UNIVERSIDADE TÉCNICA DE LISBOA INSTITUTO SUPERIOR TÉCNICO UNIVERSIDADE DE...

UNIVERSIDADE TÉCNICA DE LISBOA INSTITUTO SUPERIOR TÉCNICO

UNIVERSIDADE DE LISBOA FACULDADE DE FARMÁCIA

Técnicas de calibração espectroscópica baseadas na estimativa do

ruído espectral e do sinal de resposta aplicadas a espectros de

infravermelhos médios (MIR) de amostras de culturas de células

estaminais.

Nicolau Farias Dehanov

(Licenciado)

Dissertação para a Obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Farmacêutica

2011

Técnicas de calibração espectroscópica baseadas na estimativa do ruído espectral e do sinal de resposta

1

Ao meu Filho Nicolau

À minha Esposa Sara.


2

Agradecimentos

Esta tese é o resultado do meu trabalho de investigação que desenvolvi no Mestrado em

Engenharia Farmacêutica no Instituto Superior Técnico e na Faculdade de Farmácia de Lisboa,

entre 2009 e 2011. A minha primeira palavra é para o meu orientador, o Professor José Cardoso

Menezes, que cedo me despertou o interesse pelas áreas inovadoras de PAT; QbD e

Quimiometria. Com o seu espírito sempre dinâmico, desafiante e os seus sábios conselhos, tem-

me dado o privilégio de trabalharmos em conjunto, sendo sempre fonte de encorajamento e de

abertura a novos horizontes. Devo-lhe ainda a imensa hospitalidade com que me recebeu no

BSEL, e que me permitiu beneficiar das valiosas sugestões e comentários do Duarte Sousa Rego.

Agradeço ainda à Ana Fernandes ( BERG - IBB – IST) a sua disponibilidade em me auxiliar

laboratorialmente.

Uma última palavra para a minha família que sempre me apoiou em todos os momentos.


3

Resumo

A presente tese tem o intuito de demonstrar que as substâncias presentes em

sistemas dinâmicos, como as culturas de células estaminais, podem ser identificadas e

quantificadas, utilizando equipamentos MIR-ATR como um meio primário. Usando

técnicas de calibração espectroscópica baseadas em estimativa do ruído espectral e do

sinal de resposta (método SBC), pretende-se identificar padrões únicos característicos do

processo de cultura de células estaminais. Através do uso de espectros MIR-ATR de

baixa resolução e da aplicação destas técnicas, ilustra-se a aplicação de um novo conceito

de calibração que conduz a modelos de calibração, cujas capacidades de previsão são

semelhantes aos modelos produzidos por meio de algoritmos mais usuais, como a

projecção em estruturas latentes (PLS) ou a regressão de componentes principais (PCR).

A construção destes modelos depende, para além destas estimativas, da

caracterização das condições iniciais e finais de um processo típico que tenha decorrido

de acordo com o esperado, dado que as primeiras condicionam o seu desenrolar e as

segundas mostram que o processo teve o comportamento expectável. Os modelos

produzidos, segundo a aplicação deste conceito, são robustos, transparentes para o

utilizador e a sua realização não implica um desenho de experiências complexo, apenas o

estabelecimento das condições referidas. Para que esta técnica seja melhor implementada

devem ser utilizados mais do que um processo típico para que as previsões dos modelos

conjuntos destes processos sejam mais robustas. A técnica beneficiaria também do uso de

equipamentos MIR de alta resolução.


4

Índice

Agradecimentos ................................................................................................................................ 2

Resumo ............................................................................................................................................. 3

Índice ................................................................................................................................................ 4

Lista de símbolos e abreviaturas ...................................................................................................... 6

Índice de Tabelas .............................................................................................................................. 7

Índice de Ilustrações ......................................................................................................................... 8

1. Introdução ................................................................................................................................... 10

1.1 Esboço da tese ...................................................................................................................... 10

1.2 Motivação ............................................................................................................................. 11

1.3 Objectivos ............................................................................................................................ 11

2. Revisão bibliográfica.................................................................................................................. 12

2.1 Espectroscopia Vibracional .................................................................................................. 12

2.1.1 O sistema ATR .............................................................................................................. 14

2.2 Pré-tratamento dos dados ..................................................................................................... 18

2.2.1 Filtro Savitzky–Golay ................................................................................................... 19

2.2.3 A primeira derivada ....................................................................................................... 21

2.3 Filtro de Wiener ................................................................................................................... 24

2.4 Figuras de mérito dos Modelos ............................................................................................ 26

2.5 O Método SBC ..................................................................................................................... 28

2.5.1Teoria base do Método SBC: ......................................................................................... 29

2.6.1 Selectividade e Sensibilidade ........................................................................................ 30

2.6.2 Aplicação na prática ...................................................................................................... 31

2.7 Células estaminais ................................................................................................................ 32

2.7.1 Sistemas de cultura de células animais .......................................................................... 33

2.7.2 Monitorização de metabolitos através da Espectroscopia de infravermelhos. .............. 33

3. Método SBC aplicado à cultura de células estaminais ............................................................... 35

3.1 Materiais e Métodos ............................................................................................................. 35

3.1.1 Métodos de análise dos espectros .................................................................................. 37

3.2 Resultados e Discussão ........................................................................................................ 41

3.2.1 Fingerprinting ................................................................................................................ 41

3.2.2 Análise dos modelos de Calibração............................................................................... 43

4. Conclusões ................................................................................................................................. 49


5

5. Perspectivas e trabalho futuro .................................................................................................... 50

Bibliografia ..................................................................................................................................... 51

ANEXO I ....................................................................................................................................... 54

ANEXO II ...................................................................................................................................... 55

ANEXO III ..................................................................................................................................... 56

ANEXO IV ..................................................................................................................................... 57


6

Lista de símbolos e abreviaturas

ATR – Reflexão Total Atenuada

DoE – Desenho de Experiências (ensaios de teste) (Design of Experiments)

ERI – Elemento de Reflexão Interna

IV – Infravermelhos

MIR – Infravermelhos Médios

MSC – Correcção da Dispersão Média (da luz) (Mean Scatter Correction)

NIR – Infravermelhos Próximos

PAT – Tecnologia Analítica de Processos (Process Analitical Technology)

PCR – Regressão de Componentes Principais.

PLS – Projecção em Estruturas Latentes (Projection into Latent Structures)

QbD – Qualidade obtida através da concepção (de processos) (Quality by Design)

r2 – Factor de Determinação

RMSEP – Raiz Quadrada do Erro Médio de Previsão

SBC – Método de calibração baseado na perícia e na experiência do investigador em estimar o ruído, e o sinal de resposta de um analito de interesse (Science based)


7

Índice de Tabelas

Tabela 1 - Tabela de diluição de metabolitos ................................................................................ 36

Tabela 2 – Zonas de Finguerprint para as monitorizações realizadas com o primeiro equipamento

MIR - ATR ..................................................................................................................................... 41

Tabela 3 – Zonas de Finguerprint para as monitorizações realizadas com o segundo equipamento

MIR - ATR ..................................................................................................................................... 41

Tabela 4 – Comparação entre as rectas dos modelos dos diferentes metabolitos em relação às duas

expansões celulares (primeiro equipamento) ................................................................................. 44

Tabela 5 – Relação entre os declives das rectas dos modelos de calibração antes de serem

ajustados ......................................................................................................................................... 45

Tabela 6 – Resumo dos modelos de calibração .............................................................................. 48

Tabela 7 – Zonas de Finguerprint para os metabolitos dissolvidos em àgua – medições realizadas

com o segundo equipamento MIR - ATR ...................................................................................... 56


8

Índice de Ilustrações

Ilustração 1 ‐ Esquema representativo da estrutura da tese. ........................................................... 10

Ilustração 2 – Tipos de Reflexão .................................................................................................... 14

Ilustração 3 – Secção do cristal ERI que mostra penetração da radiação na amostra e o percurso

da onda evanescente ....................................................................................................................... 16

Ilustração 4 – Equipamento Portátil MIR-ATR (VFA Spectrometer, Wilks Enterprise, South

Norwalk, USA). ............................................................................................................................. 16

Ilustração 5 - Forma de actuação do filtro Savitsky-Golay; A - filtro Savitsky-Golay com uma

janela 2m+1=5, e 2m+1=7; Representação do gráfico depois da actuação do filtro Savitsky-Golay

com uma janela 2m+1=5. ............................................................................................................... 20

Ilustração 6 – Gráfico que ilustra o comportamento da primeira derivada .................................... 21

Ilustração 7 - Gráfico que ilustra o comportamento da segunda derivada ..................................... 22

Ilustração 8 – Gráfico de um espectro contendo um declive (em baixo); Gráfico da segunda

derivada do espectro em que o declive foi eliminado (segunda derivada calculada com um filtro

Savitsky-Golay, polinómio de segunda ordem e uma janela de cinco pontos) .............................. 23

Ilustração 9 – Actuação do filtro de Wiener sobre o sinal. ............................................................ 24

Ilustração 10 – Os gráficos mostram os tipos de espectros com formas diferentes de ruído. a) O

sinal e o ruído espectral não se sobrepõem; b) O sinal e o ruído sobrepõem-se, e o ruído pode ser

reduzido mas não pode ser completamente eliminado ................................................................... 26

Ilustração 11 – Resultados do modelo de calibração para a Glucose referente às expansões

monitorizadas pelo primeiro equipamento MIR-ATR. .................................................................. 43

Ilustração 12 – Resultados do modelo de calibração para o Ác. Láctico referente às expansões


Ilustração 13 – Resultados do modelo de calibração para a Glutamina referente às expansões


Ilustração 14 – Resultados dos modelos de calibrações referentes à expansão monitorizada pelo

segundo equipamento MIR-ATR. .................................................................................................. 46

Ilustração 15 – Resultados dos modelos de calibrações referentes ao número de células da

expansão monitorizada pelo segundo equipamento MIR-ATR. .................................................... 47


9

Ilustração 16 – Comparação entre os perfis dos metabolitos das duas expansões de células

estaminais monitorizadas com o primeiro equipamento MIR-ATR. ............................................. 54

Ilustração 17 - Caracterização das expansões de monitorizadas pelo segundo equipamento MIR-

ATR. ............................................................................................................................................... 55

Ilustração 18 – Gráfico de uma correlação espúria que ocorre com o passar do tempo no segundo

equipamento MIR-ATR. ................................................................................................................ 57


10

1. Introdução

1.1 Esboço da tese

O presente estudo encontra-se dividido em duas partes. A primeira parte é constituída

por dois capítulos e, no primeiro, introduz-se o seu problema orientador: o problema do

controlo de sistemas dinâmicos, tal como sucede com a cultura de células estaminais. De

seguida, apresentam-se os objectivos deste estudo, justificando-se simultaneamente a

motivação que lhes preside. Finalmente, o segundo capítulo assenta numa revisão

bibliográfica necessária ao enquadramento do problema do controlo das culturas de

células estaminais e das técnicas utilizadas na presente investigação.

A segunda parte é composta pelos terceiro, quarto e quinto capítulos. No terceiro

descreve-se o trabalho experimental, as técnicas utilizadas para a análise de espectros e os

métodos utilizados para a construção de calibrações. Apresentam-se e discutem-se ainda

os resultados obtidos. Nos dois últimos capítulos apresentam-se, respectivamente, as

conclusões deste estudo e as perspectivas de trabalho futuro.

Ilustração 1 ‐ Esquema representativo da estrutura da tese.

