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UNIVERSIDADE REGIONAL DO CARIRI

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA BIOLÓGICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOPROSPECÇÃO MOLECULAR

HELENICY NOGUEIRA HOLANDA VERAS

CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE

ANTIMICROBIANA E ANTIINFLAMATÓRIA TÓPICA DO ÓLEO ESSENCIAL DE

Lippia sidoides CHAM. (VERBENACEAE)

CRATO, CE

2011

1



ANTIMICROBIANA E ANTIINFLAMATÓRIA TÓPICA DO ÓLEO ESSENCIAL

DE Lippia sidoides CHAM. (VERBENACEAE)

Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de

Pós-graduação em Bioprospecção Molecular da

Universidade Regional do Cariri- URCA, como

requisito parcial para obtenção do título de Mestre

em Bioprospecção Molecular.

Orientador: Prof. Dr. Marco Antonio Botelho

Co-orientador: Prof. Dr. José Galberto Martins da Costa

CRATO, CE

2011

2

V476c Veras, Helenicy Nogueira Holanda.

Caracterização química e avaliação da

atividade antimicrobiana e antiinflamatória tópica

do óleo essencial de Lippia sidoides Cham.

(Verbenaceae). [manuscrito] / por Helenicy

Nogueira Holanda Veras. – 2011.

142 f.: il.; 29 cm.

Cópia de computador (printout).

Dissertação (Mestrado em Bioprospecção

Molecular) – Programa de Pós-Graduação em

Bioprospecção Molecular da Universidade

Regional do Cariri – URCA.

Orientador: Prof. Dr. Marco Antonio Botelho

Co-orientador: Prof. Dr. José Galberto Martins

da Costa.

1. Lippia sidoides. 2. Timol. 3. Atividade

antimicrobiana. 4. Biofilme. 5. Atividade

antiinflamatória. I. Título.

CDD: 664.02

3



ANTIMICROBIANA E ANTIINFLAMATÓRIA TÓPICA DO ÓLEO ESSENCIAL DE

Lippia sidoides Cham. (VERBENACEAE)

Dissertação submetida à Coordenação do Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em

Bioprospecção Molecular da Universidade Regional do Cariri – URCA, como requisito

parcial para obtenção do título de Mestre em Bioprospecção Molecular. Área de

concentração: Bioprospecção de Produtos Naturais.

BANCA EXAMINADORA

______________________________________________________

Prof. Dr. Marco Antonio Botelho - Orientador

Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Ceará- IFET-CE

_______________________________________________________

Prof. Dr. José Galberto Martins da Costa – Co-orientador

Universidade Regional do Cariri- URCA

_______________________________________________________

Prof. Dr. Iri Sandro Pampolha Lima -Avaliador externo

Faculdade de Medicina de Juazeiro do Norte- FMJ

_______________________________________________________

Prof. Dr. Henrique Douglas Melo Coutinho -Avaliador Interno


_______________________________________________________

Prof. Dr. Irwin Rose Alencar de Menezes – Avaliador Interno (Suplente)


4

Dedico a meus pais, Pedro Ernesto Veras e Maria Odenicy Nogueira H. Veras,

e a meus irmãos, Helaine Nogueira H. Veras e Pedro Ernesto Veras Jr,

por me apoiarem em todas as minhas escolhas e

SEMPRE acreditarem em meus projetos.

5

AGRADECIMENTOS

A Deus, inteligência suprema e causa primária de todas as coisas, obrigado Senhor

por me dar forças quando precisei, por guiar e iluminar meus caminhos!

Ao meu pai, Pedro Ernesto Veras, professor que eu admiro tanto, meu exemplo de

profissional. Sei que concluindo essa etapa estou realizando um sonho seu! À minha mãe, Mª

Odenicy Nogueira H. Veras, minha amiga, exemplo de mulher e mãe... como diz Cora

Coralina: “ Muitas vezes basta ser: colo que acolhe, braço que envolve, palavra que conforta,

silêncio que respeita, alegria que contagia, lágrima que corre, olhar que acaricia, amor que

promove”. Obrigado pelo amor incondicional e por serem responsáveis por tudo que tenho e

sou! Aos meus irmãos, Helaine Veras e Pedro Junior, por estarem sempre perto apesar de

muitos quilômetros separarem vocês de mim, obrigado pela força, carinho e incentivo! Amo

vocês!

A toda minha família, especialmente meus avós, Raimundo Hidelberto Veras da

Silva, Lirinda Maria de Souza Veras, José Holanda Guerra e meu anjo, Mª Terezinha

Nogueira Holanda (in memorian). Obrigada por serem meus pais quando precisei e por se

orgulharem dos meus estudos, essa vitória também é de vocês!

Ao meu orientador, Prof. Dr. Marco Antonio Botelho, pela irreverência, por ter me

dado esse presente que é o “alecrim pimenta”, por me ensinar a “andar com meus próprios

pés”, pelo otimismo e incentivo! Obrigado por confiar e acreditar em mim.

Ao meu co-orientador, Prof. Dr. José Galberto Martins da Costa, por ter me acolhido

no laboratório, agradeço pela pessoa que és e tenho eterna gratidão pelos ensinamentos,

dedicação, por saber elogiar e criticar do jeito e na hora certa. Obrigada por tudo!!!

À professora Msc. Fabiola Fernandes Galvão Rodrigues, pessoa muito importante

nesse trabalho, sou grata pela disponibilidade de sempre nos ajudar, pelo imenso auxílio nos

ensaios microbiológicos, pelo encorajamento transmitido e pela amizade!

Ao Prof. Dr. Irwin Rose Alencar de Menezes, pela grande ajuda nos testes

farmacológicos e pelas sugestões, sou muito grata!!! Ao Prof. Dr. Henrique Douglas Melo

Coutinho pelas sugestões nos artigos, pela amizade e pelas brincadeiras...

Às minhas queridas professoras do curso de Farmácia, Dra. Gilvandete Maria

Pinheiro Santiago, Dra. Mary Anne Medeiros Bandeira, Dra. Luzia Kalyne Almeida Moreira

Leal e Dra. Rita de Cássia Carvalho Barbosa. Obrigado por me orientarem na graduação e me

6

incentivarem para a pesquisa. Graças a vocês me encantei com as plantas medicinais e

despertei para a docência. Obrigado pela amizade!

Aos professores Dr. Iri Sandro Pampolha Lima, Dra. Marta Regina Kerntopf, Dr.

Henrique Douglas Melo Coutinho e Dr. José Galberto M. da Costa por aceitarem participar da

banca examinadora, obrigado pelas valiosas sugestões e por contribuírem para melhoria deste

trabalho!

À minha amiga Samara Alves Brito, pelo apoio, carinho, disponibilidade de sempre

me ajudar e me ouvir independente de dia e hora. Trabalhamos, nos ajudamos, rimos e

choramos, agradeço a Deus por ter colocado você na minha caminhada. Obrigado por se

preocupar sempre com minha felicidade, você é muito especial!

Aos demais membros do Laboratório de Pesquisa de Produtos Naturais (LPPN),

Aracélio Colares, Carla Karine, Eidla Mikaelle, Erlânio Oliveira, Fábio Galvão, George

Souza, Josniel Pires, Liana Oliveira, Leonardo Landim, Mário Eduardo, Manuele Eufrasio,

Samara Alves, Thiago Almeida, Stefânio Barreto e Walmir Emanuel pela ótima convivência,

receptividade e pelos momentos de descontração e amizade! A Luis Leandro da Silva (Sr.

Luis), pela ajuda nas coletas!!

Aos professores do Laboratório de Farmacologia e Química Molecular (LFQM), Dr.

Irwin Rose Alencar de Menezes e Dra. Marta Regina Kerntopf, e aos demais membros, em

especial, Mariana Késsia, pessoa fundamental na realização dos testes farmacológicos,

obrigado pela paciência, disponibilidade e amizade!

Aos professores do Programa de Pós-graduação em Biosprospecção Molecular, em

especial Prof. Dr. Diniz Maciel de Sena Júnior, Prof. Dr. José Galberto Martins da Costa,

Prof. Dr. Henrique Douglas Melo Coutinho, Prof. Dr. Irwin Rose Alencar de Menezes, Profa.

Dra. Marta Maria de Almeida Souza, Profa. Dra. Marta Regina Kerntopf, Profa. Dra. Imeuda

Peixoto Furtado e Profa. Dra. Sirleis Rodrigues Lacerda, pelos conhecimentos transmitidos!

Aos amigos do mestrado, Heloísa Ferreira, Flaviana Morais, Morgana Delfino,

Teógenes Matias, Norma Fernandes, Renata Dias, Mariana Késsia e Samara Alves por

tornarem os momentos mais divertidos e pela amizade, me orgulho em fazer parte dessa

turma!

Às coordenadoras do Programa de Pós-graduação em Biosprospecção Molecular,

Dra. Sirleis Rodrigues Lacerda e Dra. Imeuda Peixoto Furtado, às secretárias Maria Andecieli

Rolim de Brito e Maria Lenira Pereira, pela solicitude!

7

Ao Herbário Caririense Dárdano de Andrade-Lima coordenado pela Profa. Dra.

Maria Arlene Pessoa da Silva, pela identificação da espécie em estudo, e em especial, aos

amigos Ana Cleide Morais e Carlito Santos.

Aos meus amigos por entenderem minha ausência, e que apesar da distância, sempre

me dão força e torcem por mim!

À Dinalva Brito de Queiroz (Farmácia Evidence®) pelo fornecimento do timol. Ao

Prof. Dr. Sidney Goncalves Lima, da Universidade Federal do Piaui – UFPI, pela obtenção

dos espectros do óleo essencial.

Ao CNPq, FUNCAP e CAPES, pelo suporte financeiro.

8

“O Senhor fez a terra produzir os medicamentos: o homem sensato não os despreza.

Uma espécie de madeira não adoçou o amargor da água?

Essa virtude chegou ao conhecimento dos homens.

O Altíssimo deu-lhes a ciência da medicina para ser honrado em suas maravilhas;

e dela se serve para acalmar as dores e curá-las; o farmacêutico faz misturas agradáveis,

compõe ungüentos úteis à saúde, e seu trabalho não terminará,

até que a paz divina se estenda sobre a face da terra.”

Eclesiástico, 38: 4-8.

9

RESUMO

A espécie Lippia sidoides Cham. (Verbenaceae) é utilizada na medicina popular como

anti-séptico de uso local em pele e mucosas e seu efeito terapêutico é atribuído à presença de

timol. O óleo essencial das folhas de L. sidoides (OELS) e timol foram avaliados quanto à

atividade antimicrobiana, moduladora de antibióticos e antiinflamatória tópica em modelos de

edema de orelha induzidos por diferentes agentes flogísticos em camundongos Swiss. O

OELS obtido por hidrodestilação (rendimento de 1,06%) e a análise por CG/EM identificou

os principais constituintes: timol (84,9%) e p-cimeno (5,33%). Não houve diferenças no

potencial antimicrobiano entre o OELS e timol determinado pelo método de microdiluição

frente às bactérias e fungos leveduriformes originários da ATCC. A atividade moduladora por

contato direto permitiu observar que o OELS e timol reduziram a Concentração Inibitória

Mínima (CIM) da gentamicina frente à Klebsiella pneumoniae e Pseudomonas aeruginosa em

32 vezes e 4 vezes. Por outro lado, a CIM da Penicilina G foi reduzida de 128 µg/mL para 32

e 2 µg/mL quando associada ao OELS e timol, respectivamente, e houve reforço na atividade

da Ceftriaxona apenas na associação do OELS e timol frente a Enterococcus faecalis com

redução da CIM de 64 para 4 μg/mL. Verificou-se que o OELS e timol potencializaram a

atividade de todos as aminoglicosídeos testados por contato a vapor frente à P. aeruginosa e

Staphylococcus aureus e não houve diferença estatística entre a atividade do OELS e timol

contra P. aeruginosa, indicando ser este composto responsável por tal atividade frente a essa

cepa. Os resultados mais expressivos foram observados no aumento da atividade antibiótica

da gentamicina em 429,41% e 223,53% frente S. aureus, e 43,30% e 33,33% na atividade da

amicacina contra P. aeruginosa para o OELS e timol a 50% (v/v), respectivamente. O OELS

e timol foram capazes de reduzir in vitro as UFC em biofilmes de E. faecalis no tempo de

contato de 30 e 60 minutos em concentrações de 2,5 e 10%. A aplicação tópica de OELS e

timol (2 mg/orelha), reduziu significativamente (p < 0,001) em 45,1% e 47,4% o edema

induzido por AA e reduziu em 33,2% (p < 0,05) e 54,7% (p < 0,01) o edema provocado por

fenol, possivelmente reduzindo a produção de mediadores pro – inflamatórios. Além disso,

não houve diferença estatística entre a atividade antiedematogênica do OELS e timol. Os

resultados são relevantes e sugerem que o timol é o composto responsável pelas atividades

biológicas observadas pelo óleo essencial dessa espécie.

Palavras-chave: Lippia sidoides. Timol. Atividade antimicrobiana. Biofilme. Atividade

antiinflamatória.

10

ABSTRACT

The Lippia sidoides Cham. (Verbenaceae) species is used in folk medicine as an

antiseptic for local use on skin and mucous membranes. The therapeutic effect is attributed to

the presence of thymol. The essential oil of L. sidoides (LSEO) and thymol were evaluated for

antimicrobial activity, modulatory on antibiotics and topical anti-inflammatory in models of

ear edema induced by different phlogistic agents in Swiss mice. The LSEO was obtained by

hydrodistillation (yield 1.06%) and analyzed by GC / MS. The major constituents identified

were: thymol (84.9%) and p-cymene (5.33%). There were no differences in antimicrobial

activity between LSEO and thymol determined by microdilution method against bacteria and

yeast (ATCC). The synergistic activity direct showed that LSEO and thymol reduced the

minimum inhibitory concentration (MIC) of gentamicin against the Klebsiella pneumoniae

and Pseudomonas aeruginosa in 32 times and 4 times respectively. On the other hand, the

MIC of penicillin G was reduced from 128 µg/mL for 32 and 2 µg/mL when combined with

the LSEO and thymol, respectively. There was enhanced activity of ceftriaxone only the

association of LSEO and thymol against Enterococcus faecalis with a reduction in MIC from

64 to 4 µg/mL. LSEO and thymol potentiated the activity of all the aminoglycosides tested by

vapour contact to P. aeruginosa and Staphylococcus aureus and there was no statistical

difference between the activity of LSEO and thymol against P.aeruginosa, suggesting that

this compound is related for such activity. There was a increased activity of the antibiotic

gentamicin at 429.41% and 223.53% against S. aureus, and 43.30% and 33.33% in the

activity of amikacin against P.aeruginosa, for LSEO and thymol 50% (v/v), respectively. The

LSEO and thymol were able to inhibit in vitro CFU in biofilms of E. faecalis in contact time

of 30 to 60 minutes at concentrations of 2.5 and 10%. Topical application of LSEO and

thymol (2 mg/ear) significantly reduced (p <0.001) the edema induced by AA and reduced by

33.2% (p <0.05) and 54.7% (p <0.01) the edema caused by phenol. There was no statistical

difference between the antiedematogenic activity of LSEO and thymol. The results suggest

that thymol is related in biological activities observed by the essential oil of this species.

Key-words: Lippia sidoides. Thymol. Antimicrobial activity. Biofilm. Anti-inflammatory

activity.

11

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 ‒ A espécie Lippia sidoides Cham.

30

Figura 2 ‒ Estrutura química do isopreno.

38

Figura 3 ‒ Estrutura química do timol.

39

Figura 4 ‒ Produção de eicosanóides a partir do ácido araquidônico

48

Figura 5 ‒ Método de extração do óleo essencial das folhas de Lippia sidoides.

52

Figura 6 ‒ Microdiluição em caldo Brain Heart Infusion (BHI).

55

Figura 7 ‒ Visualização do crescimento após 72 h do biofilme de Enterococcus

faecalis.

56

Figura 8 ‒ Contato gasoso - Aplicação da amostra na tampa da placa.

58

Figura 9 ‒ Metodologias utilizadas para verificação de atividades biológicas do

óleo essencial de Lippia sidoides e timol.

63

Figura 10 ‒ Estruturas dos constituintes químicos identificados no óleo essencial

das folhas de Lippia sidoides Cham.

66

Figura 11 ‒ Susceptibilidade de biofilmes de E. faecalis frente a desafios

antimicrobianos a 2,5% (v/v) por 30 ou 60 minutos de contato.

83

Figura 12 ‒ Susceptibilidade de biofilmes de Enterococcus faecalis frente a

desafios antimicrobianos a 10% (v/v) por 30 ou 60 minutos de contato.

84

Figura 13 ‒ Efeito do OELS ou timol, administrados por via tópica, no edema de

orelha induzido pela aplicação única de óleo de cróton em camundongos.

87

Figura 14 ‒ Curva tempo-resposta do efeito do tratamento com OELS ou timol (2

mg/orelha) no modelo de edema de orelha induzido pela aplicação múltipla de

óleo de cróton em camundongos.

88

Figura 15 ‒ Aspecto da orelha direita de camundongos após 4 dias de tratamento

com OELS (2 mg/orelha, 2 vezes ao dia) no modelo de edema de orelha induzido

pela aplicação múltipla de óleo de cróton 5% (v/v) em acetona.

88


orelha crônico induzido pela aplicação múltipla de óleo de cróton em

camundongos.

89


orelha induzido pela aplicação de ácido araquidônico em camundongos.

91

12


orelha induzido pela aplicação intradérmica de histamina em camundongos.

91


orelha induzido pela aplicação de fenol em camundongos.

92

13

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 ‒ Atividades biológicas de espécies de Lippia no período entre 1981 a

2011.

32

Quadro 2 ‒ Atividades biológicas relacionadas ao timol no período entre 2000 a

2011.

40

14

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 ‒ Drogas e reagentes utilizados durante os procedimentos experimentais

farmacológicos.

59

Tabela 2 ‒ Constituintes químicos do óleo essencial das folhas de Lippia sidoides

Cham.

65

Tabela 3 ‒ Concentração Inibitória Mínima (CIM) do óleo essencial das folhas de

L. sidoides (OELS) ou timol, sobre cepas microbianas originárias da ATCC.

68

Tabela 4 ‒ Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Fungicida

Mínima (CFM) do óleo essencial de L. sidoides (OELS) e timol pelo método de

microdiluição em caldo, sobre cepas originárias da ATCC.

70

Tabela 5 ‒ Valores da Concentração Inibitória Mínima (CIM µg/mL) de

aminoglicosídeos na presença e ausência do óleo essencial de Lippia sidoides e

timol em concentrações subinibitórias (CIM/8) sobre cepas originárias da ATCC.

72

Tabela 6 ‒ Valores da Concentração Inibitória Mínima (CIM µg/mL) de ß-

lactâmicos na presença e ausência do óleo essencial de Lippia sidoides e timol em

concentrações subinibitórias (CIM/8) sobre cepas originárias da ATCC.

73

Tabela 7 ‒ Valores da Concentração Inibitória Mínima (CIM µg/mL) do

fluconazol na presença e ausência do óleo essencial de Lippia sidoides e timol em

concentrações subinibitórias (CIM/8) sobre cepas originárias da ATCC.

76

Tabela 8 ‒ Atividade antibacteriana dos compostos voláteis do óleo essencial de

Lippia sidoides e timol por contato gasoso.

77

Tabela 9 ‒ Modificação da atividade antibiótica de aminoglicosídeos pelos

constituintes voláteis do óleo essencial de Lippia sidoides (OELS) e timol,

utilizando o método de contato gasoso sobre Staphylococcus aureus ATCC 12624.

80

Tabela 10 ‒ Modificação da atividade antibiótica de aminoglicosídeos pelos

constituintes voláteis do óleo essencial de Lippia sidoides (OELS) e timol,

utilizando o método de contato gasoso sobre Pseudomonas aeruginosa ATCC

15442.

81

Tabela 11 ‒ Porcentagem do edema de orelha induzido por ácido araquidônico em

camundongos e o efeito inibitório médio após aplicação tópica do OELS, timol ou

indometacina (2 mg/orelha).

90

Tabela 12 ‒ Porcentagem do edema de orelha induzido por fenol em

camundongos e o efeito inibitório médio após aplicação tópica do OELS, timol (2

mg/orelha) ou dexametasona (0,08 mg/orelha).

