UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE INSTITUTO … · 1.1 NEUROGÊNESE NO CÓRTEX CEREBRAL...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
INSTITUTO DO CÉREBRO
PÓS-GRADUAÇÃO EM NEUROCIÊNCIAS
EFEITOS DA SINALIZAÇÃO VIA CREB SOBRE A SOBREVIVÊNCIA E
DIFERENCIAÇÃO NEURONAL
THEMIS TAYNAH DA SILVA SANTANA
NATAL/RN
2012
THEMIS TAYNAH DA SILVA SANTANA
EFEITOS DA SINALIZAÇÃO VIA CREB SOBRE A SOBREVIVÊNCIA E
DIFERENCIAÇÃO NEURONAL
Dissertação de mestrado apresentada
ao Programa de Pós-graduação em
Neurociências da Universidade Federal
do Rio Grande do Norte como requisito
para obtenção do título de Mestre em
Neurociências.
ORIENTADOR: PROF. DR. MARCOS ROMUALDO COSTA
NATAL/RN
2012
Catalogação da Publicação na Fonte Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Instituto do Cérebro
S231e Santana, Themis Taynah da Silva.
. Efeitos da sinalização Via Creb sobre a
sobrevivência e diferenciação neuronal / Themis Taynah da Silva Santana. - Natal, 2012. 91f: il.
Dissertação (Mestrado em Ciências, Área de concentração: Neurociências). Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Orientador: Profº. Dr. Marcos R. Costa.
.
1. Neurociências - Dissertação. 2. Córtex cerebral. 3. CREB. 4. Diferenciação dentrítica. I. Título
RN/UF/BSET/ICe CDU
612.8 RN/UF/BSET/ICE
CDU 612.8
THEMIS TAYNAH DA SILVA SANTANA
EFEITOS DA SINALIZAÇÃO VIA CREB SOBRE A SOBREVIVÊNCIA E
DIFERENCIAÇÃO NEURONAL
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em
Neurociências da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito para
obtenção do título de Mestre em Neurociências.
Aprovada em: 21/09/2012.
À Aline, por todo apoio, paciência
e companheirismo durante esses dois
anos, suportando os altos e baixos e os
acontecimentos inesperados.
À minha família, minha bússola,
meu Norte; onde sempre posso ancorar
e buscar suporte, compreensão.
Em especial, meu agradecimento
ao meu Professor Orientador, Marcos
Costa, pela confiança, imensa simpatia e
paciência que tornaram a execução
desse trabalho muito mais agradável.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente, a Deus, com o salmo que minha avó me ensinou - “O Senhor é o
meu pastor e nada me faltará.” (Salmo 23).
À minha mãe, pelo esforço contínuo em me proporcionar o melhor, incluindo a
melhor educação, que me ajudou a chegar até aqui.
Ao meu avô Doca que sempre sonhou me ver formada. Aqui estou eu, já no
mestrado!
As minhas companheiras de laboratório, em especial Jéssica Alves e Bruna
Landeira, pela ajuda nos experimentos e pelo apoio nos momentos mais complexos!
E à Sylvia Pinheiro pela enorme ajuda nas análises da vídeo-microscopia.
À professora Magdalena Götz, por abrir as portas de seu laboratório na
Alemanha.
À professora Luciana da Matta, por ter aceitado participar da minha banca de
defesa e pelos mais tantos conhecimentos compartilhados enquanto minha
orientadora na iniciação científica.
Ao professor João Menezes, também por aceitar fazer parte da minha banca.
Obrigada pela disponibilidade.
8
Pensar sobre o cérebro já é uma espécie de
enigma, porque você só pode pensar sobre
seu cérebro usando o seu cérebro. (...)
Parece, então, que estamos presos em um
paradoxo lógico de um sistema de auto-
referência, e nesse caso, de um sistema
obsecado por si mesmo. Talvez a única
conclusão confiável desse experimento de
pensamento seja de que o cérebro é muito
cheio de si.
Michael O’Shea
9
RESUMO
O desenvolvimento cortical requer um minucioso processo de
proliferação, migração, sobrevivência e diferenciação celular para que se
possa alcançar a elaboração de uma rede neuronal funcional. Diferentes
kinases, tais quais a PKA, CaMKII, MAPK e PI3K, fosforilam o fator de
transcrição CREB, ativando-o, e induzindo em ultima instância a expressão
de genes CREB-dependentes. A fim de identificar o envolvimento de tais vias
de sinalização mediadas por CREB sobre a diferenciação e sobrevivência
neuronal, experimentos in vitro de cultura celular foram conduzidos fazendo-
se uso de fármacos bloqueadores das kinases e de técnicas genéticas para
expressar diferentes formas do CREB (A-CREB e CREB-FY) em neurônios
corticais. A inibição da PKA e da CAMKII diminuiu o comprimento dos
neuritos; enquanto a inibição da MAPK não afetou o comprimento, mas
aumentou o numero de neuritos. O bloqueio da PI3K não pareceu alterar a
morfologia neuronal, nem o tamanho do soma foi afetado pelo bloqueio
dessas kinases. A ativação de CREB (CREB-FY) na presença de
bloqueadores da MAPK e PI3K teve um efeito negativo sobre o crescimento
neurítico e a expressão do A-CREB provocou uma redução significativa da
sobrevivência neuronal a partir de 60h in vitro e revelou similaridades quanto
à morfologia neuronal observadas com o bloqueio da PKA e CaMKII. Em
suma, a sinalização mediada por CREB influi na morfologia de neurônios
corticais, principalmente quando fosforilado pela PKA, e o bloqueio da
sinalização via CREB interfere na sobrevivência neuronal mesmo antes do
aparecimento de atividade sináptica. Nossos resultados contribuem para o
entendimento da sinalização por CREB, ativado por diferentes vias, sobre a
sobrevivência e diferenciação neuronal, podendo ser de grande valia na
elaboração de estratégias regenerativas em diferentes doenças neurológicas.