Análise dos modelos de Calibração

Espectroscopia Vibracional

Pré tratamento dos dados

O filtro de Wiener

Parâmetros de mérito dos Modelos de calibração

O Método SBC

Células estaminais

Esboço da tese

Motivação

Objectivos

Métodos de análise dos espectros

"Fingerprinting" Materiais e Métodos

Resultados e Discussão

2. Revisão bibliográfica

3. Método SBC aplicado à cultura de células estaminais

4. Conclusões

5. Perspectivas e trabalho futuro

1. Introdução


11

1.2 Motivação

O presente estudo procura uma nova solução conceptual para simplificar o

processo de controlo e monitorização das culturas de células estaminais.

É do conhecimento científico que as células estaminais reservam em si uma

capacidade totipotente, ou seja, de se diferenciarem em outros tipos de células. As células

estaminais subdividem-se em embrionárias e de tecidos adultos. As primeiras podem

diferenciar-se em qualquer tipo de célula, enquanto as segundas podem diferenciar-se em

células típicas dos tecidos a que pertencem. Têm um reconhecido potencial na cura de

doenças degenerativas (como a diabetes (1), Parkinson (2), enfarte de miocárdio (3)) e na

regeneração de tecidos (4).

Na investigação farmacêutica, a produção em larga escala deste tipo de células

exige uma monitorização e um controlo muito apertados dos parâmetros da sua cultura

(pH, nutrientes e outros metabolitos). A capacidade de monitorização destas varáveis nas

culturas celulares é fundamental para a generalização da sua produção.

O novo conceito proposto neste estudo – estimação da resposta espectroscópica

dos analitos e do erro espectroscópico associado – procura ser um contributo para o uso

mais facilitado das células estaminais, dado ser mais rápido e não invasivo. Estas

vantagens poderão também tornar o processo mais económico, pois a informação contida

nos espectros permite monitorizar vários aspectos, o que elimina a necessidade de uso

sensores individuais e que encarecem o processo. Pretende-se, deste modo, contribuir

para o uso mais generalizado e facilitado destas células nas suas mais diferentes

aplicações.

1.3 Objectivos

Este estudo pretende mostrar como o Método SBC permite que equipamentos

MIR-ATR sejam usados como um meio primário de identificação e de quantificação de

substâncias em sistemas líquidos e dinâmicos, como uma cultura de células estaminais.

A partir do Método SBC, pretende-se criar uma forma de reconhecer padrões

únicos que indiquem a presença de analitos de interesse (figuerprinting) obtidos

directamente pela aquisição de espectros das amostras de processo (processo físico), de


12

modo a que este conjunto de técnicas seja aplicável in situ, e/ou online para análise e

obtenção de calibrações multivariadas.

É também objectivo deste estudo demonstrar conceptualmente que este conjunto

de técnicas é um bom contributo para delinear técnicas de Quality by Design (QbD) e de

Tecnologia Analítica de Processos (PAT) para processos dinâmicos que assentam em

sistemas líquidos.

2. Revisão bibliográfica

2.1 Espectroscopia Vibracional

Os avanços que se verificaram, até ao momento, nos equipamentos

(Infravermelhos (IV) e Raman) e nas aplicações de técnicas de espectroscopia vibracional

tornam-nos actuais, não só para sistemas de moléculas relativamente pequenas, como

para sistemas complexos, como os biológicos. Tem sido demonstrado que espectros de

IV e Raman de materiais biológicos codificam a informação suficiente para distinguir

diferentes tipos de células, estruturas de tecidos e fluidos biológicos e, até mesmo, para

detectar mudanças induzidas por processos patológicos. (5)

A Espectroscopia de infravermelho e Raman, embora diferentes em design

experimental e fundo físico, dão informações complementares sobre as vibrações

moleculares e deveriam ser idealmente utilizadas em conjunto para alcançar o acesso à

totalidade de todos os modos de vibração de uma dada molécula. (5) A Espectroscopia

vibracional assenta na excitação óptica coerente de um conjunto de moléculas por um

curto pulso de luz e no estudo da dinâmica do seu movimento de vibração colectiva. (6)

Os espectros que obtemos fornecem "impressões digitais espectroscópicas" da

composição química e bioquímica do material em estudo. Esta situação deve-se ao facto

de haver uma sobreposição de regiões características de absorção de radiação

(Infravermelhos ou sinais Raman) de todos os constituintes da amostra. Estes

constituintes são observados simultaneamente, originando assim alterações espectrais

características da amostra que codificam uma grande quantidade de informações

potencialmente úteis para biodiagnósticos. (5)

As mudanças na química das amostras de materiais biológicos induzem alterações

espectroscópicas, o que torna as técnicas de espectroscopia vibracional ideais para a

detecção sensível de alterações e passíveis de serem usadas como técnicas de diagnóstico.


13

É previsível que estas mudanças sejam detectáveis também antes da manifestação

morfológica e sistémica de doenças, permitindo o diagnóstico clínico por métodos

convencionais. Isto sucede, porque a preparação da amostra e a medição são muito

simples e os tempos de colecta são de segundos ou minutos.

As técnicas de espectroscopia vibracional IV e Raman são também ideais para

criar ferramentas muito expedictas, de uso directo e com uma boa relação custo - eficácia

para o diagnóstico precoce de processos de doença nos indivíduos. A perspectiva de

realização de alguns destes ensaios com recurso à espectroscopia de infravermelho é

atraente por várias razões. As análises são feitas sem o uso de reagentes, os métodos são

sempre lineares em toda a gama de concentrações fisiológicas, várias análises estão

disponíveis simultaneamente a partir de um único espectro e as amostras utilizadas são

muito pequenas. (5)

Uma peculiaridade da espectroscopia vibracional consiste no facto de fornecer

informações não só sobre a composição complexa do material biológico, mas também

sobre os estados estruturais das moléculas em estudo, uma vez que certas bandas são

sensíveis, por exemplo, à estrutura secundária de proteínas, enquanto outras informam

sobre o estado das membranas ou a conformação das estruturas dos ácidos nucleicos.

Neste sentido, o conteúdo total de informação nos espectros vibracionais de materiais

biológicos é muito elevado. (5)

Esta definição qualifica a espectroscopia vibracional como um conjunto de

técnicas de análise exploratórias e rápidas, por excelência, o que pode ser usado para

diagnosticar doenças ou disfunções, através de biomarcadores, dado a mudança espectral

ser indicadora da presença de uma doença particular ou de uma resposta à acção de

drogas, stress ambiental ou modificação genética (5)

A natureza das informações obtidas em espectroscopia vibracional é melhor

representada pela noção de "impressões digitais espectrais" (padrões únicos). A análise

exclusiva de algumas bandas, avaliando apenas as intensidades, as frequências, ou os

comprimentos de onda dos seus picos, falhará na maioria dos casos, dada a sobreposição

dos sinais. Além disso, tendo em conta que milhares de espectros são analisados num

determinado momento, a disponibilidade de dados requer conceitos de avaliação que

deverão incluir algoritmos eficientes de pré-tratamento de dados, tais como testes de

qualidade, normalização, filtragem estatística adequada e técnicas multivariadas para

atingir redução de dados e, finalmente, a classificação de padrões. (5)


14

2.1.1 O sistema ATR

Actualmente, a técnica de reflectância total atenuada (ATR) é uma das mais

utilizadas de análise de amostras. Embora não se limitando a espectroscopia de

infravermelho, a técnica ATR tem grande impacto neste ramo da espectroscopia, pois

permite superar muitos dos problemas do manuseio da amostra que têm restringido

tradicionalmente a utilidade dos métodos de análise de IV (7). Actualmente associada a

esta técnica está a introdução de melhoramentos, como os espectrómetros FT-IV, que têm

uma relação sinal-ruído alta, o que permite obter uma melhor "impressão digital

espectral" a partir de espectros ATR. (8)

Teoria base da Técnica ATR

A espectroscopia ATR procura a obtenção do espectro da camada de superfície de

uma amostra colocada em contacto íntimo com a superfície de um material transparente,

tendo este um índice de refracção significativamente maior do que a amostra. A luz é

reflectida quando viaja num meio transparente (não absorvente) e de alto índice de

refracção para o conjunto de comprimentos de onda utilizados e atinge uma interface

entre este meio e um outro meio transparente (amostra) de menor índice de refracção. Isto

ocorre porque a maioria dos materiais orgânicos tem um índice de refracção baixo. Esta

radiação, que incide na amostra, é parcialmente transmitida e parcialmente reflectida. No

entanto, e acima do ângulo de incidência, denominado ângulo crítico, nenhuma da

radiação é transmitida para o segundo meio e ocorre a reflexão total interna. (7) (8) (9)

Ilustração 2 – Tipos de Reflexão


15

Na espetroscopia ATR, o material de alto índice de refracção é normalmente

chamado de elemento de reflexão interna (ERI), e é tipicamente escolhido porque é

transparente à radiação IV e tem um índice de refracção de, pelo menos, 2,4. A maioria

dos materiais orgânicos tem um índice de refracção de aproximadamente 1,5, de modo

que, se o ângulo de incidência for inferior a 45º, a radiação é totalmente reflectida de

volta para o ERI. Como consequência, nesta fronteira, o meio com menor índice de

refracção não absorve nenhuma radiação. Na verdade, no ponto de reflexão, uma onda

reflectida decai exponencialmente (8) (7), pois nesta fronteira parte da radiação penetra

uma curta distância no meio de baixo índice de refracção. Essa onda reflectida é

conhecida como a onda evanescente. A profundidade de penetração é definida como a

distância ( ) entre o limite em que a onda evanescente decaiu para 1/ e a sua

amplitude na superfície (8)

(eq. 1)

A luz reflectida internamente no final sai do ERI e é direccionada para o detector,

onde a sua energia é registada como uma função do comprimento de onda. A onda

evanescente é atenuada pelas características de absorção de qualquer material que está a

uma curta distância ( ) da superfície. Esta distância é normalmente cerca de um décimo

do comprimento de onda do espectro de absorção IV e pode ser medida. Devemos ter em

conta que a distância não seja tão curta, que não toque na amostra embora esta deva estar

em contacto íntimo com o ERI (8) (7). Nestas condições, a onda evanescente é

estabelecida e a sua amplitude decai exponencialmente com a distância a partir da

interface (zona de contacto). (7)

A profundidade de penetração aumenta com o comprimento de onda cada vez

maior. Assim, a menos que este efeito seja matematicamente corrigido, as intensidades

relativas das bandas de um espectro de ATR não serão as mesmas que as de um espectro

de transmissão. As bandas de baixa frequência, no final do espectro, tendem a ser mais

intensas. Pela mesma razão, as bandas largas apresentam uma notável ampliação no lado

dos comprimentos de onda longos e, consequentemente, são deslocadas para

comprimentos de onda mais longos. Além disso, quando o ângulo de incidência é

próximo ao ângulo crítico, agrava-se a distorção espectral que pode ocorrer, no entanto,

essas distorções podem ser evitadas, empregando ângulos de incidência maiores que o

ângulo crítico. (7)


16

Ilustração 3 – Secção do cristal ERI que mostra penetração da radiação na amostra e o percurso da onda evanescente

A amostra a ser analisada é então colocada em contacto com o ERI, e a medição é

repetida. Porque a onda evanescente penetra na amostra e interage com as espécies

presentes na amostra que absorvem alguns dos comprimentos de onda, a energia que

atinge o detector é atenuada em comprimentos de onda correspondentes às frequências de

absorção da amostra. Assim, a diferença na quantidade de energia é medida no detector

na ausência e na presença da amostra, em função do comprimento de onda, e assim se

produz o espectro de absorvância da amostra. (7)

A técnica ATR deve a sua utilidade ao decaimento exponencial da amplitude da

onda evanescente com a distância à superfície da ERI. (7)

Ilustração 4 – Equipamento Portátil MIR-ATR (VFA Spectrometer, Wilks Enterprise, South Norwalk, USA).