92

15

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

% ‒ Por cento; percentual

< ‒ Menor que

= ‒ Igual a

≈ – Aproximadamente

± ‒ Mais ou menos

® ‒ Marca registrada

µg/ mL ‒ Micrograma por mililitro

µL ‒ Microlitro

µm ‒ Micrômetro

μg- micrograma

5-LOX ‒ 5- Lipoxigenase

α ‒ Alfa

a. C. – Antes de Cristo

AA ‒ Ácido Araquidônico

AINEs ‒ Antiinflamatórios não- esteroidais

AMI ‒ Amicacina

ANOVA ‒ Análise de Variância

AP-1 – Proteína Ativadora-1

ATM ‒ Antimicrobianos

ATCC ‒ American Type Culture Collection

ATP – Adenosina Trifosfato

ß ‒ Beta

BHI ‒ Brain Heart Infusion (infusão de cérebro e coração, inglês)

BLA ‒ ß-lactâmicos

C+ ‒ Controle positivo

CE – Estado do Ceará (Brasil)

CEUA ‒ Comissão de Ética no Uso de Animais

CFM ‒ Concentração Fungicida Mínima

CG/EM ‒ Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas

Cham. ‒ Chamisso

CIM ‒ Concentração Inibitória Mínima

16

CIM/8 ‒ Concentração subinibitória

CLSI ‒ Clinical and Laboratory Standards Institute

cm/seg ‒ Centímetro por segundo

cm3 ‒ Centímetro cúbico

COX ‒ Cicloxigenase

d. C. – Depois de Cristo

D/E – Dey e Engley

DEX ‒ Dexametasona

DIM ‒ Dose Inibitória Mínima

DMSO ‒ Dimetilsulfóxido

E.I.M ‒ Efeito Inibitório Médio da inflamação

E.P.M. – Erro Padrão da Média

EPS ‒ Substâncias poliméricas extracelulares

et al. ‒ E colaboradores

EUA ‒ Estados Unidos da América

eV ‒ Eletrovolt

γ ‒ Gama

g ‒ Gramas

GABAA ‒ Receptor do ácido gama aminobutírico

GEN ‒ Gentamicina

h ‒ Horas

HCDAL ‒ Herbário Caririense Dárdano de Andrade-Lima

i.d. ‒ Indicativo de densidade

i.p. ‒ Via intraperitoneal

IL ‒ Interleucina

IND ‒ Indometacina

iNOS – Óxido nítrico sintetase induzível

IR – Índice de Retenção

KPa – Quilopascal

L – Litro

LOX – Lipoxigenase

LTB4 – Leucotrieno B4

m – Metro

17

m/z – Relação massa/carga

MAPK – Proteína quinase ativada por mitógeno

ml – Mililitro

mm – Milímetro

mmHg – Milímetros de mercúrio

mod – Massa do disco retirado da orelha direita

moe – Massa do disco retirado da orelha esquerda

MPEcont – Média do percentual de edema do grupo controle negativo

MPEtrat – Média do percentual de edema do grupo tratado com OELS, timol ou fármaco

n – Número da amostra

NaCl – Cloreto de sódio

NaOCl – Hipoclorito de sódio

NEO – Neomicina

NF- kB – Nucleus factor – kappa B (Fator de transcrição nuclear – capa B)

NO – Óxido nítrico

OC – Óleo de cróton

ºC – Grau Celsius

ºC/min – Grau Celsius/min

OELS – Óleo essencial de Lippia sidoides

p – Nível de significância

P.A. – Para análise

PBP – Proteínas Ligadoras de Penicilinas

PDA – Potato Dextrose Agar (Agar batata dextrose, inglês)

PE – Percentual de edema

PG – Prostaglandina

pH – Potencial hidrogeniônico

pKa – Potencial da constante de acidez

PKC – Proteína quinase C

PLA2 – Fosfolipase A2

ROS – Reative Oxygen Species (Espécies Reativas de Oxigênio, inglês)

TNF – Tumor Necrosis Factor (fator de necrose tumoral, inglês)

TPA – 13-acetato de 12-o-tetracanoilforbol

TR – Tratamento

18

TXA2 – Tromboxano A2

UFC – Unidade Formadora de Colônias

UNIFOR – Universidade de Fortaleza

URCA – Universidade Regional do Cariri

US$ ‒ United States dollar (Dólar dos Estados Unidos, inglês)

v/v – Volume/volume

VEGF – Vascular endothelial growth factor (Fator de crescimento do endotélio vascular,

inglês)

19

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO

22

2 OBJETIVOS 25

2.1 Objetivo geral 25

2.2 Objetivos específicos

25

3 REFERENCIAL TEÓRICO

3.1 Considerações botânicas

3.1.1 Família Verbenaceae

3.1.2 O gênero Lippia

3.1.3 Lippia sidoides Cham.

3.2 Atividades biológicas do gênero Lippia

3.3 Óleos essenciais

32

32

37

29

32

37

3.4 Timol: um monoterpeno presente nas folhas de Lippia sidoides 39

3.5 Atividade antimicrobiana de produtos naturais 43

3.6 Resistência microbiana 43

3.7 Biofilme 45

3.8 Atividade antiinflamatória de produtos naturais

47

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Material vegetal 51

4.2 Obtenção do óleo essencial 51

4.3 Obtenção do timol 51

4.4 Análise química do óleo essencial 53

4.5 Atividade antimicrobiana 53

4.5.1 Cepas microbianas 53

4.5.2 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) 54

4.5.3 Determinação da Concentração Fungicida Mínima (CFM) 55

4.5.4 Avaliação da inibição de biofilmes 55

4.5.4.1 Cepa bacteriana e preparo do inóculo 55

20

4.5.4.2 Formação do biofilme 56

4.5.4.3 Substâncias testadas 56

4.5.4.5 Inibição de biofilmes 56

4.5.5 Modulação da atividade antimicrobiana 57

4.5.1 Contato direto 57

4.5.2 Contato a vapor 57

4.5.2.1 Análise estatística 58

4.6 Atividade antiinflamatória tópica através de modelos de edema de orelha

induzidos por agentes irritantes

59

4.6.1 Aspectos éticos da pesquisa 59

4.6.2 Animais 59

4.6.3 Drogas, reagentes e soluções 59

4.6.4 Edema de orelha induzido pela aplicação única de óleo de cróton 60

4.6.5 Edema de orelha induzido pela aplicação múltipla de óleo de cróton 60

4.6.6 Edema de orelha induzido por Ácido Araquidônico (AA) e fenol 60

4.6.7 Edema de orelha induzido pela injeção intradérmica de histamina 61

4.6.8 Quantificação do edema 61

4.6.9 Análise estatística dos dados

62

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Análise química do óleo essencial 65

5.2 Atividade antimicrobiana 67

5.2.1 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)- Bactérias 67

5.2.2 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração

Fungicida Mínima (CFM)- Fungos leveduriformes

69

5.3 Modulação da atividade antibiótica 71

5.3.1 Contato direto- Bactérias 71

5.3.2 Contato direto – Fungos 75

5.3.4 Contato a vapor 76

5.4 Avaliação da inibição de biofilmes 81

5.5 Atividade do óleo essencial de Lippia sidoides (OELS) e timol nos modelos de

inflamação cutânea

85

5.5.1 Edema de orelha induzido pela aplicação única de óleo de cróton 85

21

5.5.2 Edema de orelha induzido pela aplicação múltipla de óleo de cróton 86

5.5.3 Edema de orelha induzido por Ácido Araquidônico (AA) 88

5.5.4 Edema de orelha induzido por histamina 89

5.5.5 Edema de orelha induzido por fenol

89

6 CONCLUSÕES

98

7 REFERÊNCIAS 100

22

INTRODUÇÃO

______________________________________________

23

1 INTRODUÇÃO

O uso de plantas com finalidades terapêuticas vem sendo praticado a milhares de anos.

A arte dos benzedores, curandeiros e xamãs, herdada de magos e feiticeiros, pode ser vista até

hoje, em teste, nos laboratórios científicos, os quais passaram a avaliar experimentalmente a

veracidade dessas informações (DI STASI, 1996; RIOS e RECIO, 2005).

O Brasil é o país com a maior diversidade genética vegetal do mundo, contando com

mais de 55.000 espécies catalogadas de um total estimado entre 350.000 e 550.000 (SIMÕES

et al., 2003). No entanto, a riqueza e diversidade desse banco genético e biomolecular se

encontram em um estágio inicial de conhecimento (CALIXTO, 2003).

A exploração da biodiversidade brasileira pode levar a identificação de metabólitos

secundários valiosos que podem servir como fitofármacos ou conduzir ao desenvolvimento de

novos fármacos semi-sintéticos ou sintéticos. Comparado ao desenvolvimento de um novo

medicamento sintético, que envolve vultosas somas de recursos (cerca de US$ 350 milhões e

10 a 15 anos de pesquisa), o desenvolvimento de um fitomedicamento requer menos recursos,

e também menor tempo de pesquisa. Estima-se que os custos para o desenvolvimento de um

fitomedicamento não devem ultrapassar 2 a 3 % daquele previsto para o desenvolvimento de

um novo medicamento sintético (CALIXTO, 2003).

Por outro lado, nos últimos anos, há um grande interesse e aumento na procura de

produtos naturais como recursos terapêuticos. Tal fato pode estar relacionado a diversos

fatores, como: efeitos indesejáveis e prejuízos causados pelo uso abusivo e/ou incorreto de

medicamentos sintéticos; o fato de que amplas camadas da população mundial não têm acesso

aos medicamentos e à medicina institucionalizada; a consciência ecológica e a crença popular

de que o natural é inofensivo (RATES, 2001). No entanto, mesmo diante da grande

biodiversidade brasileira, ainda faltam muitos estudos para comprovar a eficácia e a segurança

desses produtos naturais (CALIXTO, 2003).

O avanço da tecnologia associado à problemática do surgimento de microorganismos

cada vez mais resistentes aos antimicrobianos convencionais, fez com que a pesquisa buscasse

novas substâncias de origem natural, com eficácia superior ou igual aos da terapêutica usual

(OESTERHELT et al., 2005). Além disso, um dos maiores problemas enfrentados é a

formação de biofilmes pelas bactérias. Organismos vivendo em comunidades como em

biofilmes, podem suportar mudanças do pH, ação de radicais de oxigênio, desinfetantes e

24

antibióticos de uma forma mais favorável do que em células vivendo de forma livre

(JEFFERSON, 2004).

Nesse contexto, a atividade antimicrobiana de uma variedade de óleos essenciais é

documentada desde 1974 (GUENTHER, 1974) e torna-se importante a avaliação da atividade

dos seus constituintes majoritários para relacionar qual o composto é responsável por tal

atividade.

Algumas plantas utilizadas popularmente como antiinflamatórias possuem considerada

atividade antimicrobiana frente a vários patógenos, pois alguns traumas que comprometem a

integridade da barreira cutânea constituem-se na principal causa de mudança de

comportamento de bactérias que fazem parte da microbiota da pele para agente etiológico em

infecções cutâneas (CAETANO et al., 2002; ZAVADINACK NETTO et al., 2008).

O gênero Lippia é conhecido por apresentar, principalmente, atividade antimicrobiana,

antiinflamatória, antioxidante e larvicida (BOTELHO et al., 2007b; MENDES et al., 2010;

DAMASCENO et al., 2011). A espécie Lippia sidoides Cham., nativa da região do semi-árido

do Nordeste brasileiro, é amplamente empregada na medicina popular como anti-séptico de

uso local em pele e mucosas e está inserida no projeto Farmácias Vivas da Universidade

Federal do Ceará (MATOS, 2000; 2002).

Tendo em vista o uso popular, bem como registros na literatura comprovando algumas

atividades biológicas apresentadas por L. sidoides, resolveu-se analisar o potencial

antimicrobiano do óleo essencial das suas folhas e do timol, seu composto majoritário, por

contato direto, a vapor e a ação frente a biofilmes, bem como a possível interferência dos

mesmos na atividade de alguns antibióticos utilizados na clínica. Além disso, foi observado se

esse produto natural foi capaz de apresentar atividade antiinflamatória tópica in vivo.

25

OBJETIVOS

______________________________________________

26

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Verificar e comparar a atividade antimicrobiana, moduladora da atividade antibiótica e

antiinflamatória tópica entre o óleo essencial de L. sidoides e seu componente majoritário,

timol, bem como investigar os possíveis mecanismos envolvidos na atividade

antiinflamatória.

2.2 Objetivos específicos

Obter o óleo essencial da espécie em estudo e caracterizá-lo quimicamente;

Verificar a Concentração Inibitória Mínima (CIM) do OELS e timol frente a bactérias

e fungos;

Avaliar e comparar o efeito modificador da atividade antibiótica de aminoglicosídeos

e ß- lactâmicos exercido pelo óleo e timol frente a bactérias Gram-positivas e Gram-

negativas;

Verificar a interferência do OELS e timol sobre a atividade do fluconazol frente a

espécies de Candida por contato direto;

Determinar a atividade antimicrobiana in vitro do OELS e timol frente a biofilmes de

Enterococcus faecalis;

Avaliar a atividade antiinflamatória do OELS e timol por via tópica através do modelo

de edema de orelha induzido por óleo de cróton (modelo agudo e crônico), ácido

araquidônico, fenol e histamina, bem como elucidar os possíveis mecanismos de ação.

27

REFERENCIAL TEÓRICO

______________________________________________

28

3 REFERENCIAL TEÓRICO

3.1 Considerações botânicas

3.1.1 Família Verbenaceae

A Família Verbenaceae compreende aproximadamente 36 gêneros e cerca de 1000

espécies de distribuição pantropical, sendo que no Brasil ocorrem 17 gêneros e 250 espécies

com potencial econômico amplamente explorado (LORENZI e MATOS, 2002; SOUZA e

LORENZI, 2005).

Segundo Gonzáles (2006), essa família é caracterizada por ervas, arbustos, árvores ou

trepadeiras lenhosas, com ramos regulares ou serreadas. As espécies possuem folhas simples,

opostas e verticiladas, margens inteiras ou serreadas. Inflorescências racemosas ou cimosas,

cabeças, tirsos, espigas ou flores solitárias, ocasionalmente envolvidas por folhas. Flores leves

e evidentemente zigomórficas; bissexuadas ou unissexuadas, cálice tubular e apresenta 5

lobos persistentes, às vezes acrescido de frutos; a corola apresenta quatro a cinco logos, às

vezes bilabiada; androceu com dois a cinco estames, anteras dorsadas, às vezes presente dois

estaminódios (Stachytarpheta) cerca da metade do tubo da corola; gineceu sincárpico, ovário

inteiro e com quatro lóculos, dois carpelos (quatro aparências), placentação axilar, um óvulo

por lóculo. O fruto é carnoso e provido de núcleo ou múltiplo decomponível em frutos

simples com duas a quatro sementes e raramente a cápsula se abre em duas partes.

Algumas espécies dessa família são utilizadas como plantas ornamentais, como por

exemplo: Petrea subserrata (viuvinha) e Lantana camara (chumbinho). Outras espécies são

utilizadas pela população como plantas medicinais, na forma de infusão, por exemplo, Lippia

alba (erva-cidreira), Stachytarpheta cayennensis (jervão) e outras (RIBEIRO et al., 1999).

3.1.2 O gênero Lippia

O gênero Lippia é um dos dois maiores da família Verbenaceae, foi primeiramente

descrito em 1.753 por Linnaeu (BRANDÃO, 2003) e inclui muitas espécies medicinais e

29

aromáticas, sendo encontrado nas Américas do Sul, Central e na África Tropical (VICCINI et

al., 2006).

O número de espécies estimado neste gênero é 160, estando a maior parte no Brasil,

México, Paraguai e na Argentina, com poucas espécies endêmicas na África. O Brasil

apresenta a maior diversidade em espécies descritas do gênero Lippia, aproximadamente 111

espécies, sendo principalmente localizadas na Cadeia do Espinhaço, em Minas Gerais e na

Chapada da Diamantina, na Bahia (SALIMENA, 2000).

Segundo Troncoso (1974), o gênero Lippia pode ser caracterizado por apresentar

plantas arbustivas ou subarbustivas, com folhas decussadas, geralmente com indumento

glandular, florescências parciais capituliformes ou espiciformes, congestas, axilares, brácteas

membranáceas ou cartáceas, verdes ou coloridas, amarelas, róseas ou vináceas, ultrapassando

ou não o comprimento das flores; flores sésseis, cálice comprimido, alado, induplicado,

membranáceo, inconspícuo, persistente no fruto; corola hipocraterimorfa, alva, rósea,

magenta, lilás ou amarelas, tubo reto ou curvo, limbo de quatro a cinco lobado, lábio superior

ou adaxial lobado, lábio inferior ou abaxial único, dois lobos laterais; quatro estames; ovário

monocarpelar, bilocular, ovulado e estigma lateral. Possui fruto dividido na maturidade em

dois mericarpos.

O amplo emprego popular de espécies deste gênero ao redor do mundo concentra-se

no tratamento de disfunções gastrointestinais ou respiratórias e hipertensão (PASCUAL et al.,

2001a). Em muitos casos, as partes utilizadas são as folhas e flores, as quais são comumente

preparadas em infusão ou decocção, mas também utilizadas oralmente ou através de

emplastros e lavagens para ferimentos (LORENZI e MATOS, 2002).

Os principais constituintes químicos encontrados nos óleos essenciais das espécies

deste gênero são: limoneno, ß-cariofileno, p-cimeno, cânfora, linalol, α-pineno e timol. Dentre

os componentes não-voláteis, foram registrados flavonóides, naftoquinonas, iridóides,

alcalóides, triterpenos e saponinas (PASCUAL et al., 2001a).

3.1.3 Lippia sidoides Cham.

Lippia sidoides Cham. (syn. L. multicapitata Mart.) (Figura 1, p. 30), popularmente

conhecida como “alecrim pimenta”, é um arbusto nativo da região do semi-árido do Nordeste

30

brasileiro, amplamente empregada na medicina popular como anti-séptico de uso local em

pele e mucosas (MATOS, 2000).

A espécie se apresenta como grande arbusto caducifólio, ereto, muito ramificado e

quebradiço, de dois a três metros de altura, próprio da vegetação do semiárido nordestino.

Possui folhas aromáticas e picantes, simples e pecioladas. Flores pequenas, esbranquiçadas,

reunidas em espigas de eixo curto nas exilas das folhas. Frutos do tipo aquênio, extremamente

pequenos, cujas sementes raramente germinam. Pode ser multiplicada por estaquia usando-se,

de preferência, os ramos mais finos. As mudas devem ser plantadas depois de bem enraizadas

(um a dois meses), com espaçamento de três a quatro metros (LORENZI e MATOS, 2002).

Após sua introdução nos programas de fitoterapia em atenção primária de saúde, passou a ser

cultivada em vários Estados (MATOS e OLIVEIRA, 1998).

O estudo fitoquímico dos extratos etanólicos de L. sidoides tem resultado no

isolamento de vários constituintes químicos, tais como: taxifolina, isolariciresinol, ácido 3-O-

acetiloleanólico, benzoato de 3,4-dihidroximetila, lapachenol, tecomaquinona, tectoquinona,

tectol, tectol acetilado, quercetina, luteolina, glicoluteolina e lippisidoquinona (COSTA et al.,

2001; 2002).

Figura 1 ‒ A espécie Lippia sidoides Cham.

Fonte: da autora.

31

O efeito terapêutico de L. sidoides tem sido atribuído principalmente à presença do

timol, substância com alto poder antimicrobiano, sendo o componente majoritário do óleo

essencial e também encontrado em extratos hidroalcóolicos (MATOS e OLIVEIRA, 1998).

Outros constituintes encontrados no óleo essencial são p-cimeno, α-terpineno e ß-cariofileno.

O estudo toxicológico pré-clínico agudo com extrato hidroalcoólico das folhas de L.

sidoides demonstrou, por via intraperitoneal em camundongos, que a DL50 encontrada foi de

0,31 mg/mL, sendo considerada pelos autores uma alta toxicidade na via e forma utilizadas

(ALMEIDA et al, 2010b).

Além de possuir um amplo potencial biológico, como será demonstrado no Quadro 1

(p. 32), alguns produtos tecnológicos já estão sendo desenvolvidos a partir dessa espécie. Um

estudo duplo-cego utilizando enxaguatório bucal sem álcool a partir do seu óleo essencial

demonstrou que houve decréscimos nos índices de placa bacteriana e gengivite (BOTELHO

et al., 2009). Em outro trabalho, foi observado que o gel composto por óleo essencial de L.

sidoides e Myracrodruon urundeuva foi eficaz na periodontite, pois além de apresentar

atividade antiinflamatória, impediu o crescimento de patógenos orais e preveniu a reabsorção

óssea alveolar (BOTELHO et al., 2007b).

Paula et al. (2011) desenvolveram e caracterizaram nanoesferas encapsuladas com

quitosana e goma de cajueiro, contendo óleo essencial de L. sidoides no seu interior, para o

controle das larvas de Aedes aegypti. Também a partir do óleo essencial foram desenvolvidos

um gel e enxaguatório bucal para o controle de cárie em crianças entre 6 e 12 anos de idade, e

comprovaram nesse experimento que ambas formulações foram bastante efetivas (LOBO et

al., 2011). No entanto, apesar do futuro promissor, a exemplo de outras espécies nativas, L.

sidoides necessita de maior número de estudos para poder gerar um fitomedicamento ou

fitoterápico cientificamente validado.

32

3.2 Atividades biológicas do gênero Lippia

As espécies desse gênero se caracterizam por possuir notáveis atividades biológicas

comprovadas cientificamente, dentre estas, a mais registrada é a atividade antimicrobiana, a

qual está associada a sua constituição química, que na grande maioria é rica em constituintes

de natureza fenólica (LEMOS et al., 1990). O Quadro 1 mostra as publicações referentes às

atividades biológicas relacionadas ao gênero Lippia no período entre 1981 a 2011. Para este

fim, foi realizada uma busca dos artigos através do portal de periódicos da CAPES, bem como

em bancos de dados: Pubmed, Scielo e Science Direct. Foram utilizados os descritores Lippia,

atividade biológica e biological activities.

Quadro 1: Atividades biológicas de espécies de Lippia no período entre 1981 a 2011.

Atividade biológica Espécies Referência

Acaricida

L. sidoides Cham.

Cavalcanti et al., 2010

Alelopática

L. sidoides Cham.

Alves et al., 2004

Anestésica em peixes

L. alba (Mill.) N. E. Brown Cunha et al., 2010

Antibacteriana

L. sidoides Cham.,

L. alba (Mill.) N. E. Brown,

L. dulcis Trevir, L. formosa T. S.

Brandegee, L. gracilis H.B.K.,

L. grandifolia Hochst.,

L. javanica (N.L. Burm.) Spreng,

L. microphylla Cham.,

L. nodiflora (L.) Michx.,

L. palmeri S. Wats. var. palmeri,

Lemos et al., 1990;

Cáceres et al., 1991;

Dimayuga e Keer Garcia,

1991; Lemos et al., 1992;

Kunle et al., 2003;

Bassole et al., 2003;

Manenzhe et al.; 2004;

Oskay et al., 2005;

(Cont.)

33

Antibacteriana

L. ukambensis Vatke,

L. graveolens H.B.K.,

L. origanoides H.B.K, L. chevalieri

Moldenke, L. triphylla (L'Her) O.

Kuntze, L. wilmsii H. H. W. Pearson;

L. gracilis H.B.K.;

L. multiflora Moldenke

Pessoa et al., 2005.;

Botelho et al., 2007;

Oliveira et al., 2007;

Mevy et al., 2007;

Sánchez et al., 2010;

Shikanga et al., 2010;

Reis et al., 2011

Anticonvulsivante

L. alba (Mill.) N. E. Brown

Viana et al., 2000

Antidiarréica


Heinrich et al., 1992

Antiespasmódica

L. sidoides Cham., L. grata Schauer,

L. chamissonis D. Dietr., L. dulcis

Trev.