Palavras chave: Córtex, CREB, vias de sinalização, diferenciação dendrítica, sobrevivência
neuronal.
10
ABSTRACT
The cortical development requires a precise process of proliferation, migration,
survival and differentiation of newly formed neurons to finally achieve the
development of a functional network. Different kinases, such as PKA, CaMKII, MAPK
and PI3K, phosphorylate the transcription factors CREB, and thus activate it,
inducing CREB-dependent gene expression. In order to identify the involvement of
such signaling pathways mediated by CREB over neuronal differentiation and
survival, in vitro experiments of cell culture were conducted using pharmacological
kinase inhibitors and genetic techniques to express different forms of CREB (A-
CREB and CREB-FY) in cortical neurons. Inhibition of PKA and CaMKII decreased
the length of neuronal processes (neurites); whereas inhibition of MAPK did not
affect the length, but increased the number of neurites. Blockade of PI3K do not
appear to alter neuronal morphology, nor the soma size changed with the kinase
blockades. CREB activation (CREB-FY) along with MAPK and PI3K blockades
presented a negative side effect over neuritic growth and the expression of A-CREB
leaded to a significant decrease in neuronal survival after 60h in vitro and mimicked
some of the effects on neuronal morphology observed with PKA and CaMKII
blockade. In summary the signaling through CREB influences the morphology of
cortical neurons, particularly when phosphorylated by PKA, and CREB signaling is
also important for survival of immature neurons prior to the establishment of fully
functional synaptic contacts. Our data contribute to understanding the role of CREB
signaling, activated by different routes, on survival and neuronal differentiation and
may be valuable in the development of regenerative strategies in different
neurological diseases. Keywords: Cortex, CREB, signaling pathways, dendrite differentiation,
neuronal survival.
11
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 Histogênese no córtex cerebral .................................................... 17 Figura 2 Estudos de Birthdating demonstram o padrão “de dentro para
fora” da histogênese do córtex cerebral ....................................... 18
Figura 3 CREB ativa a proteína anti-apoptótica Bcl-2 ................................ 27 Figura 4 Organização anatômica do córtex embrionário de camundongo 35
Figura 5 Traçado dos neuritos ................................................................... 42 Figura 6 Neurônio expressando a proteína fluorescente verde (GFP) ...... 43 Figura 7 Análise morfológica de neurônios tratados farmacologicamente
com os inibidores da PKA (H-89) e da CaMKII (KN-62) .............. 46 Figura 8 Análise morfológica de neurônios tratados farmacologicamente
com os inibidores da MAPK (U0126) e da PI3K (Wort) ................ 47 Figura 9 Tamanho do soma de neurônios corticais tratados
farmacologicamente com os bloqueadores de kinases ................ 48 Figura 10 Neurônios GFP-positivos .............................................................. 49 Figura 11 Comprimento médio de cada neurito (µm) ................................... 50 Figura 12 Soma dos comprimentos dos neuritos (µm).................................. 51 Figura 13 Comprimento do neurito mais longo (µm) .................................... 53 Figura 14 Número total de neuritos por neurônio: Primários e Ramos ....... 55 Figura 15 Número de bifurcações por neurônio ........................................... 56 Figura 16 Número de bifurcações por neurito .............................................. 57 Figura 17 Taxa de sobrevivência neuronal (%) ............................................ 58 Figura 18 Densidade de neurônios em cultura ............................................. 59
12
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Exemplo de tabela gerada pelo programa ImageJ a partir do traçado dos neuritos .................................................................