17

Limitações da técnica ATR.

Na técnica ATR, a curta distância que a radiação percorre na amostra é uma

vantagem importante, na medida em que permite que se adquiram os espectros de IV de

amostras com alta absorção. Mas claramente esta vantagem pode transformar-se numa

desvantagem quando é necessária alta sensibilidade, como na detecção de espécies

presentes em baixa concentração. Nos equipamentos comerciais ATR, o comprimento

máximo do caminho eficaz é obtido por reflexão interna múltipla, sendo da ordem de

50µm a 1000 cm-1, e diminuíndo para 12,5µm a 4000 cm-1, o que se traduz num curto

comprimento do caminho efectivo. Isto implica uma sensibilidade bastante limitada em

comparação com métodos de amostragem de transmissão IV, em que o comprimento do

trajecto é várias ordens de magnitude maior.

A amplitude da onda evanescente decai exponencialmente com a distância à

superfície da ERI; a interacção da onda evanescente com a amostra ocorre apenas a uma

curta distância da superfície desta, que é da ordem da profundidade de penetração e está

na escala do micrométrico. Devido a este facto, deve-se ter em mente que o aumento na

intensidade da banda espectral conseguido através do aumento do comprimento efectivo

do percurso através do uso de múltiplas reflexões internas (figura) não corresponde a

qualquer aumento da profundidade da penetração. Este é um factor que determina que

apenas as espécies presentes ou perto da superfície da ERI façam uma contribuição

significativa para o espectro medido pela técnica ATR. Esta característica impõe uma

série de limitações, particularmente no que respeita a aplicações de análise quantitativa.

(7)

A técnica ATR só nos dá um espectro de IV verdadeiramente representativo da

amostra, se a composição da amostra for homogénea à escala da profundidade de

penetração (ou seja, da ordem de micrómetros). Em segundo lugar, qualquer

contaminação da superfície do ERI pode causar sérios erros de análise, dado que as

espécies na superfície podem ter uma contribuição desproporcional no espectro de IV

obtido pela técnica ATR. A contaminação da superfície pode surgir quando uma amostra

está a ser analisada (ex. deposição de partículas em suspensão, adsorção de determinados

constituintes da mistura ao ERI), fazendo com que o espectro obtido não seja

representativo da totalidade da amostra. (7)

Outra importante limitação da técnica de ATR é a necessidade de um contacto

íntimo entre a amostra e o ERI para se obterem espectros reprodutíveis. Esta necessidade

não é problemática no caso das amostras de fluidos e materiais facilmente maleáveis.


18

Mas obter um bom contacto já é difícil de conseguir com pós e materiais sólidos, cuja

superfície seja áspera ou irregular. Isto implica que, nestes casos, para se obterem

espectros reprodutíveis seja necessário aplicar uma pressão que promova um contacto

igual e aplicada a todas as amostras. Esta limitação, no entanto, foi minorada com uso de

equipamentos ATR que usam diamante, como material ERI. Por causa da dureza do

diamante, podem ser aplicadas altas pressões à superfície do ERI, tornando-se possível

obter um bom contacto com quase qualquer tipo de amostra. Outra vantagem do diamante

consiste no facto de, ao contrário de muitos dos materiais ERI comuns, ser quimicamente

resistente ao ataque de ácidos, bases fortes e agentes oxidantes. (5)

2.2 Pré-tratamento dos dados

Na vida real, os dados são confusos, ruidosos, incompletos, defeituosos ou uma

combinação destes factores. Em qualquer análise de dados, o primeiro passo consiste,

muitas vezes, num pré-processamento para avaliar e possivelmente melhorar a qualidade

dos dados. Alguns problemas podem ser imediatamente reconhecidos, como o ruído de

medição, picos e valores inconsistentes. Nestes casos, tomar as medidas adequadas à sua

resolução não é normalmente um problema. Difíceis são os casos em que não é óbvio

quais as características dos dados que contêm informações. (10)

As medições físico-químicas dos dados, como os espectros, contêm sempre ruído.

Por ruído entende-se as flutuações aleatórias pequenas e rápidas no espectro. Neste tipo

de medição, o primeiro objectivo é gerar dados de alta qualidade, antes de qualquer

análise. A maneira mais simples de reduzir o nível de ruído é realizar um elevado número

de medidas repetidas (espectros) e utilizar a média individual, suavizando assim o

espectro. Mas, neste caso, a altura dos picos é reduzida e estes ficam mais largos. Neste

caso, os filtros Savitsky-Golay são uma escolha popular para a redução do ruído

espectral. (10)

Em algumas formas de espectroscopia pode-se encontrar uma linha de base ou

"sinal de fundo" que está longe de ser zero, uma vez que este influencia medidas como a

altura do pico e a área do pico, o que torna importante este artefacto. A Espectroscopia de

infravermelho, por exemplo, pode levar a efeitos de dispersão, pois a superfície da

amostra influencia a medição. Como resultado, observamos muitas vezes um

deslocamento espectral, ou seja, dois espectros do mesmo material podem mostrar uma


19

diferença constante ao longo do espectro. Isto pode ser facilmente removido, utilizando a

primeira derivada, ou seja, olhamos para as diferenças entre as intensidades de

comprimentos de onda sequenciais, em vez de considerar apenas as intensidades.

Comparando os dados originais com os dados após a utilização da primeira derivada,

vemos que o ruído aumenta. A melhor maneira de obter espectros de primeira derivada é

dada pelo filtro Savitsky-Golay, que suaviza o espectro. Outra forma de remover os

efeitos de dispersão em espectroscopia infravermelha é a correcção da dispersão média da

luz (MSC – Mean Scatter Correction). Esta é uma forma eficaz de modelar o sinal de um

espectro como uma função linear de um espectro de referência. Porém, um espectro de

referência pode não estar disponível, pelo que muitas vezes é usado um espectro médio.

(10)

O pré-processamento de dados é uma arte e, na maioria dos casos, exige um

conhecimento profundo das aplicações envolvidas, pois consiste em executar vários

passos sequencialmente e o número de esquemas possíveis é, por vezes, muito elevado.

Nesta sequência, cada passo influencia o seguinte. Por exemplo, a remoção do ruído pode

tornar mais fácil a correcção da linha de base, mas a presença de uma linha de base

também pode influenciar a estimativa do que é ruído. (10)

Resoluções gerais são difíceis de dar. Porém, alguns problemas são mais graves do

que outros. A presença de mudanças de pico, por exemplo, vai tornar qualquer análise

multivariada difícil de interpretar ou um mau pré-processamento de dados nunca pode ser

compensado na análise subsequente. Daí que se devam inspeccionar sempre os dados

antes e depois do pré-processamento e avaliar se a informação relevante foi mantida

enquanto o ruído foi removido. (10)

2.2.1 Filtro Savitzky–Golay

O filtro Savitsky – Golay (11) é um filtro de suavização baseado na regressão

polinomial. Em vez de usar a técnica da média móvel1, o filtro Savitsky - Golay emprega

a capacidade de ajuste da regressão polinomial para melhorar os resultados da suavização

dos espectros. No entanto, a formulação do filtro Savitsky - Golay é bastante semelhante

à do filtro da média móvel. A principal diferença entre o método da média móvel e o

1 Média móvel – média calculada sobre uma janela com amplitude conhecida que se desloca numa sequência numérica.


20

filtro Savitsky - Golay consite no facto deste último ser essencialmente um método de

média ponderada, na forma de

∑ (eq. 2)

(2m+1=tamanho de janela)

Através da regressão polinomial encontram-se os pesos (wj). O filtro Savitsky - Golay

usa a seguinte fórmula para encaixar os primeiros dados

(eq. 3)

, 1, … , 1, ; 1, … ,

e, em seguida, encontra todos os pesos através do método dos mínimos quadrados, onde

(i) indica a original numeração dos dados e (j) é a variável tamanho da janela. Como

) e (j) são conhecidos, a técnica dos mínimos quadrados pode ser aplicada. (12)

Uma característica do filtro Savitsky - Golay a ter em conta é o facto deste utilizar

unicamente o ponto central da janela móvel para fazer a suavização. Podem também

utilizar-se diferentes tamanhos de janela e polinómios de diferentes ordens para deduzir

os pesos. Neste filtro, à medida que aumenta o tamanho da janela, o efeito de suavização

torna-se mais significativo. No entanto, há a desvantagem da distorção do sinal original

ser maior. Assim, a escolha do tamanho da janela para o filtro Savitsky - Golay é

importante. (12) (13)

Ilustração 5 - Forma de actuação do filtro Savitsky-Golay; A - filtro Savitsky-Golay com uma janela 2m+1=5, e 2m+1=7; Representação do gráfico depois da actuação do filtro Savitsky-Golay com uma janela 2m+1=5.

Ajuste de cinco pontos

Ajuste de sete pontos

Movimento da janela


21

2.2.3 A primeira derivada

As derivadas permitem calcular o declive de qualquer função matemática. Uma

vez que um espectro é uma função matemática, podem ser calculadas derivadas

espectrais. O processo de derivação pode ser aplicado várias vezes aos espectros, e assim

obtemos derivadas de várias ordens. Existem muitos algoritmos usados para calcular as

derivadas; um dos mais usuais é o algoritmo "Savitsky-Golay". (14) (15)

A primeira derivada de uma função mede o declive da tangente à curva do gráfico

nos diferentes pontos. Ao percorremos o gráfico do espectro, os sinais do valor da

derivada variam. Sempre que os valores sobem à medida que caminhamos para o topo de

um pico, o valor da derivada coincide com a inclinação do gráfico, sendo ambos positivos

(Ilustração 6). No topo do pico, existe um máximo ou uma pequena região onde o pico é

plano, a inclinação é zero e o valor da derivada também. Passando o máximo e

"descendo" o pico, a inclinação é negativa, assim como o valor da derivada. Nas partes do

espectro, onde a linha de base é plana ou o espectro mostra uma zona constante, a

derivada é zero.

Estas mudanças na inclinação significam que a derivada de um pico deve ter uma

parte positiva, passar por zero no local do número de onda correspondente ao pico, e de

seguida existir uma parte negativa. Por esta razão, as derivadas são usadas, por vezes,

para localizar as posições de picos nos espectros. (14) (15)

Ilustração 6 – Gráfico que ilustra o comportamento da primeira derivada

Parte positiva

Parte negativa

Número de onda (cm‐1)

Ponto em que a derivada é zero Gráfico da

derivada

Espectro

original


22

O deslocamento da linha de base é um problema real ao medir espectros. A

presença deste artefacto significa que toda a linha de base de um espectro varia um dado

valor de espectro para espectro. A variação nas linhas de base produz variações

indesejadas nas medidas de absorvância. Uma excelente maneira de remover este desvio

da linha de base é utilizar a primeira derivada de um espectro. Este desvio é representado

por um valor constante adicionado a todas as absorvâncias num espectro. Como a

derivada de uma constante é zero, quando se calcula a primeira derivada, este desvio da

linha de base é removido, e a linha de base passa a ser zero. As informações das áreas dos

picos após a utilização de uma primeira derivada são conservadas, assim é mantida a

correspondência quantitativa entre os espectros e a concentração em espectros derivados.