Souza Brito e Souza

Brito, 1993;

Görnemann et al., 2008

Antifúngica

L. sidoides Cham., L. palmeri S.

Wats, L. multiflora

Moldenke, L. rugosa A. Chev.,

L. scaberrima Sond., L. alba (Mill.)

N. E. Brown,

L. rehmannii H.Pearson

Duarte et al., 2005;

Fontenelle et al., 2007;

Tatsadjieu et al., 2009;

Regnier et al., 2008,

2010; Shukla et al., 2009;

Linde et al., 2010

Anti-helmíntica

L. sidoides Cham.

Camurça-Vasconcelos et

al., 2007, 2008

(Cont.)

(Cont.)

34

Anti-hipertensiva

L. sidoides Cham.,

L. multiflora Moldenke,

L. chamissonis D. Dietr.

Pham Huu Chanh et al.,

1988; Souza Brito e

Souza Brito, 1993

Antiinflamatória/

Analgésica


L. geminata H.B.K,

L. citriodora (Ort.) H.B.K,

L. gracillis Schauer,

L. sidoides Cham., L. dulcis Trevir,

L. multiflora Moldenke

Slowing Barillas, 1992;

Abena et al., 2003;

Girão et al., 2003;

Pérez et al., 2005;

Monteiro et al., 2007;

Mendes et al., 2010;

Guilhon et al., 2011

Antimalárica

L. multiflora Moldenke, L. chevalieri

Moldenke, L. javanica (N.L. Burm.)

Spreng.

Gasquet et al., 1993;

Valentin et al., 1995;

Mallie e Bastide, 1995;

Clarkson et al., 2004

Antimutagênica


Ramos et al., 2003

Antioxidante

L. nodiflora Mich., L. graveolens

H.B.K., L. berlandieri v. Schauer,


L. sidoides Cham., L. multiflora

Moldenke; L. microphylla Cham.,

L. javanica (N.L. Burm.) Spreng,

L. wilmsii H.H.W Pearson,

L. schomburgkiana Schauer,

L. grandis Schauer

Stashenko et al., 2004;

David et al.; 2007; Rocha-

Guzmán et al., 2007;

Silva et al., 2009; ,

Almeida et al., 2010a;

Ashokkumar et al., 2010;

Olivero-Verbel et al.,

2010; Sanchéz et al.,

2010, Shikanga et al.,

2010; Arthur et al., 2011;

Damasceno et al., 2011

(Cont.)

(Cont.)

35

Antiulcerogênica

L. alba (Mill.) N. E. Brown Pascual et al., 2001b

Antiviral



L. citriodora (Ort.) H.B.K.

Abad et al., 1999;

Andrighetti-Frohner et al.,

2005; Ocazionez et al.,

2010

Cardioestimulante

L. sidoides Cham. Gilbert et al., 2005

Citotóxica


Costa et al., 2004

Conservante de

alimentos

L. berlandieri Schauer Sosa et al., 2010

Escabicida

L. multiflora Moldenke Oladimeji et al., 2005

Gastroprotetora

L. sidoides Cham.

Monteiro et al., 2007

Larvicida/ repelente

L. ukambensis Vatke, L. wilmsii H.

H. W. Pearson, L. somalensis Vatke,

L. javanica (N.L. Burm.) Spreng.,

L. grandifolia Hochst., L. dauensis

(Chiov.) Chiov., L. gracillis H.B.K.,

L. sidoides Cham.

Mwangi et al., 1992;

Govere et al., 2000;

Carvalho et al., 2003;

Costa et al., 2005;

Silva et al., 2008

(Cont.)

(Cont.)

36

Leishmanicida

L. sidoides Cham.

Medeiros et al., 2011

Moduladora da

atividade de antibióticos

L. sidoides Cham. Oliveira et al., 2006

Moluscicida

L. sidoides Cham., L. aristata

Schauer, L. gracillis H.B.K.

Craveiro et al., 1981;

Teles et al., 2010

Neuroléptica

L. microphylla Cham.

Omena, 2007

Preventiva da

reabsorção do osso

alveolar

L. sidoides Cham.

Botelho et al., 2007

Sedativa


Vale et al., 1999

Tóxica frente à Artemia

salina ou

A. franciscana

L. microphylla Cham., L. gracillis

Schauer, L. alba (Mill.) N. E. Brown,

L. schomburgkiana Schauer,


L. grandis Schauer

Ajaiyeoba et al., 2006;

David et al., 2007; Silva

et al., 2009; Teles et al.,

2010; Olivero-Verbel et

al., 2010; Damasceno et

al., 2011

(Cont.)

37

3.3 Óleos essenciais

Os óleos essenciais (também denominados óleos etéreos ou essências) são misturas

complexas de substâncias voláteis, lipofílicas, geralmente odoríferas e líquidas, que podem

ser obtidos de várias partes da planta (flores, folhas, galhos, cascas, frutos, raízes, etc.)

(SIMÕES et al., 2003). Desde a antiguidade, os óleos essenciais são utilizados como

perfumes, flavorizantes e conservantes (BAUER e GARBE, 2001). O método de

hidrodestilação para extração de óleos essenciais foi realizada pela primeira vez no Oriente

(Egito, Pérsia e Índia) (LAVABRE, 1992).

A composição química desses óleos contidos em diferentes espécies é bastante

complexa e sofre influência tanto do material genético da planta, quanto das condições de

cultura e desenvolvimento (tipo de solo e clima), assim como de colheita e o processamento

pós-colheita (parte da planta da qual é extraído, horário e época do ano) (LAVABRE, 1992).

São conhecidos cerca de 3.000 óleos essenciais, dos quais 300 são

comercialmente importantes, especialmente para as indústrias farmacêutica,

agronômica, alimentícia, e principalmente para fabricação de cosméticos e perfumes

(BAKKALI et al., 2008). Drogas vegetais ricas em óleos essenciais são empregadas in natura

para a preparação de infusões e/ou sob a forma de outras preparações simples. Podem ser

utilizados na indústria farmacêutica para síntese de vitaminas, hormônios, antibióticos e

antissépticos (BRUNETON, 1995).

Os constituintes químicos dos óleos essenciais variam desde hidrocarbonetos

terpênicos, alcoóis simples e terpênicos, aldeídos, cetonas, fenóis, ésteres, éteres, óxidos,

peróxidos, furanos, ácidos orgânicos, lactonas, cumarinas, até compostos com enxofre. Na

mistura, tais compostos apresentam-se em diferentes concentrações, onde um deles é o

compostos majoritário, existindo outros em menores concentrações e alguns em baixíssimas

quantidades (traços) (SIMÕES et al., 2007).

Os terpenos constituem uma grande variedade de substâncias vegetais, que derivam de

unidades do isopreno (Figura 2, p. 38). A classificação dos terpenos é feita pelo número de

ligações de unidades de isopreno, onde o número de unidades incorporadas em determinado

terpenóide hidrocarbônico insaturado serve de base para esta classificação. Os compostos

terpênicos mais freqüentes nos óleos voláteis são os monoterpenos (cerca de 90 % dos óleos

voláteis) e os sesquiterpenos. Os monoterpenos são compostos de duas unidades e tem

38

fórmula molecular C10H16; os sesquiterpenos contêm três unidades e sua fórmula molecular é

C15H24. (SIMÕES et al., 2007).

Figura 2 ‒ Estrutura da unidade isopreno

Os terpenos possuem um largo espectro de ações biológicas, vários foram isolados e

avaliados quanto à toxicidade frente aos insetos. A grande maioria de trabalhos científicos que

se referem à terpenóides com atividade inseticida faz referência à capacidade de inibir ou

retardar o crescimento, danos na maturação, redução da capacidade reprodutiva, supressores

de apetite, podendo levar os insetos à morte por inanição ou toxicidade direta (NDUMU et al.,

1999; BRUNO et al., 1999; NAKATANI et al., 2000).

Tem sido estabelecido cientificamente que cerca de 60% dos óleos essenciais possuem

propriedades antifúngicas e 35% exibem propriedades antibacterianas (BHAVANANI e

BALLOW, 1992). Penicillium digitatum, Penicillium italicum, Penicillium expansum, e

Geotrichum, os principais fungos responsáveis pela deterioração pós-colheita de maçã, foram

inibidos com vapor de citral e seus isômeros: geranial e neral (VENTURINI et al., 2002;

WURYATMO et al., 2003).

Outros monoterpenos como citronelal, L-carvona, isopullegol e α-pineno inibiram o

crescimento de fungos que causam contaminação em frutas como banana, mamão e abacaxi,

como Colletotrichum musae, Colletotrichum gloeosporioides e Fusarium subglutinans

(GARCIA et al., 2008). O óleo essencial de Malaleuca alternifolia tem como constituinte

majoritário o monoterpeno terpinen-4-ol, e atribuem a esse composto o amplo espectro da

atividade antibacteriana (TOGASHI et al., 2008).

Muitas espécies de Lippia contém monoterpenos como constituintes majoritários dos

óleos essenciais que exibem uma variedade de atividades biológicas, sendo o timol, carvacrol,

citral e p-cimeno os compostos mais freqüentemente encontrados e responsáveis pelas

atividades biológicas observadas.

C5H8

39

3.4 Timol: um monoterpeno presente nas folhas de Lippia sidoides

O timol (Figura 3) é um monoterpeno fenólico, e é isômero do carvacrol. É encontrado

no óleo essencial das folhas de L. sidoides e nos extratos hidroalcoólicos (MATOS, 2000).

Também foi verificada sua presença em outras espécies do gênero Lippia e em espécies tais

como: Thymus vulgaris, Conobea scoparioides, Origanum compactum, Origanum vulgare e

Satureja montana.

Foi descoberto por Caspar Neumann em 1719 e purificado em 1853, por M.

Lallemand, o qual atribuiu o nome "timol" (King's American Dispensatory, 1868). Possui

fórmula C10H14O; massa molar 150, 2176; ponto de fusão 51,5°C; ponto de ebulição 232,5°C;

pKa 10,62; solubilidade em água 900 mg/L; pressão de vapor 0,0376 mmHg a 25°C;

densidade 0.974 g/cm3

(United States National Library of Medicine).

O timol tem sido encontrado em formulações de cremes e anti-sépticos bucais

(Euthymol® e Listerine

®), pomadas descongestionantes (Vick

®), pastilhas que aliviam tosse e

irritação da garganta (Valda®

), adesivos antiinflamatórios (Salonpas®) e como anti-séptico

para higienização bucal de cães e gatos (Gelsept®

).

Figura 3 ‒ Estrutura química do timol

Foi realizado um levantamento sobre as publicações referentes às atividades biológicas

relacionadas ao timol no período entre 2000 a 2011 utilizando os seguintes descritores: timol,

thymol, atividade biológica e biological activities (Quadro 2, p. 40). Foram incluídos os

trabalhos que utilizaram o timol sintético bem como as espécies que o continham como

componente majoritário do óleo essencial das folhas. A maioria das publicações citou o timol

como a substância responsável pela atividade antimicrobiana frente às bactérias Gram-

positivas, Gram-negativas e fungos, atividade larvicida e antioxidante.

OH

40

Quadro 2 ‒ Atividades biológicas relacionadas ao timol no período entre 2000 a 2011.

Atividade Espécie/ Sintético Referência

Antibacteriana

Thymus vulgaris L.,

Origanum vulgare L.,

L. chevalieri Moldenke,

L. multiflora Moldenke ,

Satureja montana L.,

Carum copticum Benth. &

Hook; Oliveria decumbens

Vent; Pulicaria odora L.;

Thymus hyemalis Lange;

Thymus zygis L.,

L. sidoides Cham.,

L. multiflora

Moldenke; Sintético

Juliano et al., 2000; Bassole

et al., 2003; Nostro et al.,

2004, 2007; Hanbali et al.,

2005; Amin et al., 2005;

Nazer et al., 2005; Chung et

al., 2006; Kobilinsky et al.,

2007; Lebert et al., 2007;

Michiels et al., 2007;

Botelho et al., 2007a,b; Rota

et al., 2008; Cávar et al.,

2008; Oroojalian et al.,

2010; Rivas et al., 2010;

Soković et al., 2010; Rúa et

al., 2011

Antifúngica/

anti-micotoxina

T. vulgaris L., Satureja

hortensis L.,

Trachyspermum copticum

L., L. sidoides Cham.,

Sintético

Daferera et al., 2000;

Vázquez et al., 2001; Pina-

Vaz et al., 2004; López-

Malo et al., 2005; Svircev et

al., 2007; Fontenelle et al.,

2007; Razzaghi-Abyaneh

et al., 2008; Rasooli et al.,

2008; Dalleau et al., 2008;

Dambolena et al., 2011

Antiinflamatória/analgésica

L. gracillis Schauer,

Origanum ehrenbergii

Boiss, L. sidoides Cham.

Loizzo et al., 2009;

Monteiro et al., 2009;

Mendes et al., 2010

(Cont.)

41

Antioxidante

Conobea scoparioides

(Cham. & Schltdl.) Benth,

L. grandis Schauer,

Thymus praecox subsp.

skorpilii (Velen.) Jalen var.

skorpilii, Clinopodium

vulgare L., Origanum

syriacum L., Origanum

ehrenbergii Boiss, Thymus

longicaulis C. Presl subsp.

longicaulis var.

longicaulis, Origanum

vulgare L., Satureja

montana L., Sintético

Milos et al., 2000; Tepe et

al., 2007; Cavar et al., 2008;

Loizzo et al., 2009; Rebelo

et al., 2009; Sarikurkcu et

al., 2010; Damasceno et al.,

2011; Rúa et al., 2011; Ozen

et al., 2011

Citotóxica

Sintético

Chang et al., 2000

Clastogênica

Sintético

Someya et al., 2008

Escabicida

Sintético

Toloza et al., 2006

Genotóxica

Sintético

Buyukleyla e

Rencuzogullari, 2009

Inibidora da formação de

peroxinitrito

Sintético

Prieto et al., 2007

Inibidora da reabsorção óssea

L. sidoides Cham.,

Sintético

Mühlbauer et al., 2003;


(Cont.)

(Cont.)

(Cont.)

42

Larvicida/ repelente

Thymus vulgaris L.,

L. sidoides Cham.,

Thymus satureioides Coss.,

Sintético

Carvalho et al., 2003;

Novelino et al., 2007; Knio

et al., 2008; Pavela et al.,

2009; Regnier e

Combrinck, 2010a; Kim et

al., 2010; Zahran e

Abdelgaleil, 2011

Inibidora da reabsorção óssea

L. sidoides Cham.,

Sintético

Mühlbauer et al., 2003;


Moduladora do receptor

GABAA

Sintético

García et al., 2006

Moduladora de antifúngicos:

fluconazol e anfotericina B

Thymus broussonetii Boiss

Saad et al., 2010

Moluscicida

Origanum compactum

Benth, Sintético

Lahlou e Berrada, 2001;

Ferreira et al., 2009

Sinergismo com

vancomicina frente à

Staphylococcus aureus

Zataria multiflora Boiss

Mahboubi e Bidgoli, 2010

Sinergismo com carvacrol,

ácido lático e ácido acético

frente a S. aureus

Sintético

Oliveira et al., 2010

(Cont.)

(Cont.)

(Cont.)

43

3.5 Atividade antimicrobiana de produtos naturais

Muito antes da descoberta da existência de microorganismos, as idéias de que certas

plantas possuíam atividade cicatrizante e de que elas continham o que se podia caracterizar

como “princípios antimicrobianos” eram muito bem aceitas. Desde a antiguidade, o homem

utiliza as plantas para tratar doenças infecciosas e até hoje, algumas delas são incluídas como

parte do tratamento de várias enfermidades (RIOS e RÉCIO, 2005).

A atividade antimicrobiana de plantas medicinais tem sido pesquisada em diversas

espécies e registrada em muitos países que possuem uma flora diversificada e uma rica

tradição na sua utilização como Brasil, Cuba, Índia, México e Malásia (NASCIMENTO et al.,

2000; DI STASI et al., 2002).

Os principais produtos vegetais que possuem atividade antimicrobiana são os extratos,

os óleos essenciais, as frações látex e as proteínas (MATOS, 2000). Esses produtos naturais

são considerados pelas comunidades uma alternativa para aliviar e até mesmo curar processos

infecciosos e constituem uma importante fonte de novos compostos biologicamente ativos

(BASTOS, 2007).

3.6 Resistência microbiana

A resistência aos antimicrobianos é um fenômeno genético relacionado à existência de

genes contidos no microorganismo que codificam diferentes mecanismos bioquímicos que

impedem a ação das drogas (TAVARES, 1996). Uma bactéria é dita resistente a um

determinado antibiótico quando é capaz de crescer, in vitro, na presença da concentração

inibitória mínima que essa droga atinge no sangue (TAVARES, 2002). De acordo com

Tóxica frente à

Artemia salina

L. grandis Schauer,

C. scoparioides (Cham. &

Schltdl.) Benth

Rebelo et al., 2009;

Damasceno et al., 2011

(Cont.)

44

European Comittee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST), um microorganismo é

considerado resistente quando existe uma alta probabilidade de falha na terapêutica

(MACGOWAN, 2008)

Apesar da disponibilização de novos antibióticos, o ritmo de desenvolvimento da

resistência bacteriana nos diferentes patógenos, Gram-positivos e negativos, representa um

constante desafio terapêutico. A seleção de antibióticos eficazes tem se tornado uma tarefa

difícil e desafiadora (ROSSI e ANDREAZZI, 2005).

Nesse sentido, a diversidade de moléculas encontradas em plantas faz das mesmas

fontes promissoras de novos agentes antimicrobianos (ESTEVAM et al., 2009). Óleos

essenciais extraídos de plantas medicinais há muito tempo têm servido de base para diversas

aplicações na medicina popular, entre elas, a produção de anti-sépticos tópicos. Muitos

estudos confirmam a atividade antimicrobiana de produtos naturais, tais como o óleo essencial

de Zanthoxylum rhoifolium (COSTA et al., 2008), Lippia alba (AGUIAR et al., 2008), entre

outros.

Segundo Daferera et al. (2003) o uso de óleos essenciais, como agentes

antimicrobianos, oferece um baixo risco de desenvolvimento de resistência microbiana, pois

sendo misturas de diferentes compostos, sua atividade antimicrobiana pode estar relacionada a

diferentes mecanismos de ação, o que dificulta a adaptação dos microrganismos.

Os compostos fenólicos presentes nos óleos essenciais têm propriedades

antibacterianas, bem como as propriedades antifúngicas e antivirais (RUSSEL et al., 1996). O

fenol foi utilizado há muito tempo como anti-séptico para feridas, mas atualmente seu uso se

tornou estrito apenas para desinfecção de superfícies em ambientes hospitalares, pois o

mesmo causa irritação na pele e danos teciduais (PAULI, 2001; RODRIGUES PÉREZ et al.,

2007). Dentre os monoterpenos fenólicos que possuem pronunciada atividade antimicrobiana,

podemos citar o timol, carvacrol, ß e γ- tujaplicina (PAULI, 2001).

A associação entre antimicrobianos tornou-se uma alternativa para o sucesso na

terapia frente aos patógenos resistentes, como ß- lactâmicos e inibidores da ß-lactamase. Os

produtos naturais também podem interagir com antibióticos modificando sua atividade, seja

potencializando ou antagonizando a ação dos mesmos. Alguns estudos comprovam a

modificação da atividade de aminoglicosídeos. Os componentes voláteis do óleo essencial de

Zanthoxylum articulatum aumentam a atividade antibiótica da gentamicina frente à

Pseudomonas aeruginosa (RODRIGUES et al., 2010) e os extratos de Cordia verbenaceae

45

diminuíram a concentração inibitória mínima frente à Escherichia coli e S. aureus

multirresistentes (MATIAS et al., 2010).

Os terpenos presentes nos óleos essenciais atuam sobre as estruturas da membrana

celular, causando danos às células (SIKKEMA, BONT e POOLMAN, 1994). Um estudo feito

por Togashi et al. (2008), demonstrou que o terpeno farnesol, presente no óleo essencial de

Melaleuca alternifolia, possui atividade antibacteriana frente à Staphylococcus aureus, cujo

mecanismo de ação envolve danos na membrana celular dessa bactéria. O farnesol, em

associação com outros dois terpenos, geraniol e geranilgeraniol, possui um efeito inibitório

maior contra a bactéria do que quando utilizado sozinho.

Então, diante da crescente resistência aos antimicrobianos, torna-se necessário o

estudo de novos produtos com propriedades antimicrobianas para serem utilizadas no combate

a esses microorganismos.

3.7 Biofilme

O biofilme é uma comunidade estruturada de células bacterianas embebidas em uma

matriz de substâncias poliméricas extracelulares (EPS) e aderida a uma superfície inerte ou

viva (COSTERTON et al., 1999). Biofilmes podem colonizar implantes como válvulas

cardíacas, cateteres e alguns tecidos corpóreos, como dentes e gengivas, pulmões, ouvidos,

trato urogenital, entre outros (STEWART e COSTERTON, 2001). Dentre as bactérias que são

responsáveis pela formação de biofilme podemos citar: Escherichia coli, Staphylococcus

aureus, Streptococcus mutans, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, dentre outras

(YOSHIDA e KURAMITSU, 2002; ABDULLAH et al., 2005; ANTUNES et al., 2007;

TIBA et al., 2009; FREITAS et al., 2010).

As vantagens de uma célula bacteriana em se encontrar contida num biofilme são

numerosas, principalmente no que diz respeito à proteção contra agentes agressivos. Além de

ser resistentes a desinfetantes e antibióticos, os biofilmes demonstram também resistência à

radiação UV, à desidratação (a matriz de EPS é altamente hidratada) e a predadores como

protozoários (ELASRI e MILLER 1999; XAVIER et al., 2003)

Os Enteroccocus são cocos Gram-positivos que geralmente se dispõem aos pares e em

curtas cadeias, e são catalase negativos (MURRAY et al., 2005). A habilidade de formação de

biofilme por esse gênero permite a colonização de superfícies inertes e biológicas, protege

46

contra agentes antimicrobianos e ação de fagócitos, mediando adesão e invasão de células do

hospedeiro (BALDASSARRI et al., 2005).