42
13
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
Bcl-2 B-cell lymphoma 2
BDNF Brain Derived Growth Factor
BrdU 5‟-Bromo-2‟-deoxiuridina
BZIP Basic leucine zíper
CaMKs Proteína Kinase Cálcio/Calmodulina-dependente
CBP CREB-Binding Protein
Cm Centímetros
CP Placa Cortical
CRE cAMP response element
CREB cAMP Responsive Element Binding Protein
DEMEN Dulbecco's Modified Eagle Medium
DIV Dias in vitro
DMSO Dimetilsulfóxido
EGF Epidermal Growth Factor
ERK Extracellular signal-Regulated Kinase
FGF Fibroblast Growth Factor
G Grama
GFP Green Fluorescent Protein
HBSS Hank’s Balanced Salt Solution
HDACs Histone deacetilases
IEGs Immediate-Early-Response Genes
IRES Internal Ribossomal Entry Site
KCl Cloreto de Potássio
Km Constante de Michaelis
MAP2 Microtubule-Associated Protein 2
MAPK Mitogen-Activated Protein Kinase
Min Minuto
Ml Mililitro
mM Milimolar
MTs Microtúbulos
14
MZ Zona Marginal
NGF Nerve Growth Factor
NT-4 Neurotrofina-4
PBS Phosphate Buffered Saline
PC Placa cortical
pCMV Packaging plasmid
PDL Poli-D-lisina
PSD Densidade pós-sináptica
PVE Epitélio pseudoestratificado
pVSVG Pseudotyping plasmid
RSK-6 Ribosomal s6 kinase
Ser133 Serina 133
VGCC Voltage Gated Calcium Channel
Wort Wortmannin
ZSV Zona subventricular
ZV Zona ventricular
l Microlitro
15
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ........................................................................................ 16 1.1 NEUROGÊNESE NO CÓRTEX CEREBRAL .......................................... 16 1.2 SOBREVIVÊNCIA E DIFERENCIAÇÃO NEURONAL ............................ 19 1.3 PAPEL DO CREB NA SOBREVIVÊNCIA E DIFERENCIAÇÃO
NEURONAL ............................................................................................ 24 1.4 CREB, PLASTICIDADE E DOENÇAS NEUROLÓGICAS .................... 28
2 OBJETIVOS ............................................................................................ 32 2.1 GERAL .................................................................................................... 32 2.2 ESPECÍFICOS ........................................................................................ 32 3 METODOLOGIA ..................................................................................... 33 3.1 ANIMAIS ................................................................................................. 33 3.2 PLASMÍDEOS E VETORES RETROVIRAIS .......................................... 33 3.2.1 Dominante negativo do CREB .............................................................. 34 3.2.2 Forma constitutivamente ativa do CREB ............................................ 34 3.3 CULTURA DE CÉLULAS ........................................................................ 34 3.4 ENSAIOS FARMACOLÓGICOS ............................................................. 36 3.5 INFECÇÃO VIRAL ................................................................................... 36 3.6 IMUNOCITOQUÍMICA ............................................................................. 37 3.7 ANÁLISE MORFOLÓGICA ..................................................................... 37 3.8 ANÁLISE DA SOBREVIVÊNCIA - VÍDEO-MICROSCOPIA .................... 38 3.9 DENSIDADE DE CÉLULAS NEURONAIS .............................................. 40 3.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA ......................................................................... 40 4 RESULTADOS ....................................................................................... 41 4.1 CULTURAS CELULARES 41 4.1.1 Cultura de neurônios corticais diferenciados a partir de
neurosferas 41 4.1.2 Cultura primária de neurônios corticais 43 4.2 ANÁLISE MORFOLÓGICA 44 4.2.1 Manipulações farmacológicas – Cultura de neurônios corticais
diferenciados a partir de neurosferas 44 4.2.1.1 Tamanho do Soma Neuronal 47 4.2.2 Manipulações farmacológicas e genéticas – Culturas primárias de
neurônios corticais 48 4.2.2.1 Comprimento dos neuritos 50 4.2.2.2 Soma dos comprimentos dos neuritos 51 4.2.2.3 Neurito mais longo 52 4.2.2.4 Número total de neuritos (Primários x Ramos) 53 4.2.2.5 Número de bifurcações por neurônio 56 4.2.2.6 Número de bifurcações por neurito 57 4.3 ANÁLISE DA SOBREVIVÊNCIA, VÍDEO-MICROSCOPIA 58 4.4 DENSIDADE DE CÉLULAS NEURONAIS 59 5 DISCUSSÃO 60 6 CONCLUSÕES ....................................................................................... 67 REFERÊNCIAS ................................................................................................... 69
Introdução 16
1 INTRODUÇÃO
1.1 NEUROGÊNESE NO CÓRTEX CEREBRAL
Em mamíferos, a disposição funcional do córtex com suas seis camadas de
discreta compartimentalização e áreas especializadas por conectividades e
composição celular particulares constitui o quadro no qual uma elaborada
computação é implementada. Entender o desenvolvimento cortical continua a ser um
desafio essencial para a compreensão do sistema nervoso. Além disso, a disfunção
do córtex é a raiz de inúmeros distúrbios neurológicos, enfatizando a importância da
pesquisa nesta área.
A formação do córtex cerebral depende da geração e diferenciação
adequadas de diferentes tipos de neurônios, além das células macrogliais (astrócitos
e oligodendrócitos). Durante o desenvolvimento embrionário, as células
neuroepiteliais do epitélio pseudoestratificado (PVE), que formam a parede do tubo
neural, apresentam uma intensa atividade proliferativa, responsável pelo
crescimento longitudinal e transversal deste tubo. Estas células também são
responsáveis pela geração dos progenitores que compõem a zona ventricular
(BOULDER COMMITTEE, 1970) e, subsequentemente, a zona subventricular
telencefálicas (BOULDER COMMITTEE, 1970; SMART, 1973; TAKAHASHI et al.,
1995; NOCTOR et al., 2004). A zona ventricular e subventricular do telencéfalo
dorsal de roedores são consideradas as principais fontes de neurônios de projeção
corticais (PARNAVELAS, 2000), enquanto os neurônios não-piramidais
GABAérgicos parecem ser gerados quase exclusivamente no telencéfalo ventral
(MARIN; RUBENSTEIN, 2001).
De forma geral e resumida, a histogênese no córtex cerebral ocorre em 3
estágios. No primeiro, a parede do córtex cerebral é constituída apenas por células
progenitoras que ocupam a zona ventricular (VZ). No próximo estágio, os primeiros
neurônios a saírem do ciclo celular, se acumulam na pré-placa, adjacente à
superfície pial. Os neurônios da pré-placa podem ser divididos em células Cajal-
Retzius, mais superficiais, e nas células da subplaca. No próximo estágio da
histogênese cortical, os neurônios recém- gerados (Figura 1, vermelho) migram
através das fibras da glia radial para formar uma camada entre as células Cajal-
Introdução 17
Retzius e a subplaca. Essa camada é chamada de placa cortical, e a maioria dos
neurônios no córtex cerebral se acumulam nessa camada (MARIN-PADILLA, 1978,
1998).