O uso de primeiras derivadas numa calibração permite eliminar a linha de base, mantendo

os detalhes espectrais necessários para correlacionar absorvâncias e concentrações. A

desvantagem de alguns algoritmos usados para calcular as derivadas consiste no facto de

introduzirem ruído no resultado (uma vez que o que é calculado é uma aproximação da

derivada). Este facto também diminui a precisão da calibração. É necessário determinar

se a eliminação da linha de base, usando derivadas, compensa o ruído espectral que

podemos estar a introduzir. (14) (15)

Ilustração 7 - Gráfico que ilustra o comportamento da segunda derivada

Parte positiva

Parte

negativa


Parte positiva

Ponto de inflexão Ponto de inflexão

Espectro

2ª derivada


23

Podemos também calcular a segunda derivada de um espectro (Ilustração 7).

Podemos pensar nesta segunda derivada como a derivada da primeira derivada. Esta

derivada de segunda ordem mede a concavidade ou a curvatura de uma função. A

concavidade típica de um pico de um espectro na sua base é positiva (concavidade virada

para cima). No local onde o pico é mais alto e mais íngreme, a concavidade passa por um

ponto de transição chamado ponto de inflexão e neste a concavidade é zero. O topo de um

pico tem a concavidade voltada para baixo ou negativa. Devido a este comportamento, a

segunda derivada de um pico tem uma parte positiva, passa por zero no ponto de inflexão,

começa então uma parte negativa, passa por zero novamente no outro ponto de inflexão e

volta a ter uma parte positiva novamente até voltar a ser zero, pois é esse o valor da linha

de base. O valor mínimo da parte negativa da derivada do pico corresponde ao máximo

do pico. É devido a este comportamento que a segunda derivada é usada para "separar"

grupos de picos sobrepostos. (14) (15)

A primeira e segunda derivadas eliminam a linha de base. A segunda derivada

elimina também a inclinação inicial dos espectros (Ilustração 8). Isto acontece porque as

linhas não têm concavidade (curvatura). (14) (15)

Ilustração 8 – Gráfico de um espectro contendo um declive (em baixo); Gráfico da segunda derivada do espectro em que o declive foi eliminado (segunda derivada calculada com um filtro Savitsky-Golay, polinómio de segunda ordem e uma janela de cinco pontos)

A informação da área dos picos também é conservada nas segundas derivadas,

preservando a correlação entre a medida espectral e os valores de concentração. A

vantagem do uso de segundas derivadas numa calibração consiste em remover a linha de

base e a inclinação do espectro do conjunto de dados espectrais. As derivadas aplicadas a

2ª derivada – não existe declive

Espectro com declive



24

espectros tendem directamente a originar um resultado mais ruidoso do que os espectros

originais, o que introduz imprecisão numa calibração. É sempre necessário determinar se

a eliminação do desvio da linha de base e/ou do declive compensa o ruído que pode ser

introduzido no cálculo das derivadas. (14) (15)

2.3 Filtro de Wiener

A teoria formulada por Norbert Wiener constitui a base de filtros, cujo erro linear

dos mínimos quadrados é dependente dos dados. Os filtros Wiener desempenham um

papel central numa ampla gama de aplicações, tais como predição linear, cancelamento

do eco, restauração de sinal, redução do ruído aditivo, equalização de canais e

identificação de sistemas. Os coeficientes de um filtro de Wiener são calculados para

minimizar o quadrado da distância média entre a saída do filtro e um sinal desejado. A

teoria de Wiener assume que os sinais são processos estacionários. No entanto, os

coeficientes do filtro são periodicamente recalculados para cada bloco de amostras de

sinal; em seguida, o filtro adapta-se às características médias dos sinais dentro dos

blocos2 (16) (17).

Ilustração 9 – Actuação do filtro de Wiener sobre o sinal.

2 No presente estudo considera-se apenas um bloco de espectros.


25

Filtro de Wiener para Redução de Ruído Aditivo

Considerando o sinal observado numa banda larga de ruído aditivo e

modelado como:

(eq. 4)

assumindo ainda que o sinal e o ruído não estão correlacionados, segue-se que a matriz de

autocorrelação do sinal de ruído é a soma da matriz de autocorrelação do sinal e o

ruído :

(eq. 5)

e também podemos escrever

(eq. 6)

onde , e são as matrizes de autocorrelação do sinal com ruído, do sinal sem

ruído e do ruído respectivamente, e é o vector da correlação cruzada do sinal ruidoso

e do sinal livre de ruído. A substituição das Equações (eq. 5) e (eq. 6) na equação do

mínimo do erro quadrado do filtro de Wiener:

(eq. 7)

origina a Equação ,

(eq. 8)

A equação (eq. 8) é o filtro linear óptimo para a remoção de ruído aditivo (16)

(17).

Filtro de Wiener e a separação do sinal e do ruído

Um sinal é completamente recuperável do ruído, se os espectros do sinal e o ruído

não se sobrepuserem. Neste caso, o sinal e o ruído ocupam diferentes partes do espectro

de frequência e podem ser separados. O mais comum é ter um processo em que o sinal e

o ruído se sobrepõem no espectro. Neste caso, não é possível separar completamente o

sinal do ruído. No entanto, os efeitos do ruído podem ser reduzidos pelo uso de um filtro

de Wiener, que atenua cada frequência de sinal ruidoso na proporção de uma estimativa

da razão sinal-ruído.

O erro médio quadrado é igual a zero somente se o sinal de entrada está

relacionado com o sinal desejado através de um filtro linear e invertível (filtro de Winer).


26

Na maioria dos casos, devido ao ruído e / ou distorções não lineares do sinal de entrada, o

mínimo do erro médio quadrado é diferente de zero (16) (17).

Ilustração 10 – Os gráficos mostram os tipos de espectros com formas diferentes de ruído. a) O sinal e o ruído espectral não se sobrepõem; b) O sinal e o ruído sobrepõem-se, e o ruído pode ser reduzido mas não pode ser completamente eliminado

2.4 Figuras de mérito dos Modelos

Os parâmetros de mérito dos modelos de calibração destinam-se a avaliar a sua

qualidade (mérito), de modo a que esta possa ser avaliada e comparada entre diferentes

modelos.

Em relação às figuras de mérito e estimativa da incerteza, não há diferença

conceptual entre os métodos de calibração univariada e multivariada. As descrições de

métodos multivariados também têm de incluir os valores dos parâmetros de mérito

estimados, bem como as estimativas de incerteza correspondentes. Porém, enquanto

existe um consenso geral sobre as expressões de previsão da incerteza univariada, que

deriva da estatística básica, a sua generalização para o domínio multivariado faz falta.

A prática comum, quando se aplicam estratégias de calibração multivariada, leva

ao uso da raiz quadrada do quadrado do erro médio de previsão (RMSEP- root-mean-

square error of prediction), que assenta numa média sobre o número de amostras

utilizadas para o teste do modelo. Um erro médio, no entanto, caracteriza o modelo em

vez das amostras individuais (desconhecidas). Assim, embora o RMSEP seja uma

estatística resumo correcta para orientar o processo de selecção de modelos (por exemplo,

pré-tratamento ideal dos dados), não pode levar a intervalos de predição com boas

Magnitude Magnitude Sinal Ruído

Frequência Frequência


27

probabilidades de cobertura (explicação dos dados). Essa diferença, em lidar com a

previsão da incerteza, é uma lacuna grave entre as metodologias de calibração univariada

e multivariada (18).

Os parâmetros de mérito podem então enumerar-se para os dois casos:

A Sensibilidade para um dado analito é definida como o declive da curva de

calibração analítica. Em termos gerais, é sensato considerar a sensibilidade como a

mudança na resposta (isenta de ruído) do instrumento dividida pela correspondente

mudança no estímulo (a concentração do analito de interesse). Assim dizemos que um

modelo é sensível se uma pequena mudança na concentração do analito causa uma grande

mudança na resposta (isenta de ruído). No caso multivariado, a sensibilidade é o

parâmetro definido como o sinal multivariado efectivo (sinal sem ruído) do analito

gerado por uma concentração de analito iunitária. Para um modelo clássico, a

sensibilidade é a inclinação da curva de calibração (pseudo-univariada). Por outro lado, a

sensibilidade é o inverso do coeficiente angular deste gráfico para o modelo inverso.

A selectividade foi definida idealmente como o índice da razão entre os declives

das linhas de calibrações do analito de interesse e uma interferência em especial. Os

índices de selectividade devem ser avaliados para cada uma das interferências

importantes que possam estar presentes em quantidades variáveis, uma vez que levariam

a previsões tendenciosas. Assim, na calibração univariada, os coeficientes de

selectividade são fundamentais para saber como é que as quantidades variáveis de

interferências na amostra podem influenciar as previsões. Por outro lado, as interferências

podem ser adequadamente modeladas, utilizando dados multivariados. É preciso ter em

conta ainda que a selectividade baixa está associada a um maior grau de sobreposição

espectral entre o analito e os componentes de outra amostra (18).

A razão sinal-ruido é a razão entre o sinal analítico útil e o ruído de fundo, sendo

este último uma medida estatística das flutuações do sinal na ausência do analito, o que é

válido para o caso multivariado também.

A Sensibilidade analítica é o parâmetro definido como a relação entre a

sensibilidade e o ruído instrumental. Parece ser mais útil do que a sensibilidade

"simples", porque é independente da técnica que se está a usar, dos equipamentos e da

escala utilizada.

O Limite de detecção é a quantidade mínima detectável. Estes limites são

encontrados através da teoria de testes de hipóteses e das probabilidades que estão

associadas aos diferentes tipos de erros (de testes de hipóteses).


28

O Limite de discriminação é o aumento mínimo na concentração de analito

numa amostra conhecida, o qual garante que o sinal analítico é significativamente

diferente do que corresponde à concentração de analito original (18). Generalizando, a

discriminação define-se como a capacidade de um método de análise química em

discriminar uma quantidade pré-definida em relação à concentração nominal (19).

A transformação dos modelos multivariados para univariados é uma abordagem

que tem sido sugerida por vários autores. Consiste em realizar uma regressão univariada

standard, usando uma variável "substituta" do sinal obtido a partir da amostra

multivariada e directamente relacionado com a concentração do analito. A partir desta

linha de regressão univariada (sinal vs concentração de analito), é possível derivar figuras

de mérito, tais como a precisão, a sensibilidade e o limite de detecção.

Esta abordagem funcionará bem, desde que o modelo multivariado seja capaz de

extrair eficientemente o sinal correspondente ao analito seleccionado (18).

2.5 O Método SBC

O Método SBC3 é um método de calibração de instrumentos multicanal baseado

no uso de processos físicos de medição para determinar o sinal de resposta do analito e do

ruído (20) (21) (22). Este tipo de abordagem física traz consigo vantagens inerentes, como:

- Os métodos espectroscópicos tornam-se "primários";

- A necessidade de valores laboratoriais de referência é praticamente eliminada;

- Os processos industriais estáveis com variações mínimas no analito também

podem ser calibrados, ou seja, a necessidade de desenho de experiências é praticamente

eliminada.

- Desenvolvimento mais rápido de analisadores para novas aplicações e menos

arriscado, porque as especificações dos equipamentos podem ser alteradas com

antecedência.

- A especificidade da resposta pode ser comprovada;

- A rastreabilidade é possível;

- O processo de calibração é transparente para o utilizador.