Inicialmente, a colonização ou infecção por E. faecalis ocorre pela aderência e

formação de biofilme nas células epiteliais e a produção de hemolisina, lipase, caseinase que

atuam como fatores de virulência (FURUMURA et al., 2006). A citolisina, proteína de

superfície de enterococos, gelatinase e substância de agregação são outros fatores de

virulência relacionados ao E. faecalis (COBURN e GILMORE, 2003; KRITISH et al., 2004),

sendo que a proteína de superfície de enterococos aumenta a formação do biofilme

(TENDOLKAR et al., 2004).

Essa bactéria é uma das mais resistentes aos antimicrobianos no trato gastrointestinal e

é conhecida por causar infecções crônicas devido à formação de biofilme (CÂNDIDO et al.,

2010). É a mais comum e, ocasionalmente, a única bactéria mais freqüentemente isolada de

canais radiculares de dentes com lesões periapicais persistentes (RÓÇAS et al., 2004).

Diante disso, trabalhos são desenvolvidos no sentido de verificar a eficácia de

produtos naturais no controle de biofilmes. A maioria desses estudos se referem ao controle

do biofilme dental (placa bacteriana), como o gel e extrato de Punica granatum (romã)

(SALGADO et al., 2006; ALSAIMARY, 2009), L. sidoides (alecrim pimenta) (BOTELHO et

al., 2009), Coffea arabica (café) (LANDUCCI et al., 2003) e extrato de Rheedia brasiliensis

(bacupari) (ALMEIDA, 2008).

Assim, óleos essenciais ou substâncias isoladas de plantas medicinais ou de outros

produtos encontrados na natureza podem ser pesquisados como alternativas terapêuticas para

reverter à resistência aos antimicrobianos, para o controle de patógenos causadores de

infecções, bem como no controle de biofilmes microbianos.

47

3.8 Atividade antiinflamatória de produtos naturais

O processo inflamatório está envolvido em diversas patologias, tais como contusões,

tendinites, infecções respiratórias, asma e doenças auto-imunes. Apresenta-se como um

mecanismo de defesa do organismo, cujo objetivo é a eliminação da causa inicial da lesão

celular, provocada por patógenos ou por ação de agentes físicos (COTRAN et al., 2000).

Nos antigos papiros egípcios (≈ 3000 a.C.) já constavam registros das características

clínicas deste processo. Os sinais cardinais da inflamação foram descritos na era clássica por

Aulus Celsus (30 a.C. – 38 d.C.): rubor (eritema), calor (temperatura elevada), tumor (edema)

e dor. Um quinto sinal, perda da função, foi acrescentado por Rudolf Virchow. No século

XVIII, Jonh Hunter verificou a dilatação dos vasos sanguíneos e Julius Cohnhein associou

inflamação à emigração de leucócitos através das paredes da microvasculatura. No final do

século XIX, Eli Metchnikoff enfatizou o papel da fagocitose no processo inflamatório,

enquanto a importância dos mediadores químicos foi descrito posteriormente por Thomas

Lewis em 1927 (WEISSMAN, 1992; MURPHY e WARD, 2006).

De acordo com o tempo de permanência do processo inflamatório no organismo, a

inflamação pode ser aguda, a qual se observa uma resposta rápida a um agente nóxico de

modo que ocorra uma estimulação na síntese de mediadores de defesa e o direcionamento dos

mesmos ao local da lesão. Na inflamação crônica, o processo pode se prolongar por períodos

mais extensos e está associada com outros processos de alterações histológicas como fibrose e

necrose do tecido afetado, proliferação de vasos sanguíneos e, principalmente, a participação

de linfócitos e macrófagos (COLLINS, 1999; MCDONALD et al., 1999).

As substâncias endógenas que modificam bioquímica e fisiologicamente a estrutura do

local afetado pelo processo inflamatório são geralmente chamadas de mediadores. Os

principais mediadores envolvidos na inflamação incluem histamina, serotonina bradicinina,

metabólitos do ácido araquidônico (AA) (Figura 4, p. 48), citocinas, neuropetídeos, óxido

nítrico (NO), espécies reativas de oxigênio (ROS), dentre outros (RANG et al., 2007).

Inicialmente, estes mediadores são liberados no local onde se deflagrou o processo. Os

macrófagos locais sinalizam a presença de material estranho ou lesão através destes

mediadores e/ou citocinas que irão recrutar células circulantes (leucócitos polimorfonucleares,

macrófagos, eosinófilos, linfócitos) que apresentam um papel amplificador no processo

(FERREIRA, 1993).

48

Figura 4: Produção de eicosanóides a partir do ácido araquidônico.

Adaptada de Krummer e Coelho (2002).

A pele é a primeira linha inata de defesa contra muitos invasores microbianos e é

dividida, basicamente, em duas camadas principais, a derme e a epiderme, separadas por uma

fina membrana basal. A maioria das funções de defesa da epiderme localiza-se no estrato

córneo, que limita a colonização por patógenos devido ao baixo teor de água, pH ácido,

presença de microflora residente normal, bem como lipídios e peptídeos antimicrobianos de

superfície (ELIAS, 2007).

Injúrias externas à epiderme podem provocar inflamação por estimular a produção de

citocinas pelos queratinócitos. Após ruptura aguda da barreira epidérmica, ocorre aumento na

expressão de interleucina-1 (IL-1), fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e interleucina-6 (IL-

6), os quais são potentes mitógenos epiteliais e estimuladores da síntese de lipídios. Essas

citocinas parecem ser fundamentais para o reparo da barreira cutânea. No entanto, se a ruptura

da barreira é prolongada com aumento crônico na produção de citocinas, poderá ocorrer um

efeito prejudicial sobre a inflamação e a proliferação epidérmica (PROKSCH; BRANDNER e

JENSEN, 2008).

As dermatites são dermatoses inflamatórias mediadas por fatores imunológicos locais

ou sistêmicos, embora as causas de muitas delas permaneçam desconhecidas. Em geral, as

Fosfolipídeos de membrana

Estímulo físico,

químico, inflamatório Fosfolipase A2

Ácido araquidônico

Lipooxigenases Ciclooxigenases

Prostaglandinas e

Tromboxanos

Leucotrienos

49

lesões agudas permanecem por alguns dias a semanas e se caracterizam por inflamação,

edema e, em algumas, lesão epidérmica, vascular e subcutânea (MURPHY, 2006).

Plantas que são utilizadas tradicionalmente na cicatrização, febre, infecção, edema ou

doenças reumáticas são indicadores da presença de compostos com propriedades

antiinflamatórias e, assim, devem ser investigadas e a sua eficácia comprovada. A evolução

no entendimento dos aspectos moleculares da fisiopatologia da inflamação favoreceu o

estabelecimento de novos sistemas de testes para a seleção de diversas substâncias que

permitem a identificação de novos compostos antiinflamatórios (CARVALHO, 2004).

O screening de compostos com propriedades antiinflamatórias é possível graças a uma

infinidade de técnicas in vitro (cultura de células e dosagem de mediadores inflamatórios;

inibição de enzimas) e in vivo (indução de inflamação por substâncias denominadas agentes

flogísticos ou irritantes em modelos animais variados), amplamente utilizados na pesquisa

pré-clínica (SARAIVA, 2009).

A indução de edema em orelhas de camundongos por diferentes substâncias irritantes

oferece uma boa avaliação sobre a eficácia de produtos naturais e outras drogas sobre o

processo inflamatório tópico. Esse modelo possui muitas vantagens, tais como: rapidez e

simplicidade; reprodutibilidade e baixa possibilidade de erro (GÁBOR, 2000).

Plantas utilizadas na medicina tradicional demonstraram potencial antiinflamatório

tópico in vivo, tais como o óleo-resina de Copaifera duckei (copaíba) (CARVALHO et al.,

2005), óleos das sementes de Helianthus annus (girassol) e Vitis vinifera (uva) (NABAS et

al., 2009) e extrato acetato de etila obtido das folhas de Memecylon edule (NUALKAEW et

al., 2009).

A aplicação tópica do extrato hidroalcóolico e frações de Serjania erecta (cipó-cinco-

folhas) revelaram atividade significativa sobre o processo inflamatório, causando uma

redução dose-dependente do edema de orelha induzido por óleo de cróton. Além disso, houve

diminuição da atividade da mieloperoxidase tissular, parâmetro indicativo do influxo de

polimorfonucleares. As frações diclorometano, acetato de etila e hexânica demonstraram

inibição máxima de 81%, 78% e 83% para o edema de orelha e 56%, 52% e 69% para

atividade da mieloperoxidase, respectivamente (GOMIG et al., 2008).

Os resultados promissores encontrados nesses estudos demonstram possibilidades da

utilização de plantas medicinais e seus metabólitos secundários como agentes

antiinflamatórios tópicos.

50

MATERIAL E MÉTODOS

______________________________________________

51

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Material vegetal

As folhas de Lippia sidoides foram coletadas no mês de Agosto/2010, às 13 h no

Horto de Plantas Medicinais e Aromáticas da Universidade Regional do Cariri (URCA), em

Crato (CE). Uma amostra representativa da espécie encontra-se depositada no Herbário

Caririense Dárdano de Andrade-Lima (HCDAL) do Departamento de Ciências Biológicas

(URCA), sob registro nº 3038.

4.2 Obtenção do óleo essencial

O óleo essencial foi obtido utilizando-se o sistema de hidrodestilação em aparelho tipo

Clevenger modificado por Gottlieb (1960). As folhas frescas de L. sidoides foram colocadas

em balão de vidro de 5 L, acrescida de 3 L de água destilada e aquecidas por 2 h. Após esse

período, a mistura água/óleo obtida foi separada, tratada com sulfato de sódio anidro, filtrada

e o óleo obtido (OELS) foi mantido sob refrigeração até o momento das análises (Figura 5, p.

52).

4.3 Obtenção do timol

O timol foi obtido através da Farmácia de Manipulação Evidence, marca Sigma-

Aldrich (St. Louis-EUA).

52

Figura 5 ‒ Método de extração do óleo essencial das folhas de Lippia sidoides Cham.

Folhas frescas

Hidrolato Óleo/Água

Separação

Solução aquosa Óleo

1. Sulfato de sódio anidro

2. Filtração

Extração em doseador tipo Clevenger

Óleo essencial

Identificação

53

4.4 Análise química do óleo essencial

A análise da composição química do óleo essencial foi realizada em cromatógrafo

gasoso acoplado a espectrômetro de massas (CG/EM Shimadzu, modelo QP5050A) e provido

de uma coluna capilar DB-5HT de sílica fundida com 30 m de comprimento, 0,25 mm de

diâmetro interno e filme 0,25 µm, tendo o hélio como gás de arraste e fluxo de 0,8 mL/min. A

temperatura do injetor foi 250 ºC e a temperatura do detector (ou interface) foi 200 ºC. A

temperatura da coluna foi programada de 35 ºC para 180 ºC em 4 ºC/min e em seguida 180 ºC

para 250 ºC em 10 ºC/min. Os espectros de massas foram gravados a partir de 30 - 450 m/z.

Os componentes individuais foram identificados por correspondência de seus

espectros de massa, com energia de impacto de 70 eV, com os da base de dados usando a

biblioteca construída através do espectrômetro (Wiley, 229) e outros dois computadores

utilizando índices de retenção como uma pré-seleção (ALENCAR, CRAVEIRO e MATOS,

1984; ALENCAR et al., 1990), bem como por comparação visual da fragmentação padrão

com aqueles relatados na literatura (STENHAGEN, ABRAHAMSON e MCLAFFERTY,

1974; ADAMS, 2001).

4.5 Atividade antimicrobiana

4.5.1. Cepas microbianas

Foram utilizadas cepas microbianas provenientes da “American Type Culture

Collection” (ATCC) doadas pelo Laboratório de Materias de Referência da Fiocruz:

Staphylococcus aureus ATCC 12624, Streptococcus mutans ATCC 446, Enterococcus

faecalis ATCC 4083, Escherichia coli ATCC 25922, Enterobacter cloacae ATCC 23355,

Klebsiella pneumoniae ATCC 10031, Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442, Providencia

rettigeri ATCC 29944, Candida albicans ATCC 40006 e Candida tropicalis ATCC 40042.

Todas as cepas foram estocadas em ágar BHI sob refrigeração, de forma a conservarem

inalteradas todas as suas características bioquímicas e perfil de sensibilidade a

antimicrobianos.

54

4.5.2 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)

A determinação da CIM foi realizada através da técnica de microdiluição em caldo

utilizando placas esterilizadas com 96 poços de fundo redondo de acordo com a Norma M7-

A6 (CLSI, 2003) (Figura 6, p. 55). Culturas microbianas mantidas em ágar estoque sob

refrigeração foram repicadas em caldo de infusão de cérebro e coração (BHI) e incubadas a

35°C durante 24 h. Após esse período, procedeu-se a padronização do inóculo, que consistiu

na preparação de uma suspensão em BHI, cuja turvação fosse similar ao tubo 0,5 da escala

McFarland (1 x 108 UFC/mL). Essa suspensão foi diluída 100 vezes, em meio BHI, o que

corresponde aproximadamente a uma suspensão contendo 1 x 106 UFC/mL, da qual foi

retirado 100 µL e adicionado em cada poço da placa acrescido de diferentes concentrações do

OELS ou timol. Para as linhagens fúngicas, utilizou-se caldo Sabouraud para padronização do

inoculo.

As soluções do OELS e timol foram preparadas separadamente utilizando 10 mg das

amostras solubilizadas em 1 mL de dimetilsufóxido (DMSO) obtendo uma concentração

inicial de 10 mg/mL. A partir desta concentração, realizaram-se diluições em água destilada

estéril para obter uma solução estoque de 1024 μg/mL. As concentrações finais das amostras

no meio de cultura foram 512, 256, 128, 64, 32, 16 e 8 μg/mL.

Os testes foram realizados em duplicata. As placas foram incubadas a 35 ± 2 ºC,

durante 24 h. Após esse período, as placas foram reveladas com corante específico, a

resazurina, um indicador calorimétrico de óxido-redução (SALVAT et al., 2001) e as placas

contendo as cepas fúngicas foram reveladas através de visualização da turvação no meio.

Uma solução foi preparada com resazurina sódica e água destilada na concentração de 0,01%,

onde 25 μL da solução indicadora foram adicionados em cada cavidade, e após 1 h procedeu-

se com a leitura do teste. A leitura dos resultados para determinação da CIM foi determinada

através da coloração do meio de cultura, sendo considerada positiva para os poços que não

apresentaram crescimento microbiano, ou seja, permaneceram com a coloração azul e

negativa os que obtiveram coloração vermelha (SALVAT et al., 2001). O controle negativo

do teste foi realizado com os meios de cultura contendo o inóculo.

A Concentração Inibitória Mínima (CIM) foi definida como a menor concentração

capaz de inibir completamente o crescimento microbiano, nos poços de microdiluição

conforme detectado macroscopicamente.

55

Figura 6 ‒ Microdiluição em caldo Brain Heart Infusion (BHI).

Fonte: da autora.

4.5.3 Determinação da Concentração Fungicida Mínima (CFM)

A concentração fungicida mínima foi realizada em duplicata a partir de cada poço do

teste anterior que não apresentou crescimento. Uma alçada foi subcultivada em placas de

Potato Dextrose Agar (PDA), devidamente identificadas. Após 24 h de incubação a

temperatura ambiente realizou-se a leitura, com a finalidade de observação do crescimento

das colônias, sendo considerada CFM, a menor concentração da droga que impediu

crescimento visível do subcultivo ou produziram menos de três colônias por placa

(SHADOMY, ESPINELINGROFF e CARTWRIGHT, 1985).

4.5.4 Avaliação da inibição de biofilmes

O preparo do inóculo, formação e inibição do biofilme foi baseado na técnica de Spratt

et al., 2001 e Abdullah et al., 2005 modificada.

4.5.4.1 Cepa bacteriana e preparo do inóculo

A cultura pura de E. faecalis foi subcultivada em placa contendo Agar BHI e

incubada por 24 h a 35°C em aerobiose. Após o crescimento, colônias isoladas foram

suspensas em tubos contendo 5 mL de caldo BHI. Após agitação, a suspensão foi ajustada até

atingir a concentração equivalente a 6.0 da escala McFarland.

56

4.5.4.2 Formação do biofilme

Filtros de membranas de nitrocelulose (13 mm de diâmetro) foram posicionados sobre

placas contendo ágar BHI e em seguida, 50 µL da suspensão bacteriana foram inoculados

sobre cada membrana. As placas foram incubadas durante 72 h em aerobiose a 35°C (Figura

7).

4.5.4.3 Substâncias testadas

O OELS ou timol foram dissolvidos em DMSO, em seguida, foram diluídos em água

destilada estéril para atingir concentrações de 2,5% e 10%. Foi utilizado como controle

positivo o hipoclorito de sódio, e como controle negativo o DMSO, ambos nas mesmas

concentrações das amostras analisadas.

4.5.4.4 Inibição de biofilmes

Após o tempo de incubação, os biofilmes foram imersos em 3 mL de cada solução, nas

diferentes concentrações, por 30 e 60 minutos. Após o tempo de contato, as membranas foram

cuidadosamente transferidas para 3 mL de caldo de neutralização D/E (para OELS, timol e

DMSO) ou para 3 mL de tiossulfato de sódio 1% (para o hipoclorito de sódio) a fim de

interromper a possível atividade antimicrobiana do agente testado. Em seguida, as membranas

foram agitadas em misturador vórtex por 30 segundos para ressuspender os microorganismos.

Posteriormente, procedeu-se com a diluição em escala decimal para contagem de unidades

formadoras de colônia (UFC/mL) utilizando D/E Agar (DEY e ENGLEY, 1983).

Figura 7 ‒ Visualização do crescimento após 72 h do biofilme de Enterococcus faecalis.

Fonte: da autora.

57

4.6 Modulação da atividade antimicrobiana

4.6.1 Contato direto

Para avaliação da atividade moduladora as CIMs dos antibióticos aminoglicosídeos

(gentamicina e neomicina), Penicilina G, ceftriaxona e fluconazol foram determinadas na

presença e ausência do OELS ou timol pelo método de microdiluição em caldo (CLSI, 2003).

As linhagens utilizadas foram inoculadas em caldo BHI a 10% e incubadas em estufa

bacteriológica a 35 ± 2ºC por 24 h. As cepas leveduriformes foram inoculadas em caldo

Sabouraud a 10% e mantidas em temperatura ambiente até o momento do ensaio. O teste foi

monitorado com um controle positivo contendo apenas os antibióticos e os microorganismos.

As soluções dos antibióticos foram preparadas com a adição de água destilada estéril

de forma a obter uma concentração correspondendo a 1.024 μg/mL. Um volume de 100 μL de

cada solução dos antibióticos foi diluído seriadamente nos poços contendo o meio de cultura a

10% e a suspensão com o inóculo contendo OELS ou timol na concentração subinibitória

(CIM/8) (COUTINHO, 2008). As concentrações finais dos antibióticos no meio de cultura

foram de 512 a 0,5 μg/mL. As placas foram incubadas por 24 h a 35 ± 2 ºC e a atividade foi

evidenciada pelo uso de resazurina sódica para bactérias e visualização da turvação, onde o

aumento da turbidez ou opacidade no meio indica o crescimento das leveduras.

4.6.2 Contato a vapor

Previamente ao teste, as cepas Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa

foram inoculadas em placas de Petri contendo agar BHI e incubadas por 24 h a 35±2 ºC. Após

esse período, as linhagens foram suspendidas em tubo de ensaio com água destilada estéril de

forma a obter uma suspensão com turvação equivalente a 0,5 da escala de McFarlland (1 x 108

UFC/mL).

Os ensaios foram realizados em triplicata utilizando concentrações de 50, 25, 12, 6 e

3% do OELS ou timol diluídos em DMSO. Um swab estéril foi imerso na suspensão

bacteriana, retirou-se o excesso do inóculo através da compressão do swab nas paredes do

tubo, em seguida, foi semeado através do método de esgotamento em placas de Petri contendo

ágar Mueller Hinton. Após esse processo, foram adicionados discos com antibióticos

aminoglicosídeos amicacina (30 μg/disco), gentamicina (10 μg/disco) e neomicina (10

μg/disco). Posteriormente, as placas foram invertidas e um volume de 50 μL de cada

58

concentração foi colocado no interior da tampa, de forma que os constituintes voláteis do óleo

essencial e timol pudessem interagir com os antibióticos (Figura 8). Placas sem o óleo

essencial ou timol e com DMSO foram utilizadas como controles positivo e negativo,

respectivamente (RODRIGUES et al, 2010). Após esse procedimento, as placas foram

incubadas por 24 h a 35 ± 2 ºC e a leitura dos halos de inibição foi realizada com auxilio de

uma régua milimetrada, sendo os diâmetros dos halos dos controles positivos comparados aos

Padrões Interpretativos dos Diâmetros dos Halos Inibição estabelecidos pela CLSI (2003).

Figura 8 ‒ Contato gasoso - Aplicação da amostra na tampa da placa.

Fonte: da autora.

4.6.3 Análise estatística

Os resultados foram expressos como média dos halos de inibição (mm) ± desvio

padrão da média, avaliados estatisticamente utilizando Análise de Variância (ANOVA)

seguido do teste de Tukey, onde as diferenças foram consideradas significativas quando p <

0,05.

59

4.7 Atividade antiinflamatória tópica através de modelos de edema de orelha

induzidos por agentes irritantes

4.7.4 Aspectos éticos da pesquisa

O projeto com protocolos referentes a este estudo foi submetido e aprovado pela

Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade de Fortaleza (CEUA-UNIFOR) com

parecer nº 010/2010.