Figura 1. Histogênese no córtex cerebral. Nas fases mais precoces do desenvolvimento cortical, os
neuritos das células progenitoras abrangem toda a espessura do córtex (VZ, Zona Ventricular). Os
neurônios recém-gerados (vermelho) migram ao longo das fibras de glia radial para formar uma
camada entre as células de Cajal-Retzius e a subplaca. Essa camada é chamada de placa cortical, e
a maioria dos neurônios do córtex cerebral se acumula nessa camada, o que resulta no aumento
significativo na espessura cortical. (Modificada de SANES; REH; HARRIS, 2006).
Nos roedores, a neurogênese cortical dura cerca de uma semana: do dia
embrionário 11.5 (sendo E0 o dia embrionário zero) ao 17.5, no caso dos
camundongos (BAYER; ALTMAN, 1991; CAVINESS et al.,1995; TAKAHASHI et al.,
1995, MIYAMA et al., 1997; NOWAKOWSKI et al., 2002). As diferentes classes
neuronais das lâminas corticais surgem pela sobreposição das camadas VI a II "de
dentro para fora" (Inside-out) (Figura 2). Assim, a histogênese cortical é
caracterizada pelo aparecimento gradual dessas camadas dentro da placa cortical, à
medida que um número crescente de neurônios recém-gerados migra da zona
Introdução 18
ventricular para dentro da placa cortical, povoando zonas progressivamente mais
periféricas, ao mesmo tempo em que os neurônios gerados anteriormente estão
diferenciando.
Figura 2: Estudos de Birthdating demonstram o padrão “de dentro para fora” da histogênese
do córtex cerebral. Ratas grávidas recebem injeções de 3H-timidina em estágios progressivamente
tardios da gestação. Quando os filhotes nascem, sobrevivem até a maturidade e depois têm seus
cérebros processados a fim de revelar as células marcadas. Neurônios que se tornaram pós-mitóticos
no dia embrionário 11 encontram-se primariamente na subplaca (agora na substância branca
subcortical), enquanto neurônios “nascidos” em E13 encontram-se em camadas corticais mais
profundas, isto é, V e VI; e neurônios gerados em E15 são encontrados em camadas corticais mais
superficiais, ou seja, IV, III e II. A camada mais superficial, camada I, contém apenas remanescentes
de neurônios da pré-placa (não mostrados). (Modificada de ANGEVINE; SIDMAN, 1961).
Introdução 19
Portanto, neurônios gerados mais tardiamente migram através daqueles gerados
mais cedo, se instalando em camadas mais superficiais. Esse é o resultado do
desenvolvimento “de dentro para fora” das camadas corticais (ANGEVINE; SIDMAN,
1961).
1.2 SOBREVIVÊNCIA E DIFERENCIAÇÃO NEURONAL
A diferenciação do sistema nervoso é acompanhada por um crescimento
notório: o corpo celular e os dendritos neuronais expandem, células gliais e mielina
surgem, os vasos sanguíneos arborizam e matriz extracelular é secretada. Mesmo
após o término do período de neurogênese, o cérebro humano continua a aumentar
de tamanho, de 400 gramas ao nascimento para 1400 gramas quando adulto
(DEKABAN; SADOWSKY, 1978). Surpreendentemente, esse período de
neurogênese e crescimento coincide com uma enorme perda de neurônios e glia,
ambos morrendo de “causas naturais”. Dependendo da região cerebral, 20 a 80%
das células diferenciadas degeneram durante o desenvolvimento (OPPENHEIM,
1991; OPPENHEIM; JOHNSON, 2003). Enquanto que, por um lado, a morte celular
integra um mecanismo valioso que faz parte do desenvolvimento, em outros casos
ela não acontece como um processo natural; é o caso quando ela ocorre em
decorrência de danos ou insultos, a exemplo do Acidente Vascular isquêmico.
A sobrevivência ou não de um neurônio depende de muitos fatores. Fatores
tróficos solúveis na matriz extracelular podem ser fornecidos por alvos pós-
sinápticos, por nervos vizinhos e células gliais ou pelo sistema circulatório. Os
neurônios também são dependentes de contatos sinápticos e a deaferentação leva à
atrofia ou morte. Esses sinais diversos são referidos como „fatores tróficos‟. Embora
seja impraticável contar o número total de neurônios em qualquer área de córtex
cerebral, estima-se que 20 a 50% dos neurônios pós-migratórios são eliminados,
dependendo da região do córtex (FINLAY; SLATTERY, 1983; MILLER, 1995).
Sabe-se que a sobrevivência neuronal depende claramente da presença de
tecidos alvos. A simples hipótese é que as células alvo secretam substâncias
químicas que os neurônios pré-sinápticos necessitam para sua sobrevivência
(HAMBURGER, 1934). Embora o NGF (Nerve Growth Factor) seja apenas a ponta
de um enorme iceberg de fatores de crescimento e de sobrevivência, tem sido
apontado como um dos principais exercendo tal papel. Um anticorpo anti-NGF,
Introdução 20
injetado em roedores neonatais, leva à perda de praticamente todos os neurônios
simpáticos (LEVI-MONTALCINI; BOOKER, 1960). Desde que sua sequência de
aminoácidos foi determinada como similar a do NGF (TURNER et al., 1982;
LEIBROCK et al., 1989), o BDNF (Brain Derived Growth Factor), juntamente com
outras neurotrofinas (também chamadas factores neurotróficos, as neurotrofinas são
uma família de proteínas que favorecem a sobrevivência dos neurônios), também
tem demonstrado agir sobre a sobrevivência de populações específicas de
neurônios, até mesmo antes do axônio alcançar seu alvo (FARINAS et al, 1996).