3 Método de calibração baseado na perícia e na experiência do investigador em estimar o ruído, e o sinal de resposta de um analito de interesse (Science Based Calibration Method)


29

Este método implica que se cumpram os seguintes pressupostos:

- Invariância dos espectros de resposta no tempo. O que quer dizer que estes

espectros não se alteram ao longo do tempo (de medição) nem os analitos, nem as variáveis

que afectam a amostra, tais como a temperatura, a distribuição do tamanho de partículas,

ou a concentração de outros componentes.

- Linearidade das medições espectroscópicas. As medições espectroscópicas

têm de ser absolutamente invariantes no tempo, o que não acontece na maioria das vezes.

Nas medições on-line, a linearidade não é um problema, pois as medições on-line têm uma

variação muito pequena nas concentrações do analito ao logo do tempo.

- Determinação da parte de confiança do espectro. É a parte do espectro que

nunca varia (comprimentos de onda que se mantêm).

2.5.1Teoria base do Método SBC:

Estimando o sinal espectral de uma forma física e o ruído espectral de uma forma

estatística, o método SBC combina a precisão da previsão da abordagem inversa com o

baixo custo e a facilidade de interpretação dos modelos clássicos. Os resultados obtidos

pelo método SBC são baseados em estimativas do sinal do analito (por exemplo o

espectro) e do "ruído" espectral () feitas pelo utilizador. As etapas básicas envolvidas

para o cálculo da concentração de analito em amostras desconhecidas estão resumidas

abaixo. Conforme descrito por Marbach (21) (22) (23) (24), cada espectro (x) com k

variáveis (xT (1 × k)) pode ser descrito como:

xT = ygT + XTn (eq.9)

onde xTn (1 × k) é a absorção no espectro medido que não é exclusiva do analito, inclui

também o ruído instrumental, as interferências nos espectros, e y e gT (1 × k) são a

concentração e o espectro do analito puro (sinal de resposta do analito), respectivamente.

Para um conjunto de espectros , a matriz X (m × k), e o sinal podem ser descritos por

uma média ygT e um valor médio quadrático, σygT, onde σy é o desvio padrão de y. O

ruído espectral também é descrito por um valor médio, , e uma matriz de co-variância,

(que actua como um filtro de Wiener modificado). Se as diferenças entre os espectros


30

incluídos na matriz X (m × k) são apenas devidas a variações nas concentrações de

componentes, com excepção do analito de interesse e fontes de ruído instrumental, depois

de centrarmos os espectros em relação à sua média, podemos dizer que espectros medidos

representam apenas "ruído" espectral:

(eq.10)

onde X é a matriz de média centrada X (m × k). De acordo com este, a covariância do

"ruído" espectral, (k × k), é calculado como:

(eq.11)

Posteriormente, o vetor-b óptimo (declive), no sentido do quadrado do erro

mínimo de pevisão, é calculado como:

(eq.12)

onde corresponde á matriz inversa de . Se tende para ∞, esta equação pode ser

simplificada para:

(eq.13)

Podemos agora usar, o vector-bopt(1) para prever a concentração do analito ( ) em

cada espectro da amostra desconhecida ( ), utilizando o conteúdo de informação do

"ruído" da matriz e da resposta do analito da seguinte forma:

(eq.14)

sendo, y o valor médio de y e x a média do "ruído" dos espectros da matriz X (m × k).

2.6.1 Selectividade e Sensibilidade

A selectividade pode ser alcançada quando o sinal das correlações inespecíficas

não se sobrepõe ao sinal de resposta do analito (g), mas isto é feito à custa da

sensibilidade. No Método SBC, este compromisso é transparente para o utilizador e por

isso é controlável. A optimização desta relação tem em vista alcançar uma selectividade

tão restrita quanto possível, à custa da redução da sensibilidade. Na prática, a variância

das correlações inespecíficas e os seus valores são determinados pelo utilizador aquando

da adição de componentes de ruído extra para que se alcance a maior robustez a longo

prazo. Estes são factores para a portabilidade. Podemos adicionar todos os componentes

de ruído para todos os efeitos espectrais, mas vamos reduzir a sensibilidade do modelo de


31

calibração, por outras palavras, vamos aumentar o ruído da previsão. Por isso devemos

seleccionar os componentes de ruído de acordo com a nossa aplicação para se alcançar o

compromisso entre selectividade/robustez/portabilidade, por um lado, e por outro

sensibilidade/precisão. A avaliação deste compromisso é transparente para o utilizador.

(24)

2.6.2 Aplicação na prática

Na prática podemos estimar o ruído de dois modos diferentes que podem ser

usados em conjunto ou em separado. Podemos optar por uma abordagem teórica em que

os componentes do ruído são somados uns aos outros e são determinados pela aplicação

dos conhecimentos de espectroscopia, características que por si só constituem vantagens.

O outro método é o método experimental, mais fácil e mais frequentemente usado, pois

não necessita de benchmarks e tem a vantagem de não deixar nada de fora. (24)

Contudo, a aplicação do método experimental tem algumas desvantagens:

- Quando estimamos o ruído podemos gerar ruído, mesmo que estejamos a

trabalhar bem (recolha de amostras), podemos gerar um vector-b (responsável pelo

declive) ruidoso.

- Para que as estimativas estatísticas sejam confiáveis temos de ter um número de

espectros elevado para superar o efeito visual (forma do espectro).

- A selectividade por si só não pode ser provada pelo método experimental.

- A falta de espectros de componentes interferentes

- Para provar a selectividade devemos usar espectros de teste para os valores de

referência.

- Quando o declive não é 1 significa que os espectros contêm correlações não

específicas que devem ser identificadas pela aplicação de conhecimentos de

espectroscopia, para que se determine o ruído com a preservação da sensibilidade ideal.

O resultado do método teórico, embora não seja perfeito, quando combinado com

o método experimental, permite-nos obter um filtro melhor (matriz do ruído), o qual irá

permitir a redução dos cálculos dos componentes das interferências dos espectros para


32

calcular a sensibilidade cruzada. Na prática não importa que o ruído tenha sido calculado

se a selectividade não for alcançada, pois a probabilidade de rejeição das previsões é

total.4

2.7 Células estaminais

As células estaminais são células que, por si só, podem dar origem a descendência

que se diferencia em qualquer uma das células especializadas de tecidos embrionários ou

adultos, ou seja, são totipotentes. O óvulo fertilizado é uma célula estaminal que se divide

cinco ou seis vezes para dar origem a ramos (linhas) de células que se diferenciam e

formam os vários órgãos. Durante essas divisões iniciais, cada célula-filha mantém

totipotência. Então, através de uma série de divisões e diferenciações, as células

estaminais embrionárias perdem potencial e ganham funções diferentes (25) (26).

As células estaminais embrionárias podem ser mantidas, proliferando

indefinidamente em cultura e mantendo um potencial irrestrito de desenvolvimento. Se

estas células forem recolocadas num embrião, serão incorporadas por ele e podem dar

origem a todos os tecidos e tipos de células no corpo, incluindo as células germinais

(células que podem dar origem aos gâmetas), integrando-se perfeitamente em qualquer

local que possam vir a ocupar, e adoptar o carácter e os comportamentos que as células

normais que estariam naquele sítio (27).

No organismo adulto, as células estaminais são específicas dos tecidos a que

pertencem e geralmente permanecem amplamente fiéis às suas origens. Colocadas num

ambiente anormal, as células diferenciadas podem deixar de exibir o conjunto completo

de características normais de células diferenciadas. Por outro lado, as células estaminais

podem diferenciar-se, mas não podem mudar e expressar as características de um outro

tipo de célula radicalmente diferente. Assim, cada tipo de célula especializada tem uma

memória da sua história. Algumas transformações limitadas certamente que podem

ocorrer e gerar uma variedade de tipos de células diferenciadas, mas as possibilidades são

restritas de acordo com o tecido que lhes deu origem (27).

4 Os valores próprios da matriz do ruído nunca devem ser inferiores aos valores próprios da matriz do ruído de fundo, ou seja, a matriz do ruído deve conter, pelo menos, o ruído do equipamento.


33

2.7.1 Sistemas de cultura de células animais

As células animais podem ser cultivadas de duas formas essenciais: em suspensão

ou em monocamada. O processo de cultura de células em suspensão envolve um volume

grande de meio de cultura para aumentar as trocas gasosas e a agitação tem de ser lenta

para evitar que as células formem um sedimento denso. Embora as células que crescem

em suspensão sejam mais fáceis de manipular, as células ancoradas têm o potencial de

desenvolver polaridade. Este pode ser um modelo de cultura melhor para a secreção de

metabolitos de interesse. Para este tipo de culturas, que depende da ancoragem, é

necessário aumentar a área de superfície do substrato na proporção do número de células

e do volume de meio (28).

De acordo com estes dois princípios de cultura desenvolveram-se vários sistemas

de cultura:

- Culturas em frasco de fundo plano (T-flasks) – no qual as células crescem

aderentes ao fundo do frasco e as trocas gasosas são feitas pela tampa do frasco.

- Cultura em tabuleiros paralelos – nos quais as células crescem aderentes ao

fundo dos tabuleiros.

- Cultura rotativa – as células crescem dentro de um cilindro ou de um frasco

cilíndrico que gira sobre o seu eixo maior. A monocamada de células cresce aderente em

redor do cilindro ou do frasco.

- Culturas por perfusão – neste tipo de culturas, as células estão estáticas e o meio

é que circula pelo sistema. Exemplos: reactores de fibras ocas, reactores de leito fixo.

- Cultura em reactores com agitação – as células nestes reactores podem crescer

em suspensão ou desenvolver-se na superfície de micro suportes em suspensão

(microcarriers). (28)

2.7.2 Monitorização de metabolitos através da Espectroscopia de infravermelhos.

A monitorização de metabolitos através da Espectroscopia de infravermelhos

oferece geralmente a vantagem de não ser invasiva, não destrutiva e fornecem

informações on-line ou at-line sobre diversas variáveis do processo simultaneamente.

Algumas destas técnicas foram testadas em células de mamíferos, incluíndo a

espectroscopia de infravermelho próximo (NIR), infravermelho médio (MIR) e


34

espectroscopia de fluorescência em 2D para monitorizar a composição das culturas. Estas

técnicas não incidem sobre componentes individuais, em vez disso, elas fornecem

grandes conjuntos de dados correlacionados, a partir dos quais, a informação significativa

deve ser extraída. Isto nem sempre é tão simples, pois por exemplo quando a cultura

alcança a fase de morte celular, o comportamento espectroscópico da cultura é ainda mais

complexo, devido à acumulação de restos celulares, aumentando assim o desafio para a

monitorização de variáveis alvo do bioprocesso (29).

As medições espectroscópicas são afectadas pela interferência de partículas

sólidas, bolhas de gás, agitação, altas densidades celulares e da viscosidade do meio de

cultura. Todos esses factores contribuem para uma diminuição na relação sinal-ruído nos

espectros obtidos.

Nos últimos anos, as técnicas espectroscópicas de Infravermelhos, principalmente

NIR (780-2526 nm) e MIR (2500 a 40000 nm), tornaram-se ferramentas importantes no

contexto da monitorização de bioprocessos para avaliar rapidamente o estado da cultura.

Ambas as espectroscopias permitem uma impressão digital de grande parte da cultura

dentro de poucos minutos. A tecnologia NIR é essencialmente útil para detectar os

componentes que contêm alifáticos, aromáticos ou alceno, as aminas N-H e ligações O-H.

No entanto, a absorção molar na faixa NIR é tipicamente muito pequena, por isso, o

método não é o ideal para componentes pequenos e diluídos. Este pode ser um factor

limitante para a aplicação às culturas de células de mamíferos, uma vez que um objetivo-

chave de controlo do processo durante a operação em feed-batch é manter a glicose e a

glutamina em concentrações muito baixas para evitar o acumular de subprodutos tóxicos

de amónia e de lactato (29).