4.7.3. Animais

Foram utilizados camundongos albinos (Mus musculus) variedade Swiss, adultos, de

ambos os sexos, pesando entre 20-30g, provenientes do Biotério da Faculdade de Medicina de

Juazeiro do Norte (FMJ), mantidos em caixas de propileno, a temperatura média de 26 ± 2°C,

com ciclos claro/escuro de 12/12 h, recebendo ração (Labina, Purina®) e água “ad libitum”.

4.7.4 Drogas, reagentes e soluções

Tabela 1 ‒ Drogas e reagentes utilizados durante os procedimentos experimentais

farmacológicos.

Droga/ Reagente Origem

Acetona P.A.

Dinâmica, Brasil

Ácido araquidônico Dinâmica, Brasil

Cloridrato de cetamina 10% (Cetamin®) Syntec, Brasil

Cloridrato de xilazina 2% (Xilazin®) Syntec, Brasil

Dexametasona (Decadron®) Ache, Brasil

Fenol 99% Sigma-Aldrich, EUA

Histamina Sigma, EUA

Indometacina (Indocid®) Merck Sharp e Dohme, Brasil

Óleo de cróton Sigma, EUA

Solução fisiológica de NaCl 0,9% Farmace, Brasil

60

4.7.5 Edema de orelha induzido pela aplicação única de óleo de cróton

Para avaliar a atividade tópica por tratamento agudo do OELS ou timol neste modelo,

grupos de camundongos Swiss (n = 7) tiveram suas orelhas direitas tratadas topicamente, com

20 μL de acetona, indometacina 100 mg/mL (2 mg/orelha), dexametasona 4 mg/mL (0,08

mg/orelha), OELS ou timol na concentração 100 mg/mL (2 mg/orelha), esperando 15 minutos

para absorção. Em seguida, 20 μL de óleo de croton 5% (v/v) em acetona foram aplicados

topicamente na orelha direita e 20 μL do veículo acetona na orelha esquerda. Após 6 horas, os

animais foram sacrificados por deslocamento cervical e discos de 6 mm de diâmetro foram

obtidos das orelhas através de um punch (perfurador de couro metálico) para avaliação do

edema, conforme item 5.7.6 (TUBARO, 1985).

4.7.3 Edema de orelha induzido pela aplicação múltipla de óleo de croton

O processo inflamatório crônico foi induzido pela aplicação de 20 μL de óleo de

croton 5% (v/v) em acetona em dias alternados, durante 9 dias, em camundongos Swiss (n =

7/grupo). O OELS ou timol (2 mg/orelha) e a dexametasona (0,08 mg/orelha, controle

positivo) foram aplicados por via tópica durante 4 dias (2 vezes ao dia) a partir do 5º dia do

experimento, sendo o edema avaliado diariamente através de medição da espessura da orelha

direita com auxílio de um paquímetro digital. No 9° dia do experimento, os animais foram

sacrificados e círculos de 6 mm de tecido das orelhas foram coletados para avaliação do

edema (STANLEY et al., 1991).

4.7.4 Edema de orelha induzido por Ácido Araquidônico (AA) e fenol

Para avaliar a atividade tópica do OELS ou timol nestes modelos, as orelhas direitas

dos camundongos (n = 7/ grupo) foram tratadas, topicamente, com 20 μL dos agentes

irritantes: ácido araquidônico 0,1 mg/μL e fenol 10% (v/v), ambos em acetona. Quinze

minutos antes da aplicação do agente irritante, as orelhas direitas foram tratadas topicamente

com 20 µL do OELS ou timol 100 mg/mL, acetona (controle negativo), indometacina 2

mg/orelha (controle positivo para AA) ou dexametasona 0,08 mg/orelha (controle positivo

para fenol). Após 1 h, os animais foram sacrificados por deslocamento cervical e discos de 6

61

mm de diâmetro foram obtidos das orelhas para avaliação do edema, conforme item 5.7.6

(YOUNG et al, 1984; CRUMMEY et al, 1987).

4.7.5 Edema de orelha induzido pela injeção intradérmica de histamina

Inicialmente, cada animal (n = 7 / grupo) foi anestesiado com cloridrato de cetamina

0,02 mL (i.p.) e cloridato de xilazina 0,01 mL (i.p.). Em seguida, os animais foram pré-

tratados topicamente com 20 μL de salina, dexametasona 4 mg/mL (0,08 mg/orelha), OELS

ou timol (2 mg/orelha). Após 30 minutos, administrou-se um volume de 5 μL de uma solução

de histamina (100 mg/mL em salina), intradermicamente, na região ventral da orelha direita

dos camundongos com o auxílio de uma agulha hipodérmica 29 G, enquanto que a orelha

esquerda recebeu o mesmo volume de salina, também intradermicamente. Após 2 h, os

animais foram sacrificados por deslocamento cervical e para posterior avaliação do edema a

partir das massas dos discos obtidos, conforme item 5.7.6 (BRAND et al, 2002).

4.7.6 Quantificação do edema

Para quantificar o percentual de inflamação em cada animal analisado, foram obtidos

discos de 6 mm de diâmetro: um da orelha direita (tratada com agente irritante) e outro da

orelha esquerda (tratada com veículo do agente irritante). Em seguida, cada disco obtido teve

sua massa mensurada com a utilização de balança analítica. O edema de orelha, expresso em

percentual de aumento da massa da orelha, foi calculado utilizando a fórmula:

% inflamação 100

oe

oeod

m

mm

onde mod é a massa (em gramas) do disco obtido da orelha direita e moe é a massa (em gramas)

do disco obtido da orelha esquerda. O cálculo do efeito inibitório médio da inflamação (EIM,

em %) de cada tratamento, procedeu-se aplicando a fórmula a seguir:

EIM (%) =

62

onde MPEtrat é a média do percentual de edema do grupo submetido a tratamento com

OELS, timol ou controle positivo e MPEcont é a média do percentual de edema do grupo

controle negativo (tratado com salina ou acetona).

4.8 Análise estatística dos dados

Os dados apresentados foram expressos em média ± erro padrão da média (EPM). Para

os ensaios que possuíram três ou mais grupos e uma única avaliação das amostras, as

diferenças obtidas entre os grupos foram submetidas à análise de variância (ANOVA) de uma

via, seguindo-se do teste de Student-Newman-Keuls. Para o ensaio que possuiu três ou mais

grupos e cuja avaliação das amostras se deu em vários intervalos de tempo (edema de orelha

induzido pela aplicação múltipla de óleo de croton), as diferenças entre os grupos foram

submetidas à ANOVA de duas vias, com medidas repetidas, seguindo-se do teste de

Bonferroni. Foram consideradas diferenças significativas valores de p < 0,05.

63

Figura 9 ‒ Metodologias utilizadas para verificação de atividades biológicas do óleo

essencial de Lippia sidoides e timol.

Material vegetal

(folhas frescas de L. sidoides)

Extração do óleo

essencial (OELS) Timol

Atividades

biológicas

Atividade

antimicrobiana

Atividade

moduladora de ATM

Atividade

antiinflamatória

CIM

CFM Biofilme

Edema de orelha induzido

por agentes irritantes

Contato direto Contato gasoso

64

RESULTADOS E DISCUSSÕES

______________________________________________

65

5 RESULTADOS E DISCUSSÕES

5.1 Análise química do óleo essencial

O óleo essencial obtido por hidrodestilação apresentou rendimento de 1,06% (p/v). O

estudo da composição química do OELS foi realizado por cromatografia gasosa acoplada a

espectrometria de massas (CG/EM) e os componentes foram identificados através de

comparação dos seus espectros de massas e tempo de retenção (Tr) com os existentes na

literatura (ADAMS, 2001). Os índices de retenção de Kovats (IK) foram determinados

utilizando uma série homóloga de n- alcanos injetados nas mesmas condições cromatográficas

das amostras. Dessa forma, foi possível a identificação de 97,82% dos constituintes (Figura

10, p. 66), sendo o timol (84,9%), p-cimeno (5,33%) e carvacrol etil éter (3,01%) os

majoritários (Tabela 2).

Tabela 2 ‒ Constituintes químicos do óleo essencial das folhas de Lippia sidoides Cham.

Composto Tr(min) IK* (%)

p-cimeno 4.2 1020 5.33

1,8-cineol 4.4 1031 1.68

γ-terpineno 5.0 1060 1.32

Carvacrol etil éter 9.7 1164 3.01

Timol 11,8 1288 84,9

Carvacrol 12,9 1292 0.41

ß-cariofileno 15,1 1418 1.17

Total 97.82

Tr: Tempo de retenção; IK: índice de Kovats

66

Figura 10 – Estruturas química dos constituintes identificados no óleo essencial das folhas de

Lippia sidoides Cham.

O

O

OH

OH

H

p-cimeno 1,8-cineol

γ-terpineno

Timol

Carvacrol etil éter

Carvacrol

ß-cariofileno

67

Em alguns estudos, o teor de timol presente no óleo essencial das folhas de L. sidoides

(OELS) pode variar entre 34,2 a 95,1% (GIRÃO et al., 2003; FONTENELLE et al., 2007).

Essa variação do teor de constituintes no óleo essencial pode sofrer influência das condições

de cultura e desenvolvimento (tipo de solo e clima), de colheita e o processamento pós-

colheita (horário e época do ano) (LAVABRE, 1992).

Os resultados encontrados na análise química do óleo essencial estão de acordo com

estudos anteriores, que mostram que a maioria dos constituintes do gênero Lippia é,

geralmente, da classe dos monoterpenos, sendo o p-cimeno e timol os mais encontrados

(PASCUAL et al., 2001; ABENA et al., 2003; MENDES et al., 2010). A maioria dos

constituintes químicos do OELS também foi encontrada em outros trabalhos com essa espécie

coletada em diferentes lugares do Brasil como em Fortaleza (CE), Mossoró (RN), Limoeiro

do Norte (CE), Poço Redondo (SE) e Teresina (PI) (GIRÃO et al., 2003; CAVALCANTI et

al., 2010; MEDEIROS et al., 2011).

5.2 Atividade antimicrobiana

5.2.1 Determinação da concentração inibitória mínima (CIM)- Bactérias

A utilização de óleos essenciais na pesquisa de novos compostos antibacterianos tem

obtido resultados satisfatórios em vários trabalhos (FONTENELLE et al., 2007;

RODRIGUES et al., 2010; REIS et al., 2011). Os óleos essenciais possuem em sua

composição química uma mistura complexa de vários componentes bioativos, por isso, faz-se

necessário identificar qual composto é responsável pela atividade antimicrobiana.

Os resultados mostram que não houve diferenças no potencial antimicrobiano entre o

OELS e timol determinado pelo método de microdiluição frente às bactérias em estudo

(Tabela 3, p. 68). O OELS e timol apresentaram uma CIM de 128 µg/mL para S. aureus, 256

µg/mL para S. mutans, K. pneumoniae, P. rettigeri e E. cloacae, e 512 µg/mL para E.

faecalis, P. aeruginosa e E. coli.

A bactéria Gram-positiva S. aureus foi a mais sensível comparada às demais cepas.

Por outro lado, a Gram-positiva E. faecalis e as Gram-negativas E. coli e P. aeruginosa foram

mais resistentes apresentando uma CIM maior que as demais. Estes resultados concordam

com os encontrados na literatura os quais demonstram que as bactérias Gram-negativas são

68

mais resistentes à ação de produtos naturais, como extratos e óleos essenciais, pois a

membrana externa presente nessas bactérias forma um envelope complexo, protegendo-as

contra a ação desses agentes antimicrobianos (OLADIMEJI, ORAFIDIYA e OKEKE, 2004;

HOLLEY e PATTEL, 2005). Comumente encontrada em canais radiculares, E. faecalis

apresenta baixa sensibilidade a agentes microbianos e alta habilidade em inativá-los

(PORTENIER et al., 2002), explicando maior CIM que as demais Gram-positivas.

Gochev e Girova (2009) analisaram o óleo essencial de Thymus vulgaris (contendo

43,4% de timol) e realizaram uma avaliação comparativa entre a atividade antimicrobiana do

óleo essencial das suas folhas e seu composto majoritário, timol, frente a P. rettigeri, P.

aeruginosa, S. aureus e E. coli isoladas de produtos alimentícios (carnes) pelo método de

microdiluição em caldo e difusão em disco. Os autores demonstraram que a atividade

antimicrobiana do óleo é dependente do teor de timol, pois como o óleo essencial apresentou

apenas 43,4% de timol, foi menos efetivo que o composto puro.

Tabela 3 ‒ Concentração Inibitória Mínima (CIM) do óleo essencial das folhas de L. sidoides

(OELS) ou timol, sobre cepas microbianas originárias da ATCC.

CIM (µg/mL)

OELS Timol

S. aureus

128

128

S. mutans 256 256

E. faecalis 512 512

E. coli 512 512

E. cloacae 256 256

K. pneumoniae 256 256

P. aeruginosa 512 512

P.rettigeri 256 256

A atividade antimicrobiana dos compostos isolados de óleos essenciais depende de sua

estrutura química (DORMAN e DEANS, 2000; INOUYE et al., 2001; JIROVETZ et al.,

2007). Os constituintes que possuem um grupamento fenólico ou alcoólico, como o timol e

Bactérias

69

carvacrol, e o aumento no número de ligações duplas permitem maiores efeitos inibitórios

sobre o crescimento microbiano, seguidos dos aldeídos e cetonas (GRIFFIN et al., 1999;

DORMAN e DEANS, 2000). Alguns estudos mostram que o timol e carvacrol (isômero

constitucional do timol) demonstram atividade antimicrobiana frente a bactérias Gram-

positivas e Gram-negativas em igualdade, o que significa que a posição da hidroxila não tem

efeito sobre a atividade dos compostos (BOTELHO et al., 2007; GOCHEV e GIROVA,

2009).

O OELS contém em sua composição química, além do timol, outros compostos com

atividade antimicrobiana comprovada, tais como carvacrol, p-cimeno, ß-cariofileno e 1,8-

cineol (KALPOUTZAKIS et al., 2001; DELGADO et al., 2004; SABULAL et al., 2006;

KORDALI et al., 2008). Esses componentes podem agir sinergicamente aumentando o

potencial antimicrobiano (BURT, 2004). No entanto, nossos resultados demonstraram que o

timol é o composto responsável pela atividade antibacteriana apresentada pelo OELS.

Devido ao grande número de componentes químicos, os óleos essenciais não possuem

alvos específicos na célula. Sua estrutura lipofílica permite a permeabilização das membranas,

resultando em perda de íons, citocromo C, radicais, proteínas e redução do potencial de

membrana, com consequente colapso da bomba de prótons e depleção de ATP (SIKKEMA et

al., 1994; YOON et al., 2000; TURINA et al., 2006). A permeabilização da membrana

externa e das membranas mitocondriais leva à morte celular por apoptose e necrose

(ARMSTRONG, 2006).

5.2.2 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração

Fungicida Mínima (CFM)- Fungos leveduriformes

Espécies de Candida são responsáveis por causar infecções oportunistas em pacientes

imunocomprometidos e podem causar desde infecções superficiais até infecções sistêmicas

(SHAO et al., 2007). As classes de antifúngicos apresentam baixa eficácia, alta toxicidade e

freqüentemente levam à resistência (ANDERSON, 2005). Diante disso, a busca por produtos

naturais com atividade antifúngica frente a espécies de Candida vem sendo alvo de muitos

estudos (GIORDANI et al., 2004; DUARTE et al., 2005).

A concentração inibitória mínima (CIM) é definida como a menor concentração capaz

de inibir completamente o crescimento microbiano nos poços de microdiluição, enquanto que

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T8D-4CCNYKX-2&_user=686348&_coverDate=07%2F31%2F2004&_alid=1640198304&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_origin=search&_zone=rslt_list_item&_cdi=5084&_st=13&_docanchor=&_ct=9&_acct=C000037259&_version=1&_urlVersion=0&_userid=686348&md5=6abfcca3c23fd430f56b5673b84bb378&searchtype=a#bbib8

70

a concentração fungicida mínima (CFM) é a menor concentração em que o composto é capaz

de agir como fungicida (MURARI et al., 2008).

A Tabela 4 mostra que a atividade antifúngica exercida pelo OELS é devido ao seu

composto majoritário, timol, pois os mesmos apresentaram uma CIM de 64 µg/mL e uma

CFM de 128 µg/mL frente a C. albicans e C. tropicalis, respectivamente. Em outro estudo

comparativo entre o OELS e compostos isolados majoritários (timol e carvacrol) frente a uma

cepa de C. albicans (ATCC), utilizando o método de microdiluição em caldo, Botelho et al.

(2007) encontraram uma CIM de 2,5 e 0,625 mg/mL para o OELS e timol, respectivamente e

uma CFM de 5 mg/mL para ambos.

Tabela 4 ‒ Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Fungicida Mínima (CFM)

do óleo essencial de L. sidoides (OELS) e timol pelo método de microdiluição em caldo,

sobre cepas originárias da ATCC.

Fungos

CIM (µg/mL) CFM (µg/mL)

OELS Timol OELS Timol

Candida albicans

64

64

128

128

Candida tropicalis

64

64

128

128

Fontenelle et al. (2007) avaliaram o efeito do óleo essencial de L. sidoides (teor de

timol 59,65%) sobre cepas de C. albicans e C. tropicalis através do método de microdiluição

em caldo. A CIM e CFM para C. albicans foi 1250 mg/mL e 2500 mg/mL, respectivamente.

Para a cepa de C. tropicalis, foi encontrado uma CIM de 2500 mg/mL e uma CFM de 5000

mg/mL. Pina-Vaz et al. (2004) encontraram uma CIM e CFM para o timol de 0,16 µL/mL e

0,32 µL/mL frente a C. albicans e C. tropicalis utilizando o método de macrodiluição em

caldo. Nos estudos anteriores, as CIM e CFM foram maiores que os valores encontrados por

nosso estudo, no entanto, deve-se existir uma padronização dos métodos de extração dos óleos

essenciais e dos ensaios antimicrobianos in vitro, para que a prospecção possa ser sistemática

e objetiva, e haver uma melhor interpretação e comparação dos resultados.

Trabalhos desenvolvidos com óleos essenciais têm indicado o potencial destes no

controle de fitopatógenos, tanto por ação fungitóxica direta, inibindo o crescimento micelial e

a germinação de esporos, quanto pela indução de fitoalexinas (STANGARLIN et al., 1999)

causando granulação citoplasmática, desorganização dos conteúdos celulares, ruptura da

71

membrana plasmática e inibição de enzimas fúngicas (LO et al., 1996; ZAMBONELLI et al.

1996).

Estudos realizados por Ahmad et al. (2010) sugerem que o timol pode interagir

diretamente com a enzima H+- ATPase frente a espécies de Candida, o que explica sua

atividade antifúngica. Esta enzima desempenha um papel crucial na fisiologia da célula

fúngica, pois permite o equilíbrio do gradiente de prótons através da membrana das células,

regula o pH intracelular e o crescimento celular (SET-YOUNG et al., 1997; PERLIN et al.,

2006). Os grupos hidroxilas no anel aromático são bastante reativos e formam pontes de

hidrogênio com sítios ativos de enzimas-alvo, inativando-as. O efeito indutivo do grupo

isopropil presente no timol deve ser considerado ao lado da aromaticidade da molécula para o

favorecimento da atividade antimicrobiana (FARAG et al., 1989; PORTE e GODOY, 2001).

5.3 Modulação da atividade antibiótica

Produtos naturais de origem vegetal e animal podem alterar o efeito de antibióticos,

seja aumentando ou reduzindo a atividade antibiótica, e podem ser denominados de

Modificadores da Atividade Antibiótica (COUTINHO et al., 2008; RODRIGUES et al.,

2009). Para avaliar a modulação da atividade de antibióticos pode-se utilizar o contato direto

entre o inoculo e o produto natural associado ao antibiótico através do método de

microdiluição em caldo (COUTINHO et al., 2009) ou através do contato entre os

constituintes voláteis do óleo essencial com discos de antibióticos padronizados (INOUYE et

al., 2001; RODRIGUES et al., 2009). A redução da Concentração Inibitória Mínima (CIM)

do antibiótico na presença do produto natural indica que o mesmo é capaz de atuar

sinergicamente favorecendo o efeito antimicrobiano, e o aumento do halo de inibição indica

potencialização da atividade do antibiótico pelos constituintes voláteis do óleo essencial.

5.3.1 Contato direto- Bactérias

A Tabela 5 (p. 72) e a Tabela 6 (p. 73) mostram a interferência do óleo essencial e

timol, em concentrações subinibitórias (CIM/8) sobre a atividade de aminoglicosídeos e ß-

lactâmicos, respectivamente, demonstrando uma interferência na atividade antibiótica sobre

algumas cepas. O OELS e timol não foram capazes de modificar a atividade da Gentamicina e

Neomicina frente a S. mutans, E. faecalis, E. coli, E. cloacae e P. rettigeri. Por outro lado, o

OELS e timol reduziram a CIM da Gentamicina frente a K. pneumoniae e P. aeruginosa em

72

32 vezes (1µg/mL) e 4 vezes (8 µg/mL), respectivamente. Também houve redução da CIM da

Gentamicina frente a S. aureus em 4 vezes (8 µg/mL) quando associada ao OELS e em 16

vezes (2 µg/mL) quando associada ao timol (Tabela 5).

Tabela 5 ‒ Valores da Concentração Inibitória Mínima (CIM µg/mL) de aminoglicosídeos na

presença e ausência do óleo essencial de Lippia sidoides e timol em concentrações

subinibitórias (CIM/8) sobre cepas originárias da ATCC.

Bactérias

Gentamicina Neomicina

C+ OELSa

Timolb

C+ OELSa

Timolb

S. aureus 32 8 2 128 32 4

S. mutans 8 8 8 32 32 32

E. faecalis 64 64 64 32 32 32

E. coli 64 64 64 128 128 128

E. cloacae 16 16 16 64 64 64

K. pneumoniae 32 1 1 16 16 16

P. aeruginosa 32 8 8 128 128 128

P. rettigeri 32 32 32 128 128 128

C+: Controle positivo (antibiótico + inóculo); OELSa: CIM do Óleo essencial de L. sidoides

combinado com o antibiótico; Timolb: CIM do timol combinado com o antibiótico.