Uma função crítica dos axônios durante o desenvolvimento é a detecção de sinais
no meio extracelular e sua transdução em mudanças na expressão gênica (HAASE
et al., 2002; PATEL et al., 2003; ZWEIFEL; KURUVILLA; GINTY, 2005; HODGE et
al., 2007). Durante o desenvolvimento, os cones de crescimento detectam NGF
sintetizado por células alvo, resultando na geração de um sinal retrógrado que é
convertido para o soma e que, em retorno, promove a sobrevivência neuronal
(HOWE; MOBLEY, 2005).
A via da PI3K-Akt (phosphatidylinositol 3-kinase/Akt) proporciona um sinal
intracelular crucial para manter os neurônios dependentes de NGF vivos (XIA et al.,
1995). O bloqueio específico tanto da PI3K quanto de Akt mata culturas primárias de
neurônios simpáticos mesmo na presença de NGF, enquanto que a ativação
constitutiva de qualquer uma das duas kinases mantém os neurônios vivos mesmo
na ausência de NGF (CROWDER; FREEMAN, 1998). Além disso, o NGF promove
a sobrevivência de células PC12, o que é acompanhado pela ativação de diversas
MAPKs (Mitogen-Activated Protein Kinases). Dentro de 6 horas da retirada de NGF,
as células PC12 começam a morrer em grande quantidade (XIA et al., 1995). Outra
kinase, a RSK (Ribosomal S6 Kinase), fosforila e inativa uma das proteínas
regulatórias pro-apoptóticas da família da Bcl-2 (B-cell lymphoma 2) (KURADA;
WHITE. 1998), também influindo na sobrevivência neuronal.
Além da sobrevivência neuronal, um dos aspectos mais importantes no
estudo da formação do sistema nervoso central (SNC) é o desenvolvimento da
microarquitetura neuronal. Desde as primeiras observações no início do século XIX,
por Camillo Golgi, os neurônios têm sido morfologicamente definidos por três
compartimentos: I. Soma ou corpo celular; II. Axônio, um prolongamento único e,
geralmente, longo partindo do soma; e III. Dendrito, um prolongamento que também
Introdução 21
parte do corpo celular e se ramifica gerando uma estrutura altamente complexa em
forma de árvore (GOLGI, 1873). A partir do método de coloração desenvolvido por
Golgi foi possível refinar o estudo da arquitetura neuronal a um nível de
detalhamento surpreendente, descrevendo os dendritos como estruturas de
recepção sináptica, que coletam informações de outros neurônios e as transmitem
em direção ao corpo celular, e o axônio como a estrutura de saída do neurônio que
faz contatos sinápticos com neurônios vizinhos (RAMÓN Y CAJAL, 1897).
A diversidade de morfologias dendríticas confere diferentes propriedades
biofísicas aos neurônios (RALL et al., 1992; KOCH; SEGEV, 2000) e dessa maneira
é crucial para a integridade da sinalização neuronal e padrões de disparo (MAINEN;
SEJNOWSKI, 1996). Consequentemente, as propriedades neuronais subjacentes à
função cerebral são fortemente dependentes de fatores que controlam a forma
dendrítica. A formação da sinapse também é uma peça importante para a
diferenciação neuronal e para a plasticidade sináptica. O crescimento dendrítico e a
maturação sináptica são dois processos essenciais e interdependentes para o
desenvolvimento dendrítico; e sabe-se que os dendritos neuronais são participantes
ativos na formação das sinapses (CLINE, 2001). Portanto, os mecanismos
moleculares que regulam o desenvolvimento dendrítico são a base para o
estabelecimento e funcionamento dos circuitos neuronais, uma vez que a maturação
da arquitetura dendrítica desempenha um papel crucial na determinação dos
padrões de conectividade no cérebro adulto.
A função cerebral está diretamente relacionada com a composição celular,
assim como à arquitetura da circuitaria, cujos padrões são estabelecidos durante o
desenvolvimento. A árvore dendrítica cresce pela adição e elongação de ramos:
dendritos primários emergem do corpo neuronal, e ramificam para formar dendritos
secundários e terciários. Os dendritos permitem que os neurônios integrem
informação de um conjunto de inputs sinápticos, e o padrão específico da
arborização dendrítica limita o número e o tipo dos inputs que um neurônio pode
receber (WONG; GOSH, 2002). A morfologia dendrítica também influencia o
decaimento do sinal sináptico enquanto ele se propaga em direção ao soma.
Consequentemente, existe uma relação bem definida entre a morfologia dendrítica
de um neurônio e sua função (YUSTE; TANK, 1996; CONNORS; REGEHR, 1996).
Porque o padrão especial da arborização dendrítica influi na função neuronal, é
Introdução 22
importante determinar como os dendritos adquirem seu tamanho característico e sua
morfologia durante o desenvolvimento.