A espectroscopia MIR permite alcançar um melhor grau de resolução espectral,

pois os níveis de energia da maioria das vibrações moleculares são encontrados na região

de infravermelhos médios (MIR) do espectro (29). O uso de espectroscopia MIR in situ

para monitorizar os perfis da glucose e lactato em culturas batch de células tem uma

aplicabilidade potencialmente maior, pois a faixa espectral MIR 1800-800 cm-1 é

chamada região de "impressão digital". Nesta região virtualmente todos os metabolitos

importantes na cultura de células têm absorvância (30).

O uso de equipamentos NIR com sonda de fibra óptica para a monitorização in

situ da concentração de analitos chave, tais como a glicose e o lactato, é uma ferramenta

capaz de prever as concentrações destes metabolitos com um bom grau de precisão

durante os processos de cultura de células animais ligadas a microsuportes em suspensão.


35

O método também é fidedigno quando se utilizam diferentes condições e é aplicável em

scale-up. Estes resultados são úteis não só para monitorizar os processos convencionais

de cultura de células, mas também no controlo de concentrações não usuais para o

desenvolvimento de planos de mitigação de risco, para o caso específico das culturas de

células aderentes (31).

Outros exemplos de sucesso da aplicação destas tecnologias podem ser

reconhecidos noutros tipos de culturas de células não animais. Os exemplos de aplicações

que se seguem realçam a capacidade desta tecnologia poder controlar parâmetros físicos e

químicos.

A espectroscopia de infravermelhos próximos (NIR) tem a capacidade de gerar

simultaneamente dados de análise multi-parâmetro em tempo real para a biomassa e

metabolitos de culturas bacterianas. Os modelos on-line conseguidos possuem precisão

espectroscópica semelhante aos das técnicas analíticas convencionais (32). As sondas de

infravermelhos médios in situ utilizadas para a obtenção de uma caracterização

quantitativa e qualitativa da fermentação de E. coli. constituem um sistema com

excelentes propriedades de estabilidade, que não é afectado pela agitação ou taxas de

arejamento ou paralisações impostas pelos procedimentos de manutenção de rotina neste

caso (33).

A simplicidade de utilização de técnicas de espectroscopia de infravermelhos

permite reduções significativas no tempo de análise de metabolitos e monitorização de

metabolitos (34) para o caso específico de culturas mistas (cultura com vários tipos de

células).

3. Método SBC aplicado à cultura de células estaminais

3.1 Materiais e Métodos

Foram utilizados dados de culturas de células estaminais que não foram

expressamente obtidos para este trabalho. Utilizaram-se três expansões celulares, em que

duas delas foram monitorizadas por um primeiro equipamento portátil MIR-ATR (VFA

Spectrometer, Wilks Enterprise, South Norwalk, USA) que deixou de poder ser utilizado,

foi então utilizado um segundo equipamento portátil MIR-ATR do mesmo fabricante para

se monitorizar a terceira expansão celular.


36

Os equipamentos medem comprimentos de onda na mesma região; contudo, os

comprimentos de onda medidos são diferentes entre os equipamentos e os seus intervalos

são diferentes entre si e entre equipamentos. Procedeu-se à correspondência entre os

vários canais (que correspondem a diferentes números de onda) dos equipamentos, a qual

se revelou infrutífera.

As três expansões celulares foram obtidas a partir de células da mesma linhagem.

Foram feitas pelo mesmo método, tendo variado entre elas o nível de arejamento

(agitação) do meio e a quantidade inicial de glucose. Todas as expansões foram

monitorizadas diariamente off-line e as amostras recolhidas foram todas analisadas pelo

método de referência e posteriormente analisadas pelos equipamentos MIR-ATR

portáteis. As duas primeiras expansões foram analisadas pelo primeiro equipamento

MIR-ATR, e a terceira foi analisada pelo segundo equipamento. De cada amostra diária

foram obtidos dois espectros com o equipamento MIR-ATR. Da terceira expansão

celular, obtiveram-se três espectros de uma amostra recolhida logo após a adição das

células (tempo zero).

Procedeu-se à análise de três analitos - Glucose, Ácido Láctico e Glutamina - em

cada uma das amostras. Obtiveram-se também as contagens celulares para a terceira

expansão celular.

Posteriormente realizaram-se diluições dos diferentes metabolitos em água

desionizada, obtida por osmose reversa de acordo com a tabela 1.

Tabela 1 - Tabela de diluição de metabolitos

Metabolito Concentrações ( mM )

Glucose 1.00 2.00 4.00 8.00 12.00 16.00 20.00

Ác. Láctico 1.00 2.00 4.00 8.00 12.00 16.00 20.00

Glutamina 0.01 0.10 0.15 0.2 0.25 0.30 0.35

A partir de cada uma das diluições foram obtidos cinco espectros com o segundo

equipamento e, para cada conjunto, foi realizada uma operação de aquisição de

background. Adicionalmente obtiveram-se 34 espectros da água e realizaram-se três

operações de aquisição de background de acordo com o setup original do segundo

equipamento.


37

3.1.1 Métodos de análise dos espectros

Todos os espectros considerados foram pré-processados, usando um filtro de

Savitzky–Golay com uma janela de 23 pontos e, de seguida, aplicada uma primeira

derivada com uma janela de 11 pontos.

A análise dos espectros assentou no Método SBC e na regressão linear simples. O

processamento foi realizado de acordo com os seguintes passos:

1. Para a glucose e glutamina que são analitos consumidos ao longo do processo de

crescimento das células estaminais, considerou-se:

a) O espectro do analito puro foi considerado como sendo a média dos

espectros da primeira amostra obtida no início de cada expansão, pois

nesta altura conhece-se bem a constituição do meio e a quantidade dos

analitos que vão ser consumidos ao longo do processo.

b) Para efeitos da construção da matriz do ruído () foram consideradas as

etapas finais do processo, sendo aqui a concentração do analito mais baixa

e a acumulação dos restantes produtos originados ao longo do processo

maior.

2. Obtenção do sinal de resposta (g) – assumiu-se que a variância do método de

referência ( ) é muito próxima de zero, pois o conjunto de espectros obtidos

para se construir o espectro de resposta (g) consiste em espectros obtidos por

leituras da mesma amostra.

3. Construção da matriz do ruído ( )

a) Centrámos todos os espectros em relação à sua média.

b) Construímos uma matriz ( ) com m espectros considerados para efeitos

do ruído dispostos em linhas (n é o numero de canais do equipamento).

c) Calculando a matriz de co-variância .

4. O factor de escala (S) considerado é 1, pois as variações de concentração ocorrem

sempre da mesma maneira em função umas das outras e todas elas pertencem à

gama de concentrações do processo. Então o que se aplica é:


38

a) ∑.

.∑. em vez de .

∑.

. .∑. pois por 1.a) 0

(tende para zero) e pelo passo 2. o factor de escala S=1.

b) Temos então:

é

.

é

5. Escolhemos a segunda expansão para construir os modelos de calibração para o

primeiro equipamento MIR, pois em relação à variação da concentração ao longo

do processo é a expansão que tem um comportamento esperado (ANEXO I). A

primeira expansão não foi a escolhida, pois apresenta uma subida da concentração

de Glucose em relação à concentração inicial (ANEXO I). Uma vez que a

Glucose é um metabolito consumido ao longo do processo, o comportamento da

primeira expansão é revelador da ocorrência de processos atípicos. Aplicámos os

três passos anteriores a todos os espectros obtidos por medição de todas as

amostras, incluindo as iniciais e as finais para todos os analitos considerados.

Estes passos foram aplicados individualmente a todos os canais do espectro,

tendo-se procedido da mesma forma para a terceira expansão monitorizada pelo

segundo equipamento MIR.

6. Procedeu-se à regressão linear simples dos valores obtidos ( ) no passo 4.b)

com os correspondentes valores determinados pelo método de referência.

Verificámos assim a qualidade da calibração para cada um dos canais do espectro

(i.e. para cada comprimento de onda, os canais do espectro são identificados pelo

seu número de onda (cm-1)). Calculou-se então o r2 referente a cada regressão dos

resultados de cada canal, assinalando todos os canais que tiveram um r2 > 0.60.

Quando o declive era positivo indicava uma correlação positiva, o que significa

que encontrámos um canal cujo comprimento de onda que representa é um

candidato a ser possivelmente incluído no espectro de resposta (g).

7. Fingerprinting - procedemos desta forma para todos os metabolitos que, neste

caso, são dos principais produtos ao longo de todo o processo:


39

a) Após encontrarmos a região de fingerprint, fizemos a média dos espectros

considerados como sendo espectros onde o metabolito é mais concentrado.

b) Para encontrar a região fingerprint considerou-se a região imutável para

diferentes expansões independentes e com os canais que apresentavam

melhores correlações.

c) Reconstruímos o espectro de resposta, colocando zeros nos locais em que

o r2 não foi satisfatório no espectro médio que calculámos. Porém

mantivemos os valores dos canais que passaram nos critérios. (em

alternativa podemos usar apenas os canais seleccionados)

A escolha das regiões espectroscópicas revelou a seguinte

peculiaridade: se não se escolher a zona característica do metabolito, por

exemplo, incluindo mais um ou dois comprimentos de onda corremos o

risco do modelo final não fazer sentido.

8. Construção do modelo de calibração – Aplicámos os passos do 1 ao 4, usando

apenas os canais seleccionados.

a) Procedeu-se à regressão linear simples dos valores obtidos de acordo

como passo 4.b) com os correspondentes valores determinados pelo

método de referência.

b) Corrigiu-se o declive (b) para que a recta de calibração do modelo tivesse

um declive unitário.

i. Encontrámos o ponto de concentração média – calculámos, para

isso, a média das concentrações obtidas pelo método de referência

( é ) e, de seguida, calculámos o seu valor esperado, usando

apenas é é

ii. Multiplicámos todos os valores previstos calculados por

é é⁄ e fizemos uma nova regressão linear simples.

iii. Adicionámos ou subtraímos uma constante à nossa recta para que

esta tivesse início na origem.

9. Aos metabolitos que se formam ao longo do processo (no nosso caso o Ác.

Láctico) aplicou-se o mesmo método descrito nos passos acima. Como estes

metabolitos são mais concentrados no final do processo, os espectros


40

considerados "do analito puro" são os das amostras recolhidas no final do

processo, e com eles se calcula o espectro de resposta (g). Os espectros do início

do processo são usados para construir a matriz do ruído.

Na construção dos modelos de calibração do primeiro equipamento MIR para os

diferentes metabolitos foi usada a segunda expansão de células como expansão de

referência, nomeadamente os seus espectros iniciais e finais. Os restantes espectros das

restantes amostras foram usados como validação para os modelos dos metabolitos. A

primeira foi usada também para validação independente dos modelos.

Os modelos do segundo equipamento MIR foram construídos do mesmo modo

que os anteriores. Contudo não se executou a segunda validação, pois com este

equipamento só se monitorizou uma expansão celular. Devido à disponibilidade das

contagens de células desta expansão foi possível construir um modelo de calibração para

estimar o número de células em cada uma das amostras. Este modelo foi construído,

tendo como base a construção da matriz do ruído, com os espectros das amostras que

correspondem à fase de latência e os espectros das amostras correspondentes à fase

estacionária, sendo estes últimos, os espectros que permitem reconstruir o sinal de

resposta (g) para o número de células. O número de células aumenta sempre como uma

potência de 2 e para que se pudesse obter uma correlação linear foi utilizado o logaritmo

de base 2 do número de células.