A associação entre o OELS e timol com a Neomicina reduziu sua CIM em 4 vezes (32

µg/mL) e 32 vezes (4 µg/mL) frente a S. aureus, respectivamente. Nas demais cepas

analisadas não houve sinergismo ou antagonismo entre a associação do OELS e timol com o

aminoglicosídeo supracitado.

Na Tabela 6 (p. 73), a CIM da Penicilina G foi reduzida de 128 µg/mL para 32 e 2

µg/mL quando associada ao OELS e timol, respectivamente. Observou-se um reforço na

atividade da Ceftriaxona apenas na associação do OELS e timol frente a E. faecalis com

redução da CIM de 64 para 4 μg/mL.

Nos últimos anos, a resistência aos antimicrobianos utilizados na clínica tem

aumentado consideravelmente, representando um problema mundial. Cerca de 90 a 95% das

cepas de S. aureus são resistentes a penicilina (CASAL et al., 2005). Em virtude do aumento

73

da resistência aos antibióticos, a seleção dos mesmos na terapêutica tem se tornado uma tarefa

difícil e desafiadora (ROSSI e ANDREAZZI, 2005).

Muitas drogas utilizadas no tratamento de doenças infecciosas foram isoladas e

purificadas a partir de plantas medicinais. Dessa forma, é possível se pensar nas plantas como

fontes de novos agentes terapêuticos contra bactérias resistentes aos antimicrobianos

(BUTTLER, 2006). É conhecida a ação sinérgica de produtos naturais junto a antimicrobianos

normalmente utilizados na clínica, determinando uma diminuição na sua CIM (MATIAS et

al., 2010; SOUSA et al., 2011).

Tabela 6 ‒ Valores da Concentração Inibitória Mínima (CIM µg/mL) de ß-lactâmicos na



Bactérias

Penicilina G Ceftriaxona

C+ OELSa

Timolb

C+ OELSa

Timolb

S. aureus ≥1024 ≥1024 ≥1024 64 64 64

S. mutans 128 32 2 8 8 8

E. faecalis 0,5 0,5 0,5 64 4 4

E. coli ≥1024 ≥1024 ≥1024 16 16 16

E. cloacae ≥1024 ≥1024 ≥1024 8 8 8

K. pneumoniae ≥1024 ≥1024 ≥1024 32 32 32

P. aeruginosa ≥1024 ≥1024 ≥1024 16 16 16

P. rettigeri ≥1024 ≥1024 ≥1024 0,5 0,5 0,5

C+: Controle positivo (antibiótico + inóculo); OELSa: CIM do Óleo essencial de L. sidoides

combinado com o antibiótico; Timolb: CIM do timol combinado com o antibiótico.

Uma estratégia empregada para reverter os mecanismos de resistência das bactérias é

utilizar a combinação entre drogas, como a associação entre ß-lactâmicos e inibidores da ß-

lactamase. Miranda-Novales et al. (2006) demonstraram que a combinação entre amicacina e

cefalotina ou dicloxacilina foi sinérgica contra a maioria das cepas resistentes de S. aureus e

Staphylococcus coagulase-negativo.

74

Algumas classes de metabólitos secundários também foram caracterizadas como

modificadores da atividade antibiótica, tais como terpenos (NICOLSON, EVANS e

O'TOOLE, 1999), taninos, alcalóides (MATIAS et al., 2010), flavonóides e derivados

(SATO et al., 2004). A associação entre produtos naturais também tem demonstrado efeitos

antimicrobianos sinérgicos, como os óleos essenciais das folhas de Thymus vulgaris e

Pimpinella anisum, os quais apresentaram sinergismo frente a bactérias Gram-positivas e

Gram-negativas pelo método de contato direto (AL-BAYATI, 2008).

Os mecanismos pelos quais óleos essenciais podem interagir com os antibióticos

envolvem diferentes interações entre os compostos presentes no óleo e a membrana

bacteriana. O timol e carvacrol podem ser eficazes contra os microorganismos através de uma

ação lipofílica na membrana celular, ocasionando a dispersão da cadeia de polipeptídeos da

membrana celular e desestabilizando a célula contra a qual estão desempenhando a sua

atividade (COWAN, 1999; NOSTRO et al., 2004). Estudos utilizando o óleo essencial do

orégano (Origanum vulgare) permitiram a observação de timol e carvacrol acumulados na

membrana plasmática de P. aeruginosa e S. aureus, resultando em aumento de 90% na

permeabilidade celular desses microorganismos (LAMBERT et al., 2001; KNOWLES et al.,

2005).

Os resultados desse estudo demonstraram um aumento na atividade dos

aminoglicosídeos frente a algumas bactérias Gram– positivas e Gram– negativas quando

associados ao OELS ou timol. Os aminoglicosídeos atuam inibindo a síntese protéica

bloqueando a subunidade 30S do ribossomo (JANA e DEB, 2005). A atividade sinérgica

verificada é atribuída ao timol, o qual pode estar favorecendo a entrada do antibiótico através

da membrana plasmática.

Devido a absorção para o espaço intracelular, a toxicidade celular é comum para todos

os aminoglicosídeos (exceto a estreptomicina). Nefrotoxicidade, ototoxicidade e bloqueio

neuromuscular são os mais importantes efeitos tóxicos dos aminoglicosídeos (VALLEJO et

al., 2001; OLIVEIRA, 2006). A freqüência relatada destes efeitos colaterais é muito variável

devido aos diferentes critérios utilizados para diagnóstico. Bloqueios neuromusculares são

raros, a ototoxicidade varia entre 0-62% (coclear) e 0-19% (vestibular) e nefrotoxicidade varia

de 0 a 50% (GILBERT, 1995).

O efeito sinérgico entre a associação do OELS e timol com os aminoglicosídeos pode

ser uma alternativa para minimizar os efeitos colaterais dessa classe de antimicrobianos, uma

75

vez que tal combinação reduz consideravelmente a CIM do antibiótico, diminuindo então a

dose necessária para que haja sucesso terapêutico.

Os ß-lactâmicos (BLA) atuam bloqueando a síntese da parede celular bacteriana. Os

mecanismos mais importantes de resistência aos BLA é a clivagem por ß-lactamases e

mudanças nas Proteínas Ligadoras de Penicilinas (PBP) (LEVINSON e JAWERT, 2005).

Muitos produtos naturais são capazes de interagir sinergicamente com BLA. A

epigalocatequina galato, presente no chá verde (Santolina chamaecyparissus), age

sinergicamente no mesmo sítio alvo, na síntese da parede celular (YAM et al., 1998; ZHAO

et al., 2001). A corilagina, um polifenol extraído de Arctostaphylos uva-ursi, é capaz de inibir

a produção ou atividade da PBP2a, uma proteína com baixa afinidade para os ß-lactâmicos

presente em estirpes de S. aureus resistentes à meticilina (MRSA) (SHIMIZU et al., 2001).

O OELS e timol apresentaram um efeito sinérgico quando associados com a

Penicilina, reduzindo consideravelmente sua CIM frente a S. mutans, e quando associados

com a Ceftriaxona frente a E. faecalis. Tal fato pode ser justificado devido à capacidade do

timol em provocar distorções na estrutura física da célula, causando expansão e conseqüente

desestabilização da membrana, desnaturando enzimas essenciais e alterando a força motriz de

prótons através de variações no pH e no potencial elétrico, atuando sinergicamente com esses

antibióticos (HELANDER et al., 1998; BURT, 2004).

Muitos antibióticos BLA conseguem penetrar em bactérias Gram- negativas através de

canais protéicos presentes em sua membrana externa. Através desses canais, as drogas

conseguem atingir seu receptor na parede celular e exercer sua ação bactericida (NIKAIDO,

1994). Apesar de atuar como barreira para compostos anfipáticos, a membrana externa pode

sofrer alteração em sua permeabilidade provocada pelo OELS e timol (HELANDER et al.,

1998; LEWIS e LOMOVSKAYA, 2001). No entanto, as cepas Gram-negativas em estudo

não foram susceptíveis a associação entre as amostras e os antibióticos. Tal fato pode ser

justificado por outros mecanismos de resistência presentes nessas bactérias como bomba de

efluxo, produção de enzimas que clivam o anel ß-lactâmico (ß-lactamases), mudanças nas

PBP, entre outros (BUSH, 2002; ENRIGHT et al., 2002).

76

5.3.2 Atividade moduladora por contato direto – fungos

Os tratamentos de escolha para infecções oportunistas por espécies de Candida são

limitados e muitos antifúngicos existentes apresentam efeitos colaterais indesejáveis, como

nefrotoxicidade, ou podem induzir a resistência fúngica, principalmente em indivíduos

imunodeprimidos (FICA, 2004). O Fluconazol, um composto triazólico, atua inibindo a

enzima lanosterol 14-desmetilase no complexo do citocromo P-450 de fungos, inibindo a

conversão do lanosterol para ergosterol. Com a consequente diminuição do ergosterol, há

perda da integridade da membrana plasmática fúngica (GHANNOUM e KUHN, 2002).

Imidazóis e triazóis, em graus variados, também interagem com o complexo P-450 da espécie

humana, causando interferência com certos hormônios ou interações metabólicas com drogas

metabolizadas através desse sistema (FICA, 2004).

A Tabela 7 mostra que a associação entre o OELS ou timol em concentrações

subinibitórias (CIM/8) com o fluconazol frente a espécies de Candida não interferiu na

atividade antifúngica, pois a CIM do fluconazol permaneceu a mesma.

Tabela 7 ‒ Valores da Concentração Inibitória Mínima (CIM µg/mL) do fluconazol na



Fungos

Fluconazol

CIM OELS Timol

C. albicans

≥1024

≥1024

≥1024

C. tropicalis 512 512 512

Guo et al. (2009) demonstraram sinergismo entre a associação do timol com

fluconazol frente a cepas de C. albicans resistentes a este antifúngico, no entanto não foram

utilizadas concentrações subinibitórias do timol. Outro estudo feito com Anfotericina B

demonstrou que houve sinergismo quando associada ao óleo essencial de Thymus vulgaris

(teor de timol 63,22%) frente à Candida albicans (GIORDANI et al., 2004). No entanto, a

concentração do timol e do OELS testada na associação destes com o fluconazol não foi capaz

de interferir na atividade deste antifúngico.

77

5.3.4 Contato a vapor

Na avaliação da atividade moduladora de antibióticos pelos constituintes voláteis do

OELS e pelo timol, os diâmetros da zona de inibição obtidos para as duas cepas em estudo

foram classificados como sensíveis segundo comparação com o padrão estabelecido pela

CLSI (2003). Não houve interferência na atividade dos antibióticos testados na concentração

de 3% das amostras e com 100% de DMSO, controle negativo.

A Dose Inibitória Mínima (DIM) é definida como a menor dose capaz de inibir o

crescimento bacteriano por unidade de espaço em um sistema fechado. A DIM, expresso em

mg/L ar pode não representar necessariamente a concentração real do vapor, a qual pode

sofrer mudanças durante o tempo de incubação, como decomposição espontânea de alguns

constituintes voláteis (INOUYE et al., 2001; KASHIWAGI et al., 2010). A Tabela 8 mostra a

atividade antibacteriana do OELS e timol por contato gasoso. Os resultados mostram a DIM,

onde P. aeruginosa é menos susceptível à ação do OELS e timol (DIM > 1 mg / L ar para

ambos) que S. aureus (DIM 0,0625 mg / L ar para ambos).

Tabela 8 ‒ Atividade antibacteriana do óleo essencial de Lippia sidoides (OELS) e timol por

contato gasoso.

Bactéria

DIM (mg/L ar)

OELS

1 0.5 0.25 0.125 0.0625 0.03125

S. aureus

ATCC 12624 - - - - + +

P. aeruginosa

ATCC 15442 + + + + + +

Timol

S. aureus

ATCC 12624 - - - - + +

P. aeruginosa

ATCC 15442 + + + + + +

Nota: +: Não houve inibição do crescimento -: Inibição do crescimento; DIM: Dose Inibitória

Mínima.

Alguns estudos demonstraram atividade antibacteriana do OELS e timol por contato

direto (método de microdiluição) frente a S. aureus e P. aeruginosa, no entanto, não existem

registros de atividade exercida pelo método de contato gasoso (NOSTRO et al., 2004;

OLIVEIRA et al., 2006; GOCHEV e GIROVA, 2009). Nossos resultados estão de acordo

78

com estudos anteriores que indicam que bactérias Gram-negativas são mais resistentes à ação

de óleos essenciais quando comparadas com bactérias Gram-positivas (COWAN, 1999;

PAULI, 2001; MURARI et al., 2008).

A Tabela 9 (p. 80) mostra que a atividade antibiótica dos aminoglicosídeos frente a

S.aureus foi aumentada na presença do OELS e timol. Os resultados demonstraram que houve

aumento de 429,41; 349; 256,82 e 21.53% na atividade antibiótica da Gentamicina nas

concentrações 50, 25, 12 e 6% do OELS, respectivamente. Também foi observado aumento

de 246,15; 198,7; 30,77 e 5,11% na atividade antibiótica da Amicacina e aumento de 322,22;

305,55; 214,77 e 42,55% na atividade da Neomicina nas concentrações testadas do OELS.

Por outro lado, o timol foi menos efetivo frente a S. aureus quando comparado ao

OELS. A Tabela 9 (p. 80) mostra aumento de 155,11; 152,54 e 79,46% na atividade

antibiótica da Amicacina nas concentrações 50, 25 e 12%; uma potencialização da Neomicina

em 216,66; 211,11; 175,89 e 33,33% e um aumento de 223,53; 192,12; 168,59 e 35,29% da

atividade da Gentamicina nas concentrações testadas. Houve diferença estatística (p<0,05)

entre a interferência do OELS e timol sobre os aminoglicosídeos testados frente a S. aureus.

Estes resultados demonstram que os outros compostos presentes no óleo essencial

desempenham papel importante para a atividade antimicrobiana frente a essa cepa.

A Tabela 10 (p. 81) mostra que para a maioria dos resultados frente a P. aeruginosa,

não houve diferença estatística (p<0,05) entre a atividade sinérgica do OELS e timol com os

aminoglicosídeos. Para o OELS, foi observado um aumento de 43,30; 36,65 e 25% na

atividade antibiótica da amicacina; um aumento de 31,06; 28,86 e 20% na atividade da

gentamicina; e 31,06 e 26,66% na atividade da neomicina. A potencialização da atividade da

amicacina pelo timol foi de 33,3; 31,5 e 30%; da gentamicina foi de 33,33; 28,86 e 24,4%; e

da neomicina foi de 31,06 e 20%. O timol foi o composto responsável pela atividade

antimicrobiana do OELS frente a P. aeruginosa, pois não foi observada diferença estatística

quando comparada ao OELS.

Os mecanismos pelos quais os óleos essenciais podem interagir com os antibióticos

envolvem diferentes interações entre os compostos presentes no óleo e a membrana bacteriana

(BURT, 2004). No método de contato gasoso, a atividade antimicrobiana resulta em uma

combinação entre a absorção direta dos constituintes voláteis pelos microorganismos e a

absorção indireta do vapor através do meio de cultura (MOLEYAR e NARASINHAM, 1986;

INOUYE et al., 2001).

79

Alguns estudos também relataram a atividade modificadora de antibióticos através do

contato gasoso. Os óleos essenciais de Zanthoxylum articulatum, Vanillosmopsis arborea,

Croton zehntneri e Lantana camara foram capazes de interagir com antibióticos promovendo

o aumento da atividade dos mesmos frente S. aureus e P. aeruginosa (RODRIGUES et al.,

2009; 2010; SANTOS et al., 2010; SOUZA et al., 2011). Entretanto, nossos resultados são

mais expressivos quando comparados aos encontrados nos trabalhos na menor concentração

do óleo essencial. Além disso, em nosso estudo, o principal componente do óleo essencial foi

testado com a finalidade de elucidar os compostos responsáveis pelas atividades observadas.

Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa são as bactérias mais comumente

isoladas em escarro (VALENZA et al., 2008). S. aureus pode atuar não apenas como um

colonizador simples da mucosa nasal, mas é capaz de criar um reservatório no interior da

mucosa, levando à infecções de repetição (CORRIVEAU et al., 2009). Por outro lado, além

de estar associada à muitas infecções do trato respiratório, como a fibrose cística, P.

aeruginosa tem sido um dos mais prevalentes agentes de infecções hospitalares em todo o

mundo (FERRAREZE et al., 2007; MILAGRES et al., 2008).

Nossos resultados sugerem que os componentes voláteis do óleo essencial de L.

sidoides e seu principal componente o timol pode suprimir o crescimento de patógenos

causadores de infecções respiratórias. No entanto, estudos pré-clínicos e clínicos são

necessários para verificar a biodisponibilidade e a possível toxicidade dessa associação com

aminoglicosídeos a fim de elucidar os mecanismos de ação envolvidos nessa interação.

80

Tabela 9 – Modificação da atividade antibiótica de aminoglicosídeos pelos constituintes voláteis do óleo essencial de L. sidoides (OELS) e timol,

utilizando o método de contato gasoso sobre Staphylococcus aureus ATCC 12624.

Amostras TR C+ DMSO 50% 25% 12% 6%

OELS

AMI 26,00±0,00a

26,00±0,00a

≥90,00±0,00b

77,66±1,15c

34,00±0,00d

27,33±1,15a

Aumento - - ≥246,15% 198,70% 30,77% 5,11%

GEN 17,00±0,00a

17,00±0,00a

≥90,00±0,00b

76,33±1,15c

60,66±1,15d

20,66±0,57e

Aumento - - ≥429,41% 349,00% 256,82% 21,53%

NEO 18,00±0,00a

18,00±0,00a

76,00±0,0b

73,00±0,00c

56,66±0,57d

25,66±0,57e

Aumento - - 322,22% 305,55% 214,77% 42,55%

Timol

AMI 26,00±0,00a

26,00±0,00a

66,33±1,15b

65,66±0,57b

46,66±1,15c

27,00±0,00a

Aumento - - 155,11% 152,54% 79,46% 3,84%

GEN 17,00±0,00a

17,00±0,00a

55,00±0,00b

49,66±0,57c

45,66±1,15d

23,00±0,00e

Aumento - - 223,53% 192,12% 168,59% 35,29%

NEO 18,00±0,00a

18,00±0,00a

57,00±0,00b

56,00±0,00b

49,66±1,15c

24,00±0,00d

Aumento - - 216,66% 211,11% 175,89% 33,33%

Médias seguidas de mesma letra, na linha, não diferem significativamente entre si (n = 3, p <0,05 - Teste de Tukey). Médias seguidas de letras diferentes, na

linha, diferem significativamente quando comparados entre si e seus respectivos controles (n = 3, p <0,05 - Teste de Tukey). Os resultados são expressos como

média do diâmetro do halo de inibição ± desvio padrão (mm). Dimetilsulfóxido (DMSO), Amicacina (AMI), Gentamicina (GEN), Neomicina (NEO); TR:

Tratamento; C+: Controle positivo, apenas o antibiótico.

81

Tabela 10 ‒ Modificação da atividade antibiótica de aminoglicosídeos pelos constituintes voláteis do óleo essencial de L. sidoides (OELS) e timol,

utilizando o método de contato gasoso sobre Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442.

Amostras TR C+ DMSO 50% 25% 12% 6%

OELS

AMI 20,00±0,00a

20,00±0,00a

28,66±1,15b

27,33±1,15b

25,00±0,00c

20,00±0,00a

Aumento -

- 43,30% 36,65% 25,00% -

GEN 15,00±0,00a

15,00±0,00a

19,66±1,56b

19,33±1,15b

18,00±0,00b

15,00±0,00a

Aumento - - 31,06% 28,86% 20,00% -

NEO 15,00±0,00a

15,00±0,00a

19,66±1,56b

19,00±1,0b

15,00±1,00a

15,00±0,00a

Aumento - - 31,06% 26,66% - -

Timol

AMI 20,00±0,00a

20,00±0,00a

26,66±1,15b

26,33±0,57b

26,33±0,57b

26,00±0,00b

Aumento - - 33,30% 31,50% 31,50% 30,00%

GEN 15,00±0,00a

15,00±0,00a

20,00±1,73b

19,33±1,15b

18,66±1,15b

18,66±1,15b

Aumento - - 33,33% 28,86% 24,40% 24,40%

NEO 15,00±0,00a

15,00±0,00a

19,66±0,57b

18,00±0,00b

15,66±1,15c

15,00±0,00c

Aumento - - 31,06% 20,00% 4,40% -

Médias seguidas de mesma letra, na linha, não diferem significativamente entre si (n = 3, p <0,05 - Teste de Tukey). Médias seguidas de letras diferentes, na

linha, diferem significativamente quando comparados entre si e seus respectivos controles (n = 3, p <0,05 - Teste de Tukey). Os resultados são expressos como

média do diâmetro do halo de inibição ± desvio padrão (mm). Dimetilsulfóxido (DMSO), Amicacina (AMI), Gentamicina (GEN), Neomicina (NEO); TR:

Tratamento; C+: Controle positivo, apenas o antibiótico.

82

5.4 Avaliação da inibição de biofilmes

A média de Unidades Formadoras de Colônia (UFC) por disco de biofilmes de E.

faecalis após o tempo de contato (30 ou 60 minutos) com soluções a 2,5% e 10% de OELS,

timol, DMSO e hipoclorito de sódio (NaOCl) estão apresentadas nas Figuras 8 (p. 83) e 9 (p.

84). O NaOCl foi o agente antimicrobiano mais efetivo, desestruturando o biofilme e

eliminando 99,99% das UFC nas concentrações e nos tempos de contato utilizados nesse

estudo. Este resultado está de acordo com os encontrados na literatura (SPRATT et al., 2001;

SENA, 2004; ABDULLAH et al., 2005).

Na Figura 8, o DMSO a 2,5%, controle negativo, permitiu o crescimento em todos os

tempos testados, resultando em 6,5 × 108

e 1,5 × 108

UFC em 30 e 60 minutos de exposição.