A fase mais ativa do crescimento dendrítico no córtex cerebral de roedores
ocorre entre a primeira e a terceira semana pós-natal, o que se aproxima bastante
do início da entrada de aferentes sensoriais talâmicos no córtex (MILLER, 1981). De
fato, diversos experimentos utilizando bloqueio de atividade neuronal sugerem que a
perda desta atividade durante o desenvolvimento leva a alterações permanentes no
desenvolvimento dendrítico (para revisão, HAAS, 2001). Enquanto essas
observações indicam que a atividade aferente exerce um papel crítico na regulação
do crescimento dendrítico durante o desenvolvimento, os mecanismos moleculares
envolvidos ainda não foram completamente elucidados (REDMOND; KASHANI;
GHOSH, 2002). Como as alterações na arborização dendrítica e na morfologia estão
presentes em muitas doenças neurodegenerativas, essas variações corrompem a
transmissão pós-sináptica e afetam a comunicação neuronal. Deste modo, é
importante entender os mecanismos moleculares que regulam a dendritogênese a
fim de possibilitar uma futura aplicabilidade de técnicas genéticas no ramo de
terapias celulares.
A arborização dendrítica se expande rapidamente quando a árvore dendrítica
ainda é relativamente simples, e o ritmo de crescimento diminui à medida que a
árvore dendrítica se torna cada vez mais complexa e quando a sinaptogênese chega
ao fim (CLINE, 2001). As vias de sinalização intracelulares que medeiam os efeitos
das atividades aferentes sobre o crescimento dendrítico e sua padronização não são
completamente compreendidas, mas o cálcio parece ser um componente chave.
Vias que envolvem variações no cálcio intracelular têm sido conhecidas por
influenciar a diferenciação neuronal, assim como crescimento axonal e seu
direcionamento (SPITZER, 2002). Estudos indicam um importante papel da
sinalização por cálcio no crescimento e padronização dendrítica. O influxo de cálcio
através dos VGCCs (Voltage Gated Calcium Channels) ativa um programa
transcricional que regula o crescimento dendrítico de forma geral (REDMOND;
KASHANI; GHOSH, 2002), afetando o crescimento dendrítico em culturas de fatias
do córtex cerebral (MCALLISTER; KATZ; LO, 1996). Redmond; Kashani; Ghosh
(2002) examinaram mecanismos do crescimento dendrítico induzido por cálcio em
neurônios corticais e observaram que a despolarização induzida pelo influxo de
cálcio através dos canais VGCCs era suficiente para induzir um programa de
Introdução 23
crescimento dendrítico. O efeito da ativação desses canais sobre o crescimento
dendrítico foi suprimido por inibidores farmacológicos das CaMKs (Proteína Kinase
Cálcio/Calmodulina-dependente) e foi reestabelecido ao nível dos controles após a
transfecção de uma forma ativa da CaM Kinase IV (CaMKIV), mas não da CaMKII.
Tais achados indicam que os efeitos da ativação de VGCC sobre os dendritos pode
ser mediado pela CaMKIV. Sabe-se que a expressão da CaMKIV atinge seus níveis
máximos durante a segunda e terceira semana pós-natal, o que coincide com o
período de maior crescimento dendrítico (MILLER; PETERS, 1981), e que seu alvo
nuclear mais bem caracterizado é o fator transcricional CREB.
Então, quais seriam os mecanismos celulares que fazem com que os
dendritos adquiram uma morfologia única? Um grande conjunto de evidências indica
que o crescimento e a padronização dos dendritos são fortemente influenciados por
sinais ambientais, incluindo sinais de feedback vindos de alvos distantes (PURVES;
SNIDER; VOYVODIC, 1988; VOYVODIC, 1987; 1989; WINGATE; THOMPSON,
1994; LOM; COHEN-CORY, 1999), interações com células vizinhas do mesmo tipo
(KIRBY; CHALUPA, 1986; Gao et al., 1999), e através do contato com células pré-
sinápticas (ZIV; SMITH, 1996; JONTES, SMITH, 2000). A identidade de vários sinais
moleculares que medeiam esses efeitos tem sido amplamente investigada. Foi
encontrado, por exemplo, que semaforina 3A (Sema3A), Slit1, Notch e BDNF (Brain-
Derived Neurotrophic Factor) atuam como reguladores do crescimento e da
arborização dendrítica dos neurônios piramidais corticais (POLLEUX; MORROW,
GHOSH, 2000; WHITFORD et al., 2000; SESTAN; ARTAVANIS-TSAKONAS;
RAKIC, 1999; REDMOND et al., 2000; MCALLISTER; LO; KATZ, 1995).
O controle genético parece contribuir significativamente para a especificação
da arquitetura dendrítica já que neurônios do mesmo tipo, até mesmo de espécies
diferentes, apresentam morfologias semelhantes e, mesmo isolados em cultura,
desenvolvem aspectos característicos da sua morfologia, sugerindo um controle
intrínseco do crescimento dendrítico. Por exemplo, neurônios piramidais e estrelados
podem ser identificados em culturas corticais baseando-se em suas morfologias
distintas (THREADGILL; BOBB; GHOSH, 1997). Em conjunto, pode-se propor que
programas intrínsecos controlam certos aspectos do crescimento e organização da
morfologia dendrítica, ao passo que a compleição da estrutura dendrítica requer
também a atividade de neurônios vizinhos conectados (METZGER, 2010).
Introdução 24
1.3 PAPEL DO CREB NA SOBREVIVÊNCIA E DIFERENCIAÇÃO NEURONAL
Em estágios precoces do desenvolvimento, programas de crescimento
intrínsecos, geneticamente controlados, lideram a especificação do tipo neuronal e
polarização, coordenando a expansão dendrítica muito provavelmente através de
fatores de crescimento para construir uma complexa e volumosa árvore dendrítica
(McALLISTER, 2000; SCOTT; LUO, 2001; MILLER; KAPLAN, 2003; JAN; JAN,
2003). Estímulos extracelulares promovem, ao nível transcricional, a expressão de
uma variedade de genes IEGs (immediate-early-response genes), os quais
codificam fatores de transcrição que influenciam a expressão de genes de resposta
secundária (SHENG; GREENBERG, 1990), cujos produtos contribuem para a
resposta fenotípica da célula a tais estímulos externos. O fator de transcrição CREB
(cAMP response element binding protein ou CRE-binding protein) pertence à família
CREB, uma subcategoria da superfamília de fatores de transcrição denominada
BZIP (basic leucine zipper). O CREB se liga a elementos regulatórios denominados
CRE (cAMP response element) que encontram-se dentro dos promotores dos genes
CREB-dependentes, o que serve para facilitar interações futuras entre componentes
da maquinaria transcricional que, em ultima análise, executará a síntese do RNA do
gene em questão (LONZE; GINTY, 2002). A atividade do CREB é regulada por
fosforilação, e a Ser133 (Serina 133) tem sido apontada como principal sítio de
fosforilação (GONZALEZ; MONTMINY, 1989). A fosforilação do CREB aumenta sua
ligação aos coativadores CBP (CREB-binding protein) e p300 (VO; GOODMAN,
2001). CBP/p300, por sua atividade histona acetiltransferase, promovem
remodelamento da histona-cromatina e o recrutamento da maquinaria basal de
transcrição até os promotores contendo sítios CRE (GOODMAN; SMOLIK, 2000).
Sabe-se que a expressão gênica mediada por CREB é necessária para a
sobrevivência de múltiplos subtipos neuronais (BONNI et al., 1999; RICCIO et al.,
1999; WALTON et al., 1999; SHALIZI et al., 2003; MOURET et al., 2008), além de
estar envolvida tanto na diferenciação, quanto na plasticidade sináptica e memória
(LONZE; GINTY, 2002). Redmond e colaboradores (2002) demonstraram que o
crescimento induzido pelos canais VGCC e pela ativação da CaMKIV é suprimida
por um dominante negativo de CREB (K-CREB). Assim, o crescimento dendrítico
induzido por cálcio em neurônios corticais parece ser mediado pela CaMKIV e pela
transcrição dependente de CREB. Os mecanismos pelos quais a transcrição
Introdução 25
mediada por CREB regula o crescimento dendrítico não são bem compreendidos,
mas é interessante notar que um dos alvos do CREB é a neurotrofina BDNF (SHIEH
et al., 1998; Tao et al., 1998). BDNF é conhecidamente um regulador do crescimento
dendrítico em neurônios corticais e cerebelares (MCALLISTER; LO; KATZ, 1995;
MCALLISTER; KATZ; LO, 1996; SCHWARTZ et al., 1997; HORCH et al., 1999;
MERTZ; KOSCHECK; SCHILING, 2000) e é tentador especular que os efeitos do
CREB sobre o crescimento dendrítico seja mediado, ao menos em parte, via BDNF.
Embora o estudo de Redmond enfatize a via CaMKIV-CREB, outros mecanismos de
sinalização também são suscetíveis a contribuir no crescimento dendrítico
dependente de cálcio. Por exemplo, Vaillant et al. (2002) reportaram que o influxo de
cálcio induz a formação de dendritos em neurônios simpáticos através da CaMKII e
da MAPK, que atuariam no citoesqueleto estabilizando os dendritos (WU; CLINE,
1998).
Várias moléculas sinalizadoras, incluindo a proteína kinase dependente de
Ca2+/Calmodulina (CaMKII) e sinais extracelulares relacionados à kinase 1 e 2
(ERK1/2) também tem sido apontadas como reguladoras do crescimento neurítico
(PREKERIS et al., 1996; MENEGON et al., 2002; VAILLANT et al., 2002; LEE et al.,
2004; KOLKOVA et al., 2005). A CaMKII concentra-se na densidade pós-sináptica
(PSD), com ampla gama de substratos incluindo proteínas do citoesqueleto e
proteínas dos canais de glutamato (WU; CLINE, 1998; CHENG et al., 2006;
COLBRAN; BROWN, 2004). A CaMKII controla o crescimento dendrítico neuronal
atividade-dependente tanto in vitro quanto in vivo (VAILLANT et al., 2002; WU;
CLINE, 1998). Além disso, VAILLANT et al. 2002 também apontaram a CaMKII como
promotora do crescimento neurítico em neurônios através da ativação de ERK, a
qual pertence a família da MAPK. A fosforilação da ERK1/2 é mediada via MAPK
(MEK) e a sinalização via MEK/ERK tem sido implicada como sendo importante
reguladora das mudanças estruturais atividade-dependentes em neurônios
hipocampais (GOLDIN; SEGAL, 2003). A CaMKIV também é considerada elemento
chave na sobrevivência neuronal dependente de CREB, uma vez que o tratamento
com o inibidor da CaMK torna os neurônios vulneráveis à isquemia concomitante a
redução na fosforilação de CREB (Ser133) (MABUCHI et al., 2001). No geral,
experimentos indicam que o crescimento dendrítico induzido por cálcio é regulado
pela ativação de um programa transcricional que envolve CaMK IV e sinalização
mediada por CREB para o núcleo (REDMOND; GHOSH; 2005).
Introdução 26
A fosforilação da Ser133 pela proteína kinase A (PKA), RSK2 (Ribosomal S6
Kinase) ou outras kinases, recruta CBP (CREB binding protein) para o complexo de
iniciação e, desse modo, promove a transcrição. Muitos genes são ativados por
CREB, incluindo outros fatores de transcrição como o c-fos, através do qual a
sinalização por CREB pode indiretamente ativar uma grande variedades de genes
(ROBERSON, 2001). A sinalização por CREB também estimula a expressão de
BDNF (TAO et al., 1998; SHIEH et al., 1998), um fator de crescimento envolvido em
diferentes aspectos do desenvolvimento do SNC. Camundongos knock-out para
BDNF apresentam uma redução da sobrevivência neuronal, na arborização
dendrítica e na formação de memória (ALCÁNTARA et al., 1997; XU et al., 2000;
GORSKI et al., 2003a,b).
A expressão de BDNF parece gerar uma retroalimentação positiva no sistema,
uma vez que a sinalização por este fator pode levar a mais ativação de CREB. De
acordo com esta interpretação, TOJIMA; KOBAYASHI; ITO (2003) demonstraram
que a cascata de sinalização da MAPK pode ser ativada pelo BDNF, promovendo
neurogênese e crescimento de neuritos via expressão de genes CREB-
dependentes. A MAPK fosforila as ERKs (extracellular signal-regulated kinases) que
ativam o CREB (BONNI et al., 1999). Embora a Ser133 do CREB não seja um
substrato para a ERK, o efeito desta é indireto através da ativação do RSK2
(TRIVIER et al. 1996). Recentemente, um importante dado experimental destacou a
importância da sinalização via MAPK/ERK na regulação transcricional em neurônios
(BOZON et al., 2003) e dentre os fatores de transcrição ativados via MAPK, o CREB
desempenha um papel central nas respostas mediadas por neurotrofinas
(FINKBEINER, et al. 1997). Há indicativos de que a MAPK/ERK deve ser um ponto
de convergência integrando sinalizações via PKC, PKA e CaMK (IMPEY et al. 1998;
ROBERSON et al. 1999; VANHOUTTE et al. 1999).
A integridade da via de sinalização da PI3K durante o desenvolvimento
também é necessária para preservar a integridade do sistema nervoso (BACKMAN
et al., 2001; KWON et al., 2001; PIMENTEL et al., 2002; PENG et al., 2004;
EASTON et al., 2005). É também uma via central para a dendrítogênese e essencial
para a manutenção da complexidade da arborização dendrítica (JAWORSKI et al.,
2005; KUMAR et al., 2005). Assim sendo, qualquer defeito em moléculas mediando
a ativação da PI3K/Akt poderia resultar em redução na expansão dendrítica.
As vias de sinalização da PKA, CaMK, MAPK e PI3K não só ativam a
Introdução 27
sinalização por CREB como também medeiam a tolerância isquêmica, uma vez que
os genes alvos do CREB, como o Bcl-2, desempenham função crucial através de
mecanismos anti-apoptóticos (TERASAKI et al., 2010) (Figura 3). Embora a
diferença básica entre os efeitos dessas vias de ainda não esteja clara, uma
possibilidade é que tal diferença possa estar relacionada a habilidade de cada uma
em induzir a transcrição mediada por CREB.
Figura 3: CREB ativa a proteína anti-apoptótica Bcl-2. Tanto a PI3K/AKT quanto a MAPK/RSK podem fosforilar o fator de transcrição CREB. O P-CREB entra no núcleo e aumenta a expressão de proteínas anti-apoptóticas, como a Bcl-2. (SANES; REH; HARRIS, 2006).
A ativação de CREB em neurônios granulares do cerebelo durante o
desenvolvimento ou em neurônios granulares do giro denteado adulto têm sido
relacionada com sobrevivência destas células (WALTON et al., 1996; MONTI et al.,
2002; JAGASIA et al., 2009), sugerindo que a sinalização por CREB poderia ter um
efeito importante sobre a sobrevivência neuronal. Vale ressaltar também que os
ramos dendríticos são altamente dinâmicos no início do desenvolvimento e a
Introdução 28
arquitetura dendrítica é alterada em resposta a mudanças ambientais (VOLKMAR;
GREENOUGH, 1972), como lesões periféricas (VAN DER LOOS; WOOLSEY, 1973),
que impulsionam plasticidade dendrítica até mesmo em adultos (HICKMOTT;
STEEN, 2005). Assim sendo, a criação de medidas que possam atuar sobre tais
fenômenos, como o remodelamento dendrítico induzido por lesões ou o aumento da
sobrevivência celular, pode constituir-se em uma poderosa ferramenta para
possibilitar o surgimento de técnicas de engenharia genética que intervenham no
curso de certas doenças.
1.4 CREB, PLASTICIDADE E DOENÇAS NEUROLÓGICAS
Uma vasta gama de processos biológicos e patofisiológicos são influenciados
pelo CREB (SASAKI et al., 2011), assim, não é nada surpreendente que as
consequências do rompimento das funções desta molécula sejam bastante severas