Os espectros obtidos através da análise das diluições dos diferentes metabolitos

foram tratados pelo método acima descrito, tomando os espectros da água para a

construção da matriz do ruído e os espectros das diluições mais concentradas para a

construção do espectro de resposta do analito (g).

Os espectros da água foram analisados devido à suspeita de uma correlação

inespecífica. Assim tomaram-se, como espectros para a construção do ruído, os cinco

espectros da água que foram obtidos primeiro e como resultado do efeito cumulativo

tomaram-se os últimos cinco espectros da água a serem obtidos para construir o sinal de

resposta (g). Este é o sinal que identifica o efeito indesejado.


41

3.2 Resultados e Discussão

3.2.1 Fingerprinting

A tabela 2 mostra-nos que as zonas em que a Glucose e a Glutamina se

correlacionam com os seus valores obtidos pelo método de referência são inversas às do

Ác. Láctico. Este fenómeno pode ficar a dever-se ao facto do ácido láctico ser dos três

analitos o que tem um carácter ácido mais marcado.

Tabela 2 – Zonas de Finguerprint para as monitorizações realizadas com o primeiro equipamento MIR - ATR

Tabela 3 – Zonas de Finguerprint para as monitorizações realizadas com o segundo equipamento MIR - ATR


42

A Glucose e a Glutamina monitorizadas pelo segundo equipamento MIR (tabela

3) continuam a ter zonas de correlação inversas às do Ác. Láctico, como esperado. Pela

análise das tabelas 2 e 3 e juntamente se tivermos em conta que as zonas fingerprint

encontradas em ambas as tabelas não correspondem minimamente às zonas encontradas

quando se analisam diluições dos metabolitos diluídos em água (ANEXO III), podemos

inferir que o que está representado são interacções dos nossos metabolitos com outros

componentes do meio. A Glucose dissolvida em água nestas concentrações não é

praticamente detectada pelo segundo equipamento MIR, mas a Glutamina em

concentrações mais baixas é detectada. Importa referir que o meio de cultura das células é

composto de soluções diluídas e que a diluição dos metabolitos em água, embora não seja

exactamente igual ao meio de cultura, em ambos os casos o aspecto geral dos espectros é

o aspecto do espectro da água. A análise da tabela 3 permite-nos inferir que o número de

células se correlaciona sobretudo com os metabolitos e complexos moleculares que se

acumulam ao longo do processo como o ácido láctico. Esta correlação é óbvia, pois as

zonas fingerprint de ambos se sobrepõem, contudo na parte final do crescimento celular,

o Lactato continua a acumular-se, mas as células podem já não crescer na mesma

proporção, pois os recursos do meio escasseiam e as células não crescem na mesma

proporção e eventualmente podem morrer.

As zonas fingerprint ilustradas pelas tabelas 2 e 3 encontram-se incluídas em

zonas de correlação positiva, o que seria de esperar, pois as moléculas e os agregados de

moléculas que são consumidos quando a célula consome glucose ou glutamina, tendem a

ser sempre os mesmos. Já com as moléculas que se correlacionam negativamente, isso já

não se verifica pois por exemplo, uma célula consome glucose e todas as moléculas de

que necessita para obter energia a partir da glucose e estas tendem a variar de forma

semelhante à glucose. Contudo uma das moléculas que se correlaciona negativamente

com a glucose é o lactato. O lactato é o produto da respiração anaeróbia das células,

sendo este um processo de obtenção de energia a partir da glucose em condições de

escassez de oxigénio. Assim quando as células estão no início do processo em que têm

condições óptimas para se desenvolverem forma-se pouco lactato, mas à medida que os

números vão aumentando e a agitação do meio se mantém (o arejamento é sempre o

mesmo) as células irão produzir mais lactato, pois há mais células a consumir oxigénio e

irão consumir mais glucose.

Assim, ao longo do processo, a forma como se forma o Lactato em relação ao

consumo da glucose não é sempre a mesma. Este tipo de fenómenos leva a que as zonas


43

de correlação negativa variem mais que as zonas de correlação positiva e por vezes até

desapareçam como no caso do lactato em que, numa das duas expansões monitorizadas

pelo primeiro equipamento MIR, uma das zonas de correlação negativa desaparece

3.2.2 Análise dos modelos de Calibração

As análises dos modelos obtidos através da segunda expansão monitorizada pelo

primeiro equipamento MIR apresentam-se reprodutíveis, uma vez que quando é usada a

primeira expansão e são calculados os valores esperados com base nos modelos de

calibração criados com a segunda expansão, o r2 de ambas as rectas obtidas é semelhante.

Quando se juntam os dados de ambas as expansões, o r2 não se altera significativamente.

A B C

Ilustração 11 – Resultados do modelo de calibração para a Glucose referente às expansões monitorizadas pelo primeiro equipamento MIR-ATR. Recta que expressa a qualidade do modelo de calibração da Glucose construído com base na primeira expansão (A); Recta que expressa a qualidade do modelo de calibração da Glucose em relação à segunda expansão (B); Recta que expressa a qualidade do modelo de calibração da Glucose com os dados combinados das duas expansões (C)

D E F

Ilustração 12 – Resultados do modelo de calibração para o Ác. Láctico referente às expansões monitorizadas pelo primeiro equipamento MIR-ATR. Recta que expressa a qualidade do modelo de calibração do Ác. Láctico construído com base na primeira expansão (A); Recta que expressa a qualidade do modelo de calibração do Ác. Láctico em relação à segunda expansão (B); Recta que expressa a qualidade do modelo de calibração do Ác. Láctico com os dados combinados das duas expansões (C).

y = 1.0031x ‐ 0.0003R² = 0.8941

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

valores de Glucose previstos (m

M)

valores de Glucose medidos pelo método de referência (mM)

y = 1,1649x ‐ 2,3174R² = 0,8965

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20


M)


y = 1,0689x ‐ 0,9392R² = 0,8898

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20


M)


y = 1.0003x + 4E‐05R² = 0.8895

0123456789

1011121314151617181920

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

valores de Ác.Láctico previstos(mM)

valores de Ác.Láctico medidos pelo método de referência (mM)

y = 0,9399x ‐ 0,3548R² = 0,8867

0123456789

1011121314151617181920

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

valores de Ác.Láctico previstos


y = 0,9874x + 0,3602R² = 0,8862

0123456789

1011121314151617181920

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

valores de Ác.Láctico previstos



44

G H I

Ilustração 13 – Resultados do modelo de calibração para a Glutamina referente às expansões monitorizadas pelo primeiro equipamento MIR-ATR. Recta que expressa a qualidade do modelo de calibração da Glutamina construído com base na primeira expansão (A); Recta que expressa a qualidade do modelo de calibração da Glutamina em relação à segunda expansão (B); Recta que expressa a qualidade do modelo de calibração da Glutamina com os dados combinados das duas expansões (C).

A análise dos gráficos de A a I mostra dois tipos de variabilidade dos dados. Os

pontos correspondentes a espectros da mesma amostra têm variações de mais do que uma

unidade, o que pode eventualmente ficar a dever-se a factores físicos relacionados com o

aparelho e a aplicação da amostra. O segundo factor de variação prende-se com o facto

de, por vezes, os pontos das zonas centrais dos gráficos se situarem abaixo da recta,

enquanto nos extremos se situarem normalmente acima, evidenciando o que aparenta ser

um comportamento sinusoidal, semelhante ao que é característico do crescimento celular.

Os gráficos ABC da Ilustração 14 mostram a qualidade dos modelos de calibração

elaborados pela análise dos espectros obtidos pelo segundo equipamento MIR, cujos r2

são sensivelmente de 0,97, o significa que são 10% melhores do que os modelos obtidos a

partir das duas expansões celulares anteriores. Estes resultados podem dever-se ao facto

de, na terceira expansão celular, existirem espectros da amostra que foi obtida no

momento em que se juntaram as células ao meio de cultura, o que por si só proporciona

uma melhoria nestes modelos que foram construídos com poucos pontos.

Tabela 4 – Comparação entre as rectas dos modelos dos diferentes metabolitos em relação às duas expansões celulares (primeiro equipamento)

Metabolito Diferença entre as

concentrações iniciais de cada expansão

Diferença das ordenadas na origem

Diferença entre os declives

Glucose

2.70 2,3171 0,1618

Lactato

0,27 0,3948 -0,0604

Glutamina

0.23 0,1868 0,7877

y = 1,0929x + 0,0788R² = 0,843

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

1.1

1.2

1.3

1.4

1.5

1.6

1.7

1.8

1.9

2.0

0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 2.0

valores de Glutamina previstos (m

M)

valores do Glutamina medidos pelo método de referência (mM)

y = 1,2122x ‐ 0,1868R² = 0,8872

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

1.1

1.2

1.3

1.4

1.5

1.6

1.7

1.8

1.9

2.0

0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 2.0


M)


y = 0.9999x + 4E‐06R² = 0.8245

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

1.1

1.2

1.3

1.4

1.5

1.6

1.7

1.8

1.9

2.0

0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 2.0


M)



45

A análise da Tabela 4 sugere que as diferenças encontradas ente as ordenadas na

origem dos diferentes modelos de calibração se relaciona com a diferença entre as

concentrações iniciais dos metabolitos em relação às duas expansões celulares, pois os

valores são da mesma ordem de grandeza respectivamente. A diferença nos declives está

possivelmente relacionada com a sensibilidade, pois a menor diferença ocorre no modelo

do Lactato que é o metabolito ao qual os equipamentos utilizados são mais sensíveis

(ANEXO III). O Modelo da Glutamina é o que tem a maior diferença entre os declives

calculados; embora o equipamento seja sensível à Glutamina, este é o metabolito que tem

uma menor concentração em ambas as expansões.

Tabela 5 – Relação entre os declives das rectas dos modelos de calibração antes de serem ajustados

Analisando a tabela 5 podemos verificar que os declives, antes de serem ajustados

para a unidade, são muito inferiores; este facto significa que existem fontes de correlação

inespecífica, e é revelador de falta de sensibilidade. Contudo trabalhamos com soluções

diluídas, em que o solvente é a água, uma das substâncias a que os equipamentos são

mais sensíveis. Este é um facto a ter em conta ao analisar estes declives. Podemos ainda

verificar que os declives tendem a ser ligeiramente melhores nos modelos para o segundo

equipamento em que se conhecem os espectros das amostras logo a seguir à junção das

células, o que indica que a caracterização da fase inicial do processo é muito necessária.

O segundo equipamento MIR parece ser mais preciso do que o primeiro, pois a

variação dos pontos que correspondem a espectros da mesma amostra, varia normalmente

menos de uma unidade (Ilustração 14).

Os resultados apresentados estão relativamente isentos das correlações

inespecíficas que fazem variar a linha de base dos espectros, pois no pré-tratamento dos

espectros, o uso da primeira derivada minora este problema. Para esclarecer este

problema, a análise dos espectros da água revelou uma correlação com um r2 = 0.66 e

com "zonas fingerprint" fora das regiões fingerprint dos nossos analitos (ANEXO IV).