Após o contato do OELS por 30 e 60 minutos, a contagem de UFC em relação ao controle

negativo foi significativamente reduzida (p < 0,001) para 6,4 × 106

e 2,2 × 106

UFC. O timol

também foi capaz de reduzir significativamente (p < 0,001) as UFC para 8,3 × 106

e 5,2 × 106.

Não houve diferenças estatísticas (p > 0,05) entre a ação do OELS e timol nos tempos de

contato designados.

83

Figura 11 ‒ Susceptibilidade de biofilmes de Enterococcus faecalis frente a desafios

antimicrobianos a 2,5% (v/v) por 30 ou 60 minutos de contato. OELS, óleo essencial de

Lippia sidoides; DMSO, dimetilsulfóxido (controle negativo), NaOCl, hipoclorito de sódio

(controle positivo). As barras verticais representam o desvio padrão (n=3). *** p <0,001

comparado ao controle negativo, DMSO (ANOVA de duas vias seguido do Teste de

Bonferroni).

OELS Timol DMSO NaOCl

10 0

10 2

10 4

10 6

10 8

30 min

60 min

***

***

******

Desafios antimicrobianos a 2,5%

UF

C/d

isco

Após 30 e 60 minutos de exposição, o DMSO a 10% permitiu o crescimento dos

biofilmes, resultando em 6,4 × 108

e 9,0 × 108

UFC, respectivamente (Figura 9, p. 84). A

contagem de UFC dos biofilmes expostos ao OELS e timol a 10% em relação ao controle

negativo foi significativamente reduzida (p < 0,001) para 3,3 × 106

e 2,6 × 106, e para 3,5 ×

108

e 6,7 × 107 UFC, respectivamente. Houve diferença estatística (p < 0,001) na média de

UFC entre o OELS e timol no tempo de 30 minutos. Por outro lado, o contato do OELS e

timol com os biofilmes durante 60 minutos não diferiram quando comparados entre si (p >

0,05).

84

Figura 12 ‒ Susceptibilidade de biofilmes de Enterococcus faecalis frente a desafios

antimicrobianos a 10% (v/v) por 30 ou 60 minutos de contato. OELS, óleo essencial de

Lippia sidoides; DMSO, dimetilsulfóxido (controle negativo), NaOCl, hipoclorito de sódio

(controle positivo). As barras verticais representam o desvio padrão (n=3). *** p <0,001

comparado ao controle negativo, DMSO (ANOVA de duas vias seguido do Teste de

Bonferroni).

OELS Timol DMSO NaOCl

10 0

10 2

10 4

10 6

10 8

30 min

60 min

*** ***

***

***

Desafios antimicrobianos a 10%

UF

C/d

isco

A maioria dos microrganismos não existe como uma cultura de células que vivem

livremente, e sim associados a uma superfície viva ou inerte formando uma comunidade

estruturada de células envoltas por uma matriz polissacarídica (COSTERTON et al., 1999).

Existem várias metodologias utilizadas em laboratório para avaliar a efetividade de agentes

antimicrobianos frente a biofilmes, porém os resultados mostram-se conflitantes em trabalhos

que utilizaram as mesmas substâncias, os mesmos microrganismos e metodologias diferentes

(SPRATT et al., 2001; SEABRA et al., 2005; ARIAS-MOLIZ et al., 2009). Os protocolos

utilizados nesse estudo foram adaptados de Spratt et al. (2001) e Abdullah et al. (2005). Essa

metodologia é acessível e rápida, além de permitir a comparação entre vários desafios

antimicrobianos frente a microorganismos presentes no biofilme.

85

Enterococcus faecalis está associado a infecções do trato urinário, endocardite,

infecções intra-abdominais e pélvicas, feridas cirúrgicas, infecções no sistema nervoso

central, formação de biofilme em cateteres, válvulas, lentes de contato e é a bactéria mais

comumente isolada em canais radiculares devido à formação de biofilme (MOHAMED e

HUANG, 2007).

A virulência de E. faecalis em canais radiculares pode estar relacionada à sua

capacidade de resistir a medicações intracanal, e a sua habilidade de sobreviver no canal

radicular como único microorganismo sem o suporte de outras bactérias, formando biofilmes

(PARADELLA e KOGA-ITO, 2007). A irrigação dos canais radiculares é um importante

passo na desinfecção e é parte integrante dos procedimentos do tratamento endodôntico. O

irrigante atualmente mais utilizado é o hipoclorito de sódio (NaOCl) devido sua forte

atividade antimicrobiana, porém a principal desvantagem do seu uso no tratamento dentário

advém da sua toxicidade sobre os tecidos biológicos (BOWDEN et al., 2006).

As bactérias estruturadas em biofilme se comportam de maneira diferente quando

expostas às substâncias químicas, pois as substâncias poliméricas que compõem a matriz do

biofilme retardam a difusão das substâncias químicas e antibióticos (STOODLEY et al.,

2002, XAVIER et al., 2003). A susceptibilidade do biofilme está diretamente relacionada ao

tempo de exposição e a quantidade da substância, além da fase de desenvolvimento do

biofilme (SPRATT et al., 2001). A velocidade de penetração da substância varia de acordo

com o microrganismo formado e composição da matriz de exopolissacarídeo (COSTERTON

et al., 1999).

Diante disso, nossos resultados demonstraram que o OELS e timol são capazes de

reduzir in vitro as UFC em biofilmes de E. faecalis (tempo de maturação de 72 horas) no

tempo de contato de 30 e 60 minutos em concentrações de 2,5 e 10%. Na concentração de

2,5% não houve diferenças estatísticas (p > 0,05) entre o tempo de contato e as amostras

analisadas, sendo o timol responsável pela atividade antimicrobiana do OELS frente ao

biofilme. Por outro lado, uma maior concentração do timol (10%) não é tão eficaz como em

uma concentração menor (2,5%), o que não é o mesmo para o OELS, que apresenta a mesma

atividade em ambas às concentrações e nos mesmos intervalos de tempo. O mecanismo pelo

qual o OELS e timol são capazes de inibir microorganismos presentes em biofilmes ainda não

está bem esclarecido.

Uma preparação à base de óleos essenciais de Eucalyptus globulus, Melaleuca

alternifolia, Thymus sp. e Syzygium aromaticum, contendo principalmente monoterpenos em

86

sua composição, demonstrou, in vitro, redução da aderência e formação do biofilme de

Staphylococcus epidermidis (AL-SHUNEIGAT et al., 2005). A associação entre o timol e

gluconato de clorexidina demonstrou atividade sinérgica frente a biofilmes de S. epidermidis

(KARPANEN et al., 2008). Braga et al. (2008) verificaram que o timol também foi capaz de

interferir com a aderência de C. albicans nas células da mucosa, e os autores sugerem que

este composto pode interferir significativamente não só com as fases iniciais da formação do

biofilme, mas também com a maturação, uma vez que inibe eficazmente a atividade

metabólica do biofilme.

Segundo Nostro et al. (2007), o timol possui tanto propriedade hidrofílica como

hidrofóbica, o que pode favorecer a difusão deste composto através da camada de

polissacarídeo do biofilme e permitir seu acesso às células bacterianas, onde irá exercer sua

atividade antimicrobiana alterando a permeabilidade da membrana. Esta hipótese é apoiada

pelos resultados encontrados em diversos estudos clínicos com enxaguatórios bucais ou

cremes dentais contendo OELS em sua composição, os quais têm demonstrado a diminuição

da placa bacteriana e conseqüente formação de biofilme dental (NUNES et al., 2006;

BOTELHO et al., 2007; BOTELHO et al., 2009; LOBO et al., 2011).

Diante disso, nosso estudo propicia uma base para a possível utilização do OELS

como adjuvante no tratamento de canais radiculares que apresentam colonização por E.

faecalis. No entanto, são necessários estudos pré-clínicos para avaliar a real eficácia e a

concentração do OELS capaz de inibir e desestruturar esse biofilme in vivo.

5.5 Atividade do óleo essencial de Lippia sidoides (OELS) e timol nos modelos de inflamação

cutânea

5.5.1 Edema de orelha induzido pela aplicação única de óleo de cróton

A Figura 13 (p. 87) mostra o que o OELS ou timol (2 mg/orelha) não mostraram efeito

antiedematogênico após 6 horas da aplicação tópica do óleo de cróton, quando comparados

com o grupo tratado com acetona (controle negativo). Neste modelo, apenas o grupo tratado

com o controle positivo, dexametasona (0,08 mg/orelha), demonstrou redução significativa

quando comparado com o controle negativo, com efeito inibitório médio da inflamação de

76,5% (p < 0,001).

87

Figura 13 ‒ Efeito do OELS ou timol, administrados por via tópica, no edema de orelha

induzido pela aplicação única de óleo de cróton em camundongos. Os animais foram

previamente tratados com acetona (controle), dexametasona 0,08 mg/orelha (DEX), OELS ou

timol (2 mg/orelha) e após 15 minutos receberam topicamente óleo de cróton 5% (v/v) em

acetona. Os gráficos representam a média do edema de orelha (%) e as barras verticais o

E.P.M de 7 animais registrados após 6h da aplicação tópica do óleo de cróton. *** p<0,001

vs controle (ANOVA e Teste de Student- Newman- Keuls).

Controle DEX OELS Timol0

50

100

150

200

***

Óleo de cróton

nsns

Percen

tual

ed

em

a (

%)

5.5.2 Edema de orelha induzido pela aplicação múltipla de óleo de cróton

Conforme demonstrado na Figura 14 (p. 88), a aplicação tópica do OELS ou timol (2

mg/orelha, 2 vezes ao dia, durante 4 dias) na orelha dos camundongos promoveu um aumento

significativo da espessura da orelha após cinco dias (96 horas) do desafio com esse agente

irritante (p < 0,001), causando necrose das orelhas tratadas (Figura 15, p. 88), quando

comparados ao grupo controle. Não houve diferenças significativas entre o efeito do OELS e

timol. Por outro lado, a dexametasona (0,08 mg/orelha, 2 vezes ao dia, durante 4 dias) foi

capaz de reduzir significativamente o edema após 1, 2, 3 e 4 dias (p < 0,001) do início do

tratamento, sendo confirmado pela avaliação do percentual de edema no último dia do

experimento (Figura 16, p. 89) e efeito inibitório médio de 45,7% (p<0,01).

88

Figura 14 ‒ Curva tempo-resposta do efeito do tratamento com OELS ou timol (2

mg/orelha) no modelo de edema de orelha induzido pela aplicação múltipla de óleo de

cróton (OC) em camundongos. A orelha direita dos animais recebeu topicamente o agente

irritante em dias alternados e acetona (veículo) na orelha esquerda. A espessura da orelha

(µm) foi mensurada com auxílio de paquímetro digital antes da aplicação do OC, quarto horas

após a primeira aplicação (fase aguda) e 2,3,4,5,6,7,8 e 9 dias após a primeira aplicação de

OC. No quinto dia do experimento, os animais receberam topicamente o tratamento com

acetona (veículo), dexametasona (DEX), OELS ou timol (2 mg/orelha), duas vezes por dia e o

tratamento continuou por mais 4 dias (setas na figura indicam os dias de tratamento). O efeito

antiedematogênico dos compostos foi verificado através da variação da espessura da orelha

Os pontos representam a média de 7 animais e as barras verticais o E.P.M. *** p <0.001 vs

veículo (ANOVA de duas vias seguido pelo teste de Bonferroni).

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100

300

600

900

1200

1500

1800Acetona

DEX 0,08 mg/orelha

OELS 2 mg/orelha

Timol 2 mg/orelha

*** *** *** ***

Tratamento tópico

******

***

*** ***

***

***

***

Tempo (dias)

E

spes

sura

da

ore

lha

( m

)

Figura 15 ‒ Aspecto da orelha direita de camundongos após 4 dias de tratamento com OELS

(2 mg/orelha, 2 vezes ao dia) no modelo de edema de orelha induzido pela aplicação múltipla

de óleo de cróton 5% (v/v) em acetona.

Fonte: da autora.

89


crônico induzido pela aplicação múltipla de óleo de cróton em camundongos. A aplicação

de óleo de cróton foi realizada em dias alternados, durante 9 dias. A partir do 5º dia do

experimento, a orelha direita dos animais recebeu acetona (controle), dexametasona 0,08

mg/orelha (DEX), OELS ou timol (2 mg/orelha) 2 vezes ao dia. Os gráficos representam a

média do edema de orelha (%) e as barras verticais o E.P.M de 7 animais registrados após 9

dias da primeira aplicação tópica do óleo de cróton. ** p< 0,01; *** p<0,001 vs controle

(ANOVA e Teste de Student- Newman- Keuls).


50

100

150

200

Óleo de cróton (crônico)

**

*****

Percen

tual

de e

dem

a (

%)

5.5.3 Edema de orelha induzido por Ácido Araquidônico (AA)

O ácido araquidônico promoveu a formação do edema após 1 hora da sua aplicação

tópica, da mesma forma que descrito na literatura (YOUNG et al., 1984; CRUMMEY et al.,

1987). Nesse modelo, o OELS e timol (2 mg/orelha) foram capazes de reduzir

significativamente o percentual de edema de orelha após 1 hora da aplicação do AA, quando

comparados com o grupo controle (Figura 14, p. 91). O efeito inibitório médio foi de 58,4%,

45,1% e 47,4% (p< 0,001) para a indometacina (2 mg/orelha), OELS e timol, respectivamente

(Tabela 11, p. 90). Não houve diferenças significativas entre o grupo tratado com

indometacina, OELS e timol.

90

Tabela 11 ‒ Porcentagem do edema de orelha induzido por ácido araquidônico em

camundongos e o efeito inibitório médio após aplicação tópica do OELS, timol ou

indometacina (2 mg/orelha).

Tratamento

Ácido araquidônico

Percentagem de edema EIM

Controle negativo 89,97±10,10 -

Indometacina 37,42±4,70*** 58,4%

OELS 49,42±3,16*** 45,1%

Timol 47,30±8,64*** 47,4%

Dados expressos como média ± E.P.M. *** p< 0,001 quando comparados com o

grupo controle negativo (ANOVA e Teste de Student-Newman-Keuls).

5.5.4 Edema de orelha induzido por histamina

O tratamento com OELS ou timol administrado por via tópica (2 mg/orelha) após 2

horas da aplicação intradérmica de solução de histamina não foi capaz de reduzir

significativamente o edema de orelha comparado ao grupo controle tratado com salina. A

dexametasona (0,08 mg/orelha) inibiu o edema (p<0,001), com efeito inibitório médio de

46,5% (Figura 18, p. 91). Não houve diferenças estatísticas entre o tratamento com o OELS e

timol.

5.5.5 Edema de orelha induzido por fenol

O OELS ou timol, aplicados por via tópica (2 mg/orelha), demonstraram redução

significativa no percentual de edema de orelha após 1 hora da aplicação tópica de fenol 10%

(v/v) em acetona, quando comparados com o grupo controle negativo (Figura 19, p. 92). A

Tabela 12 (p. 92) mostra o efeito inibitório médio de 33,2% (p<0,05) para OELS, de 54,7%

(p<0,01) para timol e de 52,6% (p<0,01) para a dexametasona (0,08 mg/orelha). Não houve

diferenças significativas entre o tratamento tópico com dexametasona, timol ou OELS.

91


induzido pela aplicação de ácido araquidônico em camundongos. Os animais foram

previamente tratados com acetona (controle), indometacina (IND), OELS ou timol (2

mg/orelha) e após 15 minutos receberam topicamente ácido araquidônico 0,1 µg/mL em

acetona. Os gráficos representam a média do edema de orelha (%) e as barras verticais o

E.P.M de 7 animais registrados após 1h da aplicação tópica do ácido araquidônico. ***

p<0,001 vs controle (ANOVA e Teste de Student- Newman- Keuls).

Controle IND OELS Timol0

50

100

150

******

AA

***

Percen

tual

de e

dem

a (

%)


induzido ptela aplicação intradérmica de histamina em camundongos. Os animais foram

previamente anestesiados, pré-tratados com salina (controle), dexametasona 0,08 mg/orelha

(DEX), OELS ou timol (2 mg/orelha) e após 15 minutos receberam intradermicamente 5 µL

de solução de histamina 100 mg/mL em salina. Os gráficos representam a média do edema

de orelha (%) e as barras verticais o E.P.M de 7 animais registrados após 2h da aplicação da

histamina. *** p<0,001 vs controle (ANOVA e Teste de Student- Newman- Keuls).


20

40

60

80

100

Histamina

***

nsns

Percen

tual

de e

dem

a (

%)

92

Tabela 12 ‒ Porcentagem do edema de orelha induzido por fenol em camundongos e o efeito

inibitório médio após aplicação tópica do OELS, timol (2 mg/orelha) ou dexametasona (0,08

mg/orelha).

Tratamento

Fenol

Porcentagem de edema EIM

Controle negativo 99,68±14,70 -

Dexametasona 47,27±6,83** 52,6%

OELS 66,62±6,31* 33,2%

Timol 45,13±9,60** 54,7%

Dados expressos como média ± E.P.M. * p<0,05; ** p< 0,01 quando comparados

com o grupo controle negativo (ANOVA e Teste de Student-Newman-Keuls).


induzido pela aplicação de fenol em camundongos. Os animais foram previamente tratados

com acetona (controle), dexametasona 0,08 mg/orelha (DEX), OELS ou timol (2 mg/orelha) e

após 15 minutos receberam topicamente 20 µL de fenol 10% (v/v) em acetona. Os gráficos

representam a média do edema de orelha (%) e as barras verticais o E.P.M de 7 animais

registrados após 1h da aplicação tópica do fenol. * p<0,05; **p<0,01 vs controle (ANOVA e

Teste de Student- Newman- Keuls).


50

100

150

Fenol

****

*

Percen

tual

de e

dem

a (

%)

93

Vários modelos experimentais de inflamação podem ser utilizados para avaliar a

atividade antiinflamatória de drogas. No presente estudo, foi analisado o possível efeito

antiinflamatório do OELS e do seu constituinte majoritário, o timol, em modelos

experimentais de inflamação aguda e crônica induzidos por agentes irritantes (óleo de cróton,

ácido araquidônico, fenol e histamina) em camundongos Swiss. Estes modelos permitem

identificar compostos com atividade antiinflamatória que possam ser potencialmente úteis no

tratamento de doenças inflamatórias que acometem a pele, pois promovem condições que se

assemelham com alguns tipos de dermatites observadas em humanos (BOUCLIER et al.,

1990).

A dexametasona, um corticosteróide usado clinicamente no tratamento das desordens

da pele, é conhecido por sua potente atividade antiinflamatória e imunossupressora, no

entanto seu efeito tópico pode causar intensa atrofia da pele, um dos principais efeitos

colaterais do seu uso em doenças crônicas (ASHWELL et al., 2000).

O agente irritante óleo de cróton, extraído das sementes de Croton tiglium, tem como

constituinte majoritário o 13-acetato de 12-o-tetracanoilforbol (TPA) (LAPA, 2003). A

aplicação tópica de TPA induz uma resposta inflamatória cutânea caracterizada por

vasodilatação e formação de eritema nas primeiras duas horas, seguido do aumento da

espessura da orelha como resultado do extravasamento celular que atinge um pico máximo na

sexta hora e tende a diminuir, atingindo os valores basais após 24 horas. A aderência dos

leucócitos polimorfonucleares na parede dos vasos e a degranulação de mastócitos é

verificada entre a 4ª e 6ª hora. No entanto, a infiltração máxima de leucócitos no tecido é

atingida somente 24 horas após a aplicação tópica do TPA (YOUNG et al., 1983).

O mecanismo pelo qual o TPA exerce seu efeito é devido à ativação da Proteína

quinase C (PKC), bem com da ativação seqüencial da via MAP quinase (MAPK), fosfolipase

A2 (PLA2), indução da expressão da COX-2 e translocação/ativação da LOX, que por sua vez

culmina na síntese e liberação de diversos mediadores pró-inflamatórios responsáveis pela

formação do edema, migração de leucócitos para a derme e hiperproliferação celular, sendo

estas as características da resposta inflamatória induzida pela aplicação tópica do TPA

(MURAKAWA et al., 2006; DE BERNARDIS et al., 1994).

A ativação da MAPK pela PKC promove a ativação de alguns fatores de transcrição

nuclear, como NF-kB e a AP-1, os quais tem um papel central na regulação de diversas

proteínas pró-inflamatórias, tais como algumas citocinas (IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, TNF-α),

enzimas pró-inflamatórias (COX-2, iNOS) e moléculas de adesão (PASCUAL e GLASS,

94

2006; GLASS e OGAWA, 2006; GARCIA-PIÑERES et al., 2001). Por outro lado, a

fosforilação da PLA2 pela PKC resulta na liberação de Ácido araquidônico (AA) seguida da

produção de prostaglandinas (PG) e leucotrienos (LT) via COX e LOX, respectivamente

(WANG et al., 2000).

A aplicação única de óleo de cróton fornece dados quanto à atividade

antiedematogênica de uma substância num processo inflamatório agudo, enquanto que a

aplicação múltipla, em dias alternados, avalia a atividade antiedematogênica num processo

inflamatório já estabelecido, com características semelhantes a uma inflamação crônica

(SARAIVA, 2009). Os resultados mostram que o OELS e timol não promoveram supressão

do edema induzido pela aplicação única e múltipla de óleo de cróton na dose testada (Figuras

10, 11 e 13). Durante o experimento crônico, foi observado que tanto o OELS como o timol

foram capazes de promover o aumento da espessura das orelhas após 24 horas do início do

tratamento, aumentando o percentual de edema consideravelmente no último dia do

experimento (Figura 11).

A aplicação tópica do AA gera uma resposta inflamatória rápida caracterizada por

intenso eritema e edema com pequeno acúmulo de neutrófilos, quando comparado com a

migração celular verificada no modelo de óleo de cróton, cujos principais mediadores

envolvidos são PGE2, LTC4 e LTD4 (YOUNG et al., 1983; HUMES et al., 1986; CRUMMEY

et al., 1987). Os antiinflamatórios não- esteroidais (AINEs) inibem a via da COX, impedindo,

portanto a síntese das PGs (RANG et al., 2007). Assim, o fármaco de referência utilizado

neste modelo experimental foi a indometacina, um AINE cuja ação antiinflamatória está

relacionada com a inibição não-seletiva das isoformas da COX (COX-1 e COX-2) e que

reverte efetivamente o edema induzido pela aplicação tópica do AA, conforme descrito na

literatura (GABOR, 2000). Da mesma forma que a indometacina, o OELS e timol também se

mostraram efetivos na inibição da formação do edema neste modelo.

Na inflamação causada pelo modelo de óleo de cróton, corticosteróides e inibidores

da LOX demonstram atividade nesse modelo, enquanto que os inibidores da COX e anti-

histamínicos demonstram pouco ou nenhum efeito (GREEN e SHUSTER, 1987). Diante

disso, nossos resultados sugerem que possivelmente o OELS e timol não são capazes de inibir

a LOX nem a PLA2, mas apresentam importante ação sobre as COX.

O modelo de edema de orelha induzido por TPA e AA são extremamente úteis na

detecção in vivo de inibidores da COX/LOX (CARLSON et al., 1985). No entanto, os

metabólitos do AA também promovem a degranulação de mastócitos, de forma que a

95

liberação de histamina contribui parcialmente na formação do edema neste modelo (CAMP,

1982). Assim, deve-se considerar que o modelo do AA não é específico para identificação de

compostos que inibem exclusivamente a COX e/ou LOX, pois outros agentes antagonistas da

histamina e antioxidantes também reduzem o edema induzido por AA (CRUMMEY, 1987).

Em geral, os corticóides não promovem nenhum efeito pelo AA, ao passo que alguns

monoterpenos inibem o metabolismo do AA (JUERGENS et al., 2003).

O timol é capaz de inibir significativamente a agregação plaquetária induzida por

ácido araquidônico (ENOMOTO et al., 2001). Em estudos feitos por Marsik e colaboradores

(2005) demonstraram que o timol presente nas sementes de Nigella sativa, pode apresentar

atividade antiinflamatória devido à inibição da COX-1, e sugeriram mais estudos relacionados

a este composto para o possível uso como antiinflamatório não-esteroidal. O óleo essencial de

Lippia gracilis, contendo timol como composto majoritário (32,68%), foi capaz de reduzir a

inflamação no edema de pata induzido por carragenina e demonstrou efeito antinociceptivo no

modelo de contorções abdominais induzido por ácido acético (MENDES et al.,2010).

A inflamação induzida por carragenina envolve migração celular e produção de

mediadores como óxido nítrico, PGE2, IL-1, IL-6 e TNF-α. (LORAM et al., 2007). No

modelo de dor visceral, há liberação de ácido araquidônico e através das ciclooxigenases, há

biossíntese de prostaglandinas que possuem um papel importante no mecanismo nociceptivo,

como a PGE2. Então nesse estudo, o timol foi o composto responsável pelas atividades

farmacológicas observadas sendo possivelmente ativo na inibição das ciclooxigenases

(MENDES et al., 2010).

Também foi avaliado o efeito do OELS ou timol sobre outros modelos de inflamação

cutânea como o modelo de edema de orelha induzido por fenol e histamina, que mimetizam a

dermatite de contato irritativa e reação alérgica do tipo imediata, respectivamente. O fato do

OELS e timol inibirem o edema induzido por um agente irritante como o fenol demonstra a

possível eficácia destes no tratamento da dermatite de contato frente a agentes irritantes. Em

resposta a estímulos exógenos, como o fenol, os queratinócitos produzem mediadores

químicos importantes na irritação primária de contato, incluindo citocinas associadas a

propriedades pró-inflamatórias, tais como IL-1, IL-8 e TNF-α (WILMER et al., 1994; LIM et

al., 2004). Um dos mecanismos pelos quais o fenol promove a irritação cutânea seria a

ruptura da membrana plasmática dos queratinócitos por efeito direto, resultando na liberação

da IL-1, além de outros mediadores inflamatórios como os metabólitos do AA. As citocinas

pró-inflamatórias são induzidas nesse modelo por um mecanismo distinto daquele observado

96

no modelo de inflamação cutânea induzido por TPA, onde a indução de citocinas ocorre via

ligação a receptores específicos, através de vias dependentes da PKC, nas quais envolvem

fatores de transcrição nuclear (WILMER et al., 1994). No entanto, apesar da resposta

inflamatória ser desencadeada por diferentes vias, ambos os modelos compartilham do

envolvimento dos metabólitos do AA na resposta inflamatória instalada. Assim, esses dados

sugerem que o OELS e seu constituinte majoritário, o timol, podem estar exercendo sua ação

antiinflamatória por atuar sobre esses mediadores, como eficientemente demonstrado no

modelo de AA (MONTEIRO et al., 2007; OZEN et al., 2011).

Os mastócitos desencadeiam reações imediatas do tipo alérgica em resposta a

diversos alérgenos, através da interação dos seus receptores de superfície com a IgE,

conduzindo a degranulação e liberação de diversos mediadores vasoativos, pró-inflamatórios

e nociceptivos, como a histamina, citocinas (IL-6, IL-8, IL-13), prostaglandinas (PGD2),

leucotrienos (LTC2), TNF-α e o fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF)

(THEOHARIDES et al., 2007). A histamina causa vasodilatação e um aumento na

permeabilidade vascular, promovendo uma resposta edematogênica em poucos minutos, além

de estimular fibras nervosas sensitivas através de mecanismos H1-dependentes que resulta em

prurido (BRAND et al., 2002). Uma das principais funções fisiopatológicas da histamina é a

sua ação como mediador das reações de hipersensibilidade do tipo I, como a urticária (RANG

et al., 2007; BRAND et al., 2002).

O OELS e timol não foram capazes de reduzir significativamente o edema induzido

por histamina, comparados ao controle negativo (salina) (p > 0,05). Esse resultado sugere que

não há envolvimento do OELS e timol na inibição da histamina produzida na ação

edematogênica induzida por AA, e sim na influência da produção de eicosanóides

inflamatórios (PGs e LTs).

Nossos resultados demostraram que, no modelo de edema de orelha crônico, como

observado em doenças inflamatórias crônicas, o tratamento em dias seguidos com OELS ou

timol promoveu o efeito pró-inflamatório e dano cutâneo. Eventualmente, o mecanismo de

ação envolvido neste processo pode ser explicado pela envolvimento de enzimas LOX. Nas

doenças crônicas, como artrite reumatóide e psoríase, há uma alteração na liberação de

citocinas pró-inflamatórias (por exemplo, interleucinas), fatores de crescimento e enzimas

pró-inflamatórias como COX e LOX que geram PGs e LTs, respectivamente, resultantes da

infiltração de leucócitos no tecido cutâneo (células T, neutrófilos e mastócitos) (KRUEGER e

BAWCOCK, 2006).

97

O estudo feito por Roschek et al. (2009) foi demonstrado que o extrato de farelo de

arroz SRB-AI (apresentando timol em sua composição química) foi capaz de promover uma

inibição dose-dependente da COX-1 e COX-2, e seletivamente inibiu a COX-2 10 vezes mais

que a COX-1. Não foi detectada inibição da 5-LOX pelo SRB-AI. A 5-LOX catalisa a

biotransformação do ácido araquidônico em hidroperóxidos de ácidos graxos, lipoxinas e

leucotrienos (como LTB4), os quais estão envolvidos em processos alérgicos e dor. Sahouo et

al. (2003) mostraram que a função das ciclooxigenases foi inibida pelos constituintes

químicos do óleo essencial de O. gratissimum, que apresenta timol como componente

majoritário (70,8 %), com IC50 de 125 µg/mL.

Elhabazi et al. (2006) demonstraram que os extratos Thymus broussonetti (rico em

timol) foram capazes de aumentar o número de neutrófilos, linfócitos totais, linfócitos T CD4

+, CD8 + e células NK. Os neutrófilos são células importantes na defesa do hospedeiro contra

microorganismos invasores, através da fagocitose, da degranulação e da produção de espécies

reativas de oxigênio (ROS), sendo que esta última é decorrente da ativação do metabolismo

oxidativo dos neutrófilos. As ROS produzidas, tais como HO., NO, H2O2, que são essenciais

para eliminar os microrganismos fagocitados, podem ser liberadas para o meio extracelular e

causar lesões aos tecidos do hospedeiro (KABEYA, 2002). O estímulo da liberação de

eicosanóides (através da 5-LOX) e citocinas, como IL-1 e TNF-α ativa neutrófilos e

macrófagos, aumentando a produção e liberação de ROS, as quais têm sido relacionados ao

dano tecidual local observado no modelo de edema de orelha crônico induzido por OC.

Diante disso, um possível mecanismo de ação anti-inflamatória (edema agudo de

orelha) do óleo essencial de L. sidoides e do timol, pode estar associado às enzimas COX,

como demonstrado nos modelo de AA e fenol. No entanto, o efeito pró-inflamatório

observado no edema crônico da orelha pode ser relacionado pelo aumento da atividade da

enzima 5-LOX na biotransformação do AA em hidroperóxidos de ácidos graxos, lipoxinas e

leucotrienos os quais induzem a formação de ROS pelos polimorfonucleares. Os resultados

são relevantes e promissores e sugerem que o timol é o composto responsável pelas atividades

biológicas observadas pelo óleo essencial dessa espécie.

98

CONCLUSÕES

______________________________________________

99

6 CONCLUSÕES

A composição química do óleo essencial de L. sidoides é caracterizada por conter o

timol o componente majoritário, apresentando 84,9% da composição química, que está

em conformidade com outros trabalhos relatados para essa espécie.

A atividade antibacteriana e antifúngica verificada pelo OELS parece ser determinada

pela presença do timol, pois os mesmos apresentaram os mesmos valores de

Concentração Inibitória Mínima (CIM) frente aos microrganismos testados, sendo

mais relevantes frente à Staphylococcus aureus ATCC 12624, Candida albicans

ATCC 40006 e Candida tropicalis ATCC 40042.

Foi observado sinergismo com aminoglicosídeos e ß- lactâmicos quando os mesmos

foram associados ao OELS e timol, por contato direto, frente a algumas bactérias. Os

componentes voláteis do óleo e o timol foram capazes de interferir na atividade de

aminoglicosídeos por contato gasoso, potencializando a ação desses antibióticos. Por

outro lado, a associação entre o OELS ou timol com o fluconazol frente a espécies de

Candida não foi capaz de interferir na atividade antifúngica.

O OELS e timol são capazes de reduzir in vitro as UFC em biofilmes de E. faecalis

(tempo de maturação de 72 horas) no tempo de contato de 30 e 60 minutos em

concentrações de 2,5 e 10%, não havendo diferenças estatísticas entre a ação

antimicrobiana dos mesmos.

A aplicação tópica de OELS e timol (2 mg/orelha), demonstrou eficácia na redução do

edema induzido por ácido araquidônico e fenol. Possivelmente sua ação pode estar

relacionada à redução da produção de mediadores pro – inflamatórios, por inibição da

COX. Além disso, não houve diferença estatística entre a atividade antiedematogênica

do OELS e timol.

100

REFERÊNCIAS

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128

ANEXOS

______________________________________________

129

ANEXO A – Produção científica vinculada ao projeto de mestrado

Artigos submetidos:

1. Periódico: Journal of Endodontics.

Toxic effect of essential oil of Lippia sidoides Cham. and thymol

on Enterococcus faecalis biofilm.

Helenicy NH Veras, MSc *†

, Fabíola FG Rodrigues, MSc ‡, Marco A Botelho, PhD

*, Irwin

RA Menezes, PhD*, Henrique DM Coutinho, PhD

* and José Galberto M Costa, PhD

*‡

ABSTRACT

Introduction: The species Lippia sidoides Cham. (Verbenaceae) is utilized in popular

medicine as a local antiseptic on the skin and mucosal tissues and its therapeutic effect is

attributed to the presence of thymol. Enteroccocus faecalis is the bacterium most frequently

isolated from root canals of teeth with persistent periapical lesions and has the ability to form

biofilm, which protects it against antimicrobial against, where it is responsible for the failure

of endodontic treatments. Methods: the essential oil of the leaves of L. sidoides (EOLS) and

its major component, thymol, were evaluated with respect to antimicrobial activity against

Enterococcus faecalis biofilm. The leaves of L. sidoides were subjected to hydrodistillation,

and the essential oil extracted was examined with respect to the chemical composition, by gas

chromatography-mass spectrometry (GC-MS). EOLS and thymol were evaluated for reduced

the CFU in biofilms of E. faecalis in vitro. Results: The overall yield of essential oil obtained

by hydrodistillation was 1.06%. The GC-MS analysis has led to the identification of the main

components thymol (84.9 %) and p-cymene (5.33%). EOLS and thymol reduced the CFU in

biofilms of E. faecalis in vitro (time of maturation of 72 h), with an exposure time of 30 and

60 min at concentrations of 2.5 and 10%. There was no statistical difference in effect

between EOLS and thymol, demonstrating that this phenolic monoterpene was the compound

responsible for the antimicrobial activity of EOLS. This is the first report of the action of

EOLS against E. faecalis biofilm. Conclusions: our study provides a basis for the possible

utilization of EOLS as an adjuvant in the treatment of root canals that show colonization by E.

faecalis. However, pre-clinical studies are necessary to determine the true efficacy and

concentration of EOLS capable of killing biofilm bacteria in vivo.

Key-words: Lippia sidoides, thymol, biofilm, Enterococcus faecalis

131

2. Periódico: Phytomedicine

Topical anti-inflammatory activity of essential oil

from Lippia sidoides Cham.: possible mechanism of action.

Helenicy N.H. Veras1, Mariana K.A. Araruna

2, José G.M. Costa

1, Henrique D.M.

Coutinho3*

, Marta R. Kerntopf2, Marco A. Botelho

1, Irwin R.A. Menezes

2

ABSTRACT

Lippia sidoides Cham. (Verbenaceae), known as “alecrim pimenta”, is a shrub easily found in

Brazilian Northeast, widely used in folk medicine as antiseptic for local use in skin and

mucous. This work reports the L. sidoides essential oil chemical composition and comparative

evaluation of topical effect of this essential oil (EOLS) and thymol (major constituent) against

different irritant agents in vivo, in order to verify its antiedematogenic effect as well to

unravel its tentative mechanisms of action. The essential oil was obtained by hydrodistillation

(yield of 1.06%) and the GC/MS analysis identified the main constituents: thymol (84.9 %)

and p-cymene (5.33%). The anti-inflammatory activity was evaluated, using a mice ear

inflammation model induced by croton oil, arachidonic acid, phenol and histamine. The

topical application of EOLS or thymol at dose of 2 mg/ear, significantly reduced (P < 0.001)

in 45.1% and 47.4% the ear edema induced by arachidonic acid and reduced in 33.2% (P

<0.05) and 54.7% (P <0.01) the ear edema induced by phenol in acute ear edema. However,

was evidenced pro-inflammatory effect in chronic era edema induced by croton oil. There

were not statistical differences between EOLS and thymol for the antiedematogenic activity.

In conclusion, the results obtained showed that thymol is the constituent responsible for the

topical anti-inflammatory activity of EOLS in the models of arachidonic acid and phenol in

mice, possibly reducing the production of pro-inflammatory mediators and can be a source of

active compounds with activity antiedematogenic.

Key- words: Lippia sidoides; thymol; anti-inflammatory activity; ear edema; essential oil

133

3. Periódico: European Journal of Medicinal Chemistry

Synergistic antibiotic activity of volatile compounds from the essential oil of

Lippia sidoides and thymol.

Helenicy N.H. Verasa, Fabíola F.G. Rodrigues

a, Aracélio V. Colares

a, Irwin R. Alencar

de Menezesb, Henrique D. Melo Coutinho

c*, Marco A. Botelho

a, José G. M. da Costa

a

Lippia sidoides Cham. (Verbenaceae) is used in the folk medicine as topical antiseptic in skin

and mucous membranes and its therapeutic effect is attributed to the thymol presence. The

objective of this work was verify the chemical composition and antibiotic modifying activity

of the essential oil extracted from the leaves of L. sidoides and its major component thymol.

The essential oil was obtained by hydrodistillation (yield of 1.06%) and the GC / MS analysis

identified the main constituents: thymol (84.9%) and p-cymene (5.33%). The antibiotic

modifying activity was verified using the minimal inhibitory doses method and gaseous

contact. It was verified that the essential oil and thymol interfered with all tested

aminoglycosides. There were not statistical differences between the activity of the essential

oil and thymol against P. aeruginosa, indicating to be this responsible composition for such

activity. However, the oil was shown more effective when compared to the thymol against S.

aureus. The essential oil of L. sidoides and its major component thymol influences the activity

of aminoglycosides and may be used as adjuvant in antibiotic therapy against respiratory tract

bacterial pathogens.

Keywords: Lippia sidoides, thymol, antibiotic activity, gaseous contact, Pseudomonas

aeruginosa, Staphylococcus aureus.

135

4. Periódico: Journal of Pharmaceutical & Biomedical Analysis

Enhancement of aminoglycosides and ß- lactams antibiotic activity by essential oil

of Lippia sidoides Cham.

H.N.H. Verasa, F.F.G. Rodrigues

a, M.A. Botelho

a, I.R.A. Menezes

b, H.D.M. Coutinho

c*,

J.G.M. Costaa

ABSTRACT

Natural products from plants can alter the effect of antibiotics, increasing or reducing its

activity. Lippia sidoides Cham. (Verbenaceae) is a bush found in the Northeastern region of

Brazil. In the popular medicine, L. sidoides has been used as antiseptic. In this work we report

the chemical composition of the essential oil from L. sidoides and to determine the

potentiation of the activity of aminoglycosides and ß - lactams. The essential oil showed as

major compounds the thymol (84.9%), Etil-methyl-carvacrol (5.33%) and p-cymene (3.01%).

The determination of the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) by microdiluition

demonstrated none difference in the antimicrobial activity between the essential oil (EOLS)

and thymol. There was reduction in the MIC of the amynoglicosides gentamicin and

neomycin when associated to EOLS and thymol. When the natural products were associated

with the ß - lactam Penicillin G and Ceftriaxone, the MIC was reduced against Streptococcus

mutans and Enterococcus faecalis. The results demonstrated that the thymol is the compound

responsible by the antimicrobial and modifying of antibiotic activity in vitro of the EOLS.

More studies are necessary in order to evaluate the behavior of that association alive in to

verify the biodisponibility and the possible toxic effects.

Keywords: Lippia sidoides, thymol, Antibacterial activity, modifying antibiotic activity.

137

ANEXO B– Produção científica não vinculada ao projeto de mestrado

Artigo aceitos para publicação:

1. Periódico: Journal of Essential Oil Bearing Plants

Lippia alba (Mill.) N.E. essential oil interfere with aminoglycosides effect against

Staphylococcus aureus

Helenicy N. H. Veras1, Adriana R. Campos

1,2, Fabíola F. G. Rodrigues

2, Marco A. Botelho

1,

Henrique D.M. Coutinho1 and

José G. M. da Costa

1*

ABSTRACT: Lippia sp essential oils have been popularly used to treat infectious diseases

and some studies have shown their effect on microorganisms control. Lippia alba (Mill.) N.E.

Brown, known as “cidreira”, is a shrub easily found in Brazilian Northeast. The traditional use

of their leaves, used as tea to treat some affections, justify the investment in further

investigations. This work reports the L. alba essential oil chemical composition and its

aminoglycosides modifying effect against Staphylococcus aureus ATCC 6538, S. aureus

ATCC 25923 and S. aureus ATCC 12692. The essential oil was obtained by hydrodistillation

(yield of 0.52%) and the GC/MS analysis identified the main constituents: Geranial (31.4 %),

Neral (29.5 %), β-elemene (16.5 %) and geranyl acetate (13.3 %). It was verified that the

essential oil interfered with all tested aminoglycosides. The antibiotic activity of gentamicin

against S. aureus ATCC 25923 was enhanced (275%) in the presence of 12% essential oil.

The 3% essential oil increased the effect against S. aureus ATCC 25923 (41.6%) and S.

aureus ATCC 6538 (58.3 %).

Key words: Lippia alba, essential oil, chemical composition, aminoglycosides, modulatory

activity.

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2. Periódico: Pharmacognosy Magazine

Enhancement of the antibiotic activity of erythromycin by volatile compounds of Lippia

alba (Mill.) N.E. Brown against Staphylococcus aureus

Helenicy N. H. Veras, Adriana R. Campos, Fabíola F. G. Rodrigues, Marco A. Botelho,

Henrique D. M. Coutinho, Irwin R. A. Menezes and José Galberto M. da Costa.

ABSTRACT

Background: Lippia alba (Mill.) N.E. Brown, popularly known as “erva-cidreira,” is

commonly found in northeastern Brazil. The leaves tea is used to treat digestive disturbances,

nausea, cough, and bronchitis. Objective: This work reports the chemical composition and

erythromycin-modifying activity by gaseous contact against Staphylococcus aureus.

Materials and Methods: The leaves of L. alba were subjected to hydrodistillation, and the

essential oil extracted was examined with respect to the chemical composition, by gas

chromatography-mass spectrometry (GC-MS), and the essential oil extracted was evaluated

for antibacterial and antibiotic-modifying activity by gaseous contact. Results: The overall

yield of essential oil obtained by hydrodistillation was 0.52%. The GC-MS analysis has led to

the identification of the main components: geranial (31.4%) and neral (29.5%). It was verified

that the essential oil interfered with erythromycin antibiotic activity against S. aureus ATCC

25923 was enhanced (221.4%) in the presence of 12% essential oil. The 3% essential oil

increased the effect against S. aureus ATCC 25923 (41.6%) and S. aureus ATCC 6538

(58.3%). Conclusion: The essential oil of L. alba influences the activity of erythromycin and

may be used as an adjuvant in antibiotic therapy against respiratory tract bacterial pathogens.

Key words: Chemical composition, erythromycin, essential oil, Lippia alba, modulatory

activity

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