla denaturazione delle proteine (2) La presenza DP
stimola la dissociazione del complesso Hsp-HSF Questo complesso limita il processo di
trascrizione in assenza di DP (3) mentre le Hsp sono libere di legarsi a DP HSF viene
attivato attraverso la fosforilazione e
La risposta inducibile allo shock termico genera un segnale che porta
allrsquoattivazione di un fattore di trascrizione [5] La trascrizione del gene
Hsp egrave sotto il controllo di una famiglia di fattori di trascrizione dello
shock termico (HSF) Membri differenti della famiglia di HSF possono
8
essere attivati da specifici stress diversi Nonostante siano stati scoperti
varie HSF HSF-1 ha dimostrato di essere il regolatore principale di una
breve induzione termica di Hsp Le Hsp giocano un importante ruolo
regolatore nella trascrizione dei geni Se le Hsp fossero sovraespresse in
assenza di stress si legherebbero direttamente al dominio di trans-
attivazione di HSF-1 determinando cosigrave la sua soppressione Le Hsp
sono proteine ubiquitarie sia nelle cellule eucariote che in quelle
procariote Come suggerisce il nome le Hsp sono indotte in cellule
esposte al calore sebbene le proteine dello stress (Chaperoni) possono
essere attivate da alcuni differenti tipi di insulti facendo in modo che le
cellule sopravvivano in condizioni altrimenti letali La tabella 1 presenta
un sommario di queste proteine la loro locazione cellulare e la loro
funzione Le Hsp ad alto peso molecolare sono ATP-dipendenti mentre
le Hsp a basso peso molecolare agiscono in maniera ATP-indipendente
[6]
9
Tabella 1 Hsp umanepeso molecolare localizzazione e funzione
10
Ogni famiglia di Hsp egrave composta da membri espressi sia in maniera
costitutiva che induttiva e si rivolge a diversi scomparti subcellulari [7]
Lrsquoattivazione costitutiva delle Hsp puograve verificarsi nelle cellule anche in
assenza di fattori di stress ambientali Per esempio Hsp90 puograve costituire
fino allrsquo1 del totale delle proteine cellulari in cellule non stressate [3]
indicando che queste proteine hanno un ruolo nel mantenimento della
conformazione delle proteine anche in condizioni normali In
condizioni di stress i dimeri di Hsp90 tendono ad associarsi in tetra-
esa- e ottameri ed oligomeri ancora piugrave elevati [8] In condizioni
fisiologiche Hsp90 si trova in associazione con diverse proteine
intracellulari tra cui calmodulina actina tubulina diverse chinasi e
qualche proteina recettore [9] I componenti dei complessi di Hsp90
come proteine kinasi e recettori steroidei possono mediare il trasporto
nucleare dellrsquoHsp90 specialmente sotto stress da calore Probabilmente
Hsp90 forma complessi stabili con filamenti di actina e si lega alla
tubulina per proteggere i microtubuli quindi puograve mediare
lrsquoorganizzazione strutturale del proteasoma un complesso
multicatalitico quando i livelli di ATP cellulari diminuiscono [5] Allo
stesso modo Hsp27 tende a oligomerizzarsi in condizioni di stress ed egrave
stato precedentemente dimostrato che nelle cellule tumorali endogene
Hsp27 egrave la piugrave importante proteina argpirimidina modificata e che
questa modifica comporta lrsquooligomerizzazione di Hsp27 [10]
Argpirimidina egrave un addotto metilgliossale-arginina che risulta dalla
glicazione non enzimatica di residui di arginina delle proteine nelle
cellule tumorali mostrando un aumento della glicolisi [11] Hsp27 e
Hsp70 sono fortemente ed universalmente indotte da diverse
sollecitazioni mentre la loro espressione egrave bassa in condizioni
fisiologiche permettendo ad attivitagrave costitutive cellulari di procedere
11
[12] A prescindere dalla loro localizzazione intracellulare le Hsp70
sono state trovate anche sulla membrana plasmatica delle cellule
trasformate malignamente e nello spazio extracellulare [13] Hsp70
Hsp90 e la proteina GP96 chaperone residente nel reticolo
endoplasmatico (RE) appartenente alla famiglia di Hsp90 [14] sono
state trovate nel mezzo cellulare Questo mette in considerazione la
duplce funzione delle Hsp la funzione citoprotettivaantiapoptotica
intracellulare e la funzione immunogenica extracellulare [7] Le Hsp
intracellulari sono importanti in quanto assicurano il ripiegamento delle
proteine nella loro corretta struttra terziaria lrsquoincorporazione di
polipeptidi nelle membrane intracellulari o nel trasporto delle proteine
attreverso le membrane [9] mentre la funzione delle Hsp extracellulari egrave
immunogenica attreverso lo chaperoning di peptidi antigenici I membri
della famiglia di Hsp70 e Hsp90 sono stati rilevati nel mezzo delle
cellule presentanti lrsquoantigene (APC) Ersquo stato osservato che lrsquouptake di
complessi Hsp-peptidi da parte delle APC egrave specifico saturabile e
concentrazione dipendente e quindi egrave stata ipotizzata lrsquoesistenza di
recettori Hsp specifici [7] Quindi il potenziale coinvolgimento delle
Hsp in molti tipi di malattie le ha rese particolarmente importanti per lo
sviluppo di nuove terapie
12
CHAPERONINE MOLECOLARI E CONTROLLO
QUALITArsquo DELLE PROTEINE
Nelle cellule viventi sia le catene polipeptidiche di nuova sintesi che le
preesistenti sono a rischio costante di mal ripiegamento
(MISFOLDING) o aggregazione In conformitagrave con lrsquoampia diversitagrave di
forme mal ripiegate lrsquoelaborazione di strategie di controllo qualitagrave si
sono evolute per opporsi a questa inevitabile disavventura Recenti studi
descrivono la rimozione di aggregati dal citosol rivelano meccanismi di
controllo di qualitagrave per proteine nel reticolo endoplasmatico (RE) e
forniscono nuove intuizioni in due classi di chaperoni molecolari
lrsquoHsp70 (Heat Shock Protein 70) e lrsquoAAA+ (Hsp100) [15]
FOLDING DI PROTEINE NEL RETICOLO
ENDOPLASMATICO RICONOSCERE IL GIUSTO
DALLO SBAGLIATO
Il reticolo endoplasmatico (ER) un organulo presente sia nelle cellule
animali che vegetali svolge un ruolo premimente in numerosi processi
di fondamentale importanza per la sopravvivenza e per il normale
funzionamento cellulare LER occupa circa il 10 del volume della
cellula e la metagrave della superficie coperta da tutte le membrane della
cellula (endomembrane piugrave membrana plasmatica) [16]
Il reticolo endoplasmatico (RE) riveste numerose funzioni vitali per la
cellula Tra le tante egrave la stazione iniziale della via secretoria ed egrave quindi
il luogo nel quale circa un terzo di tutte le proteine di una cellula viene
sintetizzato e ripiegato correttamente [17] in secondo luogo lrsquoER egrave il
13
punto di partenza dal quale numerose proteine vengono smistate e
indirizzate verso la loro destinazione finale [18]
LrsquoER egrave quindi la sede della sintesi del ripiegamento (ldquofoldingrdquo) e delle
modificazioni post-traduzionali delle proteine di membrana e secrete ed
egrave responsabile della maturazione strutturale di un quarto del proteasoma
che attraversa le vie secretorie
Il ripiegamento delle proteine secretorie fornisce una serie di sfide
uniche in quanto egrave accompagnato e dipendente dalla formazione di ponti
disolfuro ed inserzioni nel doppio strato lipidico con entrambi gli eventi
che si verificano piugrave lentamente di tipici cambi conformazionali che
accompagnano il ripiegamento Conseguentemente il RE fornisce le
condizioni ottimali per fronteggiare queste sfide includendo unrsquoalta
concentrazione di chaperoni generici oltre a una gamma di specifiche
strategie fatte su misura per favorire il ripiegamento delle proteine
secretorie Inoltre esiste un sofisticato sistema di controllo-qualitagrave nel
RE per trattenere e riparare proteine che non hanno raggiunto ancora il
loro stato naturale Malgrado la lunghezza con la quale le cellule vanno
a fornire un ambiente ottimale nel RE il ripiegamento delle proteine
secretorie puograve avvenire o manca a volte ad un ritmo allarmante Il RE
adopera due meccanismi di risposta in presenza di forme mal ripegate Il
primo meccanismo egrave una risposta allo stress RE-dedicato definito UPR
(risposta alla non corretta conformazione delle proteine) che attua il
rimodellamento del RE cosigrave da aumentare la sua capacitagrave di
ripiegamento [16] Una proteina malfunzionante rimane sequestrata nel
reticolo endoplasmatico quindi un eccesso di proteine mal strutturate
attiva la risposta da proteine con folding scorretto (Unfolded Protein
Response) Questo tipo di risposta inizia con il riconoscimento del
segnale di stress da parte di un recettore nel reticolo endoplasmatico e
14
prosegue con il blocco della sintesi proteica per permettere al
proteasoma di eliminare lrsquoeccesso di proteine mentre viene stimolata la
produzione di fattori di trascrizione Il secondo meccanismo chiamato
degradazione RE-associata (ERAD) riconosce in modo specifico le
parti terminali di proteine mal ripiegate e le loro retrotraslocazioni
attraverso la membrana del reticolo endoplasmatico nel citosol dove
possono essere degradate dal sistema di degradazione ubiquitina-
proteosoma [17] Questi due meccanismi sono intimamente collegati
lrsquoinduzione UPR aumenta la capacitagrave dellrsquoERAD una diminuzione
dellrsquoERAD comporta unrsquoinduzione dellrsquoUPR costitutivo e
contemporaneamente la diminuzione di ERAD e UPR fa diminuire di
molto la viabilitagrave delle cellule I sistemi UPR ed ERAD fronteggiano
anche il comune problema del riconoscimento che richiede
lrsquoidentificazione delle forme mal ripiegate potenzialmente patologiche
nellrsquoambiente del RE La sorveglianza di UPR ed ERAD deve garantire
un buon equilibrio proteggendo le cellule dalle pericolose specie mal
ripiegate evitando la sovra vigilanza (come accade con forme mutate di
regolatori trans membrana della fibrosi cistica CFTR) che puograve portare
allrsquoeliminazione di forme potenzialmente sanabili Recenti studi hanno
rivelato come ERAD ed UPR identifichino forme mal ripiegate
Pertanto il RE rappresenta un preciso sistema di controllo di qualitagrave atto
ad assicurare che solo le proteine correttamente ripiegate e funzionanti
possano essere rilasciate dallrsquoER e raggiungere la loro destinazione
finale mentre le proteine malripiegate o non funzionanti sono trattenute
nel ER e in seguito traslocate nel citosol per la degradazione
15
RISPOSTA ALLA NON CORRETTA
CONFORMAZIONE DELLE PROTEINE
Le proteine designate per il riconoscimento dei segnali di stress
provenienti dal reticolo endoplasmatico sono generalmente IRE1
(Inositol Requiring Kinase 1) ATF6 (Activation of Transcription Factor
6) e PERK (PKR-like Endoplasmic Reticulum Kinase)
Nel lievito la capacitagrave di ripiegarsi del RE egrave monitorata da IRE1 una
chinasi trans membrana altamente conservata che contiene un dominio
luminale responsabile del riconoscimento delle forme mal ripiegate
chinasi citosoliche e domini ribonucleasici Lrsquoaccumularsi delle proteine
mal ripiegate nel RE porta allrsquoattivazione delle chinasi IRE
Lrsquoattivazione delle IRE-chinasi promuove lo splicing non convenzionale
dei messaggi per un fattore di traduzione b-ZIP (Hac1 nel lievito e XBP-
1 nei metazoi) attraverso il suo dominio ribonucleasico La traduzione
del messaggio Hac 1 spliced crea un fattore attivo di trascrizione che
media direttamente la trascrizione dei target di UPR includendo
chaperoni del RE macchinario ERAD e tante altre proteine secretorie
In aggiunta alla IRE-1 gli eucarioti piugrave sviluppati utilizzano due altri
sensori le chinasi trans membrana del RE PERK ed il fattore di
trascrizione trans membrana del RE ATF6 (Figura 2) PERK contiene
un sensore luminale che egrave altamente correlato a quello di IRE-1 il
dominio citoplasmatico di PERK consiste in una chinasi elF2α
16
Figura 2 Struttura dei principali sensori dello stress nel reticolo endoplasmatico IRE1
ATF6 PERK
Lrsquoattivazione delle chinasi dovuta alla presenza di proteine mal
ripiegate determina unrsquoinibizione generalizzata della traduzione come
pure la up-regulation del fattore di trascrizione specifico ATF4
Lrsquoaccumulo di proteine mal ripiegate permette inoltre ad ATF6 di
raggiungere lrsquoapparato del Golgi dove le proteasi trans membrana
rilasciano il dominio citoplasmatico del fattore di trascrizione
permettendogli di entrare nel nucleo e mediare lrsquoinduzione genetica
Lrsquoesistenza di molteplici sensori UPR negli eucarioti piugrave avanzati
permette per lo piugrave una risposta piugrave sfumata alle proteine mal ripiegate
Per esempio una risposta iniziale alle proteine mal ripiegate potrebbe
portare ad una down-regulation generalizzata della traduzione seguita in
sequenza da unrsquoinduzione di chaperoni lrsquoinduzione del macchinario
17
ERAD ed infine contro lo stress prolungato lrsquoattivazione della morte
cellulare tramite apoptosi Molto recentemente ci sono stati notevoli
progressi nelle nostre conoscenze molecolari di come IRE-1 (e per
deduzione PERK) riconosce le proteine mal ripiegate Studi precedenti
avevano dimostrato che BIP (Binding Immunoglobulin Protein) lrsquo
omologo principale delle Hsp70 presente nel reticolo endoplasmatico si
lega in modo specifico con IRE1 e che questa interazione scompare in
condizioni di stress del RE Inoltre lrsquoiperespressione di BiP puograve
sopprimere lrsquoinduzione dellrsquoUPR Questo aveva suggerito un modello di
titolazione in cui BiP agisce come un regolatore negativo di IRE1 e
lrsquoaccumularsi di forme mal ripiegate porta indirettamente allrsquoattivazione
dellrsquoIRE1 attraverso il sequestro di BiP da parte proteine mal ripiegate
Tuttavia recenti studi hanno dimostrato che anche se il legame del BiP
possa avere un ruolo importante nella down-regulation di IRE1 ci sono
altri fattori importanti Analisi mutazionali hanno trovato che la
delezione della regione di IRE1 responsabile del legame con BiP non
altera la regolazione di IRE1 in risposta alle proteine unfolded [18] Piugrave
drammaticamente la struttura cristallina del core del dominio luminale
conservato (cLD) di IRE1 nel lievito rivela una profonda scanalatura
idrofobica che ricorda la tasca legante dei maggiori complessi di
istocompatibilitagrave (MHCs) che sono i responsabili per il riconoscimento
peptidico Che IRE1 possa legarsi direttamente a polipeptidi mal
ripiegati egrave unrsquoidea interessante (Figura 3) [19]
18
Figura 3 Un modello ipotetico descrive lrsquoattivazione di Ire1 attraverso la oligomerizzazione
determinata dal legame di proteine unfolded (indicate in rosso) Le interazioni dirette o
indirette fra le catene delle proteine unfolded possono contribuire allrsquoattivazione Sul lato
luminale della membrana del RE le proteine unfolded si legano alla scanalatura (indicata in
grigio) formata dalla dimerizzazione del core del dominio luminale di Ire1 attraverso
linterfaccia 1 Sul lato citoplasmaticodella membrana del RE la oligmerizzazione accosta i
domini della chinasi Ire 1 che subiscono un cambiamento conformazionale in seguito ad
autofosforilazione che porta allrsquoattivazione della funzione di RNA-ribonucleasi di Ire1
Attraverso il riconoscimento diretto delle forme mal ripiegate
lrsquoinduzione di IRE1 potrebbe verificarsi prima della completa titolazione
di BiP che data lrsquoestrema abbondanza di questrsquoultimo nel RE potrebbe
verificarsi solo dopo un catastrofico accumulo di proteine mal ripiegate
Inoltre il riconoscimento diretto di forme mal ripiegate da parte di IRE1
(e PERK) potrebbe consentire una serie di risposte piugrave sfumate in cui
diverse forme mal ripiegate potrebbero essere preferenzialmente
riconosciute da sensori diversi quali BiP IRE1 o PERK Cosigrave in linea
di principio la natura (per esempio traslazionale contro transcrizionale)
ed il ciclo di UPR potrebbe essere su misura per la classe specifica di
forme mal ripiegate che sono prevalenti nel RE [20]
19
DEGRADAZIONE DELLE PROTEINE ASSOCIATA AL
RETICOLO ENDOPLASMATICO
Come ci si poteva aspettare dalla diversitagrave delle proteine che si
ripiegano NEL RE studi recenti hanno dimostrato che la degradazione
ER-associata (ER-Associated Degradation ERAD) comprende una
serie di sistemi diversi ciascuno responsabile della degradazione di
sottoinsiemi di proteine che condividono proprietagrave fisiche comuni
Esistono anche regioni dedicate allrsquo ER Associated Degradation
(ERAD) nelle quali proteine che non raggiungono il corretto
ripiegamento vengono retrotraslocate al citosol e quindi degradate dal
proteasoma [21]
Ciograve forse egrave piugrave chiaramente dimostrato nel lievito dove ci sono almeno
due distinti meccanismi di sorveglianza per identificare le proteine mal
ripiegate del RE Il primo meccanismo chiamato ERAD-L analizza le
proteine che contengono domini luminali mal ripiegati (solubili o trans
membrana) chiamati CPY una forma mutante della proteina CPY
endogena che egrave incapace di folding Il secondo denominato ERAD-C
rileva domini mal ripiegati citosolici di proteine trans membrana [22]
Sebbene entrambe queste vie in ultima analisi convergano sul sistema
di degradazione ubiquitina-proteosoma esse dipendono da diversi
insiemi di componenti RE-associati per rivelare e fornire specie mal
ripiegate al citosol Nel caso di ERAD-C (e non di ERAD-L) la
degradazione egrave in genere dipendente da uno specifico sottoinsieme di
chaperoni citosolici inclusi i membri Hsp40 e Hsp70 Ciograve suggerisce
che queste proteine possono essere direttamente responsabili per il
riconoscimento di domini citosolici mal ripiegati di proteine trans
membrana Tuttavia le caratteristiche esatte che vengono monitorate e
20
come i substrati vengano consegnati al macchinario di
retrotranslocazione restano importanti questioni aperte per la maggior
parte dei substrati Il riconoscimento di una proteina contenente un
dominio luminale mal ripiegato dipende in modo determinante dallo
stato di glicosilazione della proteina Infatti anche piccole modifiche di
glicani N-linked puograve provocare danni gravi nella degradazione di
numerosi substrati Questo puograve effettivamente lasciare le proteine in un
limbo impossibile raggiungere lo stato nativo ma non riconosciuto dal
macchinario ERAD esse restano mal ripiegate nel RE a tempo
indeterminato A prima vista questa dipendenza dalla glicosilazione
sembra essere un miglioramento non necessario Tuttavia egrave ormai chiaro
che lo spettro di porzioni di zucchero presenti in una proteina egrave un
segnale fondamentale nel marcare il suo status di ripiegamento Infatti
dato che diverse proteine altamente abbondanti nel RE tra cui BiP e
PDI spesso non sono glicosilate la presenza e la natura covalente di
molto mannosio in un polipeptide puograve fornire un segnale importante che
aiuta il macchinario di controllo-qualitagrave del RE a distinguere le specie
ripiegate destinate ad altri scomparti da quelle piugrave abbondanti e
permanenti del RE Lrsquointuizione nel ruolo della glicosilazione nella
discriminazione tra le specie in via di ripiegamento e le proteine
terminali mal ripiegate nel RE egrave venuta dalla constatazione che
glicoproteine mal ripiegate subiscono un taglio dei loro N-glicani da una
varietagrave di glicosidasi tra cui una mannossidasi specifica In aggiunta a
proteine mal ripiegate persistenti si egrave pensato che il rimodellamento
dipendente dal tempo di N-glicani porti ad un segnale per la
degradazione del macchinario ERAD Questo permette intermedi
ripiegati in un periodo di tempo prima del rimodellamento dei loro N-
glicani in cui il polipeptide egrave immune dalla sorveglianza ERAD Egrave
21
interessante notare che un recente studio suggerisce che anche per i
polipeptidi citosolici vi egrave un periodo durante e subito dopo la sintesi in
cui le specie mal ripiegate sono immuni alla degradazione del
proteasoma [23] Recenti studi hanno identificato due differenti lettine
localizzate nel RE che svolgono un ruolo critico nellrsquoERAD La prima egrave
correlata alla proteina mannossidasi responsabile del taglio di N-glicani
nel RE ma sembra aver perso la sua attivitagrave catalitica Nel lievito si
chiama Htm1pMnl1p e nei mammiferi egrave chiamato EDEM Studi
condotti su cellule di mammifero suggeriscono che EDEM aiuta le
glicoproteine mal ripiegate a lasciare il ciclo calnexinacalreticulina del
chaperone lectina dove stanno cercando di ripiegarsi e cosigrave entrare nel
ciclo di degradazione [24 ab] Tuttavia nel lievito Htm1p egrave richiesto
per la degradazione efficiente di substrati come CPY che non
dipendono da calnexina Quindi sembra probabile che Htm1pEDEM
ricopra altri ruoli in ERAD La seconda lectina Yos9p forma un
complesso stabile con proteine mal ripiegate e la perdita di questa
lectina conduce ad un profondo e specifico difetto nella degradazione di
glicoproteine mal ripiegate [25] Sorprendentemente mentre mutazioni
puntiformi nella tasca di Yos9p legante il mannosio eliminano la sua
capacitagrave di supportare ERAD i mutanti stessi di Yos9p mostrano una
maggior interazione con i substrati Ciograve indica la possibilitagrave che la
lectina Yos9p svolga un ruolo piugrave informativo interrogando lo stato
dello zucchero di forme mal ripiegate per determinare se debbano essere
passate al macchinario di retrotranslocazione Tuttavia come con
ERAD-C sebbene ci siano stati grandi progressi nella caratterizzazione
del macchinario di retrotranslocazione [26] le caratteristiche strutturali
delle proteine mal ripiegate sono in fase di monitoraggio e sono ancora
22
limitate le conoscenzedi come le forme mal ripiegate sono passate a
questo macchinario
CLEARENCE DI AGGREGATI ATTRAVERSO
LrsquoAUTOFAGIA
Egrave sempre piugrave evidente che ci sono una varietagrave di condizioni in vivo che
anche con chaperoni e macchinari proteolitici presenti nello stesso
compartimento come proteine mal ripiegate questi meccanismi di
controllo-qualitagrave falliscono e le proteine mal ripiegate avanzano
formando aggregati Inoltre tali aggregati intracellulari sono associati
con una serie di malattie neurodegenerative come il morbo di
Huntington e di Parkinson La natura e la sorte di aggregati di proteine
nelle cellule eucariotiche egrave stata poco compresa Recentemente egrave stata
sempre piugrave sostenuta unrsquoazione protettiva della formazione di aggregati
piuttosto che unrsquoimmediata azione patogena Per esempio nel caso del
morbo di Huntington lrsquoesame di cellule neuronali in coltura
sovrapproducenti una fusione di poliglutamina espansa e huntingtina-
GFP rivelano che queste cellule contenenti aggregati fluorescenti
morfologicamente visibili esibiscono una migliore viabilitagrave rispetto a
quelle aventi per via diffusionale materiale fluorescente [27] Questo
sembra in accordo con il concetto che si tratta di piccoli assemblati di
proteine mal ripiegate inclusioni non morfologicamente visibili che
esercitano effetti tossici sulle cellule Analogamente un recente
confronto delle dimensioni rispetto a tossicitagrave per gli aggregati di
proteina prionica PrP suggerisce che piccoli aggregati contenenti da una
a due dozzine di molecole sono risultati i piugrave tossici per le cellule [28]
23
Ma le cellule dispongono di meccanismi di compensazione per questi
piccoli aggregati Studi recenti hanno suggerito che la via ubiquitina-
proteosoma possa essere il pilastro della rimozione di specie inclini
allrsquoaggregazione Infatti gli aggregati rilevati nel contesto di
neurodegenerazione di solito sono reattivi con gli anticorpi anti-
ubiquitina il che implica che le specie mal ripiegate sono state
riconosciute dal sistema di coniugazione dellubiquitina Eppure vari
studi di questi ultimi anni indicano che queste proteine modificate
rappresentano una sfida particolare per proteasomi che possono portare
alla loro inibizione [29 ab] Il meccanismo di questa inattivazione
rimane sconosciuto ma puograve coinvolgere il soffocamento della camera
del proteasoma [30]
Anatomia del proteasoma Il proteasoma egrave una macromolecola proteica del peso di circa 2 milioni
di Daltons Ersquo formata da ununitagrave base centrale (core) e 2 cappucci agli estremi (cap) Il core egrave
formato a sua volta da 4 anelli ciascuno costituito da 7 unitagrave proteiche I due ldquocaprdquo attaccati alle
due estremitagrave del core cilindrico consistono ciascuno di 20 subunitagrave
24
Ora sembra che la modifica dellrsquoubiquitina possa reclutare specie
aggregate mediante una via indipendente lrsquoAUTOFAGIA Lrsquoautofagia
implica il riconoscimento e lrsquoimpacchettamentofagocitazione di
proteine specifiche o organelli in vescicole autofagosomiche che si
fondono con i lisosomi in cui sia le vescicole che il loro contenuto sono
scomposti Piugrave di 20 componenti cosiddetti Atg (geni coinvolti
nellrsquoautofagia) mediano questo processo straordinario Recenti studi
hanno dimostrato che componenti centrali della formazione di autosomi
nei topi hanno attivitagrave nei tessuti dei mammiferi Per esempio carenza
di atg5 ha portato alla morte di animali appena nati a causa
dellrsquoincapacitagrave di fornire un apporto di aminoacidi attraverso la
degradazione di proteine del corpo durante la condizione di fame
relativa allrsquoimmediato periodo post-natale Sorprendentemente in un
altro studio in cui egrave stata indotta una carenza di atg7 piugrave avanti nella
vita con un gene ldquofloxedrdquo lrsquoaccumulo di aggregati positivi
allrsquoubiquitina egrave stata osservata nel fegato degli animali che sono stati
disabilitati nella produzione di autofagosomi La funzione del
proteasoma in questi animali egrave rimasta inalterata contenente specie mal
ripiegate etichettate con ubiquitina e possono essere eliminate attraverso
autofagia Egrave stato poi scoperto un componente denominato p62 (o
sequestosoma1) che costituisce un guscio attorno agli aggregati di
huntingtina [31] Questa proteina contiene un dominio C-terminale
associato allrsquoubiquitina (UBA) che puograve legare poliubiquitine in modo
tale che p62 si collochi con lrsquoubiquitina quando espressa in cellule
HeLa Inoltre nelle cellule che esprimono huntigtina p62 si associa con
LC3 una proteina localizzata negli autofagosomi In accordo con quanto
riportato e cioegrave che lrsquoautofagia riduce i livelli di aggregati di
huntingtina e con un ruolo critico di p62 in questo processo lrsquoinibizione
25
antisenso mediata dallrsquoesperessione di p62 aumenta lrsquoapoptosi delle
cellule che esprimono huntungtina Quindi sembra che la modifica
dellrsquoubiquitina delle proteine difettose possa offrire un ingresso sia al
sistema proteasoma o in contesti dove lrsquoaggregazione egrave in corso al
sistema autofagia
SISTEMI CHAPERONI HSP70
Le Hsp70 proteine dello shock termico di 70 KDa sono impegnate in
una serie di processi tra cui il ripiegamento di proteine di nuova sintesi
il trasporto delle proteine attraverso membrane il ripiegamento di
proteine mal ripiegate ed aggregate e il controllo delle attivitagrave delle
proteine regolatrici Questa versatilitagrave egrave ottenuta attraverso
lampliamento e la diversificazione evolutiva di geni hsp70 che ha
generato sia chaperoni Hsp70 specifici Hsp110 e proteine Hsp170 La
versatilitagrave egrave determinata attraverso lrsquoimpiego di cochaperoni proteine J
e fattori di scambio di nucleotide (NEF) che regolano lrsquoattivitagrave di Hsp70
(Figura 4)
26
Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame
del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una
Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)
Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la
proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato
allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del
substrato
Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre
specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb
Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di
legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un
numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame
dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi
Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina
Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni
Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali
di Hsp70 con se stesso
27
INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70
Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di
proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura
xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding
appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide
N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD
adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio
elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con
lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante
chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco
tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini
di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di
comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura
di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione
La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la
tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo
coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture
precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una
proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da
una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β
ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica
compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio
elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di
legame del substrato (Figura 5)
28
Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo
substrato
La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra
domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che
collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo
solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi
residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame
allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A
dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso
Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un
legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in
nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano
completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve
entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo
fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui
coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del
segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti
integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A
29
capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il
quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di
ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a
idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di
DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro
catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente
arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia
drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete
crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la
barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK
costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina
superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura
della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera
attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della
prolina
DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-
NUCLEOTIDE
Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi
meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono
fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la
liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del
substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la
dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine
BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave
dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con
30
funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S
cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1
(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la
disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e
HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70
fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi
della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente
indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene
GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg
di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei
nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte
posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i
nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario
BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in
modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del
complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si
compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo
Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva
[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con
conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve
indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca
di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di
convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la
reazione di scambio nucleotidica di Hsp70
31
LEGAMI Hsp70-Hsp70
Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro
della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In
particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce
come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola
lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di
questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento
Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il
cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che
sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi
eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente
lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se
non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di
complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di
nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di
scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione
importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto
di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel
folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle
Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza
proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa
con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere
coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di
traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina
Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come
sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le
interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di
32
Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi
SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua
attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano
legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di
idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede
possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano
lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina
stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che
Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami
con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina
J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di
stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega
bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o
Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non
limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che
la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-
associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con
Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito
meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande
aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante
per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70
AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP
Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli
AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione
disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]
33
Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un
anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del
proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico
20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA
svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP
Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104
nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico
per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste
attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come
una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-
etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE
per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla
fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il
meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere
tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria
per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli
anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una
parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali
suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata
assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando
una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a
spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad
entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel
caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro
che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti
dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una
proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In
parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno
34
individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi
domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre
interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta
apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati
che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la
questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)
Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97
Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da
proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad
entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro
efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non
devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati
dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte
lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono
piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte
superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine
adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il
35
movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori
p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su
proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di
proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la
retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e
reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo
anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite
adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente
il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente
forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei
canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]
LrsquoAZIONE DELLrsquoATP
La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico
al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco
affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad
esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello
Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che
ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo
di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli
wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli
mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori
dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di
ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di
un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di
quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda
36
subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino
al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave
significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o
sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti
differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra
essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che
attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave
adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non
vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a
cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di
subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico
Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un
substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di
queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un
meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da
F1-ATPasi non sembra escluso
HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE
NEURODEGENERATIVE
RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE
Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel
mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una
pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi
associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione
37
di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di
Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta
promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]
Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90
nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave
funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi
permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]
HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico
Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono
mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)
accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock
citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata
da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante
di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo
stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si
lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei
geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-
shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via
multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di
transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-
translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90
[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e
mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo
shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con
Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)
38
attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da
shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni
Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che
i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro
sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock
termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su
attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato
che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi
di insulti
Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90
e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con
shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La
somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a
topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello
39
Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge
contro aggregati tossici
Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un
aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave
egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di
chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione
incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste
molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente
diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su
espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative
Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie
neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a
mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei
neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia
muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-
pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma
mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme
nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che
Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in
oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza
attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili
[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di
Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt
mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore
di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo
suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro
effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi
40
indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando
monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono
probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono
essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di
atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70
permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]
Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare
spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo
nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un
miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina
[62]
Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il
riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso
lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido
dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli
di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i
motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione
acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni
Riluzolo
Arimoclomol
41
Nei vari modelli cellulari della malattia di Alzheimer (AD) vi egrave un
incremento dei livelli di Hsp70 promossa dalla solubilitagrave e dal legame ai
microtubuli delle proteine tau [63] Hsp70 ha anche inibito la
propensione di aggregazione di Aβ [64] e ridotto la tossicitagrave di Aβ su
culture neuronali [65] Inoltre la proteina precursore dellrsquoamiloide
(APP) eo il suo Aβ amiloide derivato sono bersagli di chaperoni
mediati da clearence [66-67] Nella Drosophila melanogaster e nei
modelli di lievito della malattia di Parkinson (PD) lrsquoespressione diretta
di Hsp70 o la modulazione farmacologica di Hsp ha impedito la perdita
di neuroni causata da alfa-sinucleina [68-69] Huang et al hanno
riportato che questi effetti di Hsp70 si manifestano con lrsquoinibizione della
formazione di fibrille di alfa-sinucleina prevenendo la formazione di
alfa-sinucleina prefibrillare [70] Usando delezioni mutanti di alfa-
sinucleina Luk et al hanno indicato che le interazioni tra il dominio
legante il substrato Hsp70 e la regione del core idrofobico dellrsquoalfa-
sinucleina mediano lrsquoinibizione dellrsquoassemblaggio e che questo
processo di assemblaggio egrave inibito prima della fase di allungamento
[71] Nel complesso in diversi modelli di malattia neurodegenerativa la
sovra espressione di Hsp70 ha migliorato la gravitagrave della malattia di
fenotipi diversi senza incidere visibilmente sulla formazione di
aggregati suggerendo che i chaperoni non impediscono lrsquoaggregazione
di per seacute bensigrave reindirizzano gli aggregati preferibilmente in depositi
amorfi quindi sequestrando specie potenzialmente tossiche dalla
maggior parte della soluzione
42
Lrsquoespressione di Hsp70 e di altre Hsp egrave indotta dallrsquoinibizione
farmacologica di Hsp90
Come riportato sopra lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal
complesso con Hsp90 con susseguente produzione di Hsp (Figura 7) e
lrsquoinduzione di Hsp70 da parte di inibitori di Hsp90 egrave ben documentata
nei modelli di malattie neurodegenerative La geldanamicina (GM) un
inibitore di Hsp90 induce un aumento dose dipendente di Hsp70 nei
modelli di cellule di AD (Alzhaimer) cosigrave come nei neuroni della
corteccia primaria del ratto e riduce la quantitagrave di tau insolubili e dei
livelli basali di acido okadaico indotto da tau fosforilazione [63] Il
trattamento di neuroni primari corticali con lrsquoinibitore di Hsp90 con
struttura purinica il PU24FCI ha portato ad un aumento di Hsp70 dose-
dipendente [72]
PU24FCI
KU32
43
Allo stesso modo la somministrazione di due derivati di PU24FCI
CNS-permeabili il PU-DZ8 [72] ed il EC102 [73] a topi tau transgenici
(htau e JNPL3) ha determinato induzione di Hsp70 nel cervello e
mantenuto gli effetti per 24 ore dopo la somministrazione KU32 un
inibitore di Hsp90 di diversa natura chimica ha indotto Hsp70 in culture
SH-SY5Y di neuroblastoma e la ha protetta da tossicitagrave indotta da Aβ
GM ha attivato una risposta da shock termico ed inibito lrsquoaggregazione
di htt in un modello di coltura cellulare di HD ed ha indotto Hsp70 in
maniera tempo e concentrazione-dipendente ed ha impedito
lrsquoaggregazione di alfa-sinucleina e protetto contro la tossicitagrave in un
modello di aggregazione cellulare di alfa-sinucleina Auluck et al hanno
segnalato che il trattamento di un modello volante di PD con GM ha
protetto completamente contro tossicitagrave per alfa-sinucleina [74] GM ha
protetto anche contro la neurotossicitagrave dopaminergica indotta da 1-metil-
4-fenil-1236-tetraidropiridina (MPTP) in un modello di topo di PD Il
pretrattamento con GM mediante iniezione ventricolare intracerebrale
prima del trattamento con MPTP ha indotto le Hsp70 ed incrementato il
contenuto residuale di dopamina e lrsquoimmuno reattivitagrave della tirosina
idrolasi nel corpo striato [75] Lrsquoinduzione di Hsp70 nel midollo spinale
egrave stata osservata in seguito ad iniezione intraperitoneale di un derivato
della GM il 17-AAG in un modello di SBMA topo [76] Il 17-AAG egrave
stato anche efficace contro la nuerodegenerazione in altre malattie
poliQ Vale a dire ha soppresso la degenerazione dellrsquoocchio e la
formazione di inclusioni del corpo e salvato dalla letalitagrave in un modello
di SCA di Drosophila Ha inoltre soppresso la neurodegenerazione in un
modello volante di HD La riduzione di HSF-1 ha abolito lrsquoinduzione di
chaperoni molecolari e gli effeti terapeutici di 17-AAG sulla
neurodegenerazione poliQ indotta nei modelli di Drosophila facendo
44
arguire che lrsquoeffetto terapeutico di 17-AAG egrave essenzialmente mediato da
HSF-1 [77] Riassumendo lrsquoattivazione di HSF-1 da inibitori di Hsp90
egrave stata notata specificamente in modelli in vivo ed in vitro di malattie
neurodegenerative suggerendo che lrsquoinibizione di Hsp90 puograve essere un
mezzo per modulare i livelli di Hsp in cervelli malati con lrsquoobbiettivo di
proteggere contro le proteine tossiche che si presentano nel corso del
processo neurodegenerativo
Lrsquoinibizione di Hsp90 riduce lrsquoattivitagrave e lrsquoespressione di proteine
neuronali aberranti
In aggiunta alla regolazione di HSF-1 evidenze recenti suggeriscono un
ruolo addizionale per Hsp90 nel mantenimento della stabilitagrave funzionale
della capacitagrave aberrante di proteine neuronali (Figura 8A)
La SBMA egrave una malattia ereditaria dei motoneuroni causata
dallrsquoaccrescimento di un tratto di poliglutamina allrsquointerno del recettore
androgeno (AR) [57]
Le caratteristiche patologiche di SBMA sono perdita dei motoneuroni
nel midollo spinale e nel tronco cerebrale diffusione dellrsquoaccumulo
nucleare inclusioni nucleari di mutanti AR (mAR) nei motoneuroni
residui e in alcuni organi viscerali Waza et al hanno dimostrato che
mAR presente in SBMA egrave una delle proteine regolate da Hsp90 (Figura
8A) [76]
45
Figura 8 Le Hsp90 riparano le proteine neuronali aberranti (A) Proteine neuronali
aberranti regolate da Hsp90 (B) Lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90porta allrsquoinattivazione
o degradazione delle proteine regulate da Hsp90 probabilmente attraverso la via del
proteasoma
Le Hsp90 formano un complesso molecolare con mAR per il
mantenimento della sua stabilitagrave funzionale Sia in modelli cellulari di
SBMA che in topi transgenici lrsquoinibizione di Hsp90 da parte di 17-
AAG il derivato 17 allilammino-17-demetossi della geldanamicina ha
46
portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal
macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati
disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da
destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione
dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di
SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave
rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati
[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori
hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo
sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa
(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni
Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]
Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo
egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali
sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al
hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina
(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi
familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un
complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data
da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto
47
lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della
stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave
dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita
neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei
neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che
codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a
PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson
familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson
suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente
associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che
Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate
con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente
diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina
egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille
ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno
recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di
alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che
sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina
[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce
lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari
Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-
dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento
tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-
sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da
chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di
mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il
macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD
associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-
48
sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative
caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave
caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di
tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD
lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da
unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina
chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta
(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si
era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero
netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un
gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e
Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave
causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma
17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau
[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine
neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso
portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina
mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da
Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei
modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave
patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-
dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla
settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad
una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di
tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno
dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una
diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di
AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le
49
relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la
degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90
[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al
(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave
stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da
GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β
effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi
GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di
Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe
portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in
strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati
indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone
biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione
di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da
parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi
proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di
queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)
Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie
neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio
approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare
dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la
formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione
potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di
Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare
terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare
malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo
centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90
puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione
50
successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti
neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti
clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto
che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono
tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in
modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni
nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati
promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio
spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in
modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di
Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a
lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse
da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase
esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora
rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori
dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per
mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie
neurodegenerative
51
SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-
ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-
METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE
(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE
MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO
SULLA FRAMMENTAZIONE
Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in
risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta
nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine
regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il
ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai
loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine
client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro
cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire
su molti percorsi oncogenici
Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il
nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che
lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati
composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP
attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del
processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono
emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i
tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule
normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina
(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una
maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto
che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una
piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
3
INTRODUZIONE
Proteine dello shock termico (Hsp)
Le proteine dello shock termico (Hsp) sono una famiglia di proteine
indotte nelle cellule esposte a differenti insulti [1] Questa induzione di
Hsp permette alle cellule di sopravvivere in condizioni di stress Le Hsp
dei mammiferi sono state classificate in sei famiglie a seconda del peso
molecolare Hsp100 Hsp20 Hsp70 Hsp60 Hsp40 e piccole Hsp (da 15
a 30 KDa) comprese Hsp27 Queste proteine agiscono come chaperoni
molecolari sia nel ripiegamento di proteine mal ripiegate che nella loro
eliminazione se risultano irrimediabilmente danneggiate
bull Hsp 100 (100-110 kDa)
I membri della famiglia delle Hsp100 sono proteine altamente
conservate scoperte per la prima volta nei batteri come sistema
proteasico a due subunitagrave detto Clp La subunitagrave piugrave grande detta ClpA
ha attivitagrave di unfolding ATP-dipendente e proteine correlate ad essa
sono state rilevate sia nei batteri che negli eucarioti dove svolgono
attivitagrave antiaggregante La subunitagrave piugrave piccola ClpP egrave una proteasi ed egrave
stata invece trovata solo nei batteri associata a ClpA
La funzione principale delle Hsp100 egrave quella di promuovere la
rimozione di aggregati proteici formatisi in condizioni di stress in una
modalitagrave ATP-dipendente La ClpA favorisce il defolding
(denaturazione) dellrsquoaggregato che puograve andare incontro ad un processo
di refolding (rinaturazione) o essere idrolizzato dalla subunitagrave ClpP
4
bull Hsp 90 (85-90 kDa)
Sono proteine dimeriche con un sito di dimerizzazione localizzato nella
regione C-terminale Nella regione N-terminale contengono invece un
sito di legame per lrsquoATP La rottura delle Hsp90 in un dominio N-
terminale e in uno C-terminale rivela che entrambi i frammenti possono
sopprimere lrsquoaggregazione
Questi risultati suggeriscono che le Hsp90 contengono due siti che
contribuiscono indipendentemente alla sua attivitagrave di chaperone
molecolare
I due siti inoltre mostrano specificitagrave diversa per il substrato e
dipendenza o meno dallrsquoATP
Il sito N-terminale interagisce con proteine e peptidi non ripiegati in
modo ATP-dipendente mentre il sito C-terminale sembra agire come un
chaperone generale in modo ATP-indipendente
Le Hsp90 sembrano essere coinvolte nella trasduzione del segnale date
le loro interazioni con i recettori degli ormoni steroidei e con varie
chinasi del ciclo cellulare
bull Hsp 70 (66-78 kDa)
Le proteine Hsp70 si ritrovano in tutte le specie e la loro funzione egrave
quella di favorire lrsquoassemblaggio di complessi multimerici proteici e
come chaperone molecolari di facilitare il folding intracellulare delle
proteine Queste sono costituite da due domini funzionali un dominio
carbossiterminale (circa 25 kDa) contenente il sito di legame per il
polipeptide ed un dominio amminoterminale (circa 40 kDa) contenente
il sito di legame per ADPATP e che ha attivitagrave ATPasica Funzionano
come monomeri o come dimeri riconoscendo porzioni di 7-8 residui
amminoacidici Un esempio egrave la DnaK di Ecoli che egrave un membro
stress-inducibile della famiglia delle Hsp70 e coopera con DnaJ (una
5
Hsp40) e GrpE nel formare un sistema chaperone ATP-dipendente
coinvolto nei processi cellulari
bull Hsp 60
Molte Hsp60 appartengono alla famiglia delle chaperonine complessi
proteici oligomerici costituiti da due anelli sovrapposti di 7-9 subunitagrave
che formano una cavitagrave centrale in cui vengono accolte proteine in uno
stato non nativo
Il sistema GroEL presente nei batteri egrave un esempio di Hsp60 Esso egrave
costituito da 14 subunitagrave identiche che si articolano tra loro a costituire
una complessa struttura quaternaria formata da due anelli eptamerici
sovrapposti
Ciascun anello presenta una cavitagrave interna di 50 Aring di diametro che
ospiteragrave la proteina parzialmente denaturata GroEL richiede per la sua
attivitagrave di chaperone anche il legame e lrsquoidrolisi dellrsquoATP
bull Hsp 40
Le Hsp40 come le Hsp60 sono coinvolte in processi di stabilizzazione
e di corretto ripiegamento delle proteine nascenti La piugrave studiata e
caratterizzata egrave DnaJ di Ecoli che agisce come co-chaperone con DnaK
(Hsp70)
bull Hsp a basso peso molecolare
Hanno diverse funzioni che sono specie-specifiche ed egrave stato proposto
che esse agiscano da chaperoni molecolari e impediscano lrsquoaggregazione
proteica irreversibile
bull Hsp stress ossidativo e patologie
Come noto le HSP sono state riscontrate nelle cellule sottoposte ad
unrsquoampia varietagrave di condizioni di stress Lo stress ossidativo egrave coinvolto
in una serie di condizioni patologiche compresa la neurodegenerazione
le malattie cardiovascolari e lrsquoictus e nellrsquoinvecchiamento naturale
6
In queste condizioni lo stress ossidativo si verifica come conseguenza
dello squilibrio tra la produzione di specie reattive dellossigeno (ROS) e
la capacitagrave del corpo di disintossicarsi dagli intermedi reattivi di queste
Questo squilibrio puograve portare come conseguenza una eccessiva
produzione di ROS come osservato nelle malattie ischemiche o puograve
causare una diminuzione della capacitagrave degli enzimi antiossidanti
Come risultato il normale ambiente intracellulare egrave compromesso si
osserva ossidazione e aggregazione delle proteine e del DNA vitale che
si traduce nel fallimento della normale funzione cellulare
Le proteine ossidate si accumulano causando cosigrave infiammazioni acute
Tuttavia i cambiamenti nello stato redox cellulare possono anche essere
un segnale per lattivazione della cascata apoptotica
Fra i vari cambiamenti nellrsquoattivitagrave cellulare e nella fisiologia lrsquoevento
piugrave importante nelle cellule stressate egrave la produzione di un certo numero
di proteine altamente conservate le proteine dello shock termico o da
stress [2] Negli ultimi ventrsquoanni sono state eseguite numerose ricerche
sulla struttura e sulla funzione delle proteine da shock termico o Hsp
[3] Queste proteine sono risultate molto interessanti in quanto giocano
un ruolo fondamentale nella progressione del ciclo cellulare e
nellrsquoapoptosi (o morte programmata della cellula) e sono coinvolte in
molte malattie La risposta allo shock termico o di stress egrave una risposta
di adattamento cellulare che aiuta al mantenimento dellrsquoomeostasi
cellulare in condizioni di stress Ersquo stato osservato che subito dopo un
improvviso aumento di temperatura tutte le cellule mostrano
lrsquoespressione indotta di una famiglia di geni conosciuti come geni Hsp
La sequenza del DNA che costituisce questa famiglia di geni egrave
altamente conservata tra le specie Questa famiglia di geni era stata
originariamente chiamata cosigrave a causa della loro espressione dopo
7
lrsquoesposizione al calore Tuttavia la stessa risposta si ottiene dopo
differenti insulti inclusi stress ambientali e metabolici come ipossie
ischemie iperossie anossie esposizione alla luce UV e sostanze
chimiche nicotina stress chirurgico deficienze nutrizionali (per es
privazione del glucosio) stress emozionale e meccanico lesioni
meccaniche e agenti virali o altri tipi di stress come esposizione a
radicali tossici o ad agenti cancerogeni [4 abc] In condizioni di stress
come lo shock termico e alcuni stati fisiologici le proteine da stress
sono rapidamente indotte attraverso meccanismi di trascrizione e
trasduzione (figura 1)
Figura 1 Meccanismo di attivazione delle Hsp e riparazione delle proteine denaturate(DP)
(1) Condizioni di stress portano alla denaturazione delle proteine (2) La presenza DP
stimola la dissociazione del complesso Hsp-HSF Questo complesso limita il processo di
trascrizione in assenza di DP (3) mentre le Hsp sono libere di legarsi a DP HSF viene
attivato attraverso la fosforilazione e
La risposta inducibile allo shock termico genera un segnale che porta
allrsquoattivazione di un fattore di trascrizione [5] La trascrizione del gene
Hsp egrave sotto il controllo di una famiglia di fattori di trascrizione dello
shock termico (HSF) Membri differenti della famiglia di HSF possono
8
essere attivati da specifici stress diversi Nonostante siano stati scoperti
varie HSF HSF-1 ha dimostrato di essere il regolatore principale di una
breve induzione termica di Hsp Le Hsp giocano un importante ruolo
regolatore nella trascrizione dei geni Se le Hsp fossero sovraespresse in
assenza di stress si legherebbero direttamente al dominio di trans-
attivazione di HSF-1 determinando cosigrave la sua soppressione Le Hsp
sono proteine ubiquitarie sia nelle cellule eucariote che in quelle
procariote Come suggerisce il nome le Hsp sono indotte in cellule
esposte al calore sebbene le proteine dello stress (Chaperoni) possono
essere attivate da alcuni differenti tipi di insulti facendo in modo che le
cellule sopravvivano in condizioni altrimenti letali La tabella 1 presenta
un sommario di queste proteine la loro locazione cellulare e la loro
funzione Le Hsp ad alto peso molecolare sono ATP-dipendenti mentre
le Hsp a basso peso molecolare agiscono in maniera ATP-indipendente
[6]
9
Tabella 1 Hsp umanepeso molecolare localizzazione e funzione
10
Ogni famiglia di Hsp egrave composta da membri espressi sia in maniera
costitutiva che induttiva e si rivolge a diversi scomparti subcellulari [7]
Lrsquoattivazione costitutiva delle Hsp puograve verificarsi nelle cellule anche in
assenza di fattori di stress ambientali Per esempio Hsp90 puograve costituire
fino allrsquo1 del totale delle proteine cellulari in cellule non stressate [3]
indicando che queste proteine hanno un ruolo nel mantenimento della
conformazione delle proteine anche in condizioni normali In
condizioni di stress i dimeri di Hsp90 tendono ad associarsi in tetra-
esa- e ottameri ed oligomeri ancora piugrave elevati [8] In condizioni
fisiologiche Hsp90 si trova in associazione con diverse proteine
intracellulari tra cui calmodulina actina tubulina diverse chinasi e
qualche proteina recettore [9] I componenti dei complessi di Hsp90
come proteine kinasi e recettori steroidei possono mediare il trasporto
nucleare dellrsquoHsp90 specialmente sotto stress da calore Probabilmente
Hsp90 forma complessi stabili con filamenti di actina e si lega alla
tubulina per proteggere i microtubuli quindi puograve mediare
lrsquoorganizzazione strutturale del proteasoma un complesso
multicatalitico quando i livelli di ATP cellulari diminuiscono [5] Allo
stesso modo Hsp27 tende a oligomerizzarsi in condizioni di stress ed egrave
stato precedentemente dimostrato che nelle cellule tumorali endogene
Hsp27 egrave la piugrave importante proteina argpirimidina modificata e che
questa modifica comporta lrsquooligomerizzazione di Hsp27 [10]
Argpirimidina egrave un addotto metilgliossale-arginina che risulta dalla
glicazione non enzimatica di residui di arginina delle proteine nelle
cellule tumorali mostrando un aumento della glicolisi [11] Hsp27 e
Hsp70 sono fortemente ed universalmente indotte da diverse
sollecitazioni mentre la loro espressione egrave bassa in condizioni
fisiologiche permettendo ad attivitagrave costitutive cellulari di procedere
11
[12] A prescindere dalla loro localizzazione intracellulare le Hsp70
sono state trovate anche sulla membrana plasmatica delle cellule
trasformate malignamente e nello spazio extracellulare [13] Hsp70
Hsp90 e la proteina GP96 chaperone residente nel reticolo
endoplasmatico (RE) appartenente alla famiglia di Hsp90 [14] sono
state trovate nel mezzo cellulare Questo mette in considerazione la
duplce funzione delle Hsp la funzione citoprotettivaantiapoptotica
intracellulare e la funzione immunogenica extracellulare [7] Le Hsp
intracellulari sono importanti in quanto assicurano il ripiegamento delle
proteine nella loro corretta struttra terziaria lrsquoincorporazione di
polipeptidi nelle membrane intracellulari o nel trasporto delle proteine
attreverso le membrane [9] mentre la funzione delle Hsp extracellulari egrave
immunogenica attreverso lo chaperoning di peptidi antigenici I membri
della famiglia di Hsp70 e Hsp90 sono stati rilevati nel mezzo delle
cellule presentanti lrsquoantigene (APC) Ersquo stato osservato che lrsquouptake di
complessi Hsp-peptidi da parte delle APC egrave specifico saturabile e
concentrazione dipendente e quindi egrave stata ipotizzata lrsquoesistenza di
recettori Hsp specifici [7] Quindi il potenziale coinvolgimento delle
Hsp in molti tipi di malattie le ha rese particolarmente importanti per lo
sviluppo di nuove terapie
12
CHAPERONINE MOLECOLARI E CONTROLLO
QUALITArsquo DELLE PROTEINE
Nelle cellule viventi sia le catene polipeptidiche di nuova sintesi che le
preesistenti sono a rischio costante di mal ripiegamento
(MISFOLDING) o aggregazione In conformitagrave con lrsquoampia diversitagrave di
forme mal ripiegate lrsquoelaborazione di strategie di controllo qualitagrave si
sono evolute per opporsi a questa inevitabile disavventura Recenti studi
descrivono la rimozione di aggregati dal citosol rivelano meccanismi di
controllo di qualitagrave per proteine nel reticolo endoplasmatico (RE) e
forniscono nuove intuizioni in due classi di chaperoni molecolari
lrsquoHsp70 (Heat Shock Protein 70) e lrsquoAAA+ (Hsp100) [15]
FOLDING DI PROTEINE NEL RETICOLO
ENDOPLASMATICO RICONOSCERE IL GIUSTO
DALLO SBAGLIATO
Il reticolo endoplasmatico (ER) un organulo presente sia nelle cellule
animali che vegetali svolge un ruolo premimente in numerosi processi
di fondamentale importanza per la sopravvivenza e per il normale
funzionamento cellulare LER occupa circa il 10 del volume della
cellula e la metagrave della superficie coperta da tutte le membrane della
cellula (endomembrane piugrave membrana plasmatica) [16]
Il reticolo endoplasmatico (RE) riveste numerose funzioni vitali per la
cellula Tra le tante egrave la stazione iniziale della via secretoria ed egrave quindi
il luogo nel quale circa un terzo di tutte le proteine di una cellula viene
sintetizzato e ripiegato correttamente [17] in secondo luogo lrsquoER egrave il
13
punto di partenza dal quale numerose proteine vengono smistate e
indirizzate verso la loro destinazione finale [18]
LrsquoER egrave quindi la sede della sintesi del ripiegamento (ldquofoldingrdquo) e delle
modificazioni post-traduzionali delle proteine di membrana e secrete ed
egrave responsabile della maturazione strutturale di un quarto del proteasoma
che attraversa le vie secretorie
Il ripiegamento delle proteine secretorie fornisce una serie di sfide
uniche in quanto egrave accompagnato e dipendente dalla formazione di ponti
disolfuro ed inserzioni nel doppio strato lipidico con entrambi gli eventi
che si verificano piugrave lentamente di tipici cambi conformazionali che
accompagnano il ripiegamento Conseguentemente il RE fornisce le
condizioni ottimali per fronteggiare queste sfide includendo unrsquoalta
concentrazione di chaperoni generici oltre a una gamma di specifiche
strategie fatte su misura per favorire il ripiegamento delle proteine
secretorie Inoltre esiste un sofisticato sistema di controllo-qualitagrave nel
RE per trattenere e riparare proteine che non hanno raggiunto ancora il
loro stato naturale Malgrado la lunghezza con la quale le cellule vanno
a fornire un ambiente ottimale nel RE il ripiegamento delle proteine
secretorie puograve avvenire o manca a volte ad un ritmo allarmante Il RE
adopera due meccanismi di risposta in presenza di forme mal ripegate Il
primo meccanismo egrave una risposta allo stress RE-dedicato definito UPR
(risposta alla non corretta conformazione delle proteine) che attua il
rimodellamento del RE cosigrave da aumentare la sua capacitagrave di
ripiegamento [16] Una proteina malfunzionante rimane sequestrata nel
reticolo endoplasmatico quindi un eccesso di proteine mal strutturate
attiva la risposta da proteine con folding scorretto (Unfolded Protein
Response) Questo tipo di risposta inizia con il riconoscimento del
segnale di stress da parte di un recettore nel reticolo endoplasmatico e
14
prosegue con il blocco della sintesi proteica per permettere al
proteasoma di eliminare lrsquoeccesso di proteine mentre viene stimolata la
produzione di fattori di trascrizione Il secondo meccanismo chiamato
degradazione RE-associata (ERAD) riconosce in modo specifico le
parti terminali di proteine mal ripiegate e le loro retrotraslocazioni
attraverso la membrana del reticolo endoplasmatico nel citosol dove
possono essere degradate dal sistema di degradazione ubiquitina-
proteosoma [17] Questi due meccanismi sono intimamente collegati
lrsquoinduzione UPR aumenta la capacitagrave dellrsquoERAD una diminuzione
dellrsquoERAD comporta unrsquoinduzione dellrsquoUPR costitutivo e
contemporaneamente la diminuzione di ERAD e UPR fa diminuire di
molto la viabilitagrave delle cellule I sistemi UPR ed ERAD fronteggiano
anche il comune problema del riconoscimento che richiede
lrsquoidentificazione delle forme mal ripiegate potenzialmente patologiche
nellrsquoambiente del RE La sorveglianza di UPR ed ERAD deve garantire
un buon equilibrio proteggendo le cellule dalle pericolose specie mal
ripiegate evitando la sovra vigilanza (come accade con forme mutate di
regolatori trans membrana della fibrosi cistica CFTR) che puograve portare
allrsquoeliminazione di forme potenzialmente sanabili Recenti studi hanno
rivelato come ERAD ed UPR identifichino forme mal ripiegate
Pertanto il RE rappresenta un preciso sistema di controllo di qualitagrave atto
ad assicurare che solo le proteine correttamente ripiegate e funzionanti
possano essere rilasciate dallrsquoER e raggiungere la loro destinazione
finale mentre le proteine malripiegate o non funzionanti sono trattenute
nel ER e in seguito traslocate nel citosol per la degradazione
15
RISPOSTA ALLA NON CORRETTA
CONFORMAZIONE DELLE PROTEINE
Le proteine designate per il riconoscimento dei segnali di stress
provenienti dal reticolo endoplasmatico sono generalmente IRE1
(Inositol Requiring Kinase 1) ATF6 (Activation of Transcription Factor
6) e PERK (PKR-like Endoplasmic Reticulum Kinase)
Nel lievito la capacitagrave di ripiegarsi del RE egrave monitorata da IRE1 una
chinasi trans membrana altamente conservata che contiene un dominio
luminale responsabile del riconoscimento delle forme mal ripiegate
chinasi citosoliche e domini ribonucleasici Lrsquoaccumularsi delle proteine
mal ripiegate nel RE porta allrsquoattivazione delle chinasi IRE
Lrsquoattivazione delle IRE-chinasi promuove lo splicing non convenzionale
dei messaggi per un fattore di traduzione b-ZIP (Hac1 nel lievito e XBP-
1 nei metazoi) attraverso il suo dominio ribonucleasico La traduzione
del messaggio Hac 1 spliced crea un fattore attivo di trascrizione che
media direttamente la trascrizione dei target di UPR includendo
chaperoni del RE macchinario ERAD e tante altre proteine secretorie
In aggiunta alla IRE-1 gli eucarioti piugrave sviluppati utilizzano due altri
sensori le chinasi trans membrana del RE PERK ed il fattore di
trascrizione trans membrana del RE ATF6 (Figura 2) PERK contiene
un sensore luminale che egrave altamente correlato a quello di IRE-1 il
dominio citoplasmatico di PERK consiste in una chinasi elF2α
16
Figura 2 Struttura dei principali sensori dello stress nel reticolo endoplasmatico IRE1
ATF6 PERK
Lrsquoattivazione delle chinasi dovuta alla presenza di proteine mal
ripiegate determina unrsquoinibizione generalizzata della traduzione come
pure la up-regulation del fattore di trascrizione specifico ATF4
Lrsquoaccumulo di proteine mal ripiegate permette inoltre ad ATF6 di
raggiungere lrsquoapparato del Golgi dove le proteasi trans membrana
rilasciano il dominio citoplasmatico del fattore di trascrizione
permettendogli di entrare nel nucleo e mediare lrsquoinduzione genetica
Lrsquoesistenza di molteplici sensori UPR negli eucarioti piugrave avanzati
permette per lo piugrave una risposta piugrave sfumata alle proteine mal ripiegate
Per esempio una risposta iniziale alle proteine mal ripiegate potrebbe
portare ad una down-regulation generalizzata della traduzione seguita in
sequenza da unrsquoinduzione di chaperoni lrsquoinduzione del macchinario
17
ERAD ed infine contro lo stress prolungato lrsquoattivazione della morte
cellulare tramite apoptosi Molto recentemente ci sono stati notevoli
progressi nelle nostre conoscenze molecolari di come IRE-1 (e per
deduzione PERK) riconosce le proteine mal ripiegate Studi precedenti
avevano dimostrato che BIP (Binding Immunoglobulin Protein) lrsquo
omologo principale delle Hsp70 presente nel reticolo endoplasmatico si
lega in modo specifico con IRE1 e che questa interazione scompare in
condizioni di stress del RE Inoltre lrsquoiperespressione di BiP puograve
sopprimere lrsquoinduzione dellrsquoUPR Questo aveva suggerito un modello di
titolazione in cui BiP agisce come un regolatore negativo di IRE1 e
lrsquoaccumularsi di forme mal ripiegate porta indirettamente allrsquoattivazione
dellrsquoIRE1 attraverso il sequestro di BiP da parte proteine mal ripiegate
Tuttavia recenti studi hanno dimostrato che anche se il legame del BiP
possa avere un ruolo importante nella down-regulation di IRE1 ci sono
altri fattori importanti Analisi mutazionali hanno trovato che la
delezione della regione di IRE1 responsabile del legame con BiP non
altera la regolazione di IRE1 in risposta alle proteine unfolded [18] Piugrave
drammaticamente la struttura cristallina del core del dominio luminale
conservato (cLD) di IRE1 nel lievito rivela una profonda scanalatura
idrofobica che ricorda la tasca legante dei maggiori complessi di
istocompatibilitagrave (MHCs) che sono i responsabili per il riconoscimento
peptidico Che IRE1 possa legarsi direttamente a polipeptidi mal
ripiegati egrave unrsquoidea interessante (Figura 3) [19]
18
Figura 3 Un modello ipotetico descrive lrsquoattivazione di Ire1 attraverso la oligomerizzazione
determinata dal legame di proteine unfolded (indicate in rosso) Le interazioni dirette o
indirette fra le catene delle proteine unfolded possono contribuire allrsquoattivazione Sul lato
luminale della membrana del RE le proteine unfolded si legano alla scanalatura (indicata in
grigio) formata dalla dimerizzazione del core del dominio luminale di Ire1 attraverso
linterfaccia 1 Sul lato citoplasmaticodella membrana del RE la oligmerizzazione accosta i
domini della chinasi Ire 1 che subiscono un cambiamento conformazionale in seguito ad
autofosforilazione che porta allrsquoattivazione della funzione di RNA-ribonucleasi di Ire1
Attraverso il riconoscimento diretto delle forme mal ripiegate
lrsquoinduzione di IRE1 potrebbe verificarsi prima della completa titolazione
di BiP che data lrsquoestrema abbondanza di questrsquoultimo nel RE potrebbe
verificarsi solo dopo un catastrofico accumulo di proteine mal ripiegate
Inoltre il riconoscimento diretto di forme mal ripiegate da parte di IRE1
(e PERK) potrebbe consentire una serie di risposte piugrave sfumate in cui
diverse forme mal ripiegate potrebbero essere preferenzialmente
riconosciute da sensori diversi quali BiP IRE1 o PERK Cosigrave in linea
di principio la natura (per esempio traslazionale contro transcrizionale)
ed il ciclo di UPR potrebbe essere su misura per la classe specifica di
forme mal ripiegate che sono prevalenti nel RE [20]
19
DEGRADAZIONE DELLE PROTEINE ASSOCIATA AL
RETICOLO ENDOPLASMATICO
Come ci si poteva aspettare dalla diversitagrave delle proteine che si
ripiegano NEL RE studi recenti hanno dimostrato che la degradazione
ER-associata (ER-Associated Degradation ERAD) comprende una
serie di sistemi diversi ciascuno responsabile della degradazione di
sottoinsiemi di proteine che condividono proprietagrave fisiche comuni
Esistono anche regioni dedicate allrsquo ER Associated Degradation
(ERAD) nelle quali proteine che non raggiungono il corretto
ripiegamento vengono retrotraslocate al citosol e quindi degradate dal
proteasoma [21]
Ciograve forse egrave piugrave chiaramente dimostrato nel lievito dove ci sono almeno
due distinti meccanismi di sorveglianza per identificare le proteine mal
ripiegate del RE Il primo meccanismo chiamato ERAD-L analizza le
proteine che contengono domini luminali mal ripiegati (solubili o trans
membrana) chiamati CPY una forma mutante della proteina CPY
endogena che egrave incapace di folding Il secondo denominato ERAD-C
rileva domini mal ripiegati citosolici di proteine trans membrana [22]
Sebbene entrambe queste vie in ultima analisi convergano sul sistema
di degradazione ubiquitina-proteosoma esse dipendono da diversi
insiemi di componenti RE-associati per rivelare e fornire specie mal
ripiegate al citosol Nel caso di ERAD-C (e non di ERAD-L) la
degradazione egrave in genere dipendente da uno specifico sottoinsieme di
chaperoni citosolici inclusi i membri Hsp40 e Hsp70 Ciograve suggerisce
che queste proteine possono essere direttamente responsabili per il
riconoscimento di domini citosolici mal ripiegati di proteine trans
membrana Tuttavia le caratteristiche esatte che vengono monitorate e
20
come i substrati vengano consegnati al macchinario di
retrotranslocazione restano importanti questioni aperte per la maggior
parte dei substrati Il riconoscimento di una proteina contenente un
dominio luminale mal ripiegato dipende in modo determinante dallo
stato di glicosilazione della proteina Infatti anche piccole modifiche di
glicani N-linked puograve provocare danni gravi nella degradazione di
numerosi substrati Questo puograve effettivamente lasciare le proteine in un
limbo impossibile raggiungere lo stato nativo ma non riconosciuto dal
macchinario ERAD esse restano mal ripiegate nel RE a tempo
indeterminato A prima vista questa dipendenza dalla glicosilazione
sembra essere un miglioramento non necessario Tuttavia egrave ormai chiaro
che lo spettro di porzioni di zucchero presenti in una proteina egrave un
segnale fondamentale nel marcare il suo status di ripiegamento Infatti
dato che diverse proteine altamente abbondanti nel RE tra cui BiP e
PDI spesso non sono glicosilate la presenza e la natura covalente di
molto mannosio in un polipeptide puograve fornire un segnale importante che
aiuta il macchinario di controllo-qualitagrave del RE a distinguere le specie
ripiegate destinate ad altri scomparti da quelle piugrave abbondanti e
permanenti del RE Lrsquointuizione nel ruolo della glicosilazione nella
discriminazione tra le specie in via di ripiegamento e le proteine
terminali mal ripiegate nel RE egrave venuta dalla constatazione che
glicoproteine mal ripiegate subiscono un taglio dei loro N-glicani da una
varietagrave di glicosidasi tra cui una mannossidasi specifica In aggiunta a
proteine mal ripiegate persistenti si egrave pensato che il rimodellamento
dipendente dal tempo di N-glicani porti ad un segnale per la
degradazione del macchinario ERAD Questo permette intermedi
ripiegati in un periodo di tempo prima del rimodellamento dei loro N-
glicani in cui il polipeptide egrave immune dalla sorveglianza ERAD Egrave
21
interessante notare che un recente studio suggerisce che anche per i
polipeptidi citosolici vi egrave un periodo durante e subito dopo la sintesi in
cui le specie mal ripiegate sono immuni alla degradazione del
proteasoma [23] Recenti studi hanno identificato due differenti lettine
localizzate nel RE che svolgono un ruolo critico nellrsquoERAD La prima egrave
correlata alla proteina mannossidasi responsabile del taglio di N-glicani
nel RE ma sembra aver perso la sua attivitagrave catalitica Nel lievito si
chiama Htm1pMnl1p e nei mammiferi egrave chiamato EDEM Studi
condotti su cellule di mammifero suggeriscono che EDEM aiuta le
glicoproteine mal ripiegate a lasciare il ciclo calnexinacalreticulina del
chaperone lectina dove stanno cercando di ripiegarsi e cosigrave entrare nel
ciclo di degradazione [24 ab] Tuttavia nel lievito Htm1p egrave richiesto
per la degradazione efficiente di substrati come CPY che non
dipendono da calnexina Quindi sembra probabile che Htm1pEDEM
ricopra altri ruoli in ERAD La seconda lectina Yos9p forma un
complesso stabile con proteine mal ripiegate e la perdita di questa
lectina conduce ad un profondo e specifico difetto nella degradazione di
glicoproteine mal ripiegate [25] Sorprendentemente mentre mutazioni
puntiformi nella tasca di Yos9p legante il mannosio eliminano la sua
capacitagrave di supportare ERAD i mutanti stessi di Yos9p mostrano una
maggior interazione con i substrati Ciograve indica la possibilitagrave che la
lectina Yos9p svolga un ruolo piugrave informativo interrogando lo stato
dello zucchero di forme mal ripiegate per determinare se debbano essere
passate al macchinario di retrotranslocazione Tuttavia come con
ERAD-C sebbene ci siano stati grandi progressi nella caratterizzazione
del macchinario di retrotranslocazione [26] le caratteristiche strutturali
delle proteine mal ripiegate sono in fase di monitoraggio e sono ancora
22
limitate le conoscenzedi come le forme mal ripiegate sono passate a
questo macchinario
CLEARENCE DI AGGREGATI ATTRAVERSO
LrsquoAUTOFAGIA
Egrave sempre piugrave evidente che ci sono una varietagrave di condizioni in vivo che
anche con chaperoni e macchinari proteolitici presenti nello stesso
compartimento come proteine mal ripiegate questi meccanismi di
controllo-qualitagrave falliscono e le proteine mal ripiegate avanzano
formando aggregati Inoltre tali aggregati intracellulari sono associati
con una serie di malattie neurodegenerative come il morbo di
Huntington e di Parkinson La natura e la sorte di aggregati di proteine
nelle cellule eucariotiche egrave stata poco compresa Recentemente egrave stata
sempre piugrave sostenuta unrsquoazione protettiva della formazione di aggregati
piuttosto che unrsquoimmediata azione patogena Per esempio nel caso del
morbo di Huntington lrsquoesame di cellule neuronali in coltura
sovrapproducenti una fusione di poliglutamina espansa e huntingtina-
GFP rivelano che queste cellule contenenti aggregati fluorescenti
morfologicamente visibili esibiscono una migliore viabilitagrave rispetto a
quelle aventi per via diffusionale materiale fluorescente [27] Questo
sembra in accordo con il concetto che si tratta di piccoli assemblati di
proteine mal ripiegate inclusioni non morfologicamente visibili che
esercitano effetti tossici sulle cellule Analogamente un recente
confronto delle dimensioni rispetto a tossicitagrave per gli aggregati di
proteina prionica PrP suggerisce che piccoli aggregati contenenti da una
a due dozzine di molecole sono risultati i piugrave tossici per le cellule [28]
23
Ma le cellule dispongono di meccanismi di compensazione per questi
piccoli aggregati Studi recenti hanno suggerito che la via ubiquitina-
proteosoma possa essere il pilastro della rimozione di specie inclini
allrsquoaggregazione Infatti gli aggregati rilevati nel contesto di
neurodegenerazione di solito sono reattivi con gli anticorpi anti-
ubiquitina il che implica che le specie mal ripiegate sono state
riconosciute dal sistema di coniugazione dellubiquitina Eppure vari
studi di questi ultimi anni indicano che queste proteine modificate
rappresentano una sfida particolare per proteasomi che possono portare
alla loro inibizione [29 ab] Il meccanismo di questa inattivazione
rimane sconosciuto ma puograve coinvolgere il soffocamento della camera
del proteasoma [30]
Anatomia del proteasoma Il proteasoma egrave una macromolecola proteica del peso di circa 2 milioni
di Daltons Ersquo formata da ununitagrave base centrale (core) e 2 cappucci agli estremi (cap) Il core egrave
formato a sua volta da 4 anelli ciascuno costituito da 7 unitagrave proteiche I due ldquocaprdquo attaccati alle
due estremitagrave del core cilindrico consistono ciascuno di 20 subunitagrave
24
Ora sembra che la modifica dellrsquoubiquitina possa reclutare specie
aggregate mediante una via indipendente lrsquoAUTOFAGIA Lrsquoautofagia
implica il riconoscimento e lrsquoimpacchettamentofagocitazione di
proteine specifiche o organelli in vescicole autofagosomiche che si
fondono con i lisosomi in cui sia le vescicole che il loro contenuto sono
scomposti Piugrave di 20 componenti cosiddetti Atg (geni coinvolti
nellrsquoautofagia) mediano questo processo straordinario Recenti studi
hanno dimostrato che componenti centrali della formazione di autosomi
nei topi hanno attivitagrave nei tessuti dei mammiferi Per esempio carenza
di atg5 ha portato alla morte di animali appena nati a causa
dellrsquoincapacitagrave di fornire un apporto di aminoacidi attraverso la
degradazione di proteine del corpo durante la condizione di fame
relativa allrsquoimmediato periodo post-natale Sorprendentemente in un
altro studio in cui egrave stata indotta una carenza di atg7 piugrave avanti nella
vita con un gene ldquofloxedrdquo lrsquoaccumulo di aggregati positivi
allrsquoubiquitina egrave stata osservata nel fegato degli animali che sono stati
disabilitati nella produzione di autofagosomi La funzione del
proteasoma in questi animali egrave rimasta inalterata contenente specie mal
ripiegate etichettate con ubiquitina e possono essere eliminate attraverso
autofagia Egrave stato poi scoperto un componente denominato p62 (o
sequestosoma1) che costituisce un guscio attorno agli aggregati di
huntingtina [31] Questa proteina contiene un dominio C-terminale
associato allrsquoubiquitina (UBA) che puograve legare poliubiquitine in modo
tale che p62 si collochi con lrsquoubiquitina quando espressa in cellule
HeLa Inoltre nelle cellule che esprimono huntigtina p62 si associa con
LC3 una proteina localizzata negli autofagosomi In accordo con quanto
riportato e cioegrave che lrsquoautofagia riduce i livelli di aggregati di
huntingtina e con un ruolo critico di p62 in questo processo lrsquoinibizione
25
antisenso mediata dallrsquoesperessione di p62 aumenta lrsquoapoptosi delle
cellule che esprimono huntungtina Quindi sembra che la modifica
dellrsquoubiquitina delle proteine difettose possa offrire un ingresso sia al
sistema proteasoma o in contesti dove lrsquoaggregazione egrave in corso al
sistema autofagia
SISTEMI CHAPERONI HSP70
Le Hsp70 proteine dello shock termico di 70 KDa sono impegnate in
una serie di processi tra cui il ripiegamento di proteine di nuova sintesi
il trasporto delle proteine attraverso membrane il ripiegamento di
proteine mal ripiegate ed aggregate e il controllo delle attivitagrave delle
proteine regolatrici Questa versatilitagrave egrave ottenuta attraverso
lampliamento e la diversificazione evolutiva di geni hsp70 che ha
generato sia chaperoni Hsp70 specifici Hsp110 e proteine Hsp170 La
versatilitagrave egrave determinata attraverso lrsquoimpiego di cochaperoni proteine J
e fattori di scambio di nucleotide (NEF) che regolano lrsquoattivitagrave di Hsp70
(Figura 4)
26
Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame
del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una
Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)
Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la
proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato
allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del
substrato
Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre
specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb
Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di
legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un
numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame
dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi
Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina
Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni
Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali
di Hsp70 con se stesso
27
INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70
Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di
proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura
xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding
appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide
N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD
adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio
elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con
lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante
chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco
tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini
di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di
comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura
di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione
La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la
tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo
coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture
precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una
proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da
una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β
ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica
compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio
elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di
legame del substrato (Figura 5)
28
Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo
substrato
La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra
domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che
collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo
solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi
residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame
allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A
dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso
Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un
legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in
nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano
completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve
entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo
fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui
coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del
segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti
integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A
29
capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il
quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di
ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a
idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di
DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro
catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente
arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia
drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete
crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la
barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK
costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina
superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura
della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera
attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della
prolina
DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-
NUCLEOTIDE
Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi
meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono
fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la
liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del
substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la
dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine
BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave
dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con
30
funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S
cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1
(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la
disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e
HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70
fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi
della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente
indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene
GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg
di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei
nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte
posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i
nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario
BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in
modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del
complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si
compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo
Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva
[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con
conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve
indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca
di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di
convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la
reazione di scambio nucleotidica di Hsp70
31
LEGAMI Hsp70-Hsp70
Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro
della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In
particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce
come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola
lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di
questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento
Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il
cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che
sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi
eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente
lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se
non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di
complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di
nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di
scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione
importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto
di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel
folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle
Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza
proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa
con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere
coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di
traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina
Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come
sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le
interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di
32
Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi
SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua
attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano
legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di
idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede
possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano
lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina
stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che
Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami
con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina
J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di
stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega
bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o
Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non
limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che
la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-
associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con
Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito
meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande
aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante
per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70
AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP
Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli
AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione
disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]
33
Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un
anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del
proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico
20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA
svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP
Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104
nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico
per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste
attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come
una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-
etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE
per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla
fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il
meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere
tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria
per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli
anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una
parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali
suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata
assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando
una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a
spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad
entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel
caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro
che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti
dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una
proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In
parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno
34
individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi
domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre
interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta
apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati
che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la
questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)
Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97
Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da
proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad
entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro
efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non
devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati
dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte
lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono
piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte
superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine
adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il
35
movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori
p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su
proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di
proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la
retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e
reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo
anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite
adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente
il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente
forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei
canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]
LrsquoAZIONE DELLrsquoATP
La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico
al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco
affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad
esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello
Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che
ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo
di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli
wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli
mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori
dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di
ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di
un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di
quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda
36
subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino
al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave
significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o
sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti
differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra
essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che
attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave
adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non
vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a
cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di
subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico
Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un
substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di
queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un
meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da
F1-ATPasi non sembra escluso
HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE
NEURODEGENERATIVE
RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE
Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel
mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una
pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi
associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione
37
di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di
Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta
promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]
Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90
nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave
funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi
permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]
HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico
Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono
mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)
accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock
citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata
da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante
di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo
stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si
lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei
geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-
shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via
multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di
transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-
translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90
[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e
mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo
shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con
Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)
38
attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da
shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni
Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che
i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro
sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock
termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su
attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato
che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi
di insulti
Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90
e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con
shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La
somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a
topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello
39
Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge
contro aggregati tossici
Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un
aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave
egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di
chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione
incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste
molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente
diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su
espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative
Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie
neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a
mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei
neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia
muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-
pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma
mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme
nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che
Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in
oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza
attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili
[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di
Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt
mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore
di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo
suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro
effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi
40
indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando
monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono
probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono
essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di
atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70
permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]
Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare
spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo
nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un
miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina
[62]
Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il
riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso
lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido
dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli
di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i
motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione
acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni
Riluzolo
Arimoclomol
41
Nei vari modelli cellulari della malattia di Alzheimer (AD) vi egrave un
incremento dei livelli di Hsp70 promossa dalla solubilitagrave e dal legame ai
microtubuli delle proteine tau [63] Hsp70 ha anche inibito la
propensione di aggregazione di Aβ [64] e ridotto la tossicitagrave di Aβ su
culture neuronali [65] Inoltre la proteina precursore dellrsquoamiloide
(APP) eo il suo Aβ amiloide derivato sono bersagli di chaperoni
mediati da clearence [66-67] Nella Drosophila melanogaster e nei
modelli di lievito della malattia di Parkinson (PD) lrsquoespressione diretta
di Hsp70 o la modulazione farmacologica di Hsp ha impedito la perdita
di neuroni causata da alfa-sinucleina [68-69] Huang et al hanno
riportato che questi effetti di Hsp70 si manifestano con lrsquoinibizione della
formazione di fibrille di alfa-sinucleina prevenendo la formazione di
alfa-sinucleina prefibrillare [70] Usando delezioni mutanti di alfa-
sinucleina Luk et al hanno indicato che le interazioni tra il dominio
legante il substrato Hsp70 e la regione del core idrofobico dellrsquoalfa-
sinucleina mediano lrsquoinibizione dellrsquoassemblaggio e che questo
processo di assemblaggio egrave inibito prima della fase di allungamento
[71] Nel complesso in diversi modelli di malattia neurodegenerativa la
sovra espressione di Hsp70 ha migliorato la gravitagrave della malattia di
fenotipi diversi senza incidere visibilmente sulla formazione di
aggregati suggerendo che i chaperoni non impediscono lrsquoaggregazione
di per seacute bensigrave reindirizzano gli aggregati preferibilmente in depositi
amorfi quindi sequestrando specie potenzialmente tossiche dalla
maggior parte della soluzione
42
Lrsquoespressione di Hsp70 e di altre Hsp egrave indotta dallrsquoinibizione
farmacologica di Hsp90
Come riportato sopra lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal
complesso con Hsp90 con susseguente produzione di Hsp (Figura 7) e
lrsquoinduzione di Hsp70 da parte di inibitori di Hsp90 egrave ben documentata
nei modelli di malattie neurodegenerative La geldanamicina (GM) un
inibitore di Hsp90 induce un aumento dose dipendente di Hsp70 nei
modelli di cellule di AD (Alzhaimer) cosigrave come nei neuroni della
corteccia primaria del ratto e riduce la quantitagrave di tau insolubili e dei
livelli basali di acido okadaico indotto da tau fosforilazione [63] Il
trattamento di neuroni primari corticali con lrsquoinibitore di Hsp90 con
struttura purinica il PU24FCI ha portato ad un aumento di Hsp70 dose-
dipendente [72]
PU24FCI
KU32
43
Allo stesso modo la somministrazione di due derivati di PU24FCI
CNS-permeabili il PU-DZ8 [72] ed il EC102 [73] a topi tau transgenici
(htau e JNPL3) ha determinato induzione di Hsp70 nel cervello e
mantenuto gli effetti per 24 ore dopo la somministrazione KU32 un
inibitore di Hsp90 di diversa natura chimica ha indotto Hsp70 in culture
SH-SY5Y di neuroblastoma e la ha protetta da tossicitagrave indotta da Aβ
GM ha attivato una risposta da shock termico ed inibito lrsquoaggregazione
di htt in un modello di coltura cellulare di HD ed ha indotto Hsp70 in
maniera tempo e concentrazione-dipendente ed ha impedito
lrsquoaggregazione di alfa-sinucleina e protetto contro la tossicitagrave in un
modello di aggregazione cellulare di alfa-sinucleina Auluck et al hanno
segnalato che il trattamento di un modello volante di PD con GM ha
protetto completamente contro tossicitagrave per alfa-sinucleina [74] GM ha
protetto anche contro la neurotossicitagrave dopaminergica indotta da 1-metil-
4-fenil-1236-tetraidropiridina (MPTP) in un modello di topo di PD Il
pretrattamento con GM mediante iniezione ventricolare intracerebrale
prima del trattamento con MPTP ha indotto le Hsp70 ed incrementato il
contenuto residuale di dopamina e lrsquoimmuno reattivitagrave della tirosina
idrolasi nel corpo striato [75] Lrsquoinduzione di Hsp70 nel midollo spinale
egrave stata osservata in seguito ad iniezione intraperitoneale di un derivato
della GM il 17-AAG in un modello di SBMA topo [76] Il 17-AAG egrave
stato anche efficace contro la nuerodegenerazione in altre malattie
poliQ Vale a dire ha soppresso la degenerazione dellrsquoocchio e la
formazione di inclusioni del corpo e salvato dalla letalitagrave in un modello
di SCA di Drosophila Ha inoltre soppresso la neurodegenerazione in un
modello volante di HD La riduzione di HSF-1 ha abolito lrsquoinduzione di
chaperoni molecolari e gli effeti terapeutici di 17-AAG sulla
neurodegenerazione poliQ indotta nei modelli di Drosophila facendo
44
arguire che lrsquoeffetto terapeutico di 17-AAG egrave essenzialmente mediato da
HSF-1 [77] Riassumendo lrsquoattivazione di HSF-1 da inibitori di Hsp90
egrave stata notata specificamente in modelli in vivo ed in vitro di malattie
neurodegenerative suggerendo che lrsquoinibizione di Hsp90 puograve essere un
mezzo per modulare i livelli di Hsp in cervelli malati con lrsquoobbiettivo di
proteggere contro le proteine tossiche che si presentano nel corso del
processo neurodegenerativo
Lrsquoinibizione di Hsp90 riduce lrsquoattivitagrave e lrsquoespressione di proteine
neuronali aberranti
In aggiunta alla regolazione di HSF-1 evidenze recenti suggeriscono un
ruolo addizionale per Hsp90 nel mantenimento della stabilitagrave funzionale
della capacitagrave aberrante di proteine neuronali (Figura 8A)
La SBMA egrave una malattia ereditaria dei motoneuroni causata
dallrsquoaccrescimento di un tratto di poliglutamina allrsquointerno del recettore
androgeno (AR) [57]
Le caratteristiche patologiche di SBMA sono perdita dei motoneuroni
nel midollo spinale e nel tronco cerebrale diffusione dellrsquoaccumulo
nucleare inclusioni nucleari di mutanti AR (mAR) nei motoneuroni
residui e in alcuni organi viscerali Waza et al hanno dimostrato che
mAR presente in SBMA egrave una delle proteine regolate da Hsp90 (Figura
8A) [76]
45
Figura 8 Le Hsp90 riparano le proteine neuronali aberranti (A) Proteine neuronali
aberranti regolate da Hsp90 (B) Lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90porta allrsquoinattivazione
o degradazione delle proteine regulate da Hsp90 probabilmente attraverso la via del
proteasoma
Le Hsp90 formano un complesso molecolare con mAR per il
mantenimento della sua stabilitagrave funzionale Sia in modelli cellulari di
SBMA che in topi transgenici lrsquoinibizione di Hsp90 da parte di 17-
AAG il derivato 17 allilammino-17-demetossi della geldanamicina ha
46
portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal
macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati
disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da
destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione
dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di
SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave
rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati
[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori
hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo
sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa
(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni
Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]
Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo
egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali
sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al
hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina
(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi
familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un
complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data
da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto
47
lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della
stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave
dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita
neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei
neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che
codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a
PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson
familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson
suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente
associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che
Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate
con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente
diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina
egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille
ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno
recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di
alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che
sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina
[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce
lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari
Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-
dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento
tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-
sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da
chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di
mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il
macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD
associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-
48
sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative
caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave
caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di
tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD
lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da
unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina
chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta
(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si
era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero
netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un
gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e
Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave
causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma
17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau
[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine
neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso
portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina
mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da
Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei
modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave
patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-
dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla
settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad
una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di
tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno
dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una
diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di
AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le
49
relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la
degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90
[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al
(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave
stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da
GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β
effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi
GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di
Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe
portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in
strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati
indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone
biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione
di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da
parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi
proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di
queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)
Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie
neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio
approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare
dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la
formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione
potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di
Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare
terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare
malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo
centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90
puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione
50
successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti
neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti
clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto
che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono
tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in
modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni
nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati
promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio
spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in
modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di
Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a
lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse
da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase
esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora
rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori
dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per
mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie
neurodegenerative
51
SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-
ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-
METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE
(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE
MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO
SULLA FRAMMENTAZIONE
Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in
risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta
nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine
regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il
ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai
loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine
client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro
cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire
su molti percorsi oncogenici
Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il
nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che
lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati
composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP
attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del
processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono
emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i
tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule
normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina
(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una
maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto
che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una
piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
4
bull Hsp 90 (85-90 kDa)
Sono proteine dimeriche con un sito di dimerizzazione localizzato nella
regione C-terminale Nella regione N-terminale contengono invece un
sito di legame per lrsquoATP La rottura delle Hsp90 in un dominio N-
terminale e in uno C-terminale rivela che entrambi i frammenti possono
sopprimere lrsquoaggregazione
Questi risultati suggeriscono che le Hsp90 contengono due siti che
contribuiscono indipendentemente alla sua attivitagrave di chaperone
molecolare
I due siti inoltre mostrano specificitagrave diversa per il substrato e
dipendenza o meno dallrsquoATP
Il sito N-terminale interagisce con proteine e peptidi non ripiegati in
modo ATP-dipendente mentre il sito C-terminale sembra agire come un
chaperone generale in modo ATP-indipendente
Le Hsp90 sembrano essere coinvolte nella trasduzione del segnale date
le loro interazioni con i recettori degli ormoni steroidei e con varie
chinasi del ciclo cellulare
bull Hsp 70 (66-78 kDa)
Le proteine Hsp70 si ritrovano in tutte le specie e la loro funzione egrave
quella di favorire lrsquoassemblaggio di complessi multimerici proteici e
come chaperone molecolari di facilitare il folding intracellulare delle
proteine Queste sono costituite da due domini funzionali un dominio
carbossiterminale (circa 25 kDa) contenente il sito di legame per il
polipeptide ed un dominio amminoterminale (circa 40 kDa) contenente
il sito di legame per ADPATP e che ha attivitagrave ATPasica Funzionano
come monomeri o come dimeri riconoscendo porzioni di 7-8 residui
amminoacidici Un esempio egrave la DnaK di Ecoli che egrave un membro
stress-inducibile della famiglia delle Hsp70 e coopera con DnaJ (una
5
Hsp40) e GrpE nel formare un sistema chaperone ATP-dipendente
coinvolto nei processi cellulari
bull Hsp 60
Molte Hsp60 appartengono alla famiglia delle chaperonine complessi
proteici oligomerici costituiti da due anelli sovrapposti di 7-9 subunitagrave
che formano una cavitagrave centrale in cui vengono accolte proteine in uno
stato non nativo
Il sistema GroEL presente nei batteri egrave un esempio di Hsp60 Esso egrave
costituito da 14 subunitagrave identiche che si articolano tra loro a costituire
una complessa struttura quaternaria formata da due anelli eptamerici
sovrapposti
Ciascun anello presenta una cavitagrave interna di 50 Aring di diametro che
ospiteragrave la proteina parzialmente denaturata GroEL richiede per la sua
attivitagrave di chaperone anche il legame e lrsquoidrolisi dellrsquoATP
bull Hsp 40
Le Hsp40 come le Hsp60 sono coinvolte in processi di stabilizzazione
e di corretto ripiegamento delle proteine nascenti La piugrave studiata e
caratterizzata egrave DnaJ di Ecoli che agisce come co-chaperone con DnaK
(Hsp70)
bull Hsp a basso peso molecolare
Hanno diverse funzioni che sono specie-specifiche ed egrave stato proposto
che esse agiscano da chaperoni molecolari e impediscano lrsquoaggregazione
proteica irreversibile
bull Hsp stress ossidativo e patologie
Come noto le HSP sono state riscontrate nelle cellule sottoposte ad
unrsquoampia varietagrave di condizioni di stress Lo stress ossidativo egrave coinvolto
in una serie di condizioni patologiche compresa la neurodegenerazione
le malattie cardiovascolari e lrsquoictus e nellrsquoinvecchiamento naturale
6
In queste condizioni lo stress ossidativo si verifica come conseguenza
dello squilibrio tra la produzione di specie reattive dellossigeno (ROS) e
la capacitagrave del corpo di disintossicarsi dagli intermedi reattivi di queste
Questo squilibrio puograve portare come conseguenza una eccessiva
produzione di ROS come osservato nelle malattie ischemiche o puograve
causare una diminuzione della capacitagrave degli enzimi antiossidanti
Come risultato il normale ambiente intracellulare egrave compromesso si
osserva ossidazione e aggregazione delle proteine e del DNA vitale che
si traduce nel fallimento della normale funzione cellulare
Le proteine ossidate si accumulano causando cosigrave infiammazioni acute
Tuttavia i cambiamenti nello stato redox cellulare possono anche essere
un segnale per lattivazione della cascata apoptotica
Fra i vari cambiamenti nellrsquoattivitagrave cellulare e nella fisiologia lrsquoevento
piugrave importante nelle cellule stressate egrave la produzione di un certo numero
di proteine altamente conservate le proteine dello shock termico o da
stress [2] Negli ultimi ventrsquoanni sono state eseguite numerose ricerche
sulla struttura e sulla funzione delle proteine da shock termico o Hsp
[3] Queste proteine sono risultate molto interessanti in quanto giocano
un ruolo fondamentale nella progressione del ciclo cellulare e
nellrsquoapoptosi (o morte programmata della cellula) e sono coinvolte in
molte malattie La risposta allo shock termico o di stress egrave una risposta
di adattamento cellulare che aiuta al mantenimento dellrsquoomeostasi
cellulare in condizioni di stress Ersquo stato osservato che subito dopo un
improvviso aumento di temperatura tutte le cellule mostrano
lrsquoespressione indotta di una famiglia di geni conosciuti come geni Hsp
La sequenza del DNA che costituisce questa famiglia di geni egrave
altamente conservata tra le specie Questa famiglia di geni era stata
originariamente chiamata cosigrave a causa della loro espressione dopo
7
lrsquoesposizione al calore Tuttavia la stessa risposta si ottiene dopo
differenti insulti inclusi stress ambientali e metabolici come ipossie
ischemie iperossie anossie esposizione alla luce UV e sostanze
chimiche nicotina stress chirurgico deficienze nutrizionali (per es
privazione del glucosio) stress emozionale e meccanico lesioni
meccaniche e agenti virali o altri tipi di stress come esposizione a
radicali tossici o ad agenti cancerogeni [4 abc] In condizioni di stress
come lo shock termico e alcuni stati fisiologici le proteine da stress
sono rapidamente indotte attraverso meccanismi di trascrizione e
trasduzione (figura 1)
Figura 1 Meccanismo di attivazione delle Hsp e riparazione delle proteine denaturate(DP)
(1) Condizioni di stress portano alla denaturazione delle proteine (2) La presenza DP
stimola la dissociazione del complesso Hsp-HSF Questo complesso limita il processo di
trascrizione in assenza di DP (3) mentre le Hsp sono libere di legarsi a DP HSF viene
attivato attraverso la fosforilazione e
La risposta inducibile allo shock termico genera un segnale che porta
allrsquoattivazione di un fattore di trascrizione [5] La trascrizione del gene
Hsp egrave sotto il controllo di una famiglia di fattori di trascrizione dello
shock termico (HSF) Membri differenti della famiglia di HSF possono
8
essere attivati da specifici stress diversi Nonostante siano stati scoperti
varie HSF HSF-1 ha dimostrato di essere il regolatore principale di una
breve induzione termica di Hsp Le Hsp giocano un importante ruolo
regolatore nella trascrizione dei geni Se le Hsp fossero sovraespresse in
assenza di stress si legherebbero direttamente al dominio di trans-
attivazione di HSF-1 determinando cosigrave la sua soppressione Le Hsp
sono proteine ubiquitarie sia nelle cellule eucariote che in quelle
procariote Come suggerisce il nome le Hsp sono indotte in cellule
esposte al calore sebbene le proteine dello stress (Chaperoni) possono
essere attivate da alcuni differenti tipi di insulti facendo in modo che le
cellule sopravvivano in condizioni altrimenti letali La tabella 1 presenta
un sommario di queste proteine la loro locazione cellulare e la loro
funzione Le Hsp ad alto peso molecolare sono ATP-dipendenti mentre
le Hsp a basso peso molecolare agiscono in maniera ATP-indipendente
[6]
9
Tabella 1 Hsp umanepeso molecolare localizzazione e funzione
10
Ogni famiglia di Hsp egrave composta da membri espressi sia in maniera
costitutiva che induttiva e si rivolge a diversi scomparti subcellulari [7]
Lrsquoattivazione costitutiva delle Hsp puograve verificarsi nelle cellule anche in
assenza di fattori di stress ambientali Per esempio Hsp90 puograve costituire
fino allrsquo1 del totale delle proteine cellulari in cellule non stressate [3]
indicando che queste proteine hanno un ruolo nel mantenimento della
conformazione delle proteine anche in condizioni normali In
condizioni di stress i dimeri di Hsp90 tendono ad associarsi in tetra-
esa- e ottameri ed oligomeri ancora piugrave elevati [8] In condizioni
fisiologiche Hsp90 si trova in associazione con diverse proteine
intracellulari tra cui calmodulina actina tubulina diverse chinasi e
qualche proteina recettore [9] I componenti dei complessi di Hsp90
come proteine kinasi e recettori steroidei possono mediare il trasporto
nucleare dellrsquoHsp90 specialmente sotto stress da calore Probabilmente
Hsp90 forma complessi stabili con filamenti di actina e si lega alla
tubulina per proteggere i microtubuli quindi puograve mediare
lrsquoorganizzazione strutturale del proteasoma un complesso
multicatalitico quando i livelli di ATP cellulari diminuiscono [5] Allo
stesso modo Hsp27 tende a oligomerizzarsi in condizioni di stress ed egrave
stato precedentemente dimostrato che nelle cellule tumorali endogene
Hsp27 egrave la piugrave importante proteina argpirimidina modificata e che
questa modifica comporta lrsquooligomerizzazione di Hsp27 [10]
Argpirimidina egrave un addotto metilgliossale-arginina che risulta dalla
glicazione non enzimatica di residui di arginina delle proteine nelle
cellule tumorali mostrando un aumento della glicolisi [11] Hsp27 e
Hsp70 sono fortemente ed universalmente indotte da diverse
sollecitazioni mentre la loro espressione egrave bassa in condizioni
fisiologiche permettendo ad attivitagrave costitutive cellulari di procedere
11
[12] A prescindere dalla loro localizzazione intracellulare le Hsp70
sono state trovate anche sulla membrana plasmatica delle cellule
trasformate malignamente e nello spazio extracellulare [13] Hsp70
Hsp90 e la proteina GP96 chaperone residente nel reticolo
endoplasmatico (RE) appartenente alla famiglia di Hsp90 [14] sono
state trovate nel mezzo cellulare Questo mette in considerazione la
duplce funzione delle Hsp la funzione citoprotettivaantiapoptotica
intracellulare e la funzione immunogenica extracellulare [7] Le Hsp
intracellulari sono importanti in quanto assicurano il ripiegamento delle
proteine nella loro corretta struttra terziaria lrsquoincorporazione di
polipeptidi nelle membrane intracellulari o nel trasporto delle proteine
attreverso le membrane [9] mentre la funzione delle Hsp extracellulari egrave
immunogenica attreverso lo chaperoning di peptidi antigenici I membri
della famiglia di Hsp70 e Hsp90 sono stati rilevati nel mezzo delle
cellule presentanti lrsquoantigene (APC) Ersquo stato osservato che lrsquouptake di
complessi Hsp-peptidi da parte delle APC egrave specifico saturabile e
concentrazione dipendente e quindi egrave stata ipotizzata lrsquoesistenza di
recettori Hsp specifici [7] Quindi il potenziale coinvolgimento delle
Hsp in molti tipi di malattie le ha rese particolarmente importanti per lo
sviluppo di nuove terapie
12
CHAPERONINE MOLECOLARI E CONTROLLO
QUALITArsquo DELLE PROTEINE
Nelle cellule viventi sia le catene polipeptidiche di nuova sintesi che le
preesistenti sono a rischio costante di mal ripiegamento
(MISFOLDING) o aggregazione In conformitagrave con lrsquoampia diversitagrave di
forme mal ripiegate lrsquoelaborazione di strategie di controllo qualitagrave si
sono evolute per opporsi a questa inevitabile disavventura Recenti studi
descrivono la rimozione di aggregati dal citosol rivelano meccanismi di
controllo di qualitagrave per proteine nel reticolo endoplasmatico (RE) e
forniscono nuove intuizioni in due classi di chaperoni molecolari
lrsquoHsp70 (Heat Shock Protein 70) e lrsquoAAA+ (Hsp100) [15]
FOLDING DI PROTEINE NEL RETICOLO
ENDOPLASMATICO RICONOSCERE IL GIUSTO
DALLO SBAGLIATO
Il reticolo endoplasmatico (ER) un organulo presente sia nelle cellule
animali che vegetali svolge un ruolo premimente in numerosi processi
di fondamentale importanza per la sopravvivenza e per il normale
funzionamento cellulare LER occupa circa il 10 del volume della
cellula e la metagrave della superficie coperta da tutte le membrane della
cellula (endomembrane piugrave membrana plasmatica) [16]
Il reticolo endoplasmatico (RE) riveste numerose funzioni vitali per la
cellula Tra le tante egrave la stazione iniziale della via secretoria ed egrave quindi
il luogo nel quale circa un terzo di tutte le proteine di una cellula viene
sintetizzato e ripiegato correttamente [17] in secondo luogo lrsquoER egrave il
13
punto di partenza dal quale numerose proteine vengono smistate e
indirizzate verso la loro destinazione finale [18]
LrsquoER egrave quindi la sede della sintesi del ripiegamento (ldquofoldingrdquo) e delle
modificazioni post-traduzionali delle proteine di membrana e secrete ed
egrave responsabile della maturazione strutturale di un quarto del proteasoma
che attraversa le vie secretorie
Il ripiegamento delle proteine secretorie fornisce una serie di sfide
uniche in quanto egrave accompagnato e dipendente dalla formazione di ponti
disolfuro ed inserzioni nel doppio strato lipidico con entrambi gli eventi
che si verificano piugrave lentamente di tipici cambi conformazionali che
accompagnano il ripiegamento Conseguentemente il RE fornisce le
condizioni ottimali per fronteggiare queste sfide includendo unrsquoalta
concentrazione di chaperoni generici oltre a una gamma di specifiche
strategie fatte su misura per favorire il ripiegamento delle proteine
secretorie Inoltre esiste un sofisticato sistema di controllo-qualitagrave nel
RE per trattenere e riparare proteine che non hanno raggiunto ancora il
loro stato naturale Malgrado la lunghezza con la quale le cellule vanno
a fornire un ambiente ottimale nel RE il ripiegamento delle proteine
secretorie puograve avvenire o manca a volte ad un ritmo allarmante Il RE
adopera due meccanismi di risposta in presenza di forme mal ripegate Il
primo meccanismo egrave una risposta allo stress RE-dedicato definito UPR
(risposta alla non corretta conformazione delle proteine) che attua il
rimodellamento del RE cosigrave da aumentare la sua capacitagrave di
ripiegamento [16] Una proteina malfunzionante rimane sequestrata nel
reticolo endoplasmatico quindi un eccesso di proteine mal strutturate
attiva la risposta da proteine con folding scorretto (Unfolded Protein
Response) Questo tipo di risposta inizia con il riconoscimento del
segnale di stress da parte di un recettore nel reticolo endoplasmatico e
14
prosegue con il blocco della sintesi proteica per permettere al
proteasoma di eliminare lrsquoeccesso di proteine mentre viene stimolata la
produzione di fattori di trascrizione Il secondo meccanismo chiamato
degradazione RE-associata (ERAD) riconosce in modo specifico le
parti terminali di proteine mal ripiegate e le loro retrotraslocazioni
attraverso la membrana del reticolo endoplasmatico nel citosol dove
possono essere degradate dal sistema di degradazione ubiquitina-
proteosoma [17] Questi due meccanismi sono intimamente collegati
lrsquoinduzione UPR aumenta la capacitagrave dellrsquoERAD una diminuzione
dellrsquoERAD comporta unrsquoinduzione dellrsquoUPR costitutivo e
contemporaneamente la diminuzione di ERAD e UPR fa diminuire di
molto la viabilitagrave delle cellule I sistemi UPR ed ERAD fronteggiano
anche il comune problema del riconoscimento che richiede
lrsquoidentificazione delle forme mal ripiegate potenzialmente patologiche
nellrsquoambiente del RE La sorveglianza di UPR ed ERAD deve garantire
un buon equilibrio proteggendo le cellule dalle pericolose specie mal
ripiegate evitando la sovra vigilanza (come accade con forme mutate di
regolatori trans membrana della fibrosi cistica CFTR) che puograve portare
allrsquoeliminazione di forme potenzialmente sanabili Recenti studi hanno
rivelato come ERAD ed UPR identifichino forme mal ripiegate
Pertanto il RE rappresenta un preciso sistema di controllo di qualitagrave atto
ad assicurare che solo le proteine correttamente ripiegate e funzionanti
possano essere rilasciate dallrsquoER e raggiungere la loro destinazione
finale mentre le proteine malripiegate o non funzionanti sono trattenute
nel ER e in seguito traslocate nel citosol per la degradazione
15
RISPOSTA ALLA NON CORRETTA
CONFORMAZIONE DELLE PROTEINE
Le proteine designate per il riconoscimento dei segnali di stress
provenienti dal reticolo endoplasmatico sono generalmente IRE1
(Inositol Requiring Kinase 1) ATF6 (Activation of Transcription Factor
6) e PERK (PKR-like Endoplasmic Reticulum Kinase)
Nel lievito la capacitagrave di ripiegarsi del RE egrave monitorata da IRE1 una
chinasi trans membrana altamente conservata che contiene un dominio
luminale responsabile del riconoscimento delle forme mal ripiegate
chinasi citosoliche e domini ribonucleasici Lrsquoaccumularsi delle proteine
mal ripiegate nel RE porta allrsquoattivazione delle chinasi IRE
Lrsquoattivazione delle IRE-chinasi promuove lo splicing non convenzionale
dei messaggi per un fattore di traduzione b-ZIP (Hac1 nel lievito e XBP-
1 nei metazoi) attraverso il suo dominio ribonucleasico La traduzione
del messaggio Hac 1 spliced crea un fattore attivo di trascrizione che
media direttamente la trascrizione dei target di UPR includendo
chaperoni del RE macchinario ERAD e tante altre proteine secretorie
In aggiunta alla IRE-1 gli eucarioti piugrave sviluppati utilizzano due altri
sensori le chinasi trans membrana del RE PERK ed il fattore di
trascrizione trans membrana del RE ATF6 (Figura 2) PERK contiene
un sensore luminale che egrave altamente correlato a quello di IRE-1 il
dominio citoplasmatico di PERK consiste in una chinasi elF2α
16
Figura 2 Struttura dei principali sensori dello stress nel reticolo endoplasmatico IRE1
ATF6 PERK
Lrsquoattivazione delle chinasi dovuta alla presenza di proteine mal
ripiegate determina unrsquoinibizione generalizzata della traduzione come
pure la up-regulation del fattore di trascrizione specifico ATF4
Lrsquoaccumulo di proteine mal ripiegate permette inoltre ad ATF6 di
raggiungere lrsquoapparato del Golgi dove le proteasi trans membrana
rilasciano il dominio citoplasmatico del fattore di trascrizione
permettendogli di entrare nel nucleo e mediare lrsquoinduzione genetica
Lrsquoesistenza di molteplici sensori UPR negli eucarioti piugrave avanzati
permette per lo piugrave una risposta piugrave sfumata alle proteine mal ripiegate
Per esempio una risposta iniziale alle proteine mal ripiegate potrebbe
portare ad una down-regulation generalizzata della traduzione seguita in
sequenza da unrsquoinduzione di chaperoni lrsquoinduzione del macchinario
17
ERAD ed infine contro lo stress prolungato lrsquoattivazione della morte
cellulare tramite apoptosi Molto recentemente ci sono stati notevoli
progressi nelle nostre conoscenze molecolari di come IRE-1 (e per
deduzione PERK) riconosce le proteine mal ripiegate Studi precedenti
avevano dimostrato che BIP (Binding Immunoglobulin Protein) lrsquo
omologo principale delle Hsp70 presente nel reticolo endoplasmatico si
lega in modo specifico con IRE1 e che questa interazione scompare in
condizioni di stress del RE Inoltre lrsquoiperespressione di BiP puograve
sopprimere lrsquoinduzione dellrsquoUPR Questo aveva suggerito un modello di
titolazione in cui BiP agisce come un regolatore negativo di IRE1 e
lrsquoaccumularsi di forme mal ripiegate porta indirettamente allrsquoattivazione
dellrsquoIRE1 attraverso il sequestro di BiP da parte proteine mal ripiegate
Tuttavia recenti studi hanno dimostrato che anche se il legame del BiP
possa avere un ruolo importante nella down-regulation di IRE1 ci sono
altri fattori importanti Analisi mutazionali hanno trovato che la
delezione della regione di IRE1 responsabile del legame con BiP non
altera la regolazione di IRE1 in risposta alle proteine unfolded [18] Piugrave
drammaticamente la struttura cristallina del core del dominio luminale
conservato (cLD) di IRE1 nel lievito rivela una profonda scanalatura
idrofobica che ricorda la tasca legante dei maggiori complessi di
istocompatibilitagrave (MHCs) che sono i responsabili per il riconoscimento
peptidico Che IRE1 possa legarsi direttamente a polipeptidi mal
ripiegati egrave unrsquoidea interessante (Figura 3) [19]
18
Figura 3 Un modello ipotetico descrive lrsquoattivazione di Ire1 attraverso la oligomerizzazione
determinata dal legame di proteine unfolded (indicate in rosso) Le interazioni dirette o
indirette fra le catene delle proteine unfolded possono contribuire allrsquoattivazione Sul lato
luminale della membrana del RE le proteine unfolded si legano alla scanalatura (indicata in
grigio) formata dalla dimerizzazione del core del dominio luminale di Ire1 attraverso
linterfaccia 1 Sul lato citoplasmaticodella membrana del RE la oligmerizzazione accosta i
domini della chinasi Ire 1 che subiscono un cambiamento conformazionale in seguito ad
autofosforilazione che porta allrsquoattivazione della funzione di RNA-ribonucleasi di Ire1
Attraverso il riconoscimento diretto delle forme mal ripiegate
lrsquoinduzione di IRE1 potrebbe verificarsi prima della completa titolazione
di BiP che data lrsquoestrema abbondanza di questrsquoultimo nel RE potrebbe
verificarsi solo dopo un catastrofico accumulo di proteine mal ripiegate
Inoltre il riconoscimento diretto di forme mal ripiegate da parte di IRE1
(e PERK) potrebbe consentire una serie di risposte piugrave sfumate in cui
diverse forme mal ripiegate potrebbero essere preferenzialmente
riconosciute da sensori diversi quali BiP IRE1 o PERK Cosigrave in linea
di principio la natura (per esempio traslazionale contro transcrizionale)
ed il ciclo di UPR potrebbe essere su misura per la classe specifica di
forme mal ripiegate che sono prevalenti nel RE [20]
19
DEGRADAZIONE DELLE PROTEINE ASSOCIATA AL
RETICOLO ENDOPLASMATICO
Come ci si poteva aspettare dalla diversitagrave delle proteine che si
ripiegano NEL RE studi recenti hanno dimostrato che la degradazione
ER-associata (ER-Associated Degradation ERAD) comprende una
serie di sistemi diversi ciascuno responsabile della degradazione di
sottoinsiemi di proteine che condividono proprietagrave fisiche comuni
Esistono anche regioni dedicate allrsquo ER Associated Degradation
(ERAD) nelle quali proteine che non raggiungono il corretto
ripiegamento vengono retrotraslocate al citosol e quindi degradate dal
proteasoma [21]
Ciograve forse egrave piugrave chiaramente dimostrato nel lievito dove ci sono almeno
due distinti meccanismi di sorveglianza per identificare le proteine mal
ripiegate del RE Il primo meccanismo chiamato ERAD-L analizza le
proteine che contengono domini luminali mal ripiegati (solubili o trans
membrana) chiamati CPY una forma mutante della proteina CPY
endogena che egrave incapace di folding Il secondo denominato ERAD-C
rileva domini mal ripiegati citosolici di proteine trans membrana [22]
Sebbene entrambe queste vie in ultima analisi convergano sul sistema
di degradazione ubiquitina-proteosoma esse dipendono da diversi
insiemi di componenti RE-associati per rivelare e fornire specie mal
ripiegate al citosol Nel caso di ERAD-C (e non di ERAD-L) la
degradazione egrave in genere dipendente da uno specifico sottoinsieme di
chaperoni citosolici inclusi i membri Hsp40 e Hsp70 Ciograve suggerisce
che queste proteine possono essere direttamente responsabili per il
riconoscimento di domini citosolici mal ripiegati di proteine trans
membrana Tuttavia le caratteristiche esatte che vengono monitorate e
20
come i substrati vengano consegnati al macchinario di
retrotranslocazione restano importanti questioni aperte per la maggior
parte dei substrati Il riconoscimento di una proteina contenente un
dominio luminale mal ripiegato dipende in modo determinante dallo
stato di glicosilazione della proteina Infatti anche piccole modifiche di
glicani N-linked puograve provocare danni gravi nella degradazione di
numerosi substrati Questo puograve effettivamente lasciare le proteine in un
limbo impossibile raggiungere lo stato nativo ma non riconosciuto dal
macchinario ERAD esse restano mal ripiegate nel RE a tempo
indeterminato A prima vista questa dipendenza dalla glicosilazione
sembra essere un miglioramento non necessario Tuttavia egrave ormai chiaro
che lo spettro di porzioni di zucchero presenti in una proteina egrave un
segnale fondamentale nel marcare il suo status di ripiegamento Infatti
dato che diverse proteine altamente abbondanti nel RE tra cui BiP e
PDI spesso non sono glicosilate la presenza e la natura covalente di
molto mannosio in un polipeptide puograve fornire un segnale importante che
aiuta il macchinario di controllo-qualitagrave del RE a distinguere le specie
ripiegate destinate ad altri scomparti da quelle piugrave abbondanti e
permanenti del RE Lrsquointuizione nel ruolo della glicosilazione nella
discriminazione tra le specie in via di ripiegamento e le proteine
terminali mal ripiegate nel RE egrave venuta dalla constatazione che
glicoproteine mal ripiegate subiscono un taglio dei loro N-glicani da una
varietagrave di glicosidasi tra cui una mannossidasi specifica In aggiunta a
proteine mal ripiegate persistenti si egrave pensato che il rimodellamento
dipendente dal tempo di N-glicani porti ad un segnale per la
degradazione del macchinario ERAD Questo permette intermedi
ripiegati in un periodo di tempo prima del rimodellamento dei loro N-
glicani in cui il polipeptide egrave immune dalla sorveglianza ERAD Egrave
21
interessante notare che un recente studio suggerisce che anche per i
polipeptidi citosolici vi egrave un periodo durante e subito dopo la sintesi in
cui le specie mal ripiegate sono immuni alla degradazione del
proteasoma [23] Recenti studi hanno identificato due differenti lettine
localizzate nel RE che svolgono un ruolo critico nellrsquoERAD La prima egrave
correlata alla proteina mannossidasi responsabile del taglio di N-glicani
nel RE ma sembra aver perso la sua attivitagrave catalitica Nel lievito si
chiama Htm1pMnl1p e nei mammiferi egrave chiamato EDEM Studi
condotti su cellule di mammifero suggeriscono che EDEM aiuta le
glicoproteine mal ripiegate a lasciare il ciclo calnexinacalreticulina del
chaperone lectina dove stanno cercando di ripiegarsi e cosigrave entrare nel
ciclo di degradazione [24 ab] Tuttavia nel lievito Htm1p egrave richiesto
per la degradazione efficiente di substrati come CPY che non
dipendono da calnexina Quindi sembra probabile che Htm1pEDEM
ricopra altri ruoli in ERAD La seconda lectina Yos9p forma un
complesso stabile con proteine mal ripiegate e la perdita di questa
lectina conduce ad un profondo e specifico difetto nella degradazione di
glicoproteine mal ripiegate [25] Sorprendentemente mentre mutazioni
puntiformi nella tasca di Yos9p legante il mannosio eliminano la sua
capacitagrave di supportare ERAD i mutanti stessi di Yos9p mostrano una
maggior interazione con i substrati Ciograve indica la possibilitagrave che la
lectina Yos9p svolga un ruolo piugrave informativo interrogando lo stato
dello zucchero di forme mal ripiegate per determinare se debbano essere
passate al macchinario di retrotranslocazione Tuttavia come con
ERAD-C sebbene ci siano stati grandi progressi nella caratterizzazione
del macchinario di retrotranslocazione [26] le caratteristiche strutturali
delle proteine mal ripiegate sono in fase di monitoraggio e sono ancora
22
limitate le conoscenzedi come le forme mal ripiegate sono passate a
questo macchinario
CLEARENCE DI AGGREGATI ATTRAVERSO
LrsquoAUTOFAGIA
Egrave sempre piugrave evidente che ci sono una varietagrave di condizioni in vivo che
anche con chaperoni e macchinari proteolitici presenti nello stesso
compartimento come proteine mal ripiegate questi meccanismi di
controllo-qualitagrave falliscono e le proteine mal ripiegate avanzano
formando aggregati Inoltre tali aggregati intracellulari sono associati
con una serie di malattie neurodegenerative come il morbo di
Huntington e di Parkinson La natura e la sorte di aggregati di proteine
nelle cellule eucariotiche egrave stata poco compresa Recentemente egrave stata
sempre piugrave sostenuta unrsquoazione protettiva della formazione di aggregati
piuttosto che unrsquoimmediata azione patogena Per esempio nel caso del
morbo di Huntington lrsquoesame di cellule neuronali in coltura
sovrapproducenti una fusione di poliglutamina espansa e huntingtina-
GFP rivelano che queste cellule contenenti aggregati fluorescenti
morfologicamente visibili esibiscono una migliore viabilitagrave rispetto a
quelle aventi per via diffusionale materiale fluorescente [27] Questo
sembra in accordo con il concetto che si tratta di piccoli assemblati di
proteine mal ripiegate inclusioni non morfologicamente visibili che
esercitano effetti tossici sulle cellule Analogamente un recente
confronto delle dimensioni rispetto a tossicitagrave per gli aggregati di
proteina prionica PrP suggerisce che piccoli aggregati contenenti da una
a due dozzine di molecole sono risultati i piugrave tossici per le cellule [28]
23
Ma le cellule dispongono di meccanismi di compensazione per questi
piccoli aggregati Studi recenti hanno suggerito che la via ubiquitina-
proteosoma possa essere il pilastro della rimozione di specie inclini
allrsquoaggregazione Infatti gli aggregati rilevati nel contesto di
neurodegenerazione di solito sono reattivi con gli anticorpi anti-
ubiquitina il che implica che le specie mal ripiegate sono state
riconosciute dal sistema di coniugazione dellubiquitina Eppure vari
studi di questi ultimi anni indicano che queste proteine modificate
rappresentano una sfida particolare per proteasomi che possono portare
alla loro inibizione [29 ab] Il meccanismo di questa inattivazione
rimane sconosciuto ma puograve coinvolgere il soffocamento della camera
del proteasoma [30]
Anatomia del proteasoma Il proteasoma egrave una macromolecola proteica del peso di circa 2 milioni
di Daltons Ersquo formata da ununitagrave base centrale (core) e 2 cappucci agli estremi (cap) Il core egrave
formato a sua volta da 4 anelli ciascuno costituito da 7 unitagrave proteiche I due ldquocaprdquo attaccati alle
due estremitagrave del core cilindrico consistono ciascuno di 20 subunitagrave
24
Ora sembra che la modifica dellrsquoubiquitina possa reclutare specie
aggregate mediante una via indipendente lrsquoAUTOFAGIA Lrsquoautofagia
implica il riconoscimento e lrsquoimpacchettamentofagocitazione di
proteine specifiche o organelli in vescicole autofagosomiche che si
fondono con i lisosomi in cui sia le vescicole che il loro contenuto sono
scomposti Piugrave di 20 componenti cosiddetti Atg (geni coinvolti
nellrsquoautofagia) mediano questo processo straordinario Recenti studi
hanno dimostrato che componenti centrali della formazione di autosomi
nei topi hanno attivitagrave nei tessuti dei mammiferi Per esempio carenza
di atg5 ha portato alla morte di animali appena nati a causa
dellrsquoincapacitagrave di fornire un apporto di aminoacidi attraverso la
degradazione di proteine del corpo durante la condizione di fame
relativa allrsquoimmediato periodo post-natale Sorprendentemente in un
altro studio in cui egrave stata indotta una carenza di atg7 piugrave avanti nella
vita con un gene ldquofloxedrdquo lrsquoaccumulo di aggregati positivi
allrsquoubiquitina egrave stata osservata nel fegato degli animali che sono stati
disabilitati nella produzione di autofagosomi La funzione del
proteasoma in questi animali egrave rimasta inalterata contenente specie mal
ripiegate etichettate con ubiquitina e possono essere eliminate attraverso
autofagia Egrave stato poi scoperto un componente denominato p62 (o
sequestosoma1) che costituisce un guscio attorno agli aggregati di
huntingtina [31] Questa proteina contiene un dominio C-terminale
associato allrsquoubiquitina (UBA) che puograve legare poliubiquitine in modo
tale che p62 si collochi con lrsquoubiquitina quando espressa in cellule
HeLa Inoltre nelle cellule che esprimono huntigtina p62 si associa con
LC3 una proteina localizzata negli autofagosomi In accordo con quanto
riportato e cioegrave che lrsquoautofagia riduce i livelli di aggregati di
huntingtina e con un ruolo critico di p62 in questo processo lrsquoinibizione
25
antisenso mediata dallrsquoesperessione di p62 aumenta lrsquoapoptosi delle
cellule che esprimono huntungtina Quindi sembra che la modifica
dellrsquoubiquitina delle proteine difettose possa offrire un ingresso sia al
sistema proteasoma o in contesti dove lrsquoaggregazione egrave in corso al
sistema autofagia
SISTEMI CHAPERONI HSP70
Le Hsp70 proteine dello shock termico di 70 KDa sono impegnate in
una serie di processi tra cui il ripiegamento di proteine di nuova sintesi
il trasporto delle proteine attraverso membrane il ripiegamento di
proteine mal ripiegate ed aggregate e il controllo delle attivitagrave delle
proteine regolatrici Questa versatilitagrave egrave ottenuta attraverso
lampliamento e la diversificazione evolutiva di geni hsp70 che ha
generato sia chaperoni Hsp70 specifici Hsp110 e proteine Hsp170 La
versatilitagrave egrave determinata attraverso lrsquoimpiego di cochaperoni proteine J
e fattori di scambio di nucleotide (NEF) che regolano lrsquoattivitagrave di Hsp70
(Figura 4)
26
Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame
del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una
Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)
Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la
proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato
allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del
substrato
Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre
specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb
Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di
legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un
numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame
dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi
Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina
Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni
Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali
di Hsp70 con se stesso
27
INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70
Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di
proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura
xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding
appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide
N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD
adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio
elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con
lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante
chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco
tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini
di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di
comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura
di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione
La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la
tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo
coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture
precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una
proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da
una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β
ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica
compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio
elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di
legame del substrato (Figura 5)
28
Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo
substrato
La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra
domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che
collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo
solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi
residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame
allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A
dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso
Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un
legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in
nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano
completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve
entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo
fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui
coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del
segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti
integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A
29
capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il
quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di
ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a
idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di
DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro
catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente
arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia
drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete
crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la
barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK
costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina
superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura
della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera
attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della
prolina
DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-
NUCLEOTIDE
Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi
meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono
fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la
liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del
substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la
dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine
BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave
dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con
30
funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S
cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1
(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la
disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e
HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70
fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi
della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente
indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene
GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg
di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei
nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte
posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i
nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario
BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in
modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del
complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si
compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo
Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva
[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con
conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve
indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca
di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di
convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la
reazione di scambio nucleotidica di Hsp70
31
LEGAMI Hsp70-Hsp70
Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro
della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In
particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce
come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola
lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di
questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento
Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il
cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che
sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi
eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente
lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se
non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di
complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di
nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di
scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione
importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto
di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel
folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle
Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza
proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa
con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere
coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di
traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina
Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come
sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le
interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di
32
Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi
SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua
attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano
legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di
idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede
possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano
lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina
stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che
Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami
con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina
J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di
stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega
bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o
Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non
limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che
la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-
associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con
Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito
meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande
aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante
per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70
AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP
Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli
AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione
disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]
33
Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un
anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del
proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico
20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA
svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP
Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104
nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico
per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste
attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come
una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-
etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE
per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla
fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il
meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere
tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria
per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli
anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una
parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali
suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata
assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando
una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a
spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad
entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel
caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro
che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti
dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una
proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In
parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno
34
individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi
domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre
interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta
apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati
che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la
questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)
Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97
Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da
proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad
entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro
efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non
devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati
dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte
lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono
piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte
superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine
adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il
35
movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori
p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su
proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di
proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la
retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e
reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo
anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite
adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente
il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente
forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei
canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]
LrsquoAZIONE DELLrsquoATP
La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico
al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco
affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad
esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello
Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che
ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo
di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli
wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli
mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori
dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di
ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di
un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di
quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda
36
subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino
al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave
significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o
sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti
differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra
essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che
attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave
adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non
vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a
cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di
subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico
Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un
substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di
queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un
meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da
F1-ATPasi non sembra escluso
HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE
NEURODEGENERATIVE
RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE
Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel
mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una
pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi
associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione
37
di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di
Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta
promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]
Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90
nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave
funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi
permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]
HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico
Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono
mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)
accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock
citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata
da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante
di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo
stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si
lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei
geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-
shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via
multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di
transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-
translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90
[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e
mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo
shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con
Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)
38
attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da
shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni
Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che
i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro
sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock
termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su
attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato
che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi
di insulti
Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90
e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con
shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La
somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a
topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello
39
Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge
contro aggregati tossici
Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un
aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave
egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di
chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione
incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste
molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente
diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su
espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative
Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie
neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a
mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei
neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia
muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-
pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma
mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme
nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che
Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in
oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza
attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili
[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di
Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt
mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore
di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo
suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro
effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi
40
indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando
monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono
probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono
essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di
atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70
permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]
Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare
spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo
nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un
miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina
[62]
Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il
riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso
lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido
dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli
di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i
motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione
acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni
Riluzolo
Arimoclomol
41
Nei vari modelli cellulari della malattia di Alzheimer (AD) vi egrave un
incremento dei livelli di Hsp70 promossa dalla solubilitagrave e dal legame ai
microtubuli delle proteine tau [63] Hsp70 ha anche inibito la
propensione di aggregazione di Aβ [64] e ridotto la tossicitagrave di Aβ su
culture neuronali [65] Inoltre la proteina precursore dellrsquoamiloide
(APP) eo il suo Aβ amiloide derivato sono bersagli di chaperoni
mediati da clearence [66-67] Nella Drosophila melanogaster e nei
modelli di lievito della malattia di Parkinson (PD) lrsquoespressione diretta
di Hsp70 o la modulazione farmacologica di Hsp ha impedito la perdita
di neuroni causata da alfa-sinucleina [68-69] Huang et al hanno
riportato che questi effetti di Hsp70 si manifestano con lrsquoinibizione della
formazione di fibrille di alfa-sinucleina prevenendo la formazione di
alfa-sinucleina prefibrillare [70] Usando delezioni mutanti di alfa-
sinucleina Luk et al hanno indicato che le interazioni tra il dominio
legante il substrato Hsp70 e la regione del core idrofobico dellrsquoalfa-
sinucleina mediano lrsquoinibizione dellrsquoassemblaggio e che questo
processo di assemblaggio egrave inibito prima della fase di allungamento
[71] Nel complesso in diversi modelli di malattia neurodegenerativa la
sovra espressione di Hsp70 ha migliorato la gravitagrave della malattia di
fenotipi diversi senza incidere visibilmente sulla formazione di
aggregati suggerendo che i chaperoni non impediscono lrsquoaggregazione
di per seacute bensigrave reindirizzano gli aggregati preferibilmente in depositi
amorfi quindi sequestrando specie potenzialmente tossiche dalla
maggior parte della soluzione
42
Lrsquoespressione di Hsp70 e di altre Hsp egrave indotta dallrsquoinibizione
farmacologica di Hsp90
Come riportato sopra lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal
complesso con Hsp90 con susseguente produzione di Hsp (Figura 7) e
lrsquoinduzione di Hsp70 da parte di inibitori di Hsp90 egrave ben documentata
nei modelli di malattie neurodegenerative La geldanamicina (GM) un
inibitore di Hsp90 induce un aumento dose dipendente di Hsp70 nei
modelli di cellule di AD (Alzhaimer) cosigrave come nei neuroni della
corteccia primaria del ratto e riduce la quantitagrave di tau insolubili e dei
livelli basali di acido okadaico indotto da tau fosforilazione [63] Il
trattamento di neuroni primari corticali con lrsquoinibitore di Hsp90 con
struttura purinica il PU24FCI ha portato ad un aumento di Hsp70 dose-
dipendente [72]
PU24FCI
KU32
43
Allo stesso modo la somministrazione di due derivati di PU24FCI
CNS-permeabili il PU-DZ8 [72] ed il EC102 [73] a topi tau transgenici
(htau e JNPL3) ha determinato induzione di Hsp70 nel cervello e
mantenuto gli effetti per 24 ore dopo la somministrazione KU32 un
inibitore di Hsp90 di diversa natura chimica ha indotto Hsp70 in culture
SH-SY5Y di neuroblastoma e la ha protetta da tossicitagrave indotta da Aβ
GM ha attivato una risposta da shock termico ed inibito lrsquoaggregazione
di htt in un modello di coltura cellulare di HD ed ha indotto Hsp70 in
maniera tempo e concentrazione-dipendente ed ha impedito
lrsquoaggregazione di alfa-sinucleina e protetto contro la tossicitagrave in un
modello di aggregazione cellulare di alfa-sinucleina Auluck et al hanno
segnalato che il trattamento di un modello volante di PD con GM ha
protetto completamente contro tossicitagrave per alfa-sinucleina [74] GM ha
protetto anche contro la neurotossicitagrave dopaminergica indotta da 1-metil-
4-fenil-1236-tetraidropiridina (MPTP) in un modello di topo di PD Il
pretrattamento con GM mediante iniezione ventricolare intracerebrale
prima del trattamento con MPTP ha indotto le Hsp70 ed incrementato il
contenuto residuale di dopamina e lrsquoimmuno reattivitagrave della tirosina
idrolasi nel corpo striato [75] Lrsquoinduzione di Hsp70 nel midollo spinale
egrave stata osservata in seguito ad iniezione intraperitoneale di un derivato
della GM il 17-AAG in un modello di SBMA topo [76] Il 17-AAG egrave
stato anche efficace contro la nuerodegenerazione in altre malattie
poliQ Vale a dire ha soppresso la degenerazione dellrsquoocchio e la
formazione di inclusioni del corpo e salvato dalla letalitagrave in un modello
di SCA di Drosophila Ha inoltre soppresso la neurodegenerazione in un
modello volante di HD La riduzione di HSF-1 ha abolito lrsquoinduzione di
chaperoni molecolari e gli effeti terapeutici di 17-AAG sulla
neurodegenerazione poliQ indotta nei modelli di Drosophila facendo
44
arguire che lrsquoeffetto terapeutico di 17-AAG egrave essenzialmente mediato da
HSF-1 [77] Riassumendo lrsquoattivazione di HSF-1 da inibitori di Hsp90
egrave stata notata specificamente in modelli in vivo ed in vitro di malattie
neurodegenerative suggerendo che lrsquoinibizione di Hsp90 puograve essere un
mezzo per modulare i livelli di Hsp in cervelli malati con lrsquoobbiettivo di
proteggere contro le proteine tossiche che si presentano nel corso del
processo neurodegenerativo
Lrsquoinibizione di Hsp90 riduce lrsquoattivitagrave e lrsquoespressione di proteine
neuronali aberranti
In aggiunta alla regolazione di HSF-1 evidenze recenti suggeriscono un
ruolo addizionale per Hsp90 nel mantenimento della stabilitagrave funzionale
della capacitagrave aberrante di proteine neuronali (Figura 8A)
La SBMA egrave una malattia ereditaria dei motoneuroni causata
dallrsquoaccrescimento di un tratto di poliglutamina allrsquointerno del recettore
androgeno (AR) [57]
Le caratteristiche patologiche di SBMA sono perdita dei motoneuroni
nel midollo spinale e nel tronco cerebrale diffusione dellrsquoaccumulo
nucleare inclusioni nucleari di mutanti AR (mAR) nei motoneuroni
residui e in alcuni organi viscerali Waza et al hanno dimostrato che
mAR presente in SBMA egrave una delle proteine regolate da Hsp90 (Figura
8A) [76]
45
Figura 8 Le Hsp90 riparano le proteine neuronali aberranti (A) Proteine neuronali
aberranti regolate da Hsp90 (B) Lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90porta allrsquoinattivazione
o degradazione delle proteine regulate da Hsp90 probabilmente attraverso la via del
proteasoma
Le Hsp90 formano un complesso molecolare con mAR per il
mantenimento della sua stabilitagrave funzionale Sia in modelli cellulari di
SBMA che in topi transgenici lrsquoinibizione di Hsp90 da parte di 17-
AAG il derivato 17 allilammino-17-demetossi della geldanamicina ha
46
portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal
macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati
disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da
destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione
dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di
SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave
rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati
[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori
hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo
sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa
(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni
Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]
Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo
egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali
sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al
hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina
(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi
familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un
complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data
da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto
47
lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della
stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave
dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita
neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei
neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che
codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a
PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson
familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson
suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente
associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che
Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate
con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente
diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina
egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille
ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno
recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di
alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che
sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina
[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce
lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari
Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-
dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento
tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-
sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da
chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di
mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il
macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD
associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-
48
sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative
caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave
caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di
tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD
lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da
unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina
chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta
(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si
era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero
netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un
gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e
Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave
causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma
17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau
[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine
neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso
portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina
mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da
Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei
modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave
patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-
dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla
settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad
una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di
tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno
dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una
diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di
AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le
49
relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la
degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90
[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al
(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave
stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da
GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β
effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi
GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di
Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe
portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in
strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati
indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone
biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione
di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da
parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi
proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di
queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)
Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie
neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio
approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare
dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la
formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione
potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di
Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare
terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare
malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo
centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90
puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione
50
successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti
neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti
clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto
che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono
tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in
modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni
nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati
promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio
spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in
modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di
Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a
lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse
da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase
esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora
rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori
dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per
mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie
neurodegenerative
51
SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-
ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-
METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE
(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE
MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO
SULLA FRAMMENTAZIONE
Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in
risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta
nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine
regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il
ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai
loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine
client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro
cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire
su molti percorsi oncogenici
Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il
nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che
lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati
composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP
attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del
processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono
emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i
tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule
normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina
(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una
maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto
che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una
piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
5
Hsp40) e GrpE nel formare un sistema chaperone ATP-dipendente
coinvolto nei processi cellulari
bull Hsp 60
Molte Hsp60 appartengono alla famiglia delle chaperonine complessi
proteici oligomerici costituiti da due anelli sovrapposti di 7-9 subunitagrave
che formano una cavitagrave centrale in cui vengono accolte proteine in uno
stato non nativo
Il sistema GroEL presente nei batteri egrave un esempio di Hsp60 Esso egrave
costituito da 14 subunitagrave identiche che si articolano tra loro a costituire
una complessa struttura quaternaria formata da due anelli eptamerici
sovrapposti
Ciascun anello presenta una cavitagrave interna di 50 Aring di diametro che
ospiteragrave la proteina parzialmente denaturata GroEL richiede per la sua
attivitagrave di chaperone anche il legame e lrsquoidrolisi dellrsquoATP
bull Hsp 40
Le Hsp40 come le Hsp60 sono coinvolte in processi di stabilizzazione
e di corretto ripiegamento delle proteine nascenti La piugrave studiata e
caratterizzata egrave DnaJ di Ecoli che agisce come co-chaperone con DnaK
(Hsp70)
bull Hsp a basso peso molecolare
Hanno diverse funzioni che sono specie-specifiche ed egrave stato proposto
che esse agiscano da chaperoni molecolari e impediscano lrsquoaggregazione
proteica irreversibile
bull Hsp stress ossidativo e patologie
Come noto le HSP sono state riscontrate nelle cellule sottoposte ad
unrsquoampia varietagrave di condizioni di stress Lo stress ossidativo egrave coinvolto
in una serie di condizioni patologiche compresa la neurodegenerazione
le malattie cardiovascolari e lrsquoictus e nellrsquoinvecchiamento naturale
6
In queste condizioni lo stress ossidativo si verifica come conseguenza
dello squilibrio tra la produzione di specie reattive dellossigeno (ROS) e
la capacitagrave del corpo di disintossicarsi dagli intermedi reattivi di queste
Questo squilibrio puograve portare come conseguenza una eccessiva
produzione di ROS come osservato nelle malattie ischemiche o puograve
causare una diminuzione della capacitagrave degli enzimi antiossidanti
Come risultato il normale ambiente intracellulare egrave compromesso si
osserva ossidazione e aggregazione delle proteine e del DNA vitale che
si traduce nel fallimento della normale funzione cellulare
Le proteine ossidate si accumulano causando cosigrave infiammazioni acute
Tuttavia i cambiamenti nello stato redox cellulare possono anche essere
un segnale per lattivazione della cascata apoptotica
Fra i vari cambiamenti nellrsquoattivitagrave cellulare e nella fisiologia lrsquoevento
piugrave importante nelle cellule stressate egrave la produzione di un certo numero
di proteine altamente conservate le proteine dello shock termico o da
stress [2] Negli ultimi ventrsquoanni sono state eseguite numerose ricerche
sulla struttura e sulla funzione delle proteine da shock termico o Hsp
[3] Queste proteine sono risultate molto interessanti in quanto giocano
un ruolo fondamentale nella progressione del ciclo cellulare e
nellrsquoapoptosi (o morte programmata della cellula) e sono coinvolte in
molte malattie La risposta allo shock termico o di stress egrave una risposta
di adattamento cellulare che aiuta al mantenimento dellrsquoomeostasi
cellulare in condizioni di stress Ersquo stato osservato che subito dopo un
improvviso aumento di temperatura tutte le cellule mostrano
lrsquoespressione indotta di una famiglia di geni conosciuti come geni Hsp
La sequenza del DNA che costituisce questa famiglia di geni egrave
altamente conservata tra le specie Questa famiglia di geni era stata
originariamente chiamata cosigrave a causa della loro espressione dopo
7
lrsquoesposizione al calore Tuttavia la stessa risposta si ottiene dopo
differenti insulti inclusi stress ambientali e metabolici come ipossie
ischemie iperossie anossie esposizione alla luce UV e sostanze
chimiche nicotina stress chirurgico deficienze nutrizionali (per es
privazione del glucosio) stress emozionale e meccanico lesioni
meccaniche e agenti virali o altri tipi di stress come esposizione a
radicali tossici o ad agenti cancerogeni [4 abc] In condizioni di stress
come lo shock termico e alcuni stati fisiologici le proteine da stress
sono rapidamente indotte attraverso meccanismi di trascrizione e
trasduzione (figura 1)
Figura 1 Meccanismo di attivazione delle Hsp e riparazione delle proteine denaturate(DP)
(1) Condizioni di stress portano alla denaturazione delle proteine (2) La presenza DP
stimola la dissociazione del complesso Hsp-HSF Questo complesso limita il processo di
trascrizione in assenza di DP (3) mentre le Hsp sono libere di legarsi a DP HSF viene
attivato attraverso la fosforilazione e
La risposta inducibile allo shock termico genera un segnale che porta
allrsquoattivazione di un fattore di trascrizione [5] La trascrizione del gene
Hsp egrave sotto il controllo di una famiglia di fattori di trascrizione dello
shock termico (HSF) Membri differenti della famiglia di HSF possono
8
essere attivati da specifici stress diversi Nonostante siano stati scoperti
varie HSF HSF-1 ha dimostrato di essere il regolatore principale di una
breve induzione termica di Hsp Le Hsp giocano un importante ruolo
regolatore nella trascrizione dei geni Se le Hsp fossero sovraespresse in
assenza di stress si legherebbero direttamente al dominio di trans-
attivazione di HSF-1 determinando cosigrave la sua soppressione Le Hsp
sono proteine ubiquitarie sia nelle cellule eucariote che in quelle
procariote Come suggerisce il nome le Hsp sono indotte in cellule
esposte al calore sebbene le proteine dello stress (Chaperoni) possono
essere attivate da alcuni differenti tipi di insulti facendo in modo che le
cellule sopravvivano in condizioni altrimenti letali La tabella 1 presenta
un sommario di queste proteine la loro locazione cellulare e la loro
funzione Le Hsp ad alto peso molecolare sono ATP-dipendenti mentre
le Hsp a basso peso molecolare agiscono in maniera ATP-indipendente
[6]
9
Tabella 1 Hsp umanepeso molecolare localizzazione e funzione
10
Ogni famiglia di Hsp egrave composta da membri espressi sia in maniera
costitutiva che induttiva e si rivolge a diversi scomparti subcellulari [7]
Lrsquoattivazione costitutiva delle Hsp puograve verificarsi nelle cellule anche in
assenza di fattori di stress ambientali Per esempio Hsp90 puograve costituire
fino allrsquo1 del totale delle proteine cellulari in cellule non stressate [3]
indicando che queste proteine hanno un ruolo nel mantenimento della
conformazione delle proteine anche in condizioni normali In
condizioni di stress i dimeri di Hsp90 tendono ad associarsi in tetra-
esa- e ottameri ed oligomeri ancora piugrave elevati [8] In condizioni
fisiologiche Hsp90 si trova in associazione con diverse proteine
intracellulari tra cui calmodulina actina tubulina diverse chinasi e
qualche proteina recettore [9] I componenti dei complessi di Hsp90
come proteine kinasi e recettori steroidei possono mediare il trasporto
nucleare dellrsquoHsp90 specialmente sotto stress da calore Probabilmente
Hsp90 forma complessi stabili con filamenti di actina e si lega alla
tubulina per proteggere i microtubuli quindi puograve mediare
lrsquoorganizzazione strutturale del proteasoma un complesso
multicatalitico quando i livelli di ATP cellulari diminuiscono [5] Allo
stesso modo Hsp27 tende a oligomerizzarsi in condizioni di stress ed egrave
stato precedentemente dimostrato che nelle cellule tumorali endogene
Hsp27 egrave la piugrave importante proteina argpirimidina modificata e che
questa modifica comporta lrsquooligomerizzazione di Hsp27 [10]
Argpirimidina egrave un addotto metilgliossale-arginina che risulta dalla
glicazione non enzimatica di residui di arginina delle proteine nelle
cellule tumorali mostrando un aumento della glicolisi [11] Hsp27 e
Hsp70 sono fortemente ed universalmente indotte da diverse
sollecitazioni mentre la loro espressione egrave bassa in condizioni
fisiologiche permettendo ad attivitagrave costitutive cellulari di procedere
11
[12] A prescindere dalla loro localizzazione intracellulare le Hsp70
sono state trovate anche sulla membrana plasmatica delle cellule
trasformate malignamente e nello spazio extracellulare [13] Hsp70
Hsp90 e la proteina GP96 chaperone residente nel reticolo
endoplasmatico (RE) appartenente alla famiglia di Hsp90 [14] sono
state trovate nel mezzo cellulare Questo mette in considerazione la
duplce funzione delle Hsp la funzione citoprotettivaantiapoptotica
intracellulare e la funzione immunogenica extracellulare [7] Le Hsp
intracellulari sono importanti in quanto assicurano il ripiegamento delle
proteine nella loro corretta struttra terziaria lrsquoincorporazione di
polipeptidi nelle membrane intracellulari o nel trasporto delle proteine
attreverso le membrane [9] mentre la funzione delle Hsp extracellulari egrave
immunogenica attreverso lo chaperoning di peptidi antigenici I membri
della famiglia di Hsp70 e Hsp90 sono stati rilevati nel mezzo delle
cellule presentanti lrsquoantigene (APC) Ersquo stato osservato che lrsquouptake di
complessi Hsp-peptidi da parte delle APC egrave specifico saturabile e
concentrazione dipendente e quindi egrave stata ipotizzata lrsquoesistenza di
recettori Hsp specifici [7] Quindi il potenziale coinvolgimento delle
Hsp in molti tipi di malattie le ha rese particolarmente importanti per lo
sviluppo di nuove terapie
12
CHAPERONINE MOLECOLARI E CONTROLLO
QUALITArsquo DELLE PROTEINE
Nelle cellule viventi sia le catene polipeptidiche di nuova sintesi che le
preesistenti sono a rischio costante di mal ripiegamento
(MISFOLDING) o aggregazione In conformitagrave con lrsquoampia diversitagrave di
forme mal ripiegate lrsquoelaborazione di strategie di controllo qualitagrave si
sono evolute per opporsi a questa inevitabile disavventura Recenti studi
descrivono la rimozione di aggregati dal citosol rivelano meccanismi di
controllo di qualitagrave per proteine nel reticolo endoplasmatico (RE) e
forniscono nuove intuizioni in due classi di chaperoni molecolari
lrsquoHsp70 (Heat Shock Protein 70) e lrsquoAAA+ (Hsp100) [15]
FOLDING DI PROTEINE NEL RETICOLO
ENDOPLASMATICO RICONOSCERE IL GIUSTO
DALLO SBAGLIATO
Il reticolo endoplasmatico (ER) un organulo presente sia nelle cellule
animali che vegetali svolge un ruolo premimente in numerosi processi
di fondamentale importanza per la sopravvivenza e per il normale
funzionamento cellulare LER occupa circa il 10 del volume della
cellula e la metagrave della superficie coperta da tutte le membrane della
cellula (endomembrane piugrave membrana plasmatica) [16]
Il reticolo endoplasmatico (RE) riveste numerose funzioni vitali per la
cellula Tra le tante egrave la stazione iniziale della via secretoria ed egrave quindi
il luogo nel quale circa un terzo di tutte le proteine di una cellula viene
sintetizzato e ripiegato correttamente [17] in secondo luogo lrsquoER egrave il
13
punto di partenza dal quale numerose proteine vengono smistate e
indirizzate verso la loro destinazione finale [18]
LrsquoER egrave quindi la sede della sintesi del ripiegamento (ldquofoldingrdquo) e delle
modificazioni post-traduzionali delle proteine di membrana e secrete ed
egrave responsabile della maturazione strutturale di un quarto del proteasoma
che attraversa le vie secretorie
Il ripiegamento delle proteine secretorie fornisce una serie di sfide
uniche in quanto egrave accompagnato e dipendente dalla formazione di ponti
disolfuro ed inserzioni nel doppio strato lipidico con entrambi gli eventi
che si verificano piugrave lentamente di tipici cambi conformazionali che
accompagnano il ripiegamento Conseguentemente il RE fornisce le
condizioni ottimali per fronteggiare queste sfide includendo unrsquoalta
concentrazione di chaperoni generici oltre a una gamma di specifiche
strategie fatte su misura per favorire il ripiegamento delle proteine
secretorie Inoltre esiste un sofisticato sistema di controllo-qualitagrave nel
RE per trattenere e riparare proteine che non hanno raggiunto ancora il
loro stato naturale Malgrado la lunghezza con la quale le cellule vanno
a fornire un ambiente ottimale nel RE il ripiegamento delle proteine
secretorie puograve avvenire o manca a volte ad un ritmo allarmante Il RE
adopera due meccanismi di risposta in presenza di forme mal ripegate Il
primo meccanismo egrave una risposta allo stress RE-dedicato definito UPR
(risposta alla non corretta conformazione delle proteine) che attua il
rimodellamento del RE cosigrave da aumentare la sua capacitagrave di
ripiegamento [16] Una proteina malfunzionante rimane sequestrata nel
reticolo endoplasmatico quindi un eccesso di proteine mal strutturate
attiva la risposta da proteine con folding scorretto (Unfolded Protein
Response) Questo tipo di risposta inizia con il riconoscimento del
segnale di stress da parte di un recettore nel reticolo endoplasmatico e
14
prosegue con il blocco della sintesi proteica per permettere al
proteasoma di eliminare lrsquoeccesso di proteine mentre viene stimolata la
produzione di fattori di trascrizione Il secondo meccanismo chiamato
degradazione RE-associata (ERAD) riconosce in modo specifico le
parti terminali di proteine mal ripiegate e le loro retrotraslocazioni
attraverso la membrana del reticolo endoplasmatico nel citosol dove
possono essere degradate dal sistema di degradazione ubiquitina-
proteosoma [17] Questi due meccanismi sono intimamente collegati
lrsquoinduzione UPR aumenta la capacitagrave dellrsquoERAD una diminuzione
dellrsquoERAD comporta unrsquoinduzione dellrsquoUPR costitutivo e
contemporaneamente la diminuzione di ERAD e UPR fa diminuire di
molto la viabilitagrave delle cellule I sistemi UPR ed ERAD fronteggiano
anche il comune problema del riconoscimento che richiede
lrsquoidentificazione delle forme mal ripiegate potenzialmente patologiche
nellrsquoambiente del RE La sorveglianza di UPR ed ERAD deve garantire
un buon equilibrio proteggendo le cellule dalle pericolose specie mal
ripiegate evitando la sovra vigilanza (come accade con forme mutate di
regolatori trans membrana della fibrosi cistica CFTR) che puograve portare
allrsquoeliminazione di forme potenzialmente sanabili Recenti studi hanno
rivelato come ERAD ed UPR identifichino forme mal ripiegate
Pertanto il RE rappresenta un preciso sistema di controllo di qualitagrave atto
ad assicurare che solo le proteine correttamente ripiegate e funzionanti
possano essere rilasciate dallrsquoER e raggiungere la loro destinazione
finale mentre le proteine malripiegate o non funzionanti sono trattenute
nel ER e in seguito traslocate nel citosol per la degradazione
15
RISPOSTA ALLA NON CORRETTA
CONFORMAZIONE DELLE PROTEINE
Le proteine designate per il riconoscimento dei segnali di stress
provenienti dal reticolo endoplasmatico sono generalmente IRE1
(Inositol Requiring Kinase 1) ATF6 (Activation of Transcription Factor
6) e PERK (PKR-like Endoplasmic Reticulum Kinase)
Nel lievito la capacitagrave di ripiegarsi del RE egrave monitorata da IRE1 una
chinasi trans membrana altamente conservata che contiene un dominio
luminale responsabile del riconoscimento delle forme mal ripiegate
chinasi citosoliche e domini ribonucleasici Lrsquoaccumularsi delle proteine
mal ripiegate nel RE porta allrsquoattivazione delle chinasi IRE
Lrsquoattivazione delle IRE-chinasi promuove lo splicing non convenzionale
dei messaggi per un fattore di traduzione b-ZIP (Hac1 nel lievito e XBP-
1 nei metazoi) attraverso il suo dominio ribonucleasico La traduzione
del messaggio Hac 1 spliced crea un fattore attivo di trascrizione che
media direttamente la trascrizione dei target di UPR includendo
chaperoni del RE macchinario ERAD e tante altre proteine secretorie
In aggiunta alla IRE-1 gli eucarioti piugrave sviluppati utilizzano due altri
sensori le chinasi trans membrana del RE PERK ed il fattore di
trascrizione trans membrana del RE ATF6 (Figura 2) PERK contiene
un sensore luminale che egrave altamente correlato a quello di IRE-1 il
dominio citoplasmatico di PERK consiste in una chinasi elF2α
16
Figura 2 Struttura dei principali sensori dello stress nel reticolo endoplasmatico IRE1
ATF6 PERK
Lrsquoattivazione delle chinasi dovuta alla presenza di proteine mal
ripiegate determina unrsquoinibizione generalizzata della traduzione come
pure la up-regulation del fattore di trascrizione specifico ATF4
Lrsquoaccumulo di proteine mal ripiegate permette inoltre ad ATF6 di
raggiungere lrsquoapparato del Golgi dove le proteasi trans membrana
rilasciano il dominio citoplasmatico del fattore di trascrizione
permettendogli di entrare nel nucleo e mediare lrsquoinduzione genetica
Lrsquoesistenza di molteplici sensori UPR negli eucarioti piugrave avanzati
permette per lo piugrave una risposta piugrave sfumata alle proteine mal ripiegate
Per esempio una risposta iniziale alle proteine mal ripiegate potrebbe
portare ad una down-regulation generalizzata della traduzione seguita in
sequenza da unrsquoinduzione di chaperoni lrsquoinduzione del macchinario
17
ERAD ed infine contro lo stress prolungato lrsquoattivazione della morte
cellulare tramite apoptosi Molto recentemente ci sono stati notevoli
progressi nelle nostre conoscenze molecolari di come IRE-1 (e per
deduzione PERK) riconosce le proteine mal ripiegate Studi precedenti
avevano dimostrato che BIP (Binding Immunoglobulin Protein) lrsquo
omologo principale delle Hsp70 presente nel reticolo endoplasmatico si
lega in modo specifico con IRE1 e che questa interazione scompare in
condizioni di stress del RE Inoltre lrsquoiperespressione di BiP puograve
sopprimere lrsquoinduzione dellrsquoUPR Questo aveva suggerito un modello di
titolazione in cui BiP agisce come un regolatore negativo di IRE1 e
lrsquoaccumularsi di forme mal ripiegate porta indirettamente allrsquoattivazione
dellrsquoIRE1 attraverso il sequestro di BiP da parte proteine mal ripiegate
Tuttavia recenti studi hanno dimostrato che anche se il legame del BiP
possa avere un ruolo importante nella down-regulation di IRE1 ci sono
altri fattori importanti Analisi mutazionali hanno trovato che la
delezione della regione di IRE1 responsabile del legame con BiP non
altera la regolazione di IRE1 in risposta alle proteine unfolded [18] Piugrave
drammaticamente la struttura cristallina del core del dominio luminale
conservato (cLD) di IRE1 nel lievito rivela una profonda scanalatura
idrofobica che ricorda la tasca legante dei maggiori complessi di
istocompatibilitagrave (MHCs) che sono i responsabili per il riconoscimento
peptidico Che IRE1 possa legarsi direttamente a polipeptidi mal
ripiegati egrave unrsquoidea interessante (Figura 3) [19]
18
Figura 3 Un modello ipotetico descrive lrsquoattivazione di Ire1 attraverso la oligomerizzazione
determinata dal legame di proteine unfolded (indicate in rosso) Le interazioni dirette o
indirette fra le catene delle proteine unfolded possono contribuire allrsquoattivazione Sul lato
luminale della membrana del RE le proteine unfolded si legano alla scanalatura (indicata in
grigio) formata dalla dimerizzazione del core del dominio luminale di Ire1 attraverso
linterfaccia 1 Sul lato citoplasmaticodella membrana del RE la oligmerizzazione accosta i
domini della chinasi Ire 1 che subiscono un cambiamento conformazionale in seguito ad
autofosforilazione che porta allrsquoattivazione della funzione di RNA-ribonucleasi di Ire1
Attraverso il riconoscimento diretto delle forme mal ripiegate
lrsquoinduzione di IRE1 potrebbe verificarsi prima della completa titolazione
di BiP che data lrsquoestrema abbondanza di questrsquoultimo nel RE potrebbe
verificarsi solo dopo un catastrofico accumulo di proteine mal ripiegate
Inoltre il riconoscimento diretto di forme mal ripiegate da parte di IRE1
(e PERK) potrebbe consentire una serie di risposte piugrave sfumate in cui
diverse forme mal ripiegate potrebbero essere preferenzialmente
riconosciute da sensori diversi quali BiP IRE1 o PERK Cosigrave in linea
di principio la natura (per esempio traslazionale contro transcrizionale)
ed il ciclo di UPR potrebbe essere su misura per la classe specifica di
forme mal ripiegate che sono prevalenti nel RE [20]
19
DEGRADAZIONE DELLE PROTEINE ASSOCIATA AL
RETICOLO ENDOPLASMATICO
Come ci si poteva aspettare dalla diversitagrave delle proteine che si
ripiegano NEL RE studi recenti hanno dimostrato che la degradazione
ER-associata (ER-Associated Degradation ERAD) comprende una
serie di sistemi diversi ciascuno responsabile della degradazione di
sottoinsiemi di proteine che condividono proprietagrave fisiche comuni
Esistono anche regioni dedicate allrsquo ER Associated Degradation
(ERAD) nelle quali proteine che non raggiungono il corretto
ripiegamento vengono retrotraslocate al citosol e quindi degradate dal
proteasoma [21]
Ciograve forse egrave piugrave chiaramente dimostrato nel lievito dove ci sono almeno
due distinti meccanismi di sorveglianza per identificare le proteine mal
ripiegate del RE Il primo meccanismo chiamato ERAD-L analizza le
proteine che contengono domini luminali mal ripiegati (solubili o trans
membrana) chiamati CPY una forma mutante della proteina CPY
endogena che egrave incapace di folding Il secondo denominato ERAD-C
rileva domini mal ripiegati citosolici di proteine trans membrana [22]
Sebbene entrambe queste vie in ultima analisi convergano sul sistema
di degradazione ubiquitina-proteosoma esse dipendono da diversi
insiemi di componenti RE-associati per rivelare e fornire specie mal
ripiegate al citosol Nel caso di ERAD-C (e non di ERAD-L) la
degradazione egrave in genere dipendente da uno specifico sottoinsieme di
chaperoni citosolici inclusi i membri Hsp40 e Hsp70 Ciograve suggerisce
che queste proteine possono essere direttamente responsabili per il
riconoscimento di domini citosolici mal ripiegati di proteine trans
membrana Tuttavia le caratteristiche esatte che vengono monitorate e
20
come i substrati vengano consegnati al macchinario di
retrotranslocazione restano importanti questioni aperte per la maggior
parte dei substrati Il riconoscimento di una proteina contenente un
dominio luminale mal ripiegato dipende in modo determinante dallo
stato di glicosilazione della proteina Infatti anche piccole modifiche di
glicani N-linked puograve provocare danni gravi nella degradazione di
numerosi substrati Questo puograve effettivamente lasciare le proteine in un
limbo impossibile raggiungere lo stato nativo ma non riconosciuto dal
macchinario ERAD esse restano mal ripiegate nel RE a tempo
indeterminato A prima vista questa dipendenza dalla glicosilazione
sembra essere un miglioramento non necessario Tuttavia egrave ormai chiaro
che lo spettro di porzioni di zucchero presenti in una proteina egrave un
segnale fondamentale nel marcare il suo status di ripiegamento Infatti
dato che diverse proteine altamente abbondanti nel RE tra cui BiP e
PDI spesso non sono glicosilate la presenza e la natura covalente di
molto mannosio in un polipeptide puograve fornire un segnale importante che
aiuta il macchinario di controllo-qualitagrave del RE a distinguere le specie
ripiegate destinate ad altri scomparti da quelle piugrave abbondanti e
permanenti del RE Lrsquointuizione nel ruolo della glicosilazione nella
discriminazione tra le specie in via di ripiegamento e le proteine
terminali mal ripiegate nel RE egrave venuta dalla constatazione che
glicoproteine mal ripiegate subiscono un taglio dei loro N-glicani da una
varietagrave di glicosidasi tra cui una mannossidasi specifica In aggiunta a
proteine mal ripiegate persistenti si egrave pensato che il rimodellamento
dipendente dal tempo di N-glicani porti ad un segnale per la
degradazione del macchinario ERAD Questo permette intermedi
ripiegati in un periodo di tempo prima del rimodellamento dei loro N-
glicani in cui il polipeptide egrave immune dalla sorveglianza ERAD Egrave
21
interessante notare che un recente studio suggerisce che anche per i
polipeptidi citosolici vi egrave un periodo durante e subito dopo la sintesi in
cui le specie mal ripiegate sono immuni alla degradazione del
proteasoma [23] Recenti studi hanno identificato due differenti lettine
localizzate nel RE che svolgono un ruolo critico nellrsquoERAD La prima egrave
correlata alla proteina mannossidasi responsabile del taglio di N-glicani
nel RE ma sembra aver perso la sua attivitagrave catalitica Nel lievito si
chiama Htm1pMnl1p e nei mammiferi egrave chiamato EDEM Studi
condotti su cellule di mammifero suggeriscono che EDEM aiuta le
glicoproteine mal ripiegate a lasciare il ciclo calnexinacalreticulina del
chaperone lectina dove stanno cercando di ripiegarsi e cosigrave entrare nel
ciclo di degradazione [24 ab] Tuttavia nel lievito Htm1p egrave richiesto
per la degradazione efficiente di substrati come CPY che non
dipendono da calnexina Quindi sembra probabile che Htm1pEDEM
ricopra altri ruoli in ERAD La seconda lectina Yos9p forma un
complesso stabile con proteine mal ripiegate e la perdita di questa
lectina conduce ad un profondo e specifico difetto nella degradazione di
glicoproteine mal ripiegate [25] Sorprendentemente mentre mutazioni
puntiformi nella tasca di Yos9p legante il mannosio eliminano la sua
capacitagrave di supportare ERAD i mutanti stessi di Yos9p mostrano una
maggior interazione con i substrati Ciograve indica la possibilitagrave che la
lectina Yos9p svolga un ruolo piugrave informativo interrogando lo stato
dello zucchero di forme mal ripiegate per determinare se debbano essere
passate al macchinario di retrotranslocazione Tuttavia come con
ERAD-C sebbene ci siano stati grandi progressi nella caratterizzazione
del macchinario di retrotranslocazione [26] le caratteristiche strutturali
delle proteine mal ripiegate sono in fase di monitoraggio e sono ancora
22
limitate le conoscenzedi come le forme mal ripiegate sono passate a
questo macchinario
CLEARENCE DI AGGREGATI ATTRAVERSO
LrsquoAUTOFAGIA
Egrave sempre piugrave evidente che ci sono una varietagrave di condizioni in vivo che
anche con chaperoni e macchinari proteolitici presenti nello stesso
compartimento come proteine mal ripiegate questi meccanismi di
controllo-qualitagrave falliscono e le proteine mal ripiegate avanzano
formando aggregati Inoltre tali aggregati intracellulari sono associati
con una serie di malattie neurodegenerative come il morbo di
Huntington e di Parkinson La natura e la sorte di aggregati di proteine
nelle cellule eucariotiche egrave stata poco compresa Recentemente egrave stata
sempre piugrave sostenuta unrsquoazione protettiva della formazione di aggregati
piuttosto che unrsquoimmediata azione patogena Per esempio nel caso del
morbo di Huntington lrsquoesame di cellule neuronali in coltura
sovrapproducenti una fusione di poliglutamina espansa e huntingtina-
GFP rivelano che queste cellule contenenti aggregati fluorescenti
morfologicamente visibili esibiscono una migliore viabilitagrave rispetto a
quelle aventi per via diffusionale materiale fluorescente [27] Questo
sembra in accordo con il concetto che si tratta di piccoli assemblati di
proteine mal ripiegate inclusioni non morfologicamente visibili che
esercitano effetti tossici sulle cellule Analogamente un recente
confronto delle dimensioni rispetto a tossicitagrave per gli aggregati di
proteina prionica PrP suggerisce che piccoli aggregati contenenti da una
a due dozzine di molecole sono risultati i piugrave tossici per le cellule [28]
23
Ma le cellule dispongono di meccanismi di compensazione per questi
piccoli aggregati Studi recenti hanno suggerito che la via ubiquitina-
proteosoma possa essere il pilastro della rimozione di specie inclini
allrsquoaggregazione Infatti gli aggregati rilevati nel contesto di
neurodegenerazione di solito sono reattivi con gli anticorpi anti-
ubiquitina il che implica che le specie mal ripiegate sono state
riconosciute dal sistema di coniugazione dellubiquitina Eppure vari
studi di questi ultimi anni indicano che queste proteine modificate
rappresentano una sfida particolare per proteasomi che possono portare
alla loro inibizione [29 ab] Il meccanismo di questa inattivazione
rimane sconosciuto ma puograve coinvolgere il soffocamento della camera
del proteasoma [30]
Anatomia del proteasoma Il proteasoma egrave una macromolecola proteica del peso di circa 2 milioni
di Daltons Ersquo formata da ununitagrave base centrale (core) e 2 cappucci agli estremi (cap) Il core egrave
formato a sua volta da 4 anelli ciascuno costituito da 7 unitagrave proteiche I due ldquocaprdquo attaccati alle
due estremitagrave del core cilindrico consistono ciascuno di 20 subunitagrave
24
Ora sembra che la modifica dellrsquoubiquitina possa reclutare specie
aggregate mediante una via indipendente lrsquoAUTOFAGIA Lrsquoautofagia
implica il riconoscimento e lrsquoimpacchettamentofagocitazione di
proteine specifiche o organelli in vescicole autofagosomiche che si
fondono con i lisosomi in cui sia le vescicole che il loro contenuto sono
scomposti Piugrave di 20 componenti cosiddetti Atg (geni coinvolti
nellrsquoautofagia) mediano questo processo straordinario Recenti studi
hanno dimostrato che componenti centrali della formazione di autosomi
nei topi hanno attivitagrave nei tessuti dei mammiferi Per esempio carenza
di atg5 ha portato alla morte di animali appena nati a causa
dellrsquoincapacitagrave di fornire un apporto di aminoacidi attraverso la
degradazione di proteine del corpo durante la condizione di fame
relativa allrsquoimmediato periodo post-natale Sorprendentemente in un
altro studio in cui egrave stata indotta una carenza di atg7 piugrave avanti nella
vita con un gene ldquofloxedrdquo lrsquoaccumulo di aggregati positivi
allrsquoubiquitina egrave stata osservata nel fegato degli animali che sono stati
disabilitati nella produzione di autofagosomi La funzione del
proteasoma in questi animali egrave rimasta inalterata contenente specie mal
ripiegate etichettate con ubiquitina e possono essere eliminate attraverso
autofagia Egrave stato poi scoperto un componente denominato p62 (o
sequestosoma1) che costituisce un guscio attorno agli aggregati di
huntingtina [31] Questa proteina contiene un dominio C-terminale
associato allrsquoubiquitina (UBA) che puograve legare poliubiquitine in modo
tale che p62 si collochi con lrsquoubiquitina quando espressa in cellule
HeLa Inoltre nelle cellule che esprimono huntigtina p62 si associa con
LC3 una proteina localizzata negli autofagosomi In accordo con quanto
riportato e cioegrave che lrsquoautofagia riduce i livelli di aggregati di
huntingtina e con un ruolo critico di p62 in questo processo lrsquoinibizione
25
antisenso mediata dallrsquoesperessione di p62 aumenta lrsquoapoptosi delle
cellule che esprimono huntungtina Quindi sembra che la modifica
dellrsquoubiquitina delle proteine difettose possa offrire un ingresso sia al
sistema proteasoma o in contesti dove lrsquoaggregazione egrave in corso al
sistema autofagia
SISTEMI CHAPERONI HSP70
Le Hsp70 proteine dello shock termico di 70 KDa sono impegnate in
una serie di processi tra cui il ripiegamento di proteine di nuova sintesi
il trasporto delle proteine attraverso membrane il ripiegamento di
proteine mal ripiegate ed aggregate e il controllo delle attivitagrave delle
proteine regolatrici Questa versatilitagrave egrave ottenuta attraverso
lampliamento e la diversificazione evolutiva di geni hsp70 che ha
generato sia chaperoni Hsp70 specifici Hsp110 e proteine Hsp170 La
versatilitagrave egrave determinata attraverso lrsquoimpiego di cochaperoni proteine J
e fattori di scambio di nucleotide (NEF) che regolano lrsquoattivitagrave di Hsp70
(Figura 4)
26
Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame
del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una
Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)
Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la
proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato
allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del
substrato
Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre
specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb
Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di
legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un
numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame
dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi
Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina
Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni
Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali
di Hsp70 con se stesso
27
INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70
Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di
proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura
xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding
appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide
N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD
adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio
elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con
lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante
chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco
tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini
di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di
comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura
di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione
La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la
tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo
coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture
precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una
proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da
una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β
ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica
compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio
elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di
legame del substrato (Figura 5)
28
Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo
substrato
La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra
domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che
collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo
solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi
residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame
allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A
dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso
Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un
legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in
nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano
completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve
entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo
fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui
coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del
segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti
integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A
29
capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il
quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di
ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a
idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di
DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro
catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente
arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia
drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete
crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la
barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK
costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina
superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura
della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera
attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della
prolina
DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-
NUCLEOTIDE
Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi
meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono
fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la
liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del
substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la
dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine
BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave
dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con
30
funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S
cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1
(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la
disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e
HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70
fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi
della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente
indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene
GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg
di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei
nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte
posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i
nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario
BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in
modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del
complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si
compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo
Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva
[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con
conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve
indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca
di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di
convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la
reazione di scambio nucleotidica di Hsp70
31
LEGAMI Hsp70-Hsp70
Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro
della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In
particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce
come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola
lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di
questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento
Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il
cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che
sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi
eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente
lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se
non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di
complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di
nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di
scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione
importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto
di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel
folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle
Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza
proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa
con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere
coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di
traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina
Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come
sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le
interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di
32
Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi
SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua
attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano
legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di
idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede
possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano
lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina
stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che
Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami
con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina
J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di
stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega
bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o
Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non
limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che
la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-
associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con
Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito
meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande
aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante
per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70
AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP
Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli
AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione
disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]
33
Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un
anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del
proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico
20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA
svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP
Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104
nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico
per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste
attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come
una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-
etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE
per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla
fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il
meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere
tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria
per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli
anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una
parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali
suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata
assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando
una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a
spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad
entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel
caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro
che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti
dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una
proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In
parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno
34
individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi
domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre
interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta
apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati
che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la
questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)
Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97
Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da
proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad
entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro
efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non
devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati
dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte
lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono
piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte
superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine
adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il
35
movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori
p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su
proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di
proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la
retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e
reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo
anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite
adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente
il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente
forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei
canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]
LrsquoAZIONE DELLrsquoATP
La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico
al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco
affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad
esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello
Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che
ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo
di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli
wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli
mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori
dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di
ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di
un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di
quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda
36
subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino
al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave
significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o
sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti
differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra
essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che
attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave
adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non
vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a
cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di
subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico
Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un
substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di
queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un
meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da
F1-ATPasi non sembra escluso
HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE
NEURODEGENERATIVE
RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE
Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel
mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una
pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi
associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione
37
di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di
Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta
promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]
Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90
nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave
funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi
permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]
HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico
Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono
mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)
accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock
citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata
da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante
di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo
stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si
lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei
geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-
shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via
multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di
transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-
translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90
[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e
mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo
shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con
Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)
38
attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da
shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni
Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che
i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro
sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock
termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su
attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato
che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi
di insulti
Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90
e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con
shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La
somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a
topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello
39
Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge
contro aggregati tossici
Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un
aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave
egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di
chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione
incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste
molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente
diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su
espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative
Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie
neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a
mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei
neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia
muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-
pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma
mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme
nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che
Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in
oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza
attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili
[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di
Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt
mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore
di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo
suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro
effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi
40
indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando
monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono
probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono
essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di
atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70
permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]
Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare
spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo
nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un
miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina
[62]
Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il
riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso
lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido
dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli
di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i
motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione
acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni
Riluzolo
Arimoclomol
41
Nei vari modelli cellulari della malattia di Alzheimer (AD) vi egrave un
incremento dei livelli di Hsp70 promossa dalla solubilitagrave e dal legame ai
microtubuli delle proteine tau [63] Hsp70 ha anche inibito la
propensione di aggregazione di Aβ [64] e ridotto la tossicitagrave di Aβ su
culture neuronali [65] Inoltre la proteina precursore dellrsquoamiloide
(APP) eo il suo Aβ amiloide derivato sono bersagli di chaperoni
mediati da clearence [66-67] Nella Drosophila melanogaster e nei
modelli di lievito della malattia di Parkinson (PD) lrsquoespressione diretta
di Hsp70 o la modulazione farmacologica di Hsp ha impedito la perdita
di neuroni causata da alfa-sinucleina [68-69] Huang et al hanno
riportato che questi effetti di Hsp70 si manifestano con lrsquoinibizione della
formazione di fibrille di alfa-sinucleina prevenendo la formazione di
alfa-sinucleina prefibrillare [70] Usando delezioni mutanti di alfa-
sinucleina Luk et al hanno indicato che le interazioni tra il dominio
legante il substrato Hsp70 e la regione del core idrofobico dellrsquoalfa-
sinucleina mediano lrsquoinibizione dellrsquoassemblaggio e che questo
processo di assemblaggio egrave inibito prima della fase di allungamento
[71] Nel complesso in diversi modelli di malattia neurodegenerativa la
sovra espressione di Hsp70 ha migliorato la gravitagrave della malattia di
fenotipi diversi senza incidere visibilmente sulla formazione di
aggregati suggerendo che i chaperoni non impediscono lrsquoaggregazione
di per seacute bensigrave reindirizzano gli aggregati preferibilmente in depositi
amorfi quindi sequestrando specie potenzialmente tossiche dalla
maggior parte della soluzione
42
Lrsquoespressione di Hsp70 e di altre Hsp egrave indotta dallrsquoinibizione
farmacologica di Hsp90
Come riportato sopra lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal
complesso con Hsp90 con susseguente produzione di Hsp (Figura 7) e
lrsquoinduzione di Hsp70 da parte di inibitori di Hsp90 egrave ben documentata
nei modelli di malattie neurodegenerative La geldanamicina (GM) un
inibitore di Hsp90 induce un aumento dose dipendente di Hsp70 nei
modelli di cellule di AD (Alzhaimer) cosigrave come nei neuroni della
corteccia primaria del ratto e riduce la quantitagrave di tau insolubili e dei
livelli basali di acido okadaico indotto da tau fosforilazione [63] Il
trattamento di neuroni primari corticali con lrsquoinibitore di Hsp90 con
struttura purinica il PU24FCI ha portato ad un aumento di Hsp70 dose-
dipendente [72]
PU24FCI
KU32
43
Allo stesso modo la somministrazione di due derivati di PU24FCI
CNS-permeabili il PU-DZ8 [72] ed il EC102 [73] a topi tau transgenici
(htau e JNPL3) ha determinato induzione di Hsp70 nel cervello e
mantenuto gli effetti per 24 ore dopo la somministrazione KU32 un
inibitore di Hsp90 di diversa natura chimica ha indotto Hsp70 in culture
SH-SY5Y di neuroblastoma e la ha protetta da tossicitagrave indotta da Aβ
GM ha attivato una risposta da shock termico ed inibito lrsquoaggregazione
di htt in un modello di coltura cellulare di HD ed ha indotto Hsp70 in
maniera tempo e concentrazione-dipendente ed ha impedito
lrsquoaggregazione di alfa-sinucleina e protetto contro la tossicitagrave in un
modello di aggregazione cellulare di alfa-sinucleina Auluck et al hanno
segnalato che il trattamento di un modello volante di PD con GM ha
protetto completamente contro tossicitagrave per alfa-sinucleina [74] GM ha
protetto anche contro la neurotossicitagrave dopaminergica indotta da 1-metil-
4-fenil-1236-tetraidropiridina (MPTP) in un modello di topo di PD Il
pretrattamento con GM mediante iniezione ventricolare intracerebrale
prima del trattamento con MPTP ha indotto le Hsp70 ed incrementato il
contenuto residuale di dopamina e lrsquoimmuno reattivitagrave della tirosina
idrolasi nel corpo striato [75] Lrsquoinduzione di Hsp70 nel midollo spinale
egrave stata osservata in seguito ad iniezione intraperitoneale di un derivato
della GM il 17-AAG in un modello di SBMA topo [76] Il 17-AAG egrave
stato anche efficace contro la nuerodegenerazione in altre malattie
poliQ Vale a dire ha soppresso la degenerazione dellrsquoocchio e la
formazione di inclusioni del corpo e salvato dalla letalitagrave in un modello
di SCA di Drosophila Ha inoltre soppresso la neurodegenerazione in un
modello volante di HD La riduzione di HSF-1 ha abolito lrsquoinduzione di
chaperoni molecolari e gli effeti terapeutici di 17-AAG sulla
neurodegenerazione poliQ indotta nei modelli di Drosophila facendo
44
arguire che lrsquoeffetto terapeutico di 17-AAG egrave essenzialmente mediato da
HSF-1 [77] Riassumendo lrsquoattivazione di HSF-1 da inibitori di Hsp90
egrave stata notata specificamente in modelli in vivo ed in vitro di malattie
neurodegenerative suggerendo che lrsquoinibizione di Hsp90 puograve essere un
mezzo per modulare i livelli di Hsp in cervelli malati con lrsquoobbiettivo di
proteggere contro le proteine tossiche che si presentano nel corso del
processo neurodegenerativo
Lrsquoinibizione di Hsp90 riduce lrsquoattivitagrave e lrsquoespressione di proteine
neuronali aberranti
In aggiunta alla regolazione di HSF-1 evidenze recenti suggeriscono un
ruolo addizionale per Hsp90 nel mantenimento della stabilitagrave funzionale
della capacitagrave aberrante di proteine neuronali (Figura 8A)
La SBMA egrave una malattia ereditaria dei motoneuroni causata
dallrsquoaccrescimento di un tratto di poliglutamina allrsquointerno del recettore
androgeno (AR) [57]
Le caratteristiche patologiche di SBMA sono perdita dei motoneuroni
nel midollo spinale e nel tronco cerebrale diffusione dellrsquoaccumulo
nucleare inclusioni nucleari di mutanti AR (mAR) nei motoneuroni
residui e in alcuni organi viscerali Waza et al hanno dimostrato che
mAR presente in SBMA egrave una delle proteine regolate da Hsp90 (Figura
8A) [76]
45
Figura 8 Le Hsp90 riparano le proteine neuronali aberranti (A) Proteine neuronali
aberranti regolate da Hsp90 (B) Lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90porta allrsquoinattivazione
o degradazione delle proteine regulate da Hsp90 probabilmente attraverso la via del
proteasoma
Le Hsp90 formano un complesso molecolare con mAR per il
mantenimento della sua stabilitagrave funzionale Sia in modelli cellulari di
SBMA che in topi transgenici lrsquoinibizione di Hsp90 da parte di 17-
AAG il derivato 17 allilammino-17-demetossi della geldanamicina ha
46
portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal
macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati
disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da
destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione
dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di
SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave
rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati
[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori
hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo
sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa
(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni
Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]
Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo
egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali
sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al
hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina
(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi
familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un
complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data
da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto
47
lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della
stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave
dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita
neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei
neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che
codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a
PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson
familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson
suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente
associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che
Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate
con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente
diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina
egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille
ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno
recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di
alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che
sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina
[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce
lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari
Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-
dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento
tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-
sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da
chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di
mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il
macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD
associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-
48
sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative
caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave
caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di
tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD
lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da
unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina
chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta
(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si
era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero
netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un
gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e
Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave
causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma
17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau
[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine
neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso
portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina
mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da
Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei
modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave
patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-
dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla
settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad
una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di
tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno
dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una
diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di
AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le
49
relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la
degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90
[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al
(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave
stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da
GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β
effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi
GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di
Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe
portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in
strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati
indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone
biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione
di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da
parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi
proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di
queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)
Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie
neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio
approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare
dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la
formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione
potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di
Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare
terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare
malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo
centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90
puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione
50
successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti
neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti
clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto
che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono
tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in
modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni
nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati
promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio
spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in
modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di
Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a
lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse
da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase
esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora
rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori
dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per
mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie
neurodegenerative
51
SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-
ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-
METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE
(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE
MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO
SULLA FRAMMENTAZIONE
Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in
risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta
nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine
regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il
ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai
loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine
client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro
cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire
su molti percorsi oncogenici
Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il
nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che
lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati
composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP
attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del
processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono
emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i
tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule
normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina
(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una
maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto
che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una
piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
6
In queste condizioni lo stress ossidativo si verifica come conseguenza
dello squilibrio tra la produzione di specie reattive dellossigeno (ROS) e
la capacitagrave del corpo di disintossicarsi dagli intermedi reattivi di queste
Questo squilibrio puograve portare come conseguenza una eccessiva
produzione di ROS come osservato nelle malattie ischemiche o puograve
causare una diminuzione della capacitagrave degli enzimi antiossidanti
Come risultato il normale ambiente intracellulare egrave compromesso si
osserva ossidazione e aggregazione delle proteine e del DNA vitale che
si traduce nel fallimento della normale funzione cellulare
Le proteine ossidate si accumulano causando cosigrave infiammazioni acute
Tuttavia i cambiamenti nello stato redox cellulare possono anche essere
un segnale per lattivazione della cascata apoptotica
Fra i vari cambiamenti nellrsquoattivitagrave cellulare e nella fisiologia lrsquoevento
piugrave importante nelle cellule stressate egrave la produzione di un certo numero
di proteine altamente conservate le proteine dello shock termico o da
stress [2] Negli ultimi ventrsquoanni sono state eseguite numerose ricerche
sulla struttura e sulla funzione delle proteine da shock termico o Hsp
[3] Queste proteine sono risultate molto interessanti in quanto giocano
un ruolo fondamentale nella progressione del ciclo cellulare e
nellrsquoapoptosi (o morte programmata della cellula) e sono coinvolte in
molte malattie La risposta allo shock termico o di stress egrave una risposta
di adattamento cellulare che aiuta al mantenimento dellrsquoomeostasi
cellulare in condizioni di stress Ersquo stato osservato che subito dopo un
improvviso aumento di temperatura tutte le cellule mostrano
lrsquoespressione indotta di una famiglia di geni conosciuti come geni Hsp
La sequenza del DNA che costituisce questa famiglia di geni egrave
altamente conservata tra le specie Questa famiglia di geni era stata
originariamente chiamata cosigrave a causa della loro espressione dopo
7
lrsquoesposizione al calore Tuttavia la stessa risposta si ottiene dopo
differenti insulti inclusi stress ambientali e metabolici come ipossie
ischemie iperossie anossie esposizione alla luce UV e sostanze
chimiche nicotina stress chirurgico deficienze nutrizionali (per es
privazione del glucosio) stress emozionale e meccanico lesioni
meccaniche e agenti virali o altri tipi di stress come esposizione a
radicali tossici o ad agenti cancerogeni [4 abc] In condizioni di stress
come lo shock termico e alcuni stati fisiologici le proteine da stress
sono rapidamente indotte attraverso meccanismi di trascrizione e
trasduzione (figura 1)
Figura 1 Meccanismo di attivazione delle Hsp e riparazione delle proteine denaturate(DP)
(1) Condizioni di stress portano alla denaturazione delle proteine (2) La presenza DP
stimola la dissociazione del complesso Hsp-HSF Questo complesso limita il processo di
trascrizione in assenza di DP (3) mentre le Hsp sono libere di legarsi a DP HSF viene
attivato attraverso la fosforilazione e
La risposta inducibile allo shock termico genera un segnale che porta
allrsquoattivazione di un fattore di trascrizione [5] La trascrizione del gene
Hsp egrave sotto il controllo di una famiglia di fattori di trascrizione dello
shock termico (HSF) Membri differenti della famiglia di HSF possono
8
essere attivati da specifici stress diversi Nonostante siano stati scoperti
varie HSF HSF-1 ha dimostrato di essere il regolatore principale di una
breve induzione termica di Hsp Le Hsp giocano un importante ruolo
regolatore nella trascrizione dei geni Se le Hsp fossero sovraespresse in
assenza di stress si legherebbero direttamente al dominio di trans-
attivazione di HSF-1 determinando cosigrave la sua soppressione Le Hsp
sono proteine ubiquitarie sia nelle cellule eucariote che in quelle
procariote Come suggerisce il nome le Hsp sono indotte in cellule
esposte al calore sebbene le proteine dello stress (Chaperoni) possono
essere attivate da alcuni differenti tipi di insulti facendo in modo che le
cellule sopravvivano in condizioni altrimenti letali La tabella 1 presenta
un sommario di queste proteine la loro locazione cellulare e la loro
funzione Le Hsp ad alto peso molecolare sono ATP-dipendenti mentre
le Hsp a basso peso molecolare agiscono in maniera ATP-indipendente
[6]
9
Tabella 1 Hsp umanepeso molecolare localizzazione e funzione
10
Ogni famiglia di Hsp egrave composta da membri espressi sia in maniera
costitutiva che induttiva e si rivolge a diversi scomparti subcellulari [7]
Lrsquoattivazione costitutiva delle Hsp puograve verificarsi nelle cellule anche in
assenza di fattori di stress ambientali Per esempio Hsp90 puograve costituire
fino allrsquo1 del totale delle proteine cellulari in cellule non stressate [3]
indicando che queste proteine hanno un ruolo nel mantenimento della
conformazione delle proteine anche in condizioni normali In
condizioni di stress i dimeri di Hsp90 tendono ad associarsi in tetra-
esa- e ottameri ed oligomeri ancora piugrave elevati [8] In condizioni
fisiologiche Hsp90 si trova in associazione con diverse proteine
intracellulari tra cui calmodulina actina tubulina diverse chinasi e
qualche proteina recettore [9] I componenti dei complessi di Hsp90
come proteine kinasi e recettori steroidei possono mediare il trasporto
nucleare dellrsquoHsp90 specialmente sotto stress da calore Probabilmente
Hsp90 forma complessi stabili con filamenti di actina e si lega alla
tubulina per proteggere i microtubuli quindi puograve mediare
lrsquoorganizzazione strutturale del proteasoma un complesso
multicatalitico quando i livelli di ATP cellulari diminuiscono [5] Allo
stesso modo Hsp27 tende a oligomerizzarsi in condizioni di stress ed egrave
stato precedentemente dimostrato che nelle cellule tumorali endogene
Hsp27 egrave la piugrave importante proteina argpirimidina modificata e che
questa modifica comporta lrsquooligomerizzazione di Hsp27 [10]
Argpirimidina egrave un addotto metilgliossale-arginina che risulta dalla
glicazione non enzimatica di residui di arginina delle proteine nelle
cellule tumorali mostrando un aumento della glicolisi [11] Hsp27 e
Hsp70 sono fortemente ed universalmente indotte da diverse
sollecitazioni mentre la loro espressione egrave bassa in condizioni
fisiologiche permettendo ad attivitagrave costitutive cellulari di procedere
11
[12] A prescindere dalla loro localizzazione intracellulare le Hsp70
sono state trovate anche sulla membrana plasmatica delle cellule
trasformate malignamente e nello spazio extracellulare [13] Hsp70
Hsp90 e la proteina GP96 chaperone residente nel reticolo
endoplasmatico (RE) appartenente alla famiglia di Hsp90 [14] sono
state trovate nel mezzo cellulare Questo mette in considerazione la
duplce funzione delle Hsp la funzione citoprotettivaantiapoptotica
intracellulare e la funzione immunogenica extracellulare [7] Le Hsp
intracellulari sono importanti in quanto assicurano il ripiegamento delle
proteine nella loro corretta struttra terziaria lrsquoincorporazione di
polipeptidi nelle membrane intracellulari o nel trasporto delle proteine
attreverso le membrane [9] mentre la funzione delle Hsp extracellulari egrave
immunogenica attreverso lo chaperoning di peptidi antigenici I membri
della famiglia di Hsp70 e Hsp90 sono stati rilevati nel mezzo delle
cellule presentanti lrsquoantigene (APC) Ersquo stato osservato che lrsquouptake di
complessi Hsp-peptidi da parte delle APC egrave specifico saturabile e
concentrazione dipendente e quindi egrave stata ipotizzata lrsquoesistenza di
recettori Hsp specifici [7] Quindi il potenziale coinvolgimento delle
Hsp in molti tipi di malattie le ha rese particolarmente importanti per lo
sviluppo di nuove terapie
12
CHAPERONINE MOLECOLARI E CONTROLLO
QUALITArsquo DELLE PROTEINE
Nelle cellule viventi sia le catene polipeptidiche di nuova sintesi che le
preesistenti sono a rischio costante di mal ripiegamento
(MISFOLDING) o aggregazione In conformitagrave con lrsquoampia diversitagrave di
forme mal ripiegate lrsquoelaborazione di strategie di controllo qualitagrave si
sono evolute per opporsi a questa inevitabile disavventura Recenti studi
descrivono la rimozione di aggregati dal citosol rivelano meccanismi di
controllo di qualitagrave per proteine nel reticolo endoplasmatico (RE) e
forniscono nuove intuizioni in due classi di chaperoni molecolari
lrsquoHsp70 (Heat Shock Protein 70) e lrsquoAAA+ (Hsp100) [15]
FOLDING DI PROTEINE NEL RETICOLO
ENDOPLASMATICO RICONOSCERE IL GIUSTO
DALLO SBAGLIATO
Il reticolo endoplasmatico (ER) un organulo presente sia nelle cellule
animali che vegetali svolge un ruolo premimente in numerosi processi
di fondamentale importanza per la sopravvivenza e per il normale
funzionamento cellulare LER occupa circa il 10 del volume della
cellula e la metagrave della superficie coperta da tutte le membrane della
cellula (endomembrane piugrave membrana plasmatica) [16]
Il reticolo endoplasmatico (RE) riveste numerose funzioni vitali per la
cellula Tra le tante egrave la stazione iniziale della via secretoria ed egrave quindi
il luogo nel quale circa un terzo di tutte le proteine di una cellula viene
sintetizzato e ripiegato correttamente [17] in secondo luogo lrsquoER egrave il
13
punto di partenza dal quale numerose proteine vengono smistate e
indirizzate verso la loro destinazione finale [18]
LrsquoER egrave quindi la sede della sintesi del ripiegamento (ldquofoldingrdquo) e delle
modificazioni post-traduzionali delle proteine di membrana e secrete ed
egrave responsabile della maturazione strutturale di un quarto del proteasoma
che attraversa le vie secretorie
Il ripiegamento delle proteine secretorie fornisce una serie di sfide
uniche in quanto egrave accompagnato e dipendente dalla formazione di ponti
disolfuro ed inserzioni nel doppio strato lipidico con entrambi gli eventi
che si verificano piugrave lentamente di tipici cambi conformazionali che
accompagnano il ripiegamento Conseguentemente il RE fornisce le
condizioni ottimali per fronteggiare queste sfide includendo unrsquoalta
concentrazione di chaperoni generici oltre a una gamma di specifiche
strategie fatte su misura per favorire il ripiegamento delle proteine
secretorie Inoltre esiste un sofisticato sistema di controllo-qualitagrave nel
RE per trattenere e riparare proteine che non hanno raggiunto ancora il
loro stato naturale Malgrado la lunghezza con la quale le cellule vanno
a fornire un ambiente ottimale nel RE il ripiegamento delle proteine
secretorie puograve avvenire o manca a volte ad un ritmo allarmante Il RE
adopera due meccanismi di risposta in presenza di forme mal ripegate Il
primo meccanismo egrave una risposta allo stress RE-dedicato definito UPR
(risposta alla non corretta conformazione delle proteine) che attua il
rimodellamento del RE cosigrave da aumentare la sua capacitagrave di
ripiegamento [16] Una proteina malfunzionante rimane sequestrata nel
reticolo endoplasmatico quindi un eccesso di proteine mal strutturate
attiva la risposta da proteine con folding scorretto (Unfolded Protein
Response) Questo tipo di risposta inizia con il riconoscimento del
segnale di stress da parte di un recettore nel reticolo endoplasmatico e
14
prosegue con il blocco della sintesi proteica per permettere al
proteasoma di eliminare lrsquoeccesso di proteine mentre viene stimolata la
produzione di fattori di trascrizione Il secondo meccanismo chiamato
degradazione RE-associata (ERAD) riconosce in modo specifico le
parti terminali di proteine mal ripiegate e le loro retrotraslocazioni
attraverso la membrana del reticolo endoplasmatico nel citosol dove
possono essere degradate dal sistema di degradazione ubiquitina-
proteosoma [17] Questi due meccanismi sono intimamente collegati
lrsquoinduzione UPR aumenta la capacitagrave dellrsquoERAD una diminuzione
dellrsquoERAD comporta unrsquoinduzione dellrsquoUPR costitutivo e
contemporaneamente la diminuzione di ERAD e UPR fa diminuire di
molto la viabilitagrave delle cellule I sistemi UPR ed ERAD fronteggiano
anche il comune problema del riconoscimento che richiede
lrsquoidentificazione delle forme mal ripiegate potenzialmente patologiche
nellrsquoambiente del RE La sorveglianza di UPR ed ERAD deve garantire
un buon equilibrio proteggendo le cellule dalle pericolose specie mal
ripiegate evitando la sovra vigilanza (come accade con forme mutate di
regolatori trans membrana della fibrosi cistica CFTR) che puograve portare
allrsquoeliminazione di forme potenzialmente sanabili Recenti studi hanno
rivelato come ERAD ed UPR identifichino forme mal ripiegate
Pertanto il RE rappresenta un preciso sistema di controllo di qualitagrave atto
ad assicurare che solo le proteine correttamente ripiegate e funzionanti
possano essere rilasciate dallrsquoER e raggiungere la loro destinazione
finale mentre le proteine malripiegate o non funzionanti sono trattenute
nel ER e in seguito traslocate nel citosol per la degradazione
15
RISPOSTA ALLA NON CORRETTA
CONFORMAZIONE DELLE PROTEINE
Le proteine designate per il riconoscimento dei segnali di stress
provenienti dal reticolo endoplasmatico sono generalmente IRE1
(Inositol Requiring Kinase 1) ATF6 (Activation of Transcription Factor
6) e PERK (PKR-like Endoplasmic Reticulum Kinase)
Nel lievito la capacitagrave di ripiegarsi del RE egrave monitorata da IRE1 una
chinasi trans membrana altamente conservata che contiene un dominio
luminale responsabile del riconoscimento delle forme mal ripiegate
chinasi citosoliche e domini ribonucleasici Lrsquoaccumularsi delle proteine
mal ripiegate nel RE porta allrsquoattivazione delle chinasi IRE
Lrsquoattivazione delle IRE-chinasi promuove lo splicing non convenzionale
dei messaggi per un fattore di traduzione b-ZIP (Hac1 nel lievito e XBP-
1 nei metazoi) attraverso il suo dominio ribonucleasico La traduzione
del messaggio Hac 1 spliced crea un fattore attivo di trascrizione che
media direttamente la trascrizione dei target di UPR includendo
chaperoni del RE macchinario ERAD e tante altre proteine secretorie
In aggiunta alla IRE-1 gli eucarioti piugrave sviluppati utilizzano due altri
sensori le chinasi trans membrana del RE PERK ed il fattore di
trascrizione trans membrana del RE ATF6 (Figura 2) PERK contiene
un sensore luminale che egrave altamente correlato a quello di IRE-1 il
dominio citoplasmatico di PERK consiste in una chinasi elF2α
16
Figura 2 Struttura dei principali sensori dello stress nel reticolo endoplasmatico IRE1
ATF6 PERK
Lrsquoattivazione delle chinasi dovuta alla presenza di proteine mal
ripiegate determina unrsquoinibizione generalizzata della traduzione come
pure la up-regulation del fattore di trascrizione specifico ATF4
Lrsquoaccumulo di proteine mal ripiegate permette inoltre ad ATF6 di
raggiungere lrsquoapparato del Golgi dove le proteasi trans membrana
rilasciano il dominio citoplasmatico del fattore di trascrizione
permettendogli di entrare nel nucleo e mediare lrsquoinduzione genetica
Lrsquoesistenza di molteplici sensori UPR negli eucarioti piugrave avanzati
permette per lo piugrave una risposta piugrave sfumata alle proteine mal ripiegate
Per esempio una risposta iniziale alle proteine mal ripiegate potrebbe
portare ad una down-regulation generalizzata della traduzione seguita in
sequenza da unrsquoinduzione di chaperoni lrsquoinduzione del macchinario
17
ERAD ed infine contro lo stress prolungato lrsquoattivazione della morte
cellulare tramite apoptosi Molto recentemente ci sono stati notevoli
progressi nelle nostre conoscenze molecolari di come IRE-1 (e per
deduzione PERK) riconosce le proteine mal ripiegate Studi precedenti
avevano dimostrato che BIP (Binding Immunoglobulin Protein) lrsquo
omologo principale delle Hsp70 presente nel reticolo endoplasmatico si
lega in modo specifico con IRE1 e che questa interazione scompare in
condizioni di stress del RE Inoltre lrsquoiperespressione di BiP puograve
sopprimere lrsquoinduzione dellrsquoUPR Questo aveva suggerito un modello di
titolazione in cui BiP agisce come un regolatore negativo di IRE1 e
lrsquoaccumularsi di forme mal ripiegate porta indirettamente allrsquoattivazione
dellrsquoIRE1 attraverso il sequestro di BiP da parte proteine mal ripiegate
Tuttavia recenti studi hanno dimostrato che anche se il legame del BiP
possa avere un ruolo importante nella down-regulation di IRE1 ci sono
altri fattori importanti Analisi mutazionali hanno trovato che la
delezione della regione di IRE1 responsabile del legame con BiP non
altera la regolazione di IRE1 in risposta alle proteine unfolded [18] Piugrave
drammaticamente la struttura cristallina del core del dominio luminale
conservato (cLD) di IRE1 nel lievito rivela una profonda scanalatura
idrofobica che ricorda la tasca legante dei maggiori complessi di
istocompatibilitagrave (MHCs) che sono i responsabili per il riconoscimento
peptidico Che IRE1 possa legarsi direttamente a polipeptidi mal
ripiegati egrave unrsquoidea interessante (Figura 3) [19]
18
Figura 3 Un modello ipotetico descrive lrsquoattivazione di Ire1 attraverso la oligomerizzazione
determinata dal legame di proteine unfolded (indicate in rosso) Le interazioni dirette o
indirette fra le catene delle proteine unfolded possono contribuire allrsquoattivazione Sul lato
luminale della membrana del RE le proteine unfolded si legano alla scanalatura (indicata in
grigio) formata dalla dimerizzazione del core del dominio luminale di Ire1 attraverso
linterfaccia 1 Sul lato citoplasmaticodella membrana del RE la oligmerizzazione accosta i
domini della chinasi Ire 1 che subiscono un cambiamento conformazionale in seguito ad
autofosforilazione che porta allrsquoattivazione della funzione di RNA-ribonucleasi di Ire1
Attraverso il riconoscimento diretto delle forme mal ripiegate
lrsquoinduzione di IRE1 potrebbe verificarsi prima della completa titolazione
di BiP che data lrsquoestrema abbondanza di questrsquoultimo nel RE potrebbe
verificarsi solo dopo un catastrofico accumulo di proteine mal ripiegate
Inoltre il riconoscimento diretto di forme mal ripiegate da parte di IRE1
(e PERK) potrebbe consentire una serie di risposte piugrave sfumate in cui
diverse forme mal ripiegate potrebbero essere preferenzialmente
riconosciute da sensori diversi quali BiP IRE1 o PERK Cosigrave in linea
di principio la natura (per esempio traslazionale contro transcrizionale)
ed il ciclo di UPR potrebbe essere su misura per la classe specifica di
forme mal ripiegate che sono prevalenti nel RE [20]
19
DEGRADAZIONE DELLE PROTEINE ASSOCIATA AL
RETICOLO ENDOPLASMATICO
Come ci si poteva aspettare dalla diversitagrave delle proteine che si
ripiegano NEL RE studi recenti hanno dimostrato che la degradazione
ER-associata (ER-Associated Degradation ERAD) comprende una
serie di sistemi diversi ciascuno responsabile della degradazione di
sottoinsiemi di proteine che condividono proprietagrave fisiche comuni
Esistono anche regioni dedicate allrsquo ER Associated Degradation
(ERAD) nelle quali proteine che non raggiungono il corretto
ripiegamento vengono retrotraslocate al citosol e quindi degradate dal
proteasoma [21]
Ciograve forse egrave piugrave chiaramente dimostrato nel lievito dove ci sono almeno
due distinti meccanismi di sorveglianza per identificare le proteine mal
ripiegate del RE Il primo meccanismo chiamato ERAD-L analizza le
proteine che contengono domini luminali mal ripiegati (solubili o trans
membrana) chiamati CPY una forma mutante della proteina CPY
endogena che egrave incapace di folding Il secondo denominato ERAD-C
rileva domini mal ripiegati citosolici di proteine trans membrana [22]
Sebbene entrambe queste vie in ultima analisi convergano sul sistema
di degradazione ubiquitina-proteosoma esse dipendono da diversi
insiemi di componenti RE-associati per rivelare e fornire specie mal
ripiegate al citosol Nel caso di ERAD-C (e non di ERAD-L) la
degradazione egrave in genere dipendente da uno specifico sottoinsieme di
chaperoni citosolici inclusi i membri Hsp40 e Hsp70 Ciograve suggerisce
che queste proteine possono essere direttamente responsabili per il
riconoscimento di domini citosolici mal ripiegati di proteine trans
membrana Tuttavia le caratteristiche esatte che vengono monitorate e
20
come i substrati vengano consegnati al macchinario di
retrotranslocazione restano importanti questioni aperte per la maggior
parte dei substrati Il riconoscimento di una proteina contenente un
dominio luminale mal ripiegato dipende in modo determinante dallo
stato di glicosilazione della proteina Infatti anche piccole modifiche di
glicani N-linked puograve provocare danni gravi nella degradazione di
numerosi substrati Questo puograve effettivamente lasciare le proteine in un
limbo impossibile raggiungere lo stato nativo ma non riconosciuto dal
macchinario ERAD esse restano mal ripiegate nel RE a tempo
indeterminato A prima vista questa dipendenza dalla glicosilazione
sembra essere un miglioramento non necessario Tuttavia egrave ormai chiaro
che lo spettro di porzioni di zucchero presenti in una proteina egrave un
segnale fondamentale nel marcare il suo status di ripiegamento Infatti
dato che diverse proteine altamente abbondanti nel RE tra cui BiP e
PDI spesso non sono glicosilate la presenza e la natura covalente di
molto mannosio in un polipeptide puograve fornire un segnale importante che
aiuta il macchinario di controllo-qualitagrave del RE a distinguere le specie
ripiegate destinate ad altri scomparti da quelle piugrave abbondanti e
permanenti del RE Lrsquointuizione nel ruolo della glicosilazione nella
discriminazione tra le specie in via di ripiegamento e le proteine
terminali mal ripiegate nel RE egrave venuta dalla constatazione che
glicoproteine mal ripiegate subiscono un taglio dei loro N-glicani da una
varietagrave di glicosidasi tra cui una mannossidasi specifica In aggiunta a
proteine mal ripiegate persistenti si egrave pensato che il rimodellamento
dipendente dal tempo di N-glicani porti ad un segnale per la
degradazione del macchinario ERAD Questo permette intermedi
ripiegati in un periodo di tempo prima del rimodellamento dei loro N-
glicani in cui il polipeptide egrave immune dalla sorveglianza ERAD Egrave
21
interessante notare che un recente studio suggerisce che anche per i
polipeptidi citosolici vi egrave un periodo durante e subito dopo la sintesi in
cui le specie mal ripiegate sono immuni alla degradazione del
proteasoma [23] Recenti studi hanno identificato due differenti lettine
localizzate nel RE che svolgono un ruolo critico nellrsquoERAD La prima egrave
correlata alla proteina mannossidasi responsabile del taglio di N-glicani
nel RE ma sembra aver perso la sua attivitagrave catalitica Nel lievito si
chiama Htm1pMnl1p e nei mammiferi egrave chiamato EDEM Studi
condotti su cellule di mammifero suggeriscono che EDEM aiuta le
glicoproteine mal ripiegate a lasciare il ciclo calnexinacalreticulina del
chaperone lectina dove stanno cercando di ripiegarsi e cosigrave entrare nel
ciclo di degradazione [24 ab] Tuttavia nel lievito Htm1p egrave richiesto
per la degradazione efficiente di substrati come CPY che non
dipendono da calnexina Quindi sembra probabile che Htm1pEDEM
ricopra altri ruoli in ERAD La seconda lectina Yos9p forma un
complesso stabile con proteine mal ripiegate e la perdita di questa
lectina conduce ad un profondo e specifico difetto nella degradazione di
glicoproteine mal ripiegate [25] Sorprendentemente mentre mutazioni
puntiformi nella tasca di Yos9p legante il mannosio eliminano la sua
capacitagrave di supportare ERAD i mutanti stessi di Yos9p mostrano una
maggior interazione con i substrati Ciograve indica la possibilitagrave che la
lectina Yos9p svolga un ruolo piugrave informativo interrogando lo stato
dello zucchero di forme mal ripiegate per determinare se debbano essere
passate al macchinario di retrotranslocazione Tuttavia come con
ERAD-C sebbene ci siano stati grandi progressi nella caratterizzazione
del macchinario di retrotranslocazione [26] le caratteristiche strutturali
delle proteine mal ripiegate sono in fase di monitoraggio e sono ancora
22
limitate le conoscenzedi come le forme mal ripiegate sono passate a
questo macchinario
CLEARENCE DI AGGREGATI ATTRAVERSO
LrsquoAUTOFAGIA
Egrave sempre piugrave evidente che ci sono una varietagrave di condizioni in vivo che
anche con chaperoni e macchinari proteolitici presenti nello stesso
compartimento come proteine mal ripiegate questi meccanismi di
controllo-qualitagrave falliscono e le proteine mal ripiegate avanzano
formando aggregati Inoltre tali aggregati intracellulari sono associati
con una serie di malattie neurodegenerative come il morbo di
Huntington e di Parkinson La natura e la sorte di aggregati di proteine
nelle cellule eucariotiche egrave stata poco compresa Recentemente egrave stata
sempre piugrave sostenuta unrsquoazione protettiva della formazione di aggregati
piuttosto che unrsquoimmediata azione patogena Per esempio nel caso del
morbo di Huntington lrsquoesame di cellule neuronali in coltura
sovrapproducenti una fusione di poliglutamina espansa e huntingtina-
GFP rivelano che queste cellule contenenti aggregati fluorescenti
morfologicamente visibili esibiscono una migliore viabilitagrave rispetto a
quelle aventi per via diffusionale materiale fluorescente [27] Questo
sembra in accordo con il concetto che si tratta di piccoli assemblati di
proteine mal ripiegate inclusioni non morfologicamente visibili che
esercitano effetti tossici sulle cellule Analogamente un recente
confronto delle dimensioni rispetto a tossicitagrave per gli aggregati di
proteina prionica PrP suggerisce che piccoli aggregati contenenti da una
a due dozzine di molecole sono risultati i piugrave tossici per le cellule [28]
23
Ma le cellule dispongono di meccanismi di compensazione per questi
piccoli aggregati Studi recenti hanno suggerito che la via ubiquitina-
proteosoma possa essere il pilastro della rimozione di specie inclini
allrsquoaggregazione Infatti gli aggregati rilevati nel contesto di
neurodegenerazione di solito sono reattivi con gli anticorpi anti-
ubiquitina il che implica che le specie mal ripiegate sono state
riconosciute dal sistema di coniugazione dellubiquitina Eppure vari
studi di questi ultimi anni indicano che queste proteine modificate
rappresentano una sfida particolare per proteasomi che possono portare
alla loro inibizione [29 ab] Il meccanismo di questa inattivazione
rimane sconosciuto ma puograve coinvolgere il soffocamento della camera
del proteasoma [30]
Anatomia del proteasoma Il proteasoma egrave una macromolecola proteica del peso di circa 2 milioni
di Daltons Ersquo formata da ununitagrave base centrale (core) e 2 cappucci agli estremi (cap) Il core egrave
formato a sua volta da 4 anelli ciascuno costituito da 7 unitagrave proteiche I due ldquocaprdquo attaccati alle
due estremitagrave del core cilindrico consistono ciascuno di 20 subunitagrave
24
Ora sembra che la modifica dellrsquoubiquitina possa reclutare specie
aggregate mediante una via indipendente lrsquoAUTOFAGIA Lrsquoautofagia
implica il riconoscimento e lrsquoimpacchettamentofagocitazione di
proteine specifiche o organelli in vescicole autofagosomiche che si
fondono con i lisosomi in cui sia le vescicole che il loro contenuto sono
scomposti Piugrave di 20 componenti cosiddetti Atg (geni coinvolti
nellrsquoautofagia) mediano questo processo straordinario Recenti studi
hanno dimostrato che componenti centrali della formazione di autosomi
nei topi hanno attivitagrave nei tessuti dei mammiferi Per esempio carenza
di atg5 ha portato alla morte di animali appena nati a causa
dellrsquoincapacitagrave di fornire un apporto di aminoacidi attraverso la
degradazione di proteine del corpo durante la condizione di fame
relativa allrsquoimmediato periodo post-natale Sorprendentemente in un
altro studio in cui egrave stata indotta una carenza di atg7 piugrave avanti nella
vita con un gene ldquofloxedrdquo lrsquoaccumulo di aggregati positivi
allrsquoubiquitina egrave stata osservata nel fegato degli animali che sono stati
disabilitati nella produzione di autofagosomi La funzione del
proteasoma in questi animali egrave rimasta inalterata contenente specie mal
ripiegate etichettate con ubiquitina e possono essere eliminate attraverso
autofagia Egrave stato poi scoperto un componente denominato p62 (o
sequestosoma1) che costituisce un guscio attorno agli aggregati di
huntingtina [31] Questa proteina contiene un dominio C-terminale
associato allrsquoubiquitina (UBA) che puograve legare poliubiquitine in modo
tale che p62 si collochi con lrsquoubiquitina quando espressa in cellule
HeLa Inoltre nelle cellule che esprimono huntigtina p62 si associa con
LC3 una proteina localizzata negli autofagosomi In accordo con quanto
riportato e cioegrave che lrsquoautofagia riduce i livelli di aggregati di
huntingtina e con un ruolo critico di p62 in questo processo lrsquoinibizione
25
antisenso mediata dallrsquoesperessione di p62 aumenta lrsquoapoptosi delle
cellule che esprimono huntungtina Quindi sembra che la modifica
dellrsquoubiquitina delle proteine difettose possa offrire un ingresso sia al
sistema proteasoma o in contesti dove lrsquoaggregazione egrave in corso al
sistema autofagia
SISTEMI CHAPERONI HSP70
Le Hsp70 proteine dello shock termico di 70 KDa sono impegnate in
una serie di processi tra cui il ripiegamento di proteine di nuova sintesi
il trasporto delle proteine attraverso membrane il ripiegamento di
proteine mal ripiegate ed aggregate e il controllo delle attivitagrave delle
proteine regolatrici Questa versatilitagrave egrave ottenuta attraverso
lampliamento e la diversificazione evolutiva di geni hsp70 che ha
generato sia chaperoni Hsp70 specifici Hsp110 e proteine Hsp170 La
versatilitagrave egrave determinata attraverso lrsquoimpiego di cochaperoni proteine J
e fattori di scambio di nucleotide (NEF) che regolano lrsquoattivitagrave di Hsp70
(Figura 4)
26
Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame
del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una
Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)
Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la
proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato
allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del
substrato
Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre
specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb
Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di
legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un
numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame
dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi
Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina
Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni
Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali
di Hsp70 con se stesso
27
INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70
Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di
proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura
xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding
appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide
N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD
adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio
elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con
lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante
chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco
tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini
di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di
comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura
di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione
La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la
tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo
coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture
precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una
proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da
una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β
ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica
compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio
elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di
legame del substrato (Figura 5)
28
Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo
substrato
La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra
domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che
collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo
solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi
residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame
allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A
dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso
Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un
legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in
nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano
completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve
entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo
fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui
coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del
segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti
integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A
29
capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il
quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di
ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a
idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di
DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro
catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente
arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia
drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete
crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la
barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK
costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina
superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura
della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera
attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della
prolina
DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-
NUCLEOTIDE
Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi
meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono
fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la
liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del
substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la
dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine
BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave
dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con
30
funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S
cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1
(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la
disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e
HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70
fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi
della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente
indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene
GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg
di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei
nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte
posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i
nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario
BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in
modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del
complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si
compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo
Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva
[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con
conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve
indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca
di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di
convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la
reazione di scambio nucleotidica di Hsp70
31
LEGAMI Hsp70-Hsp70
Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro
della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In
particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce
come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola
lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di
questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento
Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il
cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che
sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi
eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente
lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se
non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di
complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di
nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di
scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione
importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto
di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel
folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle
Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza
proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa
con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere
coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di
traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina
Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come
sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le
interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di
32
Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi
SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua
attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano
legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di
idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede
possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano
lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina
stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che
Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami
con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina
J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di
stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega
bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o
Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non
limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che
la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-
associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con
Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito
meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande
aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante
per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70
AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP
Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli
AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione
disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]
33
Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un
anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del
proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico
20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA
svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP
Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104
nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico
per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste
attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come
una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-
etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE
per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla
fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il
meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere
tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria
per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli
anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una
parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali
suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata
assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando
una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a
spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad
entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel
caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro
che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti
dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una
proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In
parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno
34
individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi
domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre
interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta
apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati
che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la
questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)
Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97
Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da
proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad
entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro
efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non
devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati
dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte
lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono
piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte
superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine
adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il
35
movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori
p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su
proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di
proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la
retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e
reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo
anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite
adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente
il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente
forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei
canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]
LrsquoAZIONE DELLrsquoATP
La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico
al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco
affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad
esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello
Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che
ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo
di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli
wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli
mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori
dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di
ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di
un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di
quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda
36
subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino
al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave
significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o
sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti
differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra
essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che
attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave
adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non
vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a
cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di
subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico
Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un
substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di
queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un
meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da
F1-ATPasi non sembra escluso
HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE
NEURODEGENERATIVE
RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE
Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel
mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una
pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi
associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione
37
di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di
Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta
promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]
Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90
nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave
funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi
permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]
HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico
Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono
mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)
accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock
citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata
da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante
di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo
stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si
lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei
geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-
shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via
multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di
transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-
translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90
[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e
mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo
shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con
Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)
38
attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da
shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni
Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che
i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro
sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock
termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su
attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato
che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi
di insulti
Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90
e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con
shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La
somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a
topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello
39
Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge
contro aggregati tossici
Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un
aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave
egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di
chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione
incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste
molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente
diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su
espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative
Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie
neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a
mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei
neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia
muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-
pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma
mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme
nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che
Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in
oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza
attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili
[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di
Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt
mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore
di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo
suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro
effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi
40
indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando
monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono
probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono
essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di
atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70
permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]
Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare
spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo
nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un
miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina
[62]
Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il
riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso
lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido
dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli
di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i
motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione
acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni
Riluzolo
Arimoclomol
41
Nei vari modelli cellulari della malattia di Alzheimer (AD) vi egrave un
incremento dei livelli di Hsp70 promossa dalla solubilitagrave e dal legame ai
microtubuli delle proteine tau [63] Hsp70 ha anche inibito la
propensione di aggregazione di Aβ [64] e ridotto la tossicitagrave di Aβ su
culture neuronali [65] Inoltre la proteina precursore dellrsquoamiloide
(APP) eo il suo Aβ amiloide derivato sono bersagli di chaperoni
mediati da clearence [66-67] Nella Drosophila melanogaster e nei
modelli di lievito della malattia di Parkinson (PD) lrsquoespressione diretta
di Hsp70 o la modulazione farmacologica di Hsp ha impedito la perdita
di neuroni causata da alfa-sinucleina [68-69] Huang et al hanno
riportato che questi effetti di Hsp70 si manifestano con lrsquoinibizione della
formazione di fibrille di alfa-sinucleina prevenendo la formazione di
alfa-sinucleina prefibrillare [70] Usando delezioni mutanti di alfa-
sinucleina Luk et al hanno indicato che le interazioni tra il dominio
legante il substrato Hsp70 e la regione del core idrofobico dellrsquoalfa-
sinucleina mediano lrsquoinibizione dellrsquoassemblaggio e che questo
processo di assemblaggio egrave inibito prima della fase di allungamento
[71] Nel complesso in diversi modelli di malattia neurodegenerativa la
sovra espressione di Hsp70 ha migliorato la gravitagrave della malattia di
fenotipi diversi senza incidere visibilmente sulla formazione di
aggregati suggerendo che i chaperoni non impediscono lrsquoaggregazione
di per seacute bensigrave reindirizzano gli aggregati preferibilmente in depositi
amorfi quindi sequestrando specie potenzialmente tossiche dalla
maggior parte della soluzione
42
Lrsquoespressione di Hsp70 e di altre Hsp egrave indotta dallrsquoinibizione
farmacologica di Hsp90
Come riportato sopra lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal
complesso con Hsp90 con susseguente produzione di Hsp (Figura 7) e
lrsquoinduzione di Hsp70 da parte di inibitori di Hsp90 egrave ben documentata
nei modelli di malattie neurodegenerative La geldanamicina (GM) un
inibitore di Hsp90 induce un aumento dose dipendente di Hsp70 nei
modelli di cellule di AD (Alzhaimer) cosigrave come nei neuroni della
corteccia primaria del ratto e riduce la quantitagrave di tau insolubili e dei
livelli basali di acido okadaico indotto da tau fosforilazione [63] Il
trattamento di neuroni primari corticali con lrsquoinibitore di Hsp90 con
struttura purinica il PU24FCI ha portato ad un aumento di Hsp70 dose-
dipendente [72]
PU24FCI
KU32
43
Allo stesso modo la somministrazione di due derivati di PU24FCI
CNS-permeabili il PU-DZ8 [72] ed il EC102 [73] a topi tau transgenici
(htau e JNPL3) ha determinato induzione di Hsp70 nel cervello e
mantenuto gli effetti per 24 ore dopo la somministrazione KU32 un
inibitore di Hsp90 di diversa natura chimica ha indotto Hsp70 in culture
SH-SY5Y di neuroblastoma e la ha protetta da tossicitagrave indotta da Aβ
GM ha attivato una risposta da shock termico ed inibito lrsquoaggregazione
di htt in un modello di coltura cellulare di HD ed ha indotto Hsp70 in
maniera tempo e concentrazione-dipendente ed ha impedito
lrsquoaggregazione di alfa-sinucleina e protetto contro la tossicitagrave in un
modello di aggregazione cellulare di alfa-sinucleina Auluck et al hanno
segnalato che il trattamento di un modello volante di PD con GM ha
protetto completamente contro tossicitagrave per alfa-sinucleina [74] GM ha
protetto anche contro la neurotossicitagrave dopaminergica indotta da 1-metil-
4-fenil-1236-tetraidropiridina (MPTP) in un modello di topo di PD Il
pretrattamento con GM mediante iniezione ventricolare intracerebrale
prima del trattamento con MPTP ha indotto le Hsp70 ed incrementato il
contenuto residuale di dopamina e lrsquoimmuno reattivitagrave della tirosina
idrolasi nel corpo striato [75] Lrsquoinduzione di Hsp70 nel midollo spinale
egrave stata osservata in seguito ad iniezione intraperitoneale di un derivato
della GM il 17-AAG in un modello di SBMA topo [76] Il 17-AAG egrave
stato anche efficace contro la nuerodegenerazione in altre malattie
poliQ Vale a dire ha soppresso la degenerazione dellrsquoocchio e la
formazione di inclusioni del corpo e salvato dalla letalitagrave in un modello
di SCA di Drosophila Ha inoltre soppresso la neurodegenerazione in un
modello volante di HD La riduzione di HSF-1 ha abolito lrsquoinduzione di
chaperoni molecolari e gli effeti terapeutici di 17-AAG sulla
neurodegenerazione poliQ indotta nei modelli di Drosophila facendo
44
arguire che lrsquoeffetto terapeutico di 17-AAG egrave essenzialmente mediato da
HSF-1 [77] Riassumendo lrsquoattivazione di HSF-1 da inibitori di Hsp90
egrave stata notata specificamente in modelli in vivo ed in vitro di malattie
neurodegenerative suggerendo che lrsquoinibizione di Hsp90 puograve essere un
mezzo per modulare i livelli di Hsp in cervelli malati con lrsquoobbiettivo di
proteggere contro le proteine tossiche che si presentano nel corso del
processo neurodegenerativo
Lrsquoinibizione di Hsp90 riduce lrsquoattivitagrave e lrsquoespressione di proteine
neuronali aberranti
In aggiunta alla regolazione di HSF-1 evidenze recenti suggeriscono un
ruolo addizionale per Hsp90 nel mantenimento della stabilitagrave funzionale
della capacitagrave aberrante di proteine neuronali (Figura 8A)
La SBMA egrave una malattia ereditaria dei motoneuroni causata
dallrsquoaccrescimento di un tratto di poliglutamina allrsquointerno del recettore
androgeno (AR) [57]
Le caratteristiche patologiche di SBMA sono perdita dei motoneuroni
nel midollo spinale e nel tronco cerebrale diffusione dellrsquoaccumulo
nucleare inclusioni nucleari di mutanti AR (mAR) nei motoneuroni
residui e in alcuni organi viscerali Waza et al hanno dimostrato che
mAR presente in SBMA egrave una delle proteine regolate da Hsp90 (Figura
8A) [76]
45
Figura 8 Le Hsp90 riparano le proteine neuronali aberranti (A) Proteine neuronali
aberranti regolate da Hsp90 (B) Lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90porta allrsquoinattivazione
o degradazione delle proteine regulate da Hsp90 probabilmente attraverso la via del
proteasoma
Le Hsp90 formano un complesso molecolare con mAR per il
mantenimento della sua stabilitagrave funzionale Sia in modelli cellulari di
SBMA che in topi transgenici lrsquoinibizione di Hsp90 da parte di 17-
AAG il derivato 17 allilammino-17-demetossi della geldanamicina ha
46
portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal
macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati
disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da
destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione
dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di
SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave
rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati
[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori
hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo
sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa
(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni
Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]
Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo
egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali
sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al
hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina
(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi
familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un
complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data
da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto
47
lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della
stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave
dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita
neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei
neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che
codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a
PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson
familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson
suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente
associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che
Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate
con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente
diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina
egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille
ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno
recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di
alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che
sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina
[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce
lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari
Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-
dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento
tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-
sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da
chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di
mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il
macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD
associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-
48
sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative
caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave
caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di
tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD
lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da
unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina
chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta
(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si
era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero
netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un
gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e
Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave
causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma
17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau
[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine
neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso
portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina
mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da
Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei
modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave
patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-
dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla
settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad
una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di
tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno
dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una
diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di
AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le
49
relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la
degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90
[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al
(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave
stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da
GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β
effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi
GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di
Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe
portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in
strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati
indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone
biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione
di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da
parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi
proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di
queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)
Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie
neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio
approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare
dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la
formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione
potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di
Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare
terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare
malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo
centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90
puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione
50
successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti
neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti
clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto
che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono
tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in
modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni
nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati
promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio
spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in
modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di
Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a
lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse
da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase
esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora
rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori
dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per
mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie
neurodegenerative
51
SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-
ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-
METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE
(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE
MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO
SULLA FRAMMENTAZIONE
Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in
risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta
nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine
regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il
ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai
loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine
client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro
cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire
su molti percorsi oncogenici
Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il
nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che
lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati
composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP
attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del
processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono
emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i
tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule
normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina
(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una
maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto
che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una
piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
7
lrsquoesposizione al calore Tuttavia la stessa risposta si ottiene dopo
differenti insulti inclusi stress ambientali e metabolici come ipossie
ischemie iperossie anossie esposizione alla luce UV e sostanze
chimiche nicotina stress chirurgico deficienze nutrizionali (per es
privazione del glucosio) stress emozionale e meccanico lesioni
meccaniche e agenti virali o altri tipi di stress come esposizione a
radicali tossici o ad agenti cancerogeni [4 abc] In condizioni di stress
come lo shock termico e alcuni stati fisiologici le proteine da stress
sono rapidamente indotte attraverso meccanismi di trascrizione e
trasduzione (figura 1)
Figura 1 Meccanismo di attivazione delle Hsp e riparazione delle proteine denaturate(DP)
(1) Condizioni di stress portano alla denaturazione delle proteine (2) La presenza DP
stimola la dissociazione del complesso Hsp-HSF Questo complesso limita il processo di
trascrizione in assenza di DP (3) mentre le Hsp sono libere di legarsi a DP HSF viene
attivato attraverso la fosforilazione e
La risposta inducibile allo shock termico genera un segnale che porta
allrsquoattivazione di un fattore di trascrizione [5] La trascrizione del gene
Hsp egrave sotto il controllo di una famiglia di fattori di trascrizione dello
shock termico (HSF) Membri differenti della famiglia di HSF possono
8
essere attivati da specifici stress diversi Nonostante siano stati scoperti
varie HSF HSF-1 ha dimostrato di essere il regolatore principale di una
breve induzione termica di Hsp Le Hsp giocano un importante ruolo
regolatore nella trascrizione dei geni Se le Hsp fossero sovraespresse in
assenza di stress si legherebbero direttamente al dominio di trans-
attivazione di HSF-1 determinando cosigrave la sua soppressione Le Hsp
sono proteine ubiquitarie sia nelle cellule eucariote che in quelle
procariote Come suggerisce il nome le Hsp sono indotte in cellule
esposte al calore sebbene le proteine dello stress (Chaperoni) possono
essere attivate da alcuni differenti tipi di insulti facendo in modo che le
cellule sopravvivano in condizioni altrimenti letali La tabella 1 presenta
un sommario di queste proteine la loro locazione cellulare e la loro
funzione Le Hsp ad alto peso molecolare sono ATP-dipendenti mentre
le Hsp a basso peso molecolare agiscono in maniera ATP-indipendente
[6]
9
Tabella 1 Hsp umanepeso molecolare localizzazione e funzione
10
Ogni famiglia di Hsp egrave composta da membri espressi sia in maniera
costitutiva che induttiva e si rivolge a diversi scomparti subcellulari [7]
Lrsquoattivazione costitutiva delle Hsp puograve verificarsi nelle cellule anche in
assenza di fattori di stress ambientali Per esempio Hsp90 puograve costituire
fino allrsquo1 del totale delle proteine cellulari in cellule non stressate [3]
indicando che queste proteine hanno un ruolo nel mantenimento della
conformazione delle proteine anche in condizioni normali In
condizioni di stress i dimeri di Hsp90 tendono ad associarsi in tetra-
esa- e ottameri ed oligomeri ancora piugrave elevati [8] In condizioni
fisiologiche Hsp90 si trova in associazione con diverse proteine
intracellulari tra cui calmodulina actina tubulina diverse chinasi e
qualche proteina recettore [9] I componenti dei complessi di Hsp90
come proteine kinasi e recettori steroidei possono mediare il trasporto
nucleare dellrsquoHsp90 specialmente sotto stress da calore Probabilmente
Hsp90 forma complessi stabili con filamenti di actina e si lega alla
tubulina per proteggere i microtubuli quindi puograve mediare
lrsquoorganizzazione strutturale del proteasoma un complesso
multicatalitico quando i livelli di ATP cellulari diminuiscono [5] Allo
stesso modo Hsp27 tende a oligomerizzarsi in condizioni di stress ed egrave
stato precedentemente dimostrato che nelle cellule tumorali endogene
Hsp27 egrave la piugrave importante proteina argpirimidina modificata e che
questa modifica comporta lrsquooligomerizzazione di Hsp27 [10]
Argpirimidina egrave un addotto metilgliossale-arginina che risulta dalla
glicazione non enzimatica di residui di arginina delle proteine nelle
cellule tumorali mostrando un aumento della glicolisi [11] Hsp27 e
Hsp70 sono fortemente ed universalmente indotte da diverse
sollecitazioni mentre la loro espressione egrave bassa in condizioni
fisiologiche permettendo ad attivitagrave costitutive cellulari di procedere
11
[12] A prescindere dalla loro localizzazione intracellulare le Hsp70
sono state trovate anche sulla membrana plasmatica delle cellule
trasformate malignamente e nello spazio extracellulare [13] Hsp70
Hsp90 e la proteina GP96 chaperone residente nel reticolo
endoplasmatico (RE) appartenente alla famiglia di Hsp90 [14] sono
state trovate nel mezzo cellulare Questo mette in considerazione la
duplce funzione delle Hsp la funzione citoprotettivaantiapoptotica
intracellulare e la funzione immunogenica extracellulare [7] Le Hsp
intracellulari sono importanti in quanto assicurano il ripiegamento delle
proteine nella loro corretta struttra terziaria lrsquoincorporazione di
polipeptidi nelle membrane intracellulari o nel trasporto delle proteine
attreverso le membrane [9] mentre la funzione delle Hsp extracellulari egrave
immunogenica attreverso lo chaperoning di peptidi antigenici I membri
della famiglia di Hsp70 e Hsp90 sono stati rilevati nel mezzo delle
cellule presentanti lrsquoantigene (APC) Ersquo stato osservato che lrsquouptake di
complessi Hsp-peptidi da parte delle APC egrave specifico saturabile e
concentrazione dipendente e quindi egrave stata ipotizzata lrsquoesistenza di
recettori Hsp specifici [7] Quindi il potenziale coinvolgimento delle
Hsp in molti tipi di malattie le ha rese particolarmente importanti per lo
sviluppo di nuove terapie
12
CHAPERONINE MOLECOLARI E CONTROLLO
QUALITArsquo DELLE PROTEINE
Nelle cellule viventi sia le catene polipeptidiche di nuova sintesi che le
preesistenti sono a rischio costante di mal ripiegamento
(MISFOLDING) o aggregazione In conformitagrave con lrsquoampia diversitagrave di
forme mal ripiegate lrsquoelaborazione di strategie di controllo qualitagrave si
sono evolute per opporsi a questa inevitabile disavventura Recenti studi
descrivono la rimozione di aggregati dal citosol rivelano meccanismi di
controllo di qualitagrave per proteine nel reticolo endoplasmatico (RE) e
forniscono nuove intuizioni in due classi di chaperoni molecolari
lrsquoHsp70 (Heat Shock Protein 70) e lrsquoAAA+ (Hsp100) [15]
FOLDING DI PROTEINE NEL RETICOLO
ENDOPLASMATICO RICONOSCERE IL GIUSTO
DALLO SBAGLIATO
Il reticolo endoplasmatico (ER) un organulo presente sia nelle cellule
animali che vegetali svolge un ruolo premimente in numerosi processi
di fondamentale importanza per la sopravvivenza e per il normale
funzionamento cellulare LER occupa circa il 10 del volume della
cellula e la metagrave della superficie coperta da tutte le membrane della
cellula (endomembrane piugrave membrana plasmatica) [16]
Il reticolo endoplasmatico (RE) riveste numerose funzioni vitali per la
cellula Tra le tante egrave la stazione iniziale della via secretoria ed egrave quindi
il luogo nel quale circa un terzo di tutte le proteine di una cellula viene
sintetizzato e ripiegato correttamente [17] in secondo luogo lrsquoER egrave il
13
punto di partenza dal quale numerose proteine vengono smistate e
indirizzate verso la loro destinazione finale [18]
LrsquoER egrave quindi la sede della sintesi del ripiegamento (ldquofoldingrdquo) e delle
modificazioni post-traduzionali delle proteine di membrana e secrete ed
egrave responsabile della maturazione strutturale di un quarto del proteasoma
che attraversa le vie secretorie
Il ripiegamento delle proteine secretorie fornisce una serie di sfide
uniche in quanto egrave accompagnato e dipendente dalla formazione di ponti
disolfuro ed inserzioni nel doppio strato lipidico con entrambi gli eventi
che si verificano piugrave lentamente di tipici cambi conformazionali che
accompagnano il ripiegamento Conseguentemente il RE fornisce le
condizioni ottimali per fronteggiare queste sfide includendo unrsquoalta
concentrazione di chaperoni generici oltre a una gamma di specifiche
strategie fatte su misura per favorire il ripiegamento delle proteine
secretorie Inoltre esiste un sofisticato sistema di controllo-qualitagrave nel
RE per trattenere e riparare proteine che non hanno raggiunto ancora il
loro stato naturale Malgrado la lunghezza con la quale le cellule vanno
a fornire un ambiente ottimale nel RE il ripiegamento delle proteine
secretorie puograve avvenire o manca a volte ad un ritmo allarmante Il RE
adopera due meccanismi di risposta in presenza di forme mal ripegate Il
primo meccanismo egrave una risposta allo stress RE-dedicato definito UPR
(risposta alla non corretta conformazione delle proteine) che attua il
rimodellamento del RE cosigrave da aumentare la sua capacitagrave di
ripiegamento [16] Una proteina malfunzionante rimane sequestrata nel
reticolo endoplasmatico quindi un eccesso di proteine mal strutturate
attiva la risposta da proteine con folding scorretto (Unfolded Protein
Response) Questo tipo di risposta inizia con il riconoscimento del
segnale di stress da parte di un recettore nel reticolo endoplasmatico e
14
prosegue con il blocco della sintesi proteica per permettere al
proteasoma di eliminare lrsquoeccesso di proteine mentre viene stimolata la
produzione di fattori di trascrizione Il secondo meccanismo chiamato
degradazione RE-associata (ERAD) riconosce in modo specifico le
parti terminali di proteine mal ripiegate e le loro retrotraslocazioni
attraverso la membrana del reticolo endoplasmatico nel citosol dove
possono essere degradate dal sistema di degradazione ubiquitina-
proteosoma [17] Questi due meccanismi sono intimamente collegati
lrsquoinduzione UPR aumenta la capacitagrave dellrsquoERAD una diminuzione
dellrsquoERAD comporta unrsquoinduzione dellrsquoUPR costitutivo e
contemporaneamente la diminuzione di ERAD e UPR fa diminuire di
molto la viabilitagrave delle cellule I sistemi UPR ed ERAD fronteggiano
anche il comune problema del riconoscimento che richiede
lrsquoidentificazione delle forme mal ripiegate potenzialmente patologiche
nellrsquoambiente del RE La sorveglianza di UPR ed ERAD deve garantire
un buon equilibrio proteggendo le cellule dalle pericolose specie mal
ripiegate evitando la sovra vigilanza (come accade con forme mutate di
regolatori trans membrana della fibrosi cistica CFTR) che puograve portare
allrsquoeliminazione di forme potenzialmente sanabili Recenti studi hanno
rivelato come ERAD ed UPR identifichino forme mal ripiegate
Pertanto il RE rappresenta un preciso sistema di controllo di qualitagrave atto
ad assicurare che solo le proteine correttamente ripiegate e funzionanti
possano essere rilasciate dallrsquoER e raggiungere la loro destinazione
finale mentre le proteine malripiegate o non funzionanti sono trattenute
nel ER e in seguito traslocate nel citosol per la degradazione
15
RISPOSTA ALLA NON CORRETTA
CONFORMAZIONE DELLE PROTEINE
Le proteine designate per il riconoscimento dei segnali di stress
provenienti dal reticolo endoplasmatico sono generalmente IRE1
(Inositol Requiring Kinase 1) ATF6 (Activation of Transcription Factor
6) e PERK (PKR-like Endoplasmic Reticulum Kinase)
Nel lievito la capacitagrave di ripiegarsi del RE egrave monitorata da IRE1 una
chinasi trans membrana altamente conservata che contiene un dominio
luminale responsabile del riconoscimento delle forme mal ripiegate
chinasi citosoliche e domini ribonucleasici Lrsquoaccumularsi delle proteine
mal ripiegate nel RE porta allrsquoattivazione delle chinasi IRE
Lrsquoattivazione delle IRE-chinasi promuove lo splicing non convenzionale
dei messaggi per un fattore di traduzione b-ZIP (Hac1 nel lievito e XBP-
1 nei metazoi) attraverso il suo dominio ribonucleasico La traduzione
del messaggio Hac 1 spliced crea un fattore attivo di trascrizione che
media direttamente la trascrizione dei target di UPR includendo
chaperoni del RE macchinario ERAD e tante altre proteine secretorie
In aggiunta alla IRE-1 gli eucarioti piugrave sviluppati utilizzano due altri
sensori le chinasi trans membrana del RE PERK ed il fattore di
trascrizione trans membrana del RE ATF6 (Figura 2) PERK contiene
un sensore luminale che egrave altamente correlato a quello di IRE-1 il
dominio citoplasmatico di PERK consiste in una chinasi elF2α
16
Figura 2 Struttura dei principali sensori dello stress nel reticolo endoplasmatico IRE1
ATF6 PERK
Lrsquoattivazione delle chinasi dovuta alla presenza di proteine mal
ripiegate determina unrsquoinibizione generalizzata della traduzione come
pure la up-regulation del fattore di trascrizione specifico ATF4
Lrsquoaccumulo di proteine mal ripiegate permette inoltre ad ATF6 di
raggiungere lrsquoapparato del Golgi dove le proteasi trans membrana
rilasciano il dominio citoplasmatico del fattore di trascrizione
permettendogli di entrare nel nucleo e mediare lrsquoinduzione genetica
Lrsquoesistenza di molteplici sensori UPR negli eucarioti piugrave avanzati
permette per lo piugrave una risposta piugrave sfumata alle proteine mal ripiegate
Per esempio una risposta iniziale alle proteine mal ripiegate potrebbe
portare ad una down-regulation generalizzata della traduzione seguita in
sequenza da unrsquoinduzione di chaperoni lrsquoinduzione del macchinario
17
ERAD ed infine contro lo stress prolungato lrsquoattivazione della morte
cellulare tramite apoptosi Molto recentemente ci sono stati notevoli
progressi nelle nostre conoscenze molecolari di come IRE-1 (e per
deduzione PERK) riconosce le proteine mal ripiegate Studi precedenti
avevano dimostrato che BIP (Binding Immunoglobulin Protein) lrsquo
omologo principale delle Hsp70 presente nel reticolo endoplasmatico si
lega in modo specifico con IRE1 e che questa interazione scompare in
condizioni di stress del RE Inoltre lrsquoiperespressione di BiP puograve
sopprimere lrsquoinduzione dellrsquoUPR Questo aveva suggerito un modello di
titolazione in cui BiP agisce come un regolatore negativo di IRE1 e
lrsquoaccumularsi di forme mal ripiegate porta indirettamente allrsquoattivazione
dellrsquoIRE1 attraverso il sequestro di BiP da parte proteine mal ripiegate
Tuttavia recenti studi hanno dimostrato che anche se il legame del BiP
possa avere un ruolo importante nella down-regulation di IRE1 ci sono
altri fattori importanti Analisi mutazionali hanno trovato che la
delezione della regione di IRE1 responsabile del legame con BiP non
altera la regolazione di IRE1 in risposta alle proteine unfolded [18] Piugrave
drammaticamente la struttura cristallina del core del dominio luminale
conservato (cLD) di IRE1 nel lievito rivela una profonda scanalatura
idrofobica che ricorda la tasca legante dei maggiori complessi di
istocompatibilitagrave (MHCs) che sono i responsabili per il riconoscimento
peptidico Che IRE1 possa legarsi direttamente a polipeptidi mal
ripiegati egrave unrsquoidea interessante (Figura 3) [19]
18
Figura 3 Un modello ipotetico descrive lrsquoattivazione di Ire1 attraverso la oligomerizzazione
determinata dal legame di proteine unfolded (indicate in rosso) Le interazioni dirette o
indirette fra le catene delle proteine unfolded possono contribuire allrsquoattivazione Sul lato
luminale della membrana del RE le proteine unfolded si legano alla scanalatura (indicata in
grigio) formata dalla dimerizzazione del core del dominio luminale di Ire1 attraverso
linterfaccia 1 Sul lato citoplasmaticodella membrana del RE la oligmerizzazione accosta i
domini della chinasi Ire 1 che subiscono un cambiamento conformazionale in seguito ad
autofosforilazione che porta allrsquoattivazione della funzione di RNA-ribonucleasi di Ire1
Attraverso il riconoscimento diretto delle forme mal ripiegate
lrsquoinduzione di IRE1 potrebbe verificarsi prima della completa titolazione
di BiP che data lrsquoestrema abbondanza di questrsquoultimo nel RE potrebbe
verificarsi solo dopo un catastrofico accumulo di proteine mal ripiegate
Inoltre il riconoscimento diretto di forme mal ripiegate da parte di IRE1
(e PERK) potrebbe consentire una serie di risposte piugrave sfumate in cui
diverse forme mal ripiegate potrebbero essere preferenzialmente
riconosciute da sensori diversi quali BiP IRE1 o PERK Cosigrave in linea
di principio la natura (per esempio traslazionale contro transcrizionale)
ed il ciclo di UPR potrebbe essere su misura per la classe specifica di
forme mal ripiegate che sono prevalenti nel RE [20]
19
DEGRADAZIONE DELLE PROTEINE ASSOCIATA AL
RETICOLO ENDOPLASMATICO
Come ci si poteva aspettare dalla diversitagrave delle proteine che si
ripiegano NEL RE studi recenti hanno dimostrato che la degradazione
ER-associata (ER-Associated Degradation ERAD) comprende una
serie di sistemi diversi ciascuno responsabile della degradazione di
sottoinsiemi di proteine che condividono proprietagrave fisiche comuni
Esistono anche regioni dedicate allrsquo ER Associated Degradation
(ERAD) nelle quali proteine che non raggiungono il corretto
ripiegamento vengono retrotraslocate al citosol e quindi degradate dal
proteasoma [21]
Ciograve forse egrave piugrave chiaramente dimostrato nel lievito dove ci sono almeno
due distinti meccanismi di sorveglianza per identificare le proteine mal
ripiegate del RE Il primo meccanismo chiamato ERAD-L analizza le
proteine che contengono domini luminali mal ripiegati (solubili o trans
membrana) chiamati CPY una forma mutante della proteina CPY
endogena che egrave incapace di folding Il secondo denominato ERAD-C
rileva domini mal ripiegati citosolici di proteine trans membrana [22]
Sebbene entrambe queste vie in ultima analisi convergano sul sistema
di degradazione ubiquitina-proteosoma esse dipendono da diversi
insiemi di componenti RE-associati per rivelare e fornire specie mal
ripiegate al citosol Nel caso di ERAD-C (e non di ERAD-L) la
degradazione egrave in genere dipendente da uno specifico sottoinsieme di
chaperoni citosolici inclusi i membri Hsp40 e Hsp70 Ciograve suggerisce
che queste proteine possono essere direttamente responsabili per il
riconoscimento di domini citosolici mal ripiegati di proteine trans
membrana Tuttavia le caratteristiche esatte che vengono monitorate e
20
come i substrati vengano consegnati al macchinario di
retrotranslocazione restano importanti questioni aperte per la maggior
parte dei substrati Il riconoscimento di una proteina contenente un
dominio luminale mal ripiegato dipende in modo determinante dallo
stato di glicosilazione della proteina Infatti anche piccole modifiche di
glicani N-linked puograve provocare danni gravi nella degradazione di
numerosi substrati Questo puograve effettivamente lasciare le proteine in un
limbo impossibile raggiungere lo stato nativo ma non riconosciuto dal
macchinario ERAD esse restano mal ripiegate nel RE a tempo
indeterminato A prima vista questa dipendenza dalla glicosilazione
sembra essere un miglioramento non necessario Tuttavia egrave ormai chiaro
che lo spettro di porzioni di zucchero presenti in una proteina egrave un
segnale fondamentale nel marcare il suo status di ripiegamento Infatti
dato che diverse proteine altamente abbondanti nel RE tra cui BiP e
PDI spesso non sono glicosilate la presenza e la natura covalente di
molto mannosio in un polipeptide puograve fornire un segnale importante che
aiuta il macchinario di controllo-qualitagrave del RE a distinguere le specie
ripiegate destinate ad altri scomparti da quelle piugrave abbondanti e
permanenti del RE Lrsquointuizione nel ruolo della glicosilazione nella
discriminazione tra le specie in via di ripiegamento e le proteine
terminali mal ripiegate nel RE egrave venuta dalla constatazione che
glicoproteine mal ripiegate subiscono un taglio dei loro N-glicani da una
varietagrave di glicosidasi tra cui una mannossidasi specifica In aggiunta a
proteine mal ripiegate persistenti si egrave pensato che il rimodellamento
dipendente dal tempo di N-glicani porti ad un segnale per la
degradazione del macchinario ERAD Questo permette intermedi
ripiegati in un periodo di tempo prima del rimodellamento dei loro N-
glicani in cui il polipeptide egrave immune dalla sorveglianza ERAD Egrave
21
interessante notare che un recente studio suggerisce che anche per i
polipeptidi citosolici vi egrave un periodo durante e subito dopo la sintesi in
cui le specie mal ripiegate sono immuni alla degradazione del
proteasoma [23] Recenti studi hanno identificato due differenti lettine
localizzate nel RE che svolgono un ruolo critico nellrsquoERAD La prima egrave
correlata alla proteina mannossidasi responsabile del taglio di N-glicani
nel RE ma sembra aver perso la sua attivitagrave catalitica Nel lievito si
chiama Htm1pMnl1p e nei mammiferi egrave chiamato EDEM Studi
condotti su cellule di mammifero suggeriscono che EDEM aiuta le
glicoproteine mal ripiegate a lasciare il ciclo calnexinacalreticulina del
chaperone lectina dove stanno cercando di ripiegarsi e cosigrave entrare nel
ciclo di degradazione [24 ab] Tuttavia nel lievito Htm1p egrave richiesto
per la degradazione efficiente di substrati come CPY che non
dipendono da calnexina Quindi sembra probabile che Htm1pEDEM
ricopra altri ruoli in ERAD La seconda lectina Yos9p forma un
complesso stabile con proteine mal ripiegate e la perdita di questa
lectina conduce ad un profondo e specifico difetto nella degradazione di
glicoproteine mal ripiegate [25] Sorprendentemente mentre mutazioni
puntiformi nella tasca di Yos9p legante il mannosio eliminano la sua
capacitagrave di supportare ERAD i mutanti stessi di Yos9p mostrano una
maggior interazione con i substrati Ciograve indica la possibilitagrave che la
lectina Yos9p svolga un ruolo piugrave informativo interrogando lo stato
dello zucchero di forme mal ripiegate per determinare se debbano essere
passate al macchinario di retrotranslocazione Tuttavia come con
ERAD-C sebbene ci siano stati grandi progressi nella caratterizzazione
del macchinario di retrotranslocazione [26] le caratteristiche strutturali
delle proteine mal ripiegate sono in fase di monitoraggio e sono ancora
22
limitate le conoscenzedi come le forme mal ripiegate sono passate a
questo macchinario
CLEARENCE DI AGGREGATI ATTRAVERSO
LrsquoAUTOFAGIA
Egrave sempre piugrave evidente che ci sono una varietagrave di condizioni in vivo che
anche con chaperoni e macchinari proteolitici presenti nello stesso
compartimento come proteine mal ripiegate questi meccanismi di
controllo-qualitagrave falliscono e le proteine mal ripiegate avanzano
formando aggregati Inoltre tali aggregati intracellulari sono associati
con una serie di malattie neurodegenerative come il morbo di
Huntington e di Parkinson La natura e la sorte di aggregati di proteine
nelle cellule eucariotiche egrave stata poco compresa Recentemente egrave stata
sempre piugrave sostenuta unrsquoazione protettiva della formazione di aggregati
piuttosto che unrsquoimmediata azione patogena Per esempio nel caso del
morbo di Huntington lrsquoesame di cellule neuronali in coltura
sovrapproducenti una fusione di poliglutamina espansa e huntingtina-
GFP rivelano che queste cellule contenenti aggregati fluorescenti
morfologicamente visibili esibiscono una migliore viabilitagrave rispetto a
quelle aventi per via diffusionale materiale fluorescente [27] Questo
sembra in accordo con il concetto che si tratta di piccoli assemblati di
proteine mal ripiegate inclusioni non morfologicamente visibili che
esercitano effetti tossici sulle cellule Analogamente un recente
confronto delle dimensioni rispetto a tossicitagrave per gli aggregati di
proteina prionica PrP suggerisce che piccoli aggregati contenenti da una
a due dozzine di molecole sono risultati i piugrave tossici per le cellule [28]
23
Ma le cellule dispongono di meccanismi di compensazione per questi
piccoli aggregati Studi recenti hanno suggerito che la via ubiquitina-
proteosoma possa essere il pilastro della rimozione di specie inclini
allrsquoaggregazione Infatti gli aggregati rilevati nel contesto di
neurodegenerazione di solito sono reattivi con gli anticorpi anti-
ubiquitina il che implica che le specie mal ripiegate sono state
riconosciute dal sistema di coniugazione dellubiquitina Eppure vari
studi di questi ultimi anni indicano che queste proteine modificate
rappresentano una sfida particolare per proteasomi che possono portare
alla loro inibizione [29 ab] Il meccanismo di questa inattivazione
rimane sconosciuto ma puograve coinvolgere il soffocamento della camera
del proteasoma [30]
Anatomia del proteasoma Il proteasoma egrave una macromolecola proteica del peso di circa 2 milioni
di Daltons Ersquo formata da ununitagrave base centrale (core) e 2 cappucci agli estremi (cap) Il core egrave
formato a sua volta da 4 anelli ciascuno costituito da 7 unitagrave proteiche I due ldquocaprdquo attaccati alle
due estremitagrave del core cilindrico consistono ciascuno di 20 subunitagrave
24
Ora sembra che la modifica dellrsquoubiquitina possa reclutare specie
aggregate mediante una via indipendente lrsquoAUTOFAGIA Lrsquoautofagia
implica il riconoscimento e lrsquoimpacchettamentofagocitazione di
proteine specifiche o organelli in vescicole autofagosomiche che si
fondono con i lisosomi in cui sia le vescicole che il loro contenuto sono
scomposti Piugrave di 20 componenti cosiddetti Atg (geni coinvolti
nellrsquoautofagia) mediano questo processo straordinario Recenti studi
hanno dimostrato che componenti centrali della formazione di autosomi
nei topi hanno attivitagrave nei tessuti dei mammiferi Per esempio carenza
di atg5 ha portato alla morte di animali appena nati a causa
dellrsquoincapacitagrave di fornire un apporto di aminoacidi attraverso la
degradazione di proteine del corpo durante la condizione di fame
relativa allrsquoimmediato periodo post-natale Sorprendentemente in un
altro studio in cui egrave stata indotta una carenza di atg7 piugrave avanti nella
vita con un gene ldquofloxedrdquo lrsquoaccumulo di aggregati positivi
allrsquoubiquitina egrave stata osservata nel fegato degli animali che sono stati
disabilitati nella produzione di autofagosomi La funzione del
proteasoma in questi animali egrave rimasta inalterata contenente specie mal
ripiegate etichettate con ubiquitina e possono essere eliminate attraverso
autofagia Egrave stato poi scoperto un componente denominato p62 (o
sequestosoma1) che costituisce un guscio attorno agli aggregati di
huntingtina [31] Questa proteina contiene un dominio C-terminale
associato allrsquoubiquitina (UBA) che puograve legare poliubiquitine in modo
tale che p62 si collochi con lrsquoubiquitina quando espressa in cellule
HeLa Inoltre nelle cellule che esprimono huntigtina p62 si associa con
LC3 una proteina localizzata negli autofagosomi In accordo con quanto
riportato e cioegrave che lrsquoautofagia riduce i livelli di aggregati di
huntingtina e con un ruolo critico di p62 in questo processo lrsquoinibizione
25
antisenso mediata dallrsquoesperessione di p62 aumenta lrsquoapoptosi delle
cellule che esprimono huntungtina Quindi sembra che la modifica
dellrsquoubiquitina delle proteine difettose possa offrire un ingresso sia al
sistema proteasoma o in contesti dove lrsquoaggregazione egrave in corso al
sistema autofagia
SISTEMI CHAPERONI HSP70
Le Hsp70 proteine dello shock termico di 70 KDa sono impegnate in
una serie di processi tra cui il ripiegamento di proteine di nuova sintesi
il trasporto delle proteine attraverso membrane il ripiegamento di
proteine mal ripiegate ed aggregate e il controllo delle attivitagrave delle
proteine regolatrici Questa versatilitagrave egrave ottenuta attraverso
lampliamento e la diversificazione evolutiva di geni hsp70 che ha
generato sia chaperoni Hsp70 specifici Hsp110 e proteine Hsp170 La
versatilitagrave egrave determinata attraverso lrsquoimpiego di cochaperoni proteine J
e fattori di scambio di nucleotide (NEF) che regolano lrsquoattivitagrave di Hsp70
(Figura 4)
26
Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame
del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una
Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)
Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la
proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato
allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del
substrato
Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre
specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb
Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di
legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un
numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame
dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi
Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina
Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni
Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali
di Hsp70 con se stesso
27
INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70
Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di
proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura
xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding
appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide
N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD
adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio
elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con
lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante
chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco
tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini
di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di
comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura
di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione
La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la
tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo
coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture
precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una
proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da
una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β
ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica
compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio
elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di
legame del substrato (Figura 5)
28
Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo
substrato
La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra
domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che
collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo
solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi
residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame
allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A
dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso
Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un
legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in
nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano
completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve
entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo
fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui
coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del
segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti
integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A
29
capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il
quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di
ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a
idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di
DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro
catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente
arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia
drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete
crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la
barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK
costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina
superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura
della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera
attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della
prolina
DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-
NUCLEOTIDE
Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi
meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono
fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la
liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del
substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la
dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine
BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave
dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con
30
funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S
cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1
(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la
disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e
HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70
fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi
della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente
indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene
GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg
di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei
nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte
posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i
nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario
BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in
modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del
complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si
compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo
Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva
[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con
conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve
indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca
di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di
convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la
reazione di scambio nucleotidica di Hsp70
31
LEGAMI Hsp70-Hsp70
Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro
della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In
particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce
come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola
lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di
questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento
Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il
cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che
sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi
eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente
lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se
non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di
complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di
nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di
scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione
importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto
di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel
folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle
Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza
proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa
con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere
coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di
traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina
Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come
sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le
interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di
32
Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi
SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua
attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano
legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di
idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede
possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano
lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina
stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che
Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami
con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina
J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di
stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega
bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o
Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non
limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che
la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-
associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con
Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito
meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande
aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante
per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70
AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP
Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli
AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione
disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]
33
Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un
anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del
proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico
20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA
svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP
Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104
nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico
per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste
attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come
una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-
etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE
per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla
fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il
meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere
tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria
per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli
anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una
parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali
suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata
assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando
una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a
spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad
entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel
caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro
che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti
dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una
proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In
parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno
34
individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi
domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre
interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta
apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati
che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la
questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)
Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97
Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da
proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad
entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro
efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non
devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati
dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte
lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono
piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte
superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine
adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il
35
movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori
p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su
proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di
proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la
retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e
reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo
anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite
adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente
il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente
forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei
canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]
LrsquoAZIONE DELLrsquoATP
La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico
al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco
affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad
esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello
Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che
ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo
di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli
wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli
mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori
dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di
ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di
un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di
quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda
36
subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino
al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave
significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o
sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti
differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra
essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che
attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave
adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non
vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a
cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di
subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico
Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un
substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di
queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un
meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da
F1-ATPasi non sembra escluso
HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE
NEURODEGENERATIVE
RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE
Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel
mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una
pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi
associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione
37
di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di
Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta
promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]
Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90
nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave
funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi
permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]
HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico
Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono
mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)
accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock
citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata
da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante
di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo
stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si
lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei
geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-
shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via
multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di
transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-
translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90
[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e
mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo
shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con
Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)
38
attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da
shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni
Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che
i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro
sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock
termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su
attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato
che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi
di insulti
Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90
e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con
shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La
somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a
topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello
39
Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge
contro aggregati tossici
Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un
aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave
egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di
chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione
incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste
molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente
diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su
espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative
Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie
neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a
mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei
neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia
muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-
pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma
mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme
nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che
Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in
oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza
attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili
[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di
Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt
mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore
di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo
suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro
effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi
40
indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando
monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono
probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono
essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di
atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70
permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]
Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare
spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo
nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un
miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina
[62]
Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il
riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso
lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido
dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli
di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i
motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione
acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni
Riluzolo
Arimoclomol
41
Nei vari modelli cellulari della malattia di Alzheimer (AD) vi egrave un
incremento dei livelli di Hsp70 promossa dalla solubilitagrave e dal legame ai
microtubuli delle proteine tau [63] Hsp70 ha anche inibito la
propensione di aggregazione di Aβ [64] e ridotto la tossicitagrave di Aβ su
culture neuronali [65] Inoltre la proteina precursore dellrsquoamiloide
(APP) eo il suo Aβ amiloide derivato sono bersagli di chaperoni
mediati da clearence [66-67] Nella Drosophila melanogaster e nei
modelli di lievito della malattia di Parkinson (PD) lrsquoespressione diretta
di Hsp70 o la modulazione farmacologica di Hsp ha impedito la perdita
di neuroni causata da alfa-sinucleina [68-69] Huang et al hanno
riportato che questi effetti di Hsp70 si manifestano con lrsquoinibizione della
formazione di fibrille di alfa-sinucleina prevenendo la formazione di
alfa-sinucleina prefibrillare [70] Usando delezioni mutanti di alfa-
sinucleina Luk et al hanno indicato che le interazioni tra il dominio
legante il substrato Hsp70 e la regione del core idrofobico dellrsquoalfa-
sinucleina mediano lrsquoinibizione dellrsquoassemblaggio e che questo
processo di assemblaggio egrave inibito prima della fase di allungamento
[71] Nel complesso in diversi modelli di malattia neurodegenerativa la
sovra espressione di Hsp70 ha migliorato la gravitagrave della malattia di
fenotipi diversi senza incidere visibilmente sulla formazione di
aggregati suggerendo che i chaperoni non impediscono lrsquoaggregazione
di per seacute bensigrave reindirizzano gli aggregati preferibilmente in depositi
amorfi quindi sequestrando specie potenzialmente tossiche dalla
maggior parte della soluzione
42
Lrsquoespressione di Hsp70 e di altre Hsp egrave indotta dallrsquoinibizione
farmacologica di Hsp90
Come riportato sopra lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal
complesso con Hsp90 con susseguente produzione di Hsp (Figura 7) e
lrsquoinduzione di Hsp70 da parte di inibitori di Hsp90 egrave ben documentata
nei modelli di malattie neurodegenerative La geldanamicina (GM) un
inibitore di Hsp90 induce un aumento dose dipendente di Hsp70 nei
modelli di cellule di AD (Alzhaimer) cosigrave come nei neuroni della
corteccia primaria del ratto e riduce la quantitagrave di tau insolubili e dei
livelli basali di acido okadaico indotto da tau fosforilazione [63] Il
trattamento di neuroni primari corticali con lrsquoinibitore di Hsp90 con
struttura purinica il PU24FCI ha portato ad un aumento di Hsp70 dose-
dipendente [72]
PU24FCI
KU32
43
Allo stesso modo la somministrazione di due derivati di PU24FCI
CNS-permeabili il PU-DZ8 [72] ed il EC102 [73] a topi tau transgenici
(htau e JNPL3) ha determinato induzione di Hsp70 nel cervello e
mantenuto gli effetti per 24 ore dopo la somministrazione KU32 un
inibitore di Hsp90 di diversa natura chimica ha indotto Hsp70 in culture
SH-SY5Y di neuroblastoma e la ha protetta da tossicitagrave indotta da Aβ
GM ha attivato una risposta da shock termico ed inibito lrsquoaggregazione
di htt in un modello di coltura cellulare di HD ed ha indotto Hsp70 in
maniera tempo e concentrazione-dipendente ed ha impedito
lrsquoaggregazione di alfa-sinucleina e protetto contro la tossicitagrave in un
modello di aggregazione cellulare di alfa-sinucleina Auluck et al hanno
segnalato che il trattamento di un modello volante di PD con GM ha
protetto completamente contro tossicitagrave per alfa-sinucleina [74] GM ha
protetto anche contro la neurotossicitagrave dopaminergica indotta da 1-metil-
4-fenil-1236-tetraidropiridina (MPTP) in un modello di topo di PD Il
pretrattamento con GM mediante iniezione ventricolare intracerebrale
prima del trattamento con MPTP ha indotto le Hsp70 ed incrementato il
contenuto residuale di dopamina e lrsquoimmuno reattivitagrave della tirosina
idrolasi nel corpo striato [75] Lrsquoinduzione di Hsp70 nel midollo spinale
egrave stata osservata in seguito ad iniezione intraperitoneale di un derivato
della GM il 17-AAG in un modello di SBMA topo [76] Il 17-AAG egrave
stato anche efficace contro la nuerodegenerazione in altre malattie
poliQ Vale a dire ha soppresso la degenerazione dellrsquoocchio e la
formazione di inclusioni del corpo e salvato dalla letalitagrave in un modello
di SCA di Drosophila Ha inoltre soppresso la neurodegenerazione in un
modello volante di HD La riduzione di HSF-1 ha abolito lrsquoinduzione di
chaperoni molecolari e gli effeti terapeutici di 17-AAG sulla
neurodegenerazione poliQ indotta nei modelli di Drosophila facendo
44
arguire che lrsquoeffetto terapeutico di 17-AAG egrave essenzialmente mediato da
HSF-1 [77] Riassumendo lrsquoattivazione di HSF-1 da inibitori di Hsp90
egrave stata notata specificamente in modelli in vivo ed in vitro di malattie
neurodegenerative suggerendo che lrsquoinibizione di Hsp90 puograve essere un
mezzo per modulare i livelli di Hsp in cervelli malati con lrsquoobbiettivo di
proteggere contro le proteine tossiche che si presentano nel corso del
processo neurodegenerativo
Lrsquoinibizione di Hsp90 riduce lrsquoattivitagrave e lrsquoespressione di proteine
neuronali aberranti
In aggiunta alla regolazione di HSF-1 evidenze recenti suggeriscono un
ruolo addizionale per Hsp90 nel mantenimento della stabilitagrave funzionale
della capacitagrave aberrante di proteine neuronali (Figura 8A)
La SBMA egrave una malattia ereditaria dei motoneuroni causata
dallrsquoaccrescimento di un tratto di poliglutamina allrsquointerno del recettore
androgeno (AR) [57]
Le caratteristiche patologiche di SBMA sono perdita dei motoneuroni
nel midollo spinale e nel tronco cerebrale diffusione dellrsquoaccumulo
nucleare inclusioni nucleari di mutanti AR (mAR) nei motoneuroni
residui e in alcuni organi viscerali Waza et al hanno dimostrato che
mAR presente in SBMA egrave una delle proteine regolate da Hsp90 (Figura
8A) [76]
45
Figura 8 Le Hsp90 riparano le proteine neuronali aberranti (A) Proteine neuronali
aberranti regolate da Hsp90 (B) Lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90porta allrsquoinattivazione
o degradazione delle proteine regulate da Hsp90 probabilmente attraverso la via del
proteasoma
Le Hsp90 formano un complesso molecolare con mAR per il
mantenimento della sua stabilitagrave funzionale Sia in modelli cellulari di
SBMA che in topi transgenici lrsquoinibizione di Hsp90 da parte di 17-
AAG il derivato 17 allilammino-17-demetossi della geldanamicina ha
46
portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal
macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati
disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da
destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione
dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di
SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave
rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati
[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori
hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo
sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa
(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni
Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]
Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo
egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali
sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al
hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina
(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi
familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un
complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data
da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto
47
lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della
stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave
dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita
neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei
neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che
codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a
PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson
familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson
suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente
associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che
Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate
con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente
diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina
egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille
ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno
recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di
alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che
sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina
[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce
lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari
Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-
dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento
tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-
sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da
chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di
mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il
macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD
associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-
48
sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative
caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave
caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di
tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD
lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da
unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina
chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta
(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si
era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero
netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un
gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e
Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave
causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma
17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau
[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine
neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso
portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina
mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da
Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei
modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave
patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-
dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla
settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad
una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di
tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno
dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una
diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di
AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le
49
relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la
degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90
[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al
(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave
stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da
GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β
effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi
GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di
Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe
portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in
strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati
indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone
biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione
di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da
parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi
proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di
queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)
Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie
neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio
approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare
dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la
formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione
potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di
Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare
terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare
malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo
centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90
puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione
50
successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti
neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti
clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto
che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono
tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in
modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni
nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati
promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio
spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in
modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di
Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a
lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse
da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase
esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora
rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori
dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per
mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie
neurodegenerative
51
SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-
ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-
METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE
(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE
MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO
SULLA FRAMMENTAZIONE
Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in
risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta
nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine
regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il
ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai
loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine
client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro
cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire
su molti percorsi oncogenici
Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il
nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che
lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati
composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP
attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del
processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono
emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i
tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule
normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina
(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una
maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto
che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una
piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
8
essere attivati da specifici stress diversi Nonostante siano stati scoperti
varie HSF HSF-1 ha dimostrato di essere il regolatore principale di una
breve induzione termica di Hsp Le Hsp giocano un importante ruolo
regolatore nella trascrizione dei geni Se le Hsp fossero sovraespresse in
assenza di stress si legherebbero direttamente al dominio di trans-
attivazione di HSF-1 determinando cosigrave la sua soppressione Le Hsp
sono proteine ubiquitarie sia nelle cellule eucariote che in quelle
procariote Come suggerisce il nome le Hsp sono indotte in cellule
esposte al calore sebbene le proteine dello stress (Chaperoni) possono
essere attivate da alcuni differenti tipi di insulti facendo in modo che le
cellule sopravvivano in condizioni altrimenti letali La tabella 1 presenta
un sommario di queste proteine la loro locazione cellulare e la loro
funzione Le Hsp ad alto peso molecolare sono ATP-dipendenti mentre
le Hsp a basso peso molecolare agiscono in maniera ATP-indipendente
[6]
9
Tabella 1 Hsp umanepeso molecolare localizzazione e funzione
10
Ogni famiglia di Hsp egrave composta da membri espressi sia in maniera
costitutiva che induttiva e si rivolge a diversi scomparti subcellulari [7]
Lrsquoattivazione costitutiva delle Hsp puograve verificarsi nelle cellule anche in
assenza di fattori di stress ambientali Per esempio Hsp90 puograve costituire
fino allrsquo1 del totale delle proteine cellulari in cellule non stressate [3]
indicando che queste proteine hanno un ruolo nel mantenimento della
conformazione delle proteine anche in condizioni normali In
condizioni di stress i dimeri di Hsp90 tendono ad associarsi in tetra-
esa- e ottameri ed oligomeri ancora piugrave elevati [8] In condizioni
fisiologiche Hsp90 si trova in associazione con diverse proteine
intracellulari tra cui calmodulina actina tubulina diverse chinasi e
qualche proteina recettore [9] I componenti dei complessi di Hsp90
come proteine kinasi e recettori steroidei possono mediare il trasporto
nucleare dellrsquoHsp90 specialmente sotto stress da calore Probabilmente
Hsp90 forma complessi stabili con filamenti di actina e si lega alla
tubulina per proteggere i microtubuli quindi puograve mediare
lrsquoorganizzazione strutturale del proteasoma un complesso
multicatalitico quando i livelli di ATP cellulari diminuiscono [5] Allo
stesso modo Hsp27 tende a oligomerizzarsi in condizioni di stress ed egrave
stato precedentemente dimostrato che nelle cellule tumorali endogene
Hsp27 egrave la piugrave importante proteina argpirimidina modificata e che
questa modifica comporta lrsquooligomerizzazione di Hsp27 [10]
Argpirimidina egrave un addotto metilgliossale-arginina che risulta dalla
glicazione non enzimatica di residui di arginina delle proteine nelle
cellule tumorali mostrando un aumento della glicolisi [11] Hsp27 e
Hsp70 sono fortemente ed universalmente indotte da diverse
sollecitazioni mentre la loro espressione egrave bassa in condizioni
fisiologiche permettendo ad attivitagrave costitutive cellulari di procedere
11
[12] A prescindere dalla loro localizzazione intracellulare le Hsp70
sono state trovate anche sulla membrana plasmatica delle cellule
trasformate malignamente e nello spazio extracellulare [13] Hsp70
Hsp90 e la proteina GP96 chaperone residente nel reticolo
endoplasmatico (RE) appartenente alla famiglia di Hsp90 [14] sono
state trovate nel mezzo cellulare Questo mette in considerazione la
duplce funzione delle Hsp la funzione citoprotettivaantiapoptotica
intracellulare e la funzione immunogenica extracellulare [7] Le Hsp
intracellulari sono importanti in quanto assicurano il ripiegamento delle
proteine nella loro corretta struttra terziaria lrsquoincorporazione di
polipeptidi nelle membrane intracellulari o nel trasporto delle proteine
attreverso le membrane [9] mentre la funzione delle Hsp extracellulari egrave
immunogenica attreverso lo chaperoning di peptidi antigenici I membri
della famiglia di Hsp70 e Hsp90 sono stati rilevati nel mezzo delle
cellule presentanti lrsquoantigene (APC) Ersquo stato osservato che lrsquouptake di
complessi Hsp-peptidi da parte delle APC egrave specifico saturabile e
concentrazione dipendente e quindi egrave stata ipotizzata lrsquoesistenza di
recettori Hsp specifici [7] Quindi il potenziale coinvolgimento delle
Hsp in molti tipi di malattie le ha rese particolarmente importanti per lo
sviluppo di nuove terapie
12
CHAPERONINE MOLECOLARI E CONTROLLO
QUALITArsquo DELLE PROTEINE
Nelle cellule viventi sia le catene polipeptidiche di nuova sintesi che le
preesistenti sono a rischio costante di mal ripiegamento
(MISFOLDING) o aggregazione In conformitagrave con lrsquoampia diversitagrave di
forme mal ripiegate lrsquoelaborazione di strategie di controllo qualitagrave si
sono evolute per opporsi a questa inevitabile disavventura Recenti studi
descrivono la rimozione di aggregati dal citosol rivelano meccanismi di
controllo di qualitagrave per proteine nel reticolo endoplasmatico (RE) e
forniscono nuove intuizioni in due classi di chaperoni molecolari
lrsquoHsp70 (Heat Shock Protein 70) e lrsquoAAA+ (Hsp100) [15]
FOLDING DI PROTEINE NEL RETICOLO
ENDOPLASMATICO RICONOSCERE IL GIUSTO
DALLO SBAGLIATO
Il reticolo endoplasmatico (ER) un organulo presente sia nelle cellule
animali che vegetali svolge un ruolo premimente in numerosi processi
di fondamentale importanza per la sopravvivenza e per il normale
funzionamento cellulare LER occupa circa il 10 del volume della
cellula e la metagrave della superficie coperta da tutte le membrane della
cellula (endomembrane piugrave membrana plasmatica) [16]
Il reticolo endoplasmatico (RE) riveste numerose funzioni vitali per la
cellula Tra le tante egrave la stazione iniziale della via secretoria ed egrave quindi
il luogo nel quale circa un terzo di tutte le proteine di una cellula viene
sintetizzato e ripiegato correttamente [17] in secondo luogo lrsquoER egrave il
13
punto di partenza dal quale numerose proteine vengono smistate e
indirizzate verso la loro destinazione finale [18]
LrsquoER egrave quindi la sede della sintesi del ripiegamento (ldquofoldingrdquo) e delle
modificazioni post-traduzionali delle proteine di membrana e secrete ed
egrave responsabile della maturazione strutturale di un quarto del proteasoma
che attraversa le vie secretorie
Il ripiegamento delle proteine secretorie fornisce una serie di sfide
uniche in quanto egrave accompagnato e dipendente dalla formazione di ponti
disolfuro ed inserzioni nel doppio strato lipidico con entrambi gli eventi
che si verificano piugrave lentamente di tipici cambi conformazionali che
accompagnano il ripiegamento Conseguentemente il RE fornisce le
condizioni ottimali per fronteggiare queste sfide includendo unrsquoalta
concentrazione di chaperoni generici oltre a una gamma di specifiche
strategie fatte su misura per favorire il ripiegamento delle proteine
secretorie Inoltre esiste un sofisticato sistema di controllo-qualitagrave nel
RE per trattenere e riparare proteine che non hanno raggiunto ancora il
loro stato naturale Malgrado la lunghezza con la quale le cellule vanno
a fornire un ambiente ottimale nel RE il ripiegamento delle proteine
secretorie puograve avvenire o manca a volte ad un ritmo allarmante Il RE
adopera due meccanismi di risposta in presenza di forme mal ripegate Il
primo meccanismo egrave una risposta allo stress RE-dedicato definito UPR
(risposta alla non corretta conformazione delle proteine) che attua il
rimodellamento del RE cosigrave da aumentare la sua capacitagrave di
ripiegamento [16] Una proteina malfunzionante rimane sequestrata nel
reticolo endoplasmatico quindi un eccesso di proteine mal strutturate
attiva la risposta da proteine con folding scorretto (Unfolded Protein
Response) Questo tipo di risposta inizia con il riconoscimento del
segnale di stress da parte di un recettore nel reticolo endoplasmatico e
14
prosegue con il blocco della sintesi proteica per permettere al
proteasoma di eliminare lrsquoeccesso di proteine mentre viene stimolata la
produzione di fattori di trascrizione Il secondo meccanismo chiamato
degradazione RE-associata (ERAD) riconosce in modo specifico le
parti terminali di proteine mal ripiegate e le loro retrotraslocazioni
attraverso la membrana del reticolo endoplasmatico nel citosol dove
possono essere degradate dal sistema di degradazione ubiquitina-
proteosoma [17] Questi due meccanismi sono intimamente collegati
lrsquoinduzione UPR aumenta la capacitagrave dellrsquoERAD una diminuzione
dellrsquoERAD comporta unrsquoinduzione dellrsquoUPR costitutivo e
contemporaneamente la diminuzione di ERAD e UPR fa diminuire di
molto la viabilitagrave delle cellule I sistemi UPR ed ERAD fronteggiano
anche il comune problema del riconoscimento che richiede
lrsquoidentificazione delle forme mal ripiegate potenzialmente patologiche
nellrsquoambiente del RE La sorveglianza di UPR ed ERAD deve garantire
un buon equilibrio proteggendo le cellule dalle pericolose specie mal
ripiegate evitando la sovra vigilanza (come accade con forme mutate di
regolatori trans membrana della fibrosi cistica CFTR) che puograve portare
allrsquoeliminazione di forme potenzialmente sanabili Recenti studi hanno
rivelato come ERAD ed UPR identifichino forme mal ripiegate
Pertanto il RE rappresenta un preciso sistema di controllo di qualitagrave atto
ad assicurare che solo le proteine correttamente ripiegate e funzionanti
possano essere rilasciate dallrsquoER e raggiungere la loro destinazione
finale mentre le proteine malripiegate o non funzionanti sono trattenute
nel ER e in seguito traslocate nel citosol per la degradazione
15
RISPOSTA ALLA NON CORRETTA
CONFORMAZIONE DELLE PROTEINE
Le proteine designate per il riconoscimento dei segnali di stress
provenienti dal reticolo endoplasmatico sono generalmente IRE1
(Inositol Requiring Kinase 1) ATF6 (Activation of Transcription Factor
6) e PERK (PKR-like Endoplasmic Reticulum Kinase)
Nel lievito la capacitagrave di ripiegarsi del RE egrave monitorata da IRE1 una
chinasi trans membrana altamente conservata che contiene un dominio
luminale responsabile del riconoscimento delle forme mal ripiegate
chinasi citosoliche e domini ribonucleasici Lrsquoaccumularsi delle proteine
mal ripiegate nel RE porta allrsquoattivazione delle chinasi IRE
Lrsquoattivazione delle IRE-chinasi promuove lo splicing non convenzionale
dei messaggi per un fattore di traduzione b-ZIP (Hac1 nel lievito e XBP-
1 nei metazoi) attraverso il suo dominio ribonucleasico La traduzione
del messaggio Hac 1 spliced crea un fattore attivo di trascrizione che
media direttamente la trascrizione dei target di UPR includendo
chaperoni del RE macchinario ERAD e tante altre proteine secretorie
In aggiunta alla IRE-1 gli eucarioti piugrave sviluppati utilizzano due altri
sensori le chinasi trans membrana del RE PERK ed il fattore di
trascrizione trans membrana del RE ATF6 (Figura 2) PERK contiene
un sensore luminale che egrave altamente correlato a quello di IRE-1 il
dominio citoplasmatico di PERK consiste in una chinasi elF2α
16
Figura 2 Struttura dei principali sensori dello stress nel reticolo endoplasmatico IRE1
ATF6 PERK
Lrsquoattivazione delle chinasi dovuta alla presenza di proteine mal
ripiegate determina unrsquoinibizione generalizzata della traduzione come
pure la up-regulation del fattore di trascrizione specifico ATF4
Lrsquoaccumulo di proteine mal ripiegate permette inoltre ad ATF6 di
raggiungere lrsquoapparato del Golgi dove le proteasi trans membrana
rilasciano il dominio citoplasmatico del fattore di trascrizione
permettendogli di entrare nel nucleo e mediare lrsquoinduzione genetica
Lrsquoesistenza di molteplici sensori UPR negli eucarioti piugrave avanzati
permette per lo piugrave una risposta piugrave sfumata alle proteine mal ripiegate
Per esempio una risposta iniziale alle proteine mal ripiegate potrebbe
portare ad una down-regulation generalizzata della traduzione seguita in
sequenza da unrsquoinduzione di chaperoni lrsquoinduzione del macchinario
17
ERAD ed infine contro lo stress prolungato lrsquoattivazione della morte
cellulare tramite apoptosi Molto recentemente ci sono stati notevoli
progressi nelle nostre conoscenze molecolari di come IRE-1 (e per
deduzione PERK) riconosce le proteine mal ripiegate Studi precedenti
avevano dimostrato che BIP (Binding Immunoglobulin Protein) lrsquo
omologo principale delle Hsp70 presente nel reticolo endoplasmatico si
lega in modo specifico con IRE1 e che questa interazione scompare in
condizioni di stress del RE Inoltre lrsquoiperespressione di BiP puograve
sopprimere lrsquoinduzione dellrsquoUPR Questo aveva suggerito un modello di
titolazione in cui BiP agisce come un regolatore negativo di IRE1 e
lrsquoaccumularsi di forme mal ripiegate porta indirettamente allrsquoattivazione
dellrsquoIRE1 attraverso il sequestro di BiP da parte proteine mal ripiegate
Tuttavia recenti studi hanno dimostrato che anche se il legame del BiP
possa avere un ruolo importante nella down-regulation di IRE1 ci sono
altri fattori importanti Analisi mutazionali hanno trovato che la
delezione della regione di IRE1 responsabile del legame con BiP non
altera la regolazione di IRE1 in risposta alle proteine unfolded [18] Piugrave
drammaticamente la struttura cristallina del core del dominio luminale
conservato (cLD) di IRE1 nel lievito rivela una profonda scanalatura
idrofobica che ricorda la tasca legante dei maggiori complessi di
istocompatibilitagrave (MHCs) che sono i responsabili per il riconoscimento
peptidico Che IRE1 possa legarsi direttamente a polipeptidi mal
ripiegati egrave unrsquoidea interessante (Figura 3) [19]
18
Figura 3 Un modello ipotetico descrive lrsquoattivazione di Ire1 attraverso la oligomerizzazione
determinata dal legame di proteine unfolded (indicate in rosso) Le interazioni dirette o
indirette fra le catene delle proteine unfolded possono contribuire allrsquoattivazione Sul lato
luminale della membrana del RE le proteine unfolded si legano alla scanalatura (indicata in
grigio) formata dalla dimerizzazione del core del dominio luminale di Ire1 attraverso
linterfaccia 1 Sul lato citoplasmaticodella membrana del RE la oligmerizzazione accosta i
domini della chinasi Ire 1 che subiscono un cambiamento conformazionale in seguito ad
autofosforilazione che porta allrsquoattivazione della funzione di RNA-ribonucleasi di Ire1
Attraverso il riconoscimento diretto delle forme mal ripiegate
lrsquoinduzione di IRE1 potrebbe verificarsi prima della completa titolazione
di BiP che data lrsquoestrema abbondanza di questrsquoultimo nel RE potrebbe
verificarsi solo dopo un catastrofico accumulo di proteine mal ripiegate
Inoltre il riconoscimento diretto di forme mal ripiegate da parte di IRE1
(e PERK) potrebbe consentire una serie di risposte piugrave sfumate in cui
diverse forme mal ripiegate potrebbero essere preferenzialmente
riconosciute da sensori diversi quali BiP IRE1 o PERK Cosigrave in linea
di principio la natura (per esempio traslazionale contro transcrizionale)
ed il ciclo di UPR potrebbe essere su misura per la classe specifica di
forme mal ripiegate che sono prevalenti nel RE [20]
19
DEGRADAZIONE DELLE PROTEINE ASSOCIATA AL
RETICOLO ENDOPLASMATICO
Come ci si poteva aspettare dalla diversitagrave delle proteine che si
ripiegano NEL RE studi recenti hanno dimostrato che la degradazione
ER-associata (ER-Associated Degradation ERAD) comprende una
serie di sistemi diversi ciascuno responsabile della degradazione di
sottoinsiemi di proteine che condividono proprietagrave fisiche comuni
Esistono anche regioni dedicate allrsquo ER Associated Degradation
(ERAD) nelle quali proteine che non raggiungono il corretto
ripiegamento vengono retrotraslocate al citosol e quindi degradate dal
proteasoma [21]
Ciograve forse egrave piugrave chiaramente dimostrato nel lievito dove ci sono almeno
due distinti meccanismi di sorveglianza per identificare le proteine mal
ripiegate del RE Il primo meccanismo chiamato ERAD-L analizza le
proteine che contengono domini luminali mal ripiegati (solubili o trans
membrana) chiamati CPY una forma mutante della proteina CPY
endogena che egrave incapace di folding Il secondo denominato ERAD-C
rileva domini mal ripiegati citosolici di proteine trans membrana [22]
Sebbene entrambe queste vie in ultima analisi convergano sul sistema
di degradazione ubiquitina-proteosoma esse dipendono da diversi
insiemi di componenti RE-associati per rivelare e fornire specie mal
ripiegate al citosol Nel caso di ERAD-C (e non di ERAD-L) la
degradazione egrave in genere dipendente da uno specifico sottoinsieme di
chaperoni citosolici inclusi i membri Hsp40 e Hsp70 Ciograve suggerisce
che queste proteine possono essere direttamente responsabili per il
riconoscimento di domini citosolici mal ripiegati di proteine trans
membrana Tuttavia le caratteristiche esatte che vengono monitorate e
20
come i substrati vengano consegnati al macchinario di
retrotranslocazione restano importanti questioni aperte per la maggior
parte dei substrati Il riconoscimento di una proteina contenente un
dominio luminale mal ripiegato dipende in modo determinante dallo
stato di glicosilazione della proteina Infatti anche piccole modifiche di
glicani N-linked puograve provocare danni gravi nella degradazione di
numerosi substrati Questo puograve effettivamente lasciare le proteine in un
limbo impossibile raggiungere lo stato nativo ma non riconosciuto dal
macchinario ERAD esse restano mal ripiegate nel RE a tempo
indeterminato A prima vista questa dipendenza dalla glicosilazione
sembra essere un miglioramento non necessario Tuttavia egrave ormai chiaro
che lo spettro di porzioni di zucchero presenti in una proteina egrave un
segnale fondamentale nel marcare il suo status di ripiegamento Infatti
dato che diverse proteine altamente abbondanti nel RE tra cui BiP e
PDI spesso non sono glicosilate la presenza e la natura covalente di
molto mannosio in un polipeptide puograve fornire un segnale importante che
aiuta il macchinario di controllo-qualitagrave del RE a distinguere le specie
ripiegate destinate ad altri scomparti da quelle piugrave abbondanti e
permanenti del RE Lrsquointuizione nel ruolo della glicosilazione nella
discriminazione tra le specie in via di ripiegamento e le proteine
terminali mal ripiegate nel RE egrave venuta dalla constatazione che
glicoproteine mal ripiegate subiscono un taglio dei loro N-glicani da una
varietagrave di glicosidasi tra cui una mannossidasi specifica In aggiunta a
proteine mal ripiegate persistenti si egrave pensato che il rimodellamento
dipendente dal tempo di N-glicani porti ad un segnale per la
degradazione del macchinario ERAD Questo permette intermedi
ripiegati in un periodo di tempo prima del rimodellamento dei loro N-
glicani in cui il polipeptide egrave immune dalla sorveglianza ERAD Egrave
21
interessante notare che un recente studio suggerisce che anche per i
polipeptidi citosolici vi egrave un periodo durante e subito dopo la sintesi in
cui le specie mal ripiegate sono immuni alla degradazione del
proteasoma [23] Recenti studi hanno identificato due differenti lettine
localizzate nel RE che svolgono un ruolo critico nellrsquoERAD La prima egrave
correlata alla proteina mannossidasi responsabile del taglio di N-glicani
nel RE ma sembra aver perso la sua attivitagrave catalitica Nel lievito si
chiama Htm1pMnl1p e nei mammiferi egrave chiamato EDEM Studi
condotti su cellule di mammifero suggeriscono che EDEM aiuta le
glicoproteine mal ripiegate a lasciare il ciclo calnexinacalreticulina del
chaperone lectina dove stanno cercando di ripiegarsi e cosigrave entrare nel
ciclo di degradazione [24 ab] Tuttavia nel lievito Htm1p egrave richiesto
per la degradazione efficiente di substrati come CPY che non
dipendono da calnexina Quindi sembra probabile che Htm1pEDEM
ricopra altri ruoli in ERAD La seconda lectina Yos9p forma un
complesso stabile con proteine mal ripiegate e la perdita di questa
lectina conduce ad un profondo e specifico difetto nella degradazione di
glicoproteine mal ripiegate [25] Sorprendentemente mentre mutazioni
puntiformi nella tasca di Yos9p legante il mannosio eliminano la sua
capacitagrave di supportare ERAD i mutanti stessi di Yos9p mostrano una
maggior interazione con i substrati Ciograve indica la possibilitagrave che la
lectina Yos9p svolga un ruolo piugrave informativo interrogando lo stato
dello zucchero di forme mal ripiegate per determinare se debbano essere
passate al macchinario di retrotranslocazione Tuttavia come con
ERAD-C sebbene ci siano stati grandi progressi nella caratterizzazione
del macchinario di retrotranslocazione [26] le caratteristiche strutturali
delle proteine mal ripiegate sono in fase di monitoraggio e sono ancora
22
limitate le conoscenzedi come le forme mal ripiegate sono passate a
questo macchinario
CLEARENCE DI AGGREGATI ATTRAVERSO
LrsquoAUTOFAGIA
Egrave sempre piugrave evidente che ci sono una varietagrave di condizioni in vivo che
anche con chaperoni e macchinari proteolitici presenti nello stesso
compartimento come proteine mal ripiegate questi meccanismi di
controllo-qualitagrave falliscono e le proteine mal ripiegate avanzano
formando aggregati Inoltre tali aggregati intracellulari sono associati
con una serie di malattie neurodegenerative come il morbo di
Huntington e di Parkinson La natura e la sorte di aggregati di proteine
nelle cellule eucariotiche egrave stata poco compresa Recentemente egrave stata
sempre piugrave sostenuta unrsquoazione protettiva della formazione di aggregati
piuttosto che unrsquoimmediata azione patogena Per esempio nel caso del
morbo di Huntington lrsquoesame di cellule neuronali in coltura
sovrapproducenti una fusione di poliglutamina espansa e huntingtina-
GFP rivelano che queste cellule contenenti aggregati fluorescenti
morfologicamente visibili esibiscono una migliore viabilitagrave rispetto a
quelle aventi per via diffusionale materiale fluorescente [27] Questo
sembra in accordo con il concetto che si tratta di piccoli assemblati di
proteine mal ripiegate inclusioni non morfologicamente visibili che
esercitano effetti tossici sulle cellule Analogamente un recente
confronto delle dimensioni rispetto a tossicitagrave per gli aggregati di
proteina prionica PrP suggerisce che piccoli aggregati contenenti da una
a due dozzine di molecole sono risultati i piugrave tossici per le cellule [28]
23
Ma le cellule dispongono di meccanismi di compensazione per questi
piccoli aggregati Studi recenti hanno suggerito che la via ubiquitina-
proteosoma possa essere il pilastro della rimozione di specie inclini
allrsquoaggregazione Infatti gli aggregati rilevati nel contesto di
neurodegenerazione di solito sono reattivi con gli anticorpi anti-
ubiquitina il che implica che le specie mal ripiegate sono state
riconosciute dal sistema di coniugazione dellubiquitina Eppure vari
studi di questi ultimi anni indicano che queste proteine modificate
rappresentano una sfida particolare per proteasomi che possono portare
alla loro inibizione [29 ab] Il meccanismo di questa inattivazione
rimane sconosciuto ma puograve coinvolgere il soffocamento della camera
del proteasoma [30]
Anatomia del proteasoma Il proteasoma egrave una macromolecola proteica del peso di circa 2 milioni
di Daltons Ersquo formata da ununitagrave base centrale (core) e 2 cappucci agli estremi (cap) Il core egrave
formato a sua volta da 4 anelli ciascuno costituito da 7 unitagrave proteiche I due ldquocaprdquo attaccati alle
due estremitagrave del core cilindrico consistono ciascuno di 20 subunitagrave
24
Ora sembra che la modifica dellrsquoubiquitina possa reclutare specie
aggregate mediante una via indipendente lrsquoAUTOFAGIA Lrsquoautofagia
implica il riconoscimento e lrsquoimpacchettamentofagocitazione di
proteine specifiche o organelli in vescicole autofagosomiche che si
fondono con i lisosomi in cui sia le vescicole che il loro contenuto sono
scomposti Piugrave di 20 componenti cosiddetti Atg (geni coinvolti
nellrsquoautofagia) mediano questo processo straordinario Recenti studi
hanno dimostrato che componenti centrali della formazione di autosomi
nei topi hanno attivitagrave nei tessuti dei mammiferi Per esempio carenza
di atg5 ha portato alla morte di animali appena nati a causa
dellrsquoincapacitagrave di fornire un apporto di aminoacidi attraverso la
degradazione di proteine del corpo durante la condizione di fame
relativa allrsquoimmediato periodo post-natale Sorprendentemente in un
altro studio in cui egrave stata indotta una carenza di atg7 piugrave avanti nella
vita con un gene ldquofloxedrdquo lrsquoaccumulo di aggregati positivi
allrsquoubiquitina egrave stata osservata nel fegato degli animali che sono stati
disabilitati nella produzione di autofagosomi La funzione del
proteasoma in questi animali egrave rimasta inalterata contenente specie mal
ripiegate etichettate con ubiquitina e possono essere eliminate attraverso
autofagia Egrave stato poi scoperto un componente denominato p62 (o
sequestosoma1) che costituisce un guscio attorno agli aggregati di
huntingtina [31] Questa proteina contiene un dominio C-terminale
associato allrsquoubiquitina (UBA) che puograve legare poliubiquitine in modo
tale che p62 si collochi con lrsquoubiquitina quando espressa in cellule
HeLa Inoltre nelle cellule che esprimono huntigtina p62 si associa con
LC3 una proteina localizzata negli autofagosomi In accordo con quanto
riportato e cioegrave che lrsquoautofagia riduce i livelli di aggregati di
huntingtina e con un ruolo critico di p62 in questo processo lrsquoinibizione
25
antisenso mediata dallrsquoesperessione di p62 aumenta lrsquoapoptosi delle
cellule che esprimono huntungtina Quindi sembra che la modifica
dellrsquoubiquitina delle proteine difettose possa offrire un ingresso sia al
sistema proteasoma o in contesti dove lrsquoaggregazione egrave in corso al
sistema autofagia
SISTEMI CHAPERONI HSP70
Le Hsp70 proteine dello shock termico di 70 KDa sono impegnate in
una serie di processi tra cui il ripiegamento di proteine di nuova sintesi
il trasporto delle proteine attraverso membrane il ripiegamento di
proteine mal ripiegate ed aggregate e il controllo delle attivitagrave delle
proteine regolatrici Questa versatilitagrave egrave ottenuta attraverso
lampliamento e la diversificazione evolutiva di geni hsp70 che ha
generato sia chaperoni Hsp70 specifici Hsp110 e proteine Hsp170 La
versatilitagrave egrave determinata attraverso lrsquoimpiego di cochaperoni proteine J
e fattori di scambio di nucleotide (NEF) che regolano lrsquoattivitagrave di Hsp70
(Figura 4)
26
Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame
del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una
Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)
Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la
proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato
allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del
substrato
Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre
specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb
Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di
legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un
numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame
dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi
Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina
Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni
Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali
di Hsp70 con se stesso
27
INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70
Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di
proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura
xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding
appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide
N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD
adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio
elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con
lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante
chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco
tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini
di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di
comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura
di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione
La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la
tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo
coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture
precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una
proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da
una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β
ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica
compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio
elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di
legame del substrato (Figura 5)
28
Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo
substrato
La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra
domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che
collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo
solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi
residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame
allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A
dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso
Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un
legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in
nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano
completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve
entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo
fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui
coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del
segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti
integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A
29
capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il
quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di
ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a
idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di
DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro
catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente
arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia
drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete
crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la
barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK
costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina
superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura
della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera
attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della
prolina
DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-
NUCLEOTIDE
Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi
meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono
fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la
liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del
substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la
dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine
BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave
dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con
30
funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S
cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1
(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la
disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e
HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70
fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi
della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente
indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene
GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg
di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei
nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte
posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i
nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario
BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in
modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del
complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si
compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo
Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva
[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con
conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve
indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca
di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di
convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la
reazione di scambio nucleotidica di Hsp70
31
LEGAMI Hsp70-Hsp70
Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro
della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In
particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce
come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola
lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di
questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento
Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il
cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che
sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi
eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente
lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se
non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di
complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di
nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di
scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione
importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto
di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel
folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle
Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza
proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa
con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere
coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di
traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina
Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come
sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le
interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di
32
Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi
SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua
attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano
legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di
idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede
possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano
lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina
stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che
Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami
con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina
J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di
stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega
bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o
Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non
limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che
la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-
associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con
Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito
meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande
aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante
per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70
AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP
Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli
AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione
disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]
33
Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un
anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del
proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico
20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA
svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP
Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104
nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico
per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste
attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come
una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-
etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE
per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla
fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il
meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere
tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria
per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli
anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una
parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali
suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata
assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando
una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a
spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad
entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel
caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro
che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti
dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una
proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In
parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno
34
individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi
domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre
interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta
apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati
che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la
questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)
Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97
Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da
proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad
entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro
efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non
devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati
dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte
lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono
piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte
superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine
adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il
35
movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori
p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su
proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di
proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la
retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e
reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo
anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite
adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente
il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente
forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei
canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]
LrsquoAZIONE DELLrsquoATP
La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico
al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco
affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad
esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello
Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che
ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo
di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli
wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli
mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori
dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di
ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di
un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di
quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda
36
subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino
al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave
significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o
sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti
differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra
essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che
attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave
adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non
vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a
cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di
subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico
Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un
substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di
queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un
meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da
F1-ATPasi non sembra escluso
HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE
NEURODEGENERATIVE
RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE
Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel
mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una
pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi
associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione
37
di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di
Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta
promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]
Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90
nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave
funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi
permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]
HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico
Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono
mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)
accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock
citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata
da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante
di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo
stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si
lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei
geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-
shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via
multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di
transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-
translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90
[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e
mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo
shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con
Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)
38
attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da
shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni
Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che
i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro
sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock
termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su
attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato
che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi
di insulti
Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90
e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con
shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La
somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a
topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello
39
Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge
contro aggregati tossici
Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un
aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave
egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di
chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione
incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste
molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente
diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su
espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative
Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie
neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a
mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei
neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia
muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-
pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma
mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme
nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che
Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in
oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza
attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili
[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di
Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt
mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore
di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo
suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro
effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi
40
indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando
monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono
probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono
essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di
atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70
permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]
Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare
spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo
nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un
miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina
[62]
Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il
riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso
lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido
dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli
di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i
motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione
acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni
Riluzolo
Arimoclomol
41
Nei vari modelli cellulari della malattia di Alzheimer (AD) vi egrave un
incremento dei livelli di Hsp70 promossa dalla solubilitagrave e dal legame ai
microtubuli delle proteine tau [63] Hsp70 ha anche inibito la
propensione di aggregazione di Aβ [64] e ridotto la tossicitagrave di Aβ su
culture neuronali [65] Inoltre la proteina precursore dellrsquoamiloide
(APP) eo il suo Aβ amiloide derivato sono bersagli di chaperoni
mediati da clearence [66-67] Nella Drosophila melanogaster e nei
modelli di lievito della malattia di Parkinson (PD) lrsquoespressione diretta
di Hsp70 o la modulazione farmacologica di Hsp ha impedito la perdita
di neuroni causata da alfa-sinucleina [68-69] Huang et al hanno
riportato che questi effetti di Hsp70 si manifestano con lrsquoinibizione della
formazione di fibrille di alfa-sinucleina prevenendo la formazione di
alfa-sinucleina prefibrillare [70] Usando delezioni mutanti di alfa-
sinucleina Luk et al hanno indicato che le interazioni tra il dominio
legante il substrato Hsp70 e la regione del core idrofobico dellrsquoalfa-
sinucleina mediano lrsquoinibizione dellrsquoassemblaggio e che questo
processo di assemblaggio egrave inibito prima della fase di allungamento
[71] Nel complesso in diversi modelli di malattia neurodegenerativa la
sovra espressione di Hsp70 ha migliorato la gravitagrave della malattia di
fenotipi diversi senza incidere visibilmente sulla formazione di
aggregati suggerendo che i chaperoni non impediscono lrsquoaggregazione
di per seacute bensigrave reindirizzano gli aggregati preferibilmente in depositi
amorfi quindi sequestrando specie potenzialmente tossiche dalla
maggior parte della soluzione
42
Lrsquoespressione di Hsp70 e di altre Hsp egrave indotta dallrsquoinibizione
farmacologica di Hsp90
Come riportato sopra lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal
complesso con Hsp90 con susseguente produzione di Hsp (Figura 7) e
lrsquoinduzione di Hsp70 da parte di inibitori di Hsp90 egrave ben documentata
nei modelli di malattie neurodegenerative La geldanamicina (GM) un
inibitore di Hsp90 induce un aumento dose dipendente di Hsp70 nei
modelli di cellule di AD (Alzhaimer) cosigrave come nei neuroni della
corteccia primaria del ratto e riduce la quantitagrave di tau insolubili e dei
livelli basali di acido okadaico indotto da tau fosforilazione [63] Il
trattamento di neuroni primari corticali con lrsquoinibitore di Hsp90 con
struttura purinica il PU24FCI ha portato ad un aumento di Hsp70 dose-
dipendente [72]
PU24FCI
KU32
43
Allo stesso modo la somministrazione di due derivati di PU24FCI
CNS-permeabili il PU-DZ8 [72] ed il EC102 [73] a topi tau transgenici
(htau e JNPL3) ha determinato induzione di Hsp70 nel cervello e
mantenuto gli effetti per 24 ore dopo la somministrazione KU32 un
inibitore di Hsp90 di diversa natura chimica ha indotto Hsp70 in culture
SH-SY5Y di neuroblastoma e la ha protetta da tossicitagrave indotta da Aβ
GM ha attivato una risposta da shock termico ed inibito lrsquoaggregazione
di htt in un modello di coltura cellulare di HD ed ha indotto Hsp70 in
maniera tempo e concentrazione-dipendente ed ha impedito
lrsquoaggregazione di alfa-sinucleina e protetto contro la tossicitagrave in un
modello di aggregazione cellulare di alfa-sinucleina Auluck et al hanno
segnalato che il trattamento di un modello volante di PD con GM ha
protetto completamente contro tossicitagrave per alfa-sinucleina [74] GM ha
protetto anche contro la neurotossicitagrave dopaminergica indotta da 1-metil-
4-fenil-1236-tetraidropiridina (MPTP) in un modello di topo di PD Il
pretrattamento con GM mediante iniezione ventricolare intracerebrale
prima del trattamento con MPTP ha indotto le Hsp70 ed incrementato il
contenuto residuale di dopamina e lrsquoimmuno reattivitagrave della tirosina
idrolasi nel corpo striato [75] Lrsquoinduzione di Hsp70 nel midollo spinale
egrave stata osservata in seguito ad iniezione intraperitoneale di un derivato
della GM il 17-AAG in un modello di SBMA topo [76] Il 17-AAG egrave
stato anche efficace contro la nuerodegenerazione in altre malattie
poliQ Vale a dire ha soppresso la degenerazione dellrsquoocchio e la
formazione di inclusioni del corpo e salvato dalla letalitagrave in un modello
di SCA di Drosophila Ha inoltre soppresso la neurodegenerazione in un
modello volante di HD La riduzione di HSF-1 ha abolito lrsquoinduzione di
chaperoni molecolari e gli effeti terapeutici di 17-AAG sulla
neurodegenerazione poliQ indotta nei modelli di Drosophila facendo
44
arguire che lrsquoeffetto terapeutico di 17-AAG egrave essenzialmente mediato da
HSF-1 [77] Riassumendo lrsquoattivazione di HSF-1 da inibitori di Hsp90
egrave stata notata specificamente in modelli in vivo ed in vitro di malattie
neurodegenerative suggerendo che lrsquoinibizione di Hsp90 puograve essere un
mezzo per modulare i livelli di Hsp in cervelli malati con lrsquoobbiettivo di
proteggere contro le proteine tossiche che si presentano nel corso del
processo neurodegenerativo
Lrsquoinibizione di Hsp90 riduce lrsquoattivitagrave e lrsquoespressione di proteine
neuronali aberranti
In aggiunta alla regolazione di HSF-1 evidenze recenti suggeriscono un
ruolo addizionale per Hsp90 nel mantenimento della stabilitagrave funzionale
della capacitagrave aberrante di proteine neuronali (Figura 8A)
La SBMA egrave una malattia ereditaria dei motoneuroni causata
dallrsquoaccrescimento di un tratto di poliglutamina allrsquointerno del recettore
androgeno (AR) [57]
Le caratteristiche patologiche di SBMA sono perdita dei motoneuroni
nel midollo spinale e nel tronco cerebrale diffusione dellrsquoaccumulo
nucleare inclusioni nucleari di mutanti AR (mAR) nei motoneuroni
residui e in alcuni organi viscerali Waza et al hanno dimostrato che
mAR presente in SBMA egrave una delle proteine regolate da Hsp90 (Figura
8A) [76]
45
Figura 8 Le Hsp90 riparano le proteine neuronali aberranti (A) Proteine neuronali
aberranti regolate da Hsp90 (B) Lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90porta allrsquoinattivazione
o degradazione delle proteine regulate da Hsp90 probabilmente attraverso la via del
proteasoma
Le Hsp90 formano un complesso molecolare con mAR per il
mantenimento della sua stabilitagrave funzionale Sia in modelli cellulari di
SBMA che in topi transgenici lrsquoinibizione di Hsp90 da parte di 17-
AAG il derivato 17 allilammino-17-demetossi della geldanamicina ha
46
portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal
macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati
disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da
destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione
dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di
SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave
rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati
[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori
hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo
sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa
(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni
Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]
Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo
egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali
sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al
hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina
(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi
familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un
complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data
da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto
47
lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della
stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave
dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita
neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei
neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che
codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a
PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson
familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson
suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente
associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che
Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate
con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente
diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina
egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille
ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno
recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di
alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che
sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina
[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce
lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari
Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-
dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento
tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-
sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da
chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di
mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il
macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD
associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-
48
sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative
caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave
caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di
tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD
lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da
unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina
chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta
(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si
era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero
netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un
gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e
Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave
causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma
17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau
[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine
neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso
portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina
mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da
Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei
modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave
patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-
dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla
settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad
una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di
tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno
dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una
diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di
AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le
49
relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la
degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90
[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al
(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave
stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da
GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β
effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi
GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di
Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe
portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in
strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati
indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone
biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione
di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da
parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi
proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di
queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)
Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie
neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio
approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare
dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la
formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione
potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di
Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare
terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare
malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo
centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90
puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione
50
successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti
neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti
clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto
che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono
tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in
modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni
nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati
promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio
spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in
modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di
Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a
lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse
da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase
esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora
rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori
dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per
mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie
neurodegenerative
51
SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-
ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-
METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE
(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE
MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO
SULLA FRAMMENTAZIONE
Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in
risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta
nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine
regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il
ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai
loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine
client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro
cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire
su molti percorsi oncogenici
Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il
nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che
lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati
composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP
attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del
processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono
emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i
tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule
normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina
(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una
maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto
che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una
piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
9
Tabella 1 Hsp umanepeso molecolare localizzazione e funzione
10
Ogni famiglia di Hsp egrave composta da membri espressi sia in maniera
costitutiva che induttiva e si rivolge a diversi scomparti subcellulari [7]
Lrsquoattivazione costitutiva delle Hsp puograve verificarsi nelle cellule anche in
assenza di fattori di stress ambientali Per esempio Hsp90 puograve costituire
fino allrsquo1 del totale delle proteine cellulari in cellule non stressate [3]
indicando che queste proteine hanno un ruolo nel mantenimento della
conformazione delle proteine anche in condizioni normali In
condizioni di stress i dimeri di Hsp90 tendono ad associarsi in tetra-
esa- e ottameri ed oligomeri ancora piugrave elevati [8] In condizioni
fisiologiche Hsp90 si trova in associazione con diverse proteine
intracellulari tra cui calmodulina actina tubulina diverse chinasi e
qualche proteina recettore [9] I componenti dei complessi di Hsp90
come proteine kinasi e recettori steroidei possono mediare il trasporto
nucleare dellrsquoHsp90 specialmente sotto stress da calore Probabilmente
Hsp90 forma complessi stabili con filamenti di actina e si lega alla
tubulina per proteggere i microtubuli quindi puograve mediare
lrsquoorganizzazione strutturale del proteasoma un complesso
multicatalitico quando i livelli di ATP cellulari diminuiscono [5] Allo
stesso modo Hsp27 tende a oligomerizzarsi in condizioni di stress ed egrave
stato precedentemente dimostrato che nelle cellule tumorali endogene
Hsp27 egrave la piugrave importante proteina argpirimidina modificata e che
questa modifica comporta lrsquooligomerizzazione di Hsp27 [10]
Argpirimidina egrave un addotto metilgliossale-arginina che risulta dalla
glicazione non enzimatica di residui di arginina delle proteine nelle
cellule tumorali mostrando un aumento della glicolisi [11] Hsp27 e
Hsp70 sono fortemente ed universalmente indotte da diverse
sollecitazioni mentre la loro espressione egrave bassa in condizioni
fisiologiche permettendo ad attivitagrave costitutive cellulari di procedere
11
[12] A prescindere dalla loro localizzazione intracellulare le Hsp70
sono state trovate anche sulla membrana plasmatica delle cellule
trasformate malignamente e nello spazio extracellulare [13] Hsp70
Hsp90 e la proteina GP96 chaperone residente nel reticolo
endoplasmatico (RE) appartenente alla famiglia di Hsp90 [14] sono
state trovate nel mezzo cellulare Questo mette in considerazione la
duplce funzione delle Hsp la funzione citoprotettivaantiapoptotica
intracellulare e la funzione immunogenica extracellulare [7] Le Hsp
intracellulari sono importanti in quanto assicurano il ripiegamento delle
proteine nella loro corretta struttra terziaria lrsquoincorporazione di
polipeptidi nelle membrane intracellulari o nel trasporto delle proteine
attreverso le membrane [9] mentre la funzione delle Hsp extracellulari egrave
immunogenica attreverso lo chaperoning di peptidi antigenici I membri
della famiglia di Hsp70 e Hsp90 sono stati rilevati nel mezzo delle
cellule presentanti lrsquoantigene (APC) Ersquo stato osservato che lrsquouptake di
complessi Hsp-peptidi da parte delle APC egrave specifico saturabile e
concentrazione dipendente e quindi egrave stata ipotizzata lrsquoesistenza di
recettori Hsp specifici [7] Quindi il potenziale coinvolgimento delle
Hsp in molti tipi di malattie le ha rese particolarmente importanti per lo
sviluppo di nuove terapie
12
CHAPERONINE MOLECOLARI E CONTROLLO
QUALITArsquo DELLE PROTEINE
Nelle cellule viventi sia le catene polipeptidiche di nuova sintesi che le
preesistenti sono a rischio costante di mal ripiegamento
(MISFOLDING) o aggregazione In conformitagrave con lrsquoampia diversitagrave di
forme mal ripiegate lrsquoelaborazione di strategie di controllo qualitagrave si
sono evolute per opporsi a questa inevitabile disavventura Recenti studi
descrivono la rimozione di aggregati dal citosol rivelano meccanismi di
controllo di qualitagrave per proteine nel reticolo endoplasmatico (RE) e
forniscono nuove intuizioni in due classi di chaperoni molecolari
lrsquoHsp70 (Heat Shock Protein 70) e lrsquoAAA+ (Hsp100) [15]
FOLDING DI PROTEINE NEL RETICOLO
ENDOPLASMATICO RICONOSCERE IL GIUSTO
DALLO SBAGLIATO
Il reticolo endoplasmatico (ER) un organulo presente sia nelle cellule
animali che vegetali svolge un ruolo premimente in numerosi processi
di fondamentale importanza per la sopravvivenza e per il normale
funzionamento cellulare LER occupa circa il 10 del volume della
cellula e la metagrave della superficie coperta da tutte le membrane della
cellula (endomembrane piugrave membrana plasmatica) [16]
Il reticolo endoplasmatico (RE) riveste numerose funzioni vitali per la
cellula Tra le tante egrave la stazione iniziale della via secretoria ed egrave quindi
il luogo nel quale circa un terzo di tutte le proteine di una cellula viene
sintetizzato e ripiegato correttamente [17] in secondo luogo lrsquoER egrave il
13
punto di partenza dal quale numerose proteine vengono smistate e
indirizzate verso la loro destinazione finale [18]
LrsquoER egrave quindi la sede della sintesi del ripiegamento (ldquofoldingrdquo) e delle
modificazioni post-traduzionali delle proteine di membrana e secrete ed
egrave responsabile della maturazione strutturale di un quarto del proteasoma
che attraversa le vie secretorie
Il ripiegamento delle proteine secretorie fornisce una serie di sfide
uniche in quanto egrave accompagnato e dipendente dalla formazione di ponti
disolfuro ed inserzioni nel doppio strato lipidico con entrambi gli eventi
che si verificano piugrave lentamente di tipici cambi conformazionali che
accompagnano il ripiegamento Conseguentemente il RE fornisce le
condizioni ottimali per fronteggiare queste sfide includendo unrsquoalta
concentrazione di chaperoni generici oltre a una gamma di specifiche
strategie fatte su misura per favorire il ripiegamento delle proteine
secretorie Inoltre esiste un sofisticato sistema di controllo-qualitagrave nel
RE per trattenere e riparare proteine che non hanno raggiunto ancora il
loro stato naturale Malgrado la lunghezza con la quale le cellule vanno
a fornire un ambiente ottimale nel RE il ripiegamento delle proteine
secretorie puograve avvenire o manca a volte ad un ritmo allarmante Il RE
adopera due meccanismi di risposta in presenza di forme mal ripegate Il
primo meccanismo egrave una risposta allo stress RE-dedicato definito UPR
(risposta alla non corretta conformazione delle proteine) che attua il
rimodellamento del RE cosigrave da aumentare la sua capacitagrave di
ripiegamento [16] Una proteina malfunzionante rimane sequestrata nel
reticolo endoplasmatico quindi un eccesso di proteine mal strutturate
attiva la risposta da proteine con folding scorretto (Unfolded Protein
Response) Questo tipo di risposta inizia con il riconoscimento del
segnale di stress da parte di un recettore nel reticolo endoplasmatico e
14
prosegue con il blocco della sintesi proteica per permettere al
proteasoma di eliminare lrsquoeccesso di proteine mentre viene stimolata la
produzione di fattori di trascrizione Il secondo meccanismo chiamato
degradazione RE-associata (ERAD) riconosce in modo specifico le
parti terminali di proteine mal ripiegate e le loro retrotraslocazioni
attraverso la membrana del reticolo endoplasmatico nel citosol dove
possono essere degradate dal sistema di degradazione ubiquitina-
proteosoma [17] Questi due meccanismi sono intimamente collegati
lrsquoinduzione UPR aumenta la capacitagrave dellrsquoERAD una diminuzione
dellrsquoERAD comporta unrsquoinduzione dellrsquoUPR costitutivo e
contemporaneamente la diminuzione di ERAD e UPR fa diminuire di
molto la viabilitagrave delle cellule I sistemi UPR ed ERAD fronteggiano
anche il comune problema del riconoscimento che richiede
lrsquoidentificazione delle forme mal ripiegate potenzialmente patologiche
nellrsquoambiente del RE La sorveglianza di UPR ed ERAD deve garantire
un buon equilibrio proteggendo le cellule dalle pericolose specie mal
ripiegate evitando la sovra vigilanza (come accade con forme mutate di
regolatori trans membrana della fibrosi cistica CFTR) che puograve portare
allrsquoeliminazione di forme potenzialmente sanabili Recenti studi hanno
rivelato come ERAD ed UPR identifichino forme mal ripiegate
Pertanto il RE rappresenta un preciso sistema di controllo di qualitagrave atto
ad assicurare che solo le proteine correttamente ripiegate e funzionanti
possano essere rilasciate dallrsquoER e raggiungere la loro destinazione
finale mentre le proteine malripiegate o non funzionanti sono trattenute
nel ER e in seguito traslocate nel citosol per la degradazione
15
RISPOSTA ALLA NON CORRETTA
CONFORMAZIONE DELLE PROTEINE
Le proteine designate per il riconoscimento dei segnali di stress
provenienti dal reticolo endoplasmatico sono generalmente IRE1
(Inositol Requiring Kinase 1) ATF6 (Activation of Transcription Factor
6) e PERK (PKR-like Endoplasmic Reticulum Kinase)
Nel lievito la capacitagrave di ripiegarsi del RE egrave monitorata da IRE1 una
chinasi trans membrana altamente conservata che contiene un dominio
luminale responsabile del riconoscimento delle forme mal ripiegate
chinasi citosoliche e domini ribonucleasici Lrsquoaccumularsi delle proteine
mal ripiegate nel RE porta allrsquoattivazione delle chinasi IRE
Lrsquoattivazione delle IRE-chinasi promuove lo splicing non convenzionale
dei messaggi per un fattore di traduzione b-ZIP (Hac1 nel lievito e XBP-
1 nei metazoi) attraverso il suo dominio ribonucleasico La traduzione
del messaggio Hac 1 spliced crea un fattore attivo di trascrizione che
media direttamente la trascrizione dei target di UPR includendo
chaperoni del RE macchinario ERAD e tante altre proteine secretorie
In aggiunta alla IRE-1 gli eucarioti piugrave sviluppati utilizzano due altri
sensori le chinasi trans membrana del RE PERK ed il fattore di
trascrizione trans membrana del RE ATF6 (Figura 2) PERK contiene
un sensore luminale che egrave altamente correlato a quello di IRE-1 il
dominio citoplasmatico di PERK consiste in una chinasi elF2α
16
Figura 2 Struttura dei principali sensori dello stress nel reticolo endoplasmatico IRE1
ATF6 PERK
Lrsquoattivazione delle chinasi dovuta alla presenza di proteine mal
ripiegate determina unrsquoinibizione generalizzata della traduzione come
pure la up-regulation del fattore di trascrizione specifico ATF4
Lrsquoaccumulo di proteine mal ripiegate permette inoltre ad ATF6 di
raggiungere lrsquoapparato del Golgi dove le proteasi trans membrana
rilasciano il dominio citoplasmatico del fattore di trascrizione
permettendogli di entrare nel nucleo e mediare lrsquoinduzione genetica
Lrsquoesistenza di molteplici sensori UPR negli eucarioti piugrave avanzati
permette per lo piugrave una risposta piugrave sfumata alle proteine mal ripiegate
Per esempio una risposta iniziale alle proteine mal ripiegate potrebbe
portare ad una down-regulation generalizzata della traduzione seguita in
sequenza da unrsquoinduzione di chaperoni lrsquoinduzione del macchinario
17
ERAD ed infine contro lo stress prolungato lrsquoattivazione della morte
cellulare tramite apoptosi Molto recentemente ci sono stati notevoli
progressi nelle nostre conoscenze molecolari di come IRE-1 (e per
deduzione PERK) riconosce le proteine mal ripiegate Studi precedenti
avevano dimostrato che BIP (Binding Immunoglobulin Protein) lrsquo
omologo principale delle Hsp70 presente nel reticolo endoplasmatico si
lega in modo specifico con IRE1 e che questa interazione scompare in
condizioni di stress del RE Inoltre lrsquoiperespressione di BiP puograve
sopprimere lrsquoinduzione dellrsquoUPR Questo aveva suggerito un modello di
titolazione in cui BiP agisce come un regolatore negativo di IRE1 e
lrsquoaccumularsi di forme mal ripiegate porta indirettamente allrsquoattivazione
dellrsquoIRE1 attraverso il sequestro di BiP da parte proteine mal ripiegate
Tuttavia recenti studi hanno dimostrato che anche se il legame del BiP
possa avere un ruolo importante nella down-regulation di IRE1 ci sono
altri fattori importanti Analisi mutazionali hanno trovato che la
delezione della regione di IRE1 responsabile del legame con BiP non
altera la regolazione di IRE1 in risposta alle proteine unfolded [18] Piugrave
drammaticamente la struttura cristallina del core del dominio luminale
conservato (cLD) di IRE1 nel lievito rivela una profonda scanalatura
idrofobica che ricorda la tasca legante dei maggiori complessi di
istocompatibilitagrave (MHCs) che sono i responsabili per il riconoscimento
peptidico Che IRE1 possa legarsi direttamente a polipeptidi mal
ripiegati egrave unrsquoidea interessante (Figura 3) [19]
18
Figura 3 Un modello ipotetico descrive lrsquoattivazione di Ire1 attraverso la oligomerizzazione
determinata dal legame di proteine unfolded (indicate in rosso) Le interazioni dirette o
indirette fra le catene delle proteine unfolded possono contribuire allrsquoattivazione Sul lato
luminale della membrana del RE le proteine unfolded si legano alla scanalatura (indicata in
grigio) formata dalla dimerizzazione del core del dominio luminale di Ire1 attraverso
linterfaccia 1 Sul lato citoplasmaticodella membrana del RE la oligmerizzazione accosta i
domini della chinasi Ire 1 che subiscono un cambiamento conformazionale in seguito ad
autofosforilazione che porta allrsquoattivazione della funzione di RNA-ribonucleasi di Ire1
Attraverso il riconoscimento diretto delle forme mal ripiegate
lrsquoinduzione di IRE1 potrebbe verificarsi prima della completa titolazione
di BiP che data lrsquoestrema abbondanza di questrsquoultimo nel RE potrebbe
verificarsi solo dopo un catastrofico accumulo di proteine mal ripiegate
Inoltre il riconoscimento diretto di forme mal ripiegate da parte di IRE1
(e PERK) potrebbe consentire una serie di risposte piugrave sfumate in cui
diverse forme mal ripiegate potrebbero essere preferenzialmente
riconosciute da sensori diversi quali BiP IRE1 o PERK Cosigrave in linea
di principio la natura (per esempio traslazionale contro transcrizionale)
ed il ciclo di UPR potrebbe essere su misura per la classe specifica di
forme mal ripiegate che sono prevalenti nel RE [20]
19
DEGRADAZIONE DELLE PROTEINE ASSOCIATA AL
RETICOLO ENDOPLASMATICO
Come ci si poteva aspettare dalla diversitagrave delle proteine che si
ripiegano NEL RE studi recenti hanno dimostrato che la degradazione
ER-associata (ER-Associated Degradation ERAD) comprende una
serie di sistemi diversi ciascuno responsabile della degradazione di
sottoinsiemi di proteine che condividono proprietagrave fisiche comuni
Esistono anche regioni dedicate allrsquo ER Associated Degradation
(ERAD) nelle quali proteine che non raggiungono il corretto
ripiegamento vengono retrotraslocate al citosol e quindi degradate dal
proteasoma [21]
Ciograve forse egrave piugrave chiaramente dimostrato nel lievito dove ci sono almeno
due distinti meccanismi di sorveglianza per identificare le proteine mal
ripiegate del RE Il primo meccanismo chiamato ERAD-L analizza le
proteine che contengono domini luminali mal ripiegati (solubili o trans
membrana) chiamati CPY una forma mutante della proteina CPY
endogena che egrave incapace di folding Il secondo denominato ERAD-C
rileva domini mal ripiegati citosolici di proteine trans membrana [22]
Sebbene entrambe queste vie in ultima analisi convergano sul sistema
di degradazione ubiquitina-proteosoma esse dipendono da diversi
insiemi di componenti RE-associati per rivelare e fornire specie mal
ripiegate al citosol Nel caso di ERAD-C (e non di ERAD-L) la
degradazione egrave in genere dipendente da uno specifico sottoinsieme di
chaperoni citosolici inclusi i membri Hsp40 e Hsp70 Ciograve suggerisce
che queste proteine possono essere direttamente responsabili per il
riconoscimento di domini citosolici mal ripiegati di proteine trans
membrana Tuttavia le caratteristiche esatte che vengono monitorate e
20
come i substrati vengano consegnati al macchinario di
retrotranslocazione restano importanti questioni aperte per la maggior
parte dei substrati Il riconoscimento di una proteina contenente un
dominio luminale mal ripiegato dipende in modo determinante dallo
stato di glicosilazione della proteina Infatti anche piccole modifiche di
glicani N-linked puograve provocare danni gravi nella degradazione di
numerosi substrati Questo puograve effettivamente lasciare le proteine in un
limbo impossibile raggiungere lo stato nativo ma non riconosciuto dal
macchinario ERAD esse restano mal ripiegate nel RE a tempo
indeterminato A prima vista questa dipendenza dalla glicosilazione
sembra essere un miglioramento non necessario Tuttavia egrave ormai chiaro
che lo spettro di porzioni di zucchero presenti in una proteina egrave un
segnale fondamentale nel marcare il suo status di ripiegamento Infatti
dato che diverse proteine altamente abbondanti nel RE tra cui BiP e
PDI spesso non sono glicosilate la presenza e la natura covalente di
molto mannosio in un polipeptide puograve fornire un segnale importante che
aiuta il macchinario di controllo-qualitagrave del RE a distinguere le specie
ripiegate destinate ad altri scomparti da quelle piugrave abbondanti e
permanenti del RE Lrsquointuizione nel ruolo della glicosilazione nella
discriminazione tra le specie in via di ripiegamento e le proteine
terminali mal ripiegate nel RE egrave venuta dalla constatazione che
glicoproteine mal ripiegate subiscono un taglio dei loro N-glicani da una
varietagrave di glicosidasi tra cui una mannossidasi specifica In aggiunta a
proteine mal ripiegate persistenti si egrave pensato che il rimodellamento
dipendente dal tempo di N-glicani porti ad un segnale per la
degradazione del macchinario ERAD Questo permette intermedi
ripiegati in un periodo di tempo prima del rimodellamento dei loro N-
glicani in cui il polipeptide egrave immune dalla sorveglianza ERAD Egrave
21
interessante notare che un recente studio suggerisce che anche per i
polipeptidi citosolici vi egrave un periodo durante e subito dopo la sintesi in
cui le specie mal ripiegate sono immuni alla degradazione del
proteasoma [23] Recenti studi hanno identificato due differenti lettine
localizzate nel RE che svolgono un ruolo critico nellrsquoERAD La prima egrave
correlata alla proteina mannossidasi responsabile del taglio di N-glicani
nel RE ma sembra aver perso la sua attivitagrave catalitica Nel lievito si
chiama Htm1pMnl1p e nei mammiferi egrave chiamato EDEM Studi
condotti su cellule di mammifero suggeriscono che EDEM aiuta le
glicoproteine mal ripiegate a lasciare il ciclo calnexinacalreticulina del
chaperone lectina dove stanno cercando di ripiegarsi e cosigrave entrare nel
ciclo di degradazione [24 ab] Tuttavia nel lievito Htm1p egrave richiesto
per la degradazione efficiente di substrati come CPY che non
dipendono da calnexina Quindi sembra probabile che Htm1pEDEM
ricopra altri ruoli in ERAD La seconda lectina Yos9p forma un
complesso stabile con proteine mal ripiegate e la perdita di questa
lectina conduce ad un profondo e specifico difetto nella degradazione di
glicoproteine mal ripiegate [25] Sorprendentemente mentre mutazioni
puntiformi nella tasca di Yos9p legante il mannosio eliminano la sua
capacitagrave di supportare ERAD i mutanti stessi di Yos9p mostrano una
maggior interazione con i substrati Ciograve indica la possibilitagrave che la
lectina Yos9p svolga un ruolo piugrave informativo interrogando lo stato
dello zucchero di forme mal ripiegate per determinare se debbano essere
passate al macchinario di retrotranslocazione Tuttavia come con
ERAD-C sebbene ci siano stati grandi progressi nella caratterizzazione
del macchinario di retrotranslocazione [26] le caratteristiche strutturali
delle proteine mal ripiegate sono in fase di monitoraggio e sono ancora
22
limitate le conoscenzedi come le forme mal ripiegate sono passate a
questo macchinario
CLEARENCE DI AGGREGATI ATTRAVERSO
LrsquoAUTOFAGIA
Egrave sempre piugrave evidente che ci sono una varietagrave di condizioni in vivo che
anche con chaperoni e macchinari proteolitici presenti nello stesso
compartimento come proteine mal ripiegate questi meccanismi di
controllo-qualitagrave falliscono e le proteine mal ripiegate avanzano
formando aggregati Inoltre tali aggregati intracellulari sono associati
con una serie di malattie neurodegenerative come il morbo di
Huntington e di Parkinson La natura e la sorte di aggregati di proteine
nelle cellule eucariotiche egrave stata poco compresa Recentemente egrave stata
sempre piugrave sostenuta unrsquoazione protettiva della formazione di aggregati
piuttosto che unrsquoimmediata azione patogena Per esempio nel caso del
morbo di Huntington lrsquoesame di cellule neuronali in coltura
sovrapproducenti una fusione di poliglutamina espansa e huntingtina-
GFP rivelano che queste cellule contenenti aggregati fluorescenti
morfologicamente visibili esibiscono una migliore viabilitagrave rispetto a
quelle aventi per via diffusionale materiale fluorescente [27] Questo
sembra in accordo con il concetto che si tratta di piccoli assemblati di
proteine mal ripiegate inclusioni non morfologicamente visibili che
esercitano effetti tossici sulle cellule Analogamente un recente
confronto delle dimensioni rispetto a tossicitagrave per gli aggregati di
proteina prionica PrP suggerisce che piccoli aggregati contenenti da una
a due dozzine di molecole sono risultati i piugrave tossici per le cellule [28]
23
Ma le cellule dispongono di meccanismi di compensazione per questi
piccoli aggregati Studi recenti hanno suggerito che la via ubiquitina-
proteosoma possa essere il pilastro della rimozione di specie inclini
allrsquoaggregazione Infatti gli aggregati rilevati nel contesto di
neurodegenerazione di solito sono reattivi con gli anticorpi anti-
ubiquitina il che implica che le specie mal ripiegate sono state
riconosciute dal sistema di coniugazione dellubiquitina Eppure vari
studi di questi ultimi anni indicano che queste proteine modificate
rappresentano una sfida particolare per proteasomi che possono portare
alla loro inibizione [29 ab] Il meccanismo di questa inattivazione
rimane sconosciuto ma puograve coinvolgere il soffocamento della camera
del proteasoma [30]
Anatomia del proteasoma Il proteasoma egrave una macromolecola proteica del peso di circa 2 milioni
di Daltons Ersquo formata da ununitagrave base centrale (core) e 2 cappucci agli estremi (cap) Il core egrave
formato a sua volta da 4 anelli ciascuno costituito da 7 unitagrave proteiche I due ldquocaprdquo attaccati alle
due estremitagrave del core cilindrico consistono ciascuno di 20 subunitagrave
24
Ora sembra che la modifica dellrsquoubiquitina possa reclutare specie
aggregate mediante una via indipendente lrsquoAUTOFAGIA Lrsquoautofagia
implica il riconoscimento e lrsquoimpacchettamentofagocitazione di
proteine specifiche o organelli in vescicole autofagosomiche che si
fondono con i lisosomi in cui sia le vescicole che il loro contenuto sono
scomposti Piugrave di 20 componenti cosiddetti Atg (geni coinvolti
nellrsquoautofagia) mediano questo processo straordinario Recenti studi
hanno dimostrato che componenti centrali della formazione di autosomi
nei topi hanno attivitagrave nei tessuti dei mammiferi Per esempio carenza
di atg5 ha portato alla morte di animali appena nati a causa
dellrsquoincapacitagrave di fornire un apporto di aminoacidi attraverso la
degradazione di proteine del corpo durante la condizione di fame
relativa allrsquoimmediato periodo post-natale Sorprendentemente in un
altro studio in cui egrave stata indotta una carenza di atg7 piugrave avanti nella
vita con un gene ldquofloxedrdquo lrsquoaccumulo di aggregati positivi
allrsquoubiquitina egrave stata osservata nel fegato degli animali che sono stati
disabilitati nella produzione di autofagosomi La funzione del
proteasoma in questi animali egrave rimasta inalterata contenente specie mal
ripiegate etichettate con ubiquitina e possono essere eliminate attraverso
autofagia Egrave stato poi scoperto un componente denominato p62 (o
sequestosoma1) che costituisce un guscio attorno agli aggregati di
huntingtina [31] Questa proteina contiene un dominio C-terminale
associato allrsquoubiquitina (UBA) che puograve legare poliubiquitine in modo
tale che p62 si collochi con lrsquoubiquitina quando espressa in cellule
HeLa Inoltre nelle cellule che esprimono huntigtina p62 si associa con
LC3 una proteina localizzata negli autofagosomi In accordo con quanto
riportato e cioegrave che lrsquoautofagia riduce i livelli di aggregati di
huntingtina e con un ruolo critico di p62 in questo processo lrsquoinibizione
25
antisenso mediata dallrsquoesperessione di p62 aumenta lrsquoapoptosi delle
cellule che esprimono huntungtina Quindi sembra che la modifica
dellrsquoubiquitina delle proteine difettose possa offrire un ingresso sia al
sistema proteasoma o in contesti dove lrsquoaggregazione egrave in corso al
sistema autofagia
SISTEMI CHAPERONI HSP70
Le Hsp70 proteine dello shock termico di 70 KDa sono impegnate in
una serie di processi tra cui il ripiegamento di proteine di nuova sintesi
il trasporto delle proteine attraverso membrane il ripiegamento di
proteine mal ripiegate ed aggregate e il controllo delle attivitagrave delle
proteine regolatrici Questa versatilitagrave egrave ottenuta attraverso
lampliamento e la diversificazione evolutiva di geni hsp70 che ha
generato sia chaperoni Hsp70 specifici Hsp110 e proteine Hsp170 La
versatilitagrave egrave determinata attraverso lrsquoimpiego di cochaperoni proteine J
e fattori di scambio di nucleotide (NEF) che regolano lrsquoattivitagrave di Hsp70
(Figura 4)
26
Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame
del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una
Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)
Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la
proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato
allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del
substrato
Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre
specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb
Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di
legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un
numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame
dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi
Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina
Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni
Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali
di Hsp70 con se stesso
27
INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70
Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di
proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura
xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding
appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide
N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD
adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio
elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con
lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante
chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco
tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini
di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di
comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura
di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione
La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la
tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo
coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture
precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una
proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da
una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β
ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica
compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio
elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di
legame del substrato (Figura 5)
28
Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo
substrato
La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra
domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che
collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo
solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi
residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame
allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A
dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso
Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un
legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in
nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano
completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve
entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo
fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui
coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del
segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti
integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A
29
capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il
quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di
ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a
idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di
DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro
catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente
arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia
drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete
crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la
barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK
costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina
superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura
della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera
attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della
prolina
DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-
NUCLEOTIDE
Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi
meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono
fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la
liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del
substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la
dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine
BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave
dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con
30
funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S
cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1
(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la
disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e
HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70
fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi
della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente
indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene
GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg
di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei
nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte
posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i
nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario
BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in
modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del
complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si
compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo
Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva
[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con
conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve
indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca
di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di
convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la
reazione di scambio nucleotidica di Hsp70
31
LEGAMI Hsp70-Hsp70
Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro
della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In
particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce
come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola
lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di
questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento
Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il
cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che
sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi
eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente
lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se
non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di
complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di
nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di
scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione
importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto
di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel
folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle
Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza
proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa
con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere
coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di
traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina
Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come
sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le
interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di
32
Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi
SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua
attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano
legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di
idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede
possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano
lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina
stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che
Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami
con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina
J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di
stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega
bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o
Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non
limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che
la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-
associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con
Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito
meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande
aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante
per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70
AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP
Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli
AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione
disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]
33
Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un
anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del
proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico
20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA
svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP
Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104
nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico
per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste
attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come
una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-
etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE
per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla
fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il
meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere
tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria
per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli
anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una
parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali
suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata
assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando
una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a
spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad
entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel
caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro
che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti
dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una
proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In
parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno
34
individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi
domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre
interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta
apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati
che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la
questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)
Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97
Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da
proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad
entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro
efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non
devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati
dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte
lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono
piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte
superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine
adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il
35
movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori
p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su
proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di
proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la
retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e
reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo
anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite
adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente
il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente
forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei
canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]
LrsquoAZIONE DELLrsquoATP
La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico
al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco
affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad
esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello
Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che
ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo
di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli
wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli
mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori
dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di
ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di
un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di
quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda
36
subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino
al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave
significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o
sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti
differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra
essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che
attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave
adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non
vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a
cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di
subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico
Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un
substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di
queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un
meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da
F1-ATPasi non sembra escluso
HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE
NEURODEGENERATIVE
RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE
Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel
mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una
pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi
associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione
37
di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di
Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta
promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]
Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90
nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave
funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi
permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]
HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico
Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono
mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)
accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock
citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata
da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante
di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo
stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si
lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei
geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-
shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via
multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di
transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-
translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90
[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e
mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo
shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con
Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)
38
attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da
shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni
Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che
i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro
sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock
termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su
attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato
che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi
di insulti
Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90
e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con
shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La
somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a
topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello
39
Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge
contro aggregati tossici
Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un
aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave
egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di
chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione
incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste
molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente
diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su
espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative
Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie
neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a
mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei
neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia
muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-
pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma
mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme
nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che
Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in
oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza
attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili
[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di
Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt
mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore
di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo
suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro
effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi
40
indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando
monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono
probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono
essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di
atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70
permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]
Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare
spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo
nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un
miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina
[62]
Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il
riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso
lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido
dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli
di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i
motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione
acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni
Riluzolo
Arimoclomol
41
Nei vari modelli cellulari della malattia di Alzheimer (AD) vi egrave un
incremento dei livelli di Hsp70 promossa dalla solubilitagrave e dal legame ai
microtubuli delle proteine tau [63] Hsp70 ha anche inibito la
propensione di aggregazione di Aβ [64] e ridotto la tossicitagrave di Aβ su
culture neuronali [65] Inoltre la proteina precursore dellrsquoamiloide
(APP) eo il suo Aβ amiloide derivato sono bersagli di chaperoni
mediati da clearence [66-67] Nella Drosophila melanogaster e nei
modelli di lievito della malattia di Parkinson (PD) lrsquoespressione diretta
di Hsp70 o la modulazione farmacologica di Hsp ha impedito la perdita
di neuroni causata da alfa-sinucleina [68-69] Huang et al hanno
riportato che questi effetti di Hsp70 si manifestano con lrsquoinibizione della
formazione di fibrille di alfa-sinucleina prevenendo la formazione di
alfa-sinucleina prefibrillare [70] Usando delezioni mutanti di alfa-
sinucleina Luk et al hanno indicato che le interazioni tra il dominio
legante il substrato Hsp70 e la regione del core idrofobico dellrsquoalfa-
sinucleina mediano lrsquoinibizione dellrsquoassemblaggio e che questo
processo di assemblaggio egrave inibito prima della fase di allungamento
[71] Nel complesso in diversi modelli di malattia neurodegenerativa la
sovra espressione di Hsp70 ha migliorato la gravitagrave della malattia di
fenotipi diversi senza incidere visibilmente sulla formazione di
aggregati suggerendo che i chaperoni non impediscono lrsquoaggregazione
di per seacute bensigrave reindirizzano gli aggregati preferibilmente in depositi
amorfi quindi sequestrando specie potenzialmente tossiche dalla
maggior parte della soluzione
42
Lrsquoespressione di Hsp70 e di altre Hsp egrave indotta dallrsquoinibizione
farmacologica di Hsp90
Come riportato sopra lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal
complesso con Hsp90 con susseguente produzione di Hsp (Figura 7) e
lrsquoinduzione di Hsp70 da parte di inibitori di Hsp90 egrave ben documentata
nei modelli di malattie neurodegenerative La geldanamicina (GM) un
inibitore di Hsp90 induce un aumento dose dipendente di Hsp70 nei
modelli di cellule di AD (Alzhaimer) cosigrave come nei neuroni della
corteccia primaria del ratto e riduce la quantitagrave di tau insolubili e dei
livelli basali di acido okadaico indotto da tau fosforilazione [63] Il
trattamento di neuroni primari corticali con lrsquoinibitore di Hsp90 con
struttura purinica il PU24FCI ha portato ad un aumento di Hsp70 dose-
dipendente [72]
PU24FCI
KU32
43
Allo stesso modo la somministrazione di due derivati di PU24FCI
CNS-permeabili il PU-DZ8 [72] ed il EC102 [73] a topi tau transgenici
(htau e JNPL3) ha determinato induzione di Hsp70 nel cervello e
mantenuto gli effetti per 24 ore dopo la somministrazione KU32 un
inibitore di Hsp90 di diversa natura chimica ha indotto Hsp70 in culture
SH-SY5Y di neuroblastoma e la ha protetta da tossicitagrave indotta da Aβ
GM ha attivato una risposta da shock termico ed inibito lrsquoaggregazione
di htt in un modello di coltura cellulare di HD ed ha indotto Hsp70 in
maniera tempo e concentrazione-dipendente ed ha impedito
lrsquoaggregazione di alfa-sinucleina e protetto contro la tossicitagrave in un
modello di aggregazione cellulare di alfa-sinucleina Auluck et al hanno
segnalato che il trattamento di un modello volante di PD con GM ha
protetto completamente contro tossicitagrave per alfa-sinucleina [74] GM ha
protetto anche contro la neurotossicitagrave dopaminergica indotta da 1-metil-
4-fenil-1236-tetraidropiridina (MPTP) in un modello di topo di PD Il
pretrattamento con GM mediante iniezione ventricolare intracerebrale
prima del trattamento con MPTP ha indotto le Hsp70 ed incrementato il
contenuto residuale di dopamina e lrsquoimmuno reattivitagrave della tirosina
idrolasi nel corpo striato [75] Lrsquoinduzione di Hsp70 nel midollo spinale
egrave stata osservata in seguito ad iniezione intraperitoneale di un derivato
della GM il 17-AAG in un modello di SBMA topo [76] Il 17-AAG egrave
stato anche efficace contro la nuerodegenerazione in altre malattie
poliQ Vale a dire ha soppresso la degenerazione dellrsquoocchio e la
formazione di inclusioni del corpo e salvato dalla letalitagrave in un modello
di SCA di Drosophila Ha inoltre soppresso la neurodegenerazione in un
modello volante di HD La riduzione di HSF-1 ha abolito lrsquoinduzione di
chaperoni molecolari e gli effeti terapeutici di 17-AAG sulla
neurodegenerazione poliQ indotta nei modelli di Drosophila facendo
44
arguire che lrsquoeffetto terapeutico di 17-AAG egrave essenzialmente mediato da
HSF-1 [77] Riassumendo lrsquoattivazione di HSF-1 da inibitori di Hsp90
egrave stata notata specificamente in modelli in vivo ed in vitro di malattie
neurodegenerative suggerendo che lrsquoinibizione di Hsp90 puograve essere un
mezzo per modulare i livelli di Hsp in cervelli malati con lrsquoobbiettivo di
proteggere contro le proteine tossiche che si presentano nel corso del
processo neurodegenerativo
Lrsquoinibizione di Hsp90 riduce lrsquoattivitagrave e lrsquoespressione di proteine
neuronali aberranti
In aggiunta alla regolazione di HSF-1 evidenze recenti suggeriscono un
ruolo addizionale per Hsp90 nel mantenimento della stabilitagrave funzionale
della capacitagrave aberrante di proteine neuronali (Figura 8A)
La SBMA egrave una malattia ereditaria dei motoneuroni causata
dallrsquoaccrescimento di un tratto di poliglutamina allrsquointerno del recettore
androgeno (AR) [57]
Le caratteristiche patologiche di SBMA sono perdita dei motoneuroni
nel midollo spinale e nel tronco cerebrale diffusione dellrsquoaccumulo
nucleare inclusioni nucleari di mutanti AR (mAR) nei motoneuroni
residui e in alcuni organi viscerali Waza et al hanno dimostrato che
mAR presente in SBMA egrave una delle proteine regolate da Hsp90 (Figura
8A) [76]
45
Figura 8 Le Hsp90 riparano le proteine neuronali aberranti (A) Proteine neuronali
aberranti regolate da Hsp90 (B) Lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90porta allrsquoinattivazione
o degradazione delle proteine regulate da Hsp90 probabilmente attraverso la via del
proteasoma
Le Hsp90 formano un complesso molecolare con mAR per il
mantenimento della sua stabilitagrave funzionale Sia in modelli cellulari di
SBMA che in topi transgenici lrsquoinibizione di Hsp90 da parte di 17-
AAG il derivato 17 allilammino-17-demetossi della geldanamicina ha
46
portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal
macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati
disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da
destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione
dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di
SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave
rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati
[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori
hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo
sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa
(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni
Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]
Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo
egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali
sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al
hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina
(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi
familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un
complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data
da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto
47
lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della
stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave
dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita
neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei
neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che
codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a
PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson
familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson
suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente
associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che
Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate
con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente
diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina
egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille
ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno
recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di
alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che
sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina
[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce
lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari
Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-
dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento
tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-
sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da
chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di
mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il
macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD
associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-
48
sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative
caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave
caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di
tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD
lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da
unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina
chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta
(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si
era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero
netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un
gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e
Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave
causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma
17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau
[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine
neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso
portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina
mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da
Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei
modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave
patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-
dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla
settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad
una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di
tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno
dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una
diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di
AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le
49
relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la
degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90
[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al
(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave
stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da
GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β
effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi
GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di
Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe
portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in
strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati
indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone
biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione
di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da
parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi
proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di
queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)
Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie
neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio
approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare
dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la
formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione
potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di
Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare
terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare
malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo
centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90
puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione
50
successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti
neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti
clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto
che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono
tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in
modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni
nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati
promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio
spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in
modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di
Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a
lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse
da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase
esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora
rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori
dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per
mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie
neurodegenerative
51
SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-
ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-
METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE
(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE
MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO
SULLA FRAMMENTAZIONE
Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in
risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta
nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine
regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il
ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai
loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine
client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro
cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire
su molti percorsi oncogenici
Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il
nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che
lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati
composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP
attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del
processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono
emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i
tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule
normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina
(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una
maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto
che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una
piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
10
Ogni famiglia di Hsp egrave composta da membri espressi sia in maniera
costitutiva che induttiva e si rivolge a diversi scomparti subcellulari [7]
Lrsquoattivazione costitutiva delle Hsp puograve verificarsi nelle cellule anche in
assenza di fattori di stress ambientali Per esempio Hsp90 puograve costituire
fino allrsquo1 del totale delle proteine cellulari in cellule non stressate [3]
indicando che queste proteine hanno un ruolo nel mantenimento della
conformazione delle proteine anche in condizioni normali In
condizioni di stress i dimeri di Hsp90 tendono ad associarsi in tetra-
esa- e ottameri ed oligomeri ancora piugrave elevati [8] In condizioni
fisiologiche Hsp90 si trova in associazione con diverse proteine
intracellulari tra cui calmodulina actina tubulina diverse chinasi e
qualche proteina recettore [9] I componenti dei complessi di Hsp90
come proteine kinasi e recettori steroidei possono mediare il trasporto
nucleare dellrsquoHsp90 specialmente sotto stress da calore Probabilmente
Hsp90 forma complessi stabili con filamenti di actina e si lega alla
tubulina per proteggere i microtubuli quindi puograve mediare
lrsquoorganizzazione strutturale del proteasoma un complesso
multicatalitico quando i livelli di ATP cellulari diminuiscono [5] Allo
stesso modo Hsp27 tende a oligomerizzarsi in condizioni di stress ed egrave
stato precedentemente dimostrato che nelle cellule tumorali endogene
Hsp27 egrave la piugrave importante proteina argpirimidina modificata e che
questa modifica comporta lrsquooligomerizzazione di Hsp27 [10]
Argpirimidina egrave un addotto metilgliossale-arginina che risulta dalla
glicazione non enzimatica di residui di arginina delle proteine nelle
cellule tumorali mostrando un aumento della glicolisi [11] Hsp27 e
Hsp70 sono fortemente ed universalmente indotte da diverse
sollecitazioni mentre la loro espressione egrave bassa in condizioni
fisiologiche permettendo ad attivitagrave costitutive cellulari di procedere
11
[12] A prescindere dalla loro localizzazione intracellulare le Hsp70
sono state trovate anche sulla membrana plasmatica delle cellule
trasformate malignamente e nello spazio extracellulare [13] Hsp70
Hsp90 e la proteina GP96 chaperone residente nel reticolo
endoplasmatico (RE) appartenente alla famiglia di Hsp90 [14] sono
state trovate nel mezzo cellulare Questo mette in considerazione la
duplce funzione delle Hsp la funzione citoprotettivaantiapoptotica
intracellulare e la funzione immunogenica extracellulare [7] Le Hsp
intracellulari sono importanti in quanto assicurano il ripiegamento delle
proteine nella loro corretta struttra terziaria lrsquoincorporazione di
polipeptidi nelle membrane intracellulari o nel trasporto delle proteine
attreverso le membrane [9] mentre la funzione delle Hsp extracellulari egrave
immunogenica attreverso lo chaperoning di peptidi antigenici I membri
della famiglia di Hsp70 e Hsp90 sono stati rilevati nel mezzo delle
cellule presentanti lrsquoantigene (APC) Ersquo stato osservato che lrsquouptake di
complessi Hsp-peptidi da parte delle APC egrave specifico saturabile e
concentrazione dipendente e quindi egrave stata ipotizzata lrsquoesistenza di
recettori Hsp specifici [7] Quindi il potenziale coinvolgimento delle
Hsp in molti tipi di malattie le ha rese particolarmente importanti per lo
sviluppo di nuove terapie
12
CHAPERONINE MOLECOLARI E CONTROLLO
QUALITArsquo DELLE PROTEINE
Nelle cellule viventi sia le catene polipeptidiche di nuova sintesi che le
preesistenti sono a rischio costante di mal ripiegamento
(MISFOLDING) o aggregazione In conformitagrave con lrsquoampia diversitagrave di
forme mal ripiegate lrsquoelaborazione di strategie di controllo qualitagrave si
sono evolute per opporsi a questa inevitabile disavventura Recenti studi
descrivono la rimozione di aggregati dal citosol rivelano meccanismi di
controllo di qualitagrave per proteine nel reticolo endoplasmatico (RE) e
forniscono nuove intuizioni in due classi di chaperoni molecolari
lrsquoHsp70 (Heat Shock Protein 70) e lrsquoAAA+ (Hsp100) [15]
FOLDING DI PROTEINE NEL RETICOLO
ENDOPLASMATICO RICONOSCERE IL GIUSTO
DALLO SBAGLIATO
Il reticolo endoplasmatico (ER) un organulo presente sia nelle cellule
animali che vegetali svolge un ruolo premimente in numerosi processi
di fondamentale importanza per la sopravvivenza e per il normale
funzionamento cellulare LER occupa circa il 10 del volume della
cellula e la metagrave della superficie coperta da tutte le membrane della
cellula (endomembrane piugrave membrana plasmatica) [16]
Il reticolo endoplasmatico (RE) riveste numerose funzioni vitali per la
cellula Tra le tante egrave la stazione iniziale della via secretoria ed egrave quindi
il luogo nel quale circa un terzo di tutte le proteine di una cellula viene
sintetizzato e ripiegato correttamente [17] in secondo luogo lrsquoER egrave il
13
punto di partenza dal quale numerose proteine vengono smistate e
indirizzate verso la loro destinazione finale [18]
LrsquoER egrave quindi la sede della sintesi del ripiegamento (ldquofoldingrdquo) e delle
modificazioni post-traduzionali delle proteine di membrana e secrete ed
egrave responsabile della maturazione strutturale di un quarto del proteasoma
che attraversa le vie secretorie
Il ripiegamento delle proteine secretorie fornisce una serie di sfide
uniche in quanto egrave accompagnato e dipendente dalla formazione di ponti
disolfuro ed inserzioni nel doppio strato lipidico con entrambi gli eventi
che si verificano piugrave lentamente di tipici cambi conformazionali che
accompagnano il ripiegamento Conseguentemente il RE fornisce le
condizioni ottimali per fronteggiare queste sfide includendo unrsquoalta
concentrazione di chaperoni generici oltre a una gamma di specifiche
strategie fatte su misura per favorire il ripiegamento delle proteine
secretorie Inoltre esiste un sofisticato sistema di controllo-qualitagrave nel
RE per trattenere e riparare proteine che non hanno raggiunto ancora il
loro stato naturale Malgrado la lunghezza con la quale le cellule vanno
a fornire un ambiente ottimale nel RE il ripiegamento delle proteine
secretorie puograve avvenire o manca a volte ad un ritmo allarmante Il RE
adopera due meccanismi di risposta in presenza di forme mal ripegate Il
primo meccanismo egrave una risposta allo stress RE-dedicato definito UPR
(risposta alla non corretta conformazione delle proteine) che attua il
rimodellamento del RE cosigrave da aumentare la sua capacitagrave di
ripiegamento [16] Una proteina malfunzionante rimane sequestrata nel
reticolo endoplasmatico quindi un eccesso di proteine mal strutturate
attiva la risposta da proteine con folding scorretto (Unfolded Protein
Response) Questo tipo di risposta inizia con il riconoscimento del
segnale di stress da parte di un recettore nel reticolo endoplasmatico e
14
prosegue con il blocco della sintesi proteica per permettere al
proteasoma di eliminare lrsquoeccesso di proteine mentre viene stimolata la
produzione di fattori di trascrizione Il secondo meccanismo chiamato
degradazione RE-associata (ERAD) riconosce in modo specifico le
parti terminali di proteine mal ripiegate e le loro retrotraslocazioni
attraverso la membrana del reticolo endoplasmatico nel citosol dove
possono essere degradate dal sistema di degradazione ubiquitina-
proteosoma [17] Questi due meccanismi sono intimamente collegati
lrsquoinduzione UPR aumenta la capacitagrave dellrsquoERAD una diminuzione
dellrsquoERAD comporta unrsquoinduzione dellrsquoUPR costitutivo e
contemporaneamente la diminuzione di ERAD e UPR fa diminuire di
molto la viabilitagrave delle cellule I sistemi UPR ed ERAD fronteggiano
anche il comune problema del riconoscimento che richiede
lrsquoidentificazione delle forme mal ripiegate potenzialmente patologiche
nellrsquoambiente del RE La sorveglianza di UPR ed ERAD deve garantire
un buon equilibrio proteggendo le cellule dalle pericolose specie mal
ripiegate evitando la sovra vigilanza (come accade con forme mutate di
regolatori trans membrana della fibrosi cistica CFTR) che puograve portare
allrsquoeliminazione di forme potenzialmente sanabili Recenti studi hanno
rivelato come ERAD ed UPR identifichino forme mal ripiegate
Pertanto il RE rappresenta un preciso sistema di controllo di qualitagrave atto
ad assicurare che solo le proteine correttamente ripiegate e funzionanti
possano essere rilasciate dallrsquoER e raggiungere la loro destinazione
finale mentre le proteine malripiegate o non funzionanti sono trattenute
nel ER e in seguito traslocate nel citosol per la degradazione
15
RISPOSTA ALLA NON CORRETTA
CONFORMAZIONE DELLE PROTEINE
Le proteine designate per il riconoscimento dei segnali di stress
provenienti dal reticolo endoplasmatico sono generalmente IRE1
(Inositol Requiring Kinase 1) ATF6 (Activation of Transcription Factor
6) e PERK (PKR-like Endoplasmic Reticulum Kinase)
Nel lievito la capacitagrave di ripiegarsi del RE egrave monitorata da IRE1 una
chinasi trans membrana altamente conservata che contiene un dominio
luminale responsabile del riconoscimento delle forme mal ripiegate
chinasi citosoliche e domini ribonucleasici Lrsquoaccumularsi delle proteine
mal ripiegate nel RE porta allrsquoattivazione delle chinasi IRE
Lrsquoattivazione delle IRE-chinasi promuove lo splicing non convenzionale
dei messaggi per un fattore di traduzione b-ZIP (Hac1 nel lievito e XBP-
1 nei metazoi) attraverso il suo dominio ribonucleasico La traduzione
del messaggio Hac 1 spliced crea un fattore attivo di trascrizione che
media direttamente la trascrizione dei target di UPR includendo
chaperoni del RE macchinario ERAD e tante altre proteine secretorie
In aggiunta alla IRE-1 gli eucarioti piugrave sviluppati utilizzano due altri
sensori le chinasi trans membrana del RE PERK ed il fattore di
trascrizione trans membrana del RE ATF6 (Figura 2) PERK contiene
un sensore luminale che egrave altamente correlato a quello di IRE-1 il
dominio citoplasmatico di PERK consiste in una chinasi elF2α
16
Figura 2 Struttura dei principali sensori dello stress nel reticolo endoplasmatico IRE1
ATF6 PERK
Lrsquoattivazione delle chinasi dovuta alla presenza di proteine mal
ripiegate determina unrsquoinibizione generalizzata della traduzione come
pure la up-regulation del fattore di trascrizione specifico ATF4
Lrsquoaccumulo di proteine mal ripiegate permette inoltre ad ATF6 di
raggiungere lrsquoapparato del Golgi dove le proteasi trans membrana
rilasciano il dominio citoplasmatico del fattore di trascrizione
permettendogli di entrare nel nucleo e mediare lrsquoinduzione genetica
Lrsquoesistenza di molteplici sensori UPR negli eucarioti piugrave avanzati
permette per lo piugrave una risposta piugrave sfumata alle proteine mal ripiegate
Per esempio una risposta iniziale alle proteine mal ripiegate potrebbe
portare ad una down-regulation generalizzata della traduzione seguita in
sequenza da unrsquoinduzione di chaperoni lrsquoinduzione del macchinario
17
ERAD ed infine contro lo stress prolungato lrsquoattivazione della morte
cellulare tramite apoptosi Molto recentemente ci sono stati notevoli
progressi nelle nostre conoscenze molecolari di come IRE-1 (e per
deduzione PERK) riconosce le proteine mal ripiegate Studi precedenti
avevano dimostrato che BIP (Binding Immunoglobulin Protein) lrsquo
omologo principale delle Hsp70 presente nel reticolo endoplasmatico si
lega in modo specifico con IRE1 e che questa interazione scompare in
condizioni di stress del RE Inoltre lrsquoiperespressione di BiP puograve
sopprimere lrsquoinduzione dellrsquoUPR Questo aveva suggerito un modello di
titolazione in cui BiP agisce come un regolatore negativo di IRE1 e
lrsquoaccumularsi di forme mal ripiegate porta indirettamente allrsquoattivazione
dellrsquoIRE1 attraverso il sequestro di BiP da parte proteine mal ripiegate
Tuttavia recenti studi hanno dimostrato che anche se il legame del BiP
possa avere un ruolo importante nella down-regulation di IRE1 ci sono
altri fattori importanti Analisi mutazionali hanno trovato che la
delezione della regione di IRE1 responsabile del legame con BiP non
altera la regolazione di IRE1 in risposta alle proteine unfolded [18] Piugrave
drammaticamente la struttura cristallina del core del dominio luminale
conservato (cLD) di IRE1 nel lievito rivela una profonda scanalatura
idrofobica che ricorda la tasca legante dei maggiori complessi di
istocompatibilitagrave (MHCs) che sono i responsabili per il riconoscimento
peptidico Che IRE1 possa legarsi direttamente a polipeptidi mal
ripiegati egrave unrsquoidea interessante (Figura 3) [19]
18
Figura 3 Un modello ipotetico descrive lrsquoattivazione di Ire1 attraverso la oligomerizzazione
determinata dal legame di proteine unfolded (indicate in rosso) Le interazioni dirette o
indirette fra le catene delle proteine unfolded possono contribuire allrsquoattivazione Sul lato
luminale della membrana del RE le proteine unfolded si legano alla scanalatura (indicata in
grigio) formata dalla dimerizzazione del core del dominio luminale di Ire1 attraverso
linterfaccia 1 Sul lato citoplasmaticodella membrana del RE la oligmerizzazione accosta i
domini della chinasi Ire 1 che subiscono un cambiamento conformazionale in seguito ad
autofosforilazione che porta allrsquoattivazione della funzione di RNA-ribonucleasi di Ire1
Attraverso il riconoscimento diretto delle forme mal ripiegate
lrsquoinduzione di IRE1 potrebbe verificarsi prima della completa titolazione
di BiP che data lrsquoestrema abbondanza di questrsquoultimo nel RE potrebbe
verificarsi solo dopo un catastrofico accumulo di proteine mal ripiegate
Inoltre il riconoscimento diretto di forme mal ripiegate da parte di IRE1
(e PERK) potrebbe consentire una serie di risposte piugrave sfumate in cui
diverse forme mal ripiegate potrebbero essere preferenzialmente
riconosciute da sensori diversi quali BiP IRE1 o PERK Cosigrave in linea
di principio la natura (per esempio traslazionale contro transcrizionale)
ed il ciclo di UPR potrebbe essere su misura per la classe specifica di
forme mal ripiegate che sono prevalenti nel RE [20]
19
DEGRADAZIONE DELLE PROTEINE ASSOCIATA AL
RETICOLO ENDOPLASMATICO
Come ci si poteva aspettare dalla diversitagrave delle proteine che si
ripiegano NEL RE studi recenti hanno dimostrato che la degradazione
ER-associata (ER-Associated Degradation ERAD) comprende una
serie di sistemi diversi ciascuno responsabile della degradazione di
sottoinsiemi di proteine che condividono proprietagrave fisiche comuni
Esistono anche regioni dedicate allrsquo ER Associated Degradation
(ERAD) nelle quali proteine che non raggiungono il corretto
ripiegamento vengono retrotraslocate al citosol e quindi degradate dal
proteasoma [21]
Ciograve forse egrave piugrave chiaramente dimostrato nel lievito dove ci sono almeno
due distinti meccanismi di sorveglianza per identificare le proteine mal
ripiegate del RE Il primo meccanismo chiamato ERAD-L analizza le
proteine che contengono domini luminali mal ripiegati (solubili o trans
membrana) chiamati CPY una forma mutante della proteina CPY
endogena che egrave incapace di folding Il secondo denominato ERAD-C
rileva domini mal ripiegati citosolici di proteine trans membrana [22]
Sebbene entrambe queste vie in ultima analisi convergano sul sistema
di degradazione ubiquitina-proteosoma esse dipendono da diversi
insiemi di componenti RE-associati per rivelare e fornire specie mal
ripiegate al citosol Nel caso di ERAD-C (e non di ERAD-L) la
degradazione egrave in genere dipendente da uno specifico sottoinsieme di
chaperoni citosolici inclusi i membri Hsp40 e Hsp70 Ciograve suggerisce
che queste proteine possono essere direttamente responsabili per il
riconoscimento di domini citosolici mal ripiegati di proteine trans
membrana Tuttavia le caratteristiche esatte che vengono monitorate e
20
come i substrati vengano consegnati al macchinario di
retrotranslocazione restano importanti questioni aperte per la maggior
parte dei substrati Il riconoscimento di una proteina contenente un
dominio luminale mal ripiegato dipende in modo determinante dallo
stato di glicosilazione della proteina Infatti anche piccole modifiche di
glicani N-linked puograve provocare danni gravi nella degradazione di
numerosi substrati Questo puograve effettivamente lasciare le proteine in un
limbo impossibile raggiungere lo stato nativo ma non riconosciuto dal
macchinario ERAD esse restano mal ripiegate nel RE a tempo
indeterminato A prima vista questa dipendenza dalla glicosilazione
sembra essere un miglioramento non necessario Tuttavia egrave ormai chiaro
che lo spettro di porzioni di zucchero presenti in una proteina egrave un
segnale fondamentale nel marcare il suo status di ripiegamento Infatti
dato che diverse proteine altamente abbondanti nel RE tra cui BiP e
PDI spesso non sono glicosilate la presenza e la natura covalente di
molto mannosio in un polipeptide puograve fornire un segnale importante che
aiuta il macchinario di controllo-qualitagrave del RE a distinguere le specie
ripiegate destinate ad altri scomparti da quelle piugrave abbondanti e
permanenti del RE Lrsquointuizione nel ruolo della glicosilazione nella
discriminazione tra le specie in via di ripiegamento e le proteine
terminali mal ripiegate nel RE egrave venuta dalla constatazione che
glicoproteine mal ripiegate subiscono un taglio dei loro N-glicani da una
varietagrave di glicosidasi tra cui una mannossidasi specifica In aggiunta a
proteine mal ripiegate persistenti si egrave pensato che il rimodellamento
dipendente dal tempo di N-glicani porti ad un segnale per la
degradazione del macchinario ERAD Questo permette intermedi
ripiegati in un periodo di tempo prima del rimodellamento dei loro N-
glicani in cui il polipeptide egrave immune dalla sorveglianza ERAD Egrave
21
interessante notare che un recente studio suggerisce che anche per i
polipeptidi citosolici vi egrave un periodo durante e subito dopo la sintesi in
cui le specie mal ripiegate sono immuni alla degradazione del
proteasoma [23] Recenti studi hanno identificato due differenti lettine
localizzate nel RE che svolgono un ruolo critico nellrsquoERAD La prima egrave
correlata alla proteina mannossidasi responsabile del taglio di N-glicani
nel RE ma sembra aver perso la sua attivitagrave catalitica Nel lievito si
chiama Htm1pMnl1p e nei mammiferi egrave chiamato EDEM Studi
condotti su cellule di mammifero suggeriscono che EDEM aiuta le
glicoproteine mal ripiegate a lasciare il ciclo calnexinacalreticulina del
chaperone lectina dove stanno cercando di ripiegarsi e cosigrave entrare nel
ciclo di degradazione [24 ab] Tuttavia nel lievito Htm1p egrave richiesto
per la degradazione efficiente di substrati come CPY che non
dipendono da calnexina Quindi sembra probabile che Htm1pEDEM
ricopra altri ruoli in ERAD La seconda lectina Yos9p forma un
complesso stabile con proteine mal ripiegate e la perdita di questa
lectina conduce ad un profondo e specifico difetto nella degradazione di
glicoproteine mal ripiegate [25] Sorprendentemente mentre mutazioni
puntiformi nella tasca di Yos9p legante il mannosio eliminano la sua
capacitagrave di supportare ERAD i mutanti stessi di Yos9p mostrano una
maggior interazione con i substrati Ciograve indica la possibilitagrave che la
lectina Yos9p svolga un ruolo piugrave informativo interrogando lo stato
dello zucchero di forme mal ripiegate per determinare se debbano essere
passate al macchinario di retrotranslocazione Tuttavia come con
ERAD-C sebbene ci siano stati grandi progressi nella caratterizzazione
del macchinario di retrotranslocazione [26] le caratteristiche strutturali
delle proteine mal ripiegate sono in fase di monitoraggio e sono ancora
22
limitate le conoscenzedi come le forme mal ripiegate sono passate a
questo macchinario
CLEARENCE DI AGGREGATI ATTRAVERSO
LrsquoAUTOFAGIA
Egrave sempre piugrave evidente che ci sono una varietagrave di condizioni in vivo che
anche con chaperoni e macchinari proteolitici presenti nello stesso
compartimento come proteine mal ripiegate questi meccanismi di
controllo-qualitagrave falliscono e le proteine mal ripiegate avanzano
formando aggregati Inoltre tali aggregati intracellulari sono associati
con una serie di malattie neurodegenerative come il morbo di
Huntington e di Parkinson La natura e la sorte di aggregati di proteine
nelle cellule eucariotiche egrave stata poco compresa Recentemente egrave stata
sempre piugrave sostenuta unrsquoazione protettiva della formazione di aggregati
piuttosto che unrsquoimmediata azione patogena Per esempio nel caso del
morbo di Huntington lrsquoesame di cellule neuronali in coltura
sovrapproducenti una fusione di poliglutamina espansa e huntingtina-
GFP rivelano che queste cellule contenenti aggregati fluorescenti
morfologicamente visibili esibiscono una migliore viabilitagrave rispetto a
quelle aventi per via diffusionale materiale fluorescente [27] Questo
sembra in accordo con il concetto che si tratta di piccoli assemblati di
proteine mal ripiegate inclusioni non morfologicamente visibili che
esercitano effetti tossici sulle cellule Analogamente un recente
confronto delle dimensioni rispetto a tossicitagrave per gli aggregati di
proteina prionica PrP suggerisce che piccoli aggregati contenenti da una
a due dozzine di molecole sono risultati i piugrave tossici per le cellule [28]
23
Ma le cellule dispongono di meccanismi di compensazione per questi
piccoli aggregati Studi recenti hanno suggerito che la via ubiquitina-
proteosoma possa essere il pilastro della rimozione di specie inclini
allrsquoaggregazione Infatti gli aggregati rilevati nel contesto di
neurodegenerazione di solito sono reattivi con gli anticorpi anti-
ubiquitina il che implica che le specie mal ripiegate sono state
riconosciute dal sistema di coniugazione dellubiquitina Eppure vari
studi di questi ultimi anni indicano che queste proteine modificate
rappresentano una sfida particolare per proteasomi che possono portare
alla loro inibizione [29 ab] Il meccanismo di questa inattivazione
rimane sconosciuto ma puograve coinvolgere il soffocamento della camera
del proteasoma [30]
Anatomia del proteasoma Il proteasoma egrave una macromolecola proteica del peso di circa 2 milioni
di Daltons Ersquo formata da ununitagrave base centrale (core) e 2 cappucci agli estremi (cap) Il core egrave
formato a sua volta da 4 anelli ciascuno costituito da 7 unitagrave proteiche I due ldquocaprdquo attaccati alle
due estremitagrave del core cilindrico consistono ciascuno di 20 subunitagrave
24
Ora sembra che la modifica dellrsquoubiquitina possa reclutare specie
aggregate mediante una via indipendente lrsquoAUTOFAGIA Lrsquoautofagia
implica il riconoscimento e lrsquoimpacchettamentofagocitazione di
proteine specifiche o organelli in vescicole autofagosomiche che si
fondono con i lisosomi in cui sia le vescicole che il loro contenuto sono
scomposti Piugrave di 20 componenti cosiddetti Atg (geni coinvolti
nellrsquoautofagia) mediano questo processo straordinario Recenti studi
hanno dimostrato che componenti centrali della formazione di autosomi
nei topi hanno attivitagrave nei tessuti dei mammiferi Per esempio carenza
di atg5 ha portato alla morte di animali appena nati a causa
dellrsquoincapacitagrave di fornire un apporto di aminoacidi attraverso la
degradazione di proteine del corpo durante la condizione di fame
relativa allrsquoimmediato periodo post-natale Sorprendentemente in un
altro studio in cui egrave stata indotta una carenza di atg7 piugrave avanti nella
vita con un gene ldquofloxedrdquo lrsquoaccumulo di aggregati positivi
allrsquoubiquitina egrave stata osservata nel fegato degli animali che sono stati
disabilitati nella produzione di autofagosomi La funzione del
proteasoma in questi animali egrave rimasta inalterata contenente specie mal
ripiegate etichettate con ubiquitina e possono essere eliminate attraverso
autofagia Egrave stato poi scoperto un componente denominato p62 (o
sequestosoma1) che costituisce un guscio attorno agli aggregati di
huntingtina [31] Questa proteina contiene un dominio C-terminale
associato allrsquoubiquitina (UBA) che puograve legare poliubiquitine in modo
tale che p62 si collochi con lrsquoubiquitina quando espressa in cellule
HeLa Inoltre nelle cellule che esprimono huntigtina p62 si associa con
LC3 una proteina localizzata negli autofagosomi In accordo con quanto
riportato e cioegrave che lrsquoautofagia riduce i livelli di aggregati di
huntingtina e con un ruolo critico di p62 in questo processo lrsquoinibizione
25
antisenso mediata dallrsquoesperessione di p62 aumenta lrsquoapoptosi delle
cellule che esprimono huntungtina Quindi sembra che la modifica
dellrsquoubiquitina delle proteine difettose possa offrire un ingresso sia al
sistema proteasoma o in contesti dove lrsquoaggregazione egrave in corso al
sistema autofagia
SISTEMI CHAPERONI HSP70
Le Hsp70 proteine dello shock termico di 70 KDa sono impegnate in
una serie di processi tra cui il ripiegamento di proteine di nuova sintesi
il trasporto delle proteine attraverso membrane il ripiegamento di
proteine mal ripiegate ed aggregate e il controllo delle attivitagrave delle
proteine regolatrici Questa versatilitagrave egrave ottenuta attraverso
lampliamento e la diversificazione evolutiva di geni hsp70 che ha
generato sia chaperoni Hsp70 specifici Hsp110 e proteine Hsp170 La
versatilitagrave egrave determinata attraverso lrsquoimpiego di cochaperoni proteine J
e fattori di scambio di nucleotide (NEF) che regolano lrsquoattivitagrave di Hsp70
(Figura 4)
26
Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame
del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una
Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)
Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la
proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato
allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del
substrato
Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre
specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb
Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di
legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un
numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame
dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi
Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina
Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni
Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali
di Hsp70 con se stesso
27
INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70
Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di
proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura
xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding
appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide
N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD
adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio
elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con
lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante
chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco
tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini
di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di
comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura
di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione
La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la
tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo
coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture
precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una
proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da
una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β
ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica
compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio
elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di
legame del substrato (Figura 5)
28
Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo
substrato
La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra
domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che
collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo
solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi
residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame
allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A
dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso
Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un
legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in
nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano
completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve
entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo
fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui
coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del
segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti
integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A
29
capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il
quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di
ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a
idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di
DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro
catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente
arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia
drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete
crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la
barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK
costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina
superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura
della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera
attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della
prolina
DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-
NUCLEOTIDE
Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi
meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono
fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la
liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del
substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la
dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine
BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave
dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con
30
funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S
cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1
(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la
disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e
HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70
fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi
della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente
indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene
GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg
di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei
nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte
posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i
nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario
BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in
modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del
complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si
compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo
Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva
[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con
conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve
indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca
di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di
convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la
reazione di scambio nucleotidica di Hsp70
31
LEGAMI Hsp70-Hsp70
Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro
della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In
particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce
come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola
lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di
questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento
Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il
cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che
sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi
eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente
lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se
non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di
complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di
nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di
scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione
importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto
di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel
folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle
Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza
proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa
con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere
coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di
traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina
Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come
sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le
interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di
32
Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi
SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua
attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano
legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di
idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede
possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano
lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina
stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che
Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami
con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina
J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di
stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega
bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o
Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non
limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che
la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-
associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con
Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito
meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande
aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante
per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70
AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP
Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli
AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione
disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]
33
Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un
anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del
proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico
20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA
svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP
Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104
nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico
per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste
attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come
una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-
etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE
per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla
fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il
meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere
tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria
per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli
anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una
parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali
suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata
assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando
una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a
spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad
entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel
caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro
che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti
dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una
proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In
parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno
34
individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi
domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre
interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta
apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati
che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la
questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)
Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97
Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da
proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad
entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro
efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non
devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati
dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte
lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono
piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte
superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine
adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il
35
movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori
p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su
proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di
proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la
retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e
reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo
anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite
adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente
il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente
forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei
canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]
LrsquoAZIONE DELLrsquoATP
La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico
al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco
affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad
esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello
Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che
ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo
di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli
wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli
mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori
dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di
ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di
un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di
quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda
36
subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino
al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave
significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o
sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti
differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra
essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che
attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave
adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non
vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a
cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di
subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico
Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un
substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di
queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un
meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da
F1-ATPasi non sembra escluso
HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE
NEURODEGENERATIVE
RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE
Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel
mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una
pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi
associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione
37
di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di
Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta
promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]
Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90
nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave
funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi
permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]
HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico
Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono
mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)
accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock
citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata
da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante
di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo
stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si
lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei
geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-
shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via
multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di
transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-
translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90
[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e
mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo
shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con
Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)
38
attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da
shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni
Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che
i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro
sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock
termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su
attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato
che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi
di insulti
Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90
e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con
shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La
somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a
topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello
39
Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge
contro aggregati tossici
Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un
aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave
egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di
chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione
incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste
molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente
diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su
espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative
Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie
neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a
mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei
neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia
muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-
pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma
mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme
nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che
Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in
oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza
attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili
[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di
Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt
mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore
di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo
suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro
effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi
40
indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando
monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono
probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono
essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di
atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70
permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]
Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare
spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo
nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un
miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina
[62]
Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il
riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso
lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido
dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli
di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i
motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione
acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni
Riluzolo
Arimoclomol
41
Nei vari modelli cellulari della malattia di Alzheimer (AD) vi egrave un
incremento dei livelli di Hsp70 promossa dalla solubilitagrave e dal legame ai
microtubuli delle proteine tau [63] Hsp70 ha anche inibito la
propensione di aggregazione di Aβ [64] e ridotto la tossicitagrave di Aβ su
culture neuronali [65] Inoltre la proteina precursore dellrsquoamiloide
(APP) eo il suo Aβ amiloide derivato sono bersagli di chaperoni
mediati da clearence [66-67] Nella Drosophila melanogaster e nei
modelli di lievito della malattia di Parkinson (PD) lrsquoespressione diretta
di Hsp70 o la modulazione farmacologica di Hsp ha impedito la perdita
di neuroni causata da alfa-sinucleina [68-69] Huang et al hanno
riportato che questi effetti di Hsp70 si manifestano con lrsquoinibizione della
formazione di fibrille di alfa-sinucleina prevenendo la formazione di
alfa-sinucleina prefibrillare [70] Usando delezioni mutanti di alfa-
sinucleina Luk et al hanno indicato che le interazioni tra il dominio
legante il substrato Hsp70 e la regione del core idrofobico dellrsquoalfa-
sinucleina mediano lrsquoinibizione dellrsquoassemblaggio e che questo
processo di assemblaggio egrave inibito prima della fase di allungamento
[71] Nel complesso in diversi modelli di malattia neurodegenerativa la
sovra espressione di Hsp70 ha migliorato la gravitagrave della malattia di
fenotipi diversi senza incidere visibilmente sulla formazione di
aggregati suggerendo che i chaperoni non impediscono lrsquoaggregazione
di per seacute bensigrave reindirizzano gli aggregati preferibilmente in depositi
amorfi quindi sequestrando specie potenzialmente tossiche dalla
maggior parte della soluzione
42
Lrsquoespressione di Hsp70 e di altre Hsp egrave indotta dallrsquoinibizione
farmacologica di Hsp90
Come riportato sopra lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal
complesso con Hsp90 con susseguente produzione di Hsp (Figura 7) e
lrsquoinduzione di Hsp70 da parte di inibitori di Hsp90 egrave ben documentata
nei modelli di malattie neurodegenerative La geldanamicina (GM) un
inibitore di Hsp90 induce un aumento dose dipendente di Hsp70 nei
modelli di cellule di AD (Alzhaimer) cosigrave come nei neuroni della
corteccia primaria del ratto e riduce la quantitagrave di tau insolubili e dei
livelli basali di acido okadaico indotto da tau fosforilazione [63] Il
trattamento di neuroni primari corticali con lrsquoinibitore di Hsp90 con
struttura purinica il PU24FCI ha portato ad un aumento di Hsp70 dose-
dipendente [72]
PU24FCI
KU32
43
Allo stesso modo la somministrazione di due derivati di PU24FCI
CNS-permeabili il PU-DZ8 [72] ed il EC102 [73] a topi tau transgenici
(htau e JNPL3) ha determinato induzione di Hsp70 nel cervello e
mantenuto gli effetti per 24 ore dopo la somministrazione KU32 un
inibitore di Hsp90 di diversa natura chimica ha indotto Hsp70 in culture
SH-SY5Y di neuroblastoma e la ha protetta da tossicitagrave indotta da Aβ
GM ha attivato una risposta da shock termico ed inibito lrsquoaggregazione
di htt in un modello di coltura cellulare di HD ed ha indotto Hsp70 in
maniera tempo e concentrazione-dipendente ed ha impedito
lrsquoaggregazione di alfa-sinucleina e protetto contro la tossicitagrave in un
modello di aggregazione cellulare di alfa-sinucleina Auluck et al hanno
segnalato che il trattamento di un modello volante di PD con GM ha
protetto completamente contro tossicitagrave per alfa-sinucleina [74] GM ha
protetto anche contro la neurotossicitagrave dopaminergica indotta da 1-metil-
4-fenil-1236-tetraidropiridina (MPTP) in un modello di topo di PD Il
pretrattamento con GM mediante iniezione ventricolare intracerebrale
prima del trattamento con MPTP ha indotto le Hsp70 ed incrementato il
contenuto residuale di dopamina e lrsquoimmuno reattivitagrave della tirosina
idrolasi nel corpo striato [75] Lrsquoinduzione di Hsp70 nel midollo spinale
egrave stata osservata in seguito ad iniezione intraperitoneale di un derivato
della GM il 17-AAG in un modello di SBMA topo [76] Il 17-AAG egrave
stato anche efficace contro la nuerodegenerazione in altre malattie
poliQ Vale a dire ha soppresso la degenerazione dellrsquoocchio e la
formazione di inclusioni del corpo e salvato dalla letalitagrave in un modello
di SCA di Drosophila Ha inoltre soppresso la neurodegenerazione in un
modello volante di HD La riduzione di HSF-1 ha abolito lrsquoinduzione di
chaperoni molecolari e gli effeti terapeutici di 17-AAG sulla
neurodegenerazione poliQ indotta nei modelli di Drosophila facendo
44
arguire che lrsquoeffetto terapeutico di 17-AAG egrave essenzialmente mediato da
HSF-1 [77] Riassumendo lrsquoattivazione di HSF-1 da inibitori di Hsp90
egrave stata notata specificamente in modelli in vivo ed in vitro di malattie
neurodegenerative suggerendo che lrsquoinibizione di Hsp90 puograve essere un
mezzo per modulare i livelli di Hsp in cervelli malati con lrsquoobbiettivo di
proteggere contro le proteine tossiche che si presentano nel corso del
processo neurodegenerativo
Lrsquoinibizione di Hsp90 riduce lrsquoattivitagrave e lrsquoespressione di proteine
neuronali aberranti
In aggiunta alla regolazione di HSF-1 evidenze recenti suggeriscono un
ruolo addizionale per Hsp90 nel mantenimento della stabilitagrave funzionale
della capacitagrave aberrante di proteine neuronali (Figura 8A)
La SBMA egrave una malattia ereditaria dei motoneuroni causata
dallrsquoaccrescimento di un tratto di poliglutamina allrsquointerno del recettore
androgeno (AR) [57]
Le caratteristiche patologiche di SBMA sono perdita dei motoneuroni
nel midollo spinale e nel tronco cerebrale diffusione dellrsquoaccumulo
nucleare inclusioni nucleari di mutanti AR (mAR) nei motoneuroni
residui e in alcuni organi viscerali Waza et al hanno dimostrato che
mAR presente in SBMA egrave una delle proteine regolate da Hsp90 (Figura
8A) [76]
45
Figura 8 Le Hsp90 riparano le proteine neuronali aberranti (A) Proteine neuronali
aberranti regolate da Hsp90 (B) Lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90porta allrsquoinattivazione
o degradazione delle proteine regulate da Hsp90 probabilmente attraverso la via del
proteasoma
Le Hsp90 formano un complesso molecolare con mAR per il
mantenimento della sua stabilitagrave funzionale Sia in modelli cellulari di
SBMA che in topi transgenici lrsquoinibizione di Hsp90 da parte di 17-
AAG il derivato 17 allilammino-17-demetossi della geldanamicina ha
46
portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal
macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati
disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da
destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione
dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di
SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave
rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati
[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori
hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo
sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa
(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni
Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]
Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo
egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali
sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al
hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina
(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi
familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un
complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data
da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto
47
lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della
stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave
dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita
neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei
neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che
codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a
PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson
familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson
suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente
associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che
Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate
con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente
diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina
egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille
ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno
recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di
alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che
sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina
[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce
lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari
Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-
dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento
tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-
sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da
chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di
mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il
macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD
associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-
48
sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative
caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave
caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di
tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD
lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da
unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina
chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta
(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si
era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero
netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un
gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e
Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave
causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma
17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau
[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine
neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso
portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina
mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da
Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei
modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave
patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-
dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla
settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad
una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di
tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno
dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una
diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di
AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le
49
relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la
degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90
[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al
(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave
stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da
GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β
effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi
GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di
Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe
portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in
strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati
indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone
biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione
di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da
parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi
proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di
queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)
Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie
neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio
approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare
dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la
formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione
potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di
Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare
terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare
malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo
centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90
puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione
50
successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti
neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti
clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto
che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono
tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in
modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni
nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati
promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio
spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in
modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di
Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a
lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse
da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase
esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora
rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori
dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per
mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie
neurodegenerative
51
SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-
ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-
METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE
(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE
MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO
SULLA FRAMMENTAZIONE
Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in
risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta
nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine
regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il
ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai
loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine
client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro
cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire
su molti percorsi oncogenici
Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il
nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che
lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati
composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP
attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del
processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono
emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i
tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule
normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina
(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una
maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto
che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una
piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
11
[12] A prescindere dalla loro localizzazione intracellulare le Hsp70
sono state trovate anche sulla membrana plasmatica delle cellule
trasformate malignamente e nello spazio extracellulare [13] Hsp70
Hsp90 e la proteina GP96 chaperone residente nel reticolo
endoplasmatico (RE) appartenente alla famiglia di Hsp90 [14] sono
state trovate nel mezzo cellulare Questo mette in considerazione la
duplce funzione delle Hsp la funzione citoprotettivaantiapoptotica
intracellulare e la funzione immunogenica extracellulare [7] Le Hsp
intracellulari sono importanti in quanto assicurano il ripiegamento delle
proteine nella loro corretta struttra terziaria lrsquoincorporazione di
polipeptidi nelle membrane intracellulari o nel trasporto delle proteine
attreverso le membrane [9] mentre la funzione delle Hsp extracellulari egrave
immunogenica attreverso lo chaperoning di peptidi antigenici I membri
della famiglia di Hsp70 e Hsp90 sono stati rilevati nel mezzo delle
cellule presentanti lrsquoantigene (APC) Ersquo stato osservato che lrsquouptake di
complessi Hsp-peptidi da parte delle APC egrave specifico saturabile e
concentrazione dipendente e quindi egrave stata ipotizzata lrsquoesistenza di
recettori Hsp specifici [7] Quindi il potenziale coinvolgimento delle
Hsp in molti tipi di malattie le ha rese particolarmente importanti per lo
sviluppo di nuove terapie
12
CHAPERONINE MOLECOLARI E CONTROLLO
QUALITArsquo DELLE PROTEINE
Nelle cellule viventi sia le catene polipeptidiche di nuova sintesi che le
preesistenti sono a rischio costante di mal ripiegamento
(MISFOLDING) o aggregazione In conformitagrave con lrsquoampia diversitagrave di
forme mal ripiegate lrsquoelaborazione di strategie di controllo qualitagrave si
sono evolute per opporsi a questa inevitabile disavventura Recenti studi
descrivono la rimozione di aggregati dal citosol rivelano meccanismi di
controllo di qualitagrave per proteine nel reticolo endoplasmatico (RE) e
forniscono nuove intuizioni in due classi di chaperoni molecolari
lrsquoHsp70 (Heat Shock Protein 70) e lrsquoAAA+ (Hsp100) [15]
FOLDING DI PROTEINE NEL RETICOLO
ENDOPLASMATICO RICONOSCERE IL GIUSTO
DALLO SBAGLIATO
Il reticolo endoplasmatico (ER) un organulo presente sia nelle cellule
animali che vegetali svolge un ruolo premimente in numerosi processi
di fondamentale importanza per la sopravvivenza e per il normale
funzionamento cellulare LER occupa circa il 10 del volume della
cellula e la metagrave della superficie coperta da tutte le membrane della
cellula (endomembrane piugrave membrana plasmatica) [16]
Il reticolo endoplasmatico (RE) riveste numerose funzioni vitali per la
cellula Tra le tante egrave la stazione iniziale della via secretoria ed egrave quindi
il luogo nel quale circa un terzo di tutte le proteine di una cellula viene
sintetizzato e ripiegato correttamente [17] in secondo luogo lrsquoER egrave il
13
punto di partenza dal quale numerose proteine vengono smistate e
indirizzate verso la loro destinazione finale [18]
LrsquoER egrave quindi la sede della sintesi del ripiegamento (ldquofoldingrdquo) e delle
modificazioni post-traduzionali delle proteine di membrana e secrete ed
egrave responsabile della maturazione strutturale di un quarto del proteasoma
che attraversa le vie secretorie
Il ripiegamento delle proteine secretorie fornisce una serie di sfide
uniche in quanto egrave accompagnato e dipendente dalla formazione di ponti
disolfuro ed inserzioni nel doppio strato lipidico con entrambi gli eventi
che si verificano piugrave lentamente di tipici cambi conformazionali che
accompagnano il ripiegamento Conseguentemente il RE fornisce le
condizioni ottimali per fronteggiare queste sfide includendo unrsquoalta
concentrazione di chaperoni generici oltre a una gamma di specifiche
strategie fatte su misura per favorire il ripiegamento delle proteine
secretorie Inoltre esiste un sofisticato sistema di controllo-qualitagrave nel
RE per trattenere e riparare proteine che non hanno raggiunto ancora il
loro stato naturale Malgrado la lunghezza con la quale le cellule vanno
a fornire un ambiente ottimale nel RE il ripiegamento delle proteine
secretorie puograve avvenire o manca a volte ad un ritmo allarmante Il RE
adopera due meccanismi di risposta in presenza di forme mal ripegate Il
primo meccanismo egrave una risposta allo stress RE-dedicato definito UPR
(risposta alla non corretta conformazione delle proteine) che attua il
rimodellamento del RE cosigrave da aumentare la sua capacitagrave di
ripiegamento [16] Una proteina malfunzionante rimane sequestrata nel
reticolo endoplasmatico quindi un eccesso di proteine mal strutturate
attiva la risposta da proteine con folding scorretto (Unfolded Protein
Response) Questo tipo di risposta inizia con il riconoscimento del
segnale di stress da parte di un recettore nel reticolo endoplasmatico e
14
prosegue con il blocco della sintesi proteica per permettere al
proteasoma di eliminare lrsquoeccesso di proteine mentre viene stimolata la
produzione di fattori di trascrizione Il secondo meccanismo chiamato
degradazione RE-associata (ERAD) riconosce in modo specifico le
parti terminali di proteine mal ripiegate e le loro retrotraslocazioni
attraverso la membrana del reticolo endoplasmatico nel citosol dove
possono essere degradate dal sistema di degradazione ubiquitina-
proteosoma [17] Questi due meccanismi sono intimamente collegati
lrsquoinduzione UPR aumenta la capacitagrave dellrsquoERAD una diminuzione
dellrsquoERAD comporta unrsquoinduzione dellrsquoUPR costitutivo e
contemporaneamente la diminuzione di ERAD e UPR fa diminuire di
molto la viabilitagrave delle cellule I sistemi UPR ed ERAD fronteggiano
anche il comune problema del riconoscimento che richiede
lrsquoidentificazione delle forme mal ripiegate potenzialmente patologiche
nellrsquoambiente del RE La sorveglianza di UPR ed ERAD deve garantire
un buon equilibrio proteggendo le cellule dalle pericolose specie mal
ripiegate evitando la sovra vigilanza (come accade con forme mutate di
regolatori trans membrana della fibrosi cistica CFTR) che puograve portare
allrsquoeliminazione di forme potenzialmente sanabili Recenti studi hanno
rivelato come ERAD ed UPR identifichino forme mal ripiegate
Pertanto il RE rappresenta un preciso sistema di controllo di qualitagrave atto
ad assicurare che solo le proteine correttamente ripiegate e funzionanti
possano essere rilasciate dallrsquoER e raggiungere la loro destinazione
finale mentre le proteine malripiegate o non funzionanti sono trattenute
nel ER e in seguito traslocate nel citosol per la degradazione
15
RISPOSTA ALLA NON CORRETTA
CONFORMAZIONE DELLE PROTEINE
Le proteine designate per il riconoscimento dei segnali di stress
provenienti dal reticolo endoplasmatico sono generalmente IRE1
(Inositol Requiring Kinase 1) ATF6 (Activation of Transcription Factor
6) e PERK (PKR-like Endoplasmic Reticulum Kinase)
Nel lievito la capacitagrave di ripiegarsi del RE egrave monitorata da IRE1 una
chinasi trans membrana altamente conservata che contiene un dominio
luminale responsabile del riconoscimento delle forme mal ripiegate
chinasi citosoliche e domini ribonucleasici Lrsquoaccumularsi delle proteine
mal ripiegate nel RE porta allrsquoattivazione delle chinasi IRE
Lrsquoattivazione delle IRE-chinasi promuove lo splicing non convenzionale
dei messaggi per un fattore di traduzione b-ZIP (Hac1 nel lievito e XBP-
1 nei metazoi) attraverso il suo dominio ribonucleasico La traduzione
del messaggio Hac 1 spliced crea un fattore attivo di trascrizione che
media direttamente la trascrizione dei target di UPR includendo
chaperoni del RE macchinario ERAD e tante altre proteine secretorie
In aggiunta alla IRE-1 gli eucarioti piugrave sviluppati utilizzano due altri
sensori le chinasi trans membrana del RE PERK ed il fattore di
trascrizione trans membrana del RE ATF6 (Figura 2) PERK contiene
un sensore luminale che egrave altamente correlato a quello di IRE-1 il
dominio citoplasmatico di PERK consiste in una chinasi elF2α
16
Figura 2 Struttura dei principali sensori dello stress nel reticolo endoplasmatico IRE1
ATF6 PERK
Lrsquoattivazione delle chinasi dovuta alla presenza di proteine mal
ripiegate determina unrsquoinibizione generalizzata della traduzione come
pure la up-regulation del fattore di trascrizione specifico ATF4
Lrsquoaccumulo di proteine mal ripiegate permette inoltre ad ATF6 di
raggiungere lrsquoapparato del Golgi dove le proteasi trans membrana
rilasciano il dominio citoplasmatico del fattore di trascrizione
permettendogli di entrare nel nucleo e mediare lrsquoinduzione genetica
Lrsquoesistenza di molteplici sensori UPR negli eucarioti piugrave avanzati
permette per lo piugrave una risposta piugrave sfumata alle proteine mal ripiegate
Per esempio una risposta iniziale alle proteine mal ripiegate potrebbe
portare ad una down-regulation generalizzata della traduzione seguita in
sequenza da unrsquoinduzione di chaperoni lrsquoinduzione del macchinario
17
ERAD ed infine contro lo stress prolungato lrsquoattivazione della morte
cellulare tramite apoptosi Molto recentemente ci sono stati notevoli
progressi nelle nostre conoscenze molecolari di come IRE-1 (e per
deduzione PERK) riconosce le proteine mal ripiegate Studi precedenti
avevano dimostrato che BIP (Binding Immunoglobulin Protein) lrsquo
omologo principale delle Hsp70 presente nel reticolo endoplasmatico si
lega in modo specifico con IRE1 e che questa interazione scompare in
condizioni di stress del RE Inoltre lrsquoiperespressione di BiP puograve
sopprimere lrsquoinduzione dellrsquoUPR Questo aveva suggerito un modello di
titolazione in cui BiP agisce come un regolatore negativo di IRE1 e
lrsquoaccumularsi di forme mal ripiegate porta indirettamente allrsquoattivazione
dellrsquoIRE1 attraverso il sequestro di BiP da parte proteine mal ripiegate
Tuttavia recenti studi hanno dimostrato che anche se il legame del BiP
possa avere un ruolo importante nella down-regulation di IRE1 ci sono
altri fattori importanti Analisi mutazionali hanno trovato che la
delezione della regione di IRE1 responsabile del legame con BiP non
altera la regolazione di IRE1 in risposta alle proteine unfolded [18] Piugrave
drammaticamente la struttura cristallina del core del dominio luminale
conservato (cLD) di IRE1 nel lievito rivela una profonda scanalatura
idrofobica che ricorda la tasca legante dei maggiori complessi di
istocompatibilitagrave (MHCs) che sono i responsabili per il riconoscimento
peptidico Che IRE1 possa legarsi direttamente a polipeptidi mal
ripiegati egrave unrsquoidea interessante (Figura 3) [19]
18
Figura 3 Un modello ipotetico descrive lrsquoattivazione di Ire1 attraverso la oligomerizzazione
determinata dal legame di proteine unfolded (indicate in rosso) Le interazioni dirette o
indirette fra le catene delle proteine unfolded possono contribuire allrsquoattivazione Sul lato
luminale della membrana del RE le proteine unfolded si legano alla scanalatura (indicata in
grigio) formata dalla dimerizzazione del core del dominio luminale di Ire1 attraverso
linterfaccia 1 Sul lato citoplasmaticodella membrana del RE la oligmerizzazione accosta i
domini della chinasi Ire 1 che subiscono un cambiamento conformazionale in seguito ad
autofosforilazione che porta allrsquoattivazione della funzione di RNA-ribonucleasi di Ire1
Attraverso il riconoscimento diretto delle forme mal ripiegate
lrsquoinduzione di IRE1 potrebbe verificarsi prima della completa titolazione
di BiP che data lrsquoestrema abbondanza di questrsquoultimo nel RE potrebbe
verificarsi solo dopo un catastrofico accumulo di proteine mal ripiegate
Inoltre il riconoscimento diretto di forme mal ripiegate da parte di IRE1
(e PERK) potrebbe consentire una serie di risposte piugrave sfumate in cui
diverse forme mal ripiegate potrebbero essere preferenzialmente
riconosciute da sensori diversi quali BiP IRE1 o PERK Cosigrave in linea
di principio la natura (per esempio traslazionale contro transcrizionale)
ed il ciclo di UPR potrebbe essere su misura per la classe specifica di
forme mal ripiegate che sono prevalenti nel RE [20]
19
DEGRADAZIONE DELLE PROTEINE ASSOCIATA AL
RETICOLO ENDOPLASMATICO
Come ci si poteva aspettare dalla diversitagrave delle proteine che si
ripiegano NEL RE studi recenti hanno dimostrato che la degradazione
ER-associata (ER-Associated Degradation ERAD) comprende una
serie di sistemi diversi ciascuno responsabile della degradazione di
sottoinsiemi di proteine che condividono proprietagrave fisiche comuni
Esistono anche regioni dedicate allrsquo ER Associated Degradation
(ERAD) nelle quali proteine che non raggiungono il corretto
ripiegamento vengono retrotraslocate al citosol e quindi degradate dal
proteasoma [21]
Ciograve forse egrave piugrave chiaramente dimostrato nel lievito dove ci sono almeno
due distinti meccanismi di sorveglianza per identificare le proteine mal
ripiegate del RE Il primo meccanismo chiamato ERAD-L analizza le
proteine che contengono domini luminali mal ripiegati (solubili o trans
membrana) chiamati CPY una forma mutante della proteina CPY
endogena che egrave incapace di folding Il secondo denominato ERAD-C
rileva domini mal ripiegati citosolici di proteine trans membrana [22]
Sebbene entrambe queste vie in ultima analisi convergano sul sistema
di degradazione ubiquitina-proteosoma esse dipendono da diversi
insiemi di componenti RE-associati per rivelare e fornire specie mal
ripiegate al citosol Nel caso di ERAD-C (e non di ERAD-L) la
degradazione egrave in genere dipendente da uno specifico sottoinsieme di
chaperoni citosolici inclusi i membri Hsp40 e Hsp70 Ciograve suggerisce
che queste proteine possono essere direttamente responsabili per il
riconoscimento di domini citosolici mal ripiegati di proteine trans
membrana Tuttavia le caratteristiche esatte che vengono monitorate e
20
come i substrati vengano consegnati al macchinario di
retrotranslocazione restano importanti questioni aperte per la maggior
parte dei substrati Il riconoscimento di una proteina contenente un
dominio luminale mal ripiegato dipende in modo determinante dallo
stato di glicosilazione della proteina Infatti anche piccole modifiche di
glicani N-linked puograve provocare danni gravi nella degradazione di
numerosi substrati Questo puograve effettivamente lasciare le proteine in un
limbo impossibile raggiungere lo stato nativo ma non riconosciuto dal
macchinario ERAD esse restano mal ripiegate nel RE a tempo
indeterminato A prima vista questa dipendenza dalla glicosilazione
sembra essere un miglioramento non necessario Tuttavia egrave ormai chiaro
che lo spettro di porzioni di zucchero presenti in una proteina egrave un
segnale fondamentale nel marcare il suo status di ripiegamento Infatti
dato che diverse proteine altamente abbondanti nel RE tra cui BiP e
PDI spesso non sono glicosilate la presenza e la natura covalente di
molto mannosio in un polipeptide puograve fornire un segnale importante che
aiuta il macchinario di controllo-qualitagrave del RE a distinguere le specie
ripiegate destinate ad altri scomparti da quelle piugrave abbondanti e
permanenti del RE Lrsquointuizione nel ruolo della glicosilazione nella
discriminazione tra le specie in via di ripiegamento e le proteine
terminali mal ripiegate nel RE egrave venuta dalla constatazione che
glicoproteine mal ripiegate subiscono un taglio dei loro N-glicani da una
varietagrave di glicosidasi tra cui una mannossidasi specifica In aggiunta a
proteine mal ripiegate persistenti si egrave pensato che il rimodellamento
dipendente dal tempo di N-glicani porti ad un segnale per la
degradazione del macchinario ERAD Questo permette intermedi
ripiegati in un periodo di tempo prima del rimodellamento dei loro N-
glicani in cui il polipeptide egrave immune dalla sorveglianza ERAD Egrave
21
interessante notare che un recente studio suggerisce che anche per i
polipeptidi citosolici vi egrave un periodo durante e subito dopo la sintesi in
cui le specie mal ripiegate sono immuni alla degradazione del
proteasoma [23] Recenti studi hanno identificato due differenti lettine
localizzate nel RE che svolgono un ruolo critico nellrsquoERAD La prima egrave
correlata alla proteina mannossidasi responsabile del taglio di N-glicani
nel RE ma sembra aver perso la sua attivitagrave catalitica Nel lievito si
chiama Htm1pMnl1p e nei mammiferi egrave chiamato EDEM Studi
condotti su cellule di mammifero suggeriscono che EDEM aiuta le
glicoproteine mal ripiegate a lasciare il ciclo calnexinacalreticulina del
chaperone lectina dove stanno cercando di ripiegarsi e cosigrave entrare nel
ciclo di degradazione [24 ab] Tuttavia nel lievito Htm1p egrave richiesto
per la degradazione efficiente di substrati come CPY che non
dipendono da calnexina Quindi sembra probabile che Htm1pEDEM
ricopra altri ruoli in ERAD La seconda lectina Yos9p forma un
complesso stabile con proteine mal ripiegate e la perdita di questa
lectina conduce ad un profondo e specifico difetto nella degradazione di
glicoproteine mal ripiegate [25] Sorprendentemente mentre mutazioni
puntiformi nella tasca di Yos9p legante il mannosio eliminano la sua
capacitagrave di supportare ERAD i mutanti stessi di Yos9p mostrano una
maggior interazione con i substrati Ciograve indica la possibilitagrave che la
lectina Yos9p svolga un ruolo piugrave informativo interrogando lo stato
dello zucchero di forme mal ripiegate per determinare se debbano essere
passate al macchinario di retrotranslocazione Tuttavia come con
ERAD-C sebbene ci siano stati grandi progressi nella caratterizzazione
del macchinario di retrotranslocazione [26] le caratteristiche strutturali
delle proteine mal ripiegate sono in fase di monitoraggio e sono ancora
22
limitate le conoscenzedi come le forme mal ripiegate sono passate a
questo macchinario
CLEARENCE DI AGGREGATI ATTRAVERSO
LrsquoAUTOFAGIA
Egrave sempre piugrave evidente che ci sono una varietagrave di condizioni in vivo che
anche con chaperoni e macchinari proteolitici presenti nello stesso
compartimento come proteine mal ripiegate questi meccanismi di
controllo-qualitagrave falliscono e le proteine mal ripiegate avanzano
formando aggregati Inoltre tali aggregati intracellulari sono associati
con una serie di malattie neurodegenerative come il morbo di
Huntington e di Parkinson La natura e la sorte di aggregati di proteine
nelle cellule eucariotiche egrave stata poco compresa Recentemente egrave stata
sempre piugrave sostenuta unrsquoazione protettiva della formazione di aggregati
piuttosto che unrsquoimmediata azione patogena Per esempio nel caso del
morbo di Huntington lrsquoesame di cellule neuronali in coltura
sovrapproducenti una fusione di poliglutamina espansa e huntingtina-
GFP rivelano che queste cellule contenenti aggregati fluorescenti
morfologicamente visibili esibiscono una migliore viabilitagrave rispetto a
quelle aventi per via diffusionale materiale fluorescente [27] Questo
sembra in accordo con il concetto che si tratta di piccoli assemblati di
proteine mal ripiegate inclusioni non morfologicamente visibili che
esercitano effetti tossici sulle cellule Analogamente un recente
confronto delle dimensioni rispetto a tossicitagrave per gli aggregati di
proteina prionica PrP suggerisce che piccoli aggregati contenenti da una
a due dozzine di molecole sono risultati i piugrave tossici per le cellule [28]
23
Ma le cellule dispongono di meccanismi di compensazione per questi
piccoli aggregati Studi recenti hanno suggerito che la via ubiquitina-
proteosoma possa essere il pilastro della rimozione di specie inclini
allrsquoaggregazione Infatti gli aggregati rilevati nel contesto di
neurodegenerazione di solito sono reattivi con gli anticorpi anti-
ubiquitina il che implica che le specie mal ripiegate sono state
riconosciute dal sistema di coniugazione dellubiquitina Eppure vari
studi di questi ultimi anni indicano che queste proteine modificate
rappresentano una sfida particolare per proteasomi che possono portare
alla loro inibizione [29 ab] Il meccanismo di questa inattivazione
rimane sconosciuto ma puograve coinvolgere il soffocamento della camera
del proteasoma [30]
Anatomia del proteasoma Il proteasoma egrave una macromolecola proteica del peso di circa 2 milioni
di Daltons Ersquo formata da ununitagrave base centrale (core) e 2 cappucci agli estremi (cap) Il core egrave
formato a sua volta da 4 anelli ciascuno costituito da 7 unitagrave proteiche I due ldquocaprdquo attaccati alle
due estremitagrave del core cilindrico consistono ciascuno di 20 subunitagrave
24
Ora sembra che la modifica dellrsquoubiquitina possa reclutare specie
aggregate mediante una via indipendente lrsquoAUTOFAGIA Lrsquoautofagia
implica il riconoscimento e lrsquoimpacchettamentofagocitazione di
proteine specifiche o organelli in vescicole autofagosomiche che si
fondono con i lisosomi in cui sia le vescicole che il loro contenuto sono
scomposti Piugrave di 20 componenti cosiddetti Atg (geni coinvolti
nellrsquoautofagia) mediano questo processo straordinario Recenti studi
hanno dimostrato che componenti centrali della formazione di autosomi
nei topi hanno attivitagrave nei tessuti dei mammiferi Per esempio carenza
di atg5 ha portato alla morte di animali appena nati a causa
dellrsquoincapacitagrave di fornire un apporto di aminoacidi attraverso la
degradazione di proteine del corpo durante la condizione di fame
relativa allrsquoimmediato periodo post-natale Sorprendentemente in un
altro studio in cui egrave stata indotta una carenza di atg7 piugrave avanti nella
vita con un gene ldquofloxedrdquo lrsquoaccumulo di aggregati positivi
allrsquoubiquitina egrave stata osservata nel fegato degli animali che sono stati
disabilitati nella produzione di autofagosomi La funzione del
proteasoma in questi animali egrave rimasta inalterata contenente specie mal
ripiegate etichettate con ubiquitina e possono essere eliminate attraverso
autofagia Egrave stato poi scoperto un componente denominato p62 (o
sequestosoma1) che costituisce un guscio attorno agli aggregati di
huntingtina [31] Questa proteina contiene un dominio C-terminale
associato allrsquoubiquitina (UBA) che puograve legare poliubiquitine in modo
tale che p62 si collochi con lrsquoubiquitina quando espressa in cellule
HeLa Inoltre nelle cellule che esprimono huntigtina p62 si associa con
LC3 una proteina localizzata negli autofagosomi In accordo con quanto
riportato e cioegrave che lrsquoautofagia riduce i livelli di aggregati di
huntingtina e con un ruolo critico di p62 in questo processo lrsquoinibizione
25
antisenso mediata dallrsquoesperessione di p62 aumenta lrsquoapoptosi delle
cellule che esprimono huntungtina Quindi sembra che la modifica
dellrsquoubiquitina delle proteine difettose possa offrire un ingresso sia al
sistema proteasoma o in contesti dove lrsquoaggregazione egrave in corso al
sistema autofagia
SISTEMI CHAPERONI HSP70
Le Hsp70 proteine dello shock termico di 70 KDa sono impegnate in
una serie di processi tra cui il ripiegamento di proteine di nuova sintesi
il trasporto delle proteine attraverso membrane il ripiegamento di
proteine mal ripiegate ed aggregate e il controllo delle attivitagrave delle
proteine regolatrici Questa versatilitagrave egrave ottenuta attraverso
lampliamento e la diversificazione evolutiva di geni hsp70 che ha
generato sia chaperoni Hsp70 specifici Hsp110 e proteine Hsp170 La
versatilitagrave egrave determinata attraverso lrsquoimpiego di cochaperoni proteine J
e fattori di scambio di nucleotide (NEF) che regolano lrsquoattivitagrave di Hsp70
(Figura 4)
26
Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame
del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una
Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)
Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la
proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato
allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del
substrato
Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre
specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb
Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di
legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un
numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame
dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi
Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina
Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni
Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali
di Hsp70 con se stesso
27
INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70
Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di
proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura
xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding
appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide
N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD
adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio
elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con
lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante
chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco
tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini
di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di
comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura
di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione
La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la
tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo
coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture
precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una
proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da
una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β
ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica
compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio
elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di
legame del substrato (Figura 5)
28
Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo
substrato
La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra
domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che
collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo
solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi
residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame
allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A
dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso
Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un
legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in
nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano
completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve
entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo
fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui
coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del
segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti
integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A
29
capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il
quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di
ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a
idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di
DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro
catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente
arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia
drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete
crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la
barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK
costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina
superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura
della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera
attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della
prolina
DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-
NUCLEOTIDE
Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi
meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono
fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la
liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del
substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la
dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine
BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave
dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con
30
funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S
cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1
(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la
disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e
HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70
fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi
della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente
indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene
GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg
di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei
nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte
posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i
nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario
BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in
modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del
complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si
compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo
Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva
[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con
conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve
indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca
di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di
convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la
reazione di scambio nucleotidica di Hsp70
31
LEGAMI Hsp70-Hsp70
Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro
della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In
particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce
come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola
lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di
questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento
Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il
cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che
sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi
eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente
lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se
non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di
complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di
nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di
scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione
importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto
di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel
folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle
Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza
proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa
con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere
coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di
traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina
Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come
sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le
interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di
32
Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi
SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua
attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano
legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di
idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede
possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano
lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina
stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che
Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami
con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina
J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di
stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega
bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o
Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non
limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che
la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-
associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con
Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito
meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande
aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante
per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70
AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP
Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli
AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione
disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]
33
Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un
anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del
proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico
20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA
svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP
Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104
nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico
per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste
attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come
una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-
etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE
per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla
fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il
meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere
tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria
per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli
anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una
parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali
suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata
assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando
una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a
spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad
entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel
caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro
che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti
dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una
proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In
parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno
34
individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi
domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre
interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta
apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati
che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la
questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)
Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97
Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da
proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad
entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro
efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non
devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati
dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte
lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono
piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte
superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine
adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il
35
movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori
p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su
proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di
proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la
retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e
reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo
anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite
adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente
il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente
forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei
canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]
LrsquoAZIONE DELLrsquoATP
La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico
al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco
affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad
esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello
Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che
ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo
di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli
wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli
mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori
dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di
ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di
un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di
quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda
36
subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino
al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave
significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o
sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti
differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra
essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che
attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave
adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non
vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a
cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di
subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico
Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un
substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di
queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un
meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da
F1-ATPasi non sembra escluso
HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE
NEURODEGENERATIVE
RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE
Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel
mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una
pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi
associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione
37
di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di
Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta
promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]
Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90
nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave
funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi
permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]
HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico
Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono
mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)
accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock
citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata
da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante
di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo
stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si
lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei
geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-
shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via
multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di
transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-
translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90
[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e
mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo
shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con
Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)
38
attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da
shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni
Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che
i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro
sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock
termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su
attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato
che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi
di insulti
Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90
e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con
shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La
somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a
topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello
39
Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge
contro aggregati tossici
Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un
aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave
egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di
chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione
incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste
molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente
diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su
espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative
Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie
neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a
mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei
neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia
muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-
pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma
mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme
nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che
Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in
oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza
attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili
[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di
Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt
mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore
di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo
suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro
effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi
40
indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando
monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono
probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono
essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di
atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70
permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]
Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare
spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo
nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un
miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina
[62]
Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il
riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso
lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido
dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli
di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i
motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione
acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni
Riluzolo
Arimoclomol
41
Nei vari modelli cellulari della malattia di Alzheimer (AD) vi egrave un
incremento dei livelli di Hsp70 promossa dalla solubilitagrave e dal legame ai
microtubuli delle proteine tau [63] Hsp70 ha anche inibito la
propensione di aggregazione di Aβ [64] e ridotto la tossicitagrave di Aβ su
culture neuronali [65] Inoltre la proteina precursore dellrsquoamiloide
(APP) eo il suo Aβ amiloide derivato sono bersagli di chaperoni
mediati da clearence [66-67] Nella Drosophila melanogaster e nei
modelli di lievito della malattia di Parkinson (PD) lrsquoespressione diretta
di Hsp70 o la modulazione farmacologica di Hsp ha impedito la perdita
di neuroni causata da alfa-sinucleina [68-69] Huang et al hanno
riportato che questi effetti di Hsp70 si manifestano con lrsquoinibizione della
formazione di fibrille di alfa-sinucleina prevenendo la formazione di
alfa-sinucleina prefibrillare [70] Usando delezioni mutanti di alfa-
sinucleina Luk et al hanno indicato che le interazioni tra il dominio
legante il substrato Hsp70 e la regione del core idrofobico dellrsquoalfa-
sinucleina mediano lrsquoinibizione dellrsquoassemblaggio e che questo
processo di assemblaggio egrave inibito prima della fase di allungamento
[71] Nel complesso in diversi modelli di malattia neurodegenerativa la
sovra espressione di Hsp70 ha migliorato la gravitagrave della malattia di
fenotipi diversi senza incidere visibilmente sulla formazione di
aggregati suggerendo che i chaperoni non impediscono lrsquoaggregazione
di per seacute bensigrave reindirizzano gli aggregati preferibilmente in depositi
amorfi quindi sequestrando specie potenzialmente tossiche dalla
maggior parte della soluzione
42
Lrsquoespressione di Hsp70 e di altre Hsp egrave indotta dallrsquoinibizione
farmacologica di Hsp90
Come riportato sopra lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal
complesso con Hsp90 con susseguente produzione di Hsp (Figura 7) e
lrsquoinduzione di Hsp70 da parte di inibitori di Hsp90 egrave ben documentata
nei modelli di malattie neurodegenerative La geldanamicina (GM) un
inibitore di Hsp90 induce un aumento dose dipendente di Hsp70 nei
modelli di cellule di AD (Alzhaimer) cosigrave come nei neuroni della
corteccia primaria del ratto e riduce la quantitagrave di tau insolubili e dei
livelli basali di acido okadaico indotto da tau fosforilazione [63] Il
trattamento di neuroni primari corticali con lrsquoinibitore di Hsp90 con
struttura purinica il PU24FCI ha portato ad un aumento di Hsp70 dose-
dipendente [72]
PU24FCI
KU32
43
Allo stesso modo la somministrazione di due derivati di PU24FCI
CNS-permeabili il PU-DZ8 [72] ed il EC102 [73] a topi tau transgenici
(htau e JNPL3) ha determinato induzione di Hsp70 nel cervello e
mantenuto gli effetti per 24 ore dopo la somministrazione KU32 un
inibitore di Hsp90 di diversa natura chimica ha indotto Hsp70 in culture
SH-SY5Y di neuroblastoma e la ha protetta da tossicitagrave indotta da Aβ
GM ha attivato una risposta da shock termico ed inibito lrsquoaggregazione
di htt in un modello di coltura cellulare di HD ed ha indotto Hsp70 in
maniera tempo e concentrazione-dipendente ed ha impedito
lrsquoaggregazione di alfa-sinucleina e protetto contro la tossicitagrave in un
modello di aggregazione cellulare di alfa-sinucleina Auluck et al hanno
segnalato che il trattamento di un modello volante di PD con GM ha
protetto completamente contro tossicitagrave per alfa-sinucleina [74] GM ha
protetto anche contro la neurotossicitagrave dopaminergica indotta da 1-metil-
4-fenil-1236-tetraidropiridina (MPTP) in un modello di topo di PD Il
pretrattamento con GM mediante iniezione ventricolare intracerebrale
prima del trattamento con MPTP ha indotto le Hsp70 ed incrementato il
contenuto residuale di dopamina e lrsquoimmuno reattivitagrave della tirosina
idrolasi nel corpo striato [75] Lrsquoinduzione di Hsp70 nel midollo spinale
egrave stata osservata in seguito ad iniezione intraperitoneale di un derivato
della GM il 17-AAG in un modello di SBMA topo [76] Il 17-AAG egrave
stato anche efficace contro la nuerodegenerazione in altre malattie
poliQ Vale a dire ha soppresso la degenerazione dellrsquoocchio e la
formazione di inclusioni del corpo e salvato dalla letalitagrave in un modello
di SCA di Drosophila Ha inoltre soppresso la neurodegenerazione in un
modello volante di HD La riduzione di HSF-1 ha abolito lrsquoinduzione di
chaperoni molecolari e gli effeti terapeutici di 17-AAG sulla
neurodegenerazione poliQ indotta nei modelli di Drosophila facendo
44
arguire che lrsquoeffetto terapeutico di 17-AAG egrave essenzialmente mediato da
HSF-1 [77] Riassumendo lrsquoattivazione di HSF-1 da inibitori di Hsp90
egrave stata notata specificamente in modelli in vivo ed in vitro di malattie
neurodegenerative suggerendo che lrsquoinibizione di Hsp90 puograve essere un
mezzo per modulare i livelli di Hsp in cervelli malati con lrsquoobbiettivo di
proteggere contro le proteine tossiche che si presentano nel corso del
processo neurodegenerativo
Lrsquoinibizione di Hsp90 riduce lrsquoattivitagrave e lrsquoespressione di proteine
neuronali aberranti
In aggiunta alla regolazione di HSF-1 evidenze recenti suggeriscono un
ruolo addizionale per Hsp90 nel mantenimento della stabilitagrave funzionale
della capacitagrave aberrante di proteine neuronali (Figura 8A)
La SBMA egrave una malattia ereditaria dei motoneuroni causata
dallrsquoaccrescimento di un tratto di poliglutamina allrsquointerno del recettore
androgeno (AR) [57]
Le caratteristiche patologiche di SBMA sono perdita dei motoneuroni
nel midollo spinale e nel tronco cerebrale diffusione dellrsquoaccumulo
nucleare inclusioni nucleari di mutanti AR (mAR) nei motoneuroni
residui e in alcuni organi viscerali Waza et al hanno dimostrato che
mAR presente in SBMA egrave una delle proteine regolate da Hsp90 (Figura
8A) [76]
45
Figura 8 Le Hsp90 riparano le proteine neuronali aberranti (A) Proteine neuronali
aberranti regolate da Hsp90 (B) Lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90porta allrsquoinattivazione
o degradazione delle proteine regulate da Hsp90 probabilmente attraverso la via del
proteasoma
Le Hsp90 formano un complesso molecolare con mAR per il
mantenimento della sua stabilitagrave funzionale Sia in modelli cellulari di
SBMA che in topi transgenici lrsquoinibizione di Hsp90 da parte di 17-
AAG il derivato 17 allilammino-17-demetossi della geldanamicina ha
46
portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal
macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati
disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da
destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione
dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di
SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave
rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati
[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori
hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo
sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa
(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni
Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]
Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo
egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali
sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al
hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina
(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi
familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un
complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data
da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto
47
lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della
stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave
dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita
neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei
neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che
codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a
PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson
familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson
suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente
associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che
Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate
con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente
diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina
egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille
ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno
recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di
alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che
sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina
[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce
lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari
Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-
dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento
tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-
sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da
chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di
mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il
macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD
associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-
48
sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative
caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave
caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di
tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD
lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da
unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina
chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta
(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si
era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero
netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un
gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e
Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave
causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma
17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau
[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine
neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso
portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina
mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da
Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei
modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave
patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-
dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla
settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad
una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di
tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno
dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una
diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di
AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le
49
relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la
degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90
[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al
(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave
stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da
GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β
effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi
GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di
Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe
portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in
strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati
indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone
biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione
di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da
parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi
proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di
queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)
Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie
neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio
approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare
dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la
formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione
potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di
Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare
terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare
malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo
centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90
puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione
50
successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti
neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti
clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto
che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono
tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in
modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni
nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati
promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio
spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in
modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di
Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a
lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse
da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase
esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora
rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori
dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per
mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie
neurodegenerative
51
SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-
ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-
METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE
(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE
MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO
SULLA FRAMMENTAZIONE
Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in
risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta
nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine
regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il
ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai
loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine
client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro
cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire
su molti percorsi oncogenici
Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il
nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che
lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati
composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP
attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del
processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono
emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i
tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule
normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina
(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una
maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto
che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una
piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
12
CHAPERONINE MOLECOLARI E CONTROLLO
QUALITArsquo DELLE PROTEINE
Nelle cellule viventi sia le catene polipeptidiche di nuova sintesi che le
preesistenti sono a rischio costante di mal ripiegamento
(MISFOLDING) o aggregazione In conformitagrave con lrsquoampia diversitagrave di
forme mal ripiegate lrsquoelaborazione di strategie di controllo qualitagrave si
sono evolute per opporsi a questa inevitabile disavventura Recenti studi
descrivono la rimozione di aggregati dal citosol rivelano meccanismi di
controllo di qualitagrave per proteine nel reticolo endoplasmatico (RE) e
forniscono nuove intuizioni in due classi di chaperoni molecolari
lrsquoHsp70 (Heat Shock Protein 70) e lrsquoAAA+ (Hsp100) [15]
FOLDING DI PROTEINE NEL RETICOLO
ENDOPLASMATICO RICONOSCERE IL GIUSTO
DALLO SBAGLIATO
Il reticolo endoplasmatico (ER) un organulo presente sia nelle cellule
animali che vegetali svolge un ruolo premimente in numerosi processi
di fondamentale importanza per la sopravvivenza e per il normale
funzionamento cellulare LER occupa circa il 10 del volume della
cellula e la metagrave della superficie coperta da tutte le membrane della
cellula (endomembrane piugrave membrana plasmatica) [16]
Il reticolo endoplasmatico (RE) riveste numerose funzioni vitali per la
cellula Tra le tante egrave la stazione iniziale della via secretoria ed egrave quindi
il luogo nel quale circa un terzo di tutte le proteine di una cellula viene
sintetizzato e ripiegato correttamente [17] in secondo luogo lrsquoER egrave il
13
punto di partenza dal quale numerose proteine vengono smistate e
indirizzate verso la loro destinazione finale [18]
LrsquoER egrave quindi la sede della sintesi del ripiegamento (ldquofoldingrdquo) e delle
modificazioni post-traduzionali delle proteine di membrana e secrete ed
egrave responsabile della maturazione strutturale di un quarto del proteasoma
che attraversa le vie secretorie
Il ripiegamento delle proteine secretorie fornisce una serie di sfide
uniche in quanto egrave accompagnato e dipendente dalla formazione di ponti
disolfuro ed inserzioni nel doppio strato lipidico con entrambi gli eventi
che si verificano piugrave lentamente di tipici cambi conformazionali che
accompagnano il ripiegamento Conseguentemente il RE fornisce le
condizioni ottimali per fronteggiare queste sfide includendo unrsquoalta
concentrazione di chaperoni generici oltre a una gamma di specifiche
strategie fatte su misura per favorire il ripiegamento delle proteine
secretorie Inoltre esiste un sofisticato sistema di controllo-qualitagrave nel
RE per trattenere e riparare proteine che non hanno raggiunto ancora il
loro stato naturale Malgrado la lunghezza con la quale le cellule vanno
a fornire un ambiente ottimale nel RE il ripiegamento delle proteine
secretorie puograve avvenire o manca a volte ad un ritmo allarmante Il RE
adopera due meccanismi di risposta in presenza di forme mal ripegate Il
primo meccanismo egrave una risposta allo stress RE-dedicato definito UPR
(risposta alla non corretta conformazione delle proteine) che attua il
rimodellamento del RE cosigrave da aumentare la sua capacitagrave di
ripiegamento [16] Una proteina malfunzionante rimane sequestrata nel
reticolo endoplasmatico quindi un eccesso di proteine mal strutturate
attiva la risposta da proteine con folding scorretto (Unfolded Protein
Response) Questo tipo di risposta inizia con il riconoscimento del
segnale di stress da parte di un recettore nel reticolo endoplasmatico e
14
prosegue con il blocco della sintesi proteica per permettere al
proteasoma di eliminare lrsquoeccesso di proteine mentre viene stimolata la
produzione di fattori di trascrizione Il secondo meccanismo chiamato
degradazione RE-associata (ERAD) riconosce in modo specifico le
parti terminali di proteine mal ripiegate e le loro retrotraslocazioni
attraverso la membrana del reticolo endoplasmatico nel citosol dove
possono essere degradate dal sistema di degradazione ubiquitina-
proteosoma [17] Questi due meccanismi sono intimamente collegati
lrsquoinduzione UPR aumenta la capacitagrave dellrsquoERAD una diminuzione
dellrsquoERAD comporta unrsquoinduzione dellrsquoUPR costitutivo e
contemporaneamente la diminuzione di ERAD e UPR fa diminuire di
molto la viabilitagrave delle cellule I sistemi UPR ed ERAD fronteggiano
anche il comune problema del riconoscimento che richiede
lrsquoidentificazione delle forme mal ripiegate potenzialmente patologiche
nellrsquoambiente del RE La sorveglianza di UPR ed ERAD deve garantire
un buon equilibrio proteggendo le cellule dalle pericolose specie mal
ripiegate evitando la sovra vigilanza (come accade con forme mutate di
regolatori trans membrana della fibrosi cistica CFTR) che puograve portare
allrsquoeliminazione di forme potenzialmente sanabili Recenti studi hanno
rivelato come ERAD ed UPR identifichino forme mal ripiegate
Pertanto il RE rappresenta un preciso sistema di controllo di qualitagrave atto
ad assicurare che solo le proteine correttamente ripiegate e funzionanti
possano essere rilasciate dallrsquoER e raggiungere la loro destinazione
finale mentre le proteine malripiegate o non funzionanti sono trattenute
nel ER e in seguito traslocate nel citosol per la degradazione
15
RISPOSTA ALLA NON CORRETTA
CONFORMAZIONE DELLE PROTEINE
Le proteine designate per il riconoscimento dei segnali di stress
provenienti dal reticolo endoplasmatico sono generalmente IRE1
(Inositol Requiring Kinase 1) ATF6 (Activation of Transcription Factor
6) e PERK (PKR-like Endoplasmic Reticulum Kinase)
Nel lievito la capacitagrave di ripiegarsi del RE egrave monitorata da IRE1 una
chinasi trans membrana altamente conservata che contiene un dominio
luminale responsabile del riconoscimento delle forme mal ripiegate
chinasi citosoliche e domini ribonucleasici Lrsquoaccumularsi delle proteine
mal ripiegate nel RE porta allrsquoattivazione delle chinasi IRE
Lrsquoattivazione delle IRE-chinasi promuove lo splicing non convenzionale
dei messaggi per un fattore di traduzione b-ZIP (Hac1 nel lievito e XBP-
1 nei metazoi) attraverso il suo dominio ribonucleasico La traduzione
del messaggio Hac 1 spliced crea un fattore attivo di trascrizione che
media direttamente la trascrizione dei target di UPR includendo
chaperoni del RE macchinario ERAD e tante altre proteine secretorie
In aggiunta alla IRE-1 gli eucarioti piugrave sviluppati utilizzano due altri
sensori le chinasi trans membrana del RE PERK ed il fattore di
trascrizione trans membrana del RE ATF6 (Figura 2) PERK contiene
un sensore luminale che egrave altamente correlato a quello di IRE-1 il
dominio citoplasmatico di PERK consiste in una chinasi elF2α
16
Figura 2 Struttura dei principali sensori dello stress nel reticolo endoplasmatico IRE1
ATF6 PERK
Lrsquoattivazione delle chinasi dovuta alla presenza di proteine mal
ripiegate determina unrsquoinibizione generalizzata della traduzione come
pure la up-regulation del fattore di trascrizione specifico ATF4
Lrsquoaccumulo di proteine mal ripiegate permette inoltre ad ATF6 di
raggiungere lrsquoapparato del Golgi dove le proteasi trans membrana
rilasciano il dominio citoplasmatico del fattore di trascrizione
permettendogli di entrare nel nucleo e mediare lrsquoinduzione genetica
Lrsquoesistenza di molteplici sensori UPR negli eucarioti piugrave avanzati
permette per lo piugrave una risposta piugrave sfumata alle proteine mal ripiegate
Per esempio una risposta iniziale alle proteine mal ripiegate potrebbe
portare ad una down-regulation generalizzata della traduzione seguita in
sequenza da unrsquoinduzione di chaperoni lrsquoinduzione del macchinario
17
ERAD ed infine contro lo stress prolungato lrsquoattivazione della morte
cellulare tramite apoptosi Molto recentemente ci sono stati notevoli
progressi nelle nostre conoscenze molecolari di come IRE-1 (e per
deduzione PERK) riconosce le proteine mal ripiegate Studi precedenti
avevano dimostrato che BIP (Binding Immunoglobulin Protein) lrsquo
omologo principale delle Hsp70 presente nel reticolo endoplasmatico si
lega in modo specifico con IRE1 e che questa interazione scompare in
condizioni di stress del RE Inoltre lrsquoiperespressione di BiP puograve
sopprimere lrsquoinduzione dellrsquoUPR Questo aveva suggerito un modello di
titolazione in cui BiP agisce come un regolatore negativo di IRE1 e
lrsquoaccumularsi di forme mal ripiegate porta indirettamente allrsquoattivazione
dellrsquoIRE1 attraverso il sequestro di BiP da parte proteine mal ripiegate
Tuttavia recenti studi hanno dimostrato che anche se il legame del BiP
possa avere un ruolo importante nella down-regulation di IRE1 ci sono
altri fattori importanti Analisi mutazionali hanno trovato che la
delezione della regione di IRE1 responsabile del legame con BiP non
altera la regolazione di IRE1 in risposta alle proteine unfolded [18] Piugrave
drammaticamente la struttura cristallina del core del dominio luminale
conservato (cLD) di IRE1 nel lievito rivela una profonda scanalatura
idrofobica che ricorda la tasca legante dei maggiori complessi di
istocompatibilitagrave (MHCs) che sono i responsabili per il riconoscimento
peptidico Che IRE1 possa legarsi direttamente a polipeptidi mal
ripiegati egrave unrsquoidea interessante (Figura 3) [19]
18
Figura 3 Un modello ipotetico descrive lrsquoattivazione di Ire1 attraverso la oligomerizzazione
determinata dal legame di proteine unfolded (indicate in rosso) Le interazioni dirette o
indirette fra le catene delle proteine unfolded possono contribuire allrsquoattivazione Sul lato
luminale della membrana del RE le proteine unfolded si legano alla scanalatura (indicata in
grigio) formata dalla dimerizzazione del core del dominio luminale di Ire1 attraverso
linterfaccia 1 Sul lato citoplasmaticodella membrana del RE la oligmerizzazione accosta i
domini della chinasi Ire 1 che subiscono un cambiamento conformazionale in seguito ad
autofosforilazione che porta allrsquoattivazione della funzione di RNA-ribonucleasi di Ire1
Attraverso il riconoscimento diretto delle forme mal ripiegate
lrsquoinduzione di IRE1 potrebbe verificarsi prima della completa titolazione
di BiP che data lrsquoestrema abbondanza di questrsquoultimo nel RE potrebbe
verificarsi solo dopo un catastrofico accumulo di proteine mal ripiegate
Inoltre il riconoscimento diretto di forme mal ripiegate da parte di IRE1
(e PERK) potrebbe consentire una serie di risposte piugrave sfumate in cui
diverse forme mal ripiegate potrebbero essere preferenzialmente
riconosciute da sensori diversi quali BiP IRE1 o PERK Cosigrave in linea
di principio la natura (per esempio traslazionale contro transcrizionale)
ed il ciclo di UPR potrebbe essere su misura per la classe specifica di
forme mal ripiegate che sono prevalenti nel RE [20]
19
DEGRADAZIONE DELLE PROTEINE ASSOCIATA AL
RETICOLO ENDOPLASMATICO
Come ci si poteva aspettare dalla diversitagrave delle proteine che si
ripiegano NEL RE studi recenti hanno dimostrato che la degradazione
ER-associata (ER-Associated Degradation ERAD) comprende una
serie di sistemi diversi ciascuno responsabile della degradazione di
sottoinsiemi di proteine che condividono proprietagrave fisiche comuni
Esistono anche regioni dedicate allrsquo ER Associated Degradation
(ERAD) nelle quali proteine che non raggiungono il corretto
ripiegamento vengono retrotraslocate al citosol e quindi degradate dal
proteasoma [21]
Ciograve forse egrave piugrave chiaramente dimostrato nel lievito dove ci sono almeno
due distinti meccanismi di sorveglianza per identificare le proteine mal
ripiegate del RE Il primo meccanismo chiamato ERAD-L analizza le
proteine che contengono domini luminali mal ripiegati (solubili o trans
membrana) chiamati CPY una forma mutante della proteina CPY
endogena che egrave incapace di folding Il secondo denominato ERAD-C
rileva domini mal ripiegati citosolici di proteine trans membrana [22]
Sebbene entrambe queste vie in ultima analisi convergano sul sistema
di degradazione ubiquitina-proteosoma esse dipendono da diversi
insiemi di componenti RE-associati per rivelare e fornire specie mal
ripiegate al citosol Nel caso di ERAD-C (e non di ERAD-L) la
degradazione egrave in genere dipendente da uno specifico sottoinsieme di
chaperoni citosolici inclusi i membri Hsp40 e Hsp70 Ciograve suggerisce
che queste proteine possono essere direttamente responsabili per il
riconoscimento di domini citosolici mal ripiegati di proteine trans
membrana Tuttavia le caratteristiche esatte che vengono monitorate e
20
come i substrati vengano consegnati al macchinario di
retrotranslocazione restano importanti questioni aperte per la maggior
parte dei substrati Il riconoscimento di una proteina contenente un
dominio luminale mal ripiegato dipende in modo determinante dallo
stato di glicosilazione della proteina Infatti anche piccole modifiche di
glicani N-linked puograve provocare danni gravi nella degradazione di
numerosi substrati Questo puograve effettivamente lasciare le proteine in un
limbo impossibile raggiungere lo stato nativo ma non riconosciuto dal
macchinario ERAD esse restano mal ripiegate nel RE a tempo
indeterminato A prima vista questa dipendenza dalla glicosilazione
sembra essere un miglioramento non necessario Tuttavia egrave ormai chiaro
che lo spettro di porzioni di zucchero presenti in una proteina egrave un
segnale fondamentale nel marcare il suo status di ripiegamento Infatti
dato che diverse proteine altamente abbondanti nel RE tra cui BiP e
PDI spesso non sono glicosilate la presenza e la natura covalente di
molto mannosio in un polipeptide puograve fornire un segnale importante che
aiuta il macchinario di controllo-qualitagrave del RE a distinguere le specie
ripiegate destinate ad altri scomparti da quelle piugrave abbondanti e
permanenti del RE Lrsquointuizione nel ruolo della glicosilazione nella
discriminazione tra le specie in via di ripiegamento e le proteine
terminali mal ripiegate nel RE egrave venuta dalla constatazione che
glicoproteine mal ripiegate subiscono un taglio dei loro N-glicani da una
varietagrave di glicosidasi tra cui una mannossidasi specifica In aggiunta a
proteine mal ripiegate persistenti si egrave pensato che il rimodellamento
dipendente dal tempo di N-glicani porti ad un segnale per la
degradazione del macchinario ERAD Questo permette intermedi
ripiegati in un periodo di tempo prima del rimodellamento dei loro N-
glicani in cui il polipeptide egrave immune dalla sorveglianza ERAD Egrave
21
interessante notare che un recente studio suggerisce che anche per i
polipeptidi citosolici vi egrave un periodo durante e subito dopo la sintesi in
cui le specie mal ripiegate sono immuni alla degradazione del
proteasoma [23] Recenti studi hanno identificato due differenti lettine
localizzate nel RE che svolgono un ruolo critico nellrsquoERAD La prima egrave
correlata alla proteina mannossidasi responsabile del taglio di N-glicani
nel RE ma sembra aver perso la sua attivitagrave catalitica Nel lievito si
chiama Htm1pMnl1p e nei mammiferi egrave chiamato EDEM Studi
condotti su cellule di mammifero suggeriscono che EDEM aiuta le
glicoproteine mal ripiegate a lasciare il ciclo calnexinacalreticulina del
chaperone lectina dove stanno cercando di ripiegarsi e cosigrave entrare nel
ciclo di degradazione [24 ab] Tuttavia nel lievito Htm1p egrave richiesto
per la degradazione efficiente di substrati come CPY che non
dipendono da calnexina Quindi sembra probabile che Htm1pEDEM
ricopra altri ruoli in ERAD La seconda lectina Yos9p forma un
complesso stabile con proteine mal ripiegate e la perdita di questa
lectina conduce ad un profondo e specifico difetto nella degradazione di
glicoproteine mal ripiegate [25] Sorprendentemente mentre mutazioni
puntiformi nella tasca di Yos9p legante il mannosio eliminano la sua
capacitagrave di supportare ERAD i mutanti stessi di Yos9p mostrano una
maggior interazione con i substrati Ciograve indica la possibilitagrave che la
lectina Yos9p svolga un ruolo piugrave informativo interrogando lo stato
dello zucchero di forme mal ripiegate per determinare se debbano essere
passate al macchinario di retrotranslocazione Tuttavia come con
ERAD-C sebbene ci siano stati grandi progressi nella caratterizzazione
del macchinario di retrotranslocazione [26] le caratteristiche strutturali
delle proteine mal ripiegate sono in fase di monitoraggio e sono ancora
22
limitate le conoscenzedi come le forme mal ripiegate sono passate a
questo macchinario
CLEARENCE DI AGGREGATI ATTRAVERSO
LrsquoAUTOFAGIA
Egrave sempre piugrave evidente che ci sono una varietagrave di condizioni in vivo che
anche con chaperoni e macchinari proteolitici presenti nello stesso
compartimento come proteine mal ripiegate questi meccanismi di
controllo-qualitagrave falliscono e le proteine mal ripiegate avanzano
formando aggregati Inoltre tali aggregati intracellulari sono associati
con una serie di malattie neurodegenerative come il morbo di
Huntington e di Parkinson La natura e la sorte di aggregati di proteine
nelle cellule eucariotiche egrave stata poco compresa Recentemente egrave stata
sempre piugrave sostenuta unrsquoazione protettiva della formazione di aggregati
piuttosto che unrsquoimmediata azione patogena Per esempio nel caso del
morbo di Huntington lrsquoesame di cellule neuronali in coltura
sovrapproducenti una fusione di poliglutamina espansa e huntingtina-
GFP rivelano che queste cellule contenenti aggregati fluorescenti
morfologicamente visibili esibiscono una migliore viabilitagrave rispetto a
quelle aventi per via diffusionale materiale fluorescente [27] Questo
sembra in accordo con il concetto che si tratta di piccoli assemblati di
proteine mal ripiegate inclusioni non morfologicamente visibili che
esercitano effetti tossici sulle cellule Analogamente un recente
confronto delle dimensioni rispetto a tossicitagrave per gli aggregati di
proteina prionica PrP suggerisce che piccoli aggregati contenenti da una
a due dozzine di molecole sono risultati i piugrave tossici per le cellule [28]
23
Ma le cellule dispongono di meccanismi di compensazione per questi
piccoli aggregati Studi recenti hanno suggerito che la via ubiquitina-
proteosoma possa essere il pilastro della rimozione di specie inclini
allrsquoaggregazione Infatti gli aggregati rilevati nel contesto di
neurodegenerazione di solito sono reattivi con gli anticorpi anti-
ubiquitina il che implica che le specie mal ripiegate sono state
riconosciute dal sistema di coniugazione dellubiquitina Eppure vari
studi di questi ultimi anni indicano che queste proteine modificate
rappresentano una sfida particolare per proteasomi che possono portare
alla loro inibizione [29 ab] Il meccanismo di questa inattivazione
rimane sconosciuto ma puograve coinvolgere il soffocamento della camera
del proteasoma [30]
Anatomia del proteasoma Il proteasoma egrave una macromolecola proteica del peso di circa 2 milioni
di Daltons Ersquo formata da ununitagrave base centrale (core) e 2 cappucci agli estremi (cap) Il core egrave
formato a sua volta da 4 anelli ciascuno costituito da 7 unitagrave proteiche I due ldquocaprdquo attaccati alle
due estremitagrave del core cilindrico consistono ciascuno di 20 subunitagrave
24
Ora sembra che la modifica dellrsquoubiquitina possa reclutare specie
aggregate mediante una via indipendente lrsquoAUTOFAGIA Lrsquoautofagia
implica il riconoscimento e lrsquoimpacchettamentofagocitazione di
proteine specifiche o organelli in vescicole autofagosomiche che si
fondono con i lisosomi in cui sia le vescicole che il loro contenuto sono
scomposti Piugrave di 20 componenti cosiddetti Atg (geni coinvolti
nellrsquoautofagia) mediano questo processo straordinario Recenti studi
hanno dimostrato che componenti centrali della formazione di autosomi
nei topi hanno attivitagrave nei tessuti dei mammiferi Per esempio carenza
di atg5 ha portato alla morte di animali appena nati a causa
dellrsquoincapacitagrave di fornire un apporto di aminoacidi attraverso la
degradazione di proteine del corpo durante la condizione di fame
relativa allrsquoimmediato periodo post-natale Sorprendentemente in un
altro studio in cui egrave stata indotta una carenza di atg7 piugrave avanti nella
vita con un gene ldquofloxedrdquo lrsquoaccumulo di aggregati positivi
allrsquoubiquitina egrave stata osservata nel fegato degli animali che sono stati
disabilitati nella produzione di autofagosomi La funzione del
proteasoma in questi animali egrave rimasta inalterata contenente specie mal
ripiegate etichettate con ubiquitina e possono essere eliminate attraverso
autofagia Egrave stato poi scoperto un componente denominato p62 (o
sequestosoma1) che costituisce un guscio attorno agli aggregati di
huntingtina [31] Questa proteina contiene un dominio C-terminale
associato allrsquoubiquitina (UBA) che puograve legare poliubiquitine in modo
tale che p62 si collochi con lrsquoubiquitina quando espressa in cellule
HeLa Inoltre nelle cellule che esprimono huntigtina p62 si associa con
LC3 una proteina localizzata negli autofagosomi In accordo con quanto
riportato e cioegrave che lrsquoautofagia riduce i livelli di aggregati di
huntingtina e con un ruolo critico di p62 in questo processo lrsquoinibizione
25
antisenso mediata dallrsquoesperessione di p62 aumenta lrsquoapoptosi delle
cellule che esprimono huntungtina Quindi sembra che la modifica
dellrsquoubiquitina delle proteine difettose possa offrire un ingresso sia al
sistema proteasoma o in contesti dove lrsquoaggregazione egrave in corso al
sistema autofagia
SISTEMI CHAPERONI HSP70
Le Hsp70 proteine dello shock termico di 70 KDa sono impegnate in
una serie di processi tra cui il ripiegamento di proteine di nuova sintesi
il trasporto delle proteine attraverso membrane il ripiegamento di
proteine mal ripiegate ed aggregate e il controllo delle attivitagrave delle
proteine regolatrici Questa versatilitagrave egrave ottenuta attraverso
lampliamento e la diversificazione evolutiva di geni hsp70 che ha
generato sia chaperoni Hsp70 specifici Hsp110 e proteine Hsp170 La
versatilitagrave egrave determinata attraverso lrsquoimpiego di cochaperoni proteine J
e fattori di scambio di nucleotide (NEF) che regolano lrsquoattivitagrave di Hsp70
(Figura 4)
26
Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame
del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una
Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)
Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la
proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato
allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del
substrato
Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre
specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb
Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di
legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un
numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame
dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi
Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina
Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni
Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali
di Hsp70 con se stesso
27
INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70
Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di
proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura
xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding
appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide
N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD
adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio
elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con
lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante
chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco
tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini
di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di
comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura
di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione
La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la
tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo
coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture
precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una
proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da
una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β
ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica
compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio
elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di
legame del substrato (Figura 5)
28
Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo
substrato
La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra
domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che
collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo
solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi
residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame
allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A
dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso
Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un
legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in
nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano
completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve
entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo
fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui
coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del
segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti
integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A
29
capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il
quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di
ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a
idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di
DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro
catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente
arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia
drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete
crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la
barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK
costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina
superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura
della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera
attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della
prolina
DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-
NUCLEOTIDE
Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi
meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono
fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la
liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del
substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la
dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine
BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave
dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con
30
funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S
cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1
(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la
disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e
HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70
fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi
della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente
indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene
GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg
di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei
nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte
posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i
nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario
BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in
modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del
complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si
compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo
Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva
[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con
conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve
indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca
di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di
convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la
reazione di scambio nucleotidica di Hsp70
31
LEGAMI Hsp70-Hsp70
Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro
della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In
particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce
come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola
lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di
questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento
Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il
cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che
sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi
eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente
lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se
non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di
complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di
nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di
scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione
importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto
di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel
folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle
Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza
proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa
con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere
coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di
traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina
Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come
sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le
interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di
32
Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi
SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua
attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano
legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di
idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede
possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano
lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina
stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che
Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami
con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina
J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di
stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega
bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o
Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non
limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che
la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-
associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con
Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito
meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande
aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante
per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70
AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP
Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli
AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione
disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]
33
Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un
anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del
proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico
20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA
svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP
Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104
nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico
per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste
attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come
una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-
etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE
per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla
fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il
meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere
tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria
per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli
anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una
parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali
suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata
assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando
una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a
spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad
entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel
caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro
che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti
dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una
proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In
parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno
34
individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi
domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre
interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta
apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati
che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la
questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)
Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97
Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da
proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad
entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro
efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non
devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati
dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte
lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono
piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte
superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine
adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il
35
movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori
p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su
proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di
proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la
retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e
reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo
anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite
adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente
il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente
forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei
canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]
LrsquoAZIONE DELLrsquoATP
La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico
al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco
affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad
esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello
Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che
ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo
di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli
wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli
mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori
dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di
ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di
un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di
quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda
36
subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino
al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave
significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o
sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti
differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra
essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che
attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave
adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non
vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a
cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di
subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico
Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un
substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di
queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un
meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da
F1-ATPasi non sembra escluso
HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE
NEURODEGENERATIVE
RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE
Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel
mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una
pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi
associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione
37
di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di
Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta
promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]
Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90
nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave
funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi
permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]
HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico
Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono
mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)
accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock
citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata
da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante
di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo
stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si
lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei
geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-
shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via
multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di
transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-
translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90
[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e
mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo
shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con
Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)
38
attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da
shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni
Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che
i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro
sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock
termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su
attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato
che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi
di insulti
Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90
e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con
shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La
somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a
topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello
39
Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge
contro aggregati tossici
Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un
aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave
egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di
chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione
incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste
molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente
diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su
espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative
Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie
neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a
mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei
neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia
muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-
pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma
mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme
nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che
Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in
oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza
attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili
[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di
Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt
mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore
di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo
suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro
effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi
40
indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando
monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono
probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono
essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di
atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70
permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]
Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare
spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo
nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un
miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina
[62]
Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il
riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso
lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido
dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli
di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i
motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione
acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni
Riluzolo
Arimoclomol
41
Nei vari modelli cellulari della malattia di Alzheimer (AD) vi egrave un
incremento dei livelli di Hsp70 promossa dalla solubilitagrave e dal legame ai
microtubuli delle proteine tau [63] Hsp70 ha anche inibito la
propensione di aggregazione di Aβ [64] e ridotto la tossicitagrave di Aβ su
culture neuronali [65] Inoltre la proteina precursore dellrsquoamiloide
(APP) eo il suo Aβ amiloide derivato sono bersagli di chaperoni
mediati da clearence [66-67] Nella Drosophila melanogaster e nei
modelli di lievito della malattia di Parkinson (PD) lrsquoespressione diretta
di Hsp70 o la modulazione farmacologica di Hsp ha impedito la perdita
di neuroni causata da alfa-sinucleina [68-69] Huang et al hanno
riportato che questi effetti di Hsp70 si manifestano con lrsquoinibizione della
formazione di fibrille di alfa-sinucleina prevenendo la formazione di
alfa-sinucleina prefibrillare [70] Usando delezioni mutanti di alfa-
sinucleina Luk et al hanno indicato che le interazioni tra il dominio
legante il substrato Hsp70 e la regione del core idrofobico dellrsquoalfa-
sinucleina mediano lrsquoinibizione dellrsquoassemblaggio e che questo
processo di assemblaggio egrave inibito prima della fase di allungamento
[71] Nel complesso in diversi modelli di malattia neurodegenerativa la
sovra espressione di Hsp70 ha migliorato la gravitagrave della malattia di
fenotipi diversi senza incidere visibilmente sulla formazione di
aggregati suggerendo che i chaperoni non impediscono lrsquoaggregazione
di per seacute bensigrave reindirizzano gli aggregati preferibilmente in depositi
amorfi quindi sequestrando specie potenzialmente tossiche dalla
maggior parte della soluzione
42
Lrsquoespressione di Hsp70 e di altre Hsp egrave indotta dallrsquoinibizione
farmacologica di Hsp90
Come riportato sopra lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal
complesso con Hsp90 con susseguente produzione di Hsp (Figura 7) e
lrsquoinduzione di Hsp70 da parte di inibitori di Hsp90 egrave ben documentata
nei modelli di malattie neurodegenerative La geldanamicina (GM) un
inibitore di Hsp90 induce un aumento dose dipendente di Hsp70 nei
modelli di cellule di AD (Alzhaimer) cosigrave come nei neuroni della
corteccia primaria del ratto e riduce la quantitagrave di tau insolubili e dei
livelli basali di acido okadaico indotto da tau fosforilazione [63] Il
trattamento di neuroni primari corticali con lrsquoinibitore di Hsp90 con
struttura purinica il PU24FCI ha portato ad un aumento di Hsp70 dose-
dipendente [72]
PU24FCI
KU32
43
Allo stesso modo la somministrazione di due derivati di PU24FCI
CNS-permeabili il PU-DZ8 [72] ed il EC102 [73] a topi tau transgenici
(htau e JNPL3) ha determinato induzione di Hsp70 nel cervello e
mantenuto gli effetti per 24 ore dopo la somministrazione KU32 un
inibitore di Hsp90 di diversa natura chimica ha indotto Hsp70 in culture
SH-SY5Y di neuroblastoma e la ha protetta da tossicitagrave indotta da Aβ
GM ha attivato una risposta da shock termico ed inibito lrsquoaggregazione
di htt in un modello di coltura cellulare di HD ed ha indotto Hsp70 in
maniera tempo e concentrazione-dipendente ed ha impedito
lrsquoaggregazione di alfa-sinucleina e protetto contro la tossicitagrave in un
modello di aggregazione cellulare di alfa-sinucleina Auluck et al hanno
segnalato che il trattamento di un modello volante di PD con GM ha
protetto completamente contro tossicitagrave per alfa-sinucleina [74] GM ha
protetto anche contro la neurotossicitagrave dopaminergica indotta da 1-metil-
4-fenil-1236-tetraidropiridina (MPTP) in un modello di topo di PD Il
pretrattamento con GM mediante iniezione ventricolare intracerebrale
prima del trattamento con MPTP ha indotto le Hsp70 ed incrementato il
contenuto residuale di dopamina e lrsquoimmuno reattivitagrave della tirosina
idrolasi nel corpo striato [75] Lrsquoinduzione di Hsp70 nel midollo spinale
egrave stata osservata in seguito ad iniezione intraperitoneale di un derivato
della GM il 17-AAG in un modello di SBMA topo [76] Il 17-AAG egrave
stato anche efficace contro la nuerodegenerazione in altre malattie
poliQ Vale a dire ha soppresso la degenerazione dellrsquoocchio e la
formazione di inclusioni del corpo e salvato dalla letalitagrave in un modello
di SCA di Drosophila Ha inoltre soppresso la neurodegenerazione in un
modello volante di HD La riduzione di HSF-1 ha abolito lrsquoinduzione di
chaperoni molecolari e gli effeti terapeutici di 17-AAG sulla
neurodegenerazione poliQ indotta nei modelli di Drosophila facendo
44
arguire che lrsquoeffetto terapeutico di 17-AAG egrave essenzialmente mediato da
HSF-1 [77] Riassumendo lrsquoattivazione di HSF-1 da inibitori di Hsp90
egrave stata notata specificamente in modelli in vivo ed in vitro di malattie
neurodegenerative suggerendo che lrsquoinibizione di Hsp90 puograve essere un
mezzo per modulare i livelli di Hsp in cervelli malati con lrsquoobbiettivo di
proteggere contro le proteine tossiche che si presentano nel corso del
processo neurodegenerativo
Lrsquoinibizione di Hsp90 riduce lrsquoattivitagrave e lrsquoespressione di proteine
neuronali aberranti
In aggiunta alla regolazione di HSF-1 evidenze recenti suggeriscono un
ruolo addizionale per Hsp90 nel mantenimento della stabilitagrave funzionale
della capacitagrave aberrante di proteine neuronali (Figura 8A)
La SBMA egrave una malattia ereditaria dei motoneuroni causata
dallrsquoaccrescimento di un tratto di poliglutamina allrsquointerno del recettore
androgeno (AR) [57]
Le caratteristiche patologiche di SBMA sono perdita dei motoneuroni
nel midollo spinale e nel tronco cerebrale diffusione dellrsquoaccumulo
nucleare inclusioni nucleari di mutanti AR (mAR) nei motoneuroni
residui e in alcuni organi viscerali Waza et al hanno dimostrato che
mAR presente in SBMA egrave una delle proteine regolate da Hsp90 (Figura
8A) [76]
45
Figura 8 Le Hsp90 riparano le proteine neuronali aberranti (A) Proteine neuronali
aberranti regolate da Hsp90 (B) Lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90porta allrsquoinattivazione
o degradazione delle proteine regulate da Hsp90 probabilmente attraverso la via del
proteasoma
Le Hsp90 formano un complesso molecolare con mAR per il
mantenimento della sua stabilitagrave funzionale Sia in modelli cellulari di
SBMA che in topi transgenici lrsquoinibizione di Hsp90 da parte di 17-
AAG il derivato 17 allilammino-17-demetossi della geldanamicina ha
46
portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal
macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati
disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da
destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione
dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di
SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave
rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati
[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori
hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo
sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa
(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni
Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]
Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo
egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali
sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al
hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina
(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi
familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un
complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data
da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto
47
lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della
stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave
dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita
neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei
neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che
codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a
PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson
familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson
suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente
associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che
Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate
con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente
diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina
egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille
ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno
recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di
alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che
sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina
[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce
lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari
Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-
dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento
tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-
sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da
chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di
mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il
macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD
associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-
48
sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative
caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave
caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di
tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD
lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da
unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina
chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta
(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si
era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero
netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un
gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e
Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave
causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma
17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau
[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine
neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso
portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina
mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da
Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei
modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave
patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-
dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla
settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad
una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di
tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno
dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una
diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di
AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le
49
relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la
degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90
[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al
(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave
stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da
GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β
effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi
GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di
Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe
portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in
strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati
indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone
biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione
di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da
parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi
proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di
queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)
Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie
neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio
approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare
dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la
formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione
potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di
Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare
terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare
malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo
centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90
puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione
50
successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti
neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti
clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto
che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono
tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in
modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni
nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati
promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio
spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in
modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di
Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a
lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse
da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase
esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora
rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori
dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per
mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie
neurodegenerative
51
SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-
ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-
METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE
(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE
MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO
SULLA FRAMMENTAZIONE
Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in
risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta
nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine
regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il
ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai
loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine
client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro
cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire
su molti percorsi oncogenici
Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il
nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che
lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati
composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP
attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del
processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono
emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i
tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule
normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina
(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una
maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto
che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una
piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
13
punto di partenza dal quale numerose proteine vengono smistate e
indirizzate verso la loro destinazione finale [18]
LrsquoER egrave quindi la sede della sintesi del ripiegamento (ldquofoldingrdquo) e delle
modificazioni post-traduzionali delle proteine di membrana e secrete ed
egrave responsabile della maturazione strutturale di un quarto del proteasoma
che attraversa le vie secretorie
Il ripiegamento delle proteine secretorie fornisce una serie di sfide
uniche in quanto egrave accompagnato e dipendente dalla formazione di ponti
disolfuro ed inserzioni nel doppio strato lipidico con entrambi gli eventi
che si verificano piugrave lentamente di tipici cambi conformazionali che
accompagnano il ripiegamento Conseguentemente il RE fornisce le
condizioni ottimali per fronteggiare queste sfide includendo unrsquoalta
concentrazione di chaperoni generici oltre a una gamma di specifiche
strategie fatte su misura per favorire il ripiegamento delle proteine
secretorie Inoltre esiste un sofisticato sistema di controllo-qualitagrave nel
RE per trattenere e riparare proteine che non hanno raggiunto ancora il
loro stato naturale Malgrado la lunghezza con la quale le cellule vanno
a fornire un ambiente ottimale nel RE il ripiegamento delle proteine
secretorie puograve avvenire o manca a volte ad un ritmo allarmante Il RE
adopera due meccanismi di risposta in presenza di forme mal ripegate Il
primo meccanismo egrave una risposta allo stress RE-dedicato definito UPR
(risposta alla non corretta conformazione delle proteine) che attua il
rimodellamento del RE cosigrave da aumentare la sua capacitagrave di
ripiegamento [16] Una proteina malfunzionante rimane sequestrata nel
reticolo endoplasmatico quindi un eccesso di proteine mal strutturate
attiva la risposta da proteine con folding scorretto (Unfolded Protein
Response) Questo tipo di risposta inizia con il riconoscimento del
segnale di stress da parte di un recettore nel reticolo endoplasmatico e
14
prosegue con il blocco della sintesi proteica per permettere al
proteasoma di eliminare lrsquoeccesso di proteine mentre viene stimolata la
produzione di fattori di trascrizione Il secondo meccanismo chiamato
degradazione RE-associata (ERAD) riconosce in modo specifico le
parti terminali di proteine mal ripiegate e le loro retrotraslocazioni
attraverso la membrana del reticolo endoplasmatico nel citosol dove
possono essere degradate dal sistema di degradazione ubiquitina-
proteosoma [17] Questi due meccanismi sono intimamente collegati
lrsquoinduzione UPR aumenta la capacitagrave dellrsquoERAD una diminuzione
dellrsquoERAD comporta unrsquoinduzione dellrsquoUPR costitutivo e
contemporaneamente la diminuzione di ERAD e UPR fa diminuire di
molto la viabilitagrave delle cellule I sistemi UPR ed ERAD fronteggiano
anche il comune problema del riconoscimento che richiede
lrsquoidentificazione delle forme mal ripiegate potenzialmente patologiche
nellrsquoambiente del RE La sorveglianza di UPR ed ERAD deve garantire
un buon equilibrio proteggendo le cellule dalle pericolose specie mal
ripiegate evitando la sovra vigilanza (come accade con forme mutate di
regolatori trans membrana della fibrosi cistica CFTR) che puograve portare
allrsquoeliminazione di forme potenzialmente sanabili Recenti studi hanno
rivelato come ERAD ed UPR identifichino forme mal ripiegate
Pertanto il RE rappresenta un preciso sistema di controllo di qualitagrave atto
ad assicurare che solo le proteine correttamente ripiegate e funzionanti
possano essere rilasciate dallrsquoER e raggiungere la loro destinazione
finale mentre le proteine malripiegate o non funzionanti sono trattenute
nel ER e in seguito traslocate nel citosol per la degradazione
15
RISPOSTA ALLA NON CORRETTA
CONFORMAZIONE DELLE PROTEINE
Le proteine designate per il riconoscimento dei segnali di stress
provenienti dal reticolo endoplasmatico sono generalmente IRE1
(Inositol Requiring Kinase 1) ATF6 (Activation of Transcription Factor
6) e PERK (PKR-like Endoplasmic Reticulum Kinase)
Nel lievito la capacitagrave di ripiegarsi del RE egrave monitorata da IRE1 una
chinasi trans membrana altamente conservata che contiene un dominio
luminale responsabile del riconoscimento delle forme mal ripiegate
chinasi citosoliche e domini ribonucleasici Lrsquoaccumularsi delle proteine
mal ripiegate nel RE porta allrsquoattivazione delle chinasi IRE
Lrsquoattivazione delle IRE-chinasi promuove lo splicing non convenzionale
dei messaggi per un fattore di traduzione b-ZIP (Hac1 nel lievito e XBP-
1 nei metazoi) attraverso il suo dominio ribonucleasico La traduzione
del messaggio Hac 1 spliced crea un fattore attivo di trascrizione che
media direttamente la trascrizione dei target di UPR includendo
chaperoni del RE macchinario ERAD e tante altre proteine secretorie
In aggiunta alla IRE-1 gli eucarioti piugrave sviluppati utilizzano due altri
sensori le chinasi trans membrana del RE PERK ed il fattore di
trascrizione trans membrana del RE ATF6 (Figura 2) PERK contiene
un sensore luminale che egrave altamente correlato a quello di IRE-1 il
dominio citoplasmatico di PERK consiste in una chinasi elF2α
16
Figura 2 Struttura dei principali sensori dello stress nel reticolo endoplasmatico IRE1
ATF6 PERK
Lrsquoattivazione delle chinasi dovuta alla presenza di proteine mal
ripiegate determina unrsquoinibizione generalizzata della traduzione come
pure la up-regulation del fattore di trascrizione specifico ATF4
Lrsquoaccumulo di proteine mal ripiegate permette inoltre ad ATF6 di
raggiungere lrsquoapparato del Golgi dove le proteasi trans membrana
rilasciano il dominio citoplasmatico del fattore di trascrizione
permettendogli di entrare nel nucleo e mediare lrsquoinduzione genetica
Lrsquoesistenza di molteplici sensori UPR negli eucarioti piugrave avanzati
permette per lo piugrave una risposta piugrave sfumata alle proteine mal ripiegate
Per esempio una risposta iniziale alle proteine mal ripiegate potrebbe
portare ad una down-regulation generalizzata della traduzione seguita in
sequenza da unrsquoinduzione di chaperoni lrsquoinduzione del macchinario
17
ERAD ed infine contro lo stress prolungato lrsquoattivazione della morte
cellulare tramite apoptosi Molto recentemente ci sono stati notevoli
progressi nelle nostre conoscenze molecolari di come IRE-1 (e per
deduzione PERK) riconosce le proteine mal ripiegate Studi precedenti
avevano dimostrato che BIP (Binding Immunoglobulin Protein) lrsquo
omologo principale delle Hsp70 presente nel reticolo endoplasmatico si
lega in modo specifico con IRE1 e che questa interazione scompare in
condizioni di stress del RE Inoltre lrsquoiperespressione di BiP puograve
sopprimere lrsquoinduzione dellrsquoUPR Questo aveva suggerito un modello di
titolazione in cui BiP agisce come un regolatore negativo di IRE1 e
lrsquoaccumularsi di forme mal ripiegate porta indirettamente allrsquoattivazione
dellrsquoIRE1 attraverso il sequestro di BiP da parte proteine mal ripiegate
Tuttavia recenti studi hanno dimostrato che anche se il legame del BiP
possa avere un ruolo importante nella down-regulation di IRE1 ci sono
altri fattori importanti Analisi mutazionali hanno trovato che la
delezione della regione di IRE1 responsabile del legame con BiP non
altera la regolazione di IRE1 in risposta alle proteine unfolded [18] Piugrave
drammaticamente la struttura cristallina del core del dominio luminale
conservato (cLD) di IRE1 nel lievito rivela una profonda scanalatura
idrofobica che ricorda la tasca legante dei maggiori complessi di
istocompatibilitagrave (MHCs) che sono i responsabili per il riconoscimento
peptidico Che IRE1 possa legarsi direttamente a polipeptidi mal
ripiegati egrave unrsquoidea interessante (Figura 3) [19]
18
Figura 3 Un modello ipotetico descrive lrsquoattivazione di Ire1 attraverso la oligomerizzazione
determinata dal legame di proteine unfolded (indicate in rosso) Le interazioni dirette o
indirette fra le catene delle proteine unfolded possono contribuire allrsquoattivazione Sul lato
luminale della membrana del RE le proteine unfolded si legano alla scanalatura (indicata in
grigio) formata dalla dimerizzazione del core del dominio luminale di Ire1 attraverso
linterfaccia 1 Sul lato citoplasmaticodella membrana del RE la oligmerizzazione accosta i
domini della chinasi Ire 1 che subiscono un cambiamento conformazionale in seguito ad
autofosforilazione che porta allrsquoattivazione della funzione di RNA-ribonucleasi di Ire1
Attraverso il riconoscimento diretto delle forme mal ripiegate
lrsquoinduzione di IRE1 potrebbe verificarsi prima della completa titolazione
di BiP che data lrsquoestrema abbondanza di questrsquoultimo nel RE potrebbe
verificarsi solo dopo un catastrofico accumulo di proteine mal ripiegate
Inoltre il riconoscimento diretto di forme mal ripiegate da parte di IRE1
(e PERK) potrebbe consentire una serie di risposte piugrave sfumate in cui
diverse forme mal ripiegate potrebbero essere preferenzialmente
riconosciute da sensori diversi quali BiP IRE1 o PERK Cosigrave in linea
di principio la natura (per esempio traslazionale contro transcrizionale)
ed il ciclo di UPR potrebbe essere su misura per la classe specifica di
forme mal ripiegate che sono prevalenti nel RE [20]
19
DEGRADAZIONE DELLE PROTEINE ASSOCIATA AL
RETICOLO ENDOPLASMATICO
Come ci si poteva aspettare dalla diversitagrave delle proteine che si
ripiegano NEL RE studi recenti hanno dimostrato che la degradazione
ER-associata (ER-Associated Degradation ERAD) comprende una
serie di sistemi diversi ciascuno responsabile della degradazione di
sottoinsiemi di proteine che condividono proprietagrave fisiche comuni
Esistono anche regioni dedicate allrsquo ER Associated Degradation
(ERAD) nelle quali proteine che non raggiungono il corretto
ripiegamento vengono retrotraslocate al citosol e quindi degradate dal
proteasoma [21]
Ciograve forse egrave piugrave chiaramente dimostrato nel lievito dove ci sono almeno
due distinti meccanismi di sorveglianza per identificare le proteine mal
ripiegate del RE Il primo meccanismo chiamato ERAD-L analizza le
proteine che contengono domini luminali mal ripiegati (solubili o trans
membrana) chiamati CPY una forma mutante della proteina CPY
endogena che egrave incapace di folding Il secondo denominato ERAD-C
rileva domini mal ripiegati citosolici di proteine trans membrana [22]
Sebbene entrambe queste vie in ultima analisi convergano sul sistema
di degradazione ubiquitina-proteosoma esse dipendono da diversi
insiemi di componenti RE-associati per rivelare e fornire specie mal
ripiegate al citosol Nel caso di ERAD-C (e non di ERAD-L) la
degradazione egrave in genere dipendente da uno specifico sottoinsieme di
chaperoni citosolici inclusi i membri Hsp40 e Hsp70 Ciograve suggerisce
che queste proteine possono essere direttamente responsabili per il
riconoscimento di domini citosolici mal ripiegati di proteine trans
membrana Tuttavia le caratteristiche esatte che vengono monitorate e
20
come i substrati vengano consegnati al macchinario di
retrotranslocazione restano importanti questioni aperte per la maggior
parte dei substrati Il riconoscimento di una proteina contenente un
dominio luminale mal ripiegato dipende in modo determinante dallo
stato di glicosilazione della proteina Infatti anche piccole modifiche di
glicani N-linked puograve provocare danni gravi nella degradazione di
numerosi substrati Questo puograve effettivamente lasciare le proteine in un
limbo impossibile raggiungere lo stato nativo ma non riconosciuto dal
macchinario ERAD esse restano mal ripiegate nel RE a tempo
indeterminato A prima vista questa dipendenza dalla glicosilazione
sembra essere un miglioramento non necessario Tuttavia egrave ormai chiaro
che lo spettro di porzioni di zucchero presenti in una proteina egrave un
segnale fondamentale nel marcare il suo status di ripiegamento Infatti
dato che diverse proteine altamente abbondanti nel RE tra cui BiP e
PDI spesso non sono glicosilate la presenza e la natura covalente di
molto mannosio in un polipeptide puograve fornire un segnale importante che
aiuta il macchinario di controllo-qualitagrave del RE a distinguere le specie
ripiegate destinate ad altri scomparti da quelle piugrave abbondanti e
permanenti del RE Lrsquointuizione nel ruolo della glicosilazione nella
discriminazione tra le specie in via di ripiegamento e le proteine
terminali mal ripiegate nel RE egrave venuta dalla constatazione che
glicoproteine mal ripiegate subiscono un taglio dei loro N-glicani da una
varietagrave di glicosidasi tra cui una mannossidasi specifica In aggiunta a
proteine mal ripiegate persistenti si egrave pensato che il rimodellamento
dipendente dal tempo di N-glicani porti ad un segnale per la
degradazione del macchinario ERAD Questo permette intermedi
ripiegati in un periodo di tempo prima del rimodellamento dei loro N-
glicani in cui il polipeptide egrave immune dalla sorveglianza ERAD Egrave
21
interessante notare che un recente studio suggerisce che anche per i
polipeptidi citosolici vi egrave un periodo durante e subito dopo la sintesi in
cui le specie mal ripiegate sono immuni alla degradazione del
proteasoma [23] Recenti studi hanno identificato due differenti lettine
localizzate nel RE che svolgono un ruolo critico nellrsquoERAD La prima egrave
correlata alla proteina mannossidasi responsabile del taglio di N-glicani
nel RE ma sembra aver perso la sua attivitagrave catalitica Nel lievito si
chiama Htm1pMnl1p e nei mammiferi egrave chiamato EDEM Studi
condotti su cellule di mammifero suggeriscono che EDEM aiuta le
glicoproteine mal ripiegate a lasciare il ciclo calnexinacalreticulina del
chaperone lectina dove stanno cercando di ripiegarsi e cosigrave entrare nel
ciclo di degradazione [24 ab] Tuttavia nel lievito Htm1p egrave richiesto
per la degradazione efficiente di substrati come CPY che non
dipendono da calnexina Quindi sembra probabile che Htm1pEDEM
ricopra altri ruoli in ERAD La seconda lectina Yos9p forma un
complesso stabile con proteine mal ripiegate e la perdita di questa
lectina conduce ad un profondo e specifico difetto nella degradazione di
glicoproteine mal ripiegate [25] Sorprendentemente mentre mutazioni
puntiformi nella tasca di Yos9p legante il mannosio eliminano la sua
capacitagrave di supportare ERAD i mutanti stessi di Yos9p mostrano una
maggior interazione con i substrati Ciograve indica la possibilitagrave che la
lectina Yos9p svolga un ruolo piugrave informativo interrogando lo stato
dello zucchero di forme mal ripiegate per determinare se debbano essere
passate al macchinario di retrotranslocazione Tuttavia come con
ERAD-C sebbene ci siano stati grandi progressi nella caratterizzazione
del macchinario di retrotranslocazione [26] le caratteristiche strutturali
delle proteine mal ripiegate sono in fase di monitoraggio e sono ancora
22
limitate le conoscenzedi come le forme mal ripiegate sono passate a
questo macchinario
CLEARENCE DI AGGREGATI ATTRAVERSO
LrsquoAUTOFAGIA
Egrave sempre piugrave evidente che ci sono una varietagrave di condizioni in vivo che
anche con chaperoni e macchinari proteolitici presenti nello stesso
compartimento come proteine mal ripiegate questi meccanismi di
controllo-qualitagrave falliscono e le proteine mal ripiegate avanzano
formando aggregati Inoltre tali aggregati intracellulari sono associati
con una serie di malattie neurodegenerative come il morbo di
Huntington e di Parkinson La natura e la sorte di aggregati di proteine
nelle cellule eucariotiche egrave stata poco compresa Recentemente egrave stata
sempre piugrave sostenuta unrsquoazione protettiva della formazione di aggregati
piuttosto che unrsquoimmediata azione patogena Per esempio nel caso del
morbo di Huntington lrsquoesame di cellule neuronali in coltura
sovrapproducenti una fusione di poliglutamina espansa e huntingtina-
GFP rivelano che queste cellule contenenti aggregati fluorescenti
morfologicamente visibili esibiscono una migliore viabilitagrave rispetto a
quelle aventi per via diffusionale materiale fluorescente [27] Questo
sembra in accordo con il concetto che si tratta di piccoli assemblati di
proteine mal ripiegate inclusioni non morfologicamente visibili che
esercitano effetti tossici sulle cellule Analogamente un recente
confronto delle dimensioni rispetto a tossicitagrave per gli aggregati di
proteina prionica PrP suggerisce che piccoli aggregati contenenti da una
a due dozzine di molecole sono risultati i piugrave tossici per le cellule [28]
23
Ma le cellule dispongono di meccanismi di compensazione per questi
piccoli aggregati Studi recenti hanno suggerito che la via ubiquitina-
proteosoma possa essere il pilastro della rimozione di specie inclini
allrsquoaggregazione Infatti gli aggregati rilevati nel contesto di
neurodegenerazione di solito sono reattivi con gli anticorpi anti-
ubiquitina il che implica che le specie mal ripiegate sono state
riconosciute dal sistema di coniugazione dellubiquitina Eppure vari
studi di questi ultimi anni indicano che queste proteine modificate
rappresentano una sfida particolare per proteasomi che possono portare
alla loro inibizione [29 ab] Il meccanismo di questa inattivazione
rimane sconosciuto ma puograve coinvolgere il soffocamento della camera
del proteasoma [30]
Anatomia del proteasoma Il proteasoma egrave una macromolecola proteica del peso di circa 2 milioni
di Daltons Ersquo formata da ununitagrave base centrale (core) e 2 cappucci agli estremi (cap) Il core egrave
formato a sua volta da 4 anelli ciascuno costituito da 7 unitagrave proteiche I due ldquocaprdquo attaccati alle
due estremitagrave del core cilindrico consistono ciascuno di 20 subunitagrave
24
Ora sembra che la modifica dellrsquoubiquitina possa reclutare specie
aggregate mediante una via indipendente lrsquoAUTOFAGIA Lrsquoautofagia
implica il riconoscimento e lrsquoimpacchettamentofagocitazione di
proteine specifiche o organelli in vescicole autofagosomiche che si
fondono con i lisosomi in cui sia le vescicole che il loro contenuto sono
scomposti Piugrave di 20 componenti cosiddetti Atg (geni coinvolti
nellrsquoautofagia) mediano questo processo straordinario Recenti studi
hanno dimostrato che componenti centrali della formazione di autosomi
nei topi hanno attivitagrave nei tessuti dei mammiferi Per esempio carenza
di atg5 ha portato alla morte di animali appena nati a causa
dellrsquoincapacitagrave di fornire un apporto di aminoacidi attraverso la
degradazione di proteine del corpo durante la condizione di fame
relativa allrsquoimmediato periodo post-natale Sorprendentemente in un
altro studio in cui egrave stata indotta una carenza di atg7 piugrave avanti nella
vita con un gene ldquofloxedrdquo lrsquoaccumulo di aggregati positivi
allrsquoubiquitina egrave stata osservata nel fegato degli animali che sono stati
disabilitati nella produzione di autofagosomi La funzione del
proteasoma in questi animali egrave rimasta inalterata contenente specie mal
ripiegate etichettate con ubiquitina e possono essere eliminate attraverso
autofagia Egrave stato poi scoperto un componente denominato p62 (o
sequestosoma1) che costituisce un guscio attorno agli aggregati di
huntingtina [31] Questa proteina contiene un dominio C-terminale
associato allrsquoubiquitina (UBA) che puograve legare poliubiquitine in modo
tale che p62 si collochi con lrsquoubiquitina quando espressa in cellule
HeLa Inoltre nelle cellule che esprimono huntigtina p62 si associa con
LC3 una proteina localizzata negli autofagosomi In accordo con quanto
riportato e cioegrave che lrsquoautofagia riduce i livelli di aggregati di
huntingtina e con un ruolo critico di p62 in questo processo lrsquoinibizione
25
antisenso mediata dallrsquoesperessione di p62 aumenta lrsquoapoptosi delle
cellule che esprimono huntungtina Quindi sembra che la modifica
dellrsquoubiquitina delle proteine difettose possa offrire un ingresso sia al
sistema proteasoma o in contesti dove lrsquoaggregazione egrave in corso al
sistema autofagia
SISTEMI CHAPERONI HSP70
Le Hsp70 proteine dello shock termico di 70 KDa sono impegnate in
una serie di processi tra cui il ripiegamento di proteine di nuova sintesi
il trasporto delle proteine attraverso membrane il ripiegamento di
proteine mal ripiegate ed aggregate e il controllo delle attivitagrave delle
proteine regolatrici Questa versatilitagrave egrave ottenuta attraverso
lampliamento e la diversificazione evolutiva di geni hsp70 che ha
generato sia chaperoni Hsp70 specifici Hsp110 e proteine Hsp170 La
versatilitagrave egrave determinata attraverso lrsquoimpiego di cochaperoni proteine J
e fattori di scambio di nucleotide (NEF) che regolano lrsquoattivitagrave di Hsp70
(Figura 4)
26
Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame
del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una
Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)
Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la
proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato
allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del
substrato
Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre
specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb
Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di
legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un
numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame
dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi
Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina
Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni
Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali
di Hsp70 con se stesso
27
INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70
Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di
proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura
xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding
appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide
N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD
adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio
elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con
lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante
chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco
tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini
di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di
comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura
di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione
La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la
tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo
coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture
precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una
proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da
una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β
ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica
compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio
elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di
legame del substrato (Figura 5)
28
Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo
substrato
La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra
domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che
collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo
solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi
residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame
allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A
dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso
Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un
legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in
nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano
completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve
entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo
fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui
coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del
segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti
integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A
29
capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il
quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di
ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a
idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di
DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro
catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente
arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia
drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete
crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la
barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK
costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina
superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura
della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera
attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della
prolina
DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-
NUCLEOTIDE
Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi
meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono
fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la
liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del
substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la
dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine
BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave
dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con
30
funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S
cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1
(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la
disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e
HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70
fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi
della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente
indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene
GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg
di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei
nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte
posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i
nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario
BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in
modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del
complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si
compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo
Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva
[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con
conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve
indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca
di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di
convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la
reazione di scambio nucleotidica di Hsp70
31
LEGAMI Hsp70-Hsp70
Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro
della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In
particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce
come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola
lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di
questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento
Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il
cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che
sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi
eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente
lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se
non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di
complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di
nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di
scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione
importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto
di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel
folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle
Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza
proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa
con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere
coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di
traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina
Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come
sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le
interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di
32
Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi
SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua
attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano
legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di
idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede
possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano
lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina
stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che
Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami
con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina
J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di
stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega
bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o
Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non
limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che
la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-
associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con
Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito
meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande
aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante
per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70
AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP
Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli
AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione
disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]
33
Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un
anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del
proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico
20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA
svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP
Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104
nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico
per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste
attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come
una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-
etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE
per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla
fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il
meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere
tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria
per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli
anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una
parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali
suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata
assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando
una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a
spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad
entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel
caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro
che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti
dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una
proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In
parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno
34
individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi
domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre
interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta
apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati
che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la
questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)
Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97
Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da
proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad
entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro
efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non
devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati
dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte
lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono
piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte
superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine
adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il
35
movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori
p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su
proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di
proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la
retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e
reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo
anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite
adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente
il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente
forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei
canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]
LrsquoAZIONE DELLrsquoATP
La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico
al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco
affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad
esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello
Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che
ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo
di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli
wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli
mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori
dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di
ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di
un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di
quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda
36
subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino
al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave
significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o
sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti
differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra
essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che
attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave
adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non
vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a
cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di
subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico
Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un
substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di
queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un
meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da
F1-ATPasi non sembra escluso
HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE
NEURODEGENERATIVE
RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE
Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel
mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una
pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi
associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione
37
di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di
Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta
promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]
Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90
nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave
funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi
permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]
HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico
Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono
mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)
accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock
citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata
da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante
di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo
stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si
lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei
geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-
shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via
multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di
transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-
translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90
[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e
mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo
shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con
Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)
38
attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da
shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni
Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che
i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro
sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock
termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su
attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato
che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi
di insulti
Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90
e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con
shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La
somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a
topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello
39
Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge
contro aggregati tossici
Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un
aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave
egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di
chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione
incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste
molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente
diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su
espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative
Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie
neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a
mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei
neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia
muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-
pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma
mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme
nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che
Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in
oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza
attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili
[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di
Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt
mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore
di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo
suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro
effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi
40
indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando
monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono
probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono
essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di
atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70
permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]
Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare
spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo
nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un
miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina
[62]
Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il
riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso
lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido
dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli
di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i
motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione
acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni
Riluzolo
Arimoclomol
41
Nei vari modelli cellulari della malattia di Alzheimer (AD) vi egrave un
incremento dei livelli di Hsp70 promossa dalla solubilitagrave e dal legame ai
microtubuli delle proteine tau [63] Hsp70 ha anche inibito la
propensione di aggregazione di Aβ [64] e ridotto la tossicitagrave di Aβ su
culture neuronali [65] Inoltre la proteina precursore dellrsquoamiloide
(APP) eo il suo Aβ amiloide derivato sono bersagli di chaperoni
mediati da clearence [66-67] Nella Drosophila melanogaster e nei
modelli di lievito della malattia di Parkinson (PD) lrsquoespressione diretta
di Hsp70 o la modulazione farmacologica di Hsp ha impedito la perdita
di neuroni causata da alfa-sinucleina [68-69] Huang et al hanno
riportato che questi effetti di Hsp70 si manifestano con lrsquoinibizione della
formazione di fibrille di alfa-sinucleina prevenendo la formazione di
alfa-sinucleina prefibrillare [70] Usando delezioni mutanti di alfa-
sinucleina Luk et al hanno indicato che le interazioni tra il dominio
legante il substrato Hsp70 e la regione del core idrofobico dellrsquoalfa-
sinucleina mediano lrsquoinibizione dellrsquoassemblaggio e che questo
processo di assemblaggio egrave inibito prima della fase di allungamento
[71] Nel complesso in diversi modelli di malattia neurodegenerativa la
sovra espressione di Hsp70 ha migliorato la gravitagrave della malattia di
fenotipi diversi senza incidere visibilmente sulla formazione di
aggregati suggerendo che i chaperoni non impediscono lrsquoaggregazione
di per seacute bensigrave reindirizzano gli aggregati preferibilmente in depositi
amorfi quindi sequestrando specie potenzialmente tossiche dalla
maggior parte della soluzione
42
Lrsquoespressione di Hsp70 e di altre Hsp egrave indotta dallrsquoinibizione
farmacologica di Hsp90
Come riportato sopra lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal
complesso con Hsp90 con susseguente produzione di Hsp (Figura 7) e
lrsquoinduzione di Hsp70 da parte di inibitori di Hsp90 egrave ben documentata
nei modelli di malattie neurodegenerative La geldanamicina (GM) un
inibitore di Hsp90 induce un aumento dose dipendente di Hsp70 nei
modelli di cellule di AD (Alzhaimer) cosigrave come nei neuroni della
corteccia primaria del ratto e riduce la quantitagrave di tau insolubili e dei
livelli basali di acido okadaico indotto da tau fosforilazione [63] Il
trattamento di neuroni primari corticali con lrsquoinibitore di Hsp90 con
struttura purinica il PU24FCI ha portato ad un aumento di Hsp70 dose-
dipendente [72]
PU24FCI
KU32
43
Allo stesso modo la somministrazione di due derivati di PU24FCI
CNS-permeabili il PU-DZ8 [72] ed il EC102 [73] a topi tau transgenici
(htau e JNPL3) ha determinato induzione di Hsp70 nel cervello e
mantenuto gli effetti per 24 ore dopo la somministrazione KU32 un
inibitore di Hsp90 di diversa natura chimica ha indotto Hsp70 in culture
SH-SY5Y di neuroblastoma e la ha protetta da tossicitagrave indotta da Aβ
GM ha attivato una risposta da shock termico ed inibito lrsquoaggregazione
di htt in un modello di coltura cellulare di HD ed ha indotto Hsp70 in
maniera tempo e concentrazione-dipendente ed ha impedito
lrsquoaggregazione di alfa-sinucleina e protetto contro la tossicitagrave in un
modello di aggregazione cellulare di alfa-sinucleina Auluck et al hanno
segnalato che il trattamento di un modello volante di PD con GM ha
protetto completamente contro tossicitagrave per alfa-sinucleina [74] GM ha
protetto anche contro la neurotossicitagrave dopaminergica indotta da 1-metil-
4-fenil-1236-tetraidropiridina (MPTP) in un modello di topo di PD Il
pretrattamento con GM mediante iniezione ventricolare intracerebrale
prima del trattamento con MPTP ha indotto le Hsp70 ed incrementato il
contenuto residuale di dopamina e lrsquoimmuno reattivitagrave della tirosina
idrolasi nel corpo striato [75] Lrsquoinduzione di Hsp70 nel midollo spinale
egrave stata osservata in seguito ad iniezione intraperitoneale di un derivato
della GM il 17-AAG in un modello di SBMA topo [76] Il 17-AAG egrave
stato anche efficace contro la nuerodegenerazione in altre malattie
poliQ Vale a dire ha soppresso la degenerazione dellrsquoocchio e la
formazione di inclusioni del corpo e salvato dalla letalitagrave in un modello
di SCA di Drosophila Ha inoltre soppresso la neurodegenerazione in un
modello volante di HD La riduzione di HSF-1 ha abolito lrsquoinduzione di
chaperoni molecolari e gli effeti terapeutici di 17-AAG sulla
neurodegenerazione poliQ indotta nei modelli di Drosophila facendo
44
arguire che lrsquoeffetto terapeutico di 17-AAG egrave essenzialmente mediato da
HSF-1 [77] Riassumendo lrsquoattivazione di HSF-1 da inibitori di Hsp90
egrave stata notata specificamente in modelli in vivo ed in vitro di malattie
neurodegenerative suggerendo che lrsquoinibizione di Hsp90 puograve essere un
mezzo per modulare i livelli di Hsp in cervelli malati con lrsquoobbiettivo di
proteggere contro le proteine tossiche che si presentano nel corso del
processo neurodegenerativo
Lrsquoinibizione di Hsp90 riduce lrsquoattivitagrave e lrsquoespressione di proteine
neuronali aberranti
In aggiunta alla regolazione di HSF-1 evidenze recenti suggeriscono un
ruolo addizionale per Hsp90 nel mantenimento della stabilitagrave funzionale
della capacitagrave aberrante di proteine neuronali (Figura 8A)
La SBMA egrave una malattia ereditaria dei motoneuroni causata
dallrsquoaccrescimento di un tratto di poliglutamina allrsquointerno del recettore
androgeno (AR) [57]
Le caratteristiche patologiche di SBMA sono perdita dei motoneuroni
nel midollo spinale e nel tronco cerebrale diffusione dellrsquoaccumulo
nucleare inclusioni nucleari di mutanti AR (mAR) nei motoneuroni
residui e in alcuni organi viscerali Waza et al hanno dimostrato che
mAR presente in SBMA egrave una delle proteine regolate da Hsp90 (Figura
8A) [76]
45
Figura 8 Le Hsp90 riparano le proteine neuronali aberranti (A) Proteine neuronali
aberranti regolate da Hsp90 (B) Lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90porta allrsquoinattivazione
o degradazione delle proteine regulate da Hsp90 probabilmente attraverso la via del
proteasoma
Le Hsp90 formano un complesso molecolare con mAR per il
mantenimento della sua stabilitagrave funzionale Sia in modelli cellulari di
SBMA che in topi transgenici lrsquoinibizione di Hsp90 da parte di 17-
AAG il derivato 17 allilammino-17-demetossi della geldanamicina ha
46
portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal
macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati
disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da
destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione
dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di
SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave
rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati
[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori
hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo
sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa
(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni
Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]
Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo
egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali
sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al
hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina
(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi
familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un
complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data
da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto
47
lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della
stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave
dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita
neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei
neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che
codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a
PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson
familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson
suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente
associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che
Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate
con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente
diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina
egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille
ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno
recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di
alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che
sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina
[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce
lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari
Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-
dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento
tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-
sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da
chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di
mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il
macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD
associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-
48
sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative
caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave
caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di
tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD
lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da
unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina
chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta
(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si
era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero
netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un
gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e
Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave
causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma
17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau
[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine
neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso
portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina
mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da
Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei
modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave
patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-
dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla
settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad
una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di
tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno
dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una
diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di
AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le
49
relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la
degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90
[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al
(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave
stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da
GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β
effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi
GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di
Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe
portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in
strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati
indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone
biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione
di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da
parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi
proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di
queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)
Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie
neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio
approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare
dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la
formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione
potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di
Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare
terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare
malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo
centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90
puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione
50
successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti
neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti
clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto
che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono
tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in
modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni
nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati
promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio
spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in
modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di
Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a
lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse
da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase
esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora
rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori
dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per
mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie
neurodegenerative
51
SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-
ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-
METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE
(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE
MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO
SULLA FRAMMENTAZIONE
Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in
risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta
nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine
regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il
ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai
loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine
client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro
cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire
su molti percorsi oncogenici
Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il
nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che
lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati
composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP
attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del
processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono
emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i
tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule
normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina
(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una
maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto
che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una
piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
14
prosegue con il blocco della sintesi proteica per permettere al
proteasoma di eliminare lrsquoeccesso di proteine mentre viene stimolata la
produzione di fattori di trascrizione Il secondo meccanismo chiamato
degradazione RE-associata (ERAD) riconosce in modo specifico le
parti terminali di proteine mal ripiegate e le loro retrotraslocazioni
attraverso la membrana del reticolo endoplasmatico nel citosol dove
possono essere degradate dal sistema di degradazione ubiquitina-
proteosoma [17] Questi due meccanismi sono intimamente collegati
lrsquoinduzione UPR aumenta la capacitagrave dellrsquoERAD una diminuzione
dellrsquoERAD comporta unrsquoinduzione dellrsquoUPR costitutivo e
contemporaneamente la diminuzione di ERAD e UPR fa diminuire di
molto la viabilitagrave delle cellule I sistemi UPR ed ERAD fronteggiano
anche il comune problema del riconoscimento che richiede
lrsquoidentificazione delle forme mal ripiegate potenzialmente patologiche
nellrsquoambiente del RE La sorveglianza di UPR ed ERAD deve garantire
un buon equilibrio proteggendo le cellule dalle pericolose specie mal
ripiegate evitando la sovra vigilanza (come accade con forme mutate di
regolatori trans membrana della fibrosi cistica CFTR) che puograve portare
allrsquoeliminazione di forme potenzialmente sanabili Recenti studi hanno
rivelato come ERAD ed UPR identifichino forme mal ripiegate
Pertanto il RE rappresenta un preciso sistema di controllo di qualitagrave atto
ad assicurare che solo le proteine correttamente ripiegate e funzionanti
possano essere rilasciate dallrsquoER e raggiungere la loro destinazione
finale mentre le proteine malripiegate o non funzionanti sono trattenute
nel ER e in seguito traslocate nel citosol per la degradazione
15
RISPOSTA ALLA NON CORRETTA
CONFORMAZIONE DELLE PROTEINE
Le proteine designate per il riconoscimento dei segnali di stress
provenienti dal reticolo endoplasmatico sono generalmente IRE1
(Inositol Requiring Kinase 1) ATF6 (Activation of Transcription Factor
6) e PERK (PKR-like Endoplasmic Reticulum Kinase)
Nel lievito la capacitagrave di ripiegarsi del RE egrave monitorata da IRE1 una
chinasi trans membrana altamente conservata che contiene un dominio
luminale responsabile del riconoscimento delle forme mal ripiegate
chinasi citosoliche e domini ribonucleasici Lrsquoaccumularsi delle proteine
mal ripiegate nel RE porta allrsquoattivazione delle chinasi IRE
Lrsquoattivazione delle IRE-chinasi promuove lo splicing non convenzionale
dei messaggi per un fattore di traduzione b-ZIP (Hac1 nel lievito e XBP-
1 nei metazoi) attraverso il suo dominio ribonucleasico La traduzione
del messaggio Hac 1 spliced crea un fattore attivo di trascrizione che
media direttamente la trascrizione dei target di UPR includendo
chaperoni del RE macchinario ERAD e tante altre proteine secretorie
In aggiunta alla IRE-1 gli eucarioti piugrave sviluppati utilizzano due altri
sensori le chinasi trans membrana del RE PERK ed il fattore di
trascrizione trans membrana del RE ATF6 (Figura 2) PERK contiene
un sensore luminale che egrave altamente correlato a quello di IRE-1 il
dominio citoplasmatico di PERK consiste in una chinasi elF2α
16
Figura 2 Struttura dei principali sensori dello stress nel reticolo endoplasmatico IRE1
ATF6 PERK
Lrsquoattivazione delle chinasi dovuta alla presenza di proteine mal
ripiegate determina unrsquoinibizione generalizzata della traduzione come
pure la up-regulation del fattore di trascrizione specifico ATF4
Lrsquoaccumulo di proteine mal ripiegate permette inoltre ad ATF6 di
raggiungere lrsquoapparato del Golgi dove le proteasi trans membrana
rilasciano il dominio citoplasmatico del fattore di trascrizione
permettendogli di entrare nel nucleo e mediare lrsquoinduzione genetica
Lrsquoesistenza di molteplici sensori UPR negli eucarioti piugrave avanzati
permette per lo piugrave una risposta piugrave sfumata alle proteine mal ripiegate
Per esempio una risposta iniziale alle proteine mal ripiegate potrebbe
portare ad una down-regulation generalizzata della traduzione seguita in
sequenza da unrsquoinduzione di chaperoni lrsquoinduzione del macchinario
17
ERAD ed infine contro lo stress prolungato lrsquoattivazione della morte
cellulare tramite apoptosi Molto recentemente ci sono stati notevoli
progressi nelle nostre conoscenze molecolari di come IRE-1 (e per
deduzione PERK) riconosce le proteine mal ripiegate Studi precedenti
avevano dimostrato che BIP (Binding Immunoglobulin Protein) lrsquo
omologo principale delle Hsp70 presente nel reticolo endoplasmatico si
lega in modo specifico con IRE1 e che questa interazione scompare in
condizioni di stress del RE Inoltre lrsquoiperespressione di BiP puograve
sopprimere lrsquoinduzione dellrsquoUPR Questo aveva suggerito un modello di
titolazione in cui BiP agisce come un regolatore negativo di IRE1 e
lrsquoaccumularsi di forme mal ripiegate porta indirettamente allrsquoattivazione
dellrsquoIRE1 attraverso il sequestro di BiP da parte proteine mal ripiegate
Tuttavia recenti studi hanno dimostrato che anche se il legame del BiP
possa avere un ruolo importante nella down-regulation di IRE1 ci sono
altri fattori importanti Analisi mutazionali hanno trovato che la
delezione della regione di IRE1 responsabile del legame con BiP non
altera la regolazione di IRE1 in risposta alle proteine unfolded [18] Piugrave
drammaticamente la struttura cristallina del core del dominio luminale
conservato (cLD) di IRE1 nel lievito rivela una profonda scanalatura
idrofobica che ricorda la tasca legante dei maggiori complessi di
istocompatibilitagrave (MHCs) che sono i responsabili per il riconoscimento
peptidico Che IRE1 possa legarsi direttamente a polipeptidi mal
ripiegati egrave unrsquoidea interessante (Figura 3) [19]
18
Figura 3 Un modello ipotetico descrive lrsquoattivazione di Ire1 attraverso la oligomerizzazione
determinata dal legame di proteine unfolded (indicate in rosso) Le interazioni dirette o
indirette fra le catene delle proteine unfolded possono contribuire allrsquoattivazione Sul lato
luminale della membrana del RE le proteine unfolded si legano alla scanalatura (indicata in
grigio) formata dalla dimerizzazione del core del dominio luminale di Ire1 attraverso
linterfaccia 1 Sul lato citoplasmaticodella membrana del RE la oligmerizzazione accosta i
domini della chinasi Ire 1 che subiscono un cambiamento conformazionale in seguito ad
autofosforilazione che porta allrsquoattivazione della funzione di RNA-ribonucleasi di Ire1
Attraverso il riconoscimento diretto delle forme mal ripiegate
lrsquoinduzione di IRE1 potrebbe verificarsi prima della completa titolazione
di BiP che data lrsquoestrema abbondanza di questrsquoultimo nel RE potrebbe
verificarsi solo dopo un catastrofico accumulo di proteine mal ripiegate
Inoltre il riconoscimento diretto di forme mal ripiegate da parte di IRE1
(e PERK) potrebbe consentire una serie di risposte piugrave sfumate in cui
diverse forme mal ripiegate potrebbero essere preferenzialmente
riconosciute da sensori diversi quali BiP IRE1 o PERK Cosigrave in linea
di principio la natura (per esempio traslazionale contro transcrizionale)
ed il ciclo di UPR potrebbe essere su misura per la classe specifica di
forme mal ripiegate che sono prevalenti nel RE [20]
19
DEGRADAZIONE DELLE PROTEINE ASSOCIATA AL
RETICOLO ENDOPLASMATICO
Come ci si poteva aspettare dalla diversitagrave delle proteine che si
ripiegano NEL RE studi recenti hanno dimostrato che la degradazione
ER-associata (ER-Associated Degradation ERAD) comprende una
serie di sistemi diversi ciascuno responsabile della degradazione di
sottoinsiemi di proteine che condividono proprietagrave fisiche comuni
Esistono anche regioni dedicate allrsquo ER Associated Degradation
(ERAD) nelle quali proteine che non raggiungono il corretto
ripiegamento vengono retrotraslocate al citosol e quindi degradate dal
proteasoma [21]
Ciograve forse egrave piugrave chiaramente dimostrato nel lievito dove ci sono almeno
due distinti meccanismi di sorveglianza per identificare le proteine mal
ripiegate del RE Il primo meccanismo chiamato ERAD-L analizza le
proteine che contengono domini luminali mal ripiegati (solubili o trans
membrana) chiamati CPY una forma mutante della proteina CPY
endogena che egrave incapace di folding Il secondo denominato ERAD-C
rileva domini mal ripiegati citosolici di proteine trans membrana [22]
Sebbene entrambe queste vie in ultima analisi convergano sul sistema
di degradazione ubiquitina-proteosoma esse dipendono da diversi
insiemi di componenti RE-associati per rivelare e fornire specie mal
ripiegate al citosol Nel caso di ERAD-C (e non di ERAD-L) la
degradazione egrave in genere dipendente da uno specifico sottoinsieme di
chaperoni citosolici inclusi i membri Hsp40 e Hsp70 Ciograve suggerisce
che queste proteine possono essere direttamente responsabili per il
riconoscimento di domini citosolici mal ripiegati di proteine trans
membrana Tuttavia le caratteristiche esatte che vengono monitorate e
20
come i substrati vengano consegnati al macchinario di
retrotranslocazione restano importanti questioni aperte per la maggior
parte dei substrati Il riconoscimento di una proteina contenente un
dominio luminale mal ripiegato dipende in modo determinante dallo
stato di glicosilazione della proteina Infatti anche piccole modifiche di
glicani N-linked puograve provocare danni gravi nella degradazione di
numerosi substrati Questo puograve effettivamente lasciare le proteine in un
limbo impossibile raggiungere lo stato nativo ma non riconosciuto dal
macchinario ERAD esse restano mal ripiegate nel RE a tempo
indeterminato A prima vista questa dipendenza dalla glicosilazione
sembra essere un miglioramento non necessario Tuttavia egrave ormai chiaro
che lo spettro di porzioni di zucchero presenti in una proteina egrave un
segnale fondamentale nel marcare il suo status di ripiegamento Infatti
dato che diverse proteine altamente abbondanti nel RE tra cui BiP e
PDI spesso non sono glicosilate la presenza e la natura covalente di
molto mannosio in un polipeptide puograve fornire un segnale importante che
aiuta il macchinario di controllo-qualitagrave del RE a distinguere le specie
ripiegate destinate ad altri scomparti da quelle piugrave abbondanti e
permanenti del RE Lrsquointuizione nel ruolo della glicosilazione nella
discriminazione tra le specie in via di ripiegamento e le proteine
terminali mal ripiegate nel RE egrave venuta dalla constatazione che
glicoproteine mal ripiegate subiscono un taglio dei loro N-glicani da una
varietagrave di glicosidasi tra cui una mannossidasi specifica In aggiunta a
proteine mal ripiegate persistenti si egrave pensato che il rimodellamento
dipendente dal tempo di N-glicani porti ad un segnale per la
degradazione del macchinario ERAD Questo permette intermedi
ripiegati in un periodo di tempo prima del rimodellamento dei loro N-
glicani in cui il polipeptide egrave immune dalla sorveglianza ERAD Egrave
21
interessante notare che un recente studio suggerisce che anche per i
polipeptidi citosolici vi egrave un periodo durante e subito dopo la sintesi in
cui le specie mal ripiegate sono immuni alla degradazione del
proteasoma [23] Recenti studi hanno identificato due differenti lettine
localizzate nel RE che svolgono un ruolo critico nellrsquoERAD La prima egrave
correlata alla proteina mannossidasi responsabile del taglio di N-glicani
nel RE ma sembra aver perso la sua attivitagrave catalitica Nel lievito si
chiama Htm1pMnl1p e nei mammiferi egrave chiamato EDEM Studi
condotti su cellule di mammifero suggeriscono che EDEM aiuta le
glicoproteine mal ripiegate a lasciare il ciclo calnexinacalreticulina del
chaperone lectina dove stanno cercando di ripiegarsi e cosigrave entrare nel
ciclo di degradazione [24 ab] Tuttavia nel lievito Htm1p egrave richiesto
per la degradazione efficiente di substrati come CPY che non
dipendono da calnexina Quindi sembra probabile che Htm1pEDEM
ricopra altri ruoli in ERAD La seconda lectina Yos9p forma un
complesso stabile con proteine mal ripiegate e la perdita di questa
lectina conduce ad un profondo e specifico difetto nella degradazione di
glicoproteine mal ripiegate [25] Sorprendentemente mentre mutazioni
puntiformi nella tasca di Yos9p legante il mannosio eliminano la sua
capacitagrave di supportare ERAD i mutanti stessi di Yos9p mostrano una
maggior interazione con i substrati Ciograve indica la possibilitagrave che la
lectina Yos9p svolga un ruolo piugrave informativo interrogando lo stato
dello zucchero di forme mal ripiegate per determinare se debbano essere
passate al macchinario di retrotranslocazione Tuttavia come con
ERAD-C sebbene ci siano stati grandi progressi nella caratterizzazione
del macchinario di retrotranslocazione [26] le caratteristiche strutturali
delle proteine mal ripiegate sono in fase di monitoraggio e sono ancora
22
limitate le conoscenzedi come le forme mal ripiegate sono passate a
questo macchinario
CLEARENCE DI AGGREGATI ATTRAVERSO
LrsquoAUTOFAGIA
Egrave sempre piugrave evidente che ci sono una varietagrave di condizioni in vivo che
anche con chaperoni e macchinari proteolitici presenti nello stesso
compartimento come proteine mal ripiegate questi meccanismi di
controllo-qualitagrave falliscono e le proteine mal ripiegate avanzano
formando aggregati Inoltre tali aggregati intracellulari sono associati
con una serie di malattie neurodegenerative come il morbo di
Huntington e di Parkinson La natura e la sorte di aggregati di proteine
nelle cellule eucariotiche egrave stata poco compresa Recentemente egrave stata
sempre piugrave sostenuta unrsquoazione protettiva della formazione di aggregati
piuttosto che unrsquoimmediata azione patogena Per esempio nel caso del
morbo di Huntington lrsquoesame di cellule neuronali in coltura
sovrapproducenti una fusione di poliglutamina espansa e huntingtina-
GFP rivelano che queste cellule contenenti aggregati fluorescenti
morfologicamente visibili esibiscono una migliore viabilitagrave rispetto a
quelle aventi per via diffusionale materiale fluorescente [27] Questo
sembra in accordo con il concetto che si tratta di piccoli assemblati di
proteine mal ripiegate inclusioni non morfologicamente visibili che
esercitano effetti tossici sulle cellule Analogamente un recente
confronto delle dimensioni rispetto a tossicitagrave per gli aggregati di
proteina prionica PrP suggerisce che piccoli aggregati contenenti da una
a due dozzine di molecole sono risultati i piugrave tossici per le cellule [28]
23
Ma le cellule dispongono di meccanismi di compensazione per questi
piccoli aggregati Studi recenti hanno suggerito che la via ubiquitina-
proteosoma possa essere il pilastro della rimozione di specie inclini
allrsquoaggregazione Infatti gli aggregati rilevati nel contesto di
neurodegenerazione di solito sono reattivi con gli anticorpi anti-
ubiquitina il che implica che le specie mal ripiegate sono state
riconosciute dal sistema di coniugazione dellubiquitina Eppure vari
studi di questi ultimi anni indicano che queste proteine modificate
rappresentano una sfida particolare per proteasomi che possono portare
alla loro inibizione [29 ab] Il meccanismo di questa inattivazione
rimane sconosciuto ma puograve coinvolgere il soffocamento della camera
del proteasoma [30]
Anatomia del proteasoma Il proteasoma egrave una macromolecola proteica del peso di circa 2 milioni
di Daltons Ersquo formata da ununitagrave base centrale (core) e 2 cappucci agli estremi (cap) Il core egrave
formato a sua volta da 4 anelli ciascuno costituito da 7 unitagrave proteiche I due ldquocaprdquo attaccati alle
due estremitagrave del core cilindrico consistono ciascuno di 20 subunitagrave
24
Ora sembra che la modifica dellrsquoubiquitina possa reclutare specie
aggregate mediante una via indipendente lrsquoAUTOFAGIA Lrsquoautofagia
implica il riconoscimento e lrsquoimpacchettamentofagocitazione di
proteine specifiche o organelli in vescicole autofagosomiche che si
fondono con i lisosomi in cui sia le vescicole che il loro contenuto sono
scomposti Piugrave di 20 componenti cosiddetti Atg (geni coinvolti
nellrsquoautofagia) mediano questo processo straordinario Recenti studi
hanno dimostrato che componenti centrali della formazione di autosomi
nei topi hanno attivitagrave nei tessuti dei mammiferi Per esempio carenza
di atg5 ha portato alla morte di animali appena nati a causa
dellrsquoincapacitagrave di fornire un apporto di aminoacidi attraverso la
degradazione di proteine del corpo durante la condizione di fame
relativa allrsquoimmediato periodo post-natale Sorprendentemente in un
altro studio in cui egrave stata indotta una carenza di atg7 piugrave avanti nella
vita con un gene ldquofloxedrdquo lrsquoaccumulo di aggregati positivi
allrsquoubiquitina egrave stata osservata nel fegato degli animali che sono stati
disabilitati nella produzione di autofagosomi La funzione del
proteasoma in questi animali egrave rimasta inalterata contenente specie mal
ripiegate etichettate con ubiquitina e possono essere eliminate attraverso
autofagia Egrave stato poi scoperto un componente denominato p62 (o
sequestosoma1) che costituisce un guscio attorno agli aggregati di
huntingtina [31] Questa proteina contiene un dominio C-terminale
associato allrsquoubiquitina (UBA) che puograve legare poliubiquitine in modo
tale che p62 si collochi con lrsquoubiquitina quando espressa in cellule
HeLa Inoltre nelle cellule che esprimono huntigtina p62 si associa con
LC3 una proteina localizzata negli autofagosomi In accordo con quanto
riportato e cioegrave che lrsquoautofagia riduce i livelli di aggregati di
huntingtina e con un ruolo critico di p62 in questo processo lrsquoinibizione
25
antisenso mediata dallrsquoesperessione di p62 aumenta lrsquoapoptosi delle
cellule che esprimono huntungtina Quindi sembra che la modifica
dellrsquoubiquitina delle proteine difettose possa offrire un ingresso sia al
sistema proteasoma o in contesti dove lrsquoaggregazione egrave in corso al
sistema autofagia
SISTEMI CHAPERONI HSP70
Le Hsp70 proteine dello shock termico di 70 KDa sono impegnate in
una serie di processi tra cui il ripiegamento di proteine di nuova sintesi
il trasporto delle proteine attraverso membrane il ripiegamento di
proteine mal ripiegate ed aggregate e il controllo delle attivitagrave delle
proteine regolatrici Questa versatilitagrave egrave ottenuta attraverso
lampliamento e la diversificazione evolutiva di geni hsp70 che ha
generato sia chaperoni Hsp70 specifici Hsp110 e proteine Hsp170 La
versatilitagrave egrave determinata attraverso lrsquoimpiego di cochaperoni proteine J
e fattori di scambio di nucleotide (NEF) che regolano lrsquoattivitagrave di Hsp70
(Figura 4)
26
Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame
del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una
Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)
Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la
proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato
allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del
substrato
Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre
specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb
Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di
legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un
numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame
dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi
Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina
Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni
Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali
di Hsp70 con se stesso
27
INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70
Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di
proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura
xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding
appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide
N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD
adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio
elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con
lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante
chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco
tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini
di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di
comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura
di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione
La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la
tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo
coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture
precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una
proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da
una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β
ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica
compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio
elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di
legame del substrato (Figura 5)
28
Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo
substrato
La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra
domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che
collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo
solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi
residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame
allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A
dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso
Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un
legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in
nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano
completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve
entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo
fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui
coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del
segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti
integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A
29
capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il
quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di
ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a
idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di
DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro
catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente
arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia
drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete
crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la
barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK
costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina
superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura
della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera
attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della
prolina
DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-
NUCLEOTIDE
Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi
meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono
fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la
liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del
substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la
dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine
BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave
dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con
30
funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S
cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1
(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la
disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e
HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70
fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi
della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente
indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene
GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg
di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei
nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte
posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i
nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario
BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in
modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del
complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si
compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo
Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva
[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con
conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve
indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca
di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di
convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la
reazione di scambio nucleotidica di Hsp70
31
LEGAMI Hsp70-Hsp70
Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro
della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In
particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce
come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola
lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di
questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento
Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il
cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che
sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi
eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente
lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se
non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di
complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di
nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di
scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione
importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto
di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel
folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle
Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza
proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa
con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere
coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di
traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina
Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come
sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le
interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di
32
Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi
SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua
attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano
legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di
idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede
possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano
lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina
stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che
Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami
con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina
J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di
stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega
bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o
Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non
limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che
la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-
associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con
Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito
meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande
aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante
per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70
AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP
Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli
AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione
disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]
33
Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un
anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del
proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico
20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA
svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP
Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104
nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico
per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste
attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come
una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-
etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE
per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla
fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il
meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere
tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria
per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli
anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una
parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali
suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata
assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando
una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a
spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad
entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel
caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro
che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti
dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una
proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In
parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno
34
individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi
domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre
interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta
apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati
che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la
questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)
Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97
Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da
proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad
entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro
efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non
devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati
dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte
lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono
piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte
superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine
adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il
35
movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori
p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su
proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di
proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la
retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e
reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo
anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite
adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente
il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente
forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei
canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]
LrsquoAZIONE DELLrsquoATP
La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico
al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco
affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad
esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello
Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che
ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo
di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli
wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli
mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori
dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di
ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di
un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di
quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda
36
subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino
al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave
significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o
sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti
differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra
essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che
attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave
adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non
vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a
cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di
subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico
Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un
substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di
queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un
meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da
F1-ATPasi non sembra escluso
HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE
NEURODEGENERATIVE
RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE
Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel
mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una
pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi
associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione
37
di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di
Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta
promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]
Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90
nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave
funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi
permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]
HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico
Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono
mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)
accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock
citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata
da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante
di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo
stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si
lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei
geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-
shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via
multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di
transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-
translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90
[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e
mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo
shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con
Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)
38
attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da
shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni
Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che
i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro
sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock
termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su
attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato
che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi
di insulti
Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90
e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con
shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La
somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a
topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello
39
Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge
contro aggregati tossici
Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un
aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave
egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di
chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione
incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste
molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente
diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su
espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative
Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie
neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a
mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei
neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia
muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-
pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma
mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme
nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che
Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in
oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza
attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili
[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di
Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt
mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore
di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo
suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro
effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi
40
indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando
monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono
probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono
essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di
atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70
permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]
Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare
spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo
nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un
miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina
[62]
Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il
riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso
lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido
dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli
di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i
motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione
acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni
Riluzolo
Arimoclomol
41
Nei vari modelli cellulari della malattia di Alzheimer (AD) vi egrave un
incremento dei livelli di Hsp70 promossa dalla solubilitagrave e dal legame ai
microtubuli delle proteine tau [63] Hsp70 ha anche inibito la
propensione di aggregazione di Aβ [64] e ridotto la tossicitagrave di Aβ su
culture neuronali [65] Inoltre la proteina precursore dellrsquoamiloide
(APP) eo il suo Aβ amiloide derivato sono bersagli di chaperoni
mediati da clearence [66-67] Nella Drosophila melanogaster e nei
modelli di lievito della malattia di Parkinson (PD) lrsquoespressione diretta
di Hsp70 o la modulazione farmacologica di Hsp ha impedito la perdita
di neuroni causata da alfa-sinucleina [68-69] Huang et al hanno
riportato che questi effetti di Hsp70 si manifestano con lrsquoinibizione della
formazione di fibrille di alfa-sinucleina prevenendo la formazione di
alfa-sinucleina prefibrillare [70] Usando delezioni mutanti di alfa-
sinucleina Luk et al hanno indicato che le interazioni tra il dominio
legante il substrato Hsp70 e la regione del core idrofobico dellrsquoalfa-
sinucleina mediano lrsquoinibizione dellrsquoassemblaggio e che questo
processo di assemblaggio egrave inibito prima della fase di allungamento
[71] Nel complesso in diversi modelli di malattia neurodegenerativa la
sovra espressione di Hsp70 ha migliorato la gravitagrave della malattia di
fenotipi diversi senza incidere visibilmente sulla formazione di
aggregati suggerendo che i chaperoni non impediscono lrsquoaggregazione
di per seacute bensigrave reindirizzano gli aggregati preferibilmente in depositi
amorfi quindi sequestrando specie potenzialmente tossiche dalla
maggior parte della soluzione
42
Lrsquoespressione di Hsp70 e di altre Hsp egrave indotta dallrsquoinibizione
farmacologica di Hsp90
Come riportato sopra lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal
complesso con Hsp90 con susseguente produzione di Hsp (Figura 7) e
lrsquoinduzione di Hsp70 da parte di inibitori di Hsp90 egrave ben documentata
nei modelli di malattie neurodegenerative La geldanamicina (GM) un
inibitore di Hsp90 induce un aumento dose dipendente di Hsp70 nei
modelli di cellule di AD (Alzhaimer) cosigrave come nei neuroni della
corteccia primaria del ratto e riduce la quantitagrave di tau insolubili e dei
livelli basali di acido okadaico indotto da tau fosforilazione [63] Il
trattamento di neuroni primari corticali con lrsquoinibitore di Hsp90 con
struttura purinica il PU24FCI ha portato ad un aumento di Hsp70 dose-
dipendente [72]
PU24FCI
KU32
43
Allo stesso modo la somministrazione di due derivati di PU24FCI
CNS-permeabili il PU-DZ8 [72] ed il EC102 [73] a topi tau transgenici
(htau e JNPL3) ha determinato induzione di Hsp70 nel cervello e
mantenuto gli effetti per 24 ore dopo la somministrazione KU32 un
inibitore di Hsp90 di diversa natura chimica ha indotto Hsp70 in culture
SH-SY5Y di neuroblastoma e la ha protetta da tossicitagrave indotta da Aβ
GM ha attivato una risposta da shock termico ed inibito lrsquoaggregazione
di htt in un modello di coltura cellulare di HD ed ha indotto Hsp70 in
maniera tempo e concentrazione-dipendente ed ha impedito
lrsquoaggregazione di alfa-sinucleina e protetto contro la tossicitagrave in un
modello di aggregazione cellulare di alfa-sinucleina Auluck et al hanno
segnalato che il trattamento di un modello volante di PD con GM ha
protetto completamente contro tossicitagrave per alfa-sinucleina [74] GM ha
protetto anche contro la neurotossicitagrave dopaminergica indotta da 1-metil-
4-fenil-1236-tetraidropiridina (MPTP) in un modello di topo di PD Il
pretrattamento con GM mediante iniezione ventricolare intracerebrale
prima del trattamento con MPTP ha indotto le Hsp70 ed incrementato il
contenuto residuale di dopamina e lrsquoimmuno reattivitagrave della tirosina
idrolasi nel corpo striato [75] Lrsquoinduzione di Hsp70 nel midollo spinale
egrave stata osservata in seguito ad iniezione intraperitoneale di un derivato
della GM il 17-AAG in un modello di SBMA topo [76] Il 17-AAG egrave
stato anche efficace contro la nuerodegenerazione in altre malattie
poliQ Vale a dire ha soppresso la degenerazione dellrsquoocchio e la
formazione di inclusioni del corpo e salvato dalla letalitagrave in un modello
di SCA di Drosophila Ha inoltre soppresso la neurodegenerazione in un
modello volante di HD La riduzione di HSF-1 ha abolito lrsquoinduzione di
chaperoni molecolari e gli effeti terapeutici di 17-AAG sulla
neurodegenerazione poliQ indotta nei modelli di Drosophila facendo
44
arguire che lrsquoeffetto terapeutico di 17-AAG egrave essenzialmente mediato da
HSF-1 [77] Riassumendo lrsquoattivazione di HSF-1 da inibitori di Hsp90
egrave stata notata specificamente in modelli in vivo ed in vitro di malattie
neurodegenerative suggerendo che lrsquoinibizione di Hsp90 puograve essere un
mezzo per modulare i livelli di Hsp in cervelli malati con lrsquoobbiettivo di
proteggere contro le proteine tossiche che si presentano nel corso del
processo neurodegenerativo
Lrsquoinibizione di Hsp90 riduce lrsquoattivitagrave e lrsquoespressione di proteine
neuronali aberranti
In aggiunta alla regolazione di HSF-1 evidenze recenti suggeriscono un
ruolo addizionale per Hsp90 nel mantenimento della stabilitagrave funzionale
della capacitagrave aberrante di proteine neuronali (Figura 8A)
La SBMA egrave una malattia ereditaria dei motoneuroni causata
dallrsquoaccrescimento di un tratto di poliglutamina allrsquointerno del recettore
androgeno (AR) [57]
Le caratteristiche patologiche di SBMA sono perdita dei motoneuroni
nel midollo spinale e nel tronco cerebrale diffusione dellrsquoaccumulo
nucleare inclusioni nucleari di mutanti AR (mAR) nei motoneuroni
residui e in alcuni organi viscerali Waza et al hanno dimostrato che
mAR presente in SBMA egrave una delle proteine regolate da Hsp90 (Figura
8A) [76]
45
Figura 8 Le Hsp90 riparano le proteine neuronali aberranti (A) Proteine neuronali
aberranti regolate da Hsp90 (B) Lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90porta allrsquoinattivazione
o degradazione delle proteine regulate da Hsp90 probabilmente attraverso la via del
proteasoma
Le Hsp90 formano un complesso molecolare con mAR per il
mantenimento della sua stabilitagrave funzionale Sia in modelli cellulari di
SBMA che in topi transgenici lrsquoinibizione di Hsp90 da parte di 17-
AAG il derivato 17 allilammino-17-demetossi della geldanamicina ha
46
portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal
macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati
disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da
destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione
dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di
SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave
rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati
[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori
hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo
sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa
(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni
Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]
Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo
egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali
sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al
hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina
(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi
familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un
complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data
da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto
47
lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della
stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave
dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita
neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei
neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che
codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a
PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson
familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson
suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente
associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che
Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate
con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente
diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina
egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille
ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno
recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di
alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che
sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina
[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce
lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari
Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-
dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento
tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-
sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da
chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di
mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il
macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD
associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-
48
sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative
caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave
caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di
tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD
lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da
unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina
chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta
(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si
era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero
netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un
gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e
Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave
causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma
17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau
[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine
neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso
portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina
mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da
Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei
modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave
patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-
dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla
settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad
una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di
tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno
dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una
diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di
AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le
49
relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la
degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90
[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al
(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave
stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da
GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β
effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi
GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di
Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe
portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in
strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati
indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone
biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione
di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da
parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi
proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di
queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)
Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie
neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio
approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare
dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la
formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione
potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di
Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare
terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare
malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo
centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90
puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione
50
successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti
neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti
clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto
che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono
tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in
modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni
nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati
promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio
spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in
modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di
Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a
lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse
da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase
esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora
rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori
dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per
mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie
neurodegenerative
51
SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-
ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-
METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE
(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE
MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO
SULLA FRAMMENTAZIONE
Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in
risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta
nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine
regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il
ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai
loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine
client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro
cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire
su molti percorsi oncogenici
Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il
nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che
lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati
composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP
attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del
processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono
emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i
tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule
normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina
(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una
maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto
che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una
piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
15
RISPOSTA ALLA NON CORRETTA
CONFORMAZIONE DELLE PROTEINE
Le proteine designate per il riconoscimento dei segnali di stress
provenienti dal reticolo endoplasmatico sono generalmente IRE1
(Inositol Requiring Kinase 1) ATF6 (Activation of Transcription Factor
6) e PERK (PKR-like Endoplasmic Reticulum Kinase)
Nel lievito la capacitagrave di ripiegarsi del RE egrave monitorata da IRE1 una
chinasi trans membrana altamente conservata che contiene un dominio
luminale responsabile del riconoscimento delle forme mal ripiegate
chinasi citosoliche e domini ribonucleasici Lrsquoaccumularsi delle proteine
mal ripiegate nel RE porta allrsquoattivazione delle chinasi IRE
Lrsquoattivazione delle IRE-chinasi promuove lo splicing non convenzionale
dei messaggi per un fattore di traduzione b-ZIP (Hac1 nel lievito e XBP-
1 nei metazoi) attraverso il suo dominio ribonucleasico La traduzione
del messaggio Hac 1 spliced crea un fattore attivo di trascrizione che
media direttamente la trascrizione dei target di UPR includendo
chaperoni del RE macchinario ERAD e tante altre proteine secretorie
In aggiunta alla IRE-1 gli eucarioti piugrave sviluppati utilizzano due altri
sensori le chinasi trans membrana del RE PERK ed il fattore di
trascrizione trans membrana del RE ATF6 (Figura 2) PERK contiene
un sensore luminale che egrave altamente correlato a quello di IRE-1 il
dominio citoplasmatico di PERK consiste in una chinasi elF2α
16
Figura 2 Struttura dei principali sensori dello stress nel reticolo endoplasmatico IRE1
ATF6 PERK
Lrsquoattivazione delle chinasi dovuta alla presenza di proteine mal
ripiegate determina unrsquoinibizione generalizzata della traduzione come
pure la up-regulation del fattore di trascrizione specifico ATF4
Lrsquoaccumulo di proteine mal ripiegate permette inoltre ad ATF6 di
raggiungere lrsquoapparato del Golgi dove le proteasi trans membrana
rilasciano il dominio citoplasmatico del fattore di trascrizione
permettendogli di entrare nel nucleo e mediare lrsquoinduzione genetica
Lrsquoesistenza di molteplici sensori UPR negli eucarioti piugrave avanzati
permette per lo piugrave una risposta piugrave sfumata alle proteine mal ripiegate
Per esempio una risposta iniziale alle proteine mal ripiegate potrebbe
portare ad una down-regulation generalizzata della traduzione seguita in
sequenza da unrsquoinduzione di chaperoni lrsquoinduzione del macchinario
17
ERAD ed infine contro lo stress prolungato lrsquoattivazione della morte
cellulare tramite apoptosi Molto recentemente ci sono stati notevoli
progressi nelle nostre conoscenze molecolari di come IRE-1 (e per
deduzione PERK) riconosce le proteine mal ripiegate Studi precedenti
avevano dimostrato che BIP (Binding Immunoglobulin Protein) lrsquo
omologo principale delle Hsp70 presente nel reticolo endoplasmatico si
lega in modo specifico con IRE1 e che questa interazione scompare in
condizioni di stress del RE Inoltre lrsquoiperespressione di BiP puograve
sopprimere lrsquoinduzione dellrsquoUPR Questo aveva suggerito un modello di
titolazione in cui BiP agisce come un regolatore negativo di IRE1 e
lrsquoaccumularsi di forme mal ripiegate porta indirettamente allrsquoattivazione
dellrsquoIRE1 attraverso il sequestro di BiP da parte proteine mal ripiegate
Tuttavia recenti studi hanno dimostrato che anche se il legame del BiP
possa avere un ruolo importante nella down-regulation di IRE1 ci sono
altri fattori importanti Analisi mutazionali hanno trovato che la
delezione della regione di IRE1 responsabile del legame con BiP non
altera la regolazione di IRE1 in risposta alle proteine unfolded [18] Piugrave
drammaticamente la struttura cristallina del core del dominio luminale
conservato (cLD) di IRE1 nel lievito rivela una profonda scanalatura
idrofobica che ricorda la tasca legante dei maggiori complessi di
istocompatibilitagrave (MHCs) che sono i responsabili per il riconoscimento
peptidico Che IRE1 possa legarsi direttamente a polipeptidi mal
ripiegati egrave unrsquoidea interessante (Figura 3) [19]
18
Figura 3 Un modello ipotetico descrive lrsquoattivazione di Ire1 attraverso la oligomerizzazione
determinata dal legame di proteine unfolded (indicate in rosso) Le interazioni dirette o
indirette fra le catene delle proteine unfolded possono contribuire allrsquoattivazione Sul lato
luminale della membrana del RE le proteine unfolded si legano alla scanalatura (indicata in
grigio) formata dalla dimerizzazione del core del dominio luminale di Ire1 attraverso
linterfaccia 1 Sul lato citoplasmaticodella membrana del RE la oligmerizzazione accosta i
domini della chinasi Ire 1 che subiscono un cambiamento conformazionale in seguito ad
autofosforilazione che porta allrsquoattivazione della funzione di RNA-ribonucleasi di Ire1
Attraverso il riconoscimento diretto delle forme mal ripiegate
lrsquoinduzione di IRE1 potrebbe verificarsi prima della completa titolazione
di BiP che data lrsquoestrema abbondanza di questrsquoultimo nel RE potrebbe
verificarsi solo dopo un catastrofico accumulo di proteine mal ripiegate
Inoltre il riconoscimento diretto di forme mal ripiegate da parte di IRE1
(e PERK) potrebbe consentire una serie di risposte piugrave sfumate in cui
diverse forme mal ripiegate potrebbero essere preferenzialmente
riconosciute da sensori diversi quali BiP IRE1 o PERK Cosigrave in linea
di principio la natura (per esempio traslazionale contro transcrizionale)
ed il ciclo di UPR potrebbe essere su misura per la classe specifica di
forme mal ripiegate che sono prevalenti nel RE [20]
19
DEGRADAZIONE DELLE PROTEINE ASSOCIATA AL
RETICOLO ENDOPLASMATICO
Come ci si poteva aspettare dalla diversitagrave delle proteine che si
ripiegano NEL RE studi recenti hanno dimostrato che la degradazione
ER-associata (ER-Associated Degradation ERAD) comprende una
serie di sistemi diversi ciascuno responsabile della degradazione di
sottoinsiemi di proteine che condividono proprietagrave fisiche comuni
Esistono anche regioni dedicate allrsquo ER Associated Degradation
(ERAD) nelle quali proteine che non raggiungono il corretto
ripiegamento vengono retrotraslocate al citosol e quindi degradate dal
proteasoma [21]
Ciograve forse egrave piugrave chiaramente dimostrato nel lievito dove ci sono almeno
due distinti meccanismi di sorveglianza per identificare le proteine mal
ripiegate del RE Il primo meccanismo chiamato ERAD-L analizza le
proteine che contengono domini luminali mal ripiegati (solubili o trans
membrana) chiamati CPY una forma mutante della proteina CPY
endogena che egrave incapace di folding Il secondo denominato ERAD-C
rileva domini mal ripiegati citosolici di proteine trans membrana [22]
Sebbene entrambe queste vie in ultima analisi convergano sul sistema
di degradazione ubiquitina-proteosoma esse dipendono da diversi
insiemi di componenti RE-associati per rivelare e fornire specie mal
ripiegate al citosol Nel caso di ERAD-C (e non di ERAD-L) la
degradazione egrave in genere dipendente da uno specifico sottoinsieme di
chaperoni citosolici inclusi i membri Hsp40 e Hsp70 Ciograve suggerisce
che queste proteine possono essere direttamente responsabili per il
riconoscimento di domini citosolici mal ripiegati di proteine trans
membrana Tuttavia le caratteristiche esatte che vengono monitorate e
20
come i substrati vengano consegnati al macchinario di
retrotranslocazione restano importanti questioni aperte per la maggior
parte dei substrati Il riconoscimento di una proteina contenente un
dominio luminale mal ripiegato dipende in modo determinante dallo
stato di glicosilazione della proteina Infatti anche piccole modifiche di
glicani N-linked puograve provocare danni gravi nella degradazione di
numerosi substrati Questo puograve effettivamente lasciare le proteine in un
limbo impossibile raggiungere lo stato nativo ma non riconosciuto dal
macchinario ERAD esse restano mal ripiegate nel RE a tempo
indeterminato A prima vista questa dipendenza dalla glicosilazione
sembra essere un miglioramento non necessario Tuttavia egrave ormai chiaro
che lo spettro di porzioni di zucchero presenti in una proteina egrave un
segnale fondamentale nel marcare il suo status di ripiegamento Infatti
dato che diverse proteine altamente abbondanti nel RE tra cui BiP e
PDI spesso non sono glicosilate la presenza e la natura covalente di
molto mannosio in un polipeptide puograve fornire un segnale importante che
aiuta il macchinario di controllo-qualitagrave del RE a distinguere le specie
ripiegate destinate ad altri scomparti da quelle piugrave abbondanti e
permanenti del RE Lrsquointuizione nel ruolo della glicosilazione nella
discriminazione tra le specie in via di ripiegamento e le proteine
terminali mal ripiegate nel RE egrave venuta dalla constatazione che
glicoproteine mal ripiegate subiscono un taglio dei loro N-glicani da una
varietagrave di glicosidasi tra cui una mannossidasi specifica In aggiunta a
proteine mal ripiegate persistenti si egrave pensato che il rimodellamento
dipendente dal tempo di N-glicani porti ad un segnale per la
degradazione del macchinario ERAD Questo permette intermedi
ripiegati in un periodo di tempo prima del rimodellamento dei loro N-
glicani in cui il polipeptide egrave immune dalla sorveglianza ERAD Egrave
21
interessante notare che un recente studio suggerisce che anche per i
polipeptidi citosolici vi egrave un periodo durante e subito dopo la sintesi in
cui le specie mal ripiegate sono immuni alla degradazione del
proteasoma [23] Recenti studi hanno identificato due differenti lettine
localizzate nel RE che svolgono un ruolo critico nellrsquoERAD La prima egrave
correlata alla proteina mannossidasi responsabile del taglio di N-glicani
nel RE ma sembra aver perso la sua attivitagrave catalitica Nel lievito si
chiama Htm1pMnl1p e nei mammiferi egrave chiamato EDEM Studi
condotti su cellule di mammifero suggeriscono che EDEM aiuta le
glicoproteine mal ripiegate a lasciare il ciclo calnexinacalreticulina del
chaperone lectina dove stanno cercando di ripiegarsi e cosigrave entrare nel
ciclo di degradazione [24 ab] Tuttavia nel lievito Htm1p egrave richiesto
per la degradazione efficiente di substrati come CPY che non
dipendono da calnexina Quindi sembra probabile che Htm1pEDEM
ricopra altri ruoli in ERAD La seconda lectina Yos9p forma un
complesso stabile con proteine mal ripiegate e la perdita di questa
lectina conduce ad un profondo e specifico difetto nella degradazione di
glicoproteine mal ripiegate [25] Sorprendentemente mentre mutazioni
puntiformi nella tasca di Yos9p legante il mannosio eliminano la sua
capacitagrave di supportare ERAD i mutanti stessi di Yos9p mostrano una
maggior interazione con i substrati Ciograve indica la possibilitagrave che la
lectina Yos9p svolga un ruolo piugrave informativo interrogando lo stato
dello zucchero di forme mal ripiegate per determinare se debbano essere
passate al macchinario di retrotranslocazione Tuttavia come con
ERAD-C sebbene ci siano stati grandi progressi nella caratterizzazione
del macchinario di retrotranslocazione [26] le caratteristiche strutturali
delle proteine mal ripiegate sono in fase di monitoraggio e sono ancora
22
limitate le conoscenzedi come le forme mal ripiegate sono passate a
questo macchinario
CLEARENCE DI AGGREGATI ATTRAVERSO
LrsquoAUTOFAGIA
Egrave sempre piugrave evidente che ci sono una varietagrave di condizioni in vivo che
anche con chaperoni e macchinari proteolitici presenti nello stesso
compartimento come proteine mal ripiegate questi meccanismi di
controllo-qualitagrave falliscono e le proteine mal ripiegate avanzano
formando aggregati Inoltre tali aggregati intracellulari sono associati
con una serie di malattie neurodegenerative come il morbo di
Huntington e di Parkinson La natura e la sorte di aggregati di proteine
nelle cellule eucariotiche egrave stata poco compresa Recentemente egrave stata
sempre piugrave sostenuta unrsquoazione protettiva della formazione di aggregati
piuttosto che unrsquoimmediata azione patogena Per esempio nel caso del
morbo di Huntington lrsquoesame di cellule neuronali in coltura
sovrapproducenti una fusione di poliglutamina espansa e huntingtina-
GFP rivelano che queste cellule contenenti aggregati fluorescenti
morfologicamente visibili esibiscono una migliore viabilitagrave rispetto a
quelle aventi per via diffusionale materiale fluorescente [27] Questo
sembra in accordo con il concetto che si tratta di piccoli assemblati di
proteine mal ripiegate inclusioni non morfologicamente visibili che
esercitano effetti tossici sulle cellule Analogamente un recente
confronto delle dimensioni rispetto a tossicitagrave per gli aggregati di
proteina prionica PrP suggerisce che piccoli aggregati contenenti da una
a due dozzine di molecole sono risultati i piugrave tossici per le cellule [28]
23
Ma le cellule dispongono di meccanismi di compensazione per questi
piccoli aggregati Studi recenti hanno suggerito che la via ubiquitina-
proteosoma possa essere il pilastro della rimozione di specie inclini
allrsquoaggregazione Infatti gli aggregati rilevati nel contesto di
neurodegenerazione di solito sono reattivi con gli anticorpi anti-
ubiquitina il che implica che le specie mal ripiegate sono state
riconosciute dal sistema di coniugazione dellubiquitina Eppure vari
studi di questi ultimi anni indicano che queste proteine modificate
rappresentano una sfida particolare per proteasomi che possono portare
alla loro inibizione [29 ab] Il meccanismo di questa inattivazione
rimane sconosciuto ma puograve coinvolgere il soffocamento della camera
del proteasoma [30]
Anatomia del proteasoma Il proteasoma egrave una macromolecola proteica del peso di circa 2 milioni
di Daltons Ersquo formata da ununitagrave base centrale (core) e 2 cappucci agli estremi (cap) Il core egrave
formato a sua volta da 4 anelli ciascuno costituito da 7 unitagrave proteiche I due ldquocaprdquo attaccati alle
due estremitagrave del core cilindrico consistono ciascuno di 20 subunitagrave
24
Ora sembra che la modifica dellrsquoubiquitina possa reclutare specie
aggregate mediante una via indipendente lrsquoAUTOFAGIA Lrsquoautofagia
implica il riconoscimento e lrsquoimpacchettamentofagocitazione di
proteine specifiche o organelli in vescicole autofagosomiche che si
fondono con i lisosomi in cui sia le vescicole che il loro contenuto sono
scomposti Piugrave di 20 componenti cosiddetti Atg (geni coinvolti
nellrsquoautofagia) mediano questo processo straordinario Recenti studi
hanno dimostrato che componenti centrali della formazione di autosomi
nei topi hanno attivitagrave nei tessuti dei mammiferi Per esempio carenza
di atg5 ha portato alla morte di animali appena nati a causa
dellrsquoincapacitagrave di fornire un apporto di aminoacidi attraverso la
degradazione di proteine del corpo durante la condizione di fame
relativa allrsquoimmediato periodo post-natale Sorprendentemente in un
altro studio in cui egrave stata indotta una carenza di atg7 piugrave avanti nella
vita con un gene ldquofloxedrdquo lrsquoaccumulo di aggregati positivi
allrsquoubiquitina egrave stata osservata nel fegato degli animali che sono stati
disabilitati nella produzione di autofagosomi La funzione del
proteasoma in questi animali egrave rimasta inalterata contenente specie mal
ripiegate etichettate con ubiquitina e possono essere eliminate attraverso
autofagia Egrave stato poi scoperto un componente denominato p62 (o
sequestosoma1) che costituisce un guscio attorno agli aggregati di
huntingtina [31] Questa proteina contiene un dominio C-terminale
associato allrsquoubiquitina (UBA) che puograve legare poliubiquitine in modo
tale che p62 si collochi con lrsquoubiquitina quando espressa in cellule
HeLa Inoltre nelle cellule che esprimono huntigtina p62 si associa con
LC3 una proteina localizzata negli autofagosomi In accordo con quanto
riportato e cioegrave che lrsquoautofagia riduce i livelli di aggregati di
huntingtina e con un ruolo critico di p62 in questo processo lrsquoinibizione
25
antisenso mediata dallrsquoesperessione di p62 aumenta lrsquoapoptosi delle
cellule che esprimono huntungtina Quindi sembra che la modifica
dellrsquoubiquitina delle proteine difettose possa offrire un ingresso sia al
sistema proteasoma o in contesti dove lrsquoaggregazione egrave in corso al
sistema autofagia
SISTEMI CHAPERONI HSP70
Le Hsp70 proteine dello shock termico di 70 KDa sono impegnate in
una serie di processi tra cui il ripiegamento di proteine di nuova sintesi
il trasporto delle proteine attraverso membrane il ripiegamento di
proteine mal ripiegate ed aggregate e il controllo delle attivitagrave delle
proteine regolatrici Questa versatilitagrave egrave ottenuta attraverso
lampliamento e la diversificazione evolutiva di geni hsp70 che ha
generato sia chaperoni Hsp70 specifici Hsp110 e proteine Hsp170 La
versatilitagrave egrave determinata attraverso lrsquoimpiego di cochaperoni proteine J
e fattori di scambio di nucleotide (NEF) che regolano lrsquoattivitagrave di Hsp70
(Figura 4)
26
Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame
del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una
Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)
Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la
proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato
allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del
substrato
Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre
specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb
Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di
legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un
numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame
dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi
Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina
Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni
Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali
di Hsp70 con se stesso
27
INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70
Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di
proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura
xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding
appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide
N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD
adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio
elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con
lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante
chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco
tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini
di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di
comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura
di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione
La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la
tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo
coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture
precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una
proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da
una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β
ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica
compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio
elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di
legame del substrato (Figura 5)
28
Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo
substrato
La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra
domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che
collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo
solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi
residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame
allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A
dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso
Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un
legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in
nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano
completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve
entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo
fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui
coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del
segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti
integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A
29
capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il
quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di
ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a
idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di
DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro
catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente
arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia
drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete
crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la
barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK
costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina
superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura
della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera
attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della
prolina
DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-
NUCLEOTIDE
Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi
meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono
fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la
liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del
substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la
dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine
BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave
dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con
30
funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S
cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1
(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la
disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e
HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70
fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi
della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente
indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene
GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg
di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei
nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte
posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i
nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario
BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in
modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del
complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si
compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo
Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva
[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con
conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve
indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca
di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di
convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la
reazione di scambio nucleotidica di Hsp70
31
LEGAMI Hsp70-Hsp70
Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro
della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In
particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce
come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola
lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di
questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento
Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il
cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che
sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi
eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente
lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se
non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di
complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di
nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di
scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione
importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto
di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel
folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle
Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza
proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa
con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere
coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di
traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina
Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come
sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le
interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di
32
Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi
SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua
attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano
legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di
idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede
possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano
lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina
stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che
Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami
con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina
J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di
stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega
bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o
Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non
limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che
la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-
associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con
Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito
meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande
aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante
per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70
AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP
Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli
AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione
disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]
33
Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un
anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del
proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico
20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA
svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP
Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104
nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico
per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste
attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come
una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-
etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE
per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla
fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il
meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere
tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria
per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli
anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una
parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali
suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata
assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando
una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a
spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad
entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel
caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro
che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti
dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una
proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In
parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno
34
individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi
domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre
interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta
apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati
che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la
questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)
Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97
Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da
proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad
entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro
efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non
devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati
dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte
lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono
piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte
superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine
adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il
35
movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori
p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su
proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di
proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la
retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e
reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo
anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite
adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente
il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente
forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei
canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]
LrsquoAZIONE DELLrsquoATP
La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico
al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco
affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad
esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello
Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che
ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo
di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli
wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli
mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori
dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di
ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di
un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di
quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda
36
subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino
al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave
significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o
sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti
differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra
essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che
attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave
adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non
vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a
cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di
subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico
Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un
substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di
queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un
meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da
F1-ATPasi non sembra escluso
HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE
NEURODEGENERATIVE
RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE
Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel
mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una
pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi
associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione
37
di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di
Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta
promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]
Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90
nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave
funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi
permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]
HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico
Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono
mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)
accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock
citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata
da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante
di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo
stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si
lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei
geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-
shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via
multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di
transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-
translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90
[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e
mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo
shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con
Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)
38
attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da
shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni
Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che
i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro
sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock
termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su
attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato
che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi
di insulti
Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90
e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con
shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La
somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a
topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello
39
Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge
contro aggregati tossici
Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un
aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave
egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di
chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione
incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste
molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente
diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su
espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative
Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie
neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a
mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei
neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia
muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-
pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma
mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme
nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che
Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in
oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza
attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili
[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di
Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt
mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore
di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo
suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro
effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi
40
indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando
monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono
probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono
essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di
atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70
permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]
Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare
spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo
nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un
miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina
[62]
Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il
riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso
lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido
dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli
di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i
motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione
acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni
Riluzolo
Arimoclomol
41
Nei vari modelli cellulari della malattia di Alzheimer (AD) vi egrave un
incremento dei livelli di Hsp70 promossa dalla solubilitagrave e dal legame ai
microtubuli delle proteine tau [63] Hsp70 ha anche inibito la
propensione di aggregazione di Aβ [64] e ridotto la tossicitagrave di Aβ su
culture neuronali [65] Inoltre la proteina precursore dellrsquoamiloide
(APP) eo il suo Aβ amiloide derivato sono bersagli di chaperoni
mediati da clearence [66-67] Nella Drosophila melanogaster e nei
modelli di lievito della malattia di Parkinson (PD) lrsquoespressione diretta
di Hsp70 o la modulazione farmacologica di Hsp ha impedito la perdita
di neuroni causata da alfa-sinucleina [68-69] Huang et al hanno
riportato che questi effetti di Hsp70 si manifestano con lrsquoinibizione della
formazione di fibrille di alfa-sinucleina prevenendo la formazione di
alfa-sinucleina prefibrillare [70] Usando delezioni mutanti di alfa-
sinucleina Luk et al hanno indicato che le interazioni tra il dominio
legante il substrato Hsp70 e la regione del core idrofobico dellrsquoalfa-
sinucleina mediano lrsquoinibizione dellrsquoassemblaggio e che questo
processo di assemblaggio egrave inibito prima della fase di allungamento
[71] Nel complesso in diversi modelli di malattia neurodegenerativa la
sovra espressione di Hsp70 ha migliorato la gravitagrave della malattia di
fenotipi diversi senza incidere visibilmente sulla formazione di
aggregati suggerendo che i chaperoni non impediscono lrsquoaggregazione
di per seacute bensigrave reindirizzano gli aggregati preferibilmente in depositi
amorfi quindi sequestrando specie potenzialmente tossiche dalla
maggior parte della soluzione
42
Lrsquoespressione di Hsp70 e di altre Hsp egrave indotta dallrsquoinibizione
farmacologica di Hsp90
Come riportato sopra lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal
complesso con Hsp90 con susseguente produzione di Hsp (Figura 7) e
lrsquoinduzione di Hsp70 da parte di inibitori di Hsp90 egrave ben documentata
nei modelli di malattie neurodegenerative La geldanamicina (GM) un
inibitore di Hsp90 induce un aumento dose dipendente di Hsp70 nei
modelli di cellule di AD (Alzhaimer) cosigrave come nei neuroni della
corteccia primaria del ratto e riduce la quantitagrave di tau insolubili e dei
livelli basali di acido okadaico indotto da tau fosforilazione [63] Il
trattamento di neuroni primari corticali con lrsquoinibitore di Hsp90 con
struttura purinica il PU24FCI ha portato ad un aumento di Hsp70 dose-
dipendente [72]
PU24FCI
KU32
43
Allo stesso modo la somministrazione di due derivati di PU24FCI
CNS-permeabili il PU-DZ8 [72] ed il EC102 [73] a topi tau transgenici
(htau e JNPL3) ha determinato induzione di Hsp70 nel cervello e
mantenuto gli effetti per 24 ore dopo la somministrazione KU32 un
inibitore di Hsp90 di diversa natura chimica ha indotto Hsp70 in culture
SH-SY5Y di neuroblastoma e la ha protetta da tossicitagrave indotta da Aβ
GM ha attivato una risposta da shock termico ed inibito lrsquoaggregazione
di htt in un modello di coltura cellulare di HD ed ha indotto Hsp70 in
maniera tempo e concentrazione-dipendente ed ha impedito
lrsquoaggregazione di alfa-sinucleina e protetto contro la tossicitagrave in un
modello di aggregazione cellulare di alfa-sinucleina Auluck et al hanno
segnalato che il trattamento di un modello volante di PD con GM ha
protetto completamente contro tossicitagrave per alfa-sinucleina [74] GM ha
protetto anche contro la neurotossicitagrave dopaminergica indotta da 1-metil-
4-fenil-1236-tetraidropiridina (MPTP) in un modello di topo di PD Il
pretrattamento con GM mediante iniezione ventricolare intracerebrale
prima del trattamento con MPTP ha indotto le Hsp70 ed incrementato il
contenuto residuale di dopamina e lrsquoimmuno reattivitagrave della tirosina
idrolasi nel corpo striato [75] Lrsquoinduzione di Hsp70 nel midollo spinale
egrave stata osservata in seguito ad iniezione intraperitoneale di un derivato
della GM il 17-AAG in un modello di SBMA topo [76] Il 17-AAG egrave
stato anche efficace contro la nuerodegenerazione in altre malattie
poliQ Vale a dire ha soppresso la degenerazione dellrsquoocchio e la
formazione di inclusioni del corpo e salvato dalla letalitagrave in un modello
di SCA di Drosophila Ha inoltre soppresso la neurodegenerazione in un
modello volante di HD La riduzione di HSF-1 ha abolito lrsquoinduzione di
chaperoni molecolari e gli effeti terapeutici di 17-AAG sulla
neurodegenerazione poliQ indotta nei modelli di Drosophila facendo
44
arguire che lrsquoeffetto terapeutico di 17-AAG egrave essenzialmente mediato da
HSF-1 [77] Riassumendo lrsquoattivazione di HSF-1 da inibitori di Hsp90
egrave stata notata specificamente in modelli in vivo ed in vitro di malattie
neurodegenerative suggerendo che lrsquoinibizione di Hsp90 puograve essere un
mezzo per modulare i livelli di Hsp in cervelli malati con lrsquoobbiettivo di
proteggere contro le proteine tossiche che si presentano nel corso del
processo neurodegenerativo
Lrsquoinibizione di Hsp90 riduce lrsquoattivitagrave e lrsquoespressione di proteine
neuronali aberranti
In aggiunta alla regolazione di HSF-1 evidenze recenti suggeriscono un
ruolo addizionale per Hsp90 nel mantenimento della stabilitagrave funzionale
della capacitagrave aberrante di proteine neuronali (Figura 8A)
La SBMA egrave una malattia ereditaria dei motoneuroni causata
dallrsquoaccrescimento di un tratto di poliglutamina allrsquointerno del recettore
androgeno (AR) [57]
Le caratteristiche patologiche di SBMA sono perdita dei motoneuroni
nel midollo spinale e nel tronco cerebrale diffusione dellrsquoaccumulo
nucleare inclusioni nucleari di mutanti AR (mAR) nei motoneuroni
residui e in alcuni organi viscerali Waza et al hanno dimostrato che
mAR presente in SBMA egrave una delle proteine regolate da Hsp90 (Figura
8A) [76]
45
Figura 8 Le Hsp90 riparano le proteine neuronali aberranti (A) Proteine neuronali
aberranti regolate da Hsp90 (B) Lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90porta allrsquoinattivazione
o degradazione delle proteine regulate da Hsp90 probabilmente attraverso la via del
proteasoma
Le Hsp90 formano un complesso molecolare con mAR per il
mantenimento della sua stabilitagrave funzionale Sia in modelli cellulari di
SBMA che in topi transgenici lrsquoinibizione di Hsp90 da parte di 17-
AAG il derivato 17 allilammino-17-demetossi della geldanamicina ha
46
portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal
macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati
disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da
destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione
dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di
SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave
rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati
[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori
hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo
sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa
(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni
Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]
Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo
egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali
sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al
hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina
(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi
familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un
complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data
da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto
47
lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della
stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave
dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita
neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei
neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che
codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a
PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson
familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson
suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente
associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che
Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate
con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente
diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina
egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille
ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno
recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di
alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che
sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina
[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce
lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari
Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-
dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento
tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-
sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da
chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di
mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il
macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD
associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-
48
sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative
caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave
caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di
tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD
lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da
unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina
chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta
(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si
era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero
netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un
gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e
Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave
causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma
17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau
[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine
neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso
portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina
mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da
Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei
modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave
patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-
dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla
settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad
una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di
tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno
dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una
diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di
AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le
49
relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la
degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90
[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al
(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave
stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da
GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β
effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi
GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di
Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe
portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in
strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati
indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone
biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione
di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da
parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi
proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di
queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)
Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie
neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio
approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare
dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la
formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione
potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di
Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare
terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare
malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo
centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90
puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione
50
successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti
neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti
clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto
che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono
tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in
modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni
nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati
promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio
spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in
modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di
Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a
lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse
da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase
esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora
rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori
dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per
mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie
neurodegenerative
51
SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-
ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-
METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE
(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE
MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO
SULLA FRAMMENTAZIONE
Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in
risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta
nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine
regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il
ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai
loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine
client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro
cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire
su molti percorsi oncogenici
Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il
nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che
lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati
composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP
attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del
processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono
emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i
tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule
normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina
(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una
maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto
che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una
piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
16
Figura 2 Struttura dei principali sensori dello stress nel reticolo endoplasmatico IRE1
ATF6 PERK
Lrsquoattivazione delle chinasi dovuta alla presenza di proteine mal
ripiegate determina unrsquoinibizione generalizzata della traduzione come
pure la up-regulation del fattore di trascrizione specifico ATF4
Lrsquoaccumulo di proteine mal ripiegate permette inoltre ad ATF6 di
raggiungere lrsquoapparato del Golgi dove le proteasi trans membrana
rilasciano il dominio citoplasmatico del fattore di trascrizione
permettendogli di entrare nel nucleo e mediare lrsquoinduzione genetica
Lrsquoesistenza di molteplici sensori UPR negli eucarioti piugrave avanzati
permette per lo piugrave una risposta piugrave sfumata alle proteine mal ripiegate
Per esempio una risposta iniziale alle proteine mal ripiegate potrebbe
portare ad una down-regulation generalizzata della traduzione seguita in
sequenza da unrsquoinduzione di chaperoni lrsquoinduzione del macchinario
17
ERAD ed infine contro lo stress prolungato lrsquoattivazione della morte
cellulare tramite apoptosi Molto recentemente ci sono stati notevoli
progressi nelle nostre conoscenze molecolari di come IRE-1 (e per
deduzione PERK) riconosce le proteine mal ripiegate Studi precedenti
avevano dimostrato che BIP (Binding Immunoglobulin Protein) lrsquo
omologo principale delle Hsp70 presente nel reticolo endoplasmatico si
lega in modo specifico con IRE1 e che questa interazione scompare in
condizioni di stress del RE Inoltre lrsquoiperespressione di BiP puograve
sopprimere lrsquoinduzione dellrsquoUPR Questo aveva suggerito un modello di
titolazione in cui BiP agisce come un regolatore negativo di IRE1 e
lrsquoaccumularsi di forme mal ripiegate porta indirettamente allrsquoattivazione
dellrsquoIRE1 attraverso il sequestro di BiP da parte proteine mal ripiegate
Tuttavia recenti studi hanno dimostrato che anche se il legame del BiP
possa avere un ruolo importante nella down-regulation di IRE1 ci sono
altri fattori importanti Analisi mutazionali hanno trovato che la
delezione della regione di IRE1 responsabile del legame con BiP non
altera la regolazione di IRE1 in risposta alle proteine unfolded [18] Piugrave
drammaticamente la struttura cristallina del core del dominio luminale
conservato (cLD) di IRE1 nel lievito rivela una profonda scanalatura
idrofobica che ricorda la tasca legante dei maggiori complessi di
istocompatibilitagrave (MHCs) che sono i responsabili per il riconoscimento
peptidico Che IRE1 possa legarsi direttamente a polipeptidi mal
ripiegati egrave unrsquoidea interessante (Figura 3) [19]
18
Figura 3 Un modello ipotetico descrive lrsquoattivazione di Ire1 attraverso la oligomerizzazione
determinata dal legame di proteine unfolded (indicate in rosso) Le interazioni dirette o
indirette fra le catene delle proteine unfolded possono contribuire allrsquoattivazione Sul lato
luminale della membrana del RE le proteine unfolded si legano alla scanalatura (indicata in
grigio) formata dalla dimerizzazione del core del dominio luminale di Ire1 attraverso
linterfaccia 1 Sul lato citoplasmaticodella membrana del RE la oligmerizzazione accosta i
domini della chinasi Ire 1 che subiscono un cambiamento conformazionale in seguito ad
autofosforilazione che porta allrsquoattivazione della funzione di RNA-ribonucleasi di Ire1
Attraverso il riconoscimento diretto delle forme mal ripiegate
lrsquoinduzione di IRE1 potrebbe verificarsi prima della completa titolazione
di BiP che data lrsquoestrema abbondanza di questrsquoultimo nel RE potrebbe
verificarsi solo dopo un catastrofico accumulo di proteine mal ripiegate
Inoltre il riconoscimento diretto di forme mal ripiegate da parte di IRE1
(e PERK) potrebbe consentire una serie di risposte piugrave sfumate in cui
diverse forme mal ripiegate potrebbero essere preferenzialmente
riconosciute da sensori diversi quali BiP IRE1 o PERK Cosigrave in linea
di principio la natura (per esempio traslazionale contro transcrizionale)
ed il ciclo di UPR potrebbe essere su misura per la classe specifica di
forme mal ripiegate che sono prevalenti nel RE [20]
19
DEGRADAZIONE DELLE PROTEINE ASSOCIATA AL
RETICOLO ENDOPLASMATICO
Come ci si poteva aspettare dalla diversitagrave delle proteine che si
ripiegano NEL RE studi recenti hanno dimostrato che la degradazione
ER-associata (ER-Associated Degradation ERAD) comprende una
serie di sistemi diversi ciascuno responsabile della degradazione di
sottoinsiemi di proteine che condividono proprietagrave fisiche comuni
Esistono anche regioni dedicate allrsquo ER Associated Degradation
(ERAD) nelle quali proteine che non raggiungono il corretto
ripiegamento vengono retrotraslocate al citosol e quindi degradate dal
proteasoma [21]
Ciograve forse egrave piugrave chiaramente dimostrato nel lievito dove ci sono almeno
due distinti meccanismi di sorveglianza per identificare le proteine mal
ripiegate del RE Il primo meccanismo chiamato ERAD-L analizza le
proteine che contengono domini luminali mal ripiegati (solubili o trans
membrana) chiamati CPY una forma mutante della proteina CPY
endogena che egrave incapace di folding Il secondo denominato ERAD-C
rileva domini mal ripiegati citosolici di proteine trans membrana [22]
Sebbene entrambe queste vie in ultima analisi convergano sul sistema
di degradazione ubiquitina-proteosoma esse dipendono da diversi
insiemi di componenti RE-associati per rivelare e fornire specie mal
ripiegate al citosol Nel caso di ERAD-C (e non di ERAD-L) la
degradazione egrave in genere dipendente da uno specifico sottoinsieme di
chaperoni citosolici inclusi i membri Hsp40 e Hsp70 Ciograve suggerisce
che queste proteine possono essere direttamente responsabili per il
riconoscimento di domini citosolici mal ripiegati di proteine trans
membrana Tuttavia le caratteristiche esatte che vengono monitorate e
20
come i substrati vengano consegnati al macchinario di
retrotranslocazione restano importanti questioni aperte per la maggior
parte dei substrati Il riconoscimento di una proteina contenente un
dominio luminale mal ripiegato dipende in modo determinante dallo
stato di glicosilazione della proteina Infatti anche piccole modifiche di
glicani N-linked puograve provocare danni gravi nella degradazione di
numerosi substrati Questo puograve effettivamente lasciare le proteine in un
limbo impossibile raggiungere lo stato nativo ma non riconosciuto dal
macchinario ERAD esse restano mal ripiegate nel RE a tempo
indeterminato A prima vista questa dipendenza dalla glicosilazione
sembra essere un miglioramento non necessario Tuttavia egrave ormai chiaro
che lo spettro di porzioni di zucchero presenti in una proteina egrave un
segnale fondamentale nel marcare il suo status di ripiegamento Infatti
dato che diverse proteine altamente abbondanti nel RE tra cui BiP e
PDI spesso non sono glicosilate la presenza e la natura covalente di
molto mannosio in un polipeptide puograve fornire un segnale importante che
aiuta il macchinario di controllo-qualitagrave del RE a distinguere le specie
ripiegate destinate ad altri scomparti da quelle piugrave abbondanti e
permanenti del RE Lrsquointuizione nel ruolo della glicosilazione nella
discriminazione tra le specie in via di ripiegamento e le proteine
terminali mal ripiegate nel RE egrave venuta dalla constatazione che
glicoproteine mal ripiegate subiscono un taglio dei loro N-glicani da una
varietagrave di glicosidasi tra cui una mannossidasi specifica In aggiunta a
proteine mal ripiegate persistenti si egrave pensato che il rimodellamento
dipendente dal tempo di N-glicani porti ad un segnale per la
degradazione del macchinario ERAD Questo permette intermedi
ripiegati in un periodo di tempo prima del rimodellamento dei loro N-
glicani in cui il polipeptide egrave immune dalla sorveglianza ERAD Egrave
21
interessante notare che un recente studio suggerisce che anche per i
polipeptidi citosolici vi egrave un periodo durante e subito dopo la sintesi in
cui le specie mal ripiegate sono immuni alla degradazione del
proteasoma [23] Recenti studi hanno identificato due differenti lettine
localizzate nel RE che svolgono un ruolo critico nellrsquoERAD La prima egrave
correlata alla proteina mannossidasi responsabile del taglio di N-glicani
nel RE ma sembra aver perso la sua attivitagrave catalitica Nel lievito si
chiama Htm1pMnl1p e nei mammiferi egrave chiamato EDEM Studi
condotti su cellule di mammifero suggeriscono che EDEM aiuta le
glicoproteine mal ripiegate a lasciare il ciclo calnexinacalreticulina del
chaperone lectina dove stanno cercando di ripiegarsi e cosigrave entrare nel
ciclo di degradazione [24 ab] Tuttavia nel lievito Htm1p egrave richiesto
per la degradazione efficiente di substrati come CPY che non
dipendono da calnexina Quindi sembra probabile che Htm1pEDEM
ricopra altri ruoli in ERAD La seconda lectina Yos9p forma un
complesso stabile con proteine mal ripiegate e la perdita di questa
lectina conduce ad un profondo e specifico difetto nella degradazione di
glicoproteine mal ripiegate [25] Sorprendentemente mentre mutazioni
puntiformi nella tasca di Yos9p legante il mannosio eliminano la sua
capacitagrave di supportare ERAD i mutanti stessi di Yos9p mostrano una
maggior interazione con i substrati Ciograve indica la possibilitagrave che la
lectina Yos9p svolga un ruolo piugrave informativo interrogando lo stato
dello zucchero di forme mal ripiegate per determinare se debbano essere
passate al macchinario di retrotranslocazione Tuttavia come con
ERAD-C sebbene ci siano stati grandi progressi nella caratterizzazione
del macchinario di retrotranslocazione [26] le caratteristiche strutturali
delle proteine mal ripiegate sono in fase di monitoraggio e sono ancora
22
limitate le conoscenzedi come le forme mal ripiegate sono passate a
questo macchinario
CLEARENCE DI AGGREGATI ATTRAVERSO
LrsquoAUTOFAGIA
Egrave sempre piugrave evidente che ci sono una varietagrave di condizioni in vivo che
anche con chaperoni e macchinari proteolitici presenti nello stesso
compartimento come proteine mal ripiegate questi meccanismi di
controllo-qualitagrave falliscono e le proteine mal ripiegate avanzano
formando aggregati Inoltre tali aggregati intracellulari sono associati
con una serie di malattie neurodegenerative come il morbo di
Huntington e di Parkinson La natura e la sorte di aggregati di proteine
nelle cellule eucariotiche egrave stata poco compresa Recentemente egrave stata
sempre piugrave sostenuta unrsquoazione protettiva della formazione di aggregati
piuttosto che unrsquoimmediata azione patogena Per esempio nel caso del
morbo di Huntington lrsquoesame di cellule neuronali in coltura
sovrapproducenti una fusione di poliglutamina espansa e huntingtina-
GFP rivelano che queste cellule contenenti aggregati fluorescenti
morfologicamente visibili esibiscono una migliore viabilitagrave rispetto a
quelle aventi per via diffusionale materiale fluorescente [27] Questo
sembra in accordo con il concetto che si tratta di piccoli assemblati di
proteine mal ripiegate inclusioni non morfologicamente visibili che
esercitano effetti tossici sulle cellule Analogamente un recente
confronto delle dimensioni rispetto a tossicitagrave per gli aggregati di
proteina prionica PrP suggerisce che piccoli aggregati contenenti da una
a due dozzine di molecole sono risultati i piugrave tossici per le cellule [28]
23
Ma le cellule dispongono di meccanismi di compensazione per questi
piccoli aggregati Studi recenti hanno suggerito che la via ubiquitina-
proteosoma possa essere il pilastro della rimozione di specie inclini
allrsquoaggregazione Infatti gli aggregati rilevati nel contesto di
neurodegenerazione di solito sono reattivi con gli anticorpi anti-
ubiquitina il che implica che le specie mal ripiegate sono state
riconosciute dal sistema di coniugazione dellubiquitina Eppure vari
studi di questi ultimi anni indicano che queste proteine modificate
rappresentano una sfida particolare per proteasomi che possono portare
alla loro inibizione [29 ab] Il meccanismo di questa inattivazione
rimane sconosciuto ma puograve coinvolgere il soffocamento della camera
del proteasoma [30]
Anatomia del proteasoma Il proteasoma egrave una macromolecola proteica del peso di circa 2 milioni
di Daltons Ersquo formata da ununitagrave base centrale (core) e 2 cappucci agli estremi (cap) Il core egrave
formato a sua volta da 4 anelli ciascuno costituito da 7 unitagrave proteiche I due ldquocaprdquo attaccati alle
due estremitagrave del core cilindrico consistono ciascuno di 20 subunitagrave
24
Ora sembra che la modifica dellrsquoubiquitina possa reclutare specie
aggregate mediante una via indipendente lrsquoAUTOFAGIA Lrsquoautofagia
implica il riconoscimento e lrsquoimpacchettamentofagocitazione di
proteine specifiche o organelli in vescicole autofagosomiche che si
fondono con i lisosomi in cui sia le vescicole che il loro contenuto sono
scomposti Piugrave di 20 componenti cosiddetti Atg (geni coinvolti
nellrsquoautofagia) mediano questo processo straordinario Recenti studi
hanno dimostrato che componenti centrali della formazione di autosomi
nei topi hanno attivitagrave nei tessuti dei mammiferi Per esempio carenza
di atg5 ha portato alla morte di animali appena nati a causa
dellrsquoincapacitagrave di fornire un apporto di aminoacidi attraverso la
degradazione di proteine del corpo durante la condizione di fame
relativa allrsquoimmediato periodo post-natale Sorprendentemente in un
altro studio in cui egrave stata indotta una carenza di atg7 piugrave avanti nella
vita con un gene ldquofloxedrdquo lrsquoaccumulo di aggregati positivi
allrsquoubiquitina egrave stata osservata nel fegato degli animali che sono stati
disabilitati nella produzione di autofagosomi La funzione del
proteasoma in questi animali egrave rimasta inalterata contenente specie mal
ripiegate etichettate con ubiquitina e possono essere eliminate attraverso
autofagia Egrave stato poi scoperto un componente denominato p62 (o
sequestosoma1) che costituisce un guscio attorno agli aggregati di
huntingtina [31] Questa proteina contiene un dominio C-terminale
associato allrsquoubiquitina (UBA) che puograve legare poliubiquitine in modo
tale che p62 si collochi con lrsquoubiquitina quando espressa in cellule
HeLa Inoltre nelle cellule che esprimono huntigtina p62 si associa con
LC3 una proteina localizzata negli autofagosomi In accordo con quanto
riportato e cioegrave che lrsquoautofagia riduce i livelli di aggregati di
huntingtina e con un ruolo critico di p62 in questo processo lrsquoinibizione
25
antisenso mediata dallrsquoesperessione di p62 aumenta lrsquoapoptosi delle
cellule che esprimono huntungtina Quindi sembra che la modifica
dellrsquoubiquitina delle proteine difettose possa offrire un ingresso sia al
sistema proteasoma o in contesti dove lrsquoaggregazione egrave in corso al
sistema autofagia
SISTEMI CHAPERONI HSP70
Le Hsp70 proteine dello shock termico di 70 KDa sono impegnate in
una serie di processi tra cui il ripiegamento di proteine di nuova sintesi
il trasporto delle proteine attraverso membrane il ripiegamento di
proteine mal ripiegate ed aggregate e il controllo delle attivitagrave delle
proteine regolatrici Questa versatilitagrave egrave ottenuta attraverso
lampliamento e la diversificazione evolutiva di geni hsp70 che ha
generato sia chaperoni Hsp70 specifici Hsp110 e proteine Hsp170 La
versatilitagrave egrave determinata attraverso lrsquoimpiego di cochaperoni proteine J
e fattori di scambio di nucleotide (NEF) che regolano lrsquoattivitagrave di Hsp70
(Figura 4)
26
Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame
del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una
Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)
Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la
proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato
allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del
substrato
Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre
specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb
Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di
legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un
numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame
dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi
Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina
Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni
Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali
di Hsp70 con se stesso
27
INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70
Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di
proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura
xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding
appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide
N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD
adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio
elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con
lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante
chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco
tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini
di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di
comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura
di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione
La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la
tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo
coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture
precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una
proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da
una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β
ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica
compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio
elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di
legame del substrato (Figura 5)
28
Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo
substrato
La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra
domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che
collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo
solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi
residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame
allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A
dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso
Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un
legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in
nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano
completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve
entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo
fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui
coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del
segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti
integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A
29
capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il
quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di
ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a
idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di
DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro
catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente
arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia
drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete
crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la
barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK
costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina
superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura
della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera
attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della
prolina
DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-
NUCLEOTIDE
Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi
meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono
fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la
liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del
substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la
dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine
BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave
dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con
30
funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S
cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1
(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la
disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e
HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70
fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi
della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente
indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene
GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg
di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei
nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte
posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i
nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario
BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in
modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del
complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si
compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo
Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva
[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con
conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve
indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca
di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di
convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la
reazione di scambio nucleotidica di Hsp70
31
LEGAMI Hsp70-Hsp70
Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro
della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In
particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce
come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola
lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di
questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento
Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il
cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che
sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi
eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente
lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se
non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di
complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di
nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di
scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione
importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto
di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel
folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle
Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza
proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa
con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere
coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di
traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina
Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come
sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le
interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di
32
Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi
SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua
attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano
legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di
idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede
possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano
lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina
stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che
Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami
con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina
J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di
stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega
bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o
Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non
limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che
la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-
associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con
Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito
meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande
aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante
per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70
AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP
Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli
AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione
disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]
33
Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un
anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del
proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico
20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA
svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP
Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104
nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico
per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste
attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come
una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-
etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE
per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla
fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il
meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere
tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria
per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli
anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una
parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali
suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata
assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando
una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a
spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad
entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel
caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro
che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti
dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una
proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In
parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno
34
individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi
domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre
interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta
apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati
che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la
questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)
Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97
Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da
proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad
entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro
efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non
devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati
dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte
lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono
piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte
superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine
adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il
35
movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori
p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su
proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di
proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la
retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e
reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo
anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite
adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente
il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente
forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei
canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]
LrsquoAZIONE DELLrsquoATP
La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico
al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco
affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad
esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello
Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che
ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo
di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli
wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli
mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori
dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di
ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di
un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di
quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda
36
subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino
al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave
significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o
sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti
differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra
essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che
attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave
adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non
vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a
cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di
subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico
Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un
substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di
queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un
meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da
F1-ATPasi non sembra escluso
HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE
NEURODEGENERATIVE
RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE
Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel
mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una
pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi
associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione
37
di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di
Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta
promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]
Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90
nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave
funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi
permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]
HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico
Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono
mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)
accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock
citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata
da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante
di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo
stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si
lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei
geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-
shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via
multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di
transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-
translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90
[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e
mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo
shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con
Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)
38
attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da
shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni
Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che
i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro
sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock
termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su
attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato
che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi
di insulti
Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90
e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con
shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La
somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a
topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello
39
Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge
contro aggregati tossici
Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un
aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave
egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di
chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione
incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste
molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente
diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su
espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative
Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie
neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a
mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei
neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia
muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-
pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma
mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme
nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che
Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in
oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza
attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili
[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di
Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt
mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore
di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo
suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro
effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi
40
indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando
monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono
probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono
essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di
atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70
permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]
Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare
spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo
nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un
miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina
[62]
Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il
riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso
lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido
dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli
di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i
motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione
acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni
Riluzolo
Arimoclomol
41
Nei vari modelli cellulari della malattia di Alzheimer (AD) vi egrave un
incremento dei livelli di Hsp70 promossa dalla solubilitagrave e dal legame ai
microtubuli delle proteine tau [63] Hsp70 ha anche inibito la
propensione di aggregazione di Aβ [64] e ridotto la tossicitagrave di Aβ su
culture neuronali [65] Inoltre la proteina precursore dellrsquoamiloide
(APP) eo il suo Aβ amiloide derivato sono bersagli di chaperoni
mediati da clearence [66-67] Nella Drosophila melanogaster e nei
modelli di lievito della malattia di Parkinson (PD) lrsquoespressione diretta
di Hsp70 o la modulazione farmacologica di Hsp ha impedito la perdita
di neuroni causata da alfa-sinucleina [68-69] Huang et al hanno
riportato che questi effetti di Hsp70 si manifestano con lrsquoinibizione della
formazione di fibrille di alfa-sinucleina prevenendo la formazione di
alfa-sinucleina prefibrillare [70] Usando delezioni mutanti di alfa-
sinucleina Luk et al hanno indicato che le interazioni tra il dominio
legante il substrato Hsp70 e la regione del core idrofobico dellrsquoalfa-
sinucleina mediano lrsquoinibizione dellrsquoassemblaggio e che questo
processo di assemblaggio egrave inibito prima della fase di allungamento
[71] Nel complesso in diversi modelli di malattia neurodegenerativa la
sovra espressione di Hsp70 ha migliorato la gravitagrave della malattia di
fenotipi diversi senza incidere visibilmente sulla formazione di
aggregati suggerendo che i chaperoni non impediscono lrsquoaggregazione
di per seacute bensigrave reindirizzano gli aggregati preferibilmente in depositi
amorfi quindi sequestrando specie potenzialmente tossiche dalla
maggior parte della soluzione
42
Lrsquoespressione di Hsp70 e di altre Hsp egrave indotta dallrsquoinibizione
farmacologica di Hsp90
Come riportato sopra lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal
complesso con Hsp90 con susseguente produzione di Hsp (Figura 7) e
lrsquoinduzione di Hsp70 da parte di inibitori di Hsp90 egrave ben documentata
nei modelli di malattie neurodegenerative La geldanamicina (GM) un
inibitore di Hsp90 induce un aumento dose dipendente di Hsp70 nei
modelli di cellule di AD (Alzhaimer) cosigrave come nei neuroni della
corteccia primaria del ratto e riduce la quantitagrave di tau insolubili e dei
livelli basali di acido okadaico indotto da tau fosforilazione [63] Il
trattamento di neuroni primari corticali con lrsquoinibitore di Hsp90 con
struttura purinica il PU24FCI ha portato ad un aumento di Hsp70 dose-
dipendente [72]
PU24FCI
KU32
43
Allo stesso modo la somministrazione di due derivati di PU24FCI
CNS-permeabili il PU-DZ8 [72] ed il EC102 [73] a topi tau transgenici
(htau e JNPL3) ha determinato induzione di Hsp70 nel cervello e
mantenuto gli effetti per 24 ore dopo la somministrazione KU32 un
inibitore di Hsp90 di diversa natura chimica ha indotto Hsp70 in culture
SH-SY5Y di neuroblastoma e la ha protetta da tossicitagrave indotta da Aβ
GM ha attivato una risposta da shock termico ed inibito lrsquoaggregazione
di htt in un modello di coltura cellulare di HD ed ha indotto Hsp70 in
maniera tempo e concentrazione-dipendente ed ha impedito
lrsquoaggregazione di alfa-sinucleina e protetto contro la tossicitagrave in un
modello di aggregazione cellulare di alfa-sinucleina Auluck et al hanno
segnalato che il trattamento di un modello volante di PD con GM ha
protetto completamente contro tossicitagrave per alfa-sinucleina [74] GM ha
protetto anche contro la neurotossicitagrave dopaminergica indotta da 1-metil-
4-fenil-1236-tetraidropiridina (MPTP) in un modello di topo di PD Il
pretrattamento con GM mediante iniezione ventricolare intracerebrale
prima del trattamento con MPTP ha indotto le Hsp70 ed incrementato il
contenuto residuale di dopamina e lrsquoimmuno reattivitagrave della tirosina
idrolasi nel corpo striato [75] Lrsquoinduzione di Hsp70 nel midollo spinale
egrave stata osservata in seguito ad iniezione intraperitoneale di un derivato
della GM il 17-AAG in un modello di SBMA topo [76] Il 17-AAG egrave
stato anche efficace contro la nuerodegenerazione in altre malattie
poliQ Vale a dire ha soppresso la degenerazione dellrsquoocchio e la
formazione di inclusioni del corpo e salvato dalla letalitagrave in un modello
di SCA di Drosophila Ha inoltre soppresso la neurodegenerazione in un
modello volante di HD La riduzione di HSF-1 ha abolito lrsquoinduzione di
chaperoni molecolari e gli effeti terapeutici di 17-AAG sulla
neurodegenerazione poliQ indotta nei modelli di Drosophila facendo
44
arguire che lrsquoeffetto terapeutico di 17-AAG egrave essenzialmente mediato da
HSF-1 [77] Riassumendo lrsquoattivazione di HSF-1 da inibitori di Hsp90
egrave stata notata specificamente in modelli in vivo ed in vitro di malattie
neurodegenerative suggerendo che lrsquoinibizione di Hsp90 puograve essere un
mezzo per modulare i livelli di Hsp in cervelli malati con lrsquoobbiettivo di
proteggere contro le proteine tossiche che si presentano nel corso del
processo neurodegenerativo
Lrsquoinibizione di Hsp90 riduce lrsquoattivitagrave e lrsquoespressione di proteine
neuronali aberranti
In aggiunta alla regolazione di HSF-1 evidenze recenti suggeriscono un
ruolo addizionale per Hsp90 nel mantenimento della stabilitagrave funzionale
della capacitagrave aberrante di proteine neuronali (Figura 8A)
La SBMA egrave una malattia ereditaria dei motoneuroni causata
dallrsquoaccrescimento di un tratto di poliglutamina allrsquointerno del recettore
androgeno (AR) [57]
Le caratteristiche patologiche di SBMA sono perdita dei motoneuroni
nel midollo spinale e nel tronco cerebrale diffusione dellrsquoaccumulo
nucleare inclusioni nucleari di mutanti AR (mAR) nei motoneuroni
residui e in alcuni organi viscerali Waza et al hanno dimostrato che
mAR presente in SBMA egrave una delle proteine regolate da Hsp90 (Figura
8A) [76]
45
Figura 8 Le Hsp90 riparano le proteine neuronali aberranti (A) Proteine neuronali
aberranti regolate da Hsp90 (B) Lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90porta allrsquoinattivazione
o degradazione delle proteine regulate da Hsp90 probabilmente attraverso la via del
proteasoma
Le Hsp90 formano un complesso molecolare con mAR per il
mantenimento della sua stabilitagrave funzionale Sia in modelli cellulari di
SBMA che in topi transgenici lrsquoinibizione di Hsp90 da parte di 17-
AAG il derivato 17 allilammino-17-demetossi della geldanamicina ha
46
portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal
macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati
disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da
destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione
dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di
SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave
rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati
[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori
hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo
sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa
(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni
Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]
Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo
egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali
sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al
hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina
(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi
familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un
complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data
da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto
47
lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della
stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave
dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita
neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei
neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che
codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a
PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson
familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson
suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente
associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che
Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate
con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente
diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina
egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille
ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno
recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di
alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che
sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina
[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce
lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari
Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-
dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento
tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-
sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da
chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di
mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il
macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD
associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-
48
sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative
caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave
caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di
tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD
lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da
unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina
chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta
(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si
era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero
netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un
gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e
Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave
causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma
17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau
[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine
neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso
portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina
mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da
Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei
modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave
patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-
dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla
settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad
una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di
tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno
dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una
diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di
AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le
49
relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la
degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90
[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al
(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave
stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da
GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β
effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi
GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di
Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe
portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in
strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati
indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone
biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione
di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da
parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi
proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di
queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)
Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie
neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio
approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare
dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la
formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione
potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di
Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare
terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare
malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo
centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90
puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione
50
successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti
neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti
clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto
che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono
tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in
modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni
nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati
promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio
spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in
modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di
Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a
lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse
da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase
esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora
rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori
dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per
mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie
neurodegenerative
51
SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-
ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-
METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE
(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE
MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO
SULLA FRAMMENTAZIONE
Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in
risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta
nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine
regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il
ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai
loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine
client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro
cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire
su molti percorsi oncogenici
Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il
nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che
lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati
composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP
attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del
processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono
emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i
tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule
normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina
(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una
maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto
che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una
piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
17
ERAD ed infine contro lo stress prolungato lrsquoattivazione della morte
cellulare tramite apoptosi Molto recentemente ci sono stati notevoli
progressi nelle nostre conoscenze molecolari di come IRE-1 (e per
deduzione PERK) riconosce le proteine mal ripiegate Studi precedenti
avevano dimostrato che BIP (Binding Immunoglobulin Protein) lrsquo
omologo principale delle Hsp70 presente nel reticolo endoplasmatico si
lega in modo specifico con IRE1 e che questa interazione scompare in
condizioni di stress del RE Inoltre lrsquoiperespressione di BiP puograve
sopprimere lrsquoinduzione dellrsquoUPR Questo aveva suggerito un modello di
titolazione in cui BiP agisce come un regolatore negativo di IRE1 e
lrsquoaccumularsi di forme mal ripiegate porta indirettamente allrsquoattivazione
dellrsquoIRE1 attraverso il sequestro di BiP da parte proteine mal ripiegate
Tuttavia recenti studi hanno dimostrato che anche se il legame del BiP
possa avere un ruolo importante nella down-regulation di IRE1 ci sono
altri fattori importanti Analisi mutazionali hanno trovato che la
delezione della regione di IRE1 responsabile del legame con BiP non
altera la regolazione di IRE1 in risposta alle proteine unfolded [18] Piugrave
drammaticamente la struttura cristallina del core del dominio luminale
conservato (cLD) di IRE1 nel lievito rivela una profonda scanalatura
idrofobica che ricorda la tasca legante dei maggiori complessi di
istocompatibilitagrave (MHCs) che sono i responsabili per il riconoscimento
peptidico Che IRE1 possa legarsi direttamente a polipeptidi mal
ripiegati egrave unrsquoidea interessante (Figura 3) [19]
18
Figura 3 Un modello ipotetico descrive lrsquoattivazione di Ire1 attraverso la oligomerizzazione
determinata dal legame di proteine unfolded (indicate in rosso) Le interazioni dirette o
indirette fra le catene delle proteine unfolded possono contribuire allrsquoattivazione Sul lato
luminale della membrana del RE le proteine unfolded si legano alla scanalatura (indicata in
grigio) formata dalla dimerizzazione del core del dominio luminale di Ire1 attraverso
linterfaccia 1 Sul lato citoplasmaticodella membrana del RE la oligmerizzazione accosta i
domini della chinasi Ire 1 che subiscono un cambiamento conformazionale in seguito ad
autofosforilazione che porta allrsquoattivazione della funzione di RNA-ribonucleasi di Ire1
Attraverso il riconoscimento diretto delle forme mal ripiegate
lrsquoinduzione di IRE1 potrebbe verificarsi prima della completa titolazione
di BiP che data lrsquoestrema abbondanza di questrsquoultimo nel RE potrebbe
verificarsi solo dopo un catastrofico accumulo di proteine mal ripiegate
Inoltre il riconoscimento diretto di forme mal ripiegate da parte di IRE1
(e PERK) potrebbe consentire una serie di risposte piugrave sfumate in cui
diverse forme mal ripiegate potrebbero essere preferenzialmente
riconosciute da sensori diversi quali BiP IRE1 o PERK Cosigrave in linea
di principio la natura (per esempio traslazionale contro transcrizionale)
ed il ciclo di UPR potrebbe essere su misura per la classe specifica di
forme mal ripiegate che sono prevalenti nel RE [20]
19
DEGRADAZIONE DELLE PROTEINE ASSOCIATA AL
RETICOLO ENDOPLASMATICO
Come ci si poteva aspettare dalla diversitagrave delle proteine che si
ripiegano NEL RE studi recenti hanno dimostrato che la degradazione
ER-associata (ER-Associated Degradation ERAD) comprende una
serie di sistemi diversi ciascuno responsabile della degradazione di
sottoinsiemi di proteine che condividono proprietagrave fisiche comuni
Esistono anche regioni dedicate allrsquo ER Associated Degradation
(ERAD) nelle quali proteine che non raggiungono il corretto
ripiegamento vengono retrotraslocate al citosol e quindi degradate dal
proteasoma [21]
Ciograve forse egrave piugrave chiaramente dimostrato nel lievito dove ci sono almeno
due distinti meccanismi di sorveglianza per identificare le proteine mal
ripiegate del RE Il primo meccanismo chiamato ERAD-L analizza le
proteine che contengono domini luminali mal ripiegati (solubili o trans
membrana) chiamati CPY una forma mutante della proteina CPY
endogena che egrave incapace di folding Il secondo denominato ERAD-C
rileva domini mal ripiegati citosolici di proteine trans membrana [22]
Sebbene entrambe queste vie in ultima analisi convergano sul sistema
di degradazione ubiquitina-proteosoma esse dipendono da diversi
insiemi di componenti RE-associati per rivelare e fornire specie mal
ripiegate al citosol Nel caso di ERAD-C (e non di ERAD-L) la
degradazione egrave in genere dipendente da uno specifico sottoinsieme di
chaperoni citosolici inclusi i membri Hsp40 e Hsp70 Ciograve suggerisce
che queste proteine possono essere direttamente responsabili per il
riconoscimento di domini citosolici mal ripiegati di proteine trans
membrana Tuttavia le caratteristiche esatte che vengono monitorate e
20
come i substrati vengano consegnati al macchinario di
retrotranslocazione restano importanti questioni aperte per la maggior
parte dei substrati Il riconoscimento di una proteina contenente un
dominio luminale mal ripiegato dipende in modo determinante dallo
stato di glicosilazione della proteina Infatti anche piccole modifiche di
glicani N-linked puograve provocare danni gravi nella degradazione di
numerosi substrati Questo puograve effettivamente lasciare le proteine in un
limbo impossibile raggiungere lo stato nativo ma non riconosciuto dal
macchinario ERAD esse restano mal ripiegate nel RE a tempo
indeterminato A prima vista questa dipendenza dalla glicosilazione
sembra essere un miglioramento non necessario Tuttavia egrave ormai chiaro
che lo spettro di porzioni di zucchero presenti in una proteina egrave un
segnale fondamentale nel marcare il suo status di ripiegamento Infatti
dato che diverse proteine altamente abbondanti nel RE tra cui BiP e
PDI spesso non sono glicosilate la presenza e la natura covalente di
molto mannosio in un polipeptide puograve fornire un segnale importante che
aiuta il macchinario di controllo-qualitagrave del RE a distinguere le specie
ripiegate destinate ad altri scomparti da quelle piugrave abbondanti e
permanenti del RE Lrsquointuizione nel ruolo della glicosilazione nella
discriminazione tra le specie in via di ripiegamento e le proteine
terminali mal ripiegate nel RE egrave venuta dalla constatazione che
glicoproteine mal ripiegate subiscono un taglio dei loro N-glicani da una
varietagrave di glicosidasi tra cui una mannossidasi specifica In aggiunta a
proteine mal ripiegate persistenti si egrave pensato che il rimodellamento
dipendente dal tempo di N-glicani porti ad un segnale per la
degradazione del macchinario ERAD Questo permette intermedi
ripiegati in un periodo di tempo prima del rimodellamento dei loro N-
glicani in cui il polipeptide egrave immune dalla sorveglianza ERAD Egrave
21
interessante notare che un recente studio suggerisce che anche per i
polipeptidi citosolici vi egrave un periodo durante e subito dopo la sintesi in
cui le specie mal ripiegate sono immuni alla degradazione del
proteasoma [23] Recenti studi hanno identificato due differenti lettine
localizzate nel RE che svolgono un ruolo critico nellrsquoERAD La prima egrave
correlata alla proteina mannossidasi responsabile del taglio di N-glicani
nel RE ma sembra aver perso la sua attivitagrave catalitica Nel lievito si
chiama Htm1pMnl1p e nei mammiferi egrave chiamato EDEM Studi
condotti su cellule di mammifero suggeriscono che EDEM aiuta le
glicoproteine mal ripiegate a lasciare il ciclo calnexinacalreticulina del
chaperone lectina dove stanno cercando di ripiegarsi e cosigrave entrare nel
ciclo di degradazione [24 ab] Tuttavia nel lievito Htm1p egrave richiesto
per la degradazione efficiente di substrati come CPY che non
dipendono da calnexina Quindi sembra probabile che Htm1pEDEM
ricopra altri ruoli in ERAD La seconda lectina Yos9p forma un
complesso stabile con proteine mal ripiegate e la perdita di questa
lectina conduce ad un profondo e specifico difetto nella degradazione di
glicoproteine mal ripiegate [25] Sorprendentemente mentre mutazioni
puntiformi nella tasca di Yos9p legante il mannosio eliminano la sua
capacitagrave di supportare ERAD i mutanti stessi di Yos9p mostrano una
maggior interazione con i substrati Ciograve indica la possibilitagrave che la
lectina Yos9p svolga un ruolo piugrave informativo interrogando lo stato
dello zucchero di forme mal ripiegate per determinare se debbano essere
passate al macchinario di retrotranslocazione Tuttavia come con
ERAD-C sebbene ci siano stati grandi progressi nella caratterizzazione
del macchinario di retrotranslocazione [26] le caratteristiche strutturali
delle proteine mal ripiegate sono in fase di monitoraggio e sono ancora
22
limitate le conoscenzedi come le forme mal ripiegate sono passate a
questo macchinario
CLEARENCE DI AGGREGATI ATTRAVERSO
LrsquoAUTOFAGIA
Egrave sempre piugrave evidente che ci sono una varietagrave di condizioni in vivo che
anche con chaperoni e macchinari proteolitici presenti nello stesso
compartimento come proteine mal ripiegate questi meccanismi di
controllo-qualitagrave falliscono e le proteine mal ripiegate avanzano
formando aggregati Inoltre tali aggregati intracellulari sono associati
con una serie di malattie neurodegenerative come il morbo di
Huntington e di Parkinson La natura e la sorte di aggregati di proteine
nelle cellule eucariotiche egrave stata poco compresa Recentemente egrave stata
sempre piugrave sostenuta unrsquoazione protettiva della formazione di aggregati
piuttosto che unrsquoimmediata azione patogena Per esempio nel caso del
morbo di Huntington lrsquoesame di cellule neuronali in coltura
sovrapproducenti una fusione di poliglutamina espansa e huntingtina-
GFP rivelano che queste cellule contenenti aggregati fluorescenti
morfologicamente visibili esibiscono una migliore viabilitagrave rispetto a
quelle aventi per via diffusionale materiale fluorescente [27] Questo
sembra in accordo con il concetto che si tratta di piccoli assemblati di
proteine mal ripiegate inclusioni non morfologicamente visibili che
esercitano effetti tossici sulle cellule Analogamente un recente
confronto delle dimensioni rispetto a tossicitagrave per gli aggregati di
proteina prionica PrP suggerisce che piccoli aggregati contenenti da una
a due dozzine di molecole sono risultati i piugrave tossici per le cellule [28]
23
Ma le cellule dispongono di meccanismi di compensazione per questi
piccoli aggregati Studi recenti hanno suggerito che la via ubiquitina-
proteosoma possa essere il pilastro della rimozione di specie inclini
allrsquoaggregazione Infatti gli aggregati rilevati nel contesto di
neurodegenerazione di solito sono reattivi con gli anticorpi anti-
ubiquitina il che implica che le specie mal ripiegate sono state
riconosciute dal sistema di coniugazione dellubiquitina Eppure vari
studi di questi ultimi anni indicano che queste proteine modificate
rappresentano una sfida particolare per proteasomi che possono portare
alla loro inibizione [29 ab] Il meccanismo di questa inattivazione
rimane sconosciuto ma puograve coinvolgere il soffocamento della camera
del proteasoma [30]
Anatomia del proteasoma Il proteasoma egrave una macromolecola proteica del peso di circa 2 milioni
di Daltons Ersquo formata da ununitagrave base centrale (core) e 2 cappucci agli estremi (cap) Il core egrave
formato a sua volta da 4 anelli ciascuno costituito da 7 unitagrave proteiche I due ldquocaprdquo attaccati alle
due estremitagrave del core cilindrico consistono ciascuno di 20 subunitagrave
24
Ora sembra che la modifica dellrsquoubiquitina possa reclutare specie
aggregate mediante una via indipendente lrsquoAUTOFAGIA Lrsquoautofagia
implica il riconoscimento e lrsquoimpacchettamentofagocitazione di
proteine specifiche o organelli in vescicole autofagosomiche che si
fondono con i lisosomi in cui sia le vescicole che il loro contenuto sono
scomposti Piugrave di 20 componenti cosiddetti Atg (geni coinvolti
nellrsquoautofagia) mediano questo processo straordinario Recenti studi
hanno dimostrato che componenti centrali della formazione di autosomi
nei topi hanno attivitagrave nei tessuti dei mammiferi Per esempio carenza
di atg5 ha portato alla morte di animali appena nati a causa
dellrsquoincapacitagrave di fornire un apporto di aminoacidi attraverso la
degradazione di proteine del corpo durante la condizione di fame
relativa allrsquoimmediato periodo post-natale Sorprendentemente in un
altro studio in cui egrave stata indotta una carenza di atg7 piugrave avanti nella
vita con un gene ldquofloxedrdquo lrsquoaccumulo di aggregati positivi
allrsquoubiquitina egrave stata osservata nel fegato degli animali che sono stati
disabilitati nella produzione di autofagosomi La funzione del
proteasoma in questi animali egrave rimasta inalterata contenente specie mal
ripiegate etichettate con ubiquitina e possono essere eliminate attraverso
autofagia Egrave stato poi scoperto un componente denominato p62 (o
sequestosoma1) che costituisce un guscio attorno agli aggregati di
huntingtina [31] Questa proteina contiene un dominio C-terminale
associato allrsquoubiquitina (UBA) che puograve legare poliubiquitine in modo
tale che p62 si collochi con lrsquoubiquitina quando espressa in cellule
HeLa Inoltre nelle cellule che esprimono huntigtina p62 si associa con
LC3 una proteina localizzata negli autofagosomi In accordo con quanto
riportato e cioegrave che lrsquoautofagia riduce i livelli di aggregati di
huntingtina e con un ruolo critico di p62 in questo processo lrsquoinibizione
25
antisenso mediata dallrsquoesperessione di p62 aumenta lrsquoapoptosi delle
cellule che esprimono huntungtina Quindi sembra che la modifica
dellrsquoubiquitina delle proteine difettose possa offrire un ingresso sia al
sistema proteasoma o in contesti dove lrsquoaggregazione egrave in corso al
sistema autofagia
SISTEMI CHAPERONI HSP70
Le Hsp70 proteine dello shock termico di 70 KDa sono impegnate in
una serie di processi tra cui il ripiegamento di proteine di nuova sintesi
il trasporto delle proteine attraverso membrane il ripiegamento di
proteine mal ripiegate ed aggregate e il controllo delle attivitagrave delle
proteine regolatrici Questa versatilitagrave egrave ottenuta attraverso
lampliamento e la diversificazione evolutiva di geni hsp70 che ha
generato sia chaperoni Hsp70 specifici Hsp110 e proteine Hsp170 La
versatilitagrave egrave determinata attraverso lrsquoimpiego di cochaperoni proteine J
e fattori di scambio di nucleotide (NEF) che regolano lrsquoattivitagrave di Hsp70
(Figura 4)
26
Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame
del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una
Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)
Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la
proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato
allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del
substrato
Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre
specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb
Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di
legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un
numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame
dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi
Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina
Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni
Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali
di Hsp70 con se stesso
27
INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70
Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di
proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura
xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding
appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide
N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD
adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio
elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con
lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante
chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco
tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini
di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di
comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura
di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione
La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la
tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo
coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture
precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una
proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da
una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β
ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica
compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio
elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di
legame del substrato (Figura 5)
28
Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo
substrato
La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra
domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che
collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo
solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi
residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame
allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A
dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso
Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un
legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in
nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano
completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve
entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo
fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui
coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del
segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti
integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A
29
capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il
quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di
ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a
idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di
DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro
catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente
arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia
drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete
crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la
barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK
costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina
superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura
della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera
attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della
prolina
DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-
NUCLEOTIDE
Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi
meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono
fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la
liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del
substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la
dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine
BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave
dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con
30
funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S
cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1
(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la
disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e
HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70
fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi
della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente
indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene
GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg
di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei
nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte
posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i
nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario
BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in
modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del
complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si
compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo
Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva
[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con
conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve
indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca
di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di
convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la
reazione di scambio nucleotidica di Hsp70
31
LEGAMI Hsp70-Hsp70
Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro
della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In
particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce
come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola
lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di
questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento
Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il
cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che
sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi
eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente
lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se
non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di
complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di
nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di
scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione
importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto
di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel
folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle
Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza
proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa
con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere
coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di
traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina
Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come
sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le
interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di
32
Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi
SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua
attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano
legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di
idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede
possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano
lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina
stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che
Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami
con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina
J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di
stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega
bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o
Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non
limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che
la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-
associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con
Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito
meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande
aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante
per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70
AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP
Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli
AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione
disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]
33
Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un
anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del
proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico
20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA
svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP
Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104
nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico
per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste
attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come
una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-
etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE
per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla
fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il
meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere
tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria
per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli
anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una
parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali
suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata
assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando
una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a
spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad
entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel
caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro
che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti
dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una
proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In
parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno
34
individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi
domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre
interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta
apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati
che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la
questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)
Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97
Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da
proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad
entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro
efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non
devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati
dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte
lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono
piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte
superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine
adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il
35
movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori
p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su
proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di
proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la
retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e
reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo
anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite
adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente
il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente
forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei
canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]
LrsquoAZIONE DELLrsquoATP
La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico
al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco
affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad
esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello
Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che
ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo
di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli
wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli
mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori
dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di
ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di
un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di
quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda
36
subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino
al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave
significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o
sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti
differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra
essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che
attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave
adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non
vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a
cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di
subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico
Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un
substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di
queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un
meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da
F1-ATPasi non sembra escluso
HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE
NEURODEGENERATIVE
RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE
Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel
mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una
pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi
associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione
37
di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di
Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta
promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]
Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90
nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave
funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi
permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]
HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico
Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono
mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)
accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock
citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata
da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante
di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo
stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si
lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei
geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-
shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via
multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di
transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-
translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90
[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e
mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo
shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con
Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)
38
attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da
shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni
Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che
i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro
sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock
termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su
attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato
che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi
di insulti
Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90
e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con
shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La
somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a
topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello
39
Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge
contro aggregati tossici
Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un
aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave
egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di
chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione
incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste
molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente
diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su
espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative
Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie
neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a
mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei
neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia
muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-
pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma
mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme
nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che
Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in
oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza
attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili
[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di
Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt
mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore
di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo
suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro
effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi
40
indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando
monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono
probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono
essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di
atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70
permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]
Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare
spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo
nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un
miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina
[62]
Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il
riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso
lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido
dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli
di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i
motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione
acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni
Riluzolo
Arimoclomol
41
Nei vari modelli cellulari della malattia di Alzheimer (AD) vi egrave un
incremento dei livelli di Hsp70 promossa dalla solubilitagrave e dal legame ai
microtubuli delle proteine tau [63] Hsp70 ha anche inibito la
propensione di aggregazione di Aβ [64] e ridotto la tossicitagrave di Aβ su
culture neuronali [65] Inoltre la proteina precursore dellrsquoamiloide
(APP) eo il suo Aβ amiloide derivato sono bersagli di chaperoni
mediati da clearence [66-67] Nella Drosophila melanogaster e nei
modelli di lievito della malattia di Parkinson (PD) lrsquoespressione diretta
di Hsp70 o la modulazione farmacologica di Hsp ha impedito la perdita
di neuroni causata da alfa-sinucleina [68-69] Huang et al hanno
riportato che questi effetti di Hsp70 si manifestano con lrsquoinibizione della
formazione di fibrille di alfa-sinucleina prevenendo la formazione di
alfa-sinucleina prefibrillare [70] Usando delezioni mutanti di alfa-
sinucleina Luk et al hanno indicato che le interazioni tra il dominio
legante il substrato Hsp70 e la regione del core idrofobico dellrsquoalfa-
sinucleina mediano lrsquoinibizione dellrsquoassemblaggio e che questo
processo di assemblaggio egrave inibito prima della fase di allungamento
[71] Nel complesso in diversi modelli di malattia neurodegenerativa la
sovra espressione di Hsp70 ha migliorato la gravitagrave della malattia di
fenotipi diversi senza incidere visibilmente sulla formazione di
aggregati suggerendo che i chaperoni non impediscono lrsquoaggregazione
di per seacute bensigrave reindirizzano gli aggregati preferibilmente in depositi
amorfi quindi sequestrando specie potenzialmente tossiche dalla
maggior parte della soluzione
42
Lrsquoespressione di Hsp70 e di altre Hsp egrave indotta dallrsquoinibizione
farmacologica di Hsp90
Come riportato sopra lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal
complesso con Hsp90 con susseguente produzione di Hsp (Figura 7) e
lrsquoinduzione di Hsp70 da parte di inibitori di Hsp90 egrave ben documentata
nei modelli di malattie neurodegenerative La geldanamicina (GM) un
inibitore di Hsp90 induce un aumento dose dipendente di Hsp70 nei
modelli di cellule di AD (Alzhaimer) cosigrave come nei neuroni della
corteccia primaria del ratto e riduce la quantitagrave di tau insolubili e dei
livelli basali di acido okadaico indotto da tau fosforilazione [63] Il
trattamento di neuroni primari corticali con lrsquoinibitore di Hsp90 con
struttura purinica il PU24FCI ha portato ad un aumento di Hsp70 dose-
dipendente [72]
PU24FCI
KU32
43
Allo stesso modo la somministrazione di due derivati di PU24FCI
CNS-permeabili il PU-DZ8 [72] ed il EC102 [73] a topi tau transgenici
(htau e JNPL3) ha determinato induzione di Hsp70 nel cervello e
mantenuto gli effetti per 24 ore dopo la somministrazione KU32 un
inibitore di Hsp90 di diversa natura chimica ha indotto Hsp70 in culture
SH-SY5Y di neuroblastoma e la ha protetta da tossicitagrave indotta da Aβ
GM ha attivato una risposta da shock termico ed inibito lrsquoaggregazione
di htt in un modello di coltura cellulare di HD ed ha indotto Hsp70 in
maniera tempo e concentrazione-dipendente ed ha impedito
lrsquoaggregazione di alfa-sinucleina e protetto contro la tossicitagrave in un
modello di aggregazione cellulare di alfa-sinucleina Auluck et al hanno
segnalato che il trattamento di un modello volante di PD con GM ha
protetto completamente contro tossicitagrave per alfa-sinucleina [74] GM ha
protetto anche contro la neurotossicitagrave dopaminergica indotta da 1-metil-
4-fenil-1236-tetraidropiridina (MPTP) in un modello di topo di PD Il
pretrattamento con GM mediante iniezione ventricolare intracerebrale
prima del trattamento con MPTP ha indotto le Hsp70 ed incrementato il
contenuto residuale di dopamina e lrsquoimmuno reattivitagrave della tirosina
idrolasi nel corpo striato [75] Lrsquoinduzione di Hsp70 nel midollo spinale
egrave stata osservata in seguito ad iniezione intraperitoneale di un derivato
della GM il 17-AAG in un modello di SBMA topo [76] Il 17-AAG egrave
stato anche efficace contro la nuerodegenerazione in altre malattie
poliQ Vale a dire ha soppresso la degenerazione dellrsquoocchio e la
formazione di inclusioni del corpo e salvato dalla letalitagrave in un modello
di SCA di Drosophila Ha inoltre soppresso la neurodegenerazione in un
modello volante di HD La riduzione di HSF-1 ha abolito lrsquoinduzione di
chaperoni molecolari e gli effeti terapeutici di 17-AAG sulla
neurodegenerazione poliQ indotta nei modelli di Drosophila facendo
44
arguire che lrsquoeffetto terapeutico di 17-AAG egrave essenzialmente mediato da
HSF-1 [77] Riassumendo lrsquoattivazione di HSF-1 da inibitori di Hsp90
egrave stata notata specificamente in modelli in vivo ed in vitro di malattie
neurodegenerative suggerendo che lrsquoinibizione di Hsp90 puograve essere un
mezzo per modulare i livelli di Hsp in cervelli malati con lrsquoobbiettivo di
proteggere contro le proteine tossiche che si presentano nel corso del
processo neurodegenerativo
Lrsquoinibizione di Hsp90 riduce lrsquoattivitagrave e lrsquoespressione di proteine
neuronali aberranti
In aggiunta alla regolazione di HSF-1 evidenze recenti suggeriscono un
ruolo addizionale per Hsp90 nel mantenimento della stabilitagrave funzionale
della capacitagrave aberrante di proteine neuronali (Figura 8A)
La SBMA egrave una malattia ereditaria dei motoneuroni causata
dallrsquoaccrescimento di un tratto di poliglutamina allrsquointerno del recettore
androgeno (AR) [57]
Le caratteristiche patologiche di SBMA sono perdita dei motoneuroni
nel midollo spinale e nel tronco cerebrale diffusione dellrsquoaccumulo
nucleare inclusioni nucleari di mutanti AR (mAR) nei motoneuroni
residui e in alcuni organi viscerali Waza et al hanno dimostrato che
mAR presente in SBMA egrave una delle proteine regolate da Hsp90 (Figura
8A) [76]
45
Figura 8 Le Hsp90 riparano le proteine neuronali aberranti (A) Proteine neuronali
aberranti regolate da Hsp90 (B) Lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90porta allrsquoinattivazione
o degradazione delle proteine regulate da Hsp90 probabilmente attraverso la via del
proteasoma
Le Hsp90 formano un complesso molecolare con mAR per il
mantenimento della sua stabilitagrave funzionale Sia in modelli cellulari di
SBMA che in topi transgenici lrsquoinibizione di Hsp90 da parte di 17-
AAG il derivato 17 allilammino-17-demetossi della geldanamicina ha
46
portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal
macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati
disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da
destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione
dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di
SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave
rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati
[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori
hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo
sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa
(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni
Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]
Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo
egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali
sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al
hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina
(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi
familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un
complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data
da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto
47
lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della
stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave
dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita
neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei
neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che
codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a
PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson
familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson
suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente
associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che
Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate
con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente
diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina
egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille
ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno
recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di
alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che
sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina
[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce
lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari
Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-
dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento
tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-
sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da
chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di
mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il
macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD
associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-
48
sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative
caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave
caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di
tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD
lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da
unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina
chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta
(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si
era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero
netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un
gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e
Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave
causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma
17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau
[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine
neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso
portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina
mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da
Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei
modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave
patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-
dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla
settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad
una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di
tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno
dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una
diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di
AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le
49
relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la
degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90
[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al
(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave
stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da
GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β
effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi
GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di
Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe
portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in
strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati
indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone
biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione
di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da
parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi
proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di
queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)
Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie
neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio
approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare
dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la
formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione
potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di
Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare
terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare
malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo
centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90
puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione
50
successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti
neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti
clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto
che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono
tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in
modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni
nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati
promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio
spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in
modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di
Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a
lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse
da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase
esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora
rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori
dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per
mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie
neurodegenerative
51
SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-
ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-
METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE
(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE
MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO
SULLA FRAMMENTAZIONE
Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in
risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta
nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine
regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il
ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai
loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine
client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro
cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire
su molti percorsi oncogenici
Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il
nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che
lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati
composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP
attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del
processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono
emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i
tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule
normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina
(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una
maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto
che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una
piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
18
Figura 3 Un modello ipotetico descrive lrsquoattivazione di Ire1 attraverso la oligomerizzazione
determinata dal legame di proteine unfolded (indicate in rosso) Le interazioni dirette o
indirette fra le catene delle proteine unfolded possono contribuire allrsquoattivazione Sul lato
luminale della membrana del RE le proteine unfolded si legano alla scanalatura (indicata in
grigio) formata dalla dimerizzazione del core del dominio luminale di Ire1 attraverso
linterfaccia 1 Sul lato citoplasmaticodella membrana del RE la oligmerizzazione accosta i
domini della chinasi Ire 1 che subiscono un cambiamento conformazionale in seguito ad
autofosforilazione che porta allrsquoattivazione della funzione di RNA-ribonucleasi di Ire1
Attraverso il riconoscimento diretto delle forme mal ripiegate
lrsquoinduzione di IRE1 potrebbe verificarsi prima della completa titolazione
di BiP che data lrsquoestrema abbondanza di questrsquoultimo nel RE potrebbe
verificarsi solo dopo un catastrofico accumulo di proteine mal ripiegate
Inoltre il riconoscimento diretto di forme mal ripiegate da parte di IRE1
(e PERK) potrebbe consentire una serie di risposte piugrave sfumate in cui
diverse forme mal ripiegate potrebbero essere preferenzialmente
riconosciute da sensori diversi quali BiP IRE1 o PERK Cosigrave in linea
di principio la natura (per esempio traslazionale contro transcrizionale)
ed il ciclo di UPR potrebbe essere su misura per la classe specifica di
forme mal ripiegate che sono prevalenti nel RE [20]
19
DEGRADAZIONE DELLE PROTEINE ASSOCIATA AL
RETICOLO ENDOPLASMATICO
Come ci si poteva aspettare dalla diversitagrave delle proteine che si
ripiegano NEL RE studi recenti hanno dimostrato che la degradazione
ER-associata (ER-Associated Degradation ERAD) comprende una
serie di sistemi diversi ciascuno responsabile della degradazione di
sottoinsiemi di proteine che condividono proprietagrave fisiche comuni
Esistono anche regioni dedicate allrsquo ER Associated Degradation
(ERAD) nelle quali proteine che non raggiungono il corretto
ripiegamento vengono retrotraslocate al citosol e quindi degradate dal
proteasoma [21]
Ciograve forse egrave piugrave chiaramente dimostrato nel lievito dove ci sono almeno
due distinti meccanismi di sorveglianza per identificare le proteine mal
ripiegate del RE Il primo meccanismo chiamato ERAD-L analizza le
proteine che contengono domini luminali mal ripiegati (solubili o trans
membrana) chiamati CPY una forma mutante della proteina CPY
endogena che egrave incapace di folding Il secondo denominato ERAD-C
rileva domini mal ripiegati citosolici di proteine trans membrana [22]
Sebbene entrambe queste vie in ultima analisi convergano sul sistema
di degradazione ubiquitina-proteosoma esse dipendono da diversi
insiemi di componenti RE-associati per rivelare e fornire specie mal
ripiegate al citosol Nel caso di ERAD-C (e non di ERAD-L) la
degradazione egrave in genere dipendente da uno specifico sottoinsieme di
chaperoni citosolici inclusi i membri Hsp40 e Hsp70 Ciograve suggerisce
che queste proteine possono essere direttamente responsabili per il
riconoscimento di domini citosolici mal ripiegati di proteine trans
membrana Tuttavia le caratteristiche esatte che vengono monitorate e
20
come i substrati vengano consegnati al macchinario di
retrotranslocazione restano importanti questioni aperte per la maggior
parte dei substrati Il riconoscimento di una proteina contenente un
dominio luminale mal ripiegato dipende in modo determinante dallo
stato di glicosilazione della proteina Infatti anche piccole modifiche di
glicani N-linked puograve provocare danni gravi nella degradazione di
numerosi substrati Questo puograve effettivamente lasciare le proteine in un
limbo impossibile raggiungere lo stato nativo ma non riconosciuto dal
macchinario ERAD esse restano mal ripiegate nel RE a tempo
indeterminato A prima vista questa dipendenza dalla glicosilazione
sembra essere un miglioramento non necessario Tuttavia egrave ormai chiaro
che lo spettro di porzioni di zucchero presenti in una proteina egrave un
segnale fondamentale nel marcare il suo status di ripiegamento Infatti
dato che diverse proteine altamente abbondanti nel RE tra cui BiP e
PDI spesso non sono glicosilate la presenza e la natura covalente di
molto mannosio in un polipeptide puograve fornire un segnale importante che
aiuta il macchinario di controllo-qualitagrave del RE a distinguere le specie
ripiegate destinate ad altri scomparti da quelle piugrave abbondanti e
permanenti del RE Lrsquointuizione nel ruolo della glicosilazione nella
discriminazione tra le specie in via di ripiegamento e le proteine
terminali mal ripiegate nel RE egrave venuta dalla constatazione che
glicoproteine mal ripiegate subiscono un taglio dei loro N-glicani da una
varietagrave di glicosidasi tra cui una mannossidasi specifica In aggiunta a
proteine mal ripiegate persistenti si egrave pensato che il rimodellamento
dipendente dal tempo di N-glicani porti ad un segnale per la
degradazione del macchinario ERAD Questo permette intermedi
ripiegati in un periodo di tempo prima del rimodellamento dei loro N-
glicani in cui il polipeptide egrave immune dalla sorveglianza ERAD Egrave
21
interessante notare che un recente studio suggerisce che anche per i
polipeptidi citosolici vi egrave un periodo durante e subito dopo la sintesi in
cui le specie mal ripiegate sono immuni alla degradazione del
proteasoma [23] Recenti studi hanno identificato due differenti lettine
localizzate nel RE che svolgono un ruolo critico nellrsquoERAD La prima egrave
correlata alla proteina mannossidasi responsabile del taglio di N-glicani
nel RE ma sembra aver perso la sua attivitagrave catalitica Nel lievito si
chiama Htm1pMnl1p e nei mammiferi egrave chiamato EDEM Studi
condotti su cellule di mammifero suggeriscono che EDEM aiuta le
glicoproteine mal ripiegate a lasciare il ciclo calnexinacalreticulina del
chaperone lectina dove stanno cercando di ripiegarsi e cosigrave entrare nel
ciclo di degradazione [24 ab] Tuttavia nel lievito Htm1p egrave richiesto
per la degradazione efficiente di substrati come CPY che non
dipendono da calnexina Quindi sembra probabile che Htm1pEDEM
ricopra altri ruoli in ERAD La seconda lectina Yos9p forma un
complesso stabile con proteine mal ripiegate e la perdita di questa
lectina conduce ad un profondo e specifico difetto nella degradazione di
glicoproteine mal ripiegate [25] Sorprendentemente mentre mutazioni
puntiformi nella tasca di Yos9p legante il mannosio eliminano la sua
capacitagrave di supportare ERAD i mutanti stessi di Yos9p mostrano una
maggior interazione con i substrati Ciograve indica la possibilitagrave che la
lectina Yos9p svolga un ruolo piugrave informativo interrogando lo stato
dello zucchero di forme mal ripiegate per determinare se debbano essere
passate al macchinario di retrotranslocazione Tuttavia come con
ERAD-C sebbene ci siano stati grandi progressi nella caratterizzazione
del macchinario di retrotranslocazione [26] le caratteristiche strutturali
delle proteine mal ripiegate sono in fase di monitoraggio e sono ancora
22
limitate le conoscenzedi come le forme mal ripiegate sono passate a
questo macchinario
CLEARENCE DI AGGREGATI ATTRAVERSO
LrsquoAUTOFAGIA
Egrave sempre piugrave evidente che ci sono una varietagrave di condizioni in vivo che
anche con chaperoni e macchinari proteolitici presenti nello stesso
compartimento come proteine mal ripiegate questi meccanismi di
controllo-qualitagrave falliscono e le proteine mal ripiegate avanzano
formando aggregati Inoltre tali aggregati intracellulari sono associati
con una serie di malattie neurodegenerative come il morbo di
Huntington e di Parkinson La natura e la sorte di aggregati di proteine
nelle cellule eucariotiche egrave stata poco compresa Recentemente egrave stata
sempre piugrave sostenuta unrsquoazione protettiva della formazione di aggregati
piuttosto che unrsquoimmediata azione patogena Per esempio nel caso del
morbo di Huntington lrsquoesame di cellule neuronali in coltura
sovrapproducenti una fusione di poliglutamina espansa e huntingtina-
GFP rivelano che queste cellule contenenti aggregati fluorescenti
morfologicamente visibili esibiscono una migliore viabilitagrave rispetto a
quelle aventi per via diffusionale materiale fluorescente [27] Questo
sembra in accordo con il concetto che si tratta di piccoli assemblati di
proteine mal ripiegate inclusioni non morfologicamente visibili che
esercitano effetti tossici sulle cellule Analogamente un recente
confronto delle dimensioni rispetto a tossicitagrave per gli aggregati di
proteina prionica PrP suggerisce che piccoli aggregati contenenti da una
a due dozzine di molecole sono risultati i piugrave tossici per le cellule [28]
23
Ma le cellule dispongono di meccanismi di compensazione per questi
piccoli aggregati Studi recenti hanno suggerito che la via ubiquitina-
proteosoma possa essere il pilastro della rimozione di specie inclini
allrsquoaggregazione Infatti gli aggregati rilevati nel contesto di
neurodegenerazione di solito sono reattivi con gli anticorpi anti-
ubiquitina il che implica che le specie mal ripiegate sono state
riconosciute dal sistema di coniugazione dellubiquitina Eppure vari
studi di questi ultimi anni indicano che queste proteine modificate
rappresentano una sfida particolare per proteasomi che possono portare
alla loro inibizione [29 ab] Il meccanismo di questa inattivazione
rimane sconosciuto ma puograve coinvolgere il soffocamento della camera
del proteasoma [30]
Anatomia del proteasoma Il proteasoma egrave una macromolecola proteica del peso di circa 2 milioni
di Daltons Ersquo formata da ununitagrave base centrale (core) e 2 cappucci agli estremi (cap) Il core egrave
formato a sua volta da 4 anelli ciascuno costituito da 7 unitagrave proteiche I due ldquocaprdquo attaccati alle
due estremitagrave del core cilindrico consistono ciascuno di 20 subunitagrave
24
Ora sembra che la modifica dellrsquoubiquitina possa reclutare specie
aggregate mediante una via indipendente lrsquoAUTOFAGIA Lrsquoautofagia
implica il riconoscimento e lrsquoimpacchettamentofagocitazione di
proteine specifiche o organelli in vescicole autofagosomiche che si
fondono con i lisosomi in cui sia le vescicole che il loro contenuto sono
scomposti Piugrave di 20 componenti cosiddetti Atg (geni coinvolti
nellrsquoautofagia) mediano questo processo straordinario Recenti studi
hanno dimostrato che componenti centrali della formazione di autosomi
nei topi hanno attivitagrave nei tessuti dei mammiferi Per esempio carenza
di atg5 ha portato alla morte di animali appena nati a causa
dellrsquoincapacitagrave di fornire un apporto di aminoacidi attraverso la
degradazione di proteine del corpo durante la condizione di fame
relativa allrsquoimmediato periodo post-natale Sorprendentemente in un
altro studio in cui egrave stata indotta una carenza di atg7 piugrave avanti nella
vita con un gene ldquofloxedrdquo lrsquoaccumulo di aggregati positivi
allrsquoubiquitina egrave stata osservata nel fegato degli animali che sono stati
disabilitati nella produzione di autofagosomi La funzione del
proteasoma in questi animali egrave rimasta inalterata contenente specie mal
ripiegate etichettate con ubiquitina e possono essere eliminate attraverso
autofagia Egrave stato poi scoperto un componente denominato p62 (o
sequestosoma1) che costituisce un guscio attorno agli aggregati di
huntingtina [31] Questa proteina contiene un dominio C-terminale
associato allrsquoubiquitina (UBA) che puograve legare poliubiquitine in modo
tale che p62 si collochi con lrsquoubiquitina quando espressa in cellule
HeLa Inoltre nelle cellule che esprimono huntigtina p62 si associa con
LC3 una proteina localizzata negli autofagosomi In accordo con quanto
riportato e cioegrave che lrsquoautofagia riduce i livelli di aggregati di
huntingtina e con un ruolo critico di p62 in questo processo lrsquoinibizione
25
antisenso mediata dallrsquoesperessione di p62 aumenta lrsquoapoptosi delle
cellule che esprimono huntungtina Quindi sembra che la modifica
dellrsquoubiquitina delle proteine difettose possa offrire un ingresso sia al
sistema proteasoma o in contesti dove lrsquoaggregazione egrave in corso al
sistema autofagia
SISTEMI CHAPERONI HSP70
Le Hsp70 proteine dello shock termico di 70 KDa sono impegnate in
una serie di processi tra cui il ripiegamento di proteine di nuova sintesi
il trasporto delle proteine attraverso membrane il ripiegamento di
proteine mal ripiegate ed aggregate e il controllo delle attivitagrave delle
proteine regolatrici Questa versatilitagrave egrave ottenuta attraverso
lampliamento e la diversificazione evolutiva di geni hsp70 che ha
generato sia chaperoni Hsp70 specifici Hsp110 e proteine Hsp170 La
versatilitagrave egrave determinata attraverso lrsquoimpiego di cochaperoni proteine J
e fattori di scambio di nucleotide (NEF) che regolano lrsquoattivitagrave di Hsp70
(Figura 4)
26
Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame
del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una
Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)
Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la
proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato
allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del
substrato
Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre
specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb
Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di
legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un
numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame
dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi
Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina
Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni
Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali
di Hsp70 con se stesso
27
INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70
Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di
proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura
xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding
appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide
N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD
adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio
elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con
lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante
chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco
tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini
di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di
comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura
di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione
La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la
tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo
coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture
precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una
proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da
una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β
ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica
compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio
elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di
legame del substrato (Figura 5)
28
Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo
substrato
La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra
domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che
collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo
solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi
residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame
allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A
dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso
Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un
legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in
nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano
completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve
entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo
fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui
coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del
segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti
integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A
29
capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il
quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di
ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a
idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di
DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro
catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente
arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia
drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete
crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la
barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK
costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina
superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura
della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera
attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della
prolina
DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-
NUCLEOTIDE
Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi
meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono
fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la
liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del
substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la
dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine
BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave
dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con
30
funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S
cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1
(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la
disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e
HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70
fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi
della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente
indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene
GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg
di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei
nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte
posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i
nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario
BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in
modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del
complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si
compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo
Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva
[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con
conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve
indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca
di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di
convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la
reazione di scambio nucleotidica di Hsp70
31
LEGAMI Hsp70-Hsp70
Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro
della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In
particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce
come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola
lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di
questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento
Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il
cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che
sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi
eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente
lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se
non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di
complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di
nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di
scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione
importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto
di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel
folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle
Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza
proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa
con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere
coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di
traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina
Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come
sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le
interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di
32
Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi
SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua
attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano
legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di
idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede
possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano
lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina
stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che
Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami
con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina
J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di
stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega
bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o
Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non
limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che
la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-
associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con
Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito
meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande
aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante
per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70
AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP
Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli
AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione
disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]
33
Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un
anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del
proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico
20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA
svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP
Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104
nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico
per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste
attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come
una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-
etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE
per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla
fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il
meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere
tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria
per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli
anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una
parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali
suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata
assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando
una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a
spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad
entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel
caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro
che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti
dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una
proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In
parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno
34
individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi
domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre
interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta
apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati
che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la
questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)
Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97
Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da
proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad
entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro
efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non
devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati
dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte
lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono
piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte
superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine
adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il
35
movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori
p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su
proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di
proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la
retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e
reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo
anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite
adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente
il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente
forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei
canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]
LrsquoAZIONE DELLrsquoATP
La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico
al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco
affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad
esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello
Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che
ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo
di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli
wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli
mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori
dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di
ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di
un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di
quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda
36
subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino
al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave
significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o
sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti
differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra
essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che
attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave
adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non
vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a
cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di
subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico
Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un
substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di
queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un
meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da
F1-ATPasi non sembra escluso
HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE
NEURODEGENERATIVE
RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE
Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel
mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una
pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi
associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione
37
di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di
Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta
promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]
Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90
nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave
funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi
permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]
HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico
Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono
mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)
accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock
citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata
da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante
di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo
stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si
lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei
geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-
shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via
multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di
transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-
translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90
[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e
mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo
shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con
Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)
38
attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da
shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni
Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che
i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro
sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock
termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su
attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato
che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi
di insulti
Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90
e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con
shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La
somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a
topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello
39
Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge
contro aggregati tossici
Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un
aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave
egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di
chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione
incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste
molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente
diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su
espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative
Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie
neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a
mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei
neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia
muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-
pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma
mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme
nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che
Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in
oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza
attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili
[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di
Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt
mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore
di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo
suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro
effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi
40
indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando
monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono
probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono
essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di
atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70
permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]
Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare
spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo
nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un
miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina
[62]
Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il
riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso
lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido
dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli
di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i
motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione
acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni
Riluzolo
Arimoclomol
41
Nei vari modelli cellulari della malattia di Alzheimer (AD) vi egrave un
incremento dei livelli di Hsp70 promossa dalla solubilitagrave e dal legame ai
microtubuli delle proteine tau [63] Hsp70 ha anche inibito la
propensione di aggregazione di Aβ [64] e ridotto la tossicitagrave di Aβ su
culture neuronali [65] Inoltre la proteina precursore dellrsquoamiloide
(APP) eo il suo Aβ amiloide derivato sono bersagli di chaperoni
mediati da clearence [66-67] Nella Drosophila melanogaster e nei
modelli di lievito della malattia di Parkinson (PD) lrsquoespressione diretta
di Hsp70 o la modulazione farmacologica di Hsp ha impedito la perdita
di neuroni causata da alfa-sinucleina [68-69] Huang et al hanno
riportato che questi effetti di Hsp70 si manifestano con lrsquoinibizione della
formazione di fibrille di alfa-sinucleina prevenendo la formazione di
alfa-sinucleina prefibrillare [70] Usando delezioni mutanti di alfa-
sinucleina Luk et al hanno indicato che le interazioni tra il dominio
legante il substrato Hsp70 e la regione del core idrofobico dellrsquoalfa-
sinucleina mediano lrsquoinibizione dellrsquoassemblaggio e che questo
processo di assemblaggio egrave inibito prima della fase di allungamento
[71] Nel complesso in diversi modelli di malattia neurodegenerativa la
sovra espressione di Hsp70 ha migliorato la gravitagrave della malattia di
fenotipi diversi senza incidere visibilmente sulla formazione di
aggregati suggerendo che i chaperoni non impediscono lrsquoaggregazione
di per seacute bensigrave reindirizzano gli aggregati preferibilmente in depositi
amorfi quindi sequestrando specie potenzialmente tossiche dalla
maggior parte della soluzione
42
Lrsquoespressione di Hsp70 e di altre Hsp egrave indotta dallrsquoinibizione
farmacologica di Hsp90
Come riportato sopra lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal
complesso con Hsp90 con susseguente produzione di Hsp (Figura 7) e
lrsquoinduzione di Hsp70 da parte di inibitori di Hsp90 egrave ben documentata
nei modelli di malattie neurodegenerative La geldanamicina (GM) un
inibitore di Hsp90 induce un aumento dose dipendente di Hsp70 nei
modelli di cellule di AD (Alzhaimer) cosigrave come nei neuroni della
corteccia primaria del ratto e riduce la quantitagrave di tau insolubili e dei
livelli basali di acido okadaico indotto da tau fosforilazione [63] Il
trattamento di neuroni primari corticali con lrsquoinibitore di Hsp90 con
struttura purinica il PU24FCI ha portato ad un aumento di Hsp70 dose-
dipendente [72]
PU24FCI
KU32
43
Allo stesso modo la somministrazione di due derivati di PU24FCI
CNS-permeabili il PU-DZ8 [72] ed il EC102 [73] a topi tau transgenici
(htau e JNPL3) ha determinato induzione di Hsp70 nel cervello e
mantenuto gli effetti per 24 ore dopo la somministrazione KU32 un
inibitore di Hsp90 di diversa natura chimica ha indotto Hsp70 in culture
SH-SY5Y di neuroblastoma e la ha protetta da tossicitagrave indotta da Aβ
GM ha attivato una risposta da shock termico ed inibito lrsquoaggregazione
di htt in un modello di coltura cellulare di HD ed ha indotto Hsp70 in
maniera tempo e concentrazione-dipendente ed ha impedito
lrsquoaggregazione di alfa-sinucleina e protetto contro la tossicitagrave in un
modello di aggregazione cellulare di alfa-sinucleina Auluck et al hanno
segnalato che il trattamento di un modello volante di PD con GM ha
protetto completamente contro tossicitagrave per alfa-sinucleina [74] GM ha
protetto anche contro la neurotossicitagrave dopaminergica indotta da 1-metil-
4-fenil-1236-tetraidropiridina (MPTP) in un modello di topo di PD Il
pretrattamento con GM mediante iniezione ventricolare intracerebrale
prima del trattamento con MPTP ha indotto le Hsp70 ed incrementato il
contenuto residuale di dopamina e lrsquoimmuno reattivitagrave della tirosina
idrolasi nel corpo striato [75] Lrsquoinduzione di Hsp70 nel midollo spinale
egrave stata osservata in seguito ad iniezione intraperitoneale di un derivato
della GM il 17-AAG in un modello di SBMA topo [76] Il 17-AAG egrave
stato anche efficace contro la nuerodegenerazione in altre malattie
poliQ Vale a dire ha soppresso la degenerazione dellrsquoocchio e la
formazione di inclusioni del corpo e salvato dalla letalitagrave in un modello
di SCA di Drosophila Ha inoltre soppresso la neurodegenerazione in un
modello volante di HD La riduzione di HSF-1 ha abolito lrsquoinduzione di
chaperoni molecolari e gli effeti terapeutici di 17-AAG sulla
neurodegenerazione poliQ indotta nei modelli di Drosophila facendo
44
arguire che lrsquoeffetto terapeutico di 17-AAG egrave essenzialmente mediato da
HSF-1 [77] Riassumendo lrsquoattivazione di HSF-1 da inibitori di Hsp90
egrave stata notata specificamente in modelli in vivo ed in vitro di malattie
neurodegenerative suggerendo che lrsquoinibizione di Hsp90 puograve essere un
mezzo per modulare i livelli di Hsp in cervelli malati con lrsquoobbiettivo di
proteggere contro le proteine tossiche che si presentano nel corso del
processo neurodegenerativo
Lrsquoinibizione di Hsp90 riduce lrsquoattivitagrave e lrsquoespressione di proteine
neuronali aberranti
In aggiunta alla regolazione di HSF-1 evidenze recenti suggeriscono un
ruolo addizionale per Hsp90 nel mantenimento della stabilitagrave funzionale
della capacitagrave aberrante di proteine neuronali (Figura 8A)
La SBMA egrave una malattia ereditaria dei motoneuroni causata
dallrsquoaccrescimento di un tratto di poliglutamina allrsquointerno del recettore
androgeno (AR) [57]
Le caratteristiche patologiche di SBMA sono perdita dei motoneuroni
nel midollo spinale e nel tronco cerebrale diffusione dellrsquoaccumulo
nucleare inclusioni nucleari di mutanti AR (mAR) nei motoneuroni
residui e in alcuni organi viscerali Waza et al hanno dimostrato che
mAR presente in SBMA egrave una delle proteine regolate da Hsp90 (Figura
8A) [76]
45
Figura 8 Le Hsp90 riparano le proteine neuronali aberranti (A) Proteine neuronali
aberranti regolate da Hsp90 (B) Lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90porta allrsquoinattivazione
o degradazione delle proteine regulate da Hsp90 probabilmente attraverso la via del
proteasoma
Le Hsp90 formano un complesso molecolare con mAR per il
mantenimento della sua stabilitagrave funzionale Sia in modelli cellulari di
SBMA che in topi transgenici lrsquoinibizione di Hsp90 da parte di 17-
AAG il derivato 17 allilammino-17-demetossi della geldanamicina ha
46
portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal
macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati
disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da
destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione
dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di
SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave
rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati
[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori
hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo
sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa
(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni
Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]
Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo
egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali
sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al
hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina
(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi
familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un
complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data
da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto
47
lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della
stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave
dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita
neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei
neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che
codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a
PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson
familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson
suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente
associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che
Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate
con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente
diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina
egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille
ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno
recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di
alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che
sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina
[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce
lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari
Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-
dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento
tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-
sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da
chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di
mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il
macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD
associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-
48
sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative
caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave
caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di
tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD
lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da
unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina
chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta
(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si
era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero
netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un
gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e
Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave
causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma
17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau
[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine
neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso
portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina
mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da
Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei
modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave
patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-
dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla
settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad
una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di
tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno
dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una
diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di
AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le
49
relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la
degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90
[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al
(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave
stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da
GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β
effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi
GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di
Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe
portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in
strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati
indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone
biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione
di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da
parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi
proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di
queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)
Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie
neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio
approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare
dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la
formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione
potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di
Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare
terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare
malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo
centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90
puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione
50
successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti
neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti
clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto
che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono
tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in
modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni
nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati
promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio
spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in
modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di
Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a
lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse
da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase
esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora
rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori
dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per
mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie
neurodegenerative
51
SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-
ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-
METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE
(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE
MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO
SULLA FRAMMENTAZIONE
Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in
risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta
nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine
regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il
ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai
loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine
client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro
cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire
su molti percorsi oncogenici
Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il
nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che
lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati
composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP
attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del
processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono
emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i
tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule
normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina
(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una
maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto
che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una
piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
19
DEGRADAZIONE DELLE PROTEINE ASSOCIATA AL
RETICOLO ENDOPLASMATICO
Come ci si poteva aspettare dalla diversitagrave delle proteine che si
ripiegano NEL RE studi recenti hanno dimostrato che la degradazione
ER-associata (ER-Associated Degradation ERAD) comprende una
serie di sistemi diversi ciascuno responsabile della degradazione di
sottoinsiemi di proteine che condividono proprietagrave fisiche comuni
Esistono anche regioni dedicate allrsquo ER Associated Degradation
(ERAD) nelle quali proteine che non raggiungono il corretto
ripiegamento vengono retrotraslocate al citosol e quindi degradate dal
proteasoma [21]
Ciograve forse egrave piugrave chiaramente dimostrato nel lievito dove ci sono almeno
due distinti meccanismi di sorveglianza per identificare le proteine mal
ripiegate del RE Il primo meccanismo chiamato ERAD-L analizza le
proteine che contengono domini luminali mal ripiegati (solubili o trans
membrana) chiamati CPY una forma mutante della proteina CPY
endogena che egrave incapace di folding Il secondo denominato ERAD-C
rileva domini mal ripiegati citosolici di proteine trans membrana [22]
Sebbene entrambe queste vie in ultima analisi convergano sul sistema
di degradazione ubiquitina-proteosoma esse dipendono da diversi
insiemi di componenti RE-associati per rivelare e fornire specie mal
ripiegate al citosol Nel caso di ERAD-C (e non di ERAD-L) la
degradazione egrave in genere dipendente da uno specifico sottoinsieme di
chaperoni citosolici inclusi i membri Hsp40 e Hsp70 Ciograve suggerisce
che queste proteine possono essere direttamente responsabili per il
riconoscimento di domini citosolici mal ripiegati di proteine trans
membrana Tuttavia le caratteristiche esatte che vengono monitorate e
20
come i substrati vengano consegnati al macchinario di
retrotranslocazione restano importanti questioni aperte per la maggior
parte dei substrati Il riconoscimento di una proteina contenente un
dominio luminale mal ripiegato dipende in modo determinante dallo
stato di glicosilazione della proteina Infatti anche piccole modifiche di
glicani N-linked puograve provocare danni gravi nella degradazione di
numerosi substrati Questo puograve effettivamente lasciare le proteine in un
limbo impossibile raggiungere lo stato nativo ma non riconosciuto dal
macchinario ERAD esse restano mal ripiegate nel RE a tempo
indeterminato A prima vista questa dipendenza dalla glicosilazione
sembra essere un miglioramento non necessario Tuttavia egrave ormai chiaro
che lo spettro di porzioni di zucchero presenti in una proteina egrave un
segnale fondamentale nel marcare il suo status di ripiegamento Infatti
dato che diverse proteine altamente abbondanti nel RE tra cui BiP e
PDI spesso non sono glicosilate la presenza e la natura covalente di
molto mannosio in un polipeptide puograve fornire un segnale importante che
aiuta il macchinario di controllo-qualitagrave del RE a distinguere le specie
ripiegate destinate ad altri scomparti da quelle piugrave abbondanti e
permanenti del RE Lrsquointuizione nel ruolo della glicosilazione nella
discriminazione tra le specie in via di ripiegamento e le proteine
terminali mal ripiegate nel RE egrave venuta dalla constatazione che
glicoproteine mal ripiegate subiscono un taglio dei loro N-glicani da una
varietagrave di glicosidasi tra cui una mannossidasi specifica In aggiunta a
proteine mal ripiegate persistenti si egrave pensato che il rimodellamento
dipendente dal tempo di N-glicani porti ad un segnale per la
degradazione del macchinario ERAD Questo permette intermedi
ripiegati in un periodo di tempo prima del rimodellamento dei loro N-
glicani in cui il polipeptide egrave immune dalla sorveglianza ERAD Egrave
21
interessante notare che un recente studio suggerisce che anche per i
polipeptidi citosolici vi egrave un periodo durante e subito dopo la sintesi in
cui le specie mal ripiegate sono immuni alla degradazione del
proteasoma [23] Recenti studi hanno identificato due differenti lettine
localizzate nel RE che svolgono un ruolo critico nellrsquoERAD La prima egrave
correlata alla proteina mannossidasi responsabile del taglio di N-glicani
nel RE ma sembra aver perso la sua attivitagrave catalitica Nel lievito si
chiama Htm1pMnl1p e nei mammiferi egrave chiamato EDEM Studi
condotti su cellule di mammifero suggeriscono che EDEM aiuta le
glicoproteine mal ripiegate a lasciare il ciclo calnexinacalreticulina del
chaperone lectina dove stanno cercando di ripiegarsi e cosigrave entrare nel
ciclo di degradazione [24 ab] Tuttavia nel lievito Htm1p egrave richiesto
per la degradazione efficiente di substrati come CPY che non
dipendono da calnexina Quindi sembra probabile che Htm1pEDEM
ricopra altri ruoli in ERAD La seconda lectina Yos9p forma un
complesso stabile con proteine mal ripiegate e la perdita di questa
lectina conduce ad un profondo e specifico difetto nella degradazione di
glicoproteine mal ripiegate [25] Sorprendentemente mentre mutazioni
puntiformi nella tasca di Yos9p legante il mannosio eliminano la sua
capacitagrave di supportare ERAD i mutanti stessi di Yos9p mostrano una
maggior interazione con i substrati Ciograve indica la possibilitagrave che la
lectina Yos9p svolga un ruolo piugrave informativo interrogando lo stato
dello zucchero di forme mal ripiegate per determinare se debbano essere
passate al macchinario di retrotranslocazione Tuttavia come con
ERAD-C sebbene ci siano stati grandi progressi nella caratterizzazione
del macchinario di retrotranslocazione [26] le caratteristiche strutturali
delle proteine mal ripiegate sono in fase di monitoraggio e sono ancora
22
limitate le conoscenzedi come le forme mal ripiegate sono passate a
questo macchinario
CLEARENCE DI AGGREGATI ATTRAVERSO
LrsquoAUTOFAGIA
Egrave sempre piugrave evidente che ci sono una varietagrave di condizioni in vivo che
anche con chaperoni e macchinari proteolitici presenti nello stesso
compartimento come proteine mal ripiegate questi meccanismi di
controllo-qualitagrave falliscono e le proteine mal ripiegate avanzano
formando aggregati Inoltre tali aggregati intracellulari sono associati
con una serie di malattie neurodegenerative come il morbo di
Huntington e di Parkinson La natura e la sorte di aggregati di proteine
nelle cellule eucariotiche egrave stata poco compresa Recentemente egrave stata
sempre piugrave sostenuta unrsquoazione protettiva della formazione di aggregati
piuttosto che unrsquoimmediata azione patogena Per esempio nel caso del
morbo di Huntington lrsquoesame di cellule neuronali in coltura
sovrapproducenti una fusione di poliglutamina espansa e huntingtina-
GFP rivelano che queste cellule contenenti aggregati fluorescenti
morfologicamente visibili esibiscono una migliore viabilitagrave rispetto a
quelle aventi per via diffusionale materiale fluorescente [27] Questo
sembra in accordo con il concetto che si tratta di piccoli assemblati di
proteine mal ripiegate inclusioni non morfologicamente visibili che
esercitano effetti tossici sulle cellule Analogamente un recente
confronto delle dimensioni rispetto a tossicitagrave per gli aggregati di
proteina prionica PrP suggerisce che piccoli aggregati contenenti da una
a due dozzine di molecole sono risultati i piugrave tossici per le cellule [28]
23
Ma le cellule dispongono di meccanismi di compensazione per questi
piccoli aggregati Studi recenti hanno suggerito che la via ubiquitina-
proteosoma possa essere il pilastro della rimozione di specie inclini
allrsquoaggregazione Infatti gli aggregati rilevati nel contesto di
neurodegenerazione di solito sono reattivi con gli anticorpi anti-
ubiquitina il che implica che le specie mal ripiegate sono state
riconosciute dal sistema di coniugazione dellubiquitina Eppure vari
studi di questi ultimi anni indicano che queste proteine modificate
rappresentano una sfida particolare per proteasomi che possono portare
alla loro inibizione [29 ab] Il meccanismo di questa inattivazione
rimane sconosciuto ma puograve coinvolgere il soffocamento della camera
del proteasoma [30]
Anatomia del proteasoma Il proteasoma egrave una macromolecola proteica del peso di circa 2 milioni
di Daltons Ersquo formata da ununitagrave base centrale (core) e 2 cappucci agli estremi (cap) Il core egrave
formato a sua volta da 4 anelli ciascuno costituito da 7 unitagrave proteiche I due ldquocaprdquo attaccati alle
due estremitagrave del core cilindrico consistono ciascuno di 20 subunitagrave
24
Ora sembra che la modifica dellrsquoubiquitina possa reclutare specie
aggregate mediante una via indipendente lrsquoAUTOFAGIA Lrsquoautofagia
implica il riconoscimento e lrsquoimpacchettamentofagocitazione di
proteine specifiche o organelli in vescicole autofagosomiche che si
fondono con i lisosomi in cui sia le vescicole che il loro contenuto sono
scomposti Piugrave di 20 componenti cosiddetti Atg (geni coinvolti
nellrsquoautofagia) mediano questo processo straordinario Recenti studi
hanno dimostrato che componenti centrali della formazione di autosomi
nei topi hanno attivitagrave nei tessuti dei mammiferi Per esempio carenza
di atg5 ha portato alla morte di animali appena nati a causa
dellrsquoincapacitagrave di fornire un apporto di aminoacidi attraverso la
degradazione di proteine del corpo durante la condizione di fame
relativa allrsquoimmediato periodo post-natale Sorprendentemente in un
altro studio in cui egrave stata indotta una carenza di atg7 piugrave avanti nella
vita con un gene ldquofloxedrdquo lrsquoaccumulo di aggregati positivi
allrsquoubiquitina egrave stata osservata nel fegato degli animali che sono stati
disabilitati nella produzione di autofagosomi La funzione del
proteasoma in questi animali egrave rimasta inalterata contenente specie mal
ripiegate etichettate con ubiquitina e possono essere eliminate attraverso
autofagia Egrave stato poi scoperto un componente denominato p62 (o
sequestosoma1) che costituisce un guscio attorno agli aggregati di
huntingtina [31] Questa proteina contiene un dominio C-terminale
associato allrsquoubiquitina (UBA) che puograve legare poliubiquitine in modo
tale che p62 si collochi con lrsquoubiquitina quando espressa in cellule
HeLa Inoltre nelle cellule che esprimono huntigtina p62 si associa con
LC3 una proteina localizzata negli autofagosomi In accordo con quanto
riportato e cioegrave che lrsquoautofagia riduce i livelli di aggregati di
huntingtina e con un ruolo critico di p62 in questo processo lrsquoinibizione
25
antisenso mediata dallrsquoesperessione di p62 aumenta lrsquoapoptosi delle
cellule che esprimono huntungtina Quindi sembra che la modifica
dellrsquoubiquitina delle proteine difettose possa offrire un ingresso sia al
sistema proteasoma o in contesti dove lrsquoaggregazione egrave in corso al
sistema autofagia
SISTEMI CHAPERONI HSP70
Le Hsp70 proteine dello shock termico di 70 KDa sono impegnate in
una serie di processi tra cui il ripiegamento di proteine di nuova sintesi
il trasporto delle proteine attraverso membrane il ripiegamento di
proteine mal ripiegate ed aggregate e il controllo delle attivitagrave delle
proteine regolatrici Questa versatilitagrave egrave ottenuta attraverso
lampliamento e la diversificazione evolutiva di geni hsp70 che ha
generato sia chaperoni Hsp70 specifici Hsp110 e proteine Hsp170 La
versatilitagrave egrave determinata attraverso lrsquoimpiego di cochaperoni proteine J
e fattori di scambio di nucleotide (NEF) che regolano lrsquoattivitagrave di Hsp70
(Figura 4)
26
Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame
del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una
Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)
Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la
proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato
allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del
substrato
Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre
specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb
Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di
legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un
numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame
dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi
Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina
Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni
Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali
di Hsp70 con se stesso
27
INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70
Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di
proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura
xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding
appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide
N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD
adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio
elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con
lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante
chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco
tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini
di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di
comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura
di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione
La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la
tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo
coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture
precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una
proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da
una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β
ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica
compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio
elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di
legame del substrato (Figura 5)
28
Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo
substrato
La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra
domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che
collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo
solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi
residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame
allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A
dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso
Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un
legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in
nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano
completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve
entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo
fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui
coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del
segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti
integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A
29
capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il
quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di
ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a
idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di
DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro
catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente
arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia
drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete
crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la
barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK
costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina
superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura
della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera
attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della
prolina
DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-
NUCLEOTIDE
Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi
meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono
fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la
liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del
substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la
dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine
BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave
dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con
30
funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S
cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1
(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la
disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e
HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70
fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi
della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente
indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene
GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg
di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei
nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte
posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i
nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario
BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in
modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del
complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si
compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo
Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva
[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con
conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve
indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca
di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di
convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la
reazione di scambio nucleotidica di Hsp70
31
LEGAMI Hsp70-Hsp70
Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro
della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In
particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce
come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola
lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di
questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento
Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il
cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che
sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi
eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente
lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se
non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di
complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di
nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di
scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione
importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto
di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel
folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle
Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza
proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa
con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere
coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di
traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina
Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come
sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le
interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di
32
Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi
SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua
attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano
legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di
idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede
possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano
lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina
stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che
Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami
con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina
J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di
stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega
bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o
Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non
limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che
la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-
associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con
Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito
meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande
aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante
per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70
AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP
Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli
AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione
disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]
33
Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un
anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del
proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico
20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA
svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP
Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104
nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico
per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste
attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come
una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-
etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE
per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla
fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il
meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere
tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria
per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli
anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una
parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali
suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata
assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando
una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a
spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad
entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel
caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro
che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti
dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una
proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In
parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno
34
individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi
domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre
interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta
apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati
che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la
questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)
Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97
Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da
proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad
entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro
efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non
devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati
dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte
lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono
piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte
superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine
adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il
35
movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori
p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su
proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di
proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la
retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e
reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo
anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite
adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente
il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente
forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei
canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]
LrsquoAZIONE DELLrsquoATP
La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico
al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco
affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad
esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello
Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che
ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo
di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli
wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli
mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori
dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di
ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di
un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di
quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda
36
subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino
al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave
significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o
sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti
differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra
essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che
attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave
adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non
vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a
cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di
subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico
Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un
substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di
queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un
meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da
F1-ATPasi non sembra escluso
HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE
NEURODEGENERATIVE
RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE
Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel
mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una
pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi
associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione
37
di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di
Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta
promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]
Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90
nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave
funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi
permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]
HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico
Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono
mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)
accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock
citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata
da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante
di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo
stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si
lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei
geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-
shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via
multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di
transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-
translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90
[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e
mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo
shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con
Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)
38
attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da
shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni
Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che
i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro
sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock
termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su
attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato
che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi
di insulti
Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90
e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con
shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La
somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a
topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello
39
Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge
contro aggregati tossici
Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un
aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave
egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di
chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione
incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste
molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente
diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su
espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative
Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie
neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a
mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei
neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia
muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-
pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma
mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme
nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che
Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in
oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza
attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili
[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di
Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt
mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore
di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo
suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro
effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi
40
indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando
monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono
probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono
essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di
atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70
permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]
Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare
spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo
nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un
miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina
[62]
Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il
riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso
lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido
dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli
di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i
motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione
acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni
Riluzolo
Arimoclomol
41
Nei vari modelli cellulari della malattia di Alzheimer (AD) vi egrave un
incremento dei livelli di Hsp70 promossa dalla solubilitagrave e dal legame ai
microtubuli delle proteine tau [63] Hsp70 ha anche inibito la
propensione di aggregazione di Aβ [64] e ridotto la tossicitagrave di Aβ su
culture neuronali [65] Inoltre la proteina precursore dellrsquoamiloide
(APP) eo il suo Aβ amiloide derivato sono bersagli di chaperoni
mediati da clearence [66-67] Nella Drosophila melanogaster e nei
modelli di lievito della malattia di Parkinson (PD) lrsquoespressione diretta
di Hsp70 o la modulazione farmacologica di Hsp ha impedito la perdita
di neuroni causata da alfa-sinucleina [68-69] Huang et al hanno
riportato che questi effetti di Hsp70 si manifestano con lrsquoinibizione della
formazione di fibrille di alfa-sinucleina prevenendo la formazione di
alfa-sinucleina prefibrillare [70] Usando delezioni mutanti di alfa-
sinucleina Luk et al hanno indicato che le interazioni tra il dominio
legante il substrato Hsp70 e la regione del core idrofobico dellrsquoalfa-
sinucleina mediano lrsquoinibizione dellrsquoassemblaggio e che questo
processo di assemblaggio egrave inibito prima della fase di allungamento
[71] Nel complesso in diversi modelli di malattia neurodegenerativa la
sovra espressione di Hsp70 ha migliorato la gravitagrave della malattia di
fenotipi diversi senza incidere visibilmente sulla formazione di
aggregati suggerendo che i chaperoni non impediscono lrsquoaggregazione
di per seacute bensigrave reindirizzano gli aggregati preferibilmente in depositi
amorfi quindi sequestrando specie potenzialmente tossiche dalla
maggior parte della soluzione
42
Lrsquoespressione di Hsp70 e di altre Hsp egrave indotta dallrsquoinibizione
farmacologica di Hsp90
Come riportato sopra lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal
complesso con Hsp90 con susseguente produzione di Hsp (Figura 7) e
lrsquoinduzione di Hsp70 da parte di inibitori di Hsp90 egrave ben documentata
nei modelli di malattie neurodegenerative La geldanamicina (GM) un
inibitore di Hsp90 induce un aumento dose dipendente di Hsp70 nei
modelli di cellule di AD (Alzhaimer) cosigrave come nei neuroni della
corteccia primaria del ratto e riduce la quantitagrave di tau insolubili e dei
livelli basali di acido okadaico indotto da tau fosforilazione [63] Il
trattamento di neuroni primari corticali con lrsquoinibitore di Hsp90 con
struttura purinica il PU24FCI ha portato ad un aumento di Hsp70 dose-
dipendente [72]
PU24FCI
KU32
43
Allo stesso modo la somministrazione di due derivati di PU24FCI
CNS-permeabili il PU-DZ8 [72] ed il EC102 [73] a topi tau transgenici
(htau e JNPL3) ha determinato induzione di Hsp70 nel cervello e
mantenuto gli effetti per 24 ore dopo la somministrazione KU32 un
inibitore di Hsp90 di diversa natura chimica ha indotto Hsp70 in culture
SH-SY5Y di neuroblastoma e la ha protetta da tossicitagrave indotta da Aβ
GM ha attivato una risposta da shock termico ed inibito lrsquoaggregazione
di htt in un modello di coltura cellulare di HD ed ha indotto Hsp70 in
maniera tempo e concentrazione-dipendente ed ha impedito
lrsquoaggregazione di alfa-sinucleina e protetto contro la tossicitagrave in un
modello di aggregazione cellulare di alfa-sinucleina Auluck et al hanno
segnalato che il trattamento di un modello volante di PD con GM ha
protetto completamente contro tossicitagrave per alfa-sinucleina [74] GM ha
protetto anche contro la neurotossicitagrave dopaminergica indotta da 1-metil-
4-fenil-1236-tetraidropiridina (MPTP) in un modello di topo di PD Il
pretrattamento con GM mediante iniezione ventricolare intracerebrale
prima del trattamento con MPTP ha indotto le Hsp70 ed incrementato il
contenuto residuale di dopamina e lrsquoimmuno reattivitagrave della tirosina
idrolasi nel corpo striato [75] Lrsquoinduzione di Hsp70 nel midollo spinale
egrave stata osservata in seguito ad iniezione intraperitoneale di un derivato
della GM il 17-AAG in un modello di SBMA topo [76] Il 17-AAG egrave
stato anche efficace contro la nuerodegenerazione in altre malattie
poliQ Vale a dire ha soppresso la degenerazione dellrsquoocchio e la
formazione di inclusioni del corpo e salvato dalla letalitagrave in un modello
di SCA di Drosophila Ha inoltre soppresso la neurodegenerazione in un
modello volante di HD La riduzione di HSF-1 ha abolito lrsquoinduzione di
chaperoni molecolari e gli effeti terapeutici di 17-AAG sulla
neurodegenerazione poliQ indotta nei modelli di Drosophila facendo
44
arguire che lrsquoeffetto terapeutico di 17-AAG egrave essenzialmente mediato da
HSF-1 [77] Riassumendo lrsquoattivazione di HSF-1 da inibitori di Hsp90
egrave stata notata specificamente in modelli in vivo ed in vitro di malattie
neurodegenerative suggerendo che lrsquoinibizione di Hsp90 puograve essere un
mezzo per modulare i livelli di Hsp in cervelli malati con lrsquoobbiettivo di
proteggere contro le proteine tossiche che si presentano nel corso del
processo neurodegenerativo
Lrsquoinibizione di Hsp90 riduce lrsquoattivitagrave e lrsquoespressione di proteine
neuronali aberranti
In aggiunta alla regolazione di HSF-1 evidenze recenti suggeriscono un
ruolo addizionale per Hsp90 nel mantenimento della stabilitagrave funzionale
della capacitagrave aberrante di proteine neuronali (Figura 8A)
La SBMA egrave una malattia ereditaria dei motoneuroni causata
dallrsquoaccrescimento di un tratto di poliglutamina allrsquointerno del recettore
androgeno (AR) [57]
Le caratteristiche patologiche di SBMA sono perdita dei motoneuroni
nel midollo spinale e nel tronco cerebrale diffusione dellrsquoaccumulo
nucleare inclusioni nucleari di mutanti AR (mAR) nei motoneuroni
residui e in alcuni organi viscerali Waza et al hanno dimostrato che
mAR presente in SBMA egrave una delle proteine regolate da Hsp90 (Figura
8A) [76]
45
Figura 8 Le Hsp90 riparano le proteine neuronali aberranti (A) Proteine neuronali
aberranti regolate da Hsp90 (B) Lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90porta allrsquoinattivazione
o degradazione delle proteine regulate da Hsp90 probabilmente attraverso la via del
proteasoma
Le Hsp90 formano un complesso molecolare con mAR per il
mantenimento della sua stabilitagrave funzionale Sia in modelli cellulari di
SBMA che in topi transgenici lrsquoinibizione di Hsp90 da parte di 17-
AAG il derivato 17 allilammino-17-demetossi della geldanamicina ha
46
portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal
macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati
disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da
destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione
dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di
SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave
rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati
[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori
hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo
sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa
(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni
Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]
Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo
egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali
sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al
hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina
(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi
familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un
complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data
da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto
47
lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della
stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave
dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita
neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei
neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che
codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a
PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson
familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson
suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente
associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che
Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate
con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente
diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina
egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille
ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno
recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di
alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che
sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina
[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce
lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari
Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-
dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento
tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-
sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da
chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di
mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il
macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD
associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-
48
sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative
caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave
caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di
tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD
lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da
unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina
chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta
(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si
era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero
netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un
gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e
Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave
causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma
17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau
[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine
neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso
portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina
mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da
Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei
modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave
patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-
dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla
settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad
una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di
tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno
dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una
diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di
AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le
49
relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la
degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90
[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al
(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave
stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da
GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β
effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi
GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di
Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe
portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in
strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati
indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone
biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione
di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da
parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi
proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di
queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)
Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie
neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio
approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare
dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la
formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione
potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di
Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare
terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare
malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo
centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90
puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione
50
successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti
neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti
clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto
che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono
tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in
modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni
nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati
promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio
spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in
modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di
Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a
lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse
da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase
esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora
rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori
dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per
mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie
neurodegenerative
51
SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-
ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-
METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE
(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE
MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO
SULLA FRAMMENTAZIONE
Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in
risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta
nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine
regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il
ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai
loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine
client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro
cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire
su molti percorsi oncogenici
Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il
nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che
lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati
composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP
attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del
processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono
emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i
tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule
normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina
(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una
maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto
che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una
piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
20
come i substrati vengano consegnati al macchinario di
retrotranslocazione restano importanti questioni aperte per la maggior
parte dei substrati Il riconoscimento di una proteina contenente un
dominio luminale mal ripiegato dipende in modo determinante dallo
stato di glicosilazione della proteina Infatti anche piccole modifiche di
glicani N-linked puograve provocare danni gravi nella degradazione di
numerosi substrati Questo puograve effettivamente lasciare le proteine in un
limbo impossibile raggiungere lo stato nativo ma non riconosciuto dal
macchinario ERAD esse restano mal ripiegate nel RE a tempo
indeterminato A prima vista questa dipendenza dalla glicosilazione
sembra essere un miglioramento non necessario Tuttavia egrave ormai chiaro
che lo spettro di porzioni di zucchero presenti in una proteina egrave un
segnale fondamentale nel marcare il suo status di ripiegamento Infatti
dato che diverse proteine altamente abbondanti nel RE tra cui BiP e
PDI spesso non sono glicosilate la presenza e la natura covalente di
molto mannosio in un polipeptide puograve fornire un segnale importante che
aiuta il macchinario di controllo-qualitagrave del RE a distinguere le specie
ripiegate destinate ad altri scomparti da quelle piugrave abbondanti e
permanenti del RE Lrsquointuizione nel ruolo della glicosilazione nella
discriminazione tra le specie in via di ripiegamento e le proteine
terminali mal ripiegate nel RE egrave venuta dalla constatazione che
glicoproteine mal ripiegate subiscono un taglio dei loro N-glicani da una
varietagrave di glicosidasi tra cui una mannossidasi specifica In aggiunta a
proteine mal ripiegate persistenti si egrave pensato che il rimodellamento
dipendente dal tempo di N-glicani porti ad un segnale per la
degradazione del macchinario ERAD Questo permette intermedi
ripiegati in un periodo di tempo prima del rimodellamento dei loro N-
glicani in cui il polipeptide egrave immune dalla sorveglianza ERAD Egrave
21
interessante notare che un recente studio suggerisce che anche per i
polipeptidi citosolici vi egrave un periodo durante e subito dopo la sintesi in
cui le specie mal ripiegate sono immuni alla degradazione del
proteasoma [23] Recenti studi hanno identificato due differenti lettine
localizzate nel RE che svolgono un ruolo critico nellrsquoERAD La prima egrave
correlata alla proteina mannossidasi responsabile del taglio di N-glicani
nel RE ma sembra aver perso la sua attivitagrave catalitica Nel lievito si
chiama Htm1pMnl1p e nei mammiferi egrave chiamato EDEM Studi
condotti su cellule di mammifero suggeriscono che EDEM aiuta le
glicoproteine mal ripiegate a lasciare il ciclo calnexinacalreticulina del
chaperone lectina dove stanno cercando di ripiegarsi e cosigrave entrare nel
ciclo di degradazione [24 ab] Tuttavia nel lievito Htm1p egrave richiesto
per la degradazione efficiente di substrati come CPY che non
dipendono da calnexina Quindi sembra probabile che Htm1pEDEM
ricopra altri ruoli in ERAD La seconda lectina Yos9p forma un
complesso stabile con proteine mal ripiegate e la perdita di questa
lectina conduce ad un profondo e specifico difetto nella degradazione di
glicoproteine mal ripiegate [25] Sorprendentemente mentre mutazioni
puntiformi nella tasca di Yos9p legante il mannosio eliminano la sua
capacitagrave di supportare ERAD i mutanti stessi di Yos9p mostrano una
maggior interazione con i substrati Ciograve indica la possibilitagrave che la
lectina Yos9p svolga un ruolo piugrave informativo interrogando lo stato
dello zucchero di forme mal ripiegate per determinare se debbano essere
passate al macchinario di retrotranslocazione Tuttavia come con
ERAD-C sebbene ci siano stati grandi progressi nella caratterizzazione
del macchinario di retrotranslocazione [26] le caratteristiche strutturali
delle proteine mal ripiegate sono in fase di monitoraggio e sono ancora
22
limitate le conoscenzedi come le forme mal ripiegate sono passate a
questo macchinario
CLEARENCE DI AGGREGATI ATTRAVERSO
LrsquoAUTOFAGIA
Egrave sempre piugrave evidente che ci sono una varietagrave di condizioni in vivo che
anche con chaperoni e macchinari proteolitici presenti nello stesso
compartimento come proteine mal ripiegate questi meccanismi di
controllo-qualitagrave falliscono e le proteine mal ripiegate avanzano
formando aggregati Inoltre tali aggregati intracellulari sono associati
con una serie di malattie neurodegenerative come il morbo di
Huntington e di Parkinson La natura e la sorte di aggregati di proteine
nelle cellule eucariotiche egrave stata poco compresa Recentemente egrave stata
sempre piugrave sostenuta unrsquoazione protettiva della formazione di aggregati
piuttosto che unrsquoimmediata azione patogena Per esempio nel caso del
morbo di Huntington lrsquoesame di cellule neuronali in coltura
sovrapproducenti una fusione di poliglutamina espansa e huntingtina-
GFP rivelano che queste cellule contenenti aggregati fluorescenti
morfologicamente visibili esibiscono una migliore viabilitagrave rispetto a
quelle aventi per via diffusionale materiale fluorescente [27] Questo
sembra in accordo con il concetto che si tratta di piccoli assemblati di
proteine mal ripiegate inclusioni non morfologicamente visibili che
esercitano effetti tossici sulle cellule Analogamente un recente
confronto delle dimensioni rispetto a tossicitagrave per gli aggregati di
proteina prionica PrP suggerisce che piccoli aggregati contenenti da una
a due dozzine di molecole sono risultati i piugrave tossici per le cellule [28]
23
Ma le cellule dispongono di meccanismi di compensazione per questi
piccoli aggregati Studi recenti hanno suggerito che la via ubiquitina-
proteosoma possa essere il pilastro della rimozione di specie inclini
allrsquoaggregazione Infatti gli aggregati rilevati nel contesto di
neurodegenerazione di solito sono reattivi con gli anticorpi anti-
ubiquitina il che implica che le specie mal ripiegate sono state
riconosciute dal sistema di coniugazione dellubiquitina Eppure vari
studi di questi ultimi anni indicano che queste proteine modificate
rappresentano una sfida particolare per proteasomi che possono portare
alla loro inibizione [29 ab] Il meccanismo di questa inattivazione
rimane sconosciuto ma puograve coinvolgere il soffocamento della camera
del proteasoma [30]
Anatomia del proteasoma Il proteasoma egrave una macromolecola proteica del peso di circa 2 milioni
di Daltons Ersquo formata da ununitagrave base centrale (core) e 2 cappucci agli estremi (cap) Il core egrave
formato a sua volta da 4 anelli ciascuno costituito da 7 unitagrave proteiche I due ldquocaprdquo attaccati alle
due estremitagrave del core cilindrico consistono ciascuno di 20 subunitagrave
24
Ora sembra che la modifica dellrsquoubiquitina possa reclutare specie
aggregate mediante una via indipendente lrsquoAUTOFAGIA Lrsquoautofagia
implica il riconoscimento e lrsquoimpacchettamentofagocitazione di
proteine specifiche o organelli in vescicole autofagosomiche che si
fondono con i lisosomi in cui sia le vescicole che il loro contenuto sono
scomposti Piugrave di 20 componenti cosiddetti Atg (geni coinvolti
nellrsquoautofagia) mediano questo processo straordinario Recenti studi
hanno dimostrato che componenti centrali della formazione di autosomi
nei topi hanno attivitagrave nei tessuti dei mammiferi Per esempio carenza
di atg5 ha portato alla morte di animali appena nati a causa
dellrsquoincapacitagrave di fornire un apporto di aminoacidi attraverso la
degradazione di proteine del corpo durante la condizione di fame
relativa allrsquoimmediato periodo post-natale Sorprendentemente in un
altro studio in cui egrave stata indotta una carenza di atg7 piugrave avanti nella
vita con un gene ldquofloxedrdquo lrsquoaccumulo di aggregati positivi
allrsquoubiquitina egrave stata osservata nel fegato degli animali che sono stati
disabilitati nella produzione di autofagosomi La funzione del
proteasoma in questi animali egrave rimasta inalterata contenente specie mal
ripiegate etichettate con ubiquitina e possono essere eliminate attraverso
autofagia Egrave stato poi scoperto un componente denominato p62 (o
sequestosoma1) che costituisce un guscio attorno agli aggregati di
huntingtina [31] Questa proteina contiene un dominio C-terminale
associato allrsquoubiquitina (UBA) che puograve legare poliubiquitine in modo
tale che p62 si collochi con lrsquoubiquitina quando espressa in cellule
HeLa Inoltre nelle cellule che esprimono huntigtina p62 si associa con
LC3 una proteina localizzata negli autofagosomi In accordo con quanto
riportato e cioegrave che lrsquoautofagia riduce i livelli di aggregati di
huntingtina e con un ruolo critico di p62 in questo processo lrsquoinibizione
25
antisenso mediata dallrsquoesperessione di p62 aumenta lrsquoapoptosi delle
cellule che esprimono huntungtina Quindi sembra che la modifica
dellrsquoubiquitina delle proteine difettose possa offrire un ingresso sia al
sistema proteasoma o in contesti dove lrsquoaggregazione egrave in corso al
sistema autofagia
SISTEMI CHAPERONI HSP70
Le Hsp70 proteine dello shock termico di 70 KDa sono impegnate in
una serie di processi tra cui il ripiegamento di proteine di nuova sintesi
il trasporto delle proteine attraverso membrane il ripiegamento di
proteine mal ripiegate ed aggregate e il controllo delle attivitagrave delle
proteine regolatrici Questa versatilitagrave egrave ottenuta attraverso
lampliamento e la diversificazione evolutiva di geni hsp70 che ha
generato sia chaperoni Hsp70 specifici Hsp110 e proteine Hsp170 La
versatilitagrave egrave determinata attraverso lrsquoimpiego di cochaperoni proteine J
e fattori di scambio di nucleotide (NEF) che regolano lrsquoattivitagrave di Hsp70
(Figura 4)
26
Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame
del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una
Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)
Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la
proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato
allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del
substrato
Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre
specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb
Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di
legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un
numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame
dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi
Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina
Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni
Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali
di Hsp70 con se stesso
27
INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70
Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di
proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura
xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding
appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide
N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD
adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio
elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con
lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante
chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco
tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini
di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di
comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura
di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione
La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la
tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo
coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture
precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una
proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da
una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β
ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica
compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio
elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di
legame del substrato (Figura 5)
28
Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo
substrato
La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra
domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che
collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo
solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi
residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame
allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A
dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso
Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un
legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in
nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano
completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve
entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo
fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui
coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del
segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti
integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A
29
capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il
quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di
ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a
idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di
DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro
catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente
arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia
drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete
crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la
barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK
costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina
superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura
della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera
attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della
prolina
DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-
NUCLEOTIDE
Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi
meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono
fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la
liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del
substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la
dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine
BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave
dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con
30
funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S
cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1
(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la
disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e
HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70
fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi
della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente
indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene
GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg
di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei
nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte
posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i
nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario
BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in
modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del
complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si
compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo
Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva
[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con
conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve
indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca
di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di
convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la
reazione di scambio nucleotidica di Hsp70
31
LEGAMI Hsp70-Hsp70
Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro
della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In
particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce
come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola
lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di
questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento
Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il
cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che
sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi
eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente
lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se
non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di
complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di
nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di
scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione
importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto
di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel
folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle
Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza
proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa
con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere
coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di
traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina
Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come
sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le
interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di
32
Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi
SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua
attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano
legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di
idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede
possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano
lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina
stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che
Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami
con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina
J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di
stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega
bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o
Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non
limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che
la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-
associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con
Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito
meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande
aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante
per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70
AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP
Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli
AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione
disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]
33
Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un
anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del
proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico
20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA
svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP
Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104
nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico
per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste
attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come
una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-
etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE
per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla
fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il
meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere
tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria
per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli
anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una
parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali
suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata
assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando
una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a
spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad
entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel
caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro
che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti
dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una
proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In
parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno
34
individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi
domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre
interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta
apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati
che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la
questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)
Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97
Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da
proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad
entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro
efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non
devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati
dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte
lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono
piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte
superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine
adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il
35
movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori
p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su
proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di
proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la
retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e
reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo
anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite
adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente
il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente
forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei
canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]
LrsquoAZIONE DELLrsquoATP
La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico
al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco
affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad
esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello
Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che
ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo
di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli
wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli
mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori
dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di
ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di
un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di
quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda
36
subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino
al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave
significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o
sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti
differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra
essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che
attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave
adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non
vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a
cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di
subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico
Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un
substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di
queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un
meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da
F1-ATPasi non sembra escluso
HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE
NEURODEGENERATIVE
RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE
Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel
mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una
pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi
associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione
37
di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di
Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta
promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]
Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90
nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave
funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi
permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]
HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico
Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono
mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)
accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock
citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata
da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante
di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo
stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si
lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei
geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-
shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via
multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di
transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-
translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90
[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e
mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo
shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con
Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)
38
attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da
shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni
Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che
i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro
sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock
termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su
attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato
che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi
di insulti
Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90
e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con
shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La
somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a
topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello
39
Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge
contro aggregati tossici
Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un
aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave
egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di
chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione
incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste
molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente
diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su
espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative
Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie
neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a
mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei
neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia
muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-
pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma
mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme
nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che
Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in
oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza
attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili
[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di
Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt
mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore
di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo
suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro
effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi
40
indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando
monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono
probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono
essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di
atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70
permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]
Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare
spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo
nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un
miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina
[62]
Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il
riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso
lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido
dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli
di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i
motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione
acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni
Riluzolo
Arimoclomol
41
Nei vari modelli cellulari della malattia di Alzheimer (AD) vi egrave un
incremento dei livelli di Hsp70 promossa dalla solubilitagrave e dal legame ai
microtubuli delle proteine tau [63] Hsp70 ha anche inibito la
propensione di aggregazione di Aβ [64] e ridotto la tossicitagrave di Aβ su
culture neuronali [65] Inoltre la proteina precursore dellrsquoamiloide
(APP) eo il suo Aβ amiloide derivato sono bersagli di chaperoni
mediati da clearence [66-67] Nella Drosophila melanogaster e nei
modelli di lievito della malattia di Parkinson (PD) lrsquoespressione diretta
di Hsp70 o la modulazione farmacologica di Hsp ha impedito la perdita
di neuroni causata da alfa-sinucleina [68-69] Huang et al hanno
riportato che questi effetti di Hsp70 si manifestano con lrsquoinibizione della
formazione di fibrille di alfa-sinucleina prevenendo la formazione di
alfa-sinucleina prefibrillare [70] Usando delezioni mutanti di alfa-
sinucleina Luk et al hanno indicato che le interazioni tra il dominio
legante il substrato Hsp70 e la regione del core idrofobico dellrsquoalfa-
sinucleina mediano lrsquoinibizione dellrsquoassemblaggio e che questo
processo di assemblaggio egrave inibito prima della fase di allungamento
[71] Nel complesso in diversi modelli di malattia neurodegenerativa la
sovra espressione di Hsp70 ha migliorato la gravitagrave della malattia di
fenotipi diversi senza incidere visibilmente sulla formazione di
aggregati suggerendo che i chaperoni non impediscono lrsquoaggregazione
di per seacute bensigrave reindirizzano gli aggregati preferibilmente in depositi
amorfi quindi sequestrando specie potenzialmente tossiche dalla
maggior parte della soluzione
42
Lrsquoespressione di Hsp70 e di altre Hsp egrave indotta dallrsquoinibizione
farmacologica di Hsp90
Come riportato sopra lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal
complesso con Hsp90 con susseguente produzione di Hsp (Figura 7) e
lrsquoinduzione di Hsp70 da parte di inibitori di Hsp90 egrave ben documentata
nei modelli di malattie neurodegenerative La geldanamicina (GM) un
inibitore di Hsp90 induce un aumento dose dipendente di Hsp70 nei
modelli di cellule di AD (Alzhaimer) cosigrave come nei neuroni della
corteccia primaria del ratto e riduce la quantitagrave di tau insolubili e dei
livelli basali di acido okadaico indotto da tau fosforilazione [63] Il
trattamento di neuroni primari corticali con lrsquoinibitore di Hsp90 con
struttura purinica il PU24FCI ha portato ad un aumento di Hsp70 dose-
dipendente [72]
PU24FCI
KU32
43
Allo stesso modo la somministrazione di due derivati di PU24FCI
CNS-permeabili il PU-DZ8 [72] ed il EC102 [73] a topi tau transgenici
(htau e JNPL3) ha determinato induzione di Hsp70 nel cervello e
mantenuto gli effetti per 24 ore dopo la somministrazione KU32 un
inibitore di Hsp90 di diversa natura chimica ha indotto Hsp70 in culture
SH-SY5Y di neuroblastoma e la ha protetta da tossicitagrave indotta da Aβ
GM ha attivato una risposta da shock termico ed inibito lrsquoaggregazione
di htt in un modello di coltura cellulare di HD ed ha indotto Hsp70 in
maniera tempo e concentrazione-dipendente ed ha impedito
lrsquoaggregazione di alfa-sinucleina e protetto contro la tossicitagrave in un
modello di aggregazione cellulare di alfa-sinucleina Auluck et al hanno
segnalato che il trattamento di un modello volante di PD con GM ha
protetto completamente contro tossicitagrave per alfa-sinucleina [74] GM ha
protetto anche contro la neurotossicitagrave dopaminergica indotta da 1-metil-
4-fenil-1236-tetraidropiridina (MPTP) in un modello di topo di PD Il
pretrattamento con GM mediante iniezione ventricolare intracerebrale
prima del trattamento con MPTP ha indotto le Hsp70 ed incrementato il
contenuto residuale di dopamina e lrsquoimmuno reattivitagrave della tirosina
idrolasi nel corpo striato [75] Lrsquoinduzione di Hsp70 nel midollo spinale
egrave stata osservata in seguito ad iniezione intraperitoneale di un derivato
della GM il 17-AAG in un modello di SBMA topo [76] Il 17-AAG egrave
stato anche efficace contro la nuerodegenerazione in altre malattie
poliQ Vale a dire ha soppresso la degenerazione dellrsquoocchio e la
formazione di inclusioni del corpo e salvato dalla letalitagrave in un modello
di SCA di Drosophila Ha inoltre soppresso la neurodegenerazione in un
modello volante di HD La riduzione di HSF-1 ha abolito lrsquoinduzione di
chaperoni molecolari e gli effeti terapeutici di 17-AAG sulla
neurodegenerazione poliQ indotta nei modelli di Drosophila facendo
44
arguire che lrsquoeffetto terapeutico di 17-AAG egrave essenzialmente mediato da
HSF-1 [77] Riassumendo lrsquoattivazione di HSF-1 da inibitori di Hsp90
egrave stata notata specificamente in modelli in vivo ed in vitro di malattie
neurodegenerative suggerendo che lrsquoinibizione di Hsp90 puograve essere un
mezzo per modulare i livelli di Hsp in cervelli malati con lrsquoobbiettivo di
proteggere contro le proteine tossiche che si presentano nel corso del
processo neurodegenerativo
Lrsquoinibizione di Hsp90 riduce lrsquoattivitagrave e lrsquoespressione di proteine
neuronali aberranti
In aggiunta alla regolazione di HSF-1 evidenze recenti suggeriscono un
ruolo addizionale per Hsp90 nel mantenimento della stabilitagrave funzionale
della capacitagrave aberrante di proteine neuronali (Figura 8A)
La SBMA egrave una malattia ereditaria dei motoneuroni causata
dallrsquoaccrescimento di un tratto di poliglutamina allrsquointerno del recettore
androgeno (AR) [57]
Le caratteristiche patologiche di SBMA sono perdita dei motoneuroni
nel midollo spinale e nel tronco cerebrale diffusione dellrsquoaccumulo
nucleare inclusioni nucleari di mutanti AR (mAR) nei motoneuroni
residui e in alcuni organi viscerali Waza et al hanno dimostrato che
mAR presente in SBMA egrave una delle proteine regolate da Hsp90 (Figura
8A) [76]
45
Figura 8 Le Hsp90 riparano le proteine neuronali aberranti (A) Proteine neuronali
aberranti regolate da Hsp90 (B) Lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90porta allrsquoinattivazione
o degradazione delle proteine regulate da Hsp90 probabilmente attraverso la via del
proteasoma
Le Hsp90 formano un complesso molecolare con mAR per il
mantenimento della sua stabilitagrave funzionale Sia in modelli cellulari di
SBMA che in topi transgenici lrsquoinibizione di Hsp90 da parte di 17-
AAG il derivato 17 allilammino-17-demetossi della geldanamicina ha
46
portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal
macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati
disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da
destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione
dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di
SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave
rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati
[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori
hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo
sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa
(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni
Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]
Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo
egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali
sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al
hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina
(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi
familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un
complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data
da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto
47
lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della
stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave
dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita
neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei
neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che
codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a
PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson
familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson
suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente
associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che
Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate
con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente
diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina
egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille
ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno
recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di
alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che
sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina
[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce
lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari
Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-
dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento
tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-
sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da
chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di
mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il
macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD
associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-
48
sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative
caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave
caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di
tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD
lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da
unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina
chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta
(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si
era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero
netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un
gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e
Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave
causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma
17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau
[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine
neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso
portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina
mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da
Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei
modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave
patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-
dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla
settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad
una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di
tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno
dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una
diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di
AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le
49
relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la
degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90
[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al
(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave
stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da
GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β
effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi
GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di
Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe
portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in
strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati
indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone
biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione
di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da
parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi
proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di
queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)
Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie
neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio
approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare
dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la
formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione
potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di
Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare
terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare
malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo
centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90
puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione
50
successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti
neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti
clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto
che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono
tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in
modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni
nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati
promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio
spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in
modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di
Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a
lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse
da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase
esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora
rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori
dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per
mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie
neurodegenerative
51
SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-
ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-
METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE
(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE
MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO
SULLA FRAMMENTAZIONE
Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in
risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta
nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine
regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il
ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai
loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine
client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro
cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire
su molti percorsi oncogenici
Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il
nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che
lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati
composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP
attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del
processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono
emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i
tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule
normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina
(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una
maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto
che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una
piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
21
interessante notare che un recente studio suggerisce che anche per i
polipeptidi citosolici vi egrave un periodo durante e subito dopo la sintesi in
cui le specie mal ripiegate sono immuni alla degradazione del
proteasoma [23] Recenti studi hanno identificato due differenti lettine
localizzate nel RE che svolgono un ruolo critico nellrsquoERAD La prima egrave
correlata alla proteina mannossidasi responsabile del taglio di N-glicani
nel RE ma sembra aver perso la sua attivitagrave catalitica Nel lievito si
chiama Htm1pMnl1p e nei mammiferi egrave chiamato EDEM Studi
condotti su cellule di mammifero suggeriscono che EDEM aiuta le
glicoproteine mal ripiegate a lasciare il ciclo calnexinacalreticulina del
chaperone lectina dove stanno cercando di ripiegarsi e cosigrave entrare nel
ciclo di degradazione [24 ab] Tuttavia nel lievito Htm1p egrave richiesto
per la degradazione efficiente di substrati come CPY che non
dipendono da calnexina Quindi sembra probabile che Htm1pEDEM
ricopra altri ruoli in ERAD La seconda lectina Yos9p forma un
complesso stabile con proteine mal ripiegate e la perdita di questa
lectina conduce ad un profondo e specifico difetto nella degradazione di
glicoproteine mal ripiegate [25] Sorprendentemente mentre mutazioni
puntiformi nella tasca di Yos9p legante il mannosio eliminano la sua
capacitagrave di supportare ERAD i mutanti stessi di Yos9p mostrano una
maggior interazione con i substrati Ciograve indica la possibilitagrave che la
lectina Yos9p svolga un ruolo piugrave informativo interrogando lo stato
dello zucchero di forme mal ripiegate per determinare se debbano essere
passate al macchinario di retrotranslocazione Tuttavia come con
ERAD-C sebbene ci siano stati grandi progressi nella caratterizzazione
del macchinario di retrotranslocazione [26] le caratteristiche strutturali
delle proteine mal ripiegate sono in fase di monitoraggio e sono ancora
22
limitate le conoscenzedi come le forme mal ripiegate sono passate a
questo macchinario
CLEARENCE DI AGGREGATI ATTRAVERSO
LrsquoAUTOFAGIA
Egrave sempre piugrave evidente che ci sono una varietagrave di condizioni in vivo che
anche con chaperoni e macchinari proteolitici presenti nello stesso
compartimento come proteine mal ripiegate questi meccanismi di
controllo-qualitagrave falliscono e le proteine mal ripiegate avanzano
formando aggregati Inoltre tali aggregati intracellulari sono associati
con una serie di malattie neurodegenerative come il morbo di
Huntington e di Parkinson La natura e la sorte di aggregati di proteine
nelle cellule eucariotiche egrave stata poco compresa Recentemente egrave stata
sempre piugrave sostenuta unrsquoazione protettiva della formazione di aggregati
piuttosto che unrsquoimmediata azione patogena Per esempio nel caso del
morbo di Huntington lrsquoesame di cellule neuronali in coltura
sovrapproducenti una fusione di poliglutamina espansa e huntingtina-
GFP rivelano che queste cellule contenenti aggregati fluorescenti
morfologicamente visibili esibiscono una migliore viabilitagrave rispetto a
quelle aventi per via diffusionale materiale fluorescente [27] Questo
sembra in accordo con il concetto che si tratta di piccoli assemblati di
proteine mal ripiegate inclusioni non morfologicamente visibili che
esercitano effetti tossici sulle cellule Analogamente un recente
confronto delle dimensioni rispetto a tossicitagrave per gli aggregati di
proteina prionica PrP suggerisce che piccoli aggregati contenenti da una
a due dozzine di molecole sono risultati i piugrave tossici per le cellule [28]
23
Ma le cellule dispongono di meccanismi di compensazione per questi
piccoli aggregati Studi recenti hanno suggerito che la via ubiquitina-
proteosoma possa essere il pilastro della rimozione di specie inclini
allrsquoaggregazione Infatti gli aggregati rilevati nel contesto di
neurodegenerazione di solito sono reattivi con gli anticorpi anti-
ubiquitina il che implica che le specie mal ripiegate sono state
riconosciute dal sistema di coniugazione dellubiquitina Eppure vari
studi di questi ultimi anni indicano che queste proteine modificate
rappresentano una sfida particolare per proteasomi che possono portare
alla loro inibizione [29 ab] Il meccanismo di questa inattivazione
rimane sconosciuto ma puograve coinvolgere il soffocamento della camera
del proteasoma [30]
Anatomia del proteasoma Il proteasoma egrave una macromolecola proteica del peso di circa 2 milioni
di Daltons Ersquo formata da ununitagrave base centrale (core) e 2 cappucci agli estremi (cap) Il core egrave
formato a sua volta da 4 anelli ciascuno costituito da 7 unitagrave proteiche I due ldquocaprdquo attaccati alle
due estremitagrave del core cilindrico consistono ciascuno di 20 subunitagrave
24
Ora sembra che la modifica dellrsquoubiquitina possa reclutare specie
aggregate mediante una via indipendente lrsquoAUTOFAGIA Lrsquoautofagia
implica il riconoscimento e lrsquoimpacchettamentofagocitazione di
proteine specifiche o organelli in vescicole autofagosomiche che si
fondono con i lisosomi in cui sia le vescicole che il loro contenuto sono
scomposti Piugrave di 20 componenti cosiddetti Atg (geni coinvolti
nellrsquoautofagia) mediano questo processo straordinario Recenti studi
hanno dimostrato che componenti centrali della formazione di autosomi
nei topi hanno attivitagrave nei tessuti dei mammiferi Per esempio carenza
di atg5 ha portato alla morte di animali appena nati a causa
dellrsquoincapacitagrave di fornire un apporto di aminoacidi attraverso la
degradazione di proteine del corpo durante la condizione di fame
relativa allrsquoimmediato periodo post-natale Sorprendentemente in un
altro studio in cui egrave stata indotta una carenza di atg7 piugrave avanti nella
vita con un gene ldquofloxedrdquo lrsquoaccumulo di aggregati positivi
allrsquoubiquitina egrave stata osservata nel fegato degli animali che sono stati
disabilitati nella produzione di autofagosomi La funzione del
proteasoma in questi animali egrave rimasta inalterata contenente specie mal
ripiegate etichettate con ubiquitina e possono essere eliminate attraverso
autofagia Egrave stato poi scoperto un componente denominato p62 (o
sequestosoma1) che costituisce un guscio attorno agli aggregati di
huntingtina [31] Questa proteina contiene un dominio C-terminale
associato allrsquoubiquitina (UBA) che puograve legare poliubiquitine in modo
tale che p62 si collochi con lrsquoubiquitina quando espressa in cellule
HeLa Inoltre nelle cellule che esprimono huntigtina p62 si associa con
LC3 una proteina localizzata negli autofagosomi In accordo con quanto
riportato e cioegrave che lrsquoautofagia riduce i livelli di aggregati di
huntingtina e con un ruolo critico di p62 in questo processo lrsquoinibizione
25
antisenso mediata dallrsquoesperessione di p62 aumenta lrsquoapoptosi delle
cellule che esprimono huntungtina Quindi sembra che la modifica
dellrsquoubiquitina delle proteine difettose possa offrire un ingresso sia al
sistema proteasoma o in contesti dove lrsquoaggregazione egrave in corso al
sistema autofagia
SISTEMI CHAPERONI HSP70
Le Hsp70 proteine dello shock termico di 70 KDa sono impegnate in
una serie di processi tra cui il ripiegamento di proteine di nuova sintesi
il trasporto delle proteine attraverso membrane il ripiegamento di
proteine mal ripiegate ed aggregate e il controllo delle attivitagrave delle
proteine regolatrici Questa versatilitagrave egrave ottenuta attraverso
lampliamento e la diversificazione evolutiva di geni hsp70 che ha
generato sia chaperoni Hsp70 specifici Hsp110 e proteine Hsp170 La
versatilitagrave egrave determinata attraverso lrsquoimpiego di cochaperoni proteine J
e fattori di scambio di nucleotide (NEF) che regolano lrsquoattivitagrave di Hsp70
(Figura 4)
26
Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame
del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una
Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)
Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la
proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato
allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del
substrato
Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre
specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb
Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di
legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un
numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame
dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi
Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina
Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni
Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali
di Hsp70 con se stesso
27
INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70
Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di
proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura
xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding
appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide
N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD
adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio
elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con
lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante
chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco
tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini
di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di
comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura
di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione
La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la
tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo
coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture
precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una
proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da
una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β
ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica
compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio
elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di
legame del substrato (Figura 5)
28
Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo
substrato
La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra
domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che
collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo
solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi
residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame
allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A
dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso
Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un
legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in
nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano
completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve
entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo
fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui
coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del
segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti
integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A
29
capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il
quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di
ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a
idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di
DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro
catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente
arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia
drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete
crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la
barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK
costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina
superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura
della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera
attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della
prolina
DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-
NUCLEOTIDE
Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi
meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono
fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la
liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del
substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la
dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine
BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave
dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con
30
funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S
cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1
(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la
disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e
HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70
fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi
della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente
indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene
GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg
di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei
nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte
posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i
nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario
BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in
modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del
complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si
compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo
Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva
[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con
conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve
indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca
di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di
convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la
reazione di scambio nucleotidica di Hsp70
31
LEGAMI Hsp70-Hsp70
Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro
della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In
particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce
come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola
lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di
questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento
Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il
cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che
sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi
eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente
lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se
non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di
complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di
nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di
scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione
importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto
di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel
folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle
Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza
proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa
con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere
coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di
traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina
Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come
sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le
interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di
32
Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi
SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua
attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano
legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di
idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede
possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano
lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina
stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che
Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami
con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina
J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di
stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega
bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o
Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non
limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che
la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-
associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con
Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito
meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande
aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante
per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70
AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP
Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli
AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione
disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]
33
Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un
anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del
proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico
20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA
svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP
Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104
nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico
per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste
attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come
una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-
etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE
per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla
fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il
meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere
tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria
per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli
anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una
parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali
suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata
assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando
una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a
spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad
entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel
caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro
che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti
dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una
proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In
parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno
34
individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi
domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre
interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta
apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati
che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la
questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)
Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97
Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da
proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad
entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro
efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non
devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati
dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte
lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono
piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte
superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine
adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il
35
movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori
p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su
proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di
proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la
retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e
reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo
anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite
adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente
il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente
forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei
canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]
LrsquoAZIONE DELLrsquoATP
La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico
al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco
affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad
esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello
Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che
ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo
di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli
wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli
mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori
dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di
ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di
un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di
quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda
36
subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino
al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave
significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o
sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti
differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra
essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che
attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave
adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non
vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a
cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di
subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico
Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un
substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di
queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un
meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da
F1-ATPasi non sembra escluso
HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE
NEURODEGENERATIVE
RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE
Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel
mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una
pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi
associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione
37
di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di
Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta
promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]
Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90
nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave
funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi
permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]
HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico
Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono
mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)
accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock
citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata
da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante
di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo
stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si
lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei
geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-
shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via
multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di
transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-
translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90
[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e
mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo
shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con
Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)
38
attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da
shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni
Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che
i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro
sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock
termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su
attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato
che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi
di insulti
Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90
e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con
shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La
somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a
topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello
39
Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge
contro aggregati tossici
Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un
aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave
egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di
chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione
incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste
molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente
diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su
espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative
Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie
neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a
mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei
neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia
muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-
pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma
mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme
nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che
Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in
oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza
attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili
[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di
Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt
mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore
di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo
suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro
effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi
40
indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando
monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono
probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono
essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di
atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70
permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]
Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare
spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo
nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un
miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina
[62]
Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il
riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso
lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido
dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli
di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i
motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione
acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni
Riluzolo
Arimoclomol
41
Nei vari modelli cellulari della malattia di Alzheimer (AD) vi egrave un
incremento dei livelli di Hsp70 promossa dalla solubilitagrave e dal legame ai
microtubuli delle proteine tau [63] Hsp70 ha anche inibito la
propensione di aggregazione di Aβ [64] e ridotto la tossicitagrave di Aβ su
culture neuronali [65] Inoltre la proteina precursore dellrsquoamiloide
(APP) eo il suo Aβ amiloide derivato sono bersagli di chaperoni
mediati da clearence [66-67] Nella Drosophila melanogaster e nei
modelli di lievito della malattia di Parkinson (PD) lrsquoespressione diretta
di Hsp70 o la modulazione farmacologica di Hsp ha impedito la perdita
di neuroni causata da alfa-sinucleina [68-69] Huang et al hanno
riportato che questi effetti di Hsp70 si manifestano con lrsquoinibizione della
formazione di fibrille di alfa-sinucleina prevenendo la formazione di
alfa-sinucleina prefibrillare [70] Usando delezioni mutanti di alfa-
sinucleina Luk et al hanno indicato che le interazioni tra il dominio
legante il substrato Hsp70 e la regione del core idrofobico dellrsquoalfa-
sinucleina mediano lrsquoinibizione dellrsquoassemblaggio e che questo
processo di assemblaggio egrave inibito prima della fase di allungamento
[71] Nel complesso in diversi modelli di malattia neurodegenerativa la
sovra espressione di Hsp70 ha migliorato la gravitagrave della malattia di
fenotipi diversi senza incidere visibilmente sulla formazione di
aggregati suggerendo che i chaperoni non impediscono lrsquoaggregazione
di per seacute bensigrave reindirizzano gli aggregati preferibilmente in depositi
amorfi quindi sequestrando specie potenzialmente tossiche dalla
maggior parte della soluzione
42
Lrsquoespressione di Hsp70 e di altre Hsp egrave indotta dallrsquoinibizione
farmacologica di Hsp90
Come riportato sopra lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal
complesso con Hsp90 con susseguente produzione di Hsp (Figura 7) e
lrsquoinduzione di Hsp70 da parte di inibitori di Hsp90 egrave ben documentata
nei modelli di malattie neurodegenerative La geldanamicina (GM) un
inibitore di Hsp90 induce un aumento dose dipendente di Hsp70 nei
modelli di cellule di AD (Alzhaimer) cosigrave come nei neuroni della
corteccia primaria del ratto e riduce la quantitagrave di tau insolubili e dei
livelli basali di acido okadaico indotto da tau fosforilazione [63] Il
trattamento di neuroni primari corticali con lrsquoinibitore di Hsp90 con
struttura purinica il PU24FCI ha portato ad un aumento di Hsp70 dose-
dipendente [72]
PU24FCI
KU32
43
Allo stesso modo la somministrazione di due derivati di PU24FCI
CNS-permeabili il PU-DZ8 [72] ed il EC102 [73] a topi tau transgenici
(htau e JNPL3) ha determinato induzione di Hsp70 nel cervello e
mantenuto gli effetti per 24 ore dopo la somministrazione KU32 un
inibitore di Hsp90 di diversa natura chimica ha indotto Hsp70 in culture
SH-SY5Y di neuroblastoma e la ha protetta da tossicitagrave indotta da Aβ
GM ha attivato una risposta da shock termico ed inibito lrsquoaggregazione
di htt in un modello di coltura cellulare di HD ed ha indotto Hsp70 in
maniera tempo e concentrazione-dipendente ed ha impedito
lrsquoaggregazione di alfa-sinucleina e protetto contro la tossicitagrave in un
modello di aggregazione cellulare di alfa-sinucleina Auluck et al hanno
segnalato che il trattamento di un modello volante di PD con GM ha
protetto completamente contro tossicitagrave per alfa-sinucleina [74] GM ha
protetto anche contro la neurotossicitagrave dopaminergica indotta da 1-metil-
4-fenil-1236-tetraidropiridina (MPTP) in un modello di topo di PD Il
pretrattamento con GM mediante iniezione ventricolare intracerebrale
prima del trattamento con MPTP ha indotto le Hsp70 ed incrementato il
contenuto residuale di dopamina e lrsquoimmuno reattivitagrave della tirosina
idrolasi nel corpo striato [75] Lrsquoinduzione di Hsp70 nel midollo spinale
egrave stata osservata in seguito ad iniezione intraperitoneale di un derivato
della GM il 17-AAG in un modello di SBMA topo [76] Il 17-AAG egrave
stato anche efficace contro la nuerodegenerazione in altre malattie
poliQ Vale a dire ha soppresso la degenerazione dellrsquoocchio e la
formazione di inclusioni del corpo e salvato dalla letalitagrave in un modello
di SCA di Drosophila Ha inoltre soppresso la neurodegenerazione in un
modello volante di HD La riduzione di HSF-1 ha abolito lrsquoinduzione di
chaperoni molecolari e gli effeti terapeutici di 17-AAG sulla
neurodegenerazione poliQ indotta nei modelli di Drosophila facendo
44
arguire che lrsquoeffetto terapeutico di 17-AAG egrave essenzialmente mediato da
HSF-1 [77] Riassumendo lrsquoattivazione di HSF-1 da inibitori di Hsp90
egrave stata notata specificamente in modelli in vivo ed in vitro di malattie
neurodegenerative suggerendo che lrsquoinibizione di Hsp90 puograve essere un
mezzo per modulare i livelli di Hsp in cervelli malati con lrsquoobbiettivo di
proteggere contro le proteine tossiche che si presentano nel corso del
processo neurodegenerativo
Lrsquoinibizione di Hsp90 riduce lrsquoattivitagrave e lrsquoespressione di proteine
neuronali aberranti
In aggiunta alla regolazione di HSF-1 evidenze recenti suggeriscono un
ruolo addizionale per Hsp90 nel mantenimento della stabilitagrave funzionale
della capacitagrave aberrante di proteine neuronali (Figura 8A)
La SBMA egrave una malattia ereditaria dei motoneuroni causata
dallrsquoaccrescimento di un tratto di poliglutamina allrsquointerno del recettore
androgeno (AR) [57]
Le caratteristiche patologiche di SBMA sono perdita dei motoneuroni
nel midollo spinale e nel tronco cerebrale diffusione dellrsquoaccumulo
nucleare inclusioni nucleari di mutanti AR (mAR) nei motoneuroni
residui e in alcuni organi viscerali Waza et al hanno dimostrato che
mAR presente in SBMA egrave una delle proteine regolate da Hsp90 (Figura
8A) [76]
45
Figura 8 Le Hsp90 riparano le proteine neuronali aberranti (A) Proteine neuronali
aberranti regolate da Hsp90 (B) Lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90porta allrsquoinattivazione
o degradazione delle proteine regulate da Hsp90 probabilmente attraverso la via del
proteasoma
Le Hsp90 formano un complesso molecolare con mAR per il
mantenimento della sua stabilitagrave funzionale Sia in modelli cellulari di
SBMA che in topi transgenici lrsquoinibizione di Hsp90 da parte di 17-
AAG il derivato 17 allilammino-17-demetossi della geldanamicina ha
46
portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal
macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati
disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da
destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione
dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di
SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave
rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati
[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori
hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo
sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa
(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni
Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]
Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo
egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali
sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al
hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina
(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi
familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un
complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data
da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto
47
lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della
stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave
dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita
neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei
neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che
codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a
PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson
familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson
suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente
associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che
Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate
con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente
diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina
egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille
ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno
recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di
alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che
sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina
[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce
lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari
Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-
dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento
tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-
sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da
chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di
mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il
macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD
associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-
48
sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative
caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave
caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di
tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD
lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da
unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina
chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta
(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si
era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero
netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un
gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e
Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave
causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma
17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau
[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine
neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso
portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina
mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da
Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei
modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave
patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-
dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla
settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad
una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di
tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno
dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una
diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di
AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le
49
relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la
degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90
[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al
(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave
stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da
GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β
effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi
GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di
Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe
portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in
strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati
indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone
biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione
di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da
parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi
proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di
queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)
Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie
neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio
approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare
dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la
formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione
potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di
Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare
terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare
malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo
centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90
puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione
50
successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti
neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti
clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto
che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono
tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in
modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni
nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati
promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio
spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in
modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di
Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a
lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse
da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase
esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora
rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori
dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per
mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie
neurodegenerative
51
SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-
ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-
METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE
(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE
MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO
SULLA FRAMMENTAZIONE
Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in
risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta
nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine
regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il
ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai
loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine
client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro
cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire
su molti percorsi oncogenici
Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il
nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che
lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati
composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP
attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del
processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono
emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i
tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule
normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina
(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una
maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto
che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una
piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
22
limitate le conoscenzedi come le forme mal ripiegate sono passate a
questo macchinario
CLEARENCE DI AGGREGATI ATTRAVERSO
LrsquoAUTOFAGIA
Egrave sempre piugrave evidente che ci sono una varietagrave di condizioni in vivo che
anche con chaperoni e macchinari proteolitici presenti nello stesso
compartimento come proteine mal ripiegate questi meccanismi di
controllo-qualitagrave falliscono e le proteine mal ripiegate avanzano
formando aggregati Inoltre tali aggregati intracellulari sono associati
con una serie di malattie neurodegenerative come il morbo di
Huntington e di Parkinson La natura e la sorte di aggregati di proteine
nelle cellule eucariotiche egrave stata poco compresa Recentemente egrave stata
sempre piugrave sostenuta unrsquoazione protettiva della formazione di aggregati
piuttosto che unrsquoimmediata azione patogena Per esempio nel caso del
morbo di Huntington lrsquoesame di cellule neuronali in coltura
sovrapproducenti una fusione di poliglutamina espansa e huntingtina-
GFP rivelano che queste cellule contenenti aggregati fluorescenti
morfologicamente visibili esibiscono una migliore viabilitagrave rispetto a
quelle aventi per via diffusionale materiale fluorescente [27] Questo
sembra in accordo con il concetto che si tratta di piccoli assemblati di
proteine mal ripiegate inclusioni non morfologicamente visibili che
esercitano effetti tossici sulle cellule Analogamente un recente
confronto delle dimensioni rispetto a tossicitagrave per gli aggregati di
proteina prionica PrP suggerisce che piccoli aggregati contenenti da una
a due dozzine di molecole sono risultati i piugrave tossici per le cellule [28]
23
Ma le cellule dispongono di meccanismi di compensazione per questi
piccoli aggregati Studi recenti hanno suggerito che la via ubiquitina-
proteosoma possa essere il pilastro della rimozione di specie inclini
allrsquoaggregazione Infatti gli aggregati rilevati nel contesto di
neurodegenerazione di solito sono reattivi con gli anticorpi anti-
ubiquitina il che implica che le specie mal ripiegate sono state
riconosciute dal sistema di coniugazione dellubiquitina Eppure vari
studi di questi ultimi anni indicano che queste proteine modificate
rappresentano una sfida particolare per proteasomi che possono portare
alla loro inibizione [29 ab] Il meccanismo di questa inattivazione
rimane sconosciuto ma puograve coinvolgere il soffocamento della camera
del proteasoma [30]
Anatomia del proteasoma Il proteasoma egrave una macromolecola proteica del peso di circa 2 milioni
di Daltons Ersquo formata da ununitagrave base centrale (core) e 2 cappucci agli estremi (cap) Il core egrave
formato a sua volta da 4 anelli ciascuno costituito da 7 unitagrave proteiche I due ldquocaprdquo attaccati alle
due estremitagrave del core cilindrico consistono ciascuno di 20 subunitagrave
24
Ora sembra che la modifica dellrsquoubiquitina possa reclutare specie
aggregate mediante una via indipendente lrsquoAUTOFAGIA Lrsquoautofagia
implica il riconoscimento e lrsquoimpacchettamentofagocitazione di
proteine specifiche o organelli in vescicole autofagosomiche che si
fondono con i lisosomi in cui sia le vescicole che il loro contenuto sono
scomposti Piugrave di 20 componenti cosiddetti Atg (geni coinvolti
nellrsquoautofagia) mediano questo processo straordinario Recenti studi
hanno dimostrato che componenti centrali della formazione di autosomi
nei topi hanno attivitagrave nei tessuti dei mammiferi Per esempio carenza
di atg5 ha portato alla morte di animali appena nati a causa
dellrsquoincapacitagrave di fornire un apporto di aminoacidi attraverso la
degradazione di proteine del corpo durante la condizione di fame
relativa allrsquoimmediato periodo post-natale Sorprendentemente in un
altro studio in cui egrave stata indotta una carenza di atg7 piugrave avanti nella
vita con un gene ldquofloxedrdquo lrsquoaccumulo di aggregati positivi
allrsquoubiquitina egrave stata osservata nel fegato degli animali che sono stati
disabilitati nella produzione di autofagosomi La funzione del
proteasoma in questi animali egrave rimasta inalterata contenente specie mal
ripiegate etichettate con ubiquitina e possono essere eliminate attraverso
autofagia Egrave stato poi scoperto un componente denominato p62 (o
sequestosoma1) che costituisce un guscio attorno agli aggregati di
huntingtina [31] Questa proteina contiene un dominio C-terminale
associato allrsquoubiquitina (UBA) che puograve legare poliubiquitine in modo
tale che p62 si collochi con lrsquoubiquitina quando espressa in cellule
HeLa Inoltre nelle cellule che esprimono huntigtina p62 si associa con
LC3 una proteina localizzata negli autofagosomi In accordo con quanto
riportato e cioegrave che lrsquoautofagia riduce i livelli di aggregati di
huntingtina e con un ruolo critico di p62 in questo processo lrsquoinibizione
25
antisenso mediata dallrsquoesperessione di p62 aumenta lrsquoapoptosi delle
cellule che esprimono huntungtina Quindi sembra che la modifica
dellrsquoubiquitina delle proteine difettose possa offrire un ingresso sia al
sistema proteasoma o in contesti dove lrsquoaggregazione egrave in corso al
sistema autofagia
SISTEMI CHAPERONI HSP70
Le Hsp70 proteine dello shock termico di 70 KDa sono impegnate in
una serie di processi tra cui il ripiegamento di proteine di nuova sintesi
il trasporto delle proteine attraverso membrane il ripiegamento di
proteine mal ripiegate ed aggregate e il controllo delle attivitagrave delle
proteine regolatrici Questa versatilitagrave egrave ottenuta attraverso
lampliamento e la diversificazione evolutiva di geni hsp70 che ha
generato sia chaperoni Hsp70 specifici Hsp110 e proteine Hsp170 La
versatilitagrave egrave determinata attraverso lrsquoimpiego di cochaperoni proteine J
e fattori di scambio di nucleotide (NEF) che regolano lrsquoattivitagrave di Hsp70
(Figura 4)
26
Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame
del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una
Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)
Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la
proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato
allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del
substrato
Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre
specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb
Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di
legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un
numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame
dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi
Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina
Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni
Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali
di Hsp70 con se stesso
27
INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70
Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di
proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura
xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding
appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide
N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD
adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio
elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con
lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante
chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco
tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini
di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di
comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura
di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione
La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la
tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo
coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture
precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una
proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da
una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β
ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica
compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio
elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di
legame del substrato (Figura 5)
28
Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo
substrato
La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra
domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che
collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo
solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi
residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame
allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A
dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso
Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un
legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in
nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano
completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve
entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo
fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui
coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del
segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti
integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A
29
capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il
quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di
ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a
idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di
DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro
catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente
arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia
drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete
crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la
barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK
costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina
superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura
della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera
attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della
prolina
DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-
NUCLEOTIDE
Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi
meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono
fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la
liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del
substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la
dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine
BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave
dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con
30
funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S
cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1
(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la
disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e
HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70
fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi
della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente
indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene
GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg
di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei
nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte
posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i
nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario
BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in
modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del
complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si
compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo
Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva
[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con
conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve
indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca
di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di
convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la
reazione di scambio nucleotidica di Hsp70
31
LEGAMI Hsp70-Hsp70
Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro
della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In
particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce
come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola
lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di
questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento
Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il
cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che
sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi
eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente
lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se
non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di
complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di
nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di
scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione
importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto
di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel
folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle
Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza
proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa
con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere
coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di
traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina
Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come
sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le
interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di
32
Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi
SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua
attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano
legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di
idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede
possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano
lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina
stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che
Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami
con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina
J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di
stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega
bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o
Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non
limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che
la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-
associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con
Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito
meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande
aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante
per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70
AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP
Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli
AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione
disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]
33
Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un
anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del
proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico
20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA
svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP
Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104
nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico
per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste
attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come
una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-
etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE
per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla
fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il
meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere
tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria
per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli
anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una
parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali
suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata
assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando
una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a
spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad
entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel
caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro
che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti
dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una
proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In
parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno
34
individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi
domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre
interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta
apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati
che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la
questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)
Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97
Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da
proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad
entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro
efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non
devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati
dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte
lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono
piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte
superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine
adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il
35
movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori
p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su
proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di
proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la
retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e
reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo
anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite
adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente
il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente
forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei
canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]
LrsquoAZIONE DELLrsquoATP
La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico
al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco
affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad
esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello
Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che
ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo
di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli
wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli
mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori
dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di
ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di
un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di
quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda
36
subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino
al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave
significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o
sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti
differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra
essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che
attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave
adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non
vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a
cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di
subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico
Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un
substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di
queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un
meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da
F1-ATPasi non sembra escluso
HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE
NEURODEGENERATIVE
RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE
Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel
mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una
pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi
associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione
37
di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di
Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta
promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]
Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90
nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave
funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi
permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]
HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico
Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono
mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)
accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock
citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata
da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante
di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo
stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si
lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei
geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-
shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via
multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di
transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-
translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90
[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e
mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo
shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con
Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)
38
attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da
shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni
Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che
i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro
sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock
termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su
attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato
che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi
di insulti
Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90
e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con
shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La
somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a
topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello
39
Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge
contro aggregati tossici
Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un
aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave
egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di
chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione
incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste
molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente
diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su
espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative
Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie
neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a
mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei
neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia
muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-
pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma
mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme
nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che
Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in
oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza
attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili
[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di
Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt
mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore
di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo
suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro
effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi
40
indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando
monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono
probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono
essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di
atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70
permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]
Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare
spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo
nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un
miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina
[62]
Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il
riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso
lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido
dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli
di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i
motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione
acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni
Riluzolo
Arimoclomol
41
Nei vari modelli cellulari della malattia di Alzheimer (AD) vi egrave un
incremento dei livelli di Hsp70 promossa dalla solubilitagrave e dal legame ai
microtubuli delle proteine tau [63] Hsp70 ha anche inibito la
propensione di aggregazione di Aβ [64] e ridotto la tossicitagrave di Aβ su
culture neuronali [65] Inoltre la proteina precursore dellrsquoamiloide
(APP) eo il suo Aβ amiloide derivato sono bersagli di chaperoni
mediati da clearence [66-67] Nella Drosophila melanogaster e nei
modelli di lievito della malattia di Parkinson (PD) lrsquoespressione diretta
di Hsp70 o la modulazione farmacologica di Hsp ha impedito la perdita
di neuroni causata da alfa-sinucleina [68-69] Huang et al hanno
riportato che questi effetti di Hsp70 si manifestano con lrsquoinibizione della
formazione di fibrille di alfa-sinucleina prevenendo la formazione di
alfa-sinucleina prefibrillare [70] Usando delezioni mutanti di alfa-
sinucleina Luk et al hanno indicato che le interazioni tra il dominio
legante il substrato Hsp70 e la regione del core idrofobico dellrsquoalfa-
sinucleina mediano lrsquoinibizione dellrsquoassemblaggio e che questo
processo di assemblaggio egrave inibito prima della fase di allungamento
[71] Nel complesso in diversi modelli di malattia neurodegenerativa la
sovra espressione di Hsp70 ha migliorato la gravitagrave della malattia di
fenotipi diversi senza incidere visibilmente sulla formazione di
aggregati suggerendo che i chaperoni non impediscono lrsquoaggregazione
di per seacute bensigrave reindirizzano gli aggregati preferibilmente in depositi
amorfi quindi sequestrando specie potenzialmente tossiche dalla
maggior parte della soluzione
42
Lrsquoespressione di Hsp70 e di altre Hsp egrave indotta dallrsquoinibizione
farmacologica di Hsp90
Come riportato sopra lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal
complesso con Hsp90 con susseguente produzione di Hsp (Figura 7) e
lrsquoinduzione di Hsp70 da parte di inibitori di Hsp90 egrave ben documentata
nei modelli di malattie neurodegenerative La geldanamicina (GM) un
inibitore di Hsp90 induce un aumento dose dipendente di Hsp70 nei
modelli di cellule di AD (Alzhaimer) cosigrave come nei neuroni della
corteccia primaria del ratto e riduce la quantitagrave di tau insolubili e dei
livelli basali di acido okadaico indotto da tau fosforilazione [63] Il
trattamento di neuroni primari corticali con lrsquoinibitore di Hsp90 con
struttura purinica il PU24FCI ha portato ad un aumento di Hsp70 dose-
dipendente [72]
PU24FCI
KU32
43
Allo stesso modo la somministrazione di due derivati di PU24FCI
CNS-permeabili il PU-DZ8 [72] ed il EC102 [73] a topi tau transgenici
(htau e JNPL3) ha determinato induzione di Hsp70 nel cervello e
mantenuto gli effetti per 24 ore dopo la somministrazione KU32 un
inibitore di Hsp90 di diversa natura chimica ha indotto Hsp70 in culture
SH-SY5Y di neuroblastoma e la ha protetta da tossicitagrave indotta da Aβ
GM ha attivato una risposta da shock termico ed inibito lrsquoaggregazione
di htt in un modello di coltura cellulare di HD ed ha indotto Hsp70 in
maniera tempo e concentrazione-dipendente ed ha impedito
lrsquoaggregazione di alfa-sinucleina e protetto contro la tossicitagrave in un
modello di aggregazione cellulare di alfa-sinucleina Auluck et al hanno
segnalato che il trattamento di un modello volante di PD con GM ha
protetto completamente contro tossicitagrave per alfa-sinucleina [74] GM ha
protetto anche contro la neurotossicitagrave dopaminergica indotta da 1-metil-
4-fenil-1236-tetraidropiridina (MPTP) in un modello di topo di PD Il
pretrattamento con GM mediante iniezione ventricolare intracerebrale
prima del trattamento con MPTP ha indotto le Hsp70 ed incrementato il
contenuto residuale di dopamina e lrsquoimmuno reattivitagrave della tirosina
idrolasi nel corpo striato [75] Lrsquoinduzione di Hsp70 nel midollo spinale
egrave stata osservata in seguito ad iniezione intraperitoneale di un derivato
della GM il 17-AAG in un modello di SBMA topo [76] Il 17-AAG egrave
stato anche efficace contro la nuerodegenerazione in altre malattie
poliQ Vale a dire ha soppresso la degenerazione dellrsquoocchio e la
formazione di inclusioni del corpo e salvato dalla letalitagrave in un modello
di SCA di Drosophila Ha inoltre soppresso la neurodegenerazione in un
modello volante di HD La riduzione di HSF-1 ha abolito lrsquoinduzione di
chaperoni molecolari e gli effeti terapeutici di 17-AAG sulla
neurodegenerazione poliQ indotta nei modelli di Drosophila facendo
44
arguire che lrsquoeffetto terapeutico di 17-AAG egrave essenzialmente mediato da
HSF-1 [77] Riassumendo lrsquoattivazione di HSF-1 da inibitori di Hsp90
egrave stata notata specificamente in modelli in vivo ed in vitro di malattie
neurodegenerative suggerendo che lrsquoinibizione di Hsp90 puograve essere un
mezzo per modulare i livelli di Hsp in cervelli malati con lrsquoobbiettivo di
proteggere contro le proteine tossiche che si presentano nel corso del
processo neurodegenerativo
Lrsquoinibizione di Hsp90 riduce lrsquoattivitagrave e lrsquoespressione di proteine
neuronali aberranti
In aggiunta alla regolazione di HSF-1 evidenze recenti suggeriscono un
ruolo addizionale per Hsp90 nel mantenimento della stabilitagrave funzionale
della capacitagrave aberrante di proteine neuronali (Figura 8A)
La SBMA egrave una malattia ereditaria dei motoneuroni causata
dallrsquoaccrescimento di un tratto di poliglutamina allrsquointerno del recettore
androgeno (AR) [57]
Le caratteristiche patologiche di SBMA sono perdita dei motoneuroni
nel midollo spinale e nel tronco cerebrale diffusione dellrsquoaccumulo
nucleare inclusioni nucleari di mutanti AR (mAR) nei motoneuroni
residui e in alcuni organi viscerali Waza et al hanno dimostrato che
mAR presente in SBMA egrave una delle proteine regolate da Hsp90 (Figura
8A) [76]
45
Figura 8 Le Hsp90 riparano le proteine neuronali aberranti (A) Proteine neuronali
aberranti regolate da Hsp90 (B) Lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90porta allrsquoinattivazione
o degradazione delle proteine regulate da Hsp90 probabilmente attraverso la via del
proteasoma
Le Hsp90 formano un complesso molecolare con mAR per il
mantenimento della sua stabilitagrave funzionale Sia in modelli cellulari di
SBMA che in topi transgenici lrsquoinibizione di Hsp90 da parte di 17-
AAG il derivato 17 allilammino-17-demetossi della geldanamicina ha
46
portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal
macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati
disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da
destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione
dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di
SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave
rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati
[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori
hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo
sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa
(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni
Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]
Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo
egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali
sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al
hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina
(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi
familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un
complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data
da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto
47
lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della
stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave
dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita
neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei
neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che
codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a
PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson
familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson
suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente
associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che
Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate
con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente
diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina
egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille
ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno
recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di
alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che
sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina
[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce
lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari
Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-
dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento
tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-
sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da
chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di
mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il
macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD
associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-
48
sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative
caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave
caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di
tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD
lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da
unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina
chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta
(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si
era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero
netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un
gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e
Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave
causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma
17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau
[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine
neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso
portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina
mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da
Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei
modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave
patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-
dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla
settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad
una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di
tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno
dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una
diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di
AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le
49
relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la
degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90
[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al
(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave
stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da
GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β
effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi
GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di
Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe
portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in
strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati
indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone
biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione
di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da
parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi
proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di
queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)
Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie
neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio
approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare
dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la
formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione
potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di
Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare
terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare
malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo
centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90
puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione
50
successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti
neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti
clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto
che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono
tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in
modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni
nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati
promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio
spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in
modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di
Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a
lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse
da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase
esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora
rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori
dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per
mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie
neurodegenerative
51
SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-
ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-
METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE
(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE
MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO
SULLA FRAMMENTAZIONE
Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in
risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta
nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine
regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il
ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai
loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine
client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro
cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire
su molti percorsi oncogenici
Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il
nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che
lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati
composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP
attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del
processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono
emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i
tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule
normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina
(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una
maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto
che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una
piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
23
Ma le cellule dispongono di meccanismi di compensazione per questi
piccoli aggregati Studi recenti hanno suggerito che la via ubiquitina-
proteosoma possa essere il pilastro della rimozione di specie inclini
allrsquoaggregazione Infatti gli aggregati rilevati nel contesto di
neurodegenerazione di solito sono reattivi con gli anticorpi anti-
ubiquitina il che implica che le specie mal ripiegate sono state
riconosciute dal sistema di coniugazione dellubiquitina Eppure vari
studi di questi ultimi anni indicano che queste proteine modificate
rappresentano una sfida particolare per proteasomi che possono portare
alla loro inibizione [29 ab] Il meccanismo di questa inattivazione
rimane sconosciuto ma puograve coinvolgere il soffocamento della camera
del proteasoma [30]
Anatomia del proteasoma Il proteasoma egrave una macromolecola proteica del peso di circa 2 milioni
di Daltons Ersquo formata da ununitagrave base centrale (core) e 2 cappucci agli estremi (cap) Il core egrave
formato a sua volta da 4 anelli ciascuno costituito da 7 unitagrave proteiche I due ldquocaprdquo attaccati alle
due estremitagrave del core cilindrico consistono ciascuno di 20 subunitagrave
24
Ora sembra che la modifica dellrsquoubiquitina possa reclutare specie
aggregate mediante una via indipendente lrsquoAUTOFAGIA Lrsquoautofagia
implica il riconoscimento e lrsquoimpacchettamentofagocitazione di
proteine specifiche o organelli in vescicole autofagosomiche che si
fondono con i lisosomi in cui sia le vescicole che il loro contenuto sono
scomposti Piugrave di 20 componenti cosiddetti Atg (geni coinvolti
nellrsquoautofagia) mediano questo processo straordinario Recenti studi
hanno dimostrato che componenti centrali della formazione di autosomi
nei topi hanno attivitagrave nei tessuti dei mammiferi Per esempio carenza
di atg5 ha portato alla morte di animali appena nati a causa
dellrsquoincapacitagrave di fornire un apporto di aminoacidi attraverso la
degradazione di proteine del corpo durante la condizione di fame
relativa allrsquoimmediato periodo post-natale Sorprendentemente in un
altro studio in cui egrave stata indotta una carenza di atg7 piugrave avanti nella
vita con un gene ldquofloxedrdquo lrsquoaccumulo di aggregati positivi
allrsquoubiquitina egrave stata osservata nel fegato degli animali che sono stati
disabilitati nella produzione di autofagosomi La funzione del
proteasoma in questi animali egrave rimasta inalterata contenente specie mal
ripiegate etichettate con ubiquitina e possono essere eliminate attraverso
autofagia Egrave stato poi scoperto un componente denominato p62 (o
sequestosoma1) che costituisce un guscio attorno agli aggregati di
huntingtina [31] Questa proteina contiene un dominio C-terminale
associato allrsquoubiquitina (UBA) che puograve legare poliubiquitine in modo
tale che p62 si collochi con lrsquoubiquitina quando espressa in cellule
HeLa Inoltre nelle cellule che esprimono huntigtina p62 si associa con
LC3 una proteina localizzata negli autofagosomi In accordo con quanto
riportato e cioegrave che lrsquoautofagia riduce i livelli di aggregati di
huntingtina e con un ruolo critico di p62 in questo processo lrsquoinibizione
25
antisenso mediata dallrsquoesperessione di p62 aumenta lrsquoapoptosi delle
cellule che esprimono huntungtina Quindi sembra che la modifica
dellrsquoubiquitina delle proteine difettose possa offrire un ingresso sia al
sistema proteasoma o in contesti dove lrsquoaggregazione egrave in corso al
sistema autofagia
SISTEMI CHAPERONI HSP70
Le Hsp70 proteine dello shock termico di 70 KDa sono impegnate in
una serie di processi tra cui il ripiegamento di proteine di nuova sintesi
il trasporto delle proteine attraverso membrane il ripiegamento di
proteine mal ripiegate ed aggregate e il controllo delle attivitagrave delle
proteine regolatrici Questa versatilitagrave egrave ottenuta attraverso
lampliamento e la diversificazione evolutiva di geni hsp70 che ha
generato sia chaperoni Hsp70 specifici Hsp110 e proteine Hsp170 La
versatilitagrave egrave determinata attraverso lrsquoimpiego di cochaperoni proteine J
e fattori di scambio di nucleotide (NEF) che regolano lrsquoattivitagrave di Hsp70
(Figura 4)
26
Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame
del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una
Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)
Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la
proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato
allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del
substrato
Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre
specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb
Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di
legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un
numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame
dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi
Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina
Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni
Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali
di Hsp70 con se stesso
27
INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70
Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di
proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura
xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding
appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide
N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD
adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio
elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con
lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante
chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco
tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini
di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di
comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura
di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione
La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la
tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo
coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture
precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una
proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da
una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β
ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica
compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio
elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di
legame del substrato (Figura 5)
28
Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo
substrato
La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra
domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che
collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo
solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi
residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame
allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A
dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso
Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un
legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in
nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano
completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve
entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo
fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui
coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del
segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti
integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A
29
capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il
quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di
ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a
idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di
DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro
catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente
arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia
drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete
crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la
barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK
costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina
superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura
della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera
attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della
prolina
DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-
NUCLEOTIDE
Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi
meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono
fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la
liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del
substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la
dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine
BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave
dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con
30
funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S
cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1
(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la
disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e
HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70
fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi
della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente
indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene
GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg
di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei
nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte
posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i
nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario
BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in
modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del
complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si
compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo
Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva
[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con
conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve
indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca
di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di
convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la
reazione di scambio nucleotidica di Hsp70
31
LEGAMI Hsp70-Hsp70
Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro
della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In
particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce
come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola
lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di
questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento
Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il
cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che
sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi
eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente
lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se
non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di
complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di
nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di
scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione
importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto
di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel
folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle
Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza
proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa
con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere
coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di
traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina
Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come
sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le
interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di
32
Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi
SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua
attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano
legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di
idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede
possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano
lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina
stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che
Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami
con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina
J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di
stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega
bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o
Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non
limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che
la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-
associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con
Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito
meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande
aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante
per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70
AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP
Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli
AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione
disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]
33
Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un
anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del
proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico
20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA
svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP
Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104
nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico
per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste
attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come
una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-
etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE
per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla
fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il
meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere
tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria
per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli
anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una
parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali
suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata
assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando
una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a
spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad
entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel
caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro
che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti
dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una
proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In
parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno
34
individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi
domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre
interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta
apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati
che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la
questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)
Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97
Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da
proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad
entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro
efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non
devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati
dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte
lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono
piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte
superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine
adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il
35
movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori
p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su
proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di
proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la
retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e
reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo
anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite
adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente
il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente
forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei
canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]
LrsquoAZIONE DELLrsquoATP
La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico
al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco
affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad
esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello
Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che
ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo
di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli
wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli
mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori
dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di
ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di
un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di
quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda
36
subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino
al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave
significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o
sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti
differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra
essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che
attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave
adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non
vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a
cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di
subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico
Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un
substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di
queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un
meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da
F1-ATPasi non sembra escluso
HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE
NEURODEGENERATIVE
RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE
Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel
mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una
pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi
associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione
37
di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di
Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta
promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]
Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90
nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave
funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi
permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]
HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico
Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono
mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)
accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock
citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata
da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante
di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo
stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si
lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei
geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-
shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via
multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di
transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-
translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90
[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e
mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo
shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con
Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)
38
attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da
shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni
Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che
i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro
sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock
termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su
attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato
che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi
di insulti
Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90
e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con
shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La
somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a
topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello
39
Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge
contro aggregati tossici
Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un
aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave
egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di
chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione
incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste
molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente
diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su
espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative
Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie
neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a
mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei
neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia
muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-
pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma
mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme
nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che
Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in
oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza
attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili
[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di
Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt
mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore
di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo
suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro
effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi
40
indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando
monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono
probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono
essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di
atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70
permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]
Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare
spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo
nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un
miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina
[62]
Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il
riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso
lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido
dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli
di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i
motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione
acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni
Riluzolo
Arimoclomol
41
Nei vari modelli cellulari della malattia di Alzheimer (AD) vi egrave un
incremento dei livelli di Hsp70 promossa dalla solubilitagrave e dal legame ai
microtubuli delle proteine tau [63] Hsp70 ha anche inibito la
propensione di aggregazione di Aβ [64] e ridotto la tossicitagrave di Aβ su
culture neuronali [65] Inoltre la proteina precursore dellrsquoamiloide
(APP) eo il suo Aβ amiloide derivato sono bersagli di chaperoni
mediati da clearence [66-67] Nella Drosophila melanogaster e nei
modelli di lievito della malattia di Parkinson (PD) lrsquoespressione diretta
di Hsp70 o la modulazione farmacologica di Hsp ha impedito la perdita
di neuroni causata da alfa-sinucleina [68-69] Huang et al hanno
riportato che questi effetti di Hsp70 si manifestano con lrsquoinibizione della
formazione di fibrille di alfa-sinucleina prevenendo la formazione di
alfa-sinucleina prefibrillare [70] Usando delezioni mutanti di alfa-
sinucleina Luk et al hanno indicato che le interazioni tra il dominio
legante il substrato Hsp70 e la regione del core idrofobico dellrsquoalfa-
sinucleina mediano lrsquoinibizione dellrsquoassemblaggio e che questo
processo di assemblaggio egrave inibito prima della fase di allungamento
[71] Nel complesso in diversi modelli di malattia neurodegenerativa la
sovra espressione di Hsp70 ha migliorato la gravitagrave della malattia di
fenotipi diversi senza incidere visibilmente sulla formazione di
aggregati suggerendo che i chaperoni non impediscono lrsquoaggregazione
di per seacute bensigrave reindirizzano gli aggregati preferibilmente in depositi
amorfi quindi sequestrando specie potenzialmente tossiche dalla
maggior parte della soluzione
42
Lrsquoespressione di Hsp70 e di altre Hsp egrave indotta dallrsquoinibizione
farmacologica di Hsp90
Come riportato sopra lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal
complesso con Hsp90 con susseguente produzione di Hsp (Figura 7) e
lrsquoinduzione di Hsp70 da parte di inibitori di Hsp90 egrave ben documentata
nei modelli di malattie neurodegenerative La geldanamicina (GM) un
inibitore di Hsp90 induce un aumento dose dipendente di Hsp70 nei
modelli di cellule di AD (Alzhaimer) cosigrave come nei neuroni della
corteccia primaria del ratto e riduce la quantitagrave di tau insolubili e dei
livelli basali di acido okadaico indotto da tau fosforilazione [63] Il
trattamento di neuroni primari corticali con lrsquoinibitore di Hsp90 con
struttura purinica il PU24FCI ha portato ad un aumento di Hsp70 dose-
dipendente [72]
PU24FCI
KU32
43
Allo stesso modo la somministrazione di due derivati di PU24FCI
CNS-permeabili il PU-DZ8 [72] ed il EC102 [73] a topi tau transgenici
(htau e JNPL3) ha determinato induzione di Hsp70 nel cervello e
mantenuto gli effetti per 24 ore dopo la somministrazione KU32 un
inibitore di Hsp90 di diversa natura chimica ha indotto Hsp70 in culture
SH-SY5Y di neuroblastoma e la ha protetta da tossicitagrave indotta da Aβ
GM ha attivato una risposta da shock termico ed inibito lrsquoaggregazione
di htt in un modello di coltura cellulare di HD ed ha indotto Hsp70 in
maniera tempo e concentrazione-dipendente ed ha impedito
lrsquoaggregazione di alfa-sinucleina e protetto contro la tossicitagrave in un
modello di aggregazione cellulare di alfa-sinucleina Auluck et al hanno
segnalato che il trattamento di un modello volante di PD con GM ha
protetto completamente contro tossicitagrave per alfa-sinucleina [74] GM ha
protetto anche contro la neurotossicitagrave dopaminergica indotta da 1-metil-
4-fenil-1236-tetraidropiridina (MPTP) in un modello di topo di PD Il
pretrattamento con GM mediante iniezione ventricolare intracerebrale
prima del trattamento con MPTP ha indotto le Hsp70 ed incrementato il
contenuto residuale di dopamina e lrsquoimmuno reattivitagrave della tirosina
idrolasi nel corpo striato [75] Lrsquoinduzione di Hsp70 nel midollo spinale
egrave stata osservata in seguito ad iniezione intraperitoneale di un derivato
della GM il 17-AAG in un modello di SBMA topo [76] Il 17-AAG egrave
stato anche efficace contro la nuerodegenerazione in altre malattie
poliQ Vale a dire ha soppresso la degenerazione dellrsquoocchio e la
formazione di inclusioni del corpo e salvato dalla letalitagrave in un modello
di SCA di Drosophila Ha inoltre soppresso la neurodegenerazione in un
modello volante di HD La riduzione di HSF-1 ha abolito lrsquoinduzione di
chaperoni molecolari e gli effeti terapeutici di 17-AAG sulla
neurodegenerazione poliQ indotta nei modelli di Drosophila facendo
44
arguire che lrsquoeffetto terapeutico di 17-AAG egrave essenzialmente mediato da
HSF-1 [77] Riassumendo lrsquoattivazione di HSF-1 da inibitori di Hsp90
egrave stata notata specificamente in modelli in vivo ed in vitro di malattie
neurodegenerative suggerendo che lrsquoinibizione di Hsp90 puograve essere un
mezzo per modulare i livelli di Hsp in cervelli malati con lrsquoobbiettivo di
proteggere contro le proteine tossiche che si presentano nel corso del
processo neurodegenerativo
Lrsquoinibizione di Hsp90 riduce lrsquoattivitagrave e lrsquoespressione di proteine
neuronali aberranti
In aggiunta alla regolazione di HSF-1 evidenze recenti suggeriscono un
ruolo addizionale per Hsp90 nel mantenimento della stabilitagrave funzionale
della capacitagrave aberrante di proteine neuronali (Figura 8A)
La SBMA egrave una malattia ereditaria dei motoneuroni causata
dallrsquoaccrescimento di un tratto di poliglutamina allrsquointerno del recettore
androgeno (AR) [57]
Le caratteristiche patologiche di SBMA sono perdita dei motoneuroni
nel midollo spinale e nel tronco cerebrale diffusione dellrsquoaccumulo
nucleare inclusioni nucleari di mutanti AR (mAR) nei motoneuroni
residui e in alcuni organi viscerali Waza et al hanno dimostrato che
mAR presente in SBMA egrave una delle proteine regolate da Hsp90 (Figura
8A) [76]
45
Figura 8 Le Hsp90 riparano le proteine neuronali aberranti (A) Proteine neuronali
aberranti regolate da Hsp90 (B) Lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90porta allrsquoinattivazione
o degradazione delle proteine regulate da Hsp90 probabilmente attraverso la via del
proteasoma
Le Hsp90 formano un complesso molecolare con mAR per il
mantenimento della sua stabilitagrave funzionale Sia in modelli cellulari di
SBMA che in topi transgenici lrsquoinibizione di Hsp90 da parte di 17-
AAG il derivato 17 allilammino-17-demetossi della geldanamicina ha
46
portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal
macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati
disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da
destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione
dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di
SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave
rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati
[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori
hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo
sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa
(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni
Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]
Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo
egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali
sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al
hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina
(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi
familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un
complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data
da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto
47
lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della
stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave
dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita
neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei
neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che
codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a
PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson
familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson
suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente
associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che
Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate
con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente
diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina
egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille
ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno
recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di
alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che
sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina
[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce
lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari
Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-
dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento
tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-
sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da
chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di
mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il
macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD
associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-
48
sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative
caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave
caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di
tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD
lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da
unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina
chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta
(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si
era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero
netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un
gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e
Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave
causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma
17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau
[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine
neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso
portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina
mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da
Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei
modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave
patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-
dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla
settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad
una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di
tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno
dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una
diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di
AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le
49
relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la
degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90
[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al
(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave
stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da
GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β
effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi
GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di
Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe
portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in
strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati
indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone
biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione
di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da
parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi
proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di
queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)
Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie
neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio
approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare
dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la
formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione
potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di
Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare
terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare
malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo
centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90
puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione
50
successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti
neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti
clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto
che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono
tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in
modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni
nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati
promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio
spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in
modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di
Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a
lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse
da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase
esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora
rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori
dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per
mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie
neurodegenerative
51
SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-
ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-
METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE
(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE
MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO
SULLA FRAMMENTAZIONE
Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in
risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta
nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine
regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il
ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai
loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine
client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro
cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire
su molti percorsi oncogenici
Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il
nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che
lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati
composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP
attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del
processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono
emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i
tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule
normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina
(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una
maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto
che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una
piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
24
Ora sembra che la modifica dellrsquoubiquitina possa reclutare specie
aggregate mediante una via indipendente lrsquoAUTOFAGIA Lrsquoautofagia
implica il riconoscimento e lrsquoimpacchettamentofagocitazione di
proteine specifiche o organelli in vescicole autofagosomiche che si
fondono con i lisosomi in cui sia le vescicole che il loro contenuto sono
scomposti Piugrave di 20 componenti cosiddetti Atg (geni coinvolti
nellrsquoautofagia) mediano questo processo straordinario Recenti studi
hanno dimostrato che componenti centrali della formazione di autosomi
nei topi hanno attivitagrave nei tessuti dei mammiferi Per esempio carenza
di atg5 ha portato alla morte di animali appena nati a causa
dellrsquoincapacitagrave di fornire un apporto di aminoacidi attraverso la
degradazione di proteine del corpo durante la condizione di fame
relativa allrsquoimmediato periodo post-natale Sorprendentemente in un
altro studio in cui egrave stata indotta una carenza di atg7 piugrave avanti nella
vita con un gene ldquofloxedrdquo lrsquoaccumulo di aggregati positivi
allrsquoubiquitina egrave stata osservata nel fegato degli animali che sono stati
disabilitati nella produzione di autofagosomi La funzione del
proteasoma in questi animali egrave rimasta inalterata contenente specie mal
ripiegate etichettate con ubiquitina e possono essere eliminate attraverso
autofagia Egrave stato poi scoperto un componente denominato p62 (o
sequestosoma1) che costituisce un guscio attorno agli aggregati di
huntingtina [31] Questa proteina contiene un dominio C-terminale
associato allrsquoubiquitina (UBA) che puograve legare poliubiquitine in modo
tale che p62 si collochi con lrsquoubiquitina quando espressa in cellule
HeLa Inoltre nelle cellule che esprimono huntigtina p62 si associa con
LC3 una proteina localizzata negli autofagosomi In accordo con quanto
riportato e cioegrave che lrsquoautofagia riduce i livelli di aggregati di
huntingtina e con un ruolo critico di p62 in questo processo lrsquoinibizione
25
antisenso mediata dallrsquoesperessione di p62 aumenta lrsquoapoptosi delle
cellule che esprimono huntungtina Quindi sembra che la modifica
dellrsquoubiquitina delle proteine difettose possa offrire un ingresso sia al
sistema proteasoma o in contesti dove lrsquoaggregazione egrave in corso al
sistema autofagia
SISTEMI CHAPERONI HSP70
Le Hsp70 proteine dello shock termico di 70 KDa sono impegnate in
una serie di processi tra cui il ripiegamento di proteine di nuova sintesi
il trasporto delle proteine attraverso membrane il ripiegamento di
proteine mal ripiegate ed aggregate e il controllo delle attivitagrave delle
proteine regolatrici Questa versatilitagrave egrave ottenuta attraverso
lampliamento e la diversificazione evolutiva di geni hsp70 che ha
generato sia chaperoni Hsp70 specifici Hsp110 e proteine Hsp170 La
versatilitagrave egrave determinata attraverso lrsquoimpiego di cochaperoni proteine J
e fattori di scambio di nucleotide (NEF) che regolano lrsquoattivitagrave di Hsp70
(Figura 4)
26
Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame
del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una
Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)
Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la
proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato
allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del
substrato
Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre
specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb
Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di
legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un
numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame
dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi
Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina
Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni
Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali
di Hsp70 con se stesso
27
INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70
Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di
proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura
xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding
appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide
N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD
adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio
elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con
lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante
chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco
tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini
di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di
comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura
di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione
La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la
tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo
coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture
precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una
proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da
una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β
ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica
compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio
elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di
legame del substrato (Figura 5)
28
Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo
substrato
La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra
domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che
collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo
solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi
residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame
allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A
dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso
Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un
legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in
nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano
completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve
entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo
fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui
coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del
segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti
integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A
29
capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il
quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di
ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a
idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di
DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro
catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente
arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia
drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete
crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la
barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK
costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina
superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura
della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera
attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della
prolina
DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-
NUCLEOTIDE
Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi
meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono
fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la
liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del
substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la
dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine
BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave
dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con
30
funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S
cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1
(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la
disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e
HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70
fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi
della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente
indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene
GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg
di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei
nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte
posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i
nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario
BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in
modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del
complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si
compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo
Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva
[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con
conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve
indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca
di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di
convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la
reazione di scambio nucleotidica di Hsp70
31
LEGAMI Hsp70-Hsp70
Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro
della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In
particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce
come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola
lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di
questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento
Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il
cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che
sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi
eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente
lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se
non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di
complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di
nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di
scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione
importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto
di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel
folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle
Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza
proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa
con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere
coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di
traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina
Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come
sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le
interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di
32
Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi
SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua
attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano
legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di
idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede
possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano
lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina
stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che
Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami
con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina
J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di
stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega
bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o
Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non
limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che
la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-
associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con
Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito
meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande
aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante
per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70
AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP
Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli
AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione
disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]
33
Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un
anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del
proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico
20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA
svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP
Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104
nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico
per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste
attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come
una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-
etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE
per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla
fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il
meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere
tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria
per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli
anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una
parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali
suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata
assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando
una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a
spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad
entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel
caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro
che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti
dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una
proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In
parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno
34
individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi
domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre
interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta
apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati
che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la
questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)
Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97
Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da
proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad
entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro
efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non
devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati
dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte
lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono
piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte
superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine
adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il
35
movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori
p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su
proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di
proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la
retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e
reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo
anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite
adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente
il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente
forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei
canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]
LrsquoAZIONE DELLrsquoATP
La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico
al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco
affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad
esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello
Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che
ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo
di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli
wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli
mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori
dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di
ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di
un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di
quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda
36
subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino
al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave
significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o
sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti
differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra
essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che
attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave
adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non
vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a
cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di
subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico
Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un
substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di
queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un
meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da
F1-ATPasi non sembra escluso
HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE
NEURODEGENERATIVE
RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE
Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel
mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una
pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi
associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione
37
di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di
Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta
promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]
Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90
nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave
funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi
permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]
HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico
Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono
mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)
accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock
citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata
da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante
di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo
stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si
lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei
geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-
shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via
multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di
transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-
translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90
[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e
mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo
shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con
Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)
38
attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da
shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni
Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che
i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro
sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock
termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su
attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato
che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi
di insulti
Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90
e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con
shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La
somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a
topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello
39
Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge
contro aggregati tossici
Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un
aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave
egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di
chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione
incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste
molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente
diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su
espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative
Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie
neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a
mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei
neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia
muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-
pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma
mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme
nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che
Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in
oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza
attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili
[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di
Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt
mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore
di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo
suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro
effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi
40
indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando
monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono
probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono
essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di
atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70
permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]
Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare
spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo
nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un
miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina
[62]
Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il
riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso
lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido
dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli
di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i
motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione
acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni
Riluzolo
Arimoclomol
41
Nei vari modelli cellulari della malattia di Alzheimer (AD) vi egrave un
incremento dei livelli di Hsp70 promossa dalla solubilitagrave e dal legame ai
microtubuli delle proteine tau [63] Hsp70 ha anche inibito la
propensione di aggregazione di Aβ [64] e ridotto la tossicitagrave di Aβ su
culture neuronali [65] Inoltre la proteina precursore dellrsquoamiloide
(APP) eo il suo Aβ amiloide derivato sono bersagli di chaperoni
mediati da clearence [66-67] Nella Drosophila melanogaster e nei
modelli di lievito della malattia di Parkinson (PD) lrsquoespressione diretta
di Hsp70 o la modulazione farmacologica di Hsp ha impedito la perdita
di neuroni causata da alfa-sinucleina [68-69] Huang et al hanno
riportato che questi effetti di Hsp70 si manifestano con lrsquoinibizione della
formazione di fibrille di alfa-sinucleina prevenendo la formazione di
alfa-sinucleina prefibrillare [70] Usando delezioni mutanti di alfa-
sinucleina Luk et al hanno indicato che le interazioni tra il dominio
legante il substrato Hsp70 e la regione del core idrofobico dellrsquoalfa-
sinucleina mediano lrsquoinibizione dellrsquoassemblaggio e che questo
processo di assemblaggio egrave inibito prima della fase di allungamento
[71] Nel complesso in diversi modelli di malattia neurodegenerativa la
sovra espressione di Hsp70 ha migliorato la gravitagrave della malattia di
fenotipi diversi senza incidere visibilmente sulla formazione di
aggregati suggerendo che i chaperoni non impediscono lrsquoaggregazione
di per seacute bensigrave reindirizzano gli aggregati preferibilmente in depositi
amorfi quindi sequestrando specie potenzialmente tossiche dalla
maggior parte della soluzione
42
Lrsquoespressione di Hsp70 e di altre Hsp egrave indotta dallrsquoinibizione
farmacologica di Hsp90
Come riportato sopra lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal
complesso con Hsp90 con susseguente produzione di Hsp (Figura 7) e
lrsquoinduzione di Hsp70 da parte di inibitori di Hsp90 egrave ben documentata
nei modelli di malattie neurodegenerative La geldanamicina (GM) un
inibitore di Hsp90 induce un aumento dose dipendente di Hsp70 nei
modelli di cellule di AD (Alzhaimer) cosigrave come nei neuroni della
corteccia primaria del ratto e riduce la quantitagrave di tau insolubili e dei
livelli basali di acido okadaico indotto da tau fosforilazione [63] Il
trattamento di neuroni primari corticali con lrsquoinibitore di Hsp90 con
struttura purinica il PU24FCI ha portato ad un aumento di Hsp70 dose-
dipendente [72]
PU24FCI
KU32
43
Allo stesso modo la somministrazione di due derivati di PU24FCI
CNS-permeabili il PU-DZ8 [72] ed il EC102 [73] a topi tau transgenici
(htau e JNPL3) ha determinato induzione di Hsp70 nel cervello e
mantenuto gli effetti per 24 ore dopo la somministrazione KU32 un
inibitore di Hsp90 di diversa natura chimica ha indotto Hsp70 in culture
SH-SY5Y di neuroblastoma e la ha protetta da tossicitagrave indotta da Aβ
GM ha attivato una risposta da shock termico ed inibito lrsquoaggregazione
di htt in un modello di coltura cellulare di HD ed ha indotto Hsp70 in
maniera tempo e concentrazione-dipendente ed ha impedito
lrsquoaggregazione di alfa-sinucleina e protetto contro la tossicitagrave in un
modello di aggregazione cellulare di alfa-sinucleina Auluck et al hanno
segnalato che il trattamento di un modello volante di PD con GM ha
protetto completamente contro tossicitagrave per alfa-sinucleina [74] GM ha
protetto anche contro la neurotossicitagrave dopaminergica indotta da 1-metil-
4-fenil-1236-tetraidropiridina (MPTP) in un modello di topo di PD Il
pretrattamento con GM mediante iniezione ventricolare intracerebrale
prima del trattamento con MPTP ha indotto le Hsp70 ed incrementato il
contenuto residuale di dopamina e lrsquoimmuno reattivitagrave della tirosina
idrolasi nel corpo striato [75] Lrsquoinduzione di Hsp70 nel midollo spinale
egrave stata osservata in seguito ad iniezione intraperitoneale di un derivato
della GM il 17-AAG in un modello di SBMA topo [76] Il 17-AAG egrave
stato anche efficace contro la nuerodegenerazione in altre malattie
poliQ Vale a dire ha soppresso la degenerazione dellrsquoocchio e la
formazione di inclusioni del corpo e salvato dalla letalitagrave in un modello
di SCA di Drosophila Ha inoltre soppresso la neurodegenerazione in un
modello volante di HD La riduzione di HSF-1 ha abolito lrsquoinduzione di
chaperoni molecolari e gli effeti terapeutici di 17-AAG sulla
neurodegenerazione poliQ indotta nei modelli di Drosophila facendo
44
arguire che lrsquoeffetto terapeutico di 17-AAG egrave essenzialmente mediato da
HSF-1 [77] Riassumendo lrsquoattivazione di HSF-1 da inibitori di Hsp90
egrave stata notata specificamente in modelli in vivo ed in vitro di malattie
neurodegenerative suggerendo che lrsquoinibizione di Hsp90 puograve essere un
mezzo per modulare i livelli di Hsp in cervelli malati con lrsquoobbiettivo di
proteggere contro le proteine tossiche che si presentano nel corso del
processo neurodegenerativo
Lrsquoinibizione di Hsp90 riduce lrsquoattivitagrave e lrsquoespressione di proteine
neuronali aberranti
In aggiunta alla regolazione di HSF-1 evidenze recenti suggeriscono un
ruolo addizionale per Hsp90 nel mantenimento della stabilitagrave funzionale
della capacitagrave aberrante di proteine neuronali (Figura 8A)
La SBMA egrave una malattia ereditaria dei motoneuroni causata
dallrsquoaccrescimento di un tratto di poliglutamina allrsquointerno del recettore
androgeno (AR) [57]
Le caratteristiche patologiche di SBMA sono perdita dei motoneuroni
nel midollo spinale e nel tronco cerebrale diffusione dellrsquoaccumulo
nucleare inclusioni nucleari di mutanti AR (mAR) nei motoneuroni
residui e in alcuni organi viscerali Waza et al hanno dimostrato che
mAR presente in SBMA egrave una delle proteine regolate da Hsp90 (Figura
8A) [76]
45
Figura 8 Le Hsp90 riparano le proteine neuronali aberranti (A) Proteine neuronali
aberranti regolate da Hsp90 (B) Lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90porta allrsquoinattivazione
o degradazione delle proteine regulate da Hsp90 probabilmente attraverso la via del
proteasoma
Le Hsp90 formano un complesso molecolare con mAR per il
mantenimento della sua stabilitagrave funzionale Sia in modelli cellulari di
SBMA che in topi transgenici lrsquoinibizione di Hsp90 da parte di 17-
AAG il derivato 17 allilammino-17-demetossi della geldanamicina ha
46
portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal
macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati
disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da
destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione
dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di
SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave
rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati
[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori
hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo
sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa
(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni
Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]
Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo
egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali
sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al
hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina
(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi
familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un
complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data
da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto
47
lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della
stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave
dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita
neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei
neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che
codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a
PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson
familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson
suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente
associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che
Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate
con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente
diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina
egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille
ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno
recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di
alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che
sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina
[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce
lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari
Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-
dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento
tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-
sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da
chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di
mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il
macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD
associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-
48
sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative
caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave
caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di
tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD
lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da
unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina
chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta
(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si
era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero
netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un
gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e
Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave
causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma
17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau
[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine
neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso
portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina
mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da
Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei
modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave
patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-
dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla
settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad
una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di
tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno
dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una
diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di
AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le
49
relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la
degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90
[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al
(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave
stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da
GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β
effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi
GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di
Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe
portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in
strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati
indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone
biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione
di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da
parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi
proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di
queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)
Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie
neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio
approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare
dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la
formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione
potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di
Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare
terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare
malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo
centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90
puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione
50
successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti
neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti
clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto
che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono
tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in
modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni
nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati
promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio
spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in
modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di
Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a
lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse
da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase
esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora
rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori
dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per
mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie
neurodegenerative
51
SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-
ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-
METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE
(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE
MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO
SULLA FRAMMENTAZIONE
Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in
risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta
nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine
regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il
ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai
loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine
client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro
cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire
su molti percorsi oncogenici
Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il
nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che
lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati
composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP
attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del
processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono
emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i
tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule
normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina
(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una
maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto
che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una
piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
25
antisenso mediata dallrsquoesperessione di p62 aumenta lrsquoapoptosi delle
cellule che esprimono huntungtina Quindi sembra che la modifica
dellrsquoubiquitina delle proteine difettose possa offrire un ingresso sia al
sistema proteasoma o in contesti dove lrsquoaggregazione egrave in corso al
sistema autofagia
SISTEMI CHAPERONI HSP70
Le Hsp70 proteine dello shock termico di 70 KDa sono impegnate in
una serie di processi tra cui il ripiegamento di proteine di nuova sintesi
il trasporto delle proteine attraverso membrane il ripiegamento di
proteine mal ripiegate ed aggregate e il controllo delle attivitagrave delle
proteine regolatrici Questa versatilitagrave egrave ottenuta attraverso
lampliamento e la diversificazione evolutiva di geni hsp70 che ha
generato sia chaperoni Hsp70 specifici Hsp110 e proteine Hsp170 La
versatilitagrave egrave determinata attraverso lrsquoimpiego di cochaperoni proteine J
e fattori di scambio di nucleotide (NEF) che regolano lrsquoattivitagrave di Hsp70
(Figura 4)
26
Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame
del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una
Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)
Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la
proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato
allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del
substrato
Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre
specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb
Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di
legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un
numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame
dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi
Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina
Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni
Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali
di Hsp70 con se stesso
27
INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70
Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di
proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura
xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding
appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide
N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD
adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio
elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con
lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante
chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco
tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini
di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di
comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura
di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione
La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la
tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo
coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture
precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una
proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da
una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β
ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica
compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio
elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di
legame del substrato (Figura 5)
28
Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo
substrato
La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra
domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che
collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo
solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi
residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame
allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A
dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso
Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un
legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in
nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano
completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve
entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo
fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui
coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del
segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti
integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A
29
capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il
quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di
ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a
idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di
DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro
catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente
arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia
drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete
crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la
barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK
costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina
superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura
della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera
attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della
prolina
DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-
NUCLEOTIDE
Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi
meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono
fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la
liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del
substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la
dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine
BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave
dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con
30
funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S
cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1
(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la
disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e
HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70
fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi
della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente
indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene
GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg
di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei
nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte
posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i
nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario
BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in
modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del
complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si
compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo
Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva
[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con
conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve
indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca
di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di
convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la
reazione di scambio nucleotidica di Hsp70
31
LEGAMI Hsp70-Hsp70
Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro
della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In
particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce
come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola
lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di
questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento
Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il
cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che
sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi
eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente
lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se
non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di
complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di
nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di
scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione
importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto
di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel
folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle
Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza
proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa
con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere
coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di
traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina
Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come
sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le
interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di
32
Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi
SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua
attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano
legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di
idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede
possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano
lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina
stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che
Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami
con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina
J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di
stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega
bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o
Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non
limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che
la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-
associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con
Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito
meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande
aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante
per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70
AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP
Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli
AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione
disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]
33
Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un
anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del
proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico
20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA
svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP
Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104
nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico
per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste
attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come
una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-
etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE
per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla
fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il
meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere
tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria
per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli
anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una
parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali
suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata
assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando
una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a
spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad
entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel
caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro
che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti
dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una
proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In
parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno
34
individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi
domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre
interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta
apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati
che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la
questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)
Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97
Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da
proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad
entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro
efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non
devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati
dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte
lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono
piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte
superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine
adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il
35
movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori
p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su
proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di
proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la
retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e
reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo
anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite
adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente
il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente
forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei
canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]
LrsquoAZIONE DELLrsquoATP
La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico
al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco
affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad
esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello
Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che
ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo
di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli
wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli
mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori
dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di
ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di
un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di
quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda
36
subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino
al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave
significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o
sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti
differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra
essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che
attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave
adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non
vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a
cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di
subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico
Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un
substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di
queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un
meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da
F1-ATPasi non sembra escluso
HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE
NEURODEGENERATIVE
RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE
Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel
mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una
pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi
associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione
37
di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di
Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta
promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]
Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90
nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave
funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi
permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]
HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico
Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono
mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)
accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock
citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata
da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante
di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo
stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si
lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei
geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-
shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via
multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di
transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-
translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90
[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e
mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo
shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con
Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)
38
attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da
shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni
Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che
i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro
sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock
termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su
attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato
che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi
di insulti
Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90
e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con
shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La
somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a
topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello
39
Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge
contro aggregati tossici
Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un
aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave
egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di
chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione
incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste
molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente
diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su
espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative
Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie
neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a
mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei
neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia
muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-
pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma
mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme
nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che
Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in
oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza
attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili
[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di
Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt
mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore
di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo
suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro
effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi
40
indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando
monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono
probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono
essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di
atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70
permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]
Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare
spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo
nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un
miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina
[62]
Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il
riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso
lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido
dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli
di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i
motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione
acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni
Riluzolo
Arimoclomol
41
Nei vari modelli cellulari della malattia di Alzheimer (AD) vi egrave un
incremento dei livelli di Hsp70 promossa dalla solubilitagrave e dal legame ai
microtubuli delle proteine tau [63] Hsp70 ha anche inibito la
propensione di aggregazione di Aβ [64] e ridotto la tossicitagrave di Aβ su
culture neuronali [65] Inoltre la proteina precursore dellrsquoamiloide
(APP) eo il suo Aβ amiloide derivato sono bersagli di chaperoni
mediati da clearence [66-67] Nella Drosophila melanogaster e nei
modelli di lievito della malattia di Parkinson (PD) lrsquoespressione diretta
di Hsp70 o la modulazione farmacologica di Hsp ha impedito la perdita
di neuroni causata da alfa-sinucleina [68-69] Huang et al hanno
riportato che questi effetti di Hsp70 si manifestano con lrsquoinibizione della
formazione di fibrille di alfa-sinucleina prevenendo la formazione di
alfa-sinucleina prefibrillare [70] Usando delezioni mutanti di alfa-
sinucleina Luk et al hanno indicato che le interazioni tra il dominio
legante il substrato Hsp70 e la regione del core idrofobico dellrsquoalfa-
sinucleina mediano lrsquoinibizione dellrsquoassemblaggio e che questo
processo di assemblaggio egrave inibito prima della fase di allungamento
[71] Nel complesso in diversi modelli di malattia neurodegenerativa la
sovra espressione di Hsp70 ha migliorato la gravitagrave della malattia di
fenotipi diversi senza incidere visibilmente sulla formazione di
aggregati suggerendo che i chaperoni non impediscono lrsquoaggregazione
di per seacute bensigrave reindirizzano gli aggregati preferibilmente in depositi
amorfi quindi sequestrando specie potenzialmente tossiche dalla
maggior parte della soluzione
42
Lrsquoespressione di Hsp70 e di altre Hsp egrave indotta dallrsquoinibizione
farmacologica di Hsp90
Come riportato sopra lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal
complesso con Hsp90 con susseguente produzione di Hsp (Figura 7) e
lrsquoinduzione di Hsp70 da parte di inibitori di Hsp90 egrave ben documentata
nei modelli di malattie neurodegenerative La geldanamicina (GM) un
inibitore di Hsp90 induce un aumento dose dipendente di Hsp70 nei
modelli di cellule di AD (Alzhaimer) cosigrave come nei neuroni della
corteccia primaria del ratto e riduce la quantitagrave di tau insolubili e dei
livelli basali di acido okadaico indotto da tau fosforilazione [63] Il
trattamento di neuroni primari corticali con lrsquoinibitore di Hsp90 con
struttura purinica il PU24FCI ha portato ad un aumento di Hsp70 dose-
dipendente [72]
PU24FCI
KU32
43
Allo stesso modo la somministrazione di due derivati di PU24FCI
CNS-permeabili il PU-DZ8 [72] ed il EC102 [73] a topi tau transgenici
(htau e JNPL3) ha determinato induzione di Hsp70 nel cervello e
mantenuto gli effetti per 24 ore dopo la somministrazione KU32 un
inibitore di Hsp90 di diversa natura chimica ha indotto Hsp70 in culture
SH-SY5Y di neuroblastoma e la ha protetta da tossicitagrave indotta da Aβ
GM ha attivato una risposta da shock termico ed inibito lrsquoaggregazione
di htt in un modello di coltura cellulare di HD ed ha indotto Hsp70 in
maniera tempo e concentrazione-dipendente ed ha impedito
lrsquoaggregazione di alfa-sinucleina e protetto contro la tossicitagrave in un
modello di aggregazione cellulare di alfa-sinucleina Auluck et al hanno
segnalato che il trattamento di un modello volante di PD con GM ha
protetto completamente contro tossicitagrave per alfa-sinucleina [74] GM ha
protetto anche contro la neurotossicitagrave dopaminergica indotta da 1-metil-
4-fenil-1236-tetraidropiridina (MPTP) in un modello di topo di PD Il
pretrattamento con GM mediante iniezione ventricolare intracerebrale
prima del trattamento con MPTP ha indotto le Hsp70 ed incrementato il
contenuto residuale di dopamina e lrsquoimmuno reattivitagrave della tirosina
idrolasi nel corpo striato [75] Lrsquoinduzione di Hsp70 nel midollo spinale
egrave stata osservata in seguito ad iniezione intraperitoneale di un derivato
della GM il 17-AAG in un modello di SBMA topo [76] Il 17-AAG egrave
stato anche efficace contro la nuerodegenerazione in altre malattie
poliQ Vale a dire ha soppresso la degenerazione dellrsquoocchio e la
formazione di inclusioni del corpo e salvato dalla letalitagrave in un modello
di SCA di Drosophila Ha inoltre soppresso la neurodegenerazione in un
modello volante di HD La riduzione di HSF-1 ha abolito lrsquoinduzione di
chaperoni molecolari e gli effeti terapeutici di 17-AAG sulla
neurodegenerazione poliQ indotta nei modelli di Drosophila facendo
44
arguire che lrsquoeffetto terapeutico di 17-AAG egrave essenzialmente mediato da
HSF-1 [77] Riassumendo lrsquoattivazione di HSF-1 da inibitori di Hsp90
egrave stata notata specificamente in modelli in vivo ed in vitro di malattie
neurodegenerative suggerendo che lrsquoinibizione di Hsp90 puograve essere un
mezzo per modulare i livelli di Hsp in cervelli malati con lrsquoobbiettivo di
proteggere contro le proteine tossiche che si presentano nel corso del
processo neurodegenerativo
Lrsquoinibizione di Hsp90 riduce lrsquoattivitagrave e lrsquoespressione di proteine
neuronali aberranti
In aggiunta alla regolazione di HSF-1 evidenze recenti suggeriscono un
ruolo addizionale per Hsp90 nel mantenimento della stabilitagrave funzionale
della capacitagrave aberrante di proteine neuronali (Figura 8A)
La SBMA egrave una malattia ereditaria dei motoneuroni causata
dallrsquoaccrescimento di un tratto di poliglutamina allrsquointerno del recettore
androgeno (AR) [57]
Le caratteristiche patologiche di SBMA sono perdita dei motoneuroni
nel midollo spinale e nel tronco cerebrale diffusione dellrsquoaccumulo
nucleare inclusioni nucleari di mutanti AR (mAR) nei motoneuroni
residui e in alcuni organi viscerali Waza et al hanno dimostrato che
mAR presente in SBMA egrave una delle proteine regolate da Hsp90 (Figura
8A) [76]
45
Figura 8 Le Hsp90 riparano le proteine neuronali aberranti (A) Proteine neuronali
aberranti regolate da Hsp90 (B) Lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90porta allrsquoinattivazione
o degradazione delle proteine regulate da Hsp90 probabilmente attraverso la via del
proteasoma
Le Hsp90 formano un complesso molecolare con mAR per il
mantenimento della sua stabilitagrave funzionale Sia in modelli cellulari di
SBMA che in topi transgenici lrsquoinibizione di Hsp90 da parte di 17-
AAG il derivato 17 allilammino-17-demetossi della geldanamicina ha
46
portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal
macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati
disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da
destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione
dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di
SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave
rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati
[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori
hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo
sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa
(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni
Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]
Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo
egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali
sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al
hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina
(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi
familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un
complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data
da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto
47
lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della
stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave
dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita
neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei
neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che
codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a
PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson
familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson
suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente
associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che
Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate
con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente
diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina
egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille
ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno
recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di
alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che
sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina
[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce
lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari
Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-
dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento
tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-
sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da
chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di
mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il
macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD
associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-
48
sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative
caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave
caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di
tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD
lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da
unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina
chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta
(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si
era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero
netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un
gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e
Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave
causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma
17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau
[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine
neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso
portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina
mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da
Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei
modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave
patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-
dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla
settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad
una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di
tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno
dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una
diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di
AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le
49
relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la
degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90
[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al
(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave
stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da
GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β
effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi
GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di
Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe
portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in
strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati
indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone
biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione
di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da
parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi
proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di
queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)
Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie
neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio
approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare
dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la
formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione
potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di
Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare
terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare
malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo
centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90
puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione
50
successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti
neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti
clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto
che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono
tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in
modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni
nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati
promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio
spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in
modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di
Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a
lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse
da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase
esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora
rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori
dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per
mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie
neurodegenerative
51
SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-
ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-
METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE
(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE
MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO
SULLA FRAMMENTAZIONE
Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in
risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta
nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine
regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il
ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai
loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine
client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro
cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire
su molti percorsi oncogenici
Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il
nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che
lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati
composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP
attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del
processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono
emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i
tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule
normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina
(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una
maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto
che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una
piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
26
Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame
del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una
Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)
Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la
proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato
allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del
substrato
Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre
specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb
Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di
legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un
numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame
dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi
Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina
Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni
Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali
di Hsp70 con se stesso
27
INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70
Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di
proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura
xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding
appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide
N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD
adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio
elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con
lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante
chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco
tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini
di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di
comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura
di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione
La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la
tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo
coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture
precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una
proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da
una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β
ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica
compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio
elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di
legame del substrato (Figura 5)
28
Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo
substrato
La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra
domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che
collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo
solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi
residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame
allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A
dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso
Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un
legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in
nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano
completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve
entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo
fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui
coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del
segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti
integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A
29
capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il
quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di
ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a
idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di
DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro
catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente
arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia
drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete
crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la
barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK
costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina
superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura
della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera
attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della
prolina
DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-
NUCLEOTIDE
Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi
meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono
fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la
liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del
substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la
dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine
BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave
dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con
30
funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S
cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1
(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la
disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e
HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70
fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi
della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente
indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene
GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg
di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei
nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte
posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i
nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario
BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in
modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del
complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si
compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo
Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva
[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con
conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve
indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca
di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di
convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la
reazione di scambio nucleotidica di Hsp70
31
LEGAMI Hsp70-Hsp70
Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro
della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In
particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce
come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola
lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di
questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento
Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il
cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che
sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi
eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente
lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se
non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di
complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di
nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di
scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione
importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto
di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel
folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle
Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza
proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa
con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere
coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di
traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina
Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come
sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le
interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di
32
Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi
SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua
attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano
legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di
idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede
possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano
lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina
stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che
Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami
con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina
J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di
stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega
bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o
Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non
limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che
la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-
associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con
Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito
meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande
aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante
per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70
AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP
Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli
AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione
disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]
33
Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un
anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del
proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico
20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA
svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP
Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104
nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico
per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste
attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come
una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-
etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE
per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla
fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il
meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere
tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria
per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli
anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una
parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali
suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata
assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando
una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a
spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad
entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel
caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro
che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti
dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una
proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In
parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno
34
individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi
domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre
interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta
apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati
che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la
questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)
Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97
Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da
proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad
entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro
efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non
devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati
dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte
lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono
piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte
superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine
adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il
35
movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori
p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su
proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di
proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la
retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e
reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo
anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite
adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente
il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente
forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei
canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]
LrsquoAZIONE DELLrsquoATP
La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico
al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco
affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad
esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello
Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che
ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo
di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli
wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli
mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori
dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di
ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di
un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di
quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda
36
subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino
al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave
significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o
sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti
differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra
essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che
attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave
adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non
vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a
cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di
subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico
Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un
substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di
queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un
meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da
F1-ATPasi non sembra escluso
HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE
NEURODEGENERATIVE
RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE
Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel
mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una
pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi
associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione
37
di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di
Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta
promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]
Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90
nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave
funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi
permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]
HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico
Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono
mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)
accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock
citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata
da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante
di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo
stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si
lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei
geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-
shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via
multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di
transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-
translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90
[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e
mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo
shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con
Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)
38
attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da
shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni
Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che
i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro
sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock
termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su
attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato
che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi
di insulti
Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90
e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con
shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La
somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a
topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello
39
Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge
contro aggregati tossici
Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un
aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave
egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di
chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione
incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste
molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente
diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su
espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative
Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie
neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a
mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei
neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia
muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-
pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma
mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme
nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che
Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in
oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza
attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili
[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di
Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt
mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore
di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo
suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro
effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi
40
indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando
monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono
probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono
essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di
atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70
permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]
Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare
spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo
nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un
miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina
[62]
Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il
riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso
lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido
dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli
di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i
motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione
acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni
Riluzolo
Arimoclomol
41
Nei vari modelli cellulari della malattia di Alzheimer (AD) vi egrave un
incremento dei livelli di Hsp70 promossa dalla solubilitagrave e dal legame ai
microtubuli delle proteine tau [63] Hsp70 ha anche inibito la
propensione di aggregazione di Aβ [64] e ridotto la tossicitagrave di Aβ su
culture neuronali [65] Inoltre la proteina precursore dellrsquoamiloide
(APP) eo il suo Aβ amiloide derivato sono bersagli di chaperoni
mediati da clearence [66-67] Nella Drosophila melanogaster e nei
modelli di lievito della malattia di Parkinson (PD) lrsquoespressione diretta
di Hsp70 o la modulazione farmacologica di Hsp ha impedito la perdita
di neuroni causata da alfa-sinucleina [68-69] Huang et al hanno
riportato che questi effetti di Hsp70 si manifestano con lrsquoinibizione della
formazione di fibrille di alfa-sinucleina prevenendo la formazione di
alfa-sinucleina prefibrillare [70] Usando delezioni mutanti di alfa-
sinucleina Luk et al hanno indicato che le interazioni tra il dominio
legante il substrato Hsp70 e la regione del core idrofobico dellrsquoalfa-
sinucleina mediano lrsquoinibizione dellrsquoassemblaggio e che questo
processo di assemblaggio egrave inibito prima della fase di allungamento
[71] Nel complesso in diversi modelli di malattia neurodegenerativa la
sovra espressione di Hsp70 ha migliorato la gravitagrave della malattia di
fenotipi diversi senza incidere visibilmente sulla formazione di
aggregati suggerendo che i chaperoni non impediscono lrsquoaggregazione
di per seacute bensigrave reindirizzano gli aggregati preferibilmente in depositi
amorfi quindi sequestrando specie potenzialmente tossiche dalla
maggior parte della soluzione
42
Lrsquoespressione di Hsp70 e di altre Hsp egrave indotta dallrsquoinibizione
farmacologica di Hsp90
Come riportato sopra lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal
complesso con Hsp90 con susseguente produzione di Hsp (Figura 7) e
lrsquoinduzione di Hsp70 da parte di inibitori di Hsp90 egrave ben documentata
nei modelli di malattie neurodegenerative La geldanamicina (GM) un
inibitore di Hsp90 induce un aumento dose dipendente di Hsp70 nei
modelli di cellule di AD (Alzhaimer) cosigrave come nei neuroni della
corteccia primaria del ratto e riduce la quantitagrave di tau insolubili e dei
livelli basali di acido okadaico indotto da tau fosforilazione [63] Il
trattamento di neuroni primari corticali con lrsquoinibitore di Hsp90 con
struttura purinica il PU24FCI ha portato ad un aumento di Hsp70 dose-
dipendente [72]
PU24FCI
KU32
43
Allo stesso modo la somministrazione di due derivati di PU24FCI
CNS-permeabili il PU-DZ8 [72] ed il EC102 [73] a topi tau transgenici
(htau e JNPL3) ha determinato induzione di Hsp70 nel cervello e
mantenuto gli effetti per 24 ore dopo la somministrazione KU32 un
inibitore di Hsp90 di diversa natura chimica ha indotto Hsp70 in culture
SH-SY5Y di neuroblastoma e la ha protetta da tossicitagrave indotta da Aβ
GM ha attivato una risposta da shock termico ed inibito lrsquoaggregazione
di htt in un modello di coltura cellulare di HD ed ha indotto Hsp70 in
maniera tempo e concentrazione-dipendente ed ha impedito
lrsquoaggregazione di alfa-sinucleina e protetto contro la tossicitagrave in un
modello di aggregazione cellulare di alfa-sinucleina Auluck et al hanno
segnalato che il trattamento di un modello volante di PD con GM ha
protetto completamente contro tossicitagrave per alfa-sinucleina [74] GM ha
protetto anche contro la neurotossicitagrave dopaminergica indotta da 1-metil-
4-fenil-1236-tetraidropiridina (MPTP) in un modello di topo di PD Il
pretrattamento con GM mediante iniezione ventricolare intracerebrale
prima del trattamento con MPTP ha indotto le Hsp70 ed incrementato il
contenuto residuale di dopamina e lrsquoimmuno reattivitagrave della tirosina
idrolasi nel corpo striato [75] Lrsquoinduzione di Hsp70 nel midollo spinale
egrave stata osservata in seguito ad iniezione intraperitoneale di un derivato
della GM il 17-AAG in un modello di SBMA topo [76] Il 17-AAG egrave
stato anche efficace contro la nuerodegenerazione in altre malattie
poliQ Vale a dire ha soppresso la degenerazione dellrsquoocchio e la
formazione di inclusioni del corpo e salvato dalla letalitagrave in un modello
di SCA di Drosophila Ha inoltre soppresso la neurodegenerazione in un
modello volante di HD La riduzione di HSF-1 ha abolito lrsquoinduzione di
chaperoni molecolari e gli effeti terapeutici di 17-AAG sulla
neurodegenerazione poliQ indotta nei modelli di Drosophila facendo
44
arguire che lrsquoeffetto terapeutico di 17-AAG egrave essenzialmente mediato da
HSF-1 [77] Riassumendo lrsquoattivazione di HSF-1 da inibitori di Hsp90
egrave stata notata specificamente in modelli in vivo ed in vitro di malattie
neurodegenerative suggerendo che lrsquoinibizione di Hsp90 puograve essere un
mezzo per modulare i livelli di Hsp in cervelli malati con lrsquoobbiettivo di
proteggere contro le proteine tossiche che si presentano nel corso del
processo neurodegenerativo
Lrsquoinibizione di Hsp90 riduce lrsquoattivitagrave e lrsquoespressione di proteine
neuronali aberranti
In aggiunta alla regolazione di HSF-1 evidenze recenti suggeriscono un
ruolo addizionale per Hsp90 nel mantenimento della stabilitagrave funzionale
della capacitagrave aberrante di proteine neuronali (Figura 8A)
La SBMA egrave una malattia ereditaria dei motoneuroni causata
dallrsquoaccrescimento di un tratto di poliglutamina allrsquointerno del recettore
androgeno (AR) [57]
Le caratteristiche patologiche di SBMA sono perdita dei motoneuroni
nel midollo spinale e nel tronco cerebrale diffusione dellrsquoaccumulo
nucleare inclusioni nucleari di mutanti AR (mAR) nei motoneuroni
residui e in alcuni organi viscerali Waza et al hanno dimostrato che
mAR presente in SBMA egrave una delle proteine regolate da Hsp90 (Figura
8A) [76]
45
Figura 8 Le Hsp90 riparano le proteine neuronali aberranti (A) Proteine neuronali
aberranti regolate da Hsp90 (B) Lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90porta allrsquoinattivazione
o degradazione delle proteine regulate da Hsp90 probabilmente attraverso la via del
proteasoma
Le Hsp90 formano un complesso molecolare con mAR per il
mantenimento della sua stabilitagrave funzionale Sia in modelli cellulari di
SBMA che in topi transgenici lrsquoinibizione di Hsp90 da parte di 17-
AAG il derivato 17 allilammino-17-demetossi della geldanamicina ha
46
portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal
macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati
disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da
destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione
dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di
SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave
rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati
[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori
hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo
sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa
(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni
Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]
Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo
egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali
sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al
hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina
(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi
familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un
complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data
da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto
47
lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della
stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave
dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita
neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei
neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che
codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a
PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson
familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson
suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente
associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che
Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate
con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente
diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina
egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille
ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno
recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di
alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che
sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina
[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce
lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari
Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-
dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento
tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-
sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da
chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di
mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il
macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD
associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-
48
sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative
caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave
caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di
tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD
lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da
unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina
chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta
(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si
era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero
netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un
gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e
Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave
causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma
17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau
[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine
neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso
portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina
mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da
Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei
modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave
patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-
dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla
settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad
una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di
tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno
dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una
diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di
AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le
49
relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la
degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90
[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al
(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave
stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da
GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β
effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi
GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di
Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe
portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in
strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati
indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone
biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione
di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da
parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi
proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di
queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)
Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie
neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio
approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare
dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la
formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione
potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di
Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare
terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare
malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo
centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90
puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione
50
successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti
neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti
clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto
che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono
tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in
modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni
nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati
promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio
spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in
modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di
Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a
lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse
da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase
esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora
rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori
dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per
mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie
neurodegenerative
51
SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-
ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-
METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE
(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE
MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO
SULLA FRAMMENTAZIONE
Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in
risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta
nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine
regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il
ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai
loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine
client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro
cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire
su molti percorsi oncogenici
Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il
nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che
lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati
composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP
attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del
processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono
emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i
tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule
normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina
(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una
maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto
che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una
piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
27
INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70
Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di
proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura
xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding
appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide
N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD
adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio
elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con
lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante
chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco
tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini
di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di
comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura
di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione
La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la
tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo
coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture
precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una
proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da
una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β
ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica
compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio
elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di
legame del substrato (Figura 5)
28
Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo
substrato
La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra
domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che
collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo
solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi
residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame
allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A
dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso
Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un
legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in
nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano
completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve
entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo
fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui
coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del
segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti
integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A
29
capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il
quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di
ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a
idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di
DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro
catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente
arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia
drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete
crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la
barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK
costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina
superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura
della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera
attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della
prolina
DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-
NUCLEOTIDE
Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi
meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono
fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la
liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del
substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la
dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine
BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave
dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con
30
funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S
cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1
(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la
disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e
HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70
fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi
della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente
indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene
GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg
di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei
nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte
posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i
nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario
BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in
modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del
complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si
compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo
Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva
[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con
conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve
indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca
di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di
convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la
reazione di scambio nucleotidica di Hsp70
31
LEGAMI Hsp70-Hsp70
Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro
della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In
particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce
come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola
lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di
questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento
Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il
cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che
sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi
eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente
lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se
non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di
complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di
nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di
scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione
importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto
di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel
folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle
Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza
proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa
con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere
coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di
traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina
Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come
sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le
interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di
32
Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi
SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua
attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano
legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di
idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede
possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano
lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina
stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che
Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami
con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina
J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di
stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega
bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o
Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non
limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che
la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-
associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con
Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito
meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande
aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante
per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70
AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP
Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli
AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione
disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]
33
Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un
anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del
proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico
20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA
svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP
Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104
nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico
per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste
attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come
una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-
etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE
per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla
fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il
meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere
tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria
per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli
anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una
parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali
suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata
assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando
una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a
spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad
entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel
caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro
che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti
dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una
proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In
parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno
34
individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi
domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre
interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta
apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati
che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la
questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)
Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97
Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da
proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad
entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro
efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non
devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati
dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte
lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono
piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte
superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine
adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il
35
movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori
p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su
proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di
proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la
retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e
reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo
anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite
adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente
il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente
forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei
canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]
LrsquoAZIONE DELLrsquoATP
La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico
al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco
affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad
esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello
Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che
ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo
di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli
wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli
mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori
dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di
ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di
un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di
quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda
36
subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino
al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave
significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o
sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti
differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra
essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che
attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave
adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non
vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a
cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di
subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico
Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un
substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di
queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un
meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da
F1-ATPasi non sembra escluso
HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE
NEURODEGENERATIVE
RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE
Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel
mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una
pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi
associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione
37
di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di
Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta
promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]
Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90
nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave
funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi
permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]
HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico
Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono
mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)
accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock
citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata
da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante
di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo
stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si
lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei
geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-
shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via
multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di
transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-
translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90
[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e
mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo
shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con
Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)
38
attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da
shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni
Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che
i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro
sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock
termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su
attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato
che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi
di insulti
Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90
e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con
shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La
somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a
topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello
39
Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge
contro aggregati tossici
Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un
aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave
egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di
chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione
incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste
molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente
diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su
espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative
Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie
neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a
mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei
neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia
muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-
pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma
mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme
nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che
Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in
oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza
attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili
[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di
Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt
mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore
di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo
suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro
effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi
40
indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando
monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono
probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono
essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di
atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70
permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]
Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare
spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo
nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un
miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina
[62]
Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il
riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso
lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido
dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli
di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i
motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione
acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni
Riluzolo
Arimoclomol
41
Nei vari modelli cellulari della malattia di Alzheimer (AD) vi egrave un
incremento dei livelli di Hsp70 promossa dalla solubilitagrave e dal legame ai
microtubuli delle proteine tau [63] Hsp70 ha anche inibito la
propensione di aggregazione di Aβ [64] e ridotto la tossicitagrave di Aβ su
culture neuronali [65] Inoltre la proteina precursore dellrsquoamiloide
(APP) eo il suo Aβ amiloide derivato sono bersagli di chaperoni
mediati da clearence [66-67] Nella Drosophila melanogaster e nei
modelli di lievito della malattia di Parkinson (PD) lrsquoespressione diretta
di Hsp70 o la modulazione farmacologica di Hsp ha impedito la perdita
di neuroni causata da alfa-sinucleina [68-69] Huang et al hanno
riportato che questi effetti di Hsp70 si manifestano con lrsquoinibizione della
formazione di fibrille di alfa-sinucleina prevenendo la formazione di
alfa-sinucleina prefibrillare [70] Usando delezioni mutanti di alfa-
sinucleina Luk et al hanno indicato che le interazioni tra il dominio
legante il substrato Hsp70 e la regione del core idrofobico dellrsquoalfa-
sinucleina mediano lrsquoinibizione dellrsquoassemblaggio e che questo
processo di assemblaggio egrave inibito prima della fase di allungamento
[71] Nel complesso in diversi modelli di malattia neurodegenerativa la
sovra espressione di Hsp70 ha migliorato la gravitagrave della malattia di
fenotipi diversi senza incidere visibilmente sulla formazione di
aggregati suggerendo che i chaperoni non impediscono lrsquoaggregazione
di per seacute bensigrave reindirizzano gli aggregati preferibilmente in depositi
amorfi quindi sequestrando specie potenzialmente tossiche dalla
maggior parte della soluzione
42
Lrsquoespressione di Hsp70 e di altre Hsp egrave indotta dallrsquoinibizione
farmacologica di Hsp90
Come riportato sopra lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal
complesso con Hsp90 con susseguente produzione di Hsp (Figura 7) e
lrsquoinduzione di Hsp70 da parte di inibitori di Hsp90 egrave ben documentata
nei modelli di malattie neurodegenerative La geldanamicina (GM) un
inibitore di Hsp90 induce un aumento dose dipendente di Hsp70 nei
modelli di cellule di AD (Alzhaimer) cosigrave come nei neuroni della
corteccia primaria del ratto e riduce la quantitagrave di tau insolubili e dei
livelli basali di acido okadaico indotto da tau fosforilazione [63] Il
trattamento di neuroni primari corticali con lrsquoinibitore di Hsp90 con
struttura purinica il PU24FCI ha portato ad un aumento di Hsp70 dose-
dipendente [72]
PU24FCI
KU32
43
Allo stesso modo la somministrazione di due derivati di PU24FCI
CNS-permeabili il PU-DZ8 [72] ed il EC102 [73] a topi tau transgenici
(htau e JNPL3) ha determinato induzione di Hsp70 nel cervello e
mantenuto gli effetti per 24 ore dopo la somministrazione KU32 un
inibitore di Hsp90 di diversa natura chimica ha indotto Hsp70 in culture
SH-SY5Y di neuroblastoma e la ha protetta da tossicitagrave indotta da Aβ
GM ha attivato una risposta da shock termico ed inibito lrsquoaggregazione
di htt in un modello di coltura cellulare di HD ed ha indotto Hsp70 in
maniera tempo e concentrazione-dipendente ed ha impedito
lrsquoaggregazione di alfa-sinucleina e protetto contro la tossicitagrave in un
modello di aggregazione cellulare di alfa-sinucleina Auluck et al hanno
segnalato che il trattamento di un modello volante di PD con GM ha
protetto completamente contro tossicitagrave per alfa-sinucleina [74] GM ha
protetto anche contro la neurotossicitagrave dopaminergica indotta da 1-metil-
4-fenil-1236-tetraidropiridina (MPTP) in un modello di topo di PD Il
pretrattamento con GM mediante iniezione ventricolare intracerebrale
prima del trattamento con MPTP ha indotto le Hsp70 ed incrementato il
contenuto residuale di dopamina e lrsquoimmuno reattivitagrave della tirosina
idrolasi nel corpo striato [75] Lrsquoinduzione di Hsp70 nel midollo spinale
egrave stata osservata in seguito ad iniezione intraperitoneale di un derivato
della GM il 17-AAG in un modello di SBMA topo [76] Il 17-AAG egrave
stato anche efficace contro la nuerodegenerazione in altre malattie
poliQ Vale a dire ha soppresso la degenerazione dellrsquoocchio e la
formazione di inclusioni del corpo e salvato dalla letalitagrave in un modello
di SCA di Drosophila Ha inoltre soppresso la neurodegenerazione in un
modello volante di HD La riduzione di HSF-1 ha abolito lrsquoinduzione di
chaperoni molecolari e gli effeti terapeutici di 17-AAG sulla
neurodegenerazione poliQ indotta nei modelli di Drosophila facendo
44
arguire che lrsquoeffetto terapeutico di 17-AAG egrave essenzialmente mediato da
HSF-1 [77] Riassumendo lrsquoattivazione di HSF-1 da inibitori di Hsp90
egrave stata notata specificamente in modelli in vivo ed in vitro di malattie
neurodegenerative suggerendo che lrsquoinibizione di Hsp90 puograve essere un
mezzo per modulare i livelli di Hsp in cervelli malati con lrsquoobbiettivo di
proteggere contro le proteine tossiche che si presentano nel corso del
processo neurodegenerativo
Lrsquoinibizione di Hsp90 riduce lrsquoattivitagrave e lrsquoespressione di proteine
neuronali aberranti
In aggiunta alla regolazione di HSF-1 evidenze recenti suggeriscono un
ruolo addizionale per Hsp90 nel mantenimento della stabilitagrave funzionale
della capacitagrave aberrante di proteine neuronali (Figura 8A)
La SBMA egrave una malattia ereditaria dei motoneuroni causata
dallrsquoaccrescimento di un tratto di poliglutamina allrsquointerno del recettore
androgeno (AR) [57]
Le caratteristiche patologiche di SBMA sono perdita dei motoneuroni
nel midollo spinale e nel tronco cerebrale diffusione dellrsquoaccumulo
nucleare inclusioni nucleari di mutanti AR (mAR) nei motoneuroni
residui e in alcuni organi viscerali Waza et al hanno dimostrato che
mAR presente in SBMA egrave una delle proteine regolate da Hsp90 (Figura
8A) [76]
45
Figura 8 Le Hsp90 riparano le proteine neuronali aberranti (A) Proteine neuronali
aberranti regolate da Hsp90 (B) Lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90porta allrsquoinattivazione
o degradazione delle proteine regulate da Hsp90 probabilmente attraverso la via del
proteasoma
Le Hsp90 formano un complesso molecolare con mAR per il
mantenimento della sua stabilitagrave funzionale Sia in modelli cellulari di
SBMA che in topi transgenici lrsquoinibizione di Hsp90 da parte di 17-
AAG il derivato 17 allilammino-17-demetossi della geldanamicina ha
46
portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal
macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati
disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da
destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione
dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di
SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave
rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati
[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori
hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo
sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa
(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni
Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]
Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo
egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali
sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al
hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina
(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi
familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un
complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data
da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto
47
lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della
stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave
dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita
neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei
neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che
codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a
PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson
familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson
suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente
associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che
Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate
con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente
diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina
egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille
ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno
recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di
alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che
sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina
[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce
lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari
Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-
dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento
tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-
sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da
chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di
mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il
macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD
associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-
48
sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative
caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave
caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di
tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD
lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da
unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina
chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta
(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si
era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero
netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un
gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e
Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave
causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma
17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau
[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine
neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso
portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina
mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da
Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei
modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave
patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-
dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla
settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad
una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di
tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno
dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una
diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di
AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le
49
relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la
degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90
[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al
(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave
stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da
GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β
effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi
GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di
Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe
portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in
strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati
indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone
biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione
di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da
parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi
proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di
queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)
Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie
neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio
approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare
dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la
formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione
potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di
Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare
terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare
malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo
centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90
puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione
50
successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti
neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti
clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto
che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono
tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in
modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni
nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati
promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio
spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in
modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di
Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a
lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse
da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase
esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora
rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori
dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per
mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie
neurodegenerative
51
SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-
ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-
METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE
(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE
MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO
SULLA FRAMMENTAZIONE
Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in
risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta
nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine
regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il
ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai
loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine
client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro
cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire
su molti percorsi oncogenici
Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il
nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che
lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati
composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP
attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del
processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono
emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i
tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule
normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina
(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una
maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto
che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una
piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
28
Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo
substrato
La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra
domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che
collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo
solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi
residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame
allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A
dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso
Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un
legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in
nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano
completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve
entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo
fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui
coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del
segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti
integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A
29
capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il
quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di
ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a
idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di
DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro
catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente
arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia
drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete
crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la
barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK
costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina
superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura
della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera
attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della
prolina
DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-
NUCLEOTIDE
Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi
meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono
fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la
liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del
substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la
dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine
BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave
dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con
30
funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S
cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1
(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la
disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e
HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70
fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi
della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente
indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene
GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg
di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei
nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte
posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i
nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario
BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in
modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del
complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si
compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo
Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva
[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con
conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve
indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca
di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di
convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la
reazione di scambio nucleotidica di Hsp70
31
LEGAMI Hsp70-Hsp70
Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro
della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In
particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce
come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola
lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di
questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento
Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il
cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che
sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi
eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente
lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se
non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di
complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di
nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di
scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione
importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto
di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel
folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle
Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza
proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa
con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere
coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di
traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina
Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come
sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le
interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di
32
Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi
SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua
attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano
legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di
idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede
possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano
lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina
stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che
Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami
con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina
J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di
stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega
bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o
Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non
limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che
la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-
associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con
Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito
meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande
aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante
per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70
AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP
Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli
AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione
disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]
33
Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un
anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del
proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico
20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA
svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP
Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104
nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico
per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste
attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come
una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-
etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE
per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla
fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il
meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere
tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria
per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli
anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una
parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali
suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata
assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando
una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a
spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad
entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel
caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro
che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti
dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una
proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In
parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno
34
individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi
domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre
interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta
apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati
che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la
questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)
Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97
Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da
proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad
entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro
efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non
devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati
dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte
lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono
piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte
superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine
adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il
35
movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori
p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su
proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di
proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la
retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e
reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo
anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite
adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente
il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente
forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei
canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]
LrsquoAZIONE DELLrsquoATP
La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico
al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco
affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad
esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello
Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che
ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo
di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli
wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli
mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori
dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di
ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di
un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di
quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda
36
subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino
al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave
significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o
sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti
differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra
essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che
attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave
adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non
vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a
cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di
subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico
Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un
substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di
queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un
meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da
F1-ATPasi non sembra escluso
HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE
NEURODEGENERATIVE
RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE
Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel
mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una
pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi
associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione
37
di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di
Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta
promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]
Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90
nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave
funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi
permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]
HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico
Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono
mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)
accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock
citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata
da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante
di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo
stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si
lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei
geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-
shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via
multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di
transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-
translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90
[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e
mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo
shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con
Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)
38
attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da
shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni
Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che
i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro
sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock
termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su
attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato
che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi
di insulti
Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90
e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con
shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La
somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a
topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello
39
Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge
contro aggregati tossici
Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un
aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave
egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di
chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione
incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste
molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente
diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su
espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative
Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie
neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a
mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei
neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia
muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-
pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma
mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme
nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che
Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in
oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza
attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili
[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di
Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt
mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore
di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo
suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro
effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi
40
indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando
monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono
probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono
essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di
atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70
permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]
Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare
spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo
nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un
miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina
[62]
Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il
riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso
lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido
dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli
di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i
motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione
acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni
Riluzolo
Arimoclomol
41
Nei vari modelli cellulari della malattia di Alzheimer (AD) vi egrave un
incremento dei livelli di Hsp70 promossa dalla solubilitagrave e dal legame ai
microtubuli delle proteine tau [63] Hsp70 ha anche inibito la
propensione di aggregazione di Aβ [64] e ridotto la tossicitagrave di Aβ su
culture neuronali [65] Inoltre la proteina precursore dellrsquoamiloide
(APP) eo il suo Aβ amiloide derivato sono bersagli di chaperoni
mediati da clearence [66-67] Nella Drosophila melanogaster e nei
modelli di lievito della malattia di Parkinson (PD) lrsquoespressione diretta
di Hsp70 o la modulazione farmacologica di Hsp ha impedito la perdita
di neuroni causata da alfa-sinucleina [68-69] Huang et al hanno
riportato che questi effetti di Hsp70 si manifestano con lrsquoinibizione della
formazione di fibrille di alfa-sinucleina prevenendo la formazione di
alfa-sinucleina prefibrillare [70] Usando delezioni mutanti di alfa-
sinucleina Luk et al hanno indicato che le interazioni tra il dominio
legante il substrato Hsp70 e la regione del core idrofobico dellrsquoalfa-
sinucleina mediano lrsquoinibizione dellrsquoassemblaggio e che questo
processo di assemblaggio egrave inibito prima della fase di allungamento
[71] Nel complesso in diversi modelli di malattia neurodegenerativa la
sovra espressione di Hsp70 ha migliorato la gravitagrave della malattia di
fenotipi diversi senza incidere visibilmente sulla formazione di
aggregati suggerendo che i chaperoni non impediscono lrsquoaggregazione
di per seacute bensigrave reindirizzano gli aggregati preferibilmente in depositi
amorfi quindi sequestrando specie potenzialmente tossiche dalla
maggior parte della soluzione
42
Lrsquoespressione di Hsp70 e di altre Hsp egrave indotta dallrsquoinibizione
farmacologica di Hsp90
Come riportato sopra lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal
complesso con Hsp90 con susseguente produzione di Hsp (Figura 7) e
lrsquoinduzione di Hsp70 da parte di inibitori di Hsp90 egrave ben documentata
nei modelli di malattie neurodegenerative La geldanamicina (GM) un
inibitore di Hsp90 induce un aumento dose dipendente di Hsp70 nei
modelli di cellule di AD (Alzhaimer) cosigrave come nei neuroni della
corteccia primaria del ratto e riduce la quantitagrave di tau insolubili e dei
livelli basali di acido okadaico indotto da tau fosforilazione [63] Il
trattamento di neuroni primari corticali con lrsquoinibitore di Hsp90 con
struttura purinica il PU24FCI ha portato ad un aumento di Hsp70 dose-
dipendente [72]
PU24FCI
KU32
43
Allo stesso modo la somministrazione di due derivati di PU24FCI
CNS-permeabili il PU-DZ8 [72] ed il EC102 [73] a topi tau transgenici
(htau e JNPL3) ha determinato induzione di Hsp70 nel cervello e
mantenuto gli effetti per 24 ore dopo la somministrazione KU32 un
inibitore di Hsp90 di diversa natura chimica ha indotto Hsp70 in culture
SH-SY5Y di neuroblastoma e la ha protetta da tossicitagrave indotta da Aβ
GM ha attivato una risposta da shock termico ed inibito lrsquoaggregazione
di htt in un modello di coltura cellulare di HD ed ha indotto Hsp70 in
maniera tempo e concentrazione-dipendente ed ha impedito
lrsquoaggregazione di alfa-sinucleina e protetto contro la tossicitagrave in un
modello di aggregazione cellulare di alfa-sinucleina Auluck et al hanno
segnalato che il trattamento di un modello volante di PD con GM ha
protetto completamente contro tossicitagrave per alfa-sinucleina [74] GM ha
protetto anche contro la neurotossicitagrave dopaminergica indotta da 1-metil-
4-fenil-1236-tetraidropiridina (MPTP) in un modello di topo di PD Il
pretrattamento con GM mediante iniezione ventricolare intracerebrale
prima del trattamento con MPTP ha indotto le Hsp70 ed incrementato il
contenuto residuale di dopamina e lrsquoimmuno reattivitagrave della tirosina
idrolasi nel corpo striato [75] Lrsquoinduzione di Hsp70 nel midollo spinale
egrave stata osservata in seguito ad iniezione intraperitoneale di un derivato
della GM il 17-AAG in un modello di SBMA topo [76] Il 17-AAG egrave
stato anche efficace contro la nuerodegenerazione in altre malattie
poliQ Vale a dire ha soppresso la degenerazione dellrsquoocchio e la
formazione di inclusioni del corpo e salvato dalla letalitagrave in un modello
di SCA di Drosophila Ha inoltre soppresso la neurodegenerazione in un
modello volante di HD La riduzione di HSF-1 ha abolito lrsquoinduzione di
chaperoni molecolari e gli effeti terapeutici di 17-AAG sulla
neurodegenerazione poliQ indotta nei modelli di Drosophila facendo
44
arguire che lrsquoeffetto terapeutico di 17-AAG egrave essenzialmente mediato da
HSF-1 [77] Riassumendo lrsquoattivazione di HSF-1 da inibitori di Hsp90
egrave stata notata specificamente in modelli in vivo ed in vitro di malattie
neurodegenerative suggerendo che lrsquoinibizione di Hsp90 puograve essere un
mezzo per modulare i livelli di Hsp in cervelli malati con lrsquoobbiettivo di
proteggere contro le proteine tossiche che si presentano nel corso del
processo neurodegenerativo
Lrsquoinibizione di Hsp90 riduce lrsquoattivitagrave e lrsquoespressione di proteine
neuronali aberranti
In aggiunta alla regolazione di HSF-1 evidenze recenti suggeriscono un
ruolo addizionale per Hsp90 nel mantenimento della stabilitagrave funzionale
della capacitagrave aberrante di proteine neuronali (Figura 8A)
La SBMA egrave una malattia ereditaria dei motoneuroni causata
dallrsquoaccrescimento di un tratto di poliglutamina allrsquointerno del recettore
androgeno (AR) [57]
Le caratteristiche patologiche di SBMA sono perdita dei motoneuroni
nel midollo spinale e nel tronco cerebrale diffusione dellrsquoaccumulo
nucleare inclusioni nucleari di mutanti AR (mAR) nei motoneuroni
residui e in alcuni organi viscerali Waza et al hanno dimostrato che
mAR presente in SBMA egrave una delle proteine regolate da Hsp90 (Figura
8A) [76]
45
Figura 8 Le Hsp90 riparano le proteine neuronali aberranti (A) Proteine neuronali
aberranti regolate da Hsp90 (B) Lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90porta allrsquoinattivazione
o degradazione delle proteine regulate da Hsp90 probabilmente attraverso la via del
proteasoma
Le Hsp90 formano un complesso molecolare con mAR per il
mantenimento della sua stabilitagrave funzionale Sia in modelli cellulari di
SBMA che in topi transgenici lrsquoinibizione di Hsp90 da parte di 17-
AAG il derivato 17 allilammino-17-demetossi della geldanamicina ha
46
portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal
macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati
disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da
destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione
dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di
SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave
rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati
[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori
hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo
sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa
(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni
Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]
Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo
egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali
sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al
hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina
(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi
familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un
complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data
da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto
47
lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della
stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave
dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita
neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei
neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che
codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a
PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson
familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson
suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente
associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che
Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate
con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente
diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina
egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille
ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno
recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di
alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che
sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina
[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce
lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari
Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-
dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento
tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-
sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da
chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di
mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il
macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD
associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-
48
sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative
caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave
caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di
tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD
lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da
unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina
chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta
(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si
era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero
netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un
gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e
Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave
causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma
17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau
[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine
neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso
portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina
mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da
Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei
modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave
patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-
dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla
settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad
una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di
tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno
dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una
diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di
AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le
49
relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la
degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90
[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al
(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave
stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da
GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β
effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi
GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di
Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe
portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in
strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati
indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone
biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione
di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da
parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi
proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di
queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)
Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie
neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio
approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare
dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la
formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione
potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di
Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare
terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare
malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo
centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90
puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione
50
successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti
neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti
clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto
che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono
tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in
modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni
nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati
promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio
spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in
modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di
Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a
lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse
da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase
esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora
rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori
dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per
mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie
neurodegenerative
51
SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-
ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-
METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE
(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE
MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO
SULLA FRAMMENTAZIONE
Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in
risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta
nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine
regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il
ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai
loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine
client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro
cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire
su molti percorsi oncogenici
Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il
nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che
lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati
composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP
attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del
processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono
emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i
tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule
normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina
(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una
maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto
che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una
piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
29
capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il
quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di
ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a
idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di
DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro
catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente
arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia
drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete
crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la
barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK
costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina
superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura
della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera
attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della
prolina
DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-
NUCLEOTIDE
Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi
meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono
fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la
liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del
substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la
dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine
BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave
dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con
30
funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S
cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1
(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la
disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e
HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70
fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi
della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente
indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene
GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg
di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei
nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte
posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i
nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario
BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in
modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del
complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si
compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo
Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva
[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con
conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve
indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca
di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di
convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la
reazione di scambio nucleotidica di Hsp70
31
LEGAMI Hsp70-Hsp70
Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro
della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In
particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce
come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola
lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di
questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento
Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il
cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che
sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi
eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente
lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se
non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di
complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di
nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di
scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione
importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto
di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel
folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle
Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza
proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa
con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere
coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di
traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina
Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come
sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le
interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di
32
Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi
SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua
attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano
legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di
idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede
possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano
lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina
stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che
Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami
con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina
J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di
stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega
bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o
Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non
limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che
la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-
associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con
Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito
meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande
aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante
per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70
AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP
Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli
AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione
disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]
33
Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un
anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del
proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico
20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA
svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP
Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104
nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico
per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste
attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come
una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-
etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE
per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla
fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il
meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere
tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria
per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli
anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una
parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali
suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata
assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando
una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a
spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad
entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel
caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro
che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti
dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una
proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In
parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno
34
individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi
domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre
interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta
apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati
che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la
questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)
Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97
Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da
proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad
entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro
efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non
devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati
dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte
lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono
piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte
superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine
adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il
35
movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori
p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su
proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di
proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la
retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e
reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo
anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite
adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente
il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente
forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei
canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]
LrsquoAZIONE DELLrsquoATP
La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico
al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco
affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad
esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello
Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che
ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo
di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli
wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli
mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori
dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di
ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di
un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di
quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda
36
subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino
al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave
significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o
sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti
differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra
essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che
attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave
adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non
vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a
cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di
subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico
Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un
substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di
queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un
meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da
F1-ATPasi non sembra escluso
HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE
NEURODEGENERATIVE
RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE
Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel
mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una
pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi
associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione
37
di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di
Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta
promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]
Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90
nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave
funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi
permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]
HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico
Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono
mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)
accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock
citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata
da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante
di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo
stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si
lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei
geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-
shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via
multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di
transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-
translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90
[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e
mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo
shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con
Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)
38
attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da
shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni
Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che
i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro
sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock
termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su
attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato
che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi
di insulti
Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90
e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con
shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La
somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a
topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello
39
Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge
contro aggregati tossici
Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un
aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave
egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di
chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione
incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste
molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente
diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su
espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative
Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie
neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a
mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei
neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia
muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-
pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma
mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme
nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che
Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in
oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza
attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili
[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di
Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt
mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore
di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo
suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro
effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi
40
indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando
monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono
probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono
essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di
atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70
permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]
Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare
spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo
nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un
miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina
[62]
Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il
riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso
lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido
dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli
di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i
motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione
acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni
Riluzolo
Arimoclomol
41
Nei vari modelli cellulari della malattia di Alzheimer (AD) vi egrave un
incremento dei livelli di Hsp70 promossa dalla solubilitagrave e dal legame ai
microtubuli delle proteine tau [63] Hsp70 ha anche inibito la
propensione di aggregazione di Aβ [64] e ridotto la tossicitagrave di Aβ su
culture neuronali [65] Inoltre la proteina precursore dellrsquoamiloide
(APP) eo il suo Aβ amiloide derivato sono bersagli di chaperoni
mediati da clearence [66-67] Nella Drosophila melanogaster e nei
modelli di lievito della malattia di Parkinson (PD) lrsquoespressione diretta
di Hsp70 o la modulazione farmacologica di Hsp ha impedito la perdita
di neuroni causata da alfa-sinucleina [68-69] Huang et al hanno
riportato che questi effetti di Hsp70 si manifestano con lrsquoinibizione della
formazione di fibrille di alfa-sinucleina prevenendo la formazione di
alfa-sinucleina prefibrillare [70] Usando delezioni mutanti di alfa-
sinucleina Luk et al hanno indicato che le interazioni tra il dominio
legante il substrato Hsp70 e la regione del core idrofobico dellrsquoalfa-
sinucleina mediano lrsquoinibizione dellrsquoassemblaggio e che questo
processo di assemblaggio egrave inibito prima della fase di allungamento
[71] Nel complesso in diversi modelli di malattia neurodegenerativa la
sovra espressione di Hsp70 ha migliorato la gravitagrave della malattia di
fenotipi diversi senza incidere visibilmente sulla formazione di
aggregati suggerendo che i chaperoni non impediscono lrsquoaggregazione
di per seacute bensigrave reindirizzano gli aggregati preferibilmente in depositi
amorfi quindi sequestrando specie potenzialmente tossiche dalla
maggior parte della soluzione
42
Lrsquoespressione di Hsp70 e di altre Hsp egrave indotta dallrsquoinibizione
farmacologica di Hsp90
Come riportato sopra lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal
complesso con Hsp90 con susseguente produzione di Hsp (Figura 7) e
lrsquoinduzione di Hsp70 da parte di inibitori di Hsp90 egrave ben documentata
nei modelli di malattie neurodegenerative La geldanamicina (GM) un
inibitore di Hsp90 induce un aumento dose dipendente di Hsp70 nei
modelli di cellule di AD (Alzhaimer) cosigrave come nei neuroni della
corteccia primaria del ratto e riduce la quantitagrave di tau insolubili e dei
livelli basali di acido okadaico indotto da tau fosforilazione [63] Il
trattamento di neuroni primari corticali con lrsquoinibitore di Hsp90 con
struttura purinica il PU24FCI ha portato ad un aumento di Hsp70 dose-
dipendente [72]
PU24FCI
KU32
43
Allo stesso modo la somministrazione di due derivati di PU24FCI
CNS-permeabili il PU-DZ8 [72] ed il EC102 [73] a topi tau transgenici
(htau e JNPL3) ha determinato induzione di Hsp70 nel cervello e
mantenuto gli effetti per 24 ore dopo la somministrazione KU32 un
inibitore di Hsp90 di diversa natura chimica ha indotto Hsp70 in culture
SH-SY5Y di neuroblastoma e la ha protetta da tossicitagrave indotta da Aβ
GM ha attivato una risposta da shock termico ed inibito lrsquoaggregazione
di htt in un modello di coltura cellulare di HD ed ha indotto Hsp70 in
maniera tempo e concentrazione-dipendente ed ha impedito
lrsquoaggregazione di alfa-sinucleina e protetto contro la tossicitagrave in un
modello di aggregazione cellulare di alfa-sinucleina Auluck et al hanno
segnalato che il trattamento di un modello volante di PD con GM ha
protetto completamente contro tossicitagrave per alfa-sinucleina [74] GM ha
protetto anche contro la neurotossicitagrave dopaminergica indotta da 1-metil-
4-fenil-1236-tetraidropiridina (MPTP) in un modello di topo di PD Il
pretrattamento con GM mediante iniezione ventricolare intracerebrale
prima del trattamento con MPTP ha indotto le Hsp70 ed incrementato il
contenuto residuale di dopamina e lrsquoimmuno reattivitagrave della tirosina
idrolasi nel corpo striato [75] Lrsquoinduzione di Hsp70 nel midollo spinale
egrave stata osservata in seguito ad iniezione intraperitoneale di un derivato
della GM il 17-AAG in un modello di SBMA topo [76] Il 17-AAG egrave
stato anche efficace contro la nuerodegenerazione in altre malattie
poliQ Vale a dire ha soppresso la degenerazione dellrsquoocchio e la
formazione di inclusioni del corpo e salvato dalla letalitagrave in un modello
di SCA di Drosophila Ha inoltre soppresso la neurodegenerazione in un
modello volante di HD La riduzione di HSF-1 ha abolito lrsquoinduzione di
chaperoni molecolari e gli effeti terapeutici di 17-AAG sulla
neurodegenerazione poliQ indotta nei modelli di Drosophila facendo
44
arguire che lrsquoeffetto terapeutico di 17-AAG egrave essenzialmente mediato da
HSF-1 [77] Riassumendo lrsquoattivazione di HSF-1 da inibitori di Hsp90
egrave stata notata specificamente in modelli in vivo ed in vitro di malattie
neurodegenerative suggerendo che lrsquoinibizione di Hsp90 puograve essere un
mezzo per modulare i livelli di Hsp in cervelli malati con lrsquoobbiettivo di
proteggere contro le proteine tossiche che si presentano nel corso del
processo neurodegenerativo
Lrsquoinibizione di Hsp90 riduce lrsquoattivitagrave e lrsquoespressione di proteine
neuronali aberranti
In aggiunta alla regolazione di HSF-1 evidenze recenti suggeriscono un
ruolo addizionale per Hsp90 nel mantenimento della stabilitagrave funzionale
della capacitagrave aberrante di proteine neuronali (Figura 8A)
La SBMA egrave una malattia ereditaria dei motoneuroni causata
dallrsquoaccrescimento di un tratto di poliglutamina allrsquointerno del recettore
androgeno (AR) [57]
Le caratteristiche patologiche di SBMA sono perdita dei motoneuroni
nel midollo spinale e nel tronco cerebrale diffusione dellrsquoaccumulo
nucleare inclusioni nucleari di mutanti AR (mAR) nei motoneuroni
residui e in alcuni organi viscerali Waza et al hanno dimostrato che
mAR presente in SBMA egrave una delle proteine regolate da Hsp90 (Figura
8A) [76]
45
Figura 8 Le Hsp90 riparano le proteine neuronali aberranti (A) Proteine neuronali
aberranti regolate da Hsp90 (B) Lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90porta allrsquoinattivazione
o degradazione delle proteine regulate da Hsp90 probabilmente attraverso la via del
proteasoma
Le Hsp90 formano un complesso molecolare con mAR per il
mantenimento della sua stabilitagrave funzionale Sia in modelli cellulari di
SBMA che in topi transgenici lrsquoinibizione di Hsp90 da parte di 17-
AAG il derivato 17 allilammino-17-demetossi della geldanamicina ha
46
portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal
macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati
disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da
destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione
dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di
SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave
rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati
[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori
hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo
sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa
(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni
Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]
Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo
egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali
sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al
hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina
(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi
familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un
complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data
da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto
47
lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della
stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave
dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita
neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei
neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che
codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a
PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson
familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson
suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente
associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che
Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate
con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente
diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina
egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille
ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno
recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di
alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che
sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina
[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce
lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari
Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-
dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento
tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-
sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da
chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di
mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il
macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD
associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-
48
sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative
caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave
caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di
tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD
lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da
unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina
chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta
(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si
era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero
netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un
gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e
Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave
causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma
17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau
[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine
neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso
portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina
mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da
Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei
modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave
patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-
dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla
settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad
una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di
tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno
dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una
diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di
AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le
49
relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la
degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90
[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al
(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave
stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da
GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β
effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi
GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di
Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe
portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in
strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati
indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone
biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione
di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da
parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi
proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di
queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)
Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie
neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio
approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare
dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la
formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione
potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di
Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare
terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare
malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo
centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90
puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione
50
successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti
neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti
clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto
che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono
tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in
modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni
nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati
promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio
spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in
modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di
Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a
lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse
da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase
esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora
rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori
dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per
mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie
neurodegenerative
51
SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-
ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-
METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE
(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE
MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO
SULLA FRAMMENTAZIONE
Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in
risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta
nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine
regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il
ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai
loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine
client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro
cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire
su molti percorsi oncogenici
Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il
nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che
lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati
composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP
attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del
processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono
emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i
tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule
normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina
(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una
maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto
che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una
piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
30
funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S
cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1
(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la
disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e
HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70
fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi
della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente
indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene
GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg
di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei
nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte
posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i
nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario
BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in
modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del
complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si
compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo
Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva
[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con
conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve
indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca
di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di
convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la
reazione di scambio nucleotidica di Hsp70
31
LEGAMI Hsp70-Hsp70
Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro
della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In
particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce
come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola
lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di
questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento
Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il
cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che
sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi
eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente
lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se
non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di
complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di
nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di
scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione
importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto
di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel
folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle
Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza
proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa
con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere
coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di
traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina
Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come
sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le
interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di
32
Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi
SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua
attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano
legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di
idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede
possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano
lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina
stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che
Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami
con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina
J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di
stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega
bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o
Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non
limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che
la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-
associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con
Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito
meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande
aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante
per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70
AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP
Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli
AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione
disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]
33
Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un
anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del
proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico
20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA
svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP
Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104
nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico
per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste
attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come
una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-
etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE
per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla
fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il
meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere
tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria
per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli
anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una
parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali
suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata
assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando
una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a
spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad
entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel
caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro
che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti
dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una
proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In
parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno
34
individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi
domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre
interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta
apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati
che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la
questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)
Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97
Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da
proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad
entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro
efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non
devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati
dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte
lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono
piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte
superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine
adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il
35
movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori
p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su
proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di
proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la
retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e
reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo
anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite
adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente
il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente
forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei
canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]
LrsquoAZIONE DELLrsquoATP
La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico
al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco
affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad
esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello
Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che
ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo
di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli
wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli
mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori
dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di
ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di
un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di
quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda
36
subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino
al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave
significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o
sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti
differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra
essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che
attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave
adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non
vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a
cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di
subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico
Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un
substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di
queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un
meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da
F1-ATPasi non sembra escluso
HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE
NEURODEGENERATIVE
RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE
Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel
mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una
pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi
associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione
37
di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di
Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta
promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]
Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90
nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave
funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi
permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]
HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico
Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono
mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)
accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock
citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata
da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante
di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo
stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si
lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei
geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-
shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via
multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di
transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-
translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90
[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e
mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo
shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con
Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)
38
attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da
shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni
Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che
i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro
sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock
termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su
attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato
che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi
di insulti
Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90
e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con
shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La
somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a
topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello
39
Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge
contro aggregati tossici
Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un
aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave
egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di
chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione
incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste
molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente
diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su
espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative
Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie
neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a
mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei
neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia
muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-
pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma
mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme
nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che
Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in
oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza
attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili
[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di
Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt
mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore
di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo
suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro
effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi
40
indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando
monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono
probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono
essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di
atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70
permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]
Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare
spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo
nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un
miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina
[62]
Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il
riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso
lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido
dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli
di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i
motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione
acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni
Riluzolo
Arimoclomol
41
Nei vari modelli cellulari della malattia di Alzheimer (AD) vi egrave un
incremento dei livelli di Hsp70 promossa dalla solubilitagrave e dal legame ai
microtubuli delle proteine tau [63] Hsp70 ha anche inibito la
propensione di aggregazione di Aβ [64] e ridotto la tossicitagrave di Aβ su
culture neuronali [65] Inoltre la proteina precursore dellrsquoamiloide
(APP) eo il suo Aβ amiloide derivato sono bersagli di chaperoni
mediati da clearence [66-67] Nella Drosophila melanogaster e nei
modelli di lievito della malattia di Parkinson (PD) lrsquoespressione diretta
di Hsp70 o la modulazione farmacologica di Hsp ha impedito la perdita
di neuroni causata da alfa-sinucleina [68-69] Huang et al hanno
riportato che questi effetti di Hsp70 si manifestano con lrsquoinibizione della
formazione di fibrille di alfa-sinucleina prevenendo la formazione di
alfa-sinucleina prefibrillare [70] Usando delezioni mutanti di alfa-
sinucleina Luk et al hanno indicato che le interazioni tra il dominio
legante il substrato Hsp70 e la regione del core idrofobico dellrsquoalfa-
sinucleina mediano lrsquoinibizione dellrsquoassemblaggio e che questo
processo di assemblaggio egrave inibito prima della fase di allungamento
[71] Nel complesso in diversi modelli di malattia neurodegenerativa la
sovra espressione di Hsp70 ha migliorato la gravitagrave della malattia di
fenotipi diversi senza incidere visibilmente sulla formazione di
aggregati suggerendo che i chaperoni non impediscono lrsquoaggregazione
di per seacute bensigrave reindirizzano gli aggregati preferibilmente in depositi
amorfi quindi sequestrando specie potenzialmente tossiche dalla
maggior parte della soluzione
42
Lrsquoespressione di Hsp70 e di altre Hsp egrave indotta dallrsquoinibizione
farmacologica di Hsp90
Come riportato sopra lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal
complesso con Hsp90 con susseguente produzione di Hsp (Figura 7) e
lrsquoinduzione di Hsp70 da parte di inibitori di Hsp90 egrave ben documentata
nei modelli di malattie neurodegenerative La geldanamicina (GM) un
inibitore di Hsp90 induce un aumento dose dipendente di Hsp70 nei
modelli di cellule di AD (Alzhaimer) cosigrave come nei neuroni della
corteccia primaria del ratto e riduce la quantitagrave di tau insolubili e dei
livelli basali di acido okadaico indotto da tau fosforilazione [63] Il
trattamento di neuroni primari corticali con lrsquoinibitore di Hsp90 con
struttura purinica il PU24FCI ha portato ad un aumento di Hsp70 dose-
dipendente [72]
PU24FCI
KU32
43
Allo stesso modo la somministrazione di due derivati di PU24FCI
CNS-permeabili il PU-DZ8 [72] ed il EC102 [73] a topi tau transgenici
(htau e JNPL3) ha determinato induzione di Hsp70 nel cervello e
mantenuto gli effetti per 24 ore dopo la somministrazione KU32 un
inibitore di Hsp90 di diversa natura chimica ha indotto Hsp70 in culture
SH-SY5Y di neuroblastoma e la ha protetta da tossicitagrave indotta da Aβ
GM ha attivato una risposta da shock termico ed inibito lrsquoaggregazione
di htt in un modello di coltura cellulare di HD ed ha indotto Hsp70 in
maniera tempo e concentrazione-dipendente ed ha impedito
lrsquoaggregazione di alfa-sinucleina e protetto contro la tossicitagrave in un
modello di aggregazione cellulare di alfa-sinucleina Auluck et al hanno
segnalato che il trattamento di un modello volante di PD con GM ha
protetto completamente contro tossicitagrave per alfa-sinucleina [74] GM ha
protetto anche contro la neurotossicitagrave dopaminergica indotta da 1-metil-
4-fenil-1236-tetraidropiridina (MPTP) in un modello di topo di PD Il
pretrattamento con GM mediante iniezione ventricolare intracerebrale
prima del trattamento con MPTP ha indotto le Hsp70 ed incrementato il
contenuto residuale di dopamina e lrsquoimmuno reattivitagrave della tirosina
idrolasi nel corpo striato [75] Lrsquoinduzione di Hsp70 nel midollo spinale
egrave stata osservata in seguito ad iniezione intraperitoneale di un derivato
della GM il 17-AAG in un modello di SBMA topo [76] Il 17-AAG egrave
stato anche efficace contro la nuerodegenerazione in altre malattie
poliQ Vale a dire ha soppresso la degenerazione dellrsquoocchio e la
formazione di inclusioni del corpo e salvato dalla letalitagrave in un modello
di SCA di Drosophila Ha inoltre soppresso la neurodegenerazione in un
modello volante di HD La riduzione di HSF-1 ha abolito lrsquoinduzione di
chaperoni molecolari e gli effeti terapeutici di 17-AAG sulla
neurodegenerazione poliQ indotta nei modelli di Drosophila facendo
44
arguire che lrsquoeffetto terapeutico di 17-AAG egrave essenzialmente mediato da
HSF-1 [77] Riassumendo lrsquoattivazione di HSF-1 da inibitori di Hsp90
egrave stata notata specificamente in modelli in vivo ed in vitro di malattie
neurodegenerative suggerendo che lrsquoinibizione di Hsp90 puograve essere un
mezzo per modulare i livelli di Hsp in cervelli malati con lrsquoobbiettivo di
proteggere contro le proteine tossiche che si presentano nel corso del
processo neurodegenerativo
Lrsquoinibizione di Hsp90 riduce lrsquoattivitagrave e lrsquoespressione di proteine
neuronali aberranti
In aggiunta alla regolazione di HSF-1 evidenze recenti suggeriscono un
ruolo addizionale per Hsp90 nel mantenimento della stabilitagrave funzionale
della capacitagrave aberrante di proteine neuronali (Figura 8A)
La SBMA egrave una malattia ereditaria dei motoneuroni causata
dallrsquoaccrescimento di un tratto di poliglutamina allrsquointerno del recettore
androgeno (AR) [57]
Le caratteristiche patologiche di SBMA sono perdita dei motoneuroni
nel midollo spinale e nel tronco cerebrale diffusione dellrsquoaccumulo
nucleare inclusioni nucleari di mutanti AR (mAR) nei motoneuroni
residui e in alcuni organi viscerali Waza et al hanno dimostrato che
mAR presente in SBMA egrave una delle proteine regolate da Hsp90 (Figura
8A) [76]
45
Figura 8 Le Hsp90 riparano le proteine neuronali aberranti (A) Proteine neuronali
aberranti regolate da Hsp90 (B) Lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90porta allrsquoinattivazione
o degradazione delle proteine regulate da Hsp90 probabilmente attraverso la via del
proteasoma
Le Hsp90 formano un complesso molecolare con mAR per il
mantenimento della sua stabilitagrave funzionale Sia in modelli cellulari di
SBMA che in topi transgenici lrsquoinibizione di Hsp90 da parte di 17-
AAG il derivato 17 allilammino-17-demetossi della geldanamicina ha
46
portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal
macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati
disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da
destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione
dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di
SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave
rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati
[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori
hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo
sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa
(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni
Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]
Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo
egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali
sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al
hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina
(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi
familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un
complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data
da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto
47
lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della
stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave
dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita
neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei
neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che
codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a
PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson
familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson
suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente
associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che
Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate
con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente
diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina
egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille
ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno
recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di
alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che
sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina
[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce
lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari
Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-
dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento
tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-
sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da
chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di
mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il
macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD
associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-
48
sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative
caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave
caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di
tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD
lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da
unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina
chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta
(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si
era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero
netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un
gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e
Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave
causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma
17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau
[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine
neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso
portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina
mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da
Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei
modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave
patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-
dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla
settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad
una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di
tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno
dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una
diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di
AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le
49
relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la
degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90
[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al
(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave
stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da
GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β
effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi
GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di
Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe
portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in
strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati
indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone
biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione
di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da
parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi
proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di
queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)
Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie
neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio
approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare
dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la
formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione
potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di
Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare
terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare
malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo
centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90
puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione
50
successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti
neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti
clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto
che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono
tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in
modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni
nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati
promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio
spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in
modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di
Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a
lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse
da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase
esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora
rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori
dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per
mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie
neurodegenerative
51
SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-
ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-
METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE
(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE
MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO
SULLA FRAMMENTAZIONE
Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in
risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta
nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine
regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il
ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai
loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine
client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro
cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire
su molti percorsi oncogenici
Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il
nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che
lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati
composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP
attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del
processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono
emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i
tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule
normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina
(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una
maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto
che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una
piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
31
LEGAMI Hsp70-Hsp70
Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro
della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In
particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce
come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola
lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di
questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento
Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il
cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che
sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi
eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente
lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se
non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di
complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di
nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di
scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione
importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto
di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel
folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle
Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza
proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa
con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere
coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di
traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina
Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come
sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le
interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di
32
Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi
SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua
attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano
legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di
idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede
possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano
lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina
stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che
Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami
con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina
J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di
stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega
bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o
Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non
limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che
la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-
associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con
Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito
meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande
aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante
per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70
AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP
Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli
AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione
disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]
33
Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un
anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del
proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico
20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA
svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP
Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104
nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico
per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste
attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come
una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-
etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE
per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla
fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il
meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere
tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria
per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli
anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una
parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali
suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata
assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando
una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a
spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad
entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel
caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro
che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti
dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una
proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In
parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno
34
individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi
domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre
interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta
apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati
che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la
questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)
Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97
Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da
proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad
entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro
efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non
devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati
dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte
lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono
piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte
superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine
adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il
35
movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori
p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su
proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di
proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la
retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e
reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo
anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite
adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente
il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente
forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei
canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]
LrsquoAZIONE DELLrsquoATP
La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico
al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco
affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad
esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello
Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che
ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo
di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli
wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli
mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori
dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di
ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di
un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di
quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda
36
subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino
al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave
significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o
sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti
differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra
essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che
attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave
adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non
vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a
cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di
subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico
Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un
substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di
queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un
meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da
F1-ATPasi non sembra escluso
HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE
NEURODEGENERATIVE
RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE
Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel
mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una
pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi
associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione
37
di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di
Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta
promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]
Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90
nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave
funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi
permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]
HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico
Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono
mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)
accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock
citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata
da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante
di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo
stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si
lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei
geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-
shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via
multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di
transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-
translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90
[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e
mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo
shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con
Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)
38
attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da
shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni
Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che
i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro
sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock
termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su
attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato
che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi
di insulti
Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90
e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con
shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La
somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a
topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello
39
Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge
contro aggregati tossici
Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un
aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave
egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di
chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione
incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste
molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente
diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su
espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative
Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie
neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a
mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei
neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia
muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-
pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma
mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme
nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che
Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in
oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza
attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili
[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di
Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt
mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore
di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo
suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro
effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi
40
indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando
monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono
probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono
essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di
atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70
permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]
Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare
spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo
nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un
miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina
[62]
Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il
riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso
lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido
dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli
di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i
motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione
acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni
Riluzolo
Arimoclomol
41
Nei vari modelli cellulari della malattia di Alzheimer (AD) vi egrave un
incremento dei livelli di Hsp70 promossa dalla solubilitagrave e dal legame ai
microtubuli delle proteine tau [63] Hsp70 ha anche inibito la
propensione di aggregazione di Aβ [64] e ridotto la tossicitagrave di Aβ su
culture neuronali [65] Inoltre la proteina precursore dellrsquoamiloide
(APP) eo il suo Aβ amiloide derivato sono bersagli di chaperoni
mediati da clearence [66-67] Nella Drosophila melanogaster e nei
modelli di lievito della malattia di Parkinson (PD) lrsquoespressione diretta
di Hsp70 o la modulazione farmacologica di Hsp ha impedito la perdita
di neuroni causata da alfa-sinucleina [68-69] Huang et al hanno
riportato che questi effetti di Hsp70 si manifestano con lrsquoinibizione della
formazione di fibrille di alfa-sinucleina prevenendo la formazione di
alfa-sinucleina prefibrillare [70] Usando delezioni mutanti di alfa-
sinucleina Luk et al hanno indicato che le interazioni tra il dominio
legante il substrato Hsp70 e la regione del core idrofobico dellrsquoalfa-
sinucleina mediano lrsquoinibizione dellrsquoassemblaggio e che questo
processo di assemblaggio egrave inibito prima della fase di allungamento
[71] Nel complesso in diversi modelli di malattia neurodegenerativa la
sovra espressione di Hsp70 ha migliorato la gravitagrave della malattia di
fenotipi diversi senza incidere visibilmente sulla formazione di
aggregati suggerendo che i chaperoni non impediscono lrsquoaggregazione
di per seacute bensigrave reindirizzano gli aggregati preferibilmente in depositi
amorfi quindi sequestrando specie potenzialmente tossiche dalla
maggior parte della soluzione
42
Lrsquoespressione di Hsp70 e di altre Hsp egrave indotta dallrsquoinibizione
farmacologica di Hsp90
Come riportato sopra lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal
complesso con Hsp90 con susseguente produzione di Hsp (Figura 7) e
lrsquoinduzione di Hsp70 da parte di inibitori di Hsp90 egrave ben documentata
nei modelli di malattie neurodegenerative La geldanamicina (GM) un
inibitore di Hsp90 induce un aumento dose dipendente di Hsp70 nei
modelli di cellule di AD (Alzhaimer) cosigrave come nei neuroni della
corteccia primaria del ratto e riduce la quantitagrave di tau insolubili e dei
livelli basali di acido okadaico indotto da tau fosforilazione [63] Il
trattamento di neuroni primari corticali con lrsquoinibitore di Hsp90 con
struttura purinica il PU24FCI ha portato ad un aumento di Hsp70 dose-
dipendente [72]
PU24FCI
KU32
43
Allo stesso modo la somministrazione di due derivati di PU24FCI
CNS-permeabili il PU-DZ8 [72] ed il EC102 [73] a topi tau transgenici
(htau e JNPL3) ha determinato induzione di Hsp70 nel cervello e
mantenuto gli effetti per 24 ore dopo la somministrazione KU32 un
inibitore di Hsp90 di diversa natura chimica ha indotto Hsp70 in culture
SH-SY5Y di neuroblastoma e la ha protetta da tossicitagrave indotta da Aβ
GM ha attivato una risposta da shock termico ed inibito lrsquoaggregazione
di htt in un modello di coltura cellulare di HD ed ha indotto Hsp70 in
maniera tempo e concentrazione-dipendente ed ha impedito
lrsquoaggregazione di alfa-sinucleina e protetto contro la tossicitagrave in un
modello di aggregazione cellulare di alfa-sinucleina Auluck et al hanno
segnalato che il trattamento di un modello volante di PD con GM ha
protetto completamente contro tossicitagrave per alfa-sinucleina [74] GM ha
protetto anche contro la neurotossicitagrave dopaminergica indotta da 1-metil-
4-fenil-1236-tetraidropiridina (MPTP) in un modello di topo di PD Il
pretrattamento con GM mediante iniezione ventricolare intracerebrale
prima del trattamento con MPTP ha indotto le Hsp70 ed incrementato il
contenuto residuale di dopamina e lrsquoimmuno reattivitagrave della tirosina
idrolasi nel corpo striato [75] Lrsquoinduzione di Hsp70 nel midollo spinale
egrave stata osservata in seguito ad iniezione intraperitoneale di un derivato
della GM il 17-AAG in un modello di SBMA topo [76] Il 17-AAG egrave
stato anche efficace contro la nuerodegenerazione in altre malattie
poliQ Vale a dire ha soppresso la degenerazione dellrsquoocchio e la
formazione di inclusioni del corpo e salvato dalla letalitagrave in un modello
di SCA di Drosophila Ha inoltre soppresso la neurodegenerazione in un
modello volante di HD La riduzione di HSF-1 ha abolito lrsquoinduzione di
chaperoni molecolari e gli effeti terapeutici di 17-AAG sulla
neurodegenerazione poliQ indotta nei modelli di Drosophila facendo
44
arguire che lrsquoeffetto terapeutico di 17-AAG egrave essenzialmente mediato da
HSF-1 [77] Riassumendo lrsquoattivazione di HSF-1 da inibitori di Hsp90
egrave stata notata specificamente in modelli in vivo ed in vitro di malattie
neurodegenerative suggerendo che lrsquoinibizione di Hsp90 puograve essere un
mezzo per modulare i livelli di Hsp in cervelli malati con lrsquoobbiettivo di
proteggere contro le proteine tossiche che si presentano nel corso del
processo neurodegenerativo
Lrsquoinibizione di Hsp90 riduce lrsquoattivitagrave e lrsquoespressione di proteine
neuronali aberranti
In aggiunta alla regolazione di HSF-1 evidenze recenti suggeriscono un
ruolo addizionale per Hsp90 nel mantenimento della stabilitagrave funzionale
della capacitagrave aberrante di proteine neuronali (Figura 8A)
La SBMA egrave una malattia ereditaria dei motoneuroni causata
dallrsquoaccrescimento di un tratto di poliglutamina allrsquointerno del recettore
androgeno (AR) [57]
Le caratteristiche patologiche di SBMA sono perdita dei motoneuroni
nel midollo spinale e nel tronco cerebrale diffusione dellrsquoaccumulo
nucleare inclusioni nucleari di mutanti AR (mAR) nei motoneuroni
residui e in alcuni organi viscerali Waza et al hanno dimostrato che
mAR presente in SBMA egrave una delle proteine regolate da Hsp90 (Figura
8A) [76]
45
Figura 8 Le Hsp90 riparano le proteine neuronali aberranti (A) Proteine neuronali
aberranti regolate da Hsp90 (B) Lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90porta allrsquoinattivazione
o degradazione delle proteine regulate da Hsp90 probabilmente attraverso la via del
proteasoma
Le Hsp90 formano un complesso molecolare con mAR per il
mantenimento della sua stabilitagrave funzionale Sia in modelli cellulari di
SBMA che in topi transgenici lrsquoinibizione di Hsp90 da parte di 17-
AAG il derivato 17 allilammino-17-demetossi della geldanamicina ha
46
portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal
macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati
disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da
destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione
dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di
SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave
rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati
[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori
hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo
sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa
(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni
Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]
Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo
egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali
sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al
hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina
(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi
familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un
complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data
da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto
47
lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della
stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave
dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita
neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei
neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che
codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a
PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson
familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson
suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente
associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che
Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate
con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente
diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina
egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille
ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno
recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di
alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che
sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina
[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce
lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari
Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-
dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento
tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-
sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da
chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di
mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il
macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD
associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-
48
sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative
caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave
caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di
tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD
lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da
unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina
chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta
(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si
era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero
netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un
gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e
Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave
causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma
17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau
[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine
neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso
portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina
mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da
Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei
modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave
patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-
dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla
settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad
una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di
tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno
dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una
diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di
AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le
49
relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la
degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90
[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al
(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave
stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da
GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β
effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi
GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di
Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe
portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in
strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati
indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone
biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione
di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da
parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi
proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di
queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)
Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie
neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio
approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare
dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la
formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione
potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di
Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare
terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare
malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo
centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90
puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione
50
successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti
neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti
clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto
che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono
tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in
modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni
nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati
promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio
spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in
modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di
Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a
lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse
da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase
esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora
rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori
dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per
mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie
neurodegenerative
51
SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-
ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-
METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE
(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE
MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO
SULLA FRAMMENTAZIONE
Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in
risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta
nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine
regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il
ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai
loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine
client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro
cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire
su molti percorsi oncogenici
Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il
nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che
lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati
composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP
attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del
processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono
emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i
tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule
normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina
(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una
maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto
che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una
piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
32
Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi
SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua
attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano
legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di
idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede
possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano
lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina
stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che
Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami
con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina
J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di
stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega
bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o
Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non
limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che
la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-
associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con
Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito
meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande
aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante
per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70
AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP
Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli
AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione
disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]
33
Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un
anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del
proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico
20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA
svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP
Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104
nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico
per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste
attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come
una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-
etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE
per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla
fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il
meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere
tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria
per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli
anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una
parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali
suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata
assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando
una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a
spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad
entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel
caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro
che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti
dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una
proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In
parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno
34
individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi
domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre
interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta
apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati
che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la
questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)
Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97
Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da
proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad
entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro
efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non
devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati
dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte
lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono
piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte
superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine
adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il
35
movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori
p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su
proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di
proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la
retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e
reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo
anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite
adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente
il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente
forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei
canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]
LrsquoAZIONE DELLrsquoATP
La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico
al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco
affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad
esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello
Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che
ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo
di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli
wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli
mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori
dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di
ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di
un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di
quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda
36
subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino
al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave
significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o
sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti
differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra
essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che
attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave
adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non
vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a
cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di
subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico
Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un
substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di
queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un
meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da
F1-ATPasi non sembra escluso
HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE
NEURODEGENERATIVE
RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE
Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel
mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una
pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi
associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione
37
di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di
Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta
promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]
Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90
nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave
funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi
permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]
HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico
Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono
mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)
accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock
citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata
da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante
di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo
stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si
lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei
geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-
shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via
multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di
transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-
translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90
[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e
mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo
shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con
Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)
38
attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da
shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni
Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che
i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro
sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock
termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su
attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato
che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi
di insulti
Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90
e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con
shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La
somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a
topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello
39
Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge
contro aggregati tossici
Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un
aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave
egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di
chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione
incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste
molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente
diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su
espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative
Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie
neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a
mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei
neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia
muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-
pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma
mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme
nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che
Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in
oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza
attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili
[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di
Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt
mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore
di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo
suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro
effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi
40
indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando
monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono
probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono
essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di
atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70
permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]
Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare
spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo
nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un
miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina
[62]
Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il
riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso
lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido
dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli
di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i
motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione
acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni
Riluzolo
Arimoclomol
41
Nei vari modelli cellulari della malattia di Alzheimer (AD) vi egrave un
incremento dei livelli di Hsp70 promossa dalla solubilitagrave e dal legame ai
microtubuli delle proteine tau [63] Hsp70 ha anche inibito la
propensione di aggregazione di Aβ [64] e ridotto la tossicitagrave di Aβ su
culture neuronali [65] Inoltre la proteina precursore dellrsquoamiloide
(APP) eo il suo Aβ amiloide derivato sono bersagli di chaperoni
mediati da clearence [66-67] Nella Drosophila melanogaster e nei
modelli di lievito della malattia di Parkinson (PD) lrsquoespressione diretta
di Hsp70 o la modulazione farmacologica di Hsp ha impedito la perdita
di neuroni causata da alfa-sinucleina [68-69] Huang et al hanno
riportato che questi effetti di Hsp70 si manifestano con lrsquoinibizione della
formazione di fibrille di alfa-sinucleina prevenendo la formazione di
alfa-sinucleina prefibrillare [70] Usando delezioni mutanti di alfa-
sinucleina Luk et al hanno indicato che le interazioni tra il dominio
legante il substrato Hsp70 e la regione del core idrofobico dellrsquoalfa-
sinucleina mediano lrsquoinibizione dellrsquoassemblaggio e che questo
processo di assemblaggio egrave inibito prima della fase di allungamento
[71] Nel complesso in diversi modelli di malattia neurodegenerativa la
sovra espressione di Hsp70 ha migliorato la gravitagrave della malattia di
fenotipi diversi senza incidere visibilmente sulla formazione di
aggregati suggerendo che i chaperoni non impediscono lrsquoaggregazione
di per seacute bensigrave reindirizzano gli aggregati preferibilmente in depositi
amorfi quindi sequestrando specie potenzialmente tossiche dalla
maggior parte della soluzione
42
Lrsquoespressione di Hsp70 e di altre Hsp egrave indotta dallrsquoinibizione
farmacologica di Hsp90
Come riportato sopra lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal
complesso con Hsp90 con susseguente produzione di Hsp (Figura 7) e
lrsquoinduzione di Hsp70 da parte di inibitori di Hsp90 egrave ben documentata
nei modelli di malattie neurodegenerative La geldanamicina (GM) un
inibitore di Hsp90 induce un aumento dose dipendente di Hsp70 nei
modelli di cellule di AD (Alzhaimer) cosigrave come nei neuroni della
corteccia primaria del ratto e riduce la quantitagrave di tau insolubili e dei
livelli basali di acido okadaico indotto da tau fosforilazione [63] Il
trattamento di neuroni primari corticali con lrsquoinibitore di Hsp90 con
struttura purinica il PU24FCI ha portato ad un aumento di Hsp70 dose-
dipendente [72]
PU24FCI
KU32
43
Allo stesso modo la somministrazione di due derivati di PU24FCI
CNS-permeabili il PU-DZ8 [72] ed il EC102 [73] a topi tau transgenici
(htau e JNPL3) ha determinato induzione di Hsp70 nel cervello e
mantenuto gli effetti per 24 ore dopo la somministrazione KU32 un
inibitore di Hsp90 di diversa natura chimica ha indotto Hsp70 in culture
SH-SY5Y di neuroblastoma e la ha protetta da tossicitagrave indotta da Aβ
GM ha attivato una risposta da shock termico ed inibito lrsquoaggregazione
di htt in un modello di coltura cellulare di HD ed ha indotto Hsp70 in
maniera tempo e concentrazione-dipendente ed ha impedito
lrsquoaggregazione di alfa-sinucleina e protetto contro la tossicitagrave in un
modello di aggregazione cellulare di alfa-sinucleina Auluck et al hanno
segnalato che il trattamento di un modello volante di PD con GM ha
protetto completamente contro tossicitagrave per alfa-sinucleina [74] GM ha
protetto anche contro la neurotossicitagrave dopaminergica indotta da 1-metil-
4-fenil-1236-tetraidropiridina (MPTP) in un modello di topo di PD Il
pretrattamento con GM mediante iniezione ventricolare intracerebrale
prima del trattamento con MPTP ha indotto le Hsp70 ed incrementato il
contenuto residuale di dopamina e lrsquoimmuno reattivitagrave della tirosina
idrolasi nel corpo striato [75] Lrsquoinduzione di Hsp70 nel midollo spinale
egrave stata osservata in seguito ad iniezione intraperitoneale di un derivato
della GM il 17-AAG in un modello di SBMA topo [76] Il 17-AAG egrave
stato anche efficace contro la nuerodegenerazione in altre malattie
poliQ Vale a dire ha soppresso la degenerazione dellrsquoocchio e la
formazione di inclusioni del corpo e salvato dalla letalitagrave in un modello
di SCA di Drosophila Ha inoltre soppresso la neurodegenerazione in un
modello volante di HD La riduzione di HSF-1 ha abolito lrsquoinduzione di
chaperoni molecolari e gli effeti terapeutici di 17-AAG sulla
neurodegenerazione poliQ indotta nei modelli di Drosophila facendo
44
arguire che lrsquoeffetto terapeutico di 17-AAG egrave essenzialmente mediato da
HSF-1 [77] Riassumendo lrsquoattivazione di HSF-1 da inibitori di Hsp90
egrave stata notata specificamente in modelli in vivo ed in vitro di malattie
neurodegenerative suggerendo che lrsquoinibizione di Hsp90 puograve essere un
mezzo per modulare i livelli di Hsp in cervelli malati con lrsquoobbiettivo di
proteggere contro le proteine tossiche che si presentano nel corso del
processo neurodegenerativo
Lrsquoinibizione di Hsp90 riduce lrsquoattivitagrave e lrsquoespressione di proteine
neuronali aberranti
In aggiunta alla regolazione di HSF-1 evidenze recenti suggeriscono un
ruolo addizionale per Hsp90 nel mantenimento della stabilitagrave funzionale
della capacitagrave aberrante di proteine neuronali (Figura 8A)
La SBMA egrave una malattia ereditaria dei motoneuroni causata
dallrsquoaccrescimento di un tratto di poliglutamina allrsquointerno del recettore
androgeno (AR) [57]
Le caratteristiche patologiche di SBMA sono perdita dei motoneuroni
nel midollo spinale e nel tronco cerebrale diffusione dellrsquoaccumulo
nucleare inclusioni nucleari di mutanti AR (mAR) nei motoneuroni
residui e in alcuni organi viscerali Waza et al hanno dimostrato che
mAR presente in SBMA egrave una delle proteine regolate da Hsp90 (Figura
8A) [76]
45
Figura 8 Le Hsp90 riparano le proteine neuronali aberranti (A) Proteine neuronali
aberranti regolate da Hsp90 (B) Lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90porta allrsquoinattivazione
o degradazione delle proteine regulate da Hsp90 probabilmente attraverso la via del
proteasoma
Le Hsp90 formano un complesso molecolare con mAR per il
mantenimento della sua stabilitagrave funzionale Sia in modelli cellulari di
SBMA che in topi transgenici lrsquoinibizione di Hsp90 da parte di 17-
AAG il derivato 17 allilammino-17-demetossi della geldanamicina ha
46
portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal
macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati
disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da
destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione
dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di
SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave
rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati
[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori
hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo
sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa
(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni
Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]
Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo
egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali
sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al
hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina
(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi
familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un
complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data
da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto
47
lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della
stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave
dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita
neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei
neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che
codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a
PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson
familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson
suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente
associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che
Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate
con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente
diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina
egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille
ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno
recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di
alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che
sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina
[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce
lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari
Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-
dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento
tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-
sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da
chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di
mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il
macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD
associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-
48
sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative
caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave
caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di
tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD
lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da
unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina
chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta
(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si
era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero
netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un
gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e
Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave
causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma
17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau
[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine
neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso
portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina
mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da
Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei
modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave
patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-
dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla
settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad
una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di
tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno
dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una
diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di
AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le
49
relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la
degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90
[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al
(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave
stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da
GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β
effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi
GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di
Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe
portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in
strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati
indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone
biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione
di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da
parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi
proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di
queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)
Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie
neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio
approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare
dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la
formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione
potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di
Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare
terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare
malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo
centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90
puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione
50
successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti
neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti
clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto
che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono
tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in
modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni
nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati
promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio
spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in
modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di
Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a
lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse
da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase
esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora
rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori
dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per
mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie
neurodegenerative
51
SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-
ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-
METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE
(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE
MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO
SULLA FRAMMENTAZIONE
Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in
risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta
nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine
regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il
ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai
loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine
client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro
cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire
su molti percorsi oncogenici
Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il
nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che
lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati
composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP
attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del
processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono
emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i
tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule
normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina
(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una
maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto
che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una
piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
33
Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un
anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del
proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico
20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA
svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP
Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104
nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico
per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste
attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come
una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-
etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE
per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla
fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il
meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere
tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria
per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli
anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una
parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali
suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata
assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando
una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a
spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad
entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel
caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro
che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti
dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una
proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In
parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno
34
individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi
domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre
interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta
apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati
che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la
questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)
Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97
Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da
proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad
entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro
efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non
devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati
dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte
lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono
piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte
superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine
adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il
35
movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori
p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su
proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di
proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la
retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e
reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo
anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite
adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente
il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente
forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei
canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]
LrsquoAZIONE DELLrsquoATP
La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico
al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco
affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad
esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello
Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che
ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo
di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli
wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli
mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori
dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di
ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di
un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di
quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda
36
subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino
al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave
significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o
sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti
differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra
essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che
attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave
adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non
vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a
cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di
subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico
Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un
substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di
queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un
meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da
F1-ATPasi non sembra escluso
HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE
NEURODEGENERATIVE
RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE
Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel
mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una
pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi
associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione
37
di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di
Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta
promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]
Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90
nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave
funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi
permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]
HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico
Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono
mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)
accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock
citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata
da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante
di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo
stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si
lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei
geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-
shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via
multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di
transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-
translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90
[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e
mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo
shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con
Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)
38
attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da
shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni
Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che
i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro
sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock
termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su
attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato
che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi
di insulti
Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90
e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con
shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La
somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a
topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello
39
Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge
contro aggregati tossici
Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un
aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave
egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di
chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione
incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste
molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente
diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su
espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative
Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie
neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a
mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei
neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia
muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-
pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma
mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme
nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che
Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in
oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza
attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili
[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di
Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt
mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore
di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo
suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro
effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi
40
indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando
monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono
probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono
essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di
atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70
permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]
Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare
spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo
nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un
miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina
[62]
Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il
riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso
lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido
dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli
di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i
motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione
acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni
Riluzolo
Arimoclomol
41
Nei vari modelli cellulari della malattia di Alzheimer (AD) vi egrave un
incremento dei livelli di Hsp70 promossa dalla solubilitagrave e dal legame ai
microtubuli delle proteine tau [63] Hsp70 ha anche inibito la
propensione di aggregazione di Aβ [64] e ridotto la tossicitagrave di Aβ su
culture neuronali [65] Inoltre la proteina precursore dellrsquoamiloide
(APP) eo il suo Aβ amiloide derivato sono bersagli di chaperoni
mediati da clearence [66-67] Nella Drosophila melanogaster e nei
modelli di lievito della malattia di Parkinson (PD) lrsquoespressione diretta
di Hsp70 o la modulazione farmacologica di Hsp ha impedito la perdita
di neuroni causata da alfa-sinucleina [68-69] Huang et al hanno
riportato che questi effetti di Hsp70 si manifestano con lrsquoinibizione della
formazione di fibrille di alfa-sinucleina prevenendo la formazione di
alfa-sinucleina prefibrillare [70] Usando delezioni mutanti di alfa-
sinucleina Luk et al hanno indicato che le interazioni tra il dominio
legante il substrato Hsp70 e la regione del core idrofobico dellrsquoalfa-
sinucleina mediano lrsquoinibizione dellrsquoassemblaggio e che questo
processo di assemblaggio egrave inibito prima della fase di allungamento
[71] Nel complesso in diversi modelli di malattia neurodegenerativa la
sovra espressione di Hsp70 ha migliorato la gravitagrave della malattia di
fenotipi diversi senza incidere visibilmente sulla formazione di
aggregati suggerendo che i chaperoni non impediscono lrsquoaggregazione
di per seacute bensigrave reindirizzano gli aggregati preferibilmente in depositi
amorfi quindi sequestrando specie potenzialmente tossiche dalla
maggior parte della soluzione
42
Lrsquoespressione di Hsp70 e di altre Hsp egrave indotta dallrsquoinibizione
farmacologica di Hsp90
Come riportato sopra lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal
complesso con Hsp90 con susseguente produzione di Hsp (Figura 7) e
lrsquoinduzione di Hsp70 da parte di inibitori di Hsp90 egrave ben documentata
nei modelli di malattie neurodegenerative La geldanamicina (GM) un
inibitore di Hsp90 induce un aumento dose dipendente di Hsp70 nei
modelli di cellule di AD (Alzhaimer) cosigrave come nei neuroni della
corteccia primaria del ratto e riduce la quantitagrave di tau insolubili e dei
livelli basali di acido okadaico indotto da tau fosforilazione [63] Il
trattamento di neuroni primari corticali con lrsquoinibitore di Hsp90 con
struttura purinica il PU24FCI ha portato ad un aumento di Hsp70 dose-
dipendente [72]
PU24FCI
KU32
43
Allo stesso modo la somministrazione di due derivati di PU24FCI
CNS-permeabili il PU-DZ8 [72] ed il EC102 [73] a topi tau transgenici
(htau e JNPL3) ha determinato induzione di Hsp70 nel cervello e
mantenuto gli effetti per 24 ore dopo la somministrazione KU32 un
inibitore di Hsp90 di diversa natura chimica ha indotto Hsp70 in culture
SH-SY5Y di neuroblastoma e la ha protetta da tossicitagrave indotta da Aβ
GM ha attivato una risposta da shock termico ed inibito lrsquoaggregazione
di htt in un modello di coltura cellulare di HD ed ha indotto Hsp70 in
maniera tempo e concentrazione-dipendente ed ha impedito
lrsquoaggregazione di alfa-sinucleina e protetto contro la tossicitagrave in un
modello di aggregazione cellulare di alfa-sinucleina Auluck et al hanno
segnalato che il trattamento di un modello volante di PD con GM ha
protetto completamente contro tossicitagrave per alfa-sinucleina [74] GM ha
protetto anche contro la neurotossicitagrave dopaminergica indotta da 1-metil-
4-fenil-1236-tetraidropiridina (MPTP) in un modello di topo di PD Il
pretrattamento con GM mediante iniezione ventricolare intracerebrale
prima del trattamento con MPTP ha indotto le Hsp70 ed incrementato il
contenuto residuale di dopamina e lrsquoimmuno reattivitagrave della tirosina
idrolasi nel corpo striato [75] Lrsquoinduzione di Hsp70 nel midollo spinale
egrave stata osservata in seguito ad iniezione intraperitoneale di un derivato
della GM il 17-AAG in un modello di SBMA topo [76] Il 17-AAG egrave
stato anche efficace contro la nuerodegenerazione in altre malattie
poliQ Vale a dire ha soppresso la degenerazione dellrsquoocchio e la
formazione di inclusioni del corpo e salvato dalla letalitagrave in un modello
di SCA di Drosophila Ha inoltre soppresso la neurodegenerazione in un
modello volante di HD La riduzione di HSF-1 ha abolito lrsquoinduzione di
chaperoni molecolari e gli effeti terapeutici di 17-AAG sulla
neurodegenerazione poliQ indotta nei modelli di Drosophila facendo
44
arguire che lrsquoeffetto terapeutico di 17-AAG egrave essenzialmente mediato da
HSF-1 [77] Riassumendo lrsquoattivazione di HSF-1 da inibitori di Hsp90
egrave stata notata specificamente in modelli in vivo ed in vitro di malattie
neurodegenerative suggerendo che lrsquoinibizione di Hsp90 puograve essere un
mezzo per modulare i livelli di Hsp in cervelli malati con lrsquoobbiettivo di
proteggere contro le proteine tossiche che si presentano nel corso del
processo neurodegenerativo
Lrsquoinibizione di Hsp90 riduce lrsquoattivitagrave e lrsquoespressione di proteine
neuronali aberranti
In aggiunta alla regolazione di HSF-1 evidenze recenti suggeriscono un
ruolo addizionale per Hsp90 nel mantenimento della stabilitagrave funzionale
della capacitagrave aberrante di proteine neuronali (Figura 8A)
La SBMA egrave una malattia ereditaria dei motoneuroni causata
dallrsquoaccrescimento di un tratto di poliglutamina allrsquointerno del recettore
androgeno (AR) [57]
Le caratteristiche patologiche di SBMA sono perdita dei motoneuroni
nel midollo spinale e nel tronco cerebrale diffusione dellrsquoaccumulo
nucleare inclusioni nucleari di mutanti AR (mAR) nei motoneuroni
residui e in alcuni organi viscerali Waza et al hanno dimostrato che
mAR presente in SBMA egrave una delle proteine regolate da Hsp90 (Figura
8A) [76]
45
Figura 8 Le Hsp90 riparano le proteine neuronali aberranti (A) Proteine neuronali
aberranti regolate da Hsp90 (B) Lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90porta allrsquoinattivazione
o degradazione delle proteine regulate da Hsp90 probabilmente attraverso la via del
proteasoma
Le Hsp90 formano un complesso molecolare con mAR per il
mantenimento della sua stabilitagrave funzionale Sia in modelli cellulari di
SBMA che in topi transgenici lrsquoinibizione di Hsp90 da parte di 17-
AAG il derivato 17 allilammino-17-demetossi della geldanamicina ha
46
portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal
macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati
disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da
destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione
dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di
SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave
rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati
[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori
hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo
sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa
(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni
Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]
Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo
egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali
sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al
hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina
(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi
familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un
complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data
da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto
47
lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della
stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave
dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita
neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei
neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che
codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a
PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson
familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson
suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente
associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che
Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate
con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente
diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina
egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille
ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno
recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di
alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che
sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina
[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce
lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari
Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-
dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento
tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-
sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da
chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di
mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il
macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD
associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-
48
sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative
caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave
caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di
tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD
lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da
unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina
chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta
(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si
era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero
netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un
gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e
Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave
causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma
17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau
[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine
neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso
portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina
mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da
Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei
modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave
patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-
dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla
settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad
una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di
tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno
dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una
diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di
AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le
49
relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la
degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90
[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al
(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave
stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da
GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β
effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi
GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di
Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe
portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in
strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati
indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone
biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione
di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da
parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi
proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di
queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)
Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie
neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio
approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare
dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la
formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione
potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di
Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare
terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare
malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo
centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90
puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione
50
successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti
neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti
clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto
che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono
tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in
modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni
nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati
promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio
spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in
modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di
Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a
lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse
da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase
esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora
rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori
dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per
mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie
neurodegenerative
51
SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-
ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-
METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE
(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE
MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO
SULLA FRAMMENTAZIONE
Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in
risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta
nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine
regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il
ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai
loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine
client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro
cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire
su molti percorsi oncogenici
Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il
nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che
lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati
composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP
attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del
processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono
emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i
tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule
normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina
(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una
maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto
che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una
piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
34
individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi
domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre
interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta
apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati
che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la
questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)
Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97
Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da
proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad
entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro
efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non
devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati
dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte
lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono
piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte
superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine
adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il
35
movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori
p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su
proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di
proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la
retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e
reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo
anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite
adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente
il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente
forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei
canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]
LrsquoAZIONE DELLrsquoATP
La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico
al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco
affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad
esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello
Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che
ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo
di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli
wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli
mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori
dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di
ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di
un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di
quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda
36
subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino
al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave
significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o
sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti
differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra
essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che
attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave
adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non
vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a
cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di
subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico
Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un
substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di
queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un
meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da
F1-ATPasi non sembra escluso
HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE
NEURODEGENERATIVE
RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE
Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel
mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una
pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi
associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione
37
di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di
Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta
promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]
Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90
nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave
funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi
permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]
HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico
Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono
mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)
accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock
citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata
da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante
di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo
stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si
lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei
geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-
shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via
multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di
transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-
translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90
[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e
mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo
shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con
Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)
38
attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da
shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni
Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che
i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro
sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock
termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su
attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato
che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi
di insulti
Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90
e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con
shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La
somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a
topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello
39
Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge
contro aggregati tossici
Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un
aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave
egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di
chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione
incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste
molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente
diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su
espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative
Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie
neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a
mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei
neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia
muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-
pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma
mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme
nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che
Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in
oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza
attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili
[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di
Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt
mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore
di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo
suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro
effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi
40
indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando
monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono
probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono
essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di
atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70
permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]
Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare
spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo
nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un
miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina
[62]
Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il
riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso
lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido
dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli
di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i
motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione
acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni
Riluzolo
Arimoclomol
41
Nei vari modelli cellulari della malattia di Alzheimer (AD) vi egrave un
incremento dei livelli di Hsp70 promossa dalla solubilitagrave e dal legame ai
microtubuli delle proteine tau [63] Hsp70 ha anche inibito la
propensione di aggregazione di Aβ [64] e ridotto la tossicitagrave di Aβ su
culture neuronali [65] Inoltre la proteina precursore dellrsquoamiloide
(APP) eo il suo Aβ amiloide derivato sono bersagli di chaperoni
mediati da clearence [66-67] Nella Drosophila melanogaster e nei
modelli di lievito della malattia di Parkinson (PD) lrsquoespressione diretta
di Hsp70 o la modulazione farmacologica di Hsp ha impedito la perdita
di neuroni causata da alfa-sinucleina [68-69] Huang et al hanno
riportato che questi effetti di Hsp70 si manifestano con lrsquoinibizione della
formazione di fibrille di alfa-sinucleina prevenendo la formazione di
alfa-sinucleina prefibrillare [70] Usando delezioni mutanti di alfa-
sinucleina Luk et al hanno indicato che le interazioni tra il dominio
legante il substrato Hsp70 e la regione del core idrofobico dellrsquoalfa-
sinucleina mediano lrsquoinibizione dellrsquoassemblaggio e che questo
processo di assemblaggio egrave inibito prima della fase di allungamento
[71] Nel complesso in diversi modelli di malattia neurodegenerativa la
sovra espressione di Hsp70 ha migliorato la gravitagrave della malattia di
fenotipi diversi senza incidere visibilmente sulla formazione di
aggregati suggerendo che i chaperoni non impediscono lrsquoaggregazione
di per seacute bensigrave reindirizzano gli aggregati preferibilmente in depositi
amorfi quindi sequestrando specie potenzialmente tossiche dalla
maggior parte della soluzione
42
Lrsquoespressione di Hsp70 e di altre Hsp egrave indotta dallrsquoinibizione
farmacologica di Hsp90
Come riportato sopra lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal
complesso con Hsp90 con susseguente produzione di Hsp (Figura 7) e
lrsquoinduzione di Hsp70 da parte di inibitori di Hsp90 egrave ben documentata
nei modelli di malattie neurodegenerative La geldanamicina (GM) un
inibitore di Hsp90 induce un aumento dose dipendente di Hsp70 nei
modelli di cellule di AD (Alzhaimer) cosigrave come nei neuroni della
corteccia primaria del ratto e riduce la quantitagrave di tau insolubili e dei
livelli basali di acido okadaico indotto da tau fosforilazione [63] Il
trattamento di neuroni primari corticali con lrsquoinibitore di Hsp90 con
struttura purinica il PU24FCI ha portato ad un aumento di Hsp70 dose-
dipendente [72]
PU24FCI
KU32
43
Allo stesso modo la somministrazione di due derivati di PU24FCI
CNS-permeabili il PU-DZ8 [72] ed il EC102 [73] a topi tau transgenici
(htau e JNPL3) ha determinato induzione di Hsp70 nel cervello e
mantenuto gli effetti per 24 ore dopo la somministrazione KU32 un
inibitore di Hsp90 di diversa natura chimica ha indotto Hsp70 in culture
SH-SY5Y di neuroblastoma e la ha protetta da tossicitagrave indotta da Aβ
GM ha attivato una risposta da shock termico ed inibito lrsquoaggregazione
di htt in un modello di coltura cellulare di HD ed ha indotto Hsp70 in
maniera tempo e concentrazione-dipendente ed ha impedito
lrsquoaggregazione di alfa-sinucleina e protetto contro la tossicitagrave in un
modello di aggregazione cellulare di alfa-sinucleina Auluck et al hanno
segnalato che il trattamento di un modello volante di PD con GM ha
protetto completamente contro tossicitagrave per alfa-sinucleina [74] GM ha
protetto anche contro la neurotossicitagrave dopaminergica indotta da 1-metil-
4-fenil-1236-tetraidropiridina (MPTP) in un modello di topo di PD Il
pretrattamento con GM mediante iniezione ventricolare intracerebrale
prima del trattamento con MPTP ha indotto le Hsp70 ed incrementato il
contenuto residuale di dopamina e lrsquoimmuno reattivitagrave della tirosina
idrolasi nel corpo striato [75] Lrsquoinduzione di Hsp70 nel midollo spinale
egrave stata osservata in seguito ad iniezione intraperitoneale di un derivato
della GM il 17-AAG in un modello di SBMA topo [76] Il 17-AAG egrave
stato anche efficace contro la nuerodegenerazione in altre malattie
poliQ Vale a dire ha soppresso la degenerazione dellrsquoocchio e la
formazione di inclusioni del corpo e salvato dalla letalitagrave in un modello
di SCA di Drosophila Ha inoltre soppresso la neurodegenerazione in un
modello volante di HD La riduzione di HSF-1 ha abolito lrsquoinduzione di
chaperoni molecolari e gli effeti terapeutici di 17-AAG sulla
neurodegenerazione poliQ indotta nei modelli di Drosophila facendo
44
arguire che lrsquoeffetto terapeutico di 17-AAG egrave essenzialmente mediato da
HSF-1 [77] Riassumendo lrsquoattivazione di HSF-1 da inibitori di Hsp90
egrave stata notata specificamente in modelli in vivo ed in vitro di malattie
neurodegenerative suggerendo che lrsquoinibizione di Hsp90 puograve essere un
mezzo per modulare i livelli di Hsp in cervelli malati con lrsquoobbiettivo di
proteggere contro le proteine tossiche che si presentano nel corso del
processo neurodegenerativo
Lrsquoinibizione di Hsp90 riduce lrsquoattivitagrave e lrsquoespressione di proteine
neuronali aberranti
In aggiunta alla regolazione di HSF-1 evidenze recenti suggeriscono un
ruolo addizionale per Hsp90 nel mantenimento della stabilitagrave funzionale
della capacitagrave aberrante di proteine neuronali (Figura 8A)
La SBMA egrave una malattia ereditaria dei motoneuroni causata
dallrsquoaccrescimento di un tratto di poliglutamina allrsquointerno del recettore
androgeno (AR) [57]
Le caratteristiche patologiche di SBMA sono perdita dei motoneuroni
nel midollo spinale e nel tronco cerebrale diffusione dellrsquoaccumulo
nucleare inclusioni nucleari di mutanti AR (mAR) nei motoneuroni
residui e in alcuni organi viscerali Waza et al hanno dimostrato che
mAR presente in SBMA egrave una delle proteine regolate da Hsp90 (Figura
8A) [76]
45
Figura 8 Le Hsp90 riparano le proteine neuronali aberranti (A) Proteine neuronali
aberranti regolate da Hsp90 (B) Lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90porta allrsquoinattivazione
o degradazione delle proteine regulate da Hsp90 probabilmente attraverso la via del
proteasoma
Le Hsp90 formano un complesso molecolare con mAR per il
mantenimento della sua stabilitagrave funzionale Sia in modelli cellulari di
SBMA che in topi transgenici lrsquoinibizione di Hsp90 da parte di 17-
AAG il derivato 17 allilammino-17-demetossi della geldanamicina ha
46
portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal
macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati
disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da
destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione
dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di
SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave
rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati
[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori
hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo
sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa
(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni
Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]
Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo
egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali
sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al
hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina
(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi
familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un
complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data
da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto
47
lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della
stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave
dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita
neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei
neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che
codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a
PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson
familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson
suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente
associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che
Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate
con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente
diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina
egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille
ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno
recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di
alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che
sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina
[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce
lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari
Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-
dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento
tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-
sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da
chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di
mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il
macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD
associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-
48
sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative
caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave
caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di
tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD
lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da
unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina
chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta
(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si
era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero
netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un
gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e
Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave
causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma
17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau
[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine
neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso
portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina
mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da
Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei
modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave
patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-
dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla
settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad
una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di
tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno
dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una
diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di
AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le
49
relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la
degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90
[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al
(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave
stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da
GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β
effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi
GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di
Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe
portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in
strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati
indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone
biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione
di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da
parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi
proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di
queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)
Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie
neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio
approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare
dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la
formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione
potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di
Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare
terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare
malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo
centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90
puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione
50
successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti
neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti
clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto
che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono
tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in
modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni
nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati
promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio
spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in
modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di
Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a
lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse
da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase
esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora
rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori
dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per
mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie
neurodegenerative
51
SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-
ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-
METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE
(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE
MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO
SULLA FRAMMENTAZIONE
Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in
risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta
nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine
regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il
ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai
loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine
client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro
cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire
su molti percorsi oncogenici
Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il
nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che
lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati
composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP
attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del
processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono
emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i
tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule
normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina
(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una
maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto
che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una
piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
35
movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori
p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su
proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di
proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la
retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e
reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo
anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite
adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente
il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente
forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei
canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]
LrsquoAZIONE DELLrsquoATP
La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico
al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco
affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad
esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello
Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che
ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo
di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli
wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli
mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori
dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di
ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di
un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di
quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda
36
subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino
al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave
significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o
sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti
differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra
essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che
attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave
adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non
vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a
cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di
subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico
Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un
substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di
queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un
meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da
F1-ATPasi non sembra escluso
HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE
NEURODEGENERATIVE
RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE
Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel
mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una
pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi
associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione
37
di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di
Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta
promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]
Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90
nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave
funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi
permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]
HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico
Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono
mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)
accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock
citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata
da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante
di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo
stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si
lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei
geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-
shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via
multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di
transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-
translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90
[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e
mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo
shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con
Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)
38
attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da
shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni
Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che
i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro
sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock
termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su
attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato
che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi
di insulti
Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90
e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con
shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La
somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a
topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello
39
Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge
contro aggregati tossici
Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un
aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave
egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di
chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione
incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste
molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente
diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su
espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative
Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie
neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a
mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei
neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia
muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-
pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma
mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme
nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che
Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in
oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza
attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili
[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di
Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt
mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore
di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo
suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro
effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi
40
indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando
monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono
probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono
essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di
atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70
permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]
Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare
spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo
nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un
miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina
[62]
Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il
riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso
lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido
dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli
di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i
motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione
acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni
Riluzolo
Arimoclomol
41
Nei vari modelli cellulari della malattia di Alzheimer (AD) vi egrave un
incremento dei livelli di Hsp70 promossa dalla solubilitagrave e dal legame ai
microtubuli delle proteine tau [63] Hsp70 ha anche inibito la
propensione di aggregazione di Aβ [64] e ridotto la tossicitagrave di Aβ su
culture neuronali [65] Inoltre la proteina precursore dellrsquoamiloide
(APP) eo il suo Aβ amiloide derivato sono bersagli di chaperoni
mediati da clearence [66-67] Nella Drosophila melanogaster e nei
modelli di lievito della malattia di Parkinson (PD) lrsquoespressione diretta
di Hsp70 o la modulazione farmacologica di Hsp ha impedito la perdita
di neuroni causata da alfa-sinucleina [68-69] Huang et al hanno
riportato che questi effetti di Hsp70 si manifestano con lrsquoinibizione della
formazione di fibrille di alfa-sinucleina prevenendo la formazione di
alfa-sinucleina prefibrillare [70] Usando delezioni mutanti di alfa-
sinucleina Luk et al hanno indicato che le interazioni tra il dominio
legante il substrato Hsp70 e la regione del core idrofobico dellrsquoalfa-
sinucleina mediano lrsquoinibizione dellrsquoassemblaggio e che questo
processo di assemblaggio egrave inibito prima della fase di allungamento
[71] Nel complesso in diversi modelli di malattia neurodegenerativa la
sovra espressione di Hsp70 ha migliorato la gravitagrave della malattia di
fenotipi diversi senza incidere visibilmente sulla formazione di
aggregati suggerendo che i chaperoni non impediscono lrsquoaggregazione
di per seacute bensigrave reindirizzano gli aggregati preferibilmente in depositi
amorfi quindi sequestrando specie potenzialmente tossiche dalla
maggior parte della soluzione
42
Lrsquoespressione di Hsp70 e di altre Hsp egrave indotta dallrsquoinibizione
farmacologica di Hsp90
Come riportato sopra lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal
complesso con Hsp90 con susseguente produzione di Hsp (Figura 7) e
lrsquoinduzione di Hsp70 da parte di inibitori di Hsp90 egrave ben documentata
nei modelli di malattie neurodegenerative La geldanamicina (GM) un
inibitore di Hsp90 induce un aumento dose dipendente di Hsp70 nei
modelli di cellule di AD (Alzhaimer) cosigrave come nei neuroni della
corteccia primaria del ratto e riduce la quantitagrave di tau insolubili e dei
livelli basali di acido okadaico indotto da tau fosforilazione [63] Il
trattamento di neuroni primari corticali con lrsquoinibitore di Hsp90 con
struttura purinica il PU24FCI ha portato ad un aumento di Hsp70 dose-
dipendente [72]
PU24FCI
KU32
43
Allo stesso modo la somministrazione di due derivati di PU24FCI
CNS-permeabili il PU-DZ8 [72] ed il EC102 [73] a topi tau transgenici
(htau e JNPL3) ha determinato induzione di Hsp70 nel cervello e
mantenuto gli effetti per 24 ore dopo la somministrazione KU32 un
inibitore di Hsp90 di diversa natura chimica ha indotto Hsp70 in culture
SH-SY5Y di neuroblastoma e la ha protetta da tossicitagrave indotta da Aβ
GM ha attivato una risposta da shock termico ed inibito lrsquoaggregazione
di htt in un modello di coltura cellulare di HD ed ha indotto Hsp70 in
maniera tempo e concentrazione-dipendente ed ha impedito
lrsquoaggregazione di alfa-sinucleina e protetto contro la tossicitagrave in un
modello di aggregazione cellulare di alfa-sinucleina Auluck et al hanno
segnalato che il trattamento di un modello volante di PD con GM ha
protetto completamente contro tossicitagrave per alfa-sinucleina [74] GM ha
protetto anche contro la neurotossicitagrave dopaminergica indotta da 1-metil-
4-fenil-1236-tetraidropiridina (MPTP) in un modello di topo di PD Il
pretrattamento con GM mediante iniezione ventricolare intracerebrale
prima del trattamento con MPTP ha indotto le Hsp70 ed incrementato il
contenuto residuale di dopamina e lrsquoimmuno reattivitagrave della tirosina
idrolasi nel corpo striato [75] Lrsquoinduzione di Hsp70 nel midollo spinale
egrave stata osservata in seguito ad iniezione intraperitoneale di un derivato
della GM il 17-AAG in un modello di SBMA topo [76] Il 17-AAG egrave
stato anche efficace contro la nuerodegenerazione in altre malattie
poliQ Vale a dire ha soppresso la degenerazione dellrsquoocchio e la
formazione di inclusioni del corpo e salvato dalla letalitagrave in un modello
di SCA di Drosophila Ha inoltre soppresso la neurodegenerazione in un
modello volante di HD La riduzione di HSF-1 ha abolito lrsquoinduzione di
chaperoni molecolari e gli effeti terapeutici di 17-AAG sulla
neurodegenerazione poliQ indotta nei modelli di Drosophila facendo
44
arguire che lrsquoeffetto terapeutico di 17-AAG egrave essenzialmente mediato da
HSF-1 [77] Riassumendo lrsquoattivazione di HSF-1 da inibitori di Hsp90
egrave stata notata specificamente in modelli in vivo ed in vitro di malattie
neurodegenerative suggerendo che lrsquoinibizione di Hsp90 puograve essere un
mezzo per modulare i livelli di Hsp in cervelli malati con lrsquoobbiettivo di
proteggere contro le proteine tossiche che si presentano nel corso del
processo neurodegenerativo
Lrsquoinibizione di Hsp90 riduce lrsquoattivitagrave e lrsquoespressione di proteine
neuronali aberranti
In aggiunta alla regolazione di HSF-1 evidenze recenti suggeriscono un
ruolo addizionale per Hsp90 nel mantenimento della stabilitagrave funzionale
della capacitagrave aberrante di proteine neuronali (Figura 8A)
La SBMA egrave una malattia ereditaria dei motoneuroni causata
dallrsquoaccrescimento di un tratto di poliglutamina allrsquointerno del recettore
androgeno (AR) [57]
Le caratteristiche patologiche di SBMA sono perdita dei motoneuroni
nel midollo spinale e nel tronco cerebrale diffusione dellrsquoaccumulo
nucleare inclusioni nucleari di mutanti AR (mAR) nei motoneuroni
residui e in alcuni organi viscerali Waza et al hanno dimostrato che
mAR presente in SBMA egrave una delle proteine regolate da Hsp90 (Figura
8A) [76]
45
Figura 8 Le Hsp90 riparano le proteine neuronali aberranti (A) Proteine neuronali
aberranti regolate da Hsp90 (B) Lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90porta allrsquoinattivazione
o degradazione delle proteine regulate da Hsp90 probabilmente attraverso la via del
proteasoma
Le Hsp90 formano un complesso molecolare con mAR per il
mantenimento della sua stabilitagrave funzionale Sia in modelli cellulari di
SBMA che in topi transgenici lrsquoinibizione di Hsp90 da parte di 17-
AAG il derivato 17 allilammino-17-demetossi della geldanamicina ha
46
portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal
macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati
disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da
destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione
dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di
SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave
rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati
[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori
hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo
sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa
(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni
Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]
Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo
egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali
sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al
hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina
(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi
familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un
complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data
da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto
47
lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della
stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave
dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita
neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei
neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che
codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a
PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson
familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson
suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente
associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che
Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate
con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente
diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina
egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille
ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno
recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di
alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che
sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina
[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce
lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari
Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-
dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento
tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-
sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da
chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di
mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il
macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD
associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-
48
sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative
caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave
caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di
tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD
lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da
unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina
chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta
(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si
era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero
netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un
gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e
Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave
causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma
17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau
[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine
neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso
portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina
mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da
Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei
modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave
patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-
dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla
settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad
una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di
tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno
dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una
diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di
AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le
49
relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la
degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90
[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al
(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave
stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da
GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β
effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi
GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di
Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe
portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in
strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati
indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone
biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione
di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da
parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi
proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di
queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)
Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie
neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio
approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare
dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la
formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione
potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di
Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare
terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare
malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo
centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90
puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione
50
successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti
neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti
clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto
che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono
tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in
modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni
nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati
promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio
spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in
modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di
Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a
lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse
da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase
esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora
rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori
dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per
mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie
neurodegenerative
51
SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-
ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-
METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE
(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE
MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO
SULLA FRAMMENTAZIONE
Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in
risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta
nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine
regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il
ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai
loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine
client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro
cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire
su molti percorsi oncogenici
Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il
nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che
lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati
composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP
attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del
processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono
emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i
tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule
normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina
(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una
maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto
che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una
piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
36
subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino
al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave
significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o
sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti
differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra
essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che
attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave
adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non
vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a
cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di
subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico
Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un
substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di
queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un
meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da
F1-ATPasi non sembra escluso
HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE
NEURODEGENERATIVE
RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE
Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel
mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una
pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi
associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione
37
di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di
Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta
promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]
Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90
nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave
funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi
permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]
HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico
Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono
mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)
accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock
citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata
da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante
di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo
stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si
lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei
geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-
shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via
multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di
transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-
translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90
[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e
mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo
shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con
Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)
38
attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da
shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni
Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che
i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro
sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock
termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su
attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato
che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi
di insulti
Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90
e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con
shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La
somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a
topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello
39
Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge
contro aggregati tossici
Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un
aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave
egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di
chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione
incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste
molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente
diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su
espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative
Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie
neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a
mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei
neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia
muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-
pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma
mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme
nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che
Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in
oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza
attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili
[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di
Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt
mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore
di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo
suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro
effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi
40
indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando
monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono
probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono
essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di
atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70
permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]
Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare
spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo
nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un
miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina
[62]
Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il
riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso
lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido
dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli
di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i
motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione
acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni
Riluzolo
Arimoclomol
41
Nei vari modelli cellulari della malattia di Alzheimer (AD) vi egrave un
incremento dei livelli di Hsp70 promossa dalla solubilitagrave e dal legame ai
microtubuli delle proteine tau [63] Hsp70 ha anche inibito la
propensione di aggregazione di Aβ [64] e ridotto la tossicitagrave di Aβ su
culture neuronali [65] Inoltre la proteina precursore dellrsquoamiloide
(APP) eo il suo Aβ amiloide derivato sono bersagli di chaperoni
mediati da clearence [66-67] Nella Drosophila melanogaster e nei
modelli di lievito della malattia di Parkinson (PD) lrsquoespressione diretta
di Hsp70 o la modulazione farmacologica di Hsp ha impedito la perdita
di neuroni causata da alfa-sinucleina [68-69] Huang et al hanno
riportato che questi effetti di Hsp70 si manifestano con lrsquoinibizione della
formazione di fibrille di alfa-sinucleina prevenendo la formazione di
alfa-sinucleina prefibrillare [70] Usando delezioni mutanti di alfa-
sinucleina Luk et al hanno indicato che le interazioni tra il dominio
legante il substrato Hsp70 e la regione del core idrofobico dellrsquoalfa-
sinucleina mediano lrsquoinibizione dellrsquoassemblaggio e che questo
processo di assemblaggio egrave inibito prima della fase di allungamento
[71] Nel complesso in diversi modelli di malattia neurodegenerativa la
sovra espressione di Hsp70 ha migliorato la gravitagrave della malattia di
fenotipi diversi senza incidere visibilmente sulla formazione di
aggregati suggerendo che i chaperoni non impediscono lrsquoaggregazione
di per seacute bensigrave reindirizzano gli aggregati preferibilmente in depositi
amorfi quindi sequestrando specie potenzialmente tossiche dalla
maggior parte della soluzione
42
Lrsquoespressione di Hsp70 e di altre Hsp egrave indotta dallrsquoinibizione
farmacologica di Hsp90
Come riportato sopra lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal
complesso con Hsp90 con susseguente produzione di Hsp (Figura 7) e
lrsquoinduzione di Hsp70 da parte di inibitori di Hsp90 egrave ben documentata
nei modelli di malattie neurodegenerative La geldanamicina (GM) un
inibitore di Hsp90 induce un aumento dose dipendente di Hsp70 nei
modelli di cellule di AD (Alzhaimer) cosigrave come nei neuroni della
corteccia primaria del ratto e riduce la quantitagrave di tau insolubili e dei
livelli basali di acido okadaico indotto da tau fosforilazione [63] Il
trattamento di neuroni primari corticali con lrsquoinibitore di Hsp90 con
struttura purinica il PU24FCI ha portato ad un aumento di Hsp70 dose-
dipendente [72]
PU24FCI
KU32
43
Allo stesso modo la somministrazione di due derivati di PU24FCI
CNS-permeabili il PU-DZ8 [72] ed il EC102 [73] a topi tau transgenici
(htau e JNPL3) ha determinato induzione di Hsp70 nel cervello e
mantenuto gli effetti per 24 ore dopo la somministrazione KU32 un
inibitore di Hsp90 di diversa natura chimica ha indotto Hsp70 in culture
SH-SY5Y di neuroblastoma e la ha protetta da tossicitagrave indotta da Aβ
GM ha attivato una risposta da shock termico ed inibito lrsquoaggregazione
di htt in un modello di coltura cellulare di HD ed ha indotto Hsp70 in
maniera tempo e concentrazione-dipendente ed ha impedito
lrsquoaggregazione di alfa-sinucleina e protetto contro la tossicitagrave in un
modello di aggregazione cellulare di alfa-sinucleina Auluck et al hanno
segnalato che il trattamento di un modello volante di PD con GM ha
protetto completamente contro tossicitagrave per alfa-sinucleina [74] GM ha
protetto anche contro la neurotossicitagrave dopaminergica indotta da 1-metil-
4-fenil-1236-tetraidropiridina (MPTP) in un modello di topo di PD Il
pretrattamento con GM mediante iniezione ventricolare intracerebrale
prima del trattamento con MPTP ha indotto le Hsp70 ed incrementato il
contenuto residuale di dopamina e lrsquoimmuno reattivitagrave della tirosina
idrolasi nel corpo striato [75] Lrsquoinduzione di Hsp70 nel midollo spinale
egrave stata osservata in seguito ad iniezione intraperitoneale di un derivato
della GM il 17-AAG in un modello di SBMA topo [76] Il 17-AAG egrave
stato anche efficace contro la nuerodegenerazione in altre malattie
poliQ Vale a dire ha soppresso la degenerazione dellrsquoocchio e la
formazione di inclusioni del corpo e salvato dalla letalitagrave in un modello
di SCA di Drosophila Ha inoltre soppresso la neurodegenerazione in un
modello volante di HD La riduzione di HSF-1 ha abolito lrsquoinduzione di
chaperoni molecolari e gli effeti terapeutici di 17-AAG sulla
neurodegenerazione poliQ indotta nei modelli di Drosophila facendo
44
arguire che lrsquoeffetto terapeutico di 17-AAG egrave essenzialmente mediato da
HSF-1 [77] Riassumendo lrsquoattivazione di HSF-1 da inibitori di Hsp90
egrave stata notata specificamente in modelli in vivo ed in vitro di malattie
neurodegenerative suggerendo che lrsquoinibizione di Hsp90 puograve essere un
mezzo per modulare i livelli di Hsp in cervelli malati con lrsquoobbiettivo di
proteggere contro le proteine tossiche che si presentano nel corso del
processo neurodegenerativo
Lrsquoinibizione di Hsp90 riduce lrsquoattivitagrave e lrsquoespressione di proteine
neuronali aberranti
In aggiunta alla regolazione di HSF-1 evidenze recenti suggeriscono un
ruolo addizionale per Hsp90 nel mantenimento della stabilitagrave funzionale
della capacitagrave aberrante di proteine neuronali (Figura 8A)
La SBMA egrave una malattia ereditaria dei motoneuroni causata
dallrsquoaccrescimento di un tratto di poliglutamina allrsquointerno del recettore
androgeno (AR) [57]
Le caratteristiche patologiche di SBMA sono perdita dei motoneuroni
nel midollo spinale e nel tronco cerebrale diffusione dellrsquoaccumulo
nucleare inclusioni nucleari di mutanti AR (mAR) nei motoneuroni
residui e in alcuni organi viscerali Waza et al hanno dimostrato che
mAR presente in SBMA egrave una delle proteine regolate da Hsp90 (Figura
8A) [76]
45
Figura 8 Le Hsp90 riparano le proteine neuronali aberranti (A) Proteine neuronali
aberranti regolate da Hsp90 (B) Lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90porta allrsquoinattivazione
o degradazione delle proteine regulate da Hsp90 probabilmente attraverso la via del
proteasoma
Le Hsp90 formano un complesso molecolare con mAR per il
mantenimento della sua stabilitagrave funzionale Sia in modelli cellulari di
SBMA che in topi transgenici lrsquoinibizione di Hsp90 da parte di 17-
AAG il derivato 17 allilammino-17-demetossi della geldanamicina ha
46
portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal
macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati
disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da
destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione
dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di
SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave
rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati
[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori
hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo
sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa
(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni
Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]
Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo
egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali
sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al
hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina
(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi
familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un
complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data
da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto
47
lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della
stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave
dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita
neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei
neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che
codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a
PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson
familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson
suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente
associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che
Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate
con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente
diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina
egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille
ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno
recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di
alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che
sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina
[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce
lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari
Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-
dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento
tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-
sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da
chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di
mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il
macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD
associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-
48
sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative
caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave
caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di
tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD
lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da
unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina
chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta
(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si
era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero
netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un
gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e
Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave
causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma
17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau
[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine
neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso
portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina
mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da
Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei
modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave
patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-
dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla
settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad
una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di
tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno
dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una
diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di
AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le
49
relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la
degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90
[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al
(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave
stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da
GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β
effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi
GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di
Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe
portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in
strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati
indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone
biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione
di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da
parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi
proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di
queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)
Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie
neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio
approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare
dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la
formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione
potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di
Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare
terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare
malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo
centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90
puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione
50
successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti
neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti
clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto
che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono
tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in
modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni
nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati
promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio
spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in
modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di
Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a
lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse
da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase
esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora
rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori
dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per
mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie
neurodegenerative
51
SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-
ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-
METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE
(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE
MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO
SULLA FRAMMENTAZIONE
Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in
risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta
nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine
regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il
ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai
loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine
client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro
cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire
su molti percorsi oncogenici
Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il
nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che
lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati
composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP
attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del
processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono
emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i
tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule
normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina
(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una
maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto
che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una
piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
37
di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di
Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta
promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]
Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90
nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave
funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi
permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]
HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico
Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono
mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)
accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock
citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata
da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante
di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo
stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si
lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei
geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-
shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via
multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di
transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-
translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90
[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e
mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo
shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con
Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)
38
attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da
shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni
Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che
i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro
sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock
termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su
attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato
che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi
di insulti
Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90
e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con
shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La
somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a
topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello
39
Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge
contro aggregati tossici
Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un
aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave
egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di
chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione
incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste
molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente
diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su
espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative
Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie
neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a
mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei
neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia
muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-
pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma
mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme
nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che
Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in
oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza
attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili
[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di
Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt
mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore
di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo
suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro
effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi
40
indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando
monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono
probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono
essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di
atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70
permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]
Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare
spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo
nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un
miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina
[62]
Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il
riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso
lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido
dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli
di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i
motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione
acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni
Riluzolo
Arimoclomol
41
Nei vari modelli cellulari della malattia di Alzheimer (AD) vi egrave un
incremento dei livelli di Hsp70 promossa dalla solubilitagrave e dal legame ai
microtubuli delle proteine tau [63] Hsp70 ha anche inibito la
propensione di aggregazione di Aβ [64] e ridotto la tossicitagrave di Aβ su
culture neuronali [65] Inoltre la proteina precursore dellrsquoamiloide
(APP) eo il suo Aβ amiloide derivato sono bersagli di chaperoni
mediati da clearence [66-67] Nella Drosophila melanogaster e nei
modelli di lievito della malattia di Parkinson (PD) lrsquoespressione diretta
di Hsp70 o la modulazione farmacologica di Hsp ha impedito la perdita
di neuroni causata da alfa-sinucleina [68-69] Huang et al hanno
riportato che questi effetti di Hsp70 si manifestano con lrsquoinibizione della
formazione di fibrille di alfa-sinucleina prevenendo la formazione di
alfa-sinucleina prefibrillare [70] Usando delezioni mutanti di alfa-
sinucleina Luk et al hanno indicato che le interazioni tra il dominio
legante il substrato Hsp70 e la regione del core idrofobico dellrsquoalfa-
sinucleina mediano lrsquoinibizione dellrsquoassemblaggio e che questo
processo di assemblaggio egrave inibito prima della fase di allungamento
[71] Nel complesso in diversi modelli di malattia neurodegenerativa la
sovra espressione di Hsp70 ha migliorato la gravitagrave della malattia di
fenotipi diversi senza incidere visibilmente sulla formazione di
aggregati suggerendo che i chaperoni non impediscono lrsquoaggregazione
di per seacute bensigrave reindirizzano gli aggregati preferibilmente in depositi
amorfi quindi sequestrando specie potenzialmente tossiche dalla
maggior parte della soluzione
42
Lrsquoespressione di Hsp70 e di altre Hsp egrave indotta dallrsquoinibizione
farmacologica di Hsp90
Come riportato sopra lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal
complesso con Hsp90 con susseguente produzione di Hsp (Figura 7) e
lrsquoinduzione di Hsp70 da parte di inibitori di Hsp90 egrave ben documentata
nei modelli di malattie neurodegenerative La geldanamicina (GM) un
inibitore di Hsp90 induce un aumento dose dipendente di Hsp70 nei
modelli di cellule di AD (Alzhaimer) cosigrave come nei neuroni della
corteccia primaria del ratto e riduce la quantitagrave di tau insolubili e dei
livelli basali di acido okadaico indotto da tau fosforilazione [63] Il
trattamento di neuroni primari corticali con lrsquoinibitore di Hsp90 con
struttura purinica il PU24FCI ha portato ad un aumento di Hsp70 dose-
dipendente [72]
PU24FCI
KU32
43
Allo stesso modo la somministrazione di due derivati di PU24FCI
CNS-permeabili il PU-DZ8 [72] ed il EC102 [73] a topi tau transgenici
(htau e JNPL3) ha determinato induzione di Hsp70 nel cervello e
mantenuto gli effetti per 24 ore dopo la somministrazione KU32 un
inibitore di Hsp90 di diversa natura chimica ha indotto Hsp70 in culture
SH-SY5Y di neuroblastoma e la ha protetta da tossicitagrave indotta da Aβ
GM ha attivato una risposta da shock termico ed inibito lrsquoaggregazione
di htt in un modello di coltura cellulare di HD ed ha indotto Hsp70 in
maniera tempo e concentrazione-dipendente ed ha impedito
lrsquoaggregazione di alfa-sinucleina e protetto contro la tossicitagrave in un
modello di aggregazione cellulare di alfa-sinucleina Auluck et al hanno
segnalato che il trattamento di un modello volante di PD con GM ha
protetto completamente contro tossicitagrave per alfa-sinucleina [74] GM ha
protetto anche contro la neurotossicitagrave dopaminergica indotta da 1-metil-
4-fenil-1236-tetraidropiridina (MPTP) in un modello di topo di PD Il
pretrattamento con GM mediante iniezione ventricolare intracerebrale
prima del trattamento con MPTP ha indotto le Hsp70 ed incrementato il
contenuto residuale di dopamina e lrsquoimmuno reattivitagrave della tirosina
idrolasi nel corpo striato [75] Lrsquoinduzione di Hsp70 nel midollo spinale
egrave stata osservata in seguito ad iniezione intraperitoneale di un derivato
della GM il 17-AAG in un modello di SBMA topo [76] Il 17-AAG egrave
stato anche efficace contro la nuerodegenerazione in altre malattie
poliQ Vale a dire ha soppresso la degenerazione dellrsquoocchio e la
formazione di inclusioni del corpo e salvato dalla letalitagrave in un modello
di SCA di Drosophila Ha inoltre soppresso la neurodegenerazione in un
modello volante di HD La riduzione di HSF-1 ha abolito lrsquoinduzione di
chaperoni molecolari e gli effeti terapeutici di 17-AAG sulla
neurodegenerazione poliQ indotta nei modelli di Drosophila facendo
44
arguire che lrsquoeffetto terapeutico di 17-AAG egrave essenzialmente mediato da
HSF-1 [77] Riassumendo lrsquoattivazione di HSF-1 da inibitori di Hsp90
egrave stata notata specificamente in modelli in vivo ed in vitro di malattie
neurodegenerative suggerendo che lrsquoinibizione di Hsp90 puograve essere un
mezzo per modulare i livelli di Hsp in cervelli malati con lrsquoobbiettivo di
proteggere contro le proteine tossiche che si presentano nel corso del
processo neurodegenerativo
Lrsquoinibizione di Hsp90 riduce lrsquoattivitagrave e lrsquoespressione di proteine
neuronali aberranti
In aggiunta alla regolazione di HSF-1 evidenze recenti suggeriscono un
ruolo addizionale per Hsp90 nel mantenimento della stabilitagrave funzionale
della capacitagrave aberrante di proteine neuronali (Figura 8A)
La SBMA egrave una malattia ereditaria dei motoneuroni causata
dallrsquoaccrescimento di un tratto di poliglutamina allrsquointerno del recettore
androgeno (AR) [57]
Le caratteristiche patologiche di SBMA sono perdita dei motoneuroni
nel midollo spinale e nel tronco cerebrale diffusione dellrsquoaccumulo
nucleare inclusioni nucleari di mutanti AR (mAR) nei motoneuroni
residui e in alcuni organi viscerali Waza et al hanno dimostrato che
mAR presente in SBMA egrave una delle proteine regolate da Hsp90 (Figura
8A) [76]
45
Figura 8 Le Hsp90 riparano le proteine neuronali aberranti (A) Proteine neuronali
aberranti regolate da Hsp90 (B) Lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90porta allrsquoinattivazione
o degradazione delle proteine regulate da Hsp90 probabilmente attraverso la via del
proteasoma
Le Hsp90 formano un complesso molecolare con mAR per il
mantenimento della sua stabilitagrave funzionale Sia in modelli cellulari di
SBMA che in topi transgenici lrsquoinibizione di Hsp90 da parte di 17-
AAG il derivato 17 allilammino-17-demetossi della geldanamicina ha
46
portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal
macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati
disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da
destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione
dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di
SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave
rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati
[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori
hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo
sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa
(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni
Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]
Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo
egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali
sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al
hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina
(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi
familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un
complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data
da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto
47
lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della
stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave
dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita
neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei
neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che
codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a
PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson
familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson
suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente
associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che
Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate
con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente
diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina
egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille
ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno
recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di
alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che
sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina
[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce
lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari
Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-
dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento
tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-
sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da
chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di
mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il
macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD
associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-
48
sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative
caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave
caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di
tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD
lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da
unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina
chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta
(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si
era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero
netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un
gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e
Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave
causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma
17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau
[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine
neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso
portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina
mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da
Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei
modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave
patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-
dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla
settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad
una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di
tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno
dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una
diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di
AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le
49
relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la
degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90
[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al
(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave
stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da
GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β
effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi
GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di
Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe
portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in
strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati
indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone
biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione
di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da
parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi
proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di
queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)
Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie
neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio
approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare
dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la
formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione
potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di
Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare
terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare
malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo
centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90
puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione
50
successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti
neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti
clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto
che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono
tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in
modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni
nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati
promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio
spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in
modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di
Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a
lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse
da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase
esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora
rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori
dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per
mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie
neurodegenerative
51
SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-
ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-
METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE
(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE
MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO
SULLA FRAMMENTAZIONE
Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in
risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta
nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine
regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il
ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai
loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine
client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro
cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire
su molti percorsi oncogenici
Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il
nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che
lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati
composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP
attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del
processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono
emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i
tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule
normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina
(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una
maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto
che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una
piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
38
attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da
shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni
Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che
i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro
sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock
termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su
attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato
che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi
di insulti
Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90
e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con
shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La
somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a
topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello
39
Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge
contro aggregati tossici
Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un
aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave
egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di
chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione
incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste
molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente
diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su
espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative
Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie
neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a
mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei
neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia
muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-
pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma
mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme
nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che
Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in
oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza
attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili
[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di
Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt
mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore
di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo
suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro
effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi
40
indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando
monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono
probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono
essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di
atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70
permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]
Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare
spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo
nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un
miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina
[62]
Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il
riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso
lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido
dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli
di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i
motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione
acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni
Riluzolo
Arimoclomol
41
Nei vari modelli cellulari della malattia di Alzheimer (AD) vi egrave un
incremento dei livelli di Hsp70 promossa dalla solubilitagrave e dal legame ai
microtubuli delle proteine tau [63] Hsp70 ha anche inibito la
propensione di aggregazione di Aβ [64] e ridotto la tossicitagrave di Aβ su
culture neuronali [65] Inoltre la proteina precursore dellrsquoamiloide
(APP) eo il suo Aβ amiloide derivato sono bersagli di chaperoni
mediati da clearence [66-67] Nella Drosophila melanogaster e nei
modelli di lievito della malattia di Parkinson (PD) lrsquoespressione diretta
di Hsp70 o la modulazione farmacologica di Hsp ha impedito la perdita
di neuroni causata da alfa-sinucleina [68-69] Huang et al hanno
riportato che questi effetti di Hsp70 si manifestano con lrsquoinibizione della
formazione di fibrille di alfa-sinucleina prevenendo la formazione di
alfa-sinucleina prefibrillare [70] Usando delezioni mutanti di alfa-
sinucleina Luk et al hanno indicato che le interazioni tra il dominio
legante il substrato Hsp70 e la regione del core idrofobico dellrsquoalfa-
sinucleina mediano lrsquoinibizione dellrsquoassemblaggio e che questo
processo di assemblaggio egrave inibito prima della fase di allungamento
[71] Nel complesso in diversi modelli di malattia neurodegenerativa la
sovra espressione di Hsp70 ha migliorato la gravitagrave della malattia di
fenotipi diversi senza incidere visibilmente sulla formazione di
aggregati suggerendo che i chaperoni non impediscono lrsquoaggregazione
di per seacute bensigrave reindirizzano gli aggregati preferibilmente in depositi
amorfi quindi sequestrando specie potenzialmente tossiche dalla
maggior parte della soluzione
42
Lrsquoespressione di Hsp70 e di altre Hsp egrave indotta dallrsquoinibizione
farmacologica di Hsp90
Come riportato sopra lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal
complesso con Hsp90 con susseguente produzione di Hsp (Figura 7) e
lrsquoinduzione di Hsp70 da parte di inibitori di Hsp90 egrave ben documentata
nei modelli di malattie neurodegenerative La geldanamicina (GM) un
inibitore di Hsp90 induce un aumento dose dipendente di Hsp70 nei
modelli di cellule di AD (Alzhaimer) cosigrave come nei neuroni della
corteccia primaria del ratto e riduce la quantitagrave di tau insolubili e dei
livelli basali di acido okadaico indotto da tau fosforilazione [63] Il
trattamento di neuroni primari corticali con lrsquoinibitore di Hsp90 con
struttura purinica il PU24FCI ha portato ad un aumento di Hsp70 dose-
dipendente [72]
PU24FCI
KU32
43
Allo stesso modo la somministrazione di due derivati di PU24FCI
CNS-permeabili il PU-DZ8 [72] ed il EC102 [73] a topi tau transgenici
(htau e JNPL3) ha determinato induzione di Hsp70 nel cervello e
mantenuto gli effetti per 24 ore dopo la somministrazione KU32 un
inibitore di Hsp90 di diversa natura chimica ha indotto Hsp70 in culture
SH-SY5Y di neuroblastoma e la ha protetta da tossicitagrave indotta da Aβ
GM ha attivato una risposta da shock termico ed inibito lrsquoaggregazione
di htt in un modello di coltura cellulare di HD ed ha indotto Hsp70 in
maniera tempo e concentrazione-dipendente ed ha impedito
lrsquoaggregazione di alfa-sinucleina e protetto contro la tossicitagrave in un
modello di aggregazione cellulare di alfa-sinucleina Auluck et al hanno
segnalato che il trattamento di un modello volante di PD con GM ha
protetto completamente contro tossicitagrave per alfa-sinucleina [74] GM ha
protetto anche contro la neurotossicitagrave dopaminergica indotta da 1-metil-
4-fenil-1236-tetraidropiridina (MPTP) in un modello di topo di PD Il
pretrattamento con GM mediante iniezione ventricolare intracerebrale
prima del trattamento con MPTP ha indotto le Hsp70 ed incrementato il
contenuto residuale di dopamina e lrsquoimmuno reattivitagrave della tirosina
idrolasi nel corpo striato [75] Lrsquoinduzione di Hsp70 nel midollo spinale
egrave stata osservata in seguito ad iniezione intraperitoneale di un derivato
della GM il 17-AAG in un modello di SBMA topo [76] Il 17-AAG egrave
stato anche efficace contro la nuerodegenerazione in altre malattie
poliQ Vale a dire ha soppresso la degenerazione dellrsquoocchio e la
formazione di inclusioni del corpo e salvato dalla letalitagrave in un modello
di SCA di Drosophila Ha inoltre soppresso la neurodegenerazione in un
modello volante di HD La riduzione di HSF-1 ha abolito lrsquoinduzione di
chaperoni molecolari e gli effeti terapeutici di 17-AAG sulla
neurodegenerazione poliQ indotta nei modelli di Drosophila facendo
44
arguire che lrsquoeffetto terapeutico di 17-AAG egrave essenzialmente mediato da
HSF-1 [77] Riassumendo lrsquoattivazione di HSF-1 da inibitori di Hsp90
egrave stata notata specificamente in modelli in vivo ed in vitro di malattie
neurodegenerative suggerendo che lrsquoinibizione di Hsp90 puograve essere un
mezzo per modulare i livelli di Hsp in cervelli malati con lrsquoobbiettivo di
proteggere contro le proteine tossiche che si presentano nel corso del
processo neurodegenerativo
Lrsquoinibizione di Hsp90 riduce lrsquoattivitagrave e lrsquoespressione di proteine
neuronali aberranti
In aggiunta alla regolazione di HSF-1 evidenze recenti suggeriscono un
ruolo addizionale per Hsp90 nel mantenimento della stabilitagrave funzionale
della capacitagrave aberrante di proteine neuronali (Figura 8A)
La SBMA egrave una malattia ereditaria dei motoneuroni causata
dallrsquoaccrescimento di un tratto di poliglutamina allrsquointerno del recettore
androgeno (AR) [57]
Le caratteristiche patologiche di SBMA sono perdita dei motoneuroni
nel midollo spinale e nel tronco cerebrale diffusione dellrsquoaccumulo
nucleare inclusioni nucleari di mutanti AR (mAR) nei motoneuroni
residui e in alcuni organi viscerali Waza et al hanno dimostrato che
mAR presente in SBMA egrave una delle proteine regolate da Hsp90 (Figura
8A) [76]
45
Figura 8 Le Hsp90 riparano le proteine neuronali aberranti (A) Proteine neuronali
aberranti regolate da Hsp90 (B) Lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90porta allrsquoinattivazione
o degradazione delle proteine regulate da Hsp90 probabilmente attraverso la via del
proteasoma
Le Hsp90 formano un complesso molecolare con mAR per il
mantenimento della sua stabilitagrave funzionale Sia in modelli cellulari di
SBMA che in topi transgenici lrsquoinibizione di Hsp90 da parte di 17-
AAG il derivato 17 allilammino-17-demetossi della geldanamicina ha
46
portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal
macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati
disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da
destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione
dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di
SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave
rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati
[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori
hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo
sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa
(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni
Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]
Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo
egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali
sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al
hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina
(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi
familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un
complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data
da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto
47
lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della
stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave
dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita
neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei
neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che
codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a
PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson
familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson
suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente
associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che
Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate
con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente
diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina
egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille
ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno
recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di
alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che
sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina
[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce
lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari
Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-
dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento
tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-
sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da
chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di
mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il
macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD
associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-
48
sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative
caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave
caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di
tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD
lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da
unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina
chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta
(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si
era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero
netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un
gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e
Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave
causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma
17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau
[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine
neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso
portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina
mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da
Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei
modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave
patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-
dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla
settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad
una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di
tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno
dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una
diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di
AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le
49
relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la
degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90
[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al
(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave
stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da
GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β
effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi
GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di
Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe
portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in
strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati
indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone
biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione
di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da
parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi
proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di
queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)
Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie
neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio
approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare
dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la
formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione
potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di
Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare
terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare
malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo
centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90
puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione
50
successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti
neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti
clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto
che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono
tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in
modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni
nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati
promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio
spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in
modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di
Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a
lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse
da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase
esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora
rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori
dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per
mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie
neurodegenerative
51
SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-
ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-
METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE
(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE
MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO
SULLA FRAMMENTAZIONE
Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in
risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta
nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine
regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il
ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai
loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine
client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro
cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire
su molti percorsi oncogenici
Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il
nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che
lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati
composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP
attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del
processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono
emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i
tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule
normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina
(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una
maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto
che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una
piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
39
Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge
contro aggregati tossici
Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un
aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave
egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di
chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione
incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste
molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente
diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su
espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative
Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie
neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a
mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei
neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia
muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-
pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma
mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme
nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che
Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in
oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza
attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili
[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di
Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt
mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore
di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo
suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro
effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi
40
indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando
monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono
probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono
essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di
atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70
permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]
Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare
spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo
nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un
miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina
[62]
Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il
riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso
lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido
dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli
di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i
motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione
acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni
Riluzolo
Arimoclomol
41
Nei vari modelli cellulari della malattia di Alzheimer (AD) vi egrave un
incremento dei livelli di Hsp70 promossa dalla solubilitagrave e dal legame ai
microtubuli delle proteine tau [63] Hsp70 ha anche inibito la
propensione di aggregazione di Aβ [64] e ridotto la tossicitagrave di Aβ su
culture neuronali [65] Inoltre la proteina precursore dellrsquoamiloide
(APP) eo il suo Aβ amiloide derivato sono bersagli di chaperoni
mediati da clearence [66-67] Nella Drosophila melanogaster e nei
modelli di lievito della malattia di Parkinson (PD) lrsquoespressione diretta
di Hsp70 o la modulazione farmacologica di Hsp ha impedito la perdita
di neuroni causata da alfa-sinucleina [68-69] Huang et al hanno
riportato che questi effetti di Hsp70 si manifestano con lrsquoinibizione della
formazione di fibrille di alfa-sinucleina prevenendo la formazione di
alfa-sinucleina prefibrillare [70] Usando delezioni mutanti di alfa-
sinucleina Luk et al hanno indicato che le interazioni tra il dominio
legante il substrato Hsp70 e la regione del core idrofobico dellrsquoalfa-
sinucleina mediano lrsquoinibizione dellrsquoassemblaggio e che questo
processo di assemblaggio egrave inibito prima della fase di allungamento
[71] Nel complesso in diversi modelli di malattia neurodegenerativa la
sovra espressione di Hsp70 ha migliorato la gravitagrave della malattia di
fenotipi diversi senza incidere visibilmente sulla formazione di
aggregati suggerendo che i chaperoni non impediscono lrsquoaggregazione
di per seacute bensigrave reindirizzano gli aggregati preferibilmente in depositi
amorfi quindi sequestrando specie potenzialmente tossiche dalla
maggior parte della soluzione
42
Lrsquoespressione di Hsp70 e di altre Hsp egrave indotta dallrsquoinibizione
farmacologica di Hsp90
Come riportato sopra lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal
complesso con Hsp90 con susseguente produzione di Hsp (Figura 7) e
lrsquoinduzione di Hsp70 da parte di inibitori di Hsp90 egrave ben documentata
nei modelli di malattie neurodegenerative La geldanamicina (GM) un
inibitore di Hsp90 induce un aumento dose dipendente di Hsp70 nei
modelli di cellule di AD (Alzhaimer) cosigrave come nei neuroni della
corteccia primaria del ratto e riduce la quantitagrave di tau insolubili e dei
livelli basali di acido okadaico indotto da tau fosforilazione [63] Il
trattamento di neuroni primari corticali con lrsquoinibitore di Hsp90 con
struttura purinica il PU24FCI ha portato ad un aumento di Hsp70 dose-
dipendente [72]
PU24FCI
KU32
43
Allo stesso modo la somministrazione di due derivati di PU24FCI
CNS-permeabili il PU-DZ8 [72] ed il EC102 [73] a topi tau transgenici
(htau e JNPL3) ha determinato induzione di Hsp70 nel cervello e
mantenuto gli effetti per 24 ore dopo la somministrazione KU32 un
inibitore di Hsp90 di diversa natura chimica ha indotto Hsp70 in culture
SH-SY5Y di neuroblastoma e la ha protetta da tossicitagrave indotta da Aβ
GM ha attivato una risposta da shock termico ed inibito lrsquoaggregazione
di htt in un modello di coltura cellulare di HD ed ha indotto Hsp70 in
maniera tempo e concentrazione-dipendente ed ha impedito
lrsquoaggregazione di alfa-sinucleina e protetto contro la tossicitagrave in un
modello di aggregazione cellulare di alfa-sinucleina Auluck et al hanno
segnalato che il trattamento di un modello volante di PD con GM ha
protetto completamente contro tossicitagrave per alfa-sinucleina [74] GM ha
protetto anche contro la neurotossicitagrave dopaminergica indotta da 1-metil-
4-fenil-1236-tetraidropiridina (MPTP) in un modello di topo di PD Il
pretrattamento con GM mediante iniezione ventricolare intracerebrale
prima del trattamento con MPTP ha indotto le Hsp70 ed incrementato il
contenuto residuale di dopamina e lrsquoimmuno reattivitagrave della tirosina
idrolasi nel corpo striato [75] Lrsquoinduzione di Hsp70 nel midollo spinale
egrave stata osservata in seguito ad iniezione intraperitoneale di un derivato
della GM il 17-AAG in un modello di SBMA topo [76] Il 17-AAG egrave
stato anche efficace contro la nuerodegenerazione in altre malattie
poliQ Vale a dire ha soppresso la degenerazione dellrsquoocchio e la
formazione di inclusioni del corpo e salvato dalla letalitagrave in un modello
di SCA di Drosophila Ha inoltre soppresso la neurodegenerazione in un
modello volante di HD La riduzione di HSF-1 ha abolito lrsquoinduzione di
chaperoni molecolari e gli effeti terapeutici di 17-AAG sulla
neurodegenerazione poliQ indotta nei modelli di Drosophila facendo
44
arguire che lrsquoeffetto terapeutico di 17-AAG egrave essenzialmente mediato da
HSF-1 [77] Riassumendo lrsquoattivazione di HSF-1 da inibitori di Hsp90
egrave stata notata specificamente in modelli in vivo ed in vitro di malattie
neurodegenerative suggerendo che lrsquoinibizione di Hsp90 puograve essere un
mezzo per modulare i livelli di Hsp in cervelli malati con lrsquoobbiettivo di
proteggere contro le proteine tossiche che si presentano nel corso del
processo neurodegenerativo
Lrsquoinibizione di Hsp90 riduce lrsquoattivitagrave e lrsquoespressione di proteine
neuronali aberranti
In aggiunta alla regolazione di HSF-1 evidenze recenti suggeriscono un
ruolo addizionale per Hsp90 nel mantenimento della stabilitagrave funzionale
della capacitagrave aberrante di proteine neuronali (Figura 8A)
La SBMA egrave una malattia ereditaria dei motoneuroni causata
dallrsquoaccrescimento di un tratto di poliglutamina allrsquointerno del recettore
androgeno (AR) [57]
Le caratteristiche patologiche di SBMA sono perdita dei motoneuroni
nel midollo spinale e nel tronco cerebrale diffusione dellrsquoaccumulo
nucleare inclusioni nucleari di mutanti AR (mAR) nei motoneuroni
residui e in alcuni organi viscerali Waza et al hanno dimostrato che
mAR presente in SBMA egrave una delle proteine regolate da Hsp90 (Figura
8A) [76]
45
Figura 8 Le Hsp90 riparano le proteine neuronali aberranti (A) Proteine neuronali
aberranti regolate da Hsp90 (B) Lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90porta allrsquoinattivazione
o degradazione delle proteine regulate da Hsp90 probabilmente attraverso la via del
proteasoma
Le Hsp90 formano un complesso molecolare con mAR per il
mantenimento della sua stabilitagrave funzionale Sia in modelli cellulari di
SBMA che in topi transgenici lrsquoinibizione di Hsp90 da parte di 17-
AAG il derivato 17 allilammino-17-demetossi della geldanamicina ha
46
portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal
macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati
disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da
destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione
dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di
SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave
rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati
[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori
hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo
sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa
(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni
Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]
Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo
egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali
sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al
hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina
(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi
familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un
complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data
da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto
47
lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della
stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave
dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita
neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei
neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che
codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a
PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson
familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson
suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente
associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che
Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate
con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente
diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina
egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille
ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno
recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di
alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che
sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina
[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce
lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari
Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-
dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento
tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-
sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da
chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di
mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il
macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD
associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-
48
sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative
caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave
caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di
tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD
lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da
unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina
chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta
(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si
era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero
netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un
gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e
Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave
causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma
17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau
[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine
neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso
portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina
mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da
Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei
modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave
patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-
dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla
settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad
una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di
tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno
dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una
diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di
AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le
49
relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la
degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90
[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al
(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave
stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da
GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β
effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi
GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di
Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe
portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in
strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati
indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone
biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione
di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da
parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi
proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di
queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)
Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie
neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio
approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare
dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la
formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione
potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di
Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare
terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare
malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo
centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90
puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione
50
successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti
neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti
clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto
che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono
tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in
modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni
nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati
promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio
spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in
modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di
Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a
lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse
da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase
esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora
rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori
dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per
mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie
neurodegenerative
51
SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-
ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-
METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE
(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE
MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO
SULLA FRAMMENTAZIONE
Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in
risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta
nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine
regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il
ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai
loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine
client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro
cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire
su molti percorsi oncogenici
Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il
nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che
lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati
composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP
attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del
processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono
emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i
tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule
normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina
(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una
maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto
che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una
piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
40
indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando
monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono
probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono
essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di
atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70
permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]
Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare
spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo
nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un
miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina
[62]
Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il
riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso
lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido
dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli
di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i
motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione
acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni
Riluzolo
Arimoclomol
41
Nei vari modelli cellulari della malattia di Alzheimer (AD) vi egrave un
incremento dei livelli di Hsp70 promossa dalla solubilitagrave e dal legame ai
microtubuli delle proteine tau [63] Hsp70 ha anche inibito la
propensione di aggregazione di Aβ [64] e ridotto la tossicitagrave di Aβ su
culture neuronali [65] Inoltre la proteina precursore dellrsquoamiloide
(APP) eo il suo Aβ amiloide derivato sono bersagli di chaperoni
mediati da clearence [66-67] Nella Drosophila melanogaster e nei
modelli di lievito della malattia di Parkinson (PD) lrsquoespressione diretta
di Hsp70 o la modulazione farmacologica di Hsp ha impedito la perdita
di neuroni causata da alfa-sinucleina [68-69] Huang et al hanno
riportato che questi effetti di Hsp70 si manifestano con lrsquoinibizione della
formazione di fibrille di alfa-sinucleina prevenendo la formazione di
alfa-sinucleina prefibrillare [70] Usando delezioni mutanti di alfa-
sinucleina Luk et al hanno indicato che le interazioni tra il dominio
legante il substrato Hsp70 e la regione del core idrofobico dellrsquoalfa-
sinucleina mediano lrsquoinibizione dellrsquoassemblaggio e che questo
processo di assemblaggio egrave inibito prima della fase di allungamento
[71] Nel complesso in diversi modelli di malattia neurodegenerativa la
sovra espressione di Hsp70 ha migliorato la gravitagrave della malattia di
fenotipi diversi senza incidere visibilmente sulla formazione di
aggregati suggerendo che i chaperoni non impediscono lrsquoaggregazione
di per seacute bensigrave reindirizzano gli aggregati preferibilmente in depositi
amorfi quindi sequestrando specie potenzialmente tossiche dalla
maggior parte della soluzione
42
Lrsquoespressione di Hsp70 e di altre Hsp egrave indotta dallrsquoinibizione
farmacologica di Hsp90
Come riportato sopra lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal
complesso con Hsp90 con susseguente produzione di Hsp (Figura 7) e
lrsquoinduzione di Hsp70 da parte di inibitori di Hsp90 egrave ben documentata
nei modelli di malattie neurodegenerative La geldanamicina (GM) un
inibitore di Hsp90 induce un aumento dose dipendente di Hsp70 nei
modelli di cellule di AD (Alzhaimer) cosigrave come nei neuroni della
corteccia primaria del ratto e riduce la quantitagrave di tau insolubili e dei
livelli basali di acido okadaico indotto da tau fosforilazione [63] Il
trattamento di neuroni primari corticali con lrsquoinibitore di Hsp90 con
struttura purinica il PU24FCI ha portato ad un aumento di Hsp70 dose-
dipendente [72]
PU24FCI
KU32
43
Allo stesso modo la somministrazione di due derivati di PU24FCI
CNS-permeabili il PU-DZ8 [72] ed il EC102 [73] a topi tau transgenici
(htau e JNPL3) ha determinato induzione di Hsp70 nel cervello e
mantenuto gli effetti per 24 ore dopo la somministrazione KU32 un
inibitore di Hsp90 di diversa natura chimica ha indotto Hsp70 in culture
SH-SY5Y di neuroblastoma e la ha protetta da tossicitagrave indotta da Aβ
GM ha attivato una risposta da shock termico ed inibito lrsquoaggregazione
di htt in un modello di coltura cellulare di HD ed ha indotto Hsp70 in
maniera tempo e concentrazione-dipendente ed ha impedito
lrsquoaggregazione di alfa-sinucleina e protetto contro la tossicitagrave in un
modello di aggregazione cellulare di alfa-sinucleina Auluck et al hanno
segnalato che il trattamento di un modello volante di PD con GM ha
protetto completamente contro tossicitagrave per alfa-sinucleina [74] GM ha
protetto anche contro la neurotossicitagrave dopaminergica indotta da 1-metil-
4-fenil-1236-tetraidropiridina (MPTP) in un modello di topo di PD Il
pretrattamento con GM mediante iniezione ventricolare intracerebrale
prima del trattamento con MPTP ha indotto le Hsp70 ed incrementato il
contenuto residuale di dopamina e lrsquoimmuno reattivitagrave della tirosina
idrolasi nel corpo striato [75] Lrsquoinduzione di Hsp70 nel midollo spinale
egrave stata osservata in seguito ad iniezione intraperitoneale di un derivato
della GM il 17-AAG in un modello di SBMA topo [76] Il 17-AAG egrave
stato anche efficace contro la nuerodegenerazione in altre malattie
poliQ Vale a dire ha soppresso la degenerazione dellrsquoocchio e la
formazione di inclusioni del corpo e salvato dalla letalitagrave in un modello
di SCA di Drosophila Ha inoltre soppresso la neurodegenerazione in un
modello volante di HD La riduzione di HSF-1 ha abolito lrsquoinduzione di
chaperoni molecolari e gli effeti terapeutici di 17-AAG sulla
neurodegenerazione poliQ indotta nei modelli di Drosophila facendo
44
arguire che lrsquoeffetto terapeutico di 17-AAG egrave essenzialmente mediato da
HSF-1 [77] Riassumendo lrsquoattivazione di HSF-1 da inibitori di Hsp90
egrave stata notata specificamente in modelli in vivo ed in vitro di malattie
neurodegenerative suggerendo che lrsquoinibizione di Hsp90 puograve essere un
mezzo per modulare i livelli di Hsp in cervelli malati con lrsquoobbiettivo di
proteggere contro le proteine tossiche che si presentano nel corso del
processo neurodegenerativo
Lrsquoinibizione di Hsp90 riduce lrsquoattivitagrave e lrsquoespressione di proteine
neuronali aberranti
In aggiunta alla regolazione di HSF-1 evidenze recenti suggeriscono un
ruolo addizionale per Hsp90 nel mantenimento della stabilitagrave funzionale
della capacitagrave aberrante di proteine neuronali (Figura 8A)
La SBMA egrave una malattia ereditaria dei motoneuroni causata
dallrsquoaccrescimento di un tratto di poliglutamina allrsquointerno del recettore
androgeno (AR) [57]
Le caratteristiche patologiche di SBMA sono perdita dei motoneuroni
nel midollo spinale e nel tronco cerebrale diffusione dellrsquoaccumulo
nucleare inclusioni nucleari di mutanti AR (mAR) nei motoneuroni
residui e in alcuni organi viscerali Waza et al hanno dimostrato che
mAR presente in SBMA egrave una delle proteine regolate da Hsp90 (Figura
8A) [76]
45
Figura 8 Le Hsp90 riparano le proteine neuronali aberranti (A) Proteine neuronali
aberranti regolate da Hsp90 (B) Lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90porta allrsquoinattivazione
o degradazione delle proteine regulate da Hsp90 probabilmente attraverso la via del
proteasoma
Le Hsp90 formano un complesso molecolare con mAR per il
mantenimento della sua stabilitagrave funzionale Sia in modelli cellulari di
SBMA che in topi transgenici lrsquoinibizione di Hsp90 da parte di 17-
AAG il derivato 17 allilammino-17-demetossi della geldanamicina ha
46
portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal
macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati
disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da
destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione
dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di
SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave
rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati
[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori
hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo
sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa
(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni
Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]
Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo
egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali
sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al
hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina
(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi
familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un
complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data
da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto
47
lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della
stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave
dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita
neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei
neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che
codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a
PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson
familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson
suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente
associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che
Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate
con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente
diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina
egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille
ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno
recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di
alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che
sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina
[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce
lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari
Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-
dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento
tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-
sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da
chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di
mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il
macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD
associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-
48
sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative
caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave
caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di
tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD
lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da
unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina
chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta
(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si
era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero
netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un
gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e
Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave
causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma
17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau
[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine
neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso
portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina
mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da
Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei
modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave
patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-
dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla
settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad
una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di
tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno
dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una
diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di
AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le
49
relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la
degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90
[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al
(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave
stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da
GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β
effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi
GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di
Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe
portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in
strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati
indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone
biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione
di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da
parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi
proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di
queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)
Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie
neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio
approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare
dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la
formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione
potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di
Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare
terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare
malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo
centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90
puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione
50
successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti
neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti
clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto
che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono
tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in
modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni
nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati
promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio
spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in
modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di
Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a
lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse
da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase
esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora
rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori
dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per
mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie
neurodegenerative
51
SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-
ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-
METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE
(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE
MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO
SULLA FRAMMENTAZIONE
Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in
risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta
nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine
regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il
ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai
loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine
client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro
cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire
su molti percorsi oncogenici
Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il
nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che
lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati
composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP
attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del
processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono
emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i
tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule
normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina
(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una
maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto
che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una
piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
41
Nei vari modelli cellulari della malattia di Alzheimer (AD) vi egrave un
incremento dei livelli di Hsp70 promossa dalla solubilitagrave e dal legame ai
microtubuli delle proteine tau [63] Hsp70 ha anche inibito la
propensione di aggregazione di Aβ [64] e ridotto la tossicitagrave di Aβ su
culture neuronali [65] Inoltre la proteina precursore dellrsquoamiloide
(APP) eo il suo Aβ amiloide derivato sono bersagli di chaperoni
mediati da clearence [66-67] Nella Drosophila melanogaster e nei
modelli di lievito della malattia di Parkinson (PD) lrsquoespressione diretta
di Hsp70 o la modulazione farmacologica di Hsp ha impedito la perdita
di neuroni causata da alfa-sinucleina [68-69] Huang et al hanno
riportato che questi effetti di Hsp70 si manifestano con lrsquoinibizione della
formazione di fibrille di alfa-sinucleina prevenendo la formazione di
alfa-sinucleina prefibrillare [70] Usando delezioni mutanti di alfa-
sinucleina Luk et al hanno indicato che le interazioni tra il dominio
legante il substrato Hsp70 e la regione del core idrofobico dellrsquoalfa-
sinucleina mediano lrsquoinibizione dellrsquoassemblaggio e che questo
processo di assemblaggio egrave inibito prima della fase di allungamento
[71] Nel complesso in diversi modelli di malattia neurodegenerativa la
sovra espressione di Hsp70 ha migliorato la gravitagrave della malattia di
fenotipi diversi senza incidere visibilmente sulla formazione di
aggregati suggerendo che i chaperoni non impediscono lrsquoaggregazione
di per seacute bensigrave reindirizzano gli aggregati preferibilmente in depositi
amorfi quindi sequestrando specie potenzialmente tossiche dalla
maggior parte della soluzione
42
Lrsquoespressione di Hsp70 e di altre Hsp egrave indotta dallrsquoinibizione
farmacologica di Hsp90
Come riportato sopra lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal
complesso con Hsp90 con susseguente produzione di Hsp (Figura 7) e
lrsquoinduzione di Hsp70 da parte di inibitori di Hsp90 egrave ben documentata
nei modelli di malattie neurodegenerative La geldanamicina (GM) un
inibitore di Hsp90 induce un aumento dose dipendente di Hsp70 nei
modelli di cellule di AD (Alzhaimer) cosigrave come nei neuroni della
corteccia primaria del ratto e riduce la quantitagrave di tau insolubili e dei
livelli basali di acido okadaico indotto da tau fosforilazione [63] Il
trattamento di neuroni primari corticali con lrsquoinibitore di Hsp90 con
struttura purinica il PU24FCI ha portato ad un aumento di Hsp70 dose-
dipendente [72]
PU24FCI
KU32
43
Allo stesso modo la somministrazione di due derivati di PU24FCI
CNS-permeabili il PU-DZ8 [72] ed il EC102 [73] a topi tau transgenici
(htau e JNPL3) ha determinato induzione di Hsp70 nel cervello e
mantenuto gli effetti per 24 ore dopo la somministrazione KU32 un
inibitore di Hsp90 di diversa natura chimica ha indotto Hsp70 in culture
SH-SY5Y di neuroblastoma e la ha protetta da tossicitagrave indotta da Aβ
GM ha attivato una risposta da shock termico ed inibito lrsquoaggregazione
di htt in un modello di coltura cellulare di HD ed ha indotto Hsp70 in
maniera tempo e concentrazione-dipendente ed ha impedito
lrsquoaggregazione di alfa-sinucleina e protetto contro la tossicitagrave in un
modello di aggregazione cellulare di alfa-sinucleina Auluck et al hanno
segnalato che il trattamento di un modello volante di PD con GM ha
protetto completamente contro tossicitagrave per alfa-sinucleina [74] GM ha
protetto anche contro la neurotossicitagrave dopaminergica indotta da 1-metil-
4-fenil-1236-tetraidropiridina (MPTP) in un modello di topo di PD Il
pretrattamento con GM mediante iniezione ventricolare intracerebrale
prima del trattamento con MPTP ha indotto le Hsp70 ed incrementato il
contenuto residuale di dopamina e lrsquoimmuno reattivitagrave della tirosina
idrolasi nel corpo striato [75] Lrsquoinduzione di Hsp70 nel midollo spinale
egrave stata osservata in seguito ad iniezione intraperitoneale di un derivato
della GM il 17-AAG in un modello di SBMA topo [76] Il 17-AAG egrave
stato anche efficace contro la nuerodegenerazione in altre malattie
poliQ Vale a dire ha soppresso la degenerazione dellrsquoocchio e la
formazione di inclusioni del corpo e salvato dalla letalitagrave in un modello
di SCA di Drosophila Ha inoltre soppresso la neurodegenerazione in un
modello volante di HD La riduzione di HSF-1 ha abolito lrsquoinduzione di
chaperoni molecolari e gli effeti terapeutici di 17-AAG sulla
neurodegenerazione poliQ indotta nei modelli di Drosophila facendo
44
arguire che lrsquoeffetto terapeutico di 17-AAG egrave essenzialmente mediato da
HSF-1 [77] Riassumendo lrsquoattivazione di HSF-1 da inibitori di Hsp90
egrave stata notata specificamente in modelli in vivo ed in vitro di malattie
neurodegenerative suggerendo che lrsquoinibizione di Hsp90 puograve essere un
mezzo per modulare i livelli di Hsp in cervelli malati con lrsquoobbiettivo di
proteggere contro le proteine tossiche che si presentano nel corso del
processo neurodegenerativo
Lrsquoinibizione di Hsp90 riduce lrsquoattivitagrave e lrsquoespressione di proteine
neuronali aberranti
In aggiunta alla regolazione di HSF-1 evidenze recenti suggeriscono un
ruolo addizionale per Hsp90 nel mantenimento della stabilitagrave funzionale
della capacitagrave aberrante di proteine neuronali (Figura 8A)
La SBMA egrave una malattia ereditaria dei motoneuroni causata
dallrsquoaccrescimento di un tratto di poliglutamina allrsquointerno del recettore
androgeno (AR) [57]
Le caratteristiche patologiche di SBMA sono perdita dei motoneuroni
nel midollo spinale e nel tronco cerebrale diffusione dellrsquoaccumulo
nucleare inclusioni nucleari di mutanti AR (mAR) nei motoneuroni
residui e in alcuni organi viscerali Waza et al hanno dimostrato che
mAR presente in SBMA egrave una delle proteine regolate da Hsp90 (Figura
8A) [76]
45
Figura 8 Le Hsp90 riparano le proteine neuronali aberranti (A) Proteine neuronali
aberranti regolate da Hsp90 (B) Lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90porta allrsquoinattivazione
o degradazione delle proteine regulate da Hsp90 probabilmente attraverso la via del
proteasoma
Le Hsp90 formano un complesso molecolare con mAR per il
mantenimento della sua stabilitagrave funzionale Sia in modelli cellulari di
SBMA che in topi transgenici lrsquoinibizione di Hsp90 da parte di 17-
AAG il derivato 17 allilammino-17-demetossi della geldanamicina ha
46
portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal
macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati
disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da
destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione
dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di
SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave
rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati
[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori
hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo
sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa
(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni
Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]
Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo
egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali
sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al
hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina
(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi
familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un
complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data
da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto
47
lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della
stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave
dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita
neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei
neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che
codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a
PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson
familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson
suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente
associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che
Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate
con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente
diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina
egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille
ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno
recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di
alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che
sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina
[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce
lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari
Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-
dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento
tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-
sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da
chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di
mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il
macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD
associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-
48
sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative
caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave
caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di
tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD
lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da
unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina
chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta
(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si
era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero
netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un
gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e
Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave
causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma
17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau
[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine
neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso
portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina
mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da
Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei
modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave
patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-
dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla
settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad
una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di
tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno
dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una
diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di
AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le
49
relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la
degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90
[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al
(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave
stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da
GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β
effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi
GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di
Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe
portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in
strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati
indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone
biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione
di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da
parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi
proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di
queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)
Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie
neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio
approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare
dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la
formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione
potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di
Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare
terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare
malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo
centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90
puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione
50
successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti
neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti
clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto
che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono
tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in
modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni
nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati
promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio
spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in
modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di
Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a
lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse
da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase
esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora
rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori
dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per
mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie
neurodegenerative
51
SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-
ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-
METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE
(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE
MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO
SULLA FRAMMENTAZIONE
Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in
risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta
nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine
regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il
ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai
loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine
client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro
cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire
su molti percorsi oncogenici
Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il
nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che
lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati
composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP
attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del
processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono
emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i
tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule
normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina
(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una
maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto
che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una
piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
42
Lrsquoespressione di Hsp70 e di altre Hsp egrave indotta dallrsquoinibizione
farmacologica di Hsp90
Come riportato sopra lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal
complesso con Hsp90 con susseguente produzione di Hsp (Figura 7) e
lrsquoinduzione di Hsp70 da parte di inibitori di Hsp90 egrave ben documentata
nei modelli di malattie neurodegenerative La geldanamicina (GM) un
inibitore di Hsp90 induce un aumento dose dipendente di Hsp70 nei
modelli di cellule di AD (Alzhaimer) cosigrave come nei neuroni della
corteccia primaria del ratto e riduce la quantitagrave di tau insolubili e dei
livelli basali di acido okadaico indotto da tau fosforilazione [63] Il
trattamento di neuroni primari corticali con lrsquoinibitore di Hsp90 con
struttura purinica il PU24FCI ha portato ad un aumento di Hsp70 dose-
dipendente [72]
PU24FCI
KU32
43
Allo stesso modo la somministrazione di due derivati di PU24FCI
CNS-permeabili il PU-DZ8 [72] ed il EC102 [73] a topi tau transgenici
(htau e JNPL3) ha determinato induzione di Hsp70 nel cervello e
mantenuto gli effetti per 24 ore dopo la somministrazione KU32 un
inibitore di Hsp90 di diversa natura chimica ha indotto Hsp70 in culture
SH-SY5Y di neuroblastoma e la ha protetta da tossicitagrave indotta da Aβ
GM ha attivato una risposta da shock termico ed inibito lrsquoaggregazione
di htt in un modello di coltura cellulare di HD ed ha indotto Hsp70 in
maniera tempo e concentrazione-dipendente ed ha impedito
lrsquoaggregazione di alfa-sinucleina e protetto contro la tossicitagrave in un
modello di aggregazione cellulare di alfa-sinucleina Auluck et al hanno
segnalato che il trattamento di un modello volante di PD con GM ha
protetto completamente contro tossicitagrave per alfa-sinucleina [74] GM ha
protetto anche contro la neurotossicitagrave dopaminergica indotta da 1-metil-
4-fenil-1236-tetraidropiridina (MPTP) in un modello di topo di PD Il
pretrattamento con GM mediante iniezione ventricolare intracerebrale
prima del trattamento con MPTP ha indotto le Hsp70 ed incrementato il
contenuto residuale di dopamina e lrsquoimmuno reattivitagrave della tirosina
idrolasi nel corpo striato [75] Lrsquoinduzione di Hsp70 nel midollo spinale
egrave stata osservata in seguito ad iniezione intraperitoneale di un derivato
della GM il 17-AAG in un modello di SBMA topo [76] Il 17-AAG egrave
stato anche efficace contro la nuerodegenerazione in altre malattie
poliQ Vale a dire ha soppresso la degenerazione dellrsquoocchio e la
formazione di inclusioni del corpo e salvato dalla letalitagrave in un modello
di SCA di Drosophila Ha inoltre soppresso la neurodegenerazione in un
modello volante di HD La riduzione di HSF-1 ha abolito lrsquoinduzione di
chaperoni molecolari e gli effeti terapeutici di 17-AAG sulla
neurodegenerazione poliQ indotta nei modelli di Drosophila facendo
44
arguire che lrsquoeffetto terapeutico di 17-AAG egrave essenzialmente mediato da
HSF-1 [77] Riassumendo lrsquoattivazione di HSF-1 da inibitori di Hsp90
egrave stata notata specificamente in modelli in vivo ed in vitro di malattie
neurodegenerative suggerendo che lrsquoinibizione di Hsp90 puograve essere un
mezzo per modulare i livelli di Hsp in cervelli malati con lrsquoobbiettivo di
proteggere contro le proteine tossiche che si presentano nel corso del
processo neurodegenerativo
Lrsquoinibizione di Hsp90 riduce lrsquoattivitagrave e lrsquoespressione di proteine
neuronali aberranti
In aggiunta alla regolazione di HSF-1 evidenze recenti suggeriscono un
ruolo addizionale per Hsp90 nel mantenimento della stabilitagrave funzionale
della capacitagrave aberrante di proteine neuronali (Figura 8A)
La SBMA egrave una malattia ereditaria dei motoneuroni causata
dallrsquoaccrescimento di un tratto di poliglutamina allrsquointerno del recettore
androgeno (AR) [57]
Le caratteristiche patologiche di SBMA sono perdita dei motoneuroni
nel midollo spinale e nel tronco cerebrale diffusione dellrsquoaccumulo
nucleare inclusioni nucleari di mutanti AR (mAR) nei motoneuroni
residui e in alcuni organi viscerali Waza et al hanno dimostrato che
mAR presente in SBMA egrave una delle proteine regolate da Hsp90 (Figura
8A) [76]
45
Figura 8 Le Hsp90 riparano le proteine neuronali aberranti (A) Proteine neuronali
aberranti regolate da Hsp90 (B) Lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90porta allrsquoinattivazione
o degradazione delle proteine regulate da Hsp90 probabilmente attraverso la via del
proteasoma
Le Hsp90 formano un complesso molecolare con mAR per il
mantenimento della sua stabilitagrave funzionale Sia in modelli cellulari di
SBMA che in topi transgenici lrsquoinibizione di Hsp90 da parte di 17-
AAG il derivato 17 allilammino-17-demetossi della geldanamicina ha
46
portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal
macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati
disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da
destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione
dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di
SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave
rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati
[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori
hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo
sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa
(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni
Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]
Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo
egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali
sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al
hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina
(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi
familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un
complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data
da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto
47
lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della
stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave
dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita
neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei
neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che
codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a
PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson
familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson
suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente
associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che
Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate
con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente
diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina
egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille
ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno
recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di
alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che
sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina
[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce
lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari
Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-
dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento
tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-
sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da
chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di
mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il
macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD
associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-
48
sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative
caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave
caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di
tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD
lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da
unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina
chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta
(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si
era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero
netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un
gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e
Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave
causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma
17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau
[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine
neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso
portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina
mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da
Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei
modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave
patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-
dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla
settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad
una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di
tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno
dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una
diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di
AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le
49
relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la
degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90
[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al
(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave
stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da
GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β
effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi
GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di
Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe
portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in
strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati
indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone
biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione
di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da
parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi
proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di
queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)
Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie
neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio
approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare
dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la
formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione
potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di
Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare
terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare
malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo
centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90
puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione
50
successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti
neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti
clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto
che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono
tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in
modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni
nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati
promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio
spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in
modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di
Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a
lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse
da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase
esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora
rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori
dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per
mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie
neurodegenerative
51
SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-
ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-
METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE
(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE
MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO
SULLA FRAMMENTAZIONE
Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in
risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta
nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine
regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il
ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai
loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine
client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro
cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire
su molti percorsi oncogenici
Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il
nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che
lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati
composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP
attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del
processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono
emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i
tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule
normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina
(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una
maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto
che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una
piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
43
Allo stesso modo la somministrazione di due derivati di PU24FCI
CNS-permeabili il PU-DZ8 [72] ed il EC102 [73] a topi tau transgenici
(htau e JNPL3) ha determinato induzione di Hsp70 nel cervello e
mantenuto gli effetti per 24 ore dopo la somministrazione KU32 un
inibitore di Hsp90 di diversa natura chimica ha indotto Hsp70 in culture
SH-SY5Y di neuroblastoma e la ha protetta da tossicitagrave indotta da Aβ
GM ha attivato una risposta da shock termico ed inibito lrsquoaggregazione
di htt in un modello di coltura cellulare di HD ed ha indotto Hsp70 in
maniera tempo e concentrazione-dipendente ed ha impedito
lrsquoaggregazione di alfa-sinucleina e protetto contro la tossicitagrave in un
modello di aggregazione cellulare di alfa-sinucleina Auluck et al hanno
segnalato che il trattamento di un modello volante di PD con GM ha
protetto completamente contro tossicitagrave per alfa-sinucleina [74] GM ha
protetto anche contro la neurotossicitagrave dopaminergica indotta da 1-metil-
4-fenil-1236-tetraidropiridina (MPTP) in un modello di topo di PD Il
pretrattamento con GM mediante iniezione ventricolare intracerebrale
prima del trattamento con MPTP ha indotto le Hsp70 ed incrementato il
contenuto residuale di dopamina e lrsquoimmuno reattivitagrave della tirosina
idrolasi nel corpo striato [75] Lrsquoinduzione di Hsp70 nel midollo spinale
egrave stata osservata in seguito ad iniezione intraperitoneale di un derivato
della GM il 17-AAG in un modello di SBMA topo [76] Il 17-AAG egrave
stato anche efficace contro la nuerodegenerazione in altre malattie
poliQ Vale a dire ha soppresso la degenerazione dellrsquoocchio e la
formazione di inclusioni del corpo e salvato dalla letalitagrave in un modello
di SCA di Drosophila Ha inoltre soppresso la neurodegenerazione in un
modello volante di HD La riduzione di HSF-1 ha abolito lrsquoinduzione di
chaperoni molecolari e gli effeti terapeutici di 17-AAG sulla
neurodegenerazione poliQ indotta nei modelli di Drosophila facendo
44
arguire che lrsquoeffetto terapeutico di 17-AAG egrave essenzialmente mediato da
HSF-1 [77] Riassumendo lrsquoattivazione di HSF-1 da inibitori di Hsp90
egrave stata notata specificamente in modelli in vivo ed in vitro di malattie
neurodegenerative suggerendo che lrsquoinibizione di Hsp90 puograve essere un
mezzo per modulare i livelli di Hsp in cervelli malati con lrsquoobbiettivo di
proteggere contro le proteine tossiche che si presentano nel corso del
processo neurodegenerativo
Lrsquoinibizione di Hsp90 riduce lrsquoattivitagrave e lrsquoespressione di proteine
neuronali aberranti
In aggiunta alla regolazione di HSF-1 evidenze recenti suggeriscono un
ruolo addizionale per Hsp90 nel mantenimento della stabilitagrave funzionale
della capacitagrave aberrante di proteine neuronali (Figura 8A)
La SBMA egrave una malattia ereditaria dei motoneuroni causata
dallrsquoaccrescimento di un tratto di poliglutamina allrsquointerno del recettore
androgeno (AR) [57]
Le caratteristiche patologiche di SBMA sono perdita dei motoneuroni
nel midollo spinale e nel tronco cerebrale diffusione dellrsquoaccumulo
nucleare inclusioni nucleari di mutanti AR (mAR) nei motoneuroni
residui e in alcuni organi viscerali Waza et al hanno dimostrato che
mAR presente in SBMA egrave una delle proteine regolate da Hsp90 (Figura
8A) [76]
45
Figura 8 Le Hsp90 riparano le proteine neuronali aberranti (A) Proteine neuronali
aberranti regolate da Hsp90 (B) Lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90porta allrsquoinattivazione
o degradazione delle proteine regulate da Hsp90 probabilmente attraverso la via del
proteasoma
Le Hsp90 formano un complesso molecolare con mAR per il
mantenimento della sua stabilitagrave funzionale Sia in modelli cellulari di
SBMA che in topi transgenici lrsquoinibizione di Hsp90 da parte di 17-
AAG il derivato 17 allilammino-17-demetossi della geldanamicina ha
46
portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal
macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati
disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da
destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione
dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di
SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave
rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati
[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori
hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo
sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa
(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni
Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]
Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo
egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali
sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al
hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina
(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi
familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un
complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data
da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto
47
lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della
stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave
dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita
neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei
neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che
codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a
PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson
familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson
suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente
associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che
Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate
con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente
diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina
egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille
ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno
recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di
alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che
sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina
[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce
lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari
Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-
dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento
tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-
sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da
chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di
mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il
macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD
associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-
48
sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative
caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave
caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di
tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD
lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da
unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina
chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta
(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si
era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero
netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un
gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e
Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave
causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma
17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau
[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine
neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso
portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina
mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da
Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei
modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave
patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-
dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla
settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad
una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di
tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno
dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una
diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di
AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le
49
relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la
degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90
[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al
(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave
stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da
GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β
effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi
GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di
Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe
portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in
strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati
indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone
biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione
di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da
parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi
proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di
queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)
Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie
neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio
approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare
dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la
formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione
potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di
Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare
terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare
malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo
centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90
puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione
50
successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti
neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti
clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto
che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono
tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in
modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni
nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati
promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio
spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in
modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di
Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a
lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse
da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase
esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora
rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori
dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per
mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie
neurodegenerative
51
SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-
ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-
METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE
(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE
MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO
SULLA FRAMMENTAZIONE
Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in
risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta
nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine
regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il
ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai
loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine
client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro
cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire
su molti percorsi oncogenici
Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il
nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che
lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati
composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP
attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del
processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono
emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i
tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule
normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina
(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una
maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto
che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una
piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
44
arguire che lrsquoeffetto terapeutico di 17-AAG egrave essenzialmente mediato da
HSF-1 [77] Riassumendo lrsquoattivazione di HSF-1 da inibitori di Hsp90
egrave stata notata specificamente in modelli in vivo ed in vitro di malattie
neurodegenerative suggerendo che lrsquoinibizione di Hsp90 puograve essere un
mezzo per modulare i livelli di Hsp in cervelli malati con lrsquoobbiettivo di
proteggere contro le proteine tossiche che si presentano nel corso del
processo neurodegenerativo
Lrsquoinibizione di Hsp90 riduce lrsquoattivitagrave e lrsquoespressione di proteine
neuronali aberranti
In aggiunta alla regolazione di HSF-1 evidenze recenti suggeriscono un
ruolo addizionale per Hsp90 nel mantenimento della stabilitagrave funzionale
della capacitagrave aberrante di proteine neuronali (Figura 8A)
La SBMA egrave una malattia ereditaria dei motoneuroni causata
dallrsquoaccrescimento di un tratto di poliglutamina allrsquointerno del recettore
androgeno (AR) [57]
Le caratteristiche patologiche di SBMA sono perdita dei motoneuroni
nel midollo spinale e nel tronco cerebrale diffusione dellrsquoaccumulo
nucleare inclusioni nucleari di mutanti AR (mAR) nei motoneuroni
residui e in alcuni organi viscerali Waza et al hanno dimostrato che
mAR presente in SBMA egrave una delle proteine regolate da Hsp90 (Figura
8A) [76]
45
Figura 8 Le Hsp90 riparano le proteine neuronali aberranti (A) Proteine neuronali
aberranti regolate da Hsp90 (B) Lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90porta allrsquoinattivazione
o degradazione delle proteine regulate da Hsp90 probabilmente attraverso la via del
proteasoma
Le Hsp90 formano un complesso molecolare con mAR per il
mantenimento della sua stabilitagrave funzionale Sia in modelli cellulari di
SBMA che in topi transgenici lrsquoinibizione di Hsp90 da parte di 17-
AAG il derivato 17 allilammino-17-demetossi della geldanamicina ha
46
portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal
macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati
disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da
destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione
dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di
SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave
rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati
[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori
hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo
sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa
(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni
Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]
Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo
egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali
sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al
hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina
(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi
familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un
complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data
da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto
47
lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della
stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave
dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita
neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei
neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che
codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a
PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson
familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson
suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente
associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che
Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate
con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente
diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina
egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille
ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno
recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di
alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che
sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina
[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce
lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari
Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-
dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento
tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-
sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da
chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di
mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il
macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD
associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-
48
sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative
caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave
caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di
tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD
lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da
unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina
chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta
(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si
era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero
netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un
gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e
Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave
causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma
17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau
[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine
neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso
portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina
mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da
Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei
modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave
patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-
dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla
settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad
una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di
tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno
dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una
diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di
AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le
49
relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la
degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90
[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al
(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave
stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da
GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β
effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi
GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di
Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe
portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in
strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati
indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone
biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione
di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da
parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi
proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di
queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)
Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie
neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio
approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare
dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la
formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione
potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di
Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare
terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare
malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo
centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90
puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione
50
successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti
neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti
clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto
che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono
tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in
modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni
nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati
promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio
spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in
modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di
Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a
lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse
da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase
esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora
rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori
dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per
mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie
neurodegenerative
51
SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-
ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-
METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE
(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE
MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO
SULLA FRAMMENTAZIONE
Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in
risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta
nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine
regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il
ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai
loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine
client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro
cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire
su molti percorsi oncogenici
Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il
nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che
lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati
composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP
attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del
processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono
emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i
tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule
normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina
(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una
maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto
che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una
piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
45
Figura 8 Le Hsp90 riparano le proteine neuronali aberranti (A) Proteine neuronali
aberranti regolate da Hsp90 (B) Lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90porta allrsquoinattivazione
o degradazione delle proteine regulate da Hsp90 probabilmente attraverso la via del
proteasoma
Le Hsp90 formano un complesso molecolare con mAR per il
mantenimento della sua stabilitagrave funzionale Sia in modelli cellulari di
SBMA che in topi transgenici lrsquoinibizione di Hsp90 da parte di 17-
AAG il derivato 17 allilammino-17-demetossi della geldanamicina ha
46
portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal
macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati
disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da
destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione
dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di
SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave
rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati
[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori
hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo
sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa
(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni
Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]
Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo
egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali
sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al
hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina
(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi
familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un
complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data
da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto
47
lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della
stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave
dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita
neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei
neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che
codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a
PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson
familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson
suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente
associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che
Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate
con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente
diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina
egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille
ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno
recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di
alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che
sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina
[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce
lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari
Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-
dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento
tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-
sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da
chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di
mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il
macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD
associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-
48
sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative
caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave
caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di
tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD
lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da
unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina
chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta
(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si
era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero
netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un
gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e
Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave
causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma
17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau
[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine
neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso
portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina
mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da
Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei
modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave
patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-
dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla
settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad
una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di
tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno
dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una
diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di
AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le
49
relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la
degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90
[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al
(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave
stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da
GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β
effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi
GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di
Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe
portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in
strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati
indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone
biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione
di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da
parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi
proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di
queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)
Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie
neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio
approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare
dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la
formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione
potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di
Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare
terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare
malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo
centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90
puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione
50
successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti
neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti
clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto
che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono
tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in
modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni
nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati
promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio
spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in
modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di
Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a
lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse
da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase
esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora
rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori
dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per
mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie
neurodegenerative
51
SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-
ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-
METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE
(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE
MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO
SULLA FRAMMENTAZIONE
Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in
risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta
nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine
regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il
ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai
loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine
client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro
cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire
su molti percorsi oncogenici
Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il
nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che
lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati
composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP
attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del
processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono
emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i
tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule
normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina
(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una
maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto
che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una
piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
46
portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal
macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati
disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da
destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione
dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di
SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave
rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati
[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori
hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo
sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa
(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni
Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]
Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo
egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali
sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al
hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina
(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi
familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un
complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data
da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto
47
lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della
stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave
dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita
neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei
neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che
codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a
PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson
familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson
suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente
associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che
Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate
con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente
diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina
egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille
ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno
recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di
alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che
sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina
[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce
lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari
Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-
dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento
tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-
sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da
chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di
mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il
macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD
associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-
48
sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative
caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave
caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di
tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD
lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da
unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina
chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta
(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si
era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero
netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un
gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e
Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave
causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma
17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau
[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine
neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso
portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina
mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da
Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei
modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave
patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-
dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla
settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad
una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di
tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno
dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una
diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di
AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le
49
relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la
degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90
[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al
(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave
stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da
GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β
effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi
GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di
Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe
portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in
strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati
indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone
biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione
di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da
parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi
proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di
queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)
Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie
neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio
approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare
dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la
formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione
potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di
Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare
terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare
malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo
centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90
puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione
50
successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti
neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti
clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto
che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono
tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in
modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni
nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati
promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio
spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in
modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di
Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a
lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse
da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase
esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora
rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori
dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per
mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie
neurodegenerative
51
SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-
ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-
METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE
(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE
MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO
SULLA FRAMMENTAZIONE
Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in
risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta
nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine
regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il
ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai
loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine
client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro
cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire
su molti percorsi oncogenici
Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il
nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che
lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati
composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP
attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del
processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono
emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i
tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule
normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina
(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una
maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto
che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una
piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
47
lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della
stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave
dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita
neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei
neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che
codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a
PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson
familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson
suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente
associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che
Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate
con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente
diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina
egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille
ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno
recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di
alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che
sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina
[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce
lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari
Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-
dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento
tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-
sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da
chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di
mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il
macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD
associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-
48
sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative
caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave
caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di
tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD
lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da
unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina
chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta
(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si
era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero
netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un
gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e
Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave
causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma
17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau
[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine
neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso
portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina
mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da
Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei
modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave
patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-
dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla
settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad
una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di
tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno
dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una
diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di
AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le
49
relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la
degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90
[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al
(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave
stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da
GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β
effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi
GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di
Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe
portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in
strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati
indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone
biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione
di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da
parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi
proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di
queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)
Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie
neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio
approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare
dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la
formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione
potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di
Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare
terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare
malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo
centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90
puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione
50
successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti
neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti
clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto
che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono
tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in
modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni
nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati
promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio
spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in
modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di
Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a
lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse
da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase
esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora
rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori
dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per
mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie
neurodegenerative
51
SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-
ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-
METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE
(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE
MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO
SULLA FRAMMENTAZIONE
Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in
risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta
nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine
regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il
ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai
loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine
client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro
cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire
su molti percorsi oncogenici
Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il
nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che
lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati
composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP
attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del
processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono
emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i
tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule
normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina
(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una
maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto
che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una
piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
48
sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative
caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave
caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di
tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD
lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da
unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina
chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta
(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si
era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero
netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un
gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e
Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave
causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma
17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau
[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine
neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso
portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina
mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da
Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei
modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave
patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-
dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla
settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad
una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di
tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno
dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una
diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di
AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le
49
relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la
degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90
[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al
(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave
stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da
GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β
effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi
GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di
Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe
portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in
strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati
indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone
biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione
di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da
parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi
proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di
queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)
Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie
neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio
approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare
dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la
formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione
potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di
Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare
terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare
malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo
centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90
puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione
50
successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti
neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti
clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto
che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono
tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in
modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni
nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati
promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio
spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in
modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di
Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a
lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse
da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase
esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora
rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori
dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per
mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie
neurodegenerative
51
SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-
ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-
METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE
(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE
MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO
SULLA FRAMMENTAZIONE
Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in
risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta
nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine
regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il
ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai
loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine
client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro
cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire
su molti percorsi oncogenici
Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il
nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che
lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati
composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP
attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del
processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono
emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i
tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule
normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina
(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una
maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto
che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una
piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
49
relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la
degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90
[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al
(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave
stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da
GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β
effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi
GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di
Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe
portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in
strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati
indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone
biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione
di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da
parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi
proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di
queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)
Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie
neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio
approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare
dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la
formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione
potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di
Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare
terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare
malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo
centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90
puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione
50
successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti
neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti
clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto
che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono
tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in
modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni
nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati
promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio
spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in
modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di
Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a
lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse
da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase
esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora
rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori
dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per
mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie
neurodegenerative
51
SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-
ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-
METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE
(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE
MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO
SULLA FRAMMENTAZIONE
Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in
risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta
nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine
regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il
ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai
loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine
client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro
cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire
su molti percorsi oncogenici
Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il
nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che
lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati
composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP
attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del
processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono
emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i
tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule
normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina
(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una
maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto
che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una
piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
50
successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti
neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti
clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto
che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono
tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in
modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni
nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati
promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio
spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in
modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di
Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a
lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse
da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase
esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora
rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori
dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per
mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie
neurodegenerative
51
SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-
ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-
METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE
(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE
MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO
SULLA FRAMMENTAZIONE
Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in
risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta
nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine
regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il
ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai
loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine
client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro
cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire
su molti percorsi oncogenici
Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il
nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che
lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati
composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP
attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del
processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono
emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i
tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule
normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina
(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una
maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto
che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una
piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
51
SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-
ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-
METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE
(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE
MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO
SULLA FRAMMENTAZIONE
Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in
risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta
nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine
regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il
ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai
loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine
client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro
cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire
su molti percorsi oncogenici
Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il
nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che
lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati
composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP
attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del
processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono
emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i
tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule
normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina
(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una
maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto
che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una
piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
52
normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori
xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato
dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la
proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave
suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la
degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la
potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di
composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi
composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug
design basato sulla struttura [95]
OH
HO
NO
1
In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave
stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della
struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente
del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-
diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo
Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di
ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti
del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
53
modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide
Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le
Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo
approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della
molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione
La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico
ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata
clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di
potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo
OH
HO
NO
R
2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)
OH
HO
NO
OR
( ) n
3 n=1 R = NMe 2
Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati
ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase
preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa
fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose
umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave
formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato
selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente
affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-
asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
54
Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di
Hsp90
Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti
di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica
statisticamente significativa in modelli anticancro di topo
OH
HO
NO
X N N
4 X = CH2
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
55
Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di
citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2
2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le
proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta
solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati
gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile
alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il
composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo
sviluppo clinico
INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL
NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE
INIBITORI DELLrsquoHsp90
Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una
delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone
ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la
stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine
[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come
sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2
AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono
associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave
emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici
contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente
revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono
ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di
Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
56
geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP
nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]
Radicicol
La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della
geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e
in soluzione con spettroscopia NMR [102]
Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii
piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta
associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di
chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103
abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha
una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di
prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei
quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in
vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo
e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe
avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi
biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una
nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso
il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
57
Triazol-ciclopropanradicicol NP261
Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol
legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito
(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave
biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi
macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse
Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito
Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un
importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della
proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di
Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
58
simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso
(Figura 11)
Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito
In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione
ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono
lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale
di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83
lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena
principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)
Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento
dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-
amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente
minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce
che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo
studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e
per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di
eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
59
catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli
inibitori
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
60
BIBLIOGRAFIA
1) Ashraf A Khalil Nihal F Kabapy Sahar F Deraz Christopher Smith
Biochimica et Biophysica Acta 1816 2011 89ndash104
2) MJ Schlesinger M Ashburner A Tissiers Heat Shock Proteins
From Bacteria to Man Cold Spring Harbor Laboratory Press New
York 1982
3) DJ Kuhn EL Zeger RZ Orlowski Proteosome inhibitors and
modulators of heat shock protein function Update Cancer Ther 1
2006 91ndash116
4) a S Lindquist EA Craig The heat-shock proteins Annu Rev Genet
22 1998 631ndash677 b JJ Cotto RI Morimoto Stress-induced
activation of the heat-shock response cell and molecular biology of
heat-shock factors Biochem Soc Symp 64 1999 105ndash118 c T
Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role
in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346
5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human
cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226
6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G
Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on
intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem
14 2007 2839ndash2847
7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins
repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27
8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in
vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607
9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature
division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47
10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of
heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by
methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775
11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K
Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock
protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism
for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
61
12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson
CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of
substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555
13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y
Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201
14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the
roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in
eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751
15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular
Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006
Elsevier Inc
16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton
Structural and functional link between the mitochondrial network and
the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27
17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early
secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802
18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 1975 189347-358
19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and
stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65
20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein
response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789
21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456
22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno
K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-
sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456
23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P
On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic
reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784
24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of
endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010
14719-25
25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential
checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165
41ndash52
26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient
restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash
1963
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
62
27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P
Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the
calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa
N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally
misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299
1394ndash1397
28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed
bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719
29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu
Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is
UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31
24ndash25
30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner
S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and
risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810
31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL
Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein
particles Nature 2005 437 257ndash261
32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the
ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001
292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and
Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by
nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body
formation Mol Cell 2005 17 351ndash365
33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg
AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences
and release them during degradation of polyglutamine-containing
proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104
34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M
Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms
protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect
on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614
35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of
interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005
20 513ndash524
36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in
the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular
chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling
J Mol Biol 1999 286 915ndash932
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
63
37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70
chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367
38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC
Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation
of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate
mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash
379
39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated
activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101
40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast
Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and
Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese
V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different
cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol
Chem 2005 280 41252ndash41261
41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow
T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-
associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs
Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767
42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y
Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the
ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative
peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208
43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The
Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-
protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504
44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P
Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones
MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated
complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069
45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human
Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are
ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034
46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM
Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I
et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly
machines Cell 2004 119 9ndash18
47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A
ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
64
unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash
637
48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich
AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein
binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041
49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT
Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase
allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027
50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela
Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524
51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy
to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004
17299-306
52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System
Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158
53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by
molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22
54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F
Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in
neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against
disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W
Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to
Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7
55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and
developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88
56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of
heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90
complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998
94471-480
57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein
misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528
58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK
Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of
polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci
USA 2000 977841-7846
59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies
with the length of the polyglutamine expansion and the expression of
chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
65
60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q
Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ
Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar
aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009
299104-9114
61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT
Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered
subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1
Nat Genet 1998 19148-154
62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F
Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins
alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl
Acad Sci USA 2005 1021606-1680
63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras
GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau
protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-
726
64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90
inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol
Chem 2006 28133182-33191
65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J
Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90
inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med
Chem Lett 2007 171984-1990
66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS
Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs
interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and
influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864
67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors
induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with
Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810
68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM
Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila
model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868
69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat
shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of
Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100
70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H
Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
66
formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006
364323-336
71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between
Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril
assembly Biochemistry 2008 4712614-1225
72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre
J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in
maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in
tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516
73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J
Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity
HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades
phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658
74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson
disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186
75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin
induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced
dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-
39969
76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F
Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates
polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005
111088-1095
77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T
Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress
polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of
multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197
78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman
AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent
trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the
expanded glutamine androgen receptor without stress protein
induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883
79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S
Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37
chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner
Neurosci Res 2008 6143-48
80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular
chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of
the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009
28431190-31199
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
67
81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction
between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the
lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem
2008 28323731-23738
82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative
foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46
83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein
phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr
Top Med Chem 2002 4395-415
84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies
Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250
85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of
the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60
86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding
of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation
of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325
87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small
molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin
Pharmacol 2008 8370-374
88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle
JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R
Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW
OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM
Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem
2010 Aug 2653(16)5956-69
89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H
Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical
trials J Med Chem 2010 53 3ndash17
90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90
molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash
294
91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the
explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284
92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz
L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers
tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410
93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L
Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S
Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
68
new class of geldanamycin derivatives as potent inhibitors of Hsp90 J
Med Chem 2004 47 3865ndash3873
94) a Soga S Shiotsu Y Akinaga S Sharma S V Development of
radicicol analogues Curr Cancer Drug Targets 2003 3 359ndash369 b
Neckers L Schulte T W Mimnaugh E Geldanamycin as a
potential anti-cancer agent its molecular target and biochemical
activity Invest New Drugs 1999 17 361ndash373 c Ge J Normant E
Porter J R Ali J A Dembski M S Gao Y Georges A T
Grenier L Pak R H Patterson J Sydor J R Tibbitts T T
Tong J K Adams J Palombella V J Design synthesis and
biological evaluation of hydroquinone derivatives of 17-amino-17-
demethoxygeldanamycin as potent watersoluble inhibitors of Hsp90
J Med Chem 2006 49 4606ndash4615 d Kaur G Belotti D Burger
A M Fisher-Nielson K Borsotti P Riccardi E Thillainathan J
Hollingshead M Sausville E A Giavazzi R Antiangiogenic
properties of 17-(dimethylaminoethylamino)- 17-
demethoxygeldanamycin an orally bioavailable heat shock protein 90
modulator Clin Cancer Res 2004 10 4813ndash4821 e Schulte T W
Neckers L M The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-
demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important
biologic activities with geldanamycin Cancer Chemother Pharmacol
1998 42 273ndash279
95) a Brough P A Barril X Borgognoni J Chene P et All
Combining hit identification strategies fragment-based and in silico
approaches to orally active 2-aminothieno[23-d]pyrimidine inhibitors
of the Hsp90 molecular chaperone J Med Chem 2009 52 4794ndash
4809 b Eccles S A Massey A Raynaud F I Sharp S Y et
All NVP-AUY922 a novel heat shock protein 90 inhibitor active
against xenograft tumor growth angiogenesis and metastasis Cancer
Res 2008 68 2850ndash2860 c Brough P A Aherne W Barril X
Borgognoni J et All 45-Diarylisoxazole Hsp90 chaperone
inhibitors potential therapeutic agents for the treatment of cancer J
Med Chem 2008 51 196ndash218 d Bao R Lai C J Qu H Wang
D et All CUDC-305 a novel synthetic HSP90 inhibitor with unique
pharmacologic properties for cancer therapy Clin Cancer Res 2009
15 4046ndash4057 e Huang K H Veal J M Fadden R P Rice J
W et All Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat
shock protein 90 as potent selective and orally active antitumor agents
J Med Chem 2009 52 4288ndash4305 f Lundgren K Zhang H
Brekken J Huser N et All BIIB021 an orally available fully
synthetic small-molecule inhibitor of the heat shock protein Hsp90
Mol Cancer Ther 2009 8 921ndash929
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
69
96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S
Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham
B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R
Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based
drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with
high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d
97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne
Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J
2010 16 2758 ndash 2763
98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439
99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149
100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper
L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K
Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H
Pearl Nature 2006 440 1013
101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L
H Pearl J Med Chem 1999 42 260
102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler
ChemBioChem 2003 4 870
103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M
Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky
R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett
Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel
D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123
10903
104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T
Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445
105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G
Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318
Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D
Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc
2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett
2004 1325
106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
70
RINGRAZIAMENTI
Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e
lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia
relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi
nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo
anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora
Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di
svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui
Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e
compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei
potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole
superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola
indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele
Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel
quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe
onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria
Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso
lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria
Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un
ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di
difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei
amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la
lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry
Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave
71
hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia
senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove
sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi
e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente
inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui
studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente
nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento
piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare
stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire
riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose
piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel
dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi
rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico
ciao Papagrave