Metabolitos Primeiro equipamento Segundo equipamento

Glucose 0,0145 0,0318

Lactato 0,0145 0,0081

Glutamina 0,1335 0,2549

Células ----------- 0,0059


46

A

B

C

Ilustração 14 – Resultados dos modelos de calibrações referentes à expansão monitorizada pelo segundo equipamento MIR-ATR. Recta que expressa a qualidade do modelo de calibração da Glucose (A); Recta que expressa a qualidade do modelo de calibração do Ác. Láctico (B); Recta que expressa a qualidade do modelo de calibração da Glutamina (C)

y = 1.0014x + 1E‐05R² = 0.9752

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

valores de Glucose previsto (mM)


y = 1.0018x + 2E‐05R² = 0.9735

‐5‐4‐3‐2‐10123456789

101112131415161718192021

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20valores de Ác.Láctico previstos (m

M)


y = 1x ‐ 3E‐05R² = 0.8809

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

2.2

1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2


M)



47

Ilustração 15 – Resultados dos modelos de calibrações referentes ao número de células da expansão monitorizada pelo

segundo equipamento MIR-ATR.

A análise do resultado do modelo de calibração para o número de células tem o

aspecto esperado, pois os pontos distribuem-se numa zona abaixo da recta e numa zona

acima da recta, o que poderá ocorrer devido ao comportamento não linear do crescimento

celular, mesmo apesar da tentativa de linearização com a aplicação do logaritmo. Não

existe dúvida de que o número de células de cada amostra é essencialmente previsto pela

acumulação de lactato no meio de cultura.

O comportamento aparentemente sinusoidal que os pontos dos gráficos revelam

pode eventualmente ser explicado pelo facto de estarmos a quantificar eventuais

agregados de moléculas que têm um comportamento semelhante aos analitos que

monitorizámos. Daí que as células, à medida que se desenvolvem especialmente na fase

exponencial do crescimento, retirarem do meio mais elementos e estes estarem menos

disponíveis para formar agregados com os analitos. Isto pode eventualmente explicar que

o sinal dos analitos seja menos forte

Um outro facto a salientar é o de o sinal dos analitos estar sobreposto pelos sinais

de metabolitos semelhantes, o que também contribui para a diminuição do sinal na

ausência dos eventuais agregados de moléculas que se relacionam com os analitos. Por

exemplo, a glutamina pode ter o seu sinal sobreposto por sinais de aminoácidos

semelhantes, o mesmo se passa com o sinal da glucose, que pode ser sobreposto por

sinais de outros açúcares.

Na tabela 6 é evidenciada a robustez dos modelos de calibração conseguidos com

a análise dos espectros da primeira e segundas expansões. Os modelos da terceira

expansão confirmam que os modelos obtidos pela aplicação do conceito do método SBC

aplicado a sistemas dinâmicos, como são as culturas de células, produz modelos robustos.

y = 0.9983x ‐ 0.0179R² = 0.8878

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

15 16 17 18 19 20 21 22 23

valores do lo

garitm

o do número de

células previsto

valores do logaritmo do número de células medido pelo método de referência


48

Tabela 6 – Resumo dos modelos de calibração

Metabolitos

Zonas

Correlação

positiva

(Cm-1)

Zonas

Correlação

Negativa

(Cm-1)

Zonas

Figurinha

(Cm-1)

r2

dos modelos de

calibração

(Correlação

positiva)

r2

máximo

Primeiro

equipamento

Primeira

Expansão

Glucose 1312,18-1219,32

1110,50-1063,07

1457,32-1368,29

1010,32954,36

1105,05-1053,08

0,8941

_____

Ác. Láctico

1496,26-1359,99

1105,03-1053,07

1411,41- 1359,99

0,8895

_____

Glutamina

1105,03-1053,07

1496,26-1359,99

1099,60-1078,43

0,8245

_____

Segunda

Expansão

Glucose

1319,91-1253,44

1116,04-1038,43

1666,86-1351,78

979,40-930,57

1105,05-1053,08

0,8895

_____

Ác. Láctico

1476,53-1351,78

979,40-934,45

1319,91-1260,49

1110,50-1043,26

1411,41- 1359,99

0,8867

_____

Glutamina

1319,91-1260,49

1110,50-1043,26

1476,53-1351,78

979,40-934,45

1099,60-1078,43

0.8872

_____

Segundo

equipamento

Expansão

(única)

Glucose

1631,80-1619,77

132642-1209,59

1123,03-1058,13

1656,40-1644,01

1529,56-1350,89

1318,46-1265,31

1100,53-1053,07

0,9772

_____

Ác. Láctico

1668,98-1644-01

1529,56-1350,89

1631,80-1596,24

1326,42-1223,05

1123,03-1058,13

1439,38-1359,24

0,9735

_____

Glutamina

1468,24-1350,89

1836,37-1791,45

1326,42-1209,59

1123,03-1058,13

1310,60-1272,64

0,8809

_____

Nº Células

(Log2)

1668,98-1644,01

1529,36-1330,89

1836,37-1791,45

1631,80-1584,72

1326,42-1250,91

1171,32-1068,43

1439,38-1376,27

0,8878

_____

Metabolitos

dissolvidos em

água

Glucose

_____

995,79-965,17

_____

_____

0,7435

Ác. Láctico

1707,90-1573,37

1326,42-1243-83

1229,90-1177,19

1164,71-1111,67

1836,37-1762,71

1519,99-1334,48

1106,07-982,43

_____

_____

0,9944

Glutamina

1631,80-1619,77

1202,97-1183,53

1478,11-1326,42

_____

_____

0,8996


49

4. Conclusões

A transferência de calibrações entre os dois equipamentos MIR não é possível,

pois os dois equipamentos não utilizam os mesmos comprimentos de onda.

A aplicação do conceito de Métodos de Calibração Baseados em Ciência a

sistemas dinâmicos, como as culturas de células, é possível e produz Modelos robustos.

A aplicação deste método não necessita de valores ou padrões obtidos por

métodos de referência. Contudo, é necessária a caracterização precisa das condições do

início e do final do(s) processo(s) tomado(s) como referência (processos que tiveram um

comportamento esperado dentro dos padrões estabelecidos). Um exemplo disso é a

construção dos modelos de calibração que foram obtidos a partir da análise dos espectros

da terceira expansão celular, nos quais foram incluídos os espectros do momento em que

se adicionaram as células ao meio de cultura. Neste momento conheciam-se as

concentrações de glucose e glutamina, pois estas tinham sido medidas por pesagem e

adição de soluções de concentrações conhecidas.

A aplicação destes métodos apenas exige que sejam conhecidos os espectros das

amostras finais e iniciais de um processo tomado como referência (que tenha "corrido

bem") e de preferência com a captação de vários espectros da mesma amostra. Todavia,

para produtos que se formam ao longo do processo e cuja concentração não é conhecida

no final do processo, temos de recorrer a processos teóricos para "construir" um espectro

de resposta para o analito que queremos quantificar.

Com a aplicação deste conceito construímos modelos apenas com base no

conhecimento espectral, calibrando instrumentos multicanal (que geram dados

multivariados), como se de instrumentos univariados (exemplo: sensor de temperatura) se

tratasse, sem qualquer recurso à modelação estatística usual.

A monitorização das culturas de células com os modelos apresentados é rápida e

transparente para o utilizador, aliada ao facto de se usarem equipamentos de MIR

portáteis. Estas são vantagens que fazem, dos métodos aqui apresentados, um bom meio

expedito para diagnóstico e monitorização.


50

5. Perspectivas e trabalho futuro

Os métodos aqui apresentados poderiam ser melhorados, recorrendo a

equipamentos MIR de elevada resolução, pois a determinação das zonas fingerprint dos

analitos de interesse é crucial. O facto de ser possível definir zonas fingerprint com mais

comprimentos de onda permitirá que pequenas alterações no processo, eventualmente

reflectidas nos espectros obtidos, não afectem grandemente estas zonas.

Em condições ideais deveríamos ter um número de espectros por amostra do

processo que fosse da ordem de grandeza dos 10000, como é sugerido na literatura.

Contudo, como os materiais biológicos se degradam ao fim de algum tempo, deveríamos

ter um número de espectros por amostra tão elevado quanto possível. Este tipo de

métodos também pode beneficiar do facto de se elevar tanto quanto possível a frequência

de amostragem durante o processo.

Idealmente, todos os outros processos, para além do processo de referência,

podem ser usados para validação. Para verificar a robustez dos modelos obtidos poderiam

ser utilizados para validação espectros obtidos de amostras de processos em que se

fizeram variar parâmetros físicos, como, por exemplo, o volume e geometria do local de

cultura, temperatura do processo, para além da concentração inicial do analito em questão

e do arejamento (agitação) do meio de cultura. No caso de se desejar poderiam adicionar-

se ou retirar componentes de ruído extra com vista a melhorar a relação

selectividade/sensibilidade, para a aplicação pretendida.

Um outro melhoramento a ser introduzido para o aumento da sensibilidade é a

concentração das amostras antes da sua leitura no equipamento ou, em alternativa,

eliminar a influência do solvente (no caso da água). Por exemplo, "subtraindo" o espectro

da água. O facto de se "subtrair" o espectro médio da água a todos os espectros pode

deixar ainda correlações não específicas. Por exemplo no número de portes de hidrogénio

das quais depende a solubilidade dos constituintes da amostra que está relacionada com a

temperatura. Assim se a temperatura variar podemos ter uma variação significativa no

"sinal" dos nossos metabolitos de interesse.


51

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54

ANEXO I

Caracterização das expansões de monitorizadas pelo primeiro equipamento.

A B C

Ilustração 16 – Comparação entre os perfis dos metabolitos das duas expansões de células estaminais monitorizadas com o primeiro equipamento MIR-ATR. Perfil da Glucose ao longo do tempo (A); perfil do Ácido láctico ao longo do tempo (B); perfil da Glutamina ao longo do tempo (C); Expansão 1 ( ); Expansão 2 ( );

0.00

2.00

4.00

6.00

8.00

10.00

12.00

14.00

16.00

18.00

20.00

0 2 4 6 8 10

Valores previstos de concentração

de Glucose (mM)

Dias

0.00

2.00

4.00

6.00

8.00

10.00

12.00

14.00

16.00

18.00

20.00

0 2 4 6 8 10


de Lactato (mM)

Dias

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

1.60

1.80

2.00

0 2 4 6 8 10


de Glutamina(mM)

Dias


55

ANEXO II

Caracterização da expansão de monitorizada pelo segundo equipamento.

A B

C

D E

Ilustração 17 - Caracterização das expansões de monitorizadas pelo segundo equipamento MIR-ATR. Perfil da Glucose ao longo do tempo (A); perfil do Ácido láctico ao longo do tempo (B); perfil da Glutamina ao longo do tempo (C); curva de crescimento das células estaminais [Nº de células] (D); curva de crescimento das células estaminais [Log2 (Nº de células)] (E);

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Valores de concentração

de Glucose (mM)

Dias

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11


de Lactato (mM)

Dias

0.00

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11


de Glutamina(mM)

Dias

0.0E+00

1.0E+06

2.0E+06

3.0E+06

4.0E+06

5.0E+06

6.0E+06

7.0E+06

8.0E+06

9.0E+06

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Valores do número de células

Dias

15

16

17

18

19

20

21

22

23

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Valores do Log 2(nºcélulas)

Dias


56

ANEXO III

Tabela 7 – Zonas de Finguerprint para os metabolitos dissolvidos em água – medições realizadas com o segundo equipamento MIR - ATR


57

ANEXO IV

Ilustração 18 – Gráfico de uma correlação espúria que ocorre com o passar do tempo no segundo equipamento MIR-

ATR.

y = 0.0003x ‐ 0.0014R² = 0.664

0.004

0.002

0.000

0.002

0.004

0.006

0.008

0.010

0.012

0 5 10 15 20 25 30 35 40

valor da correlação espúria

tempo em minutos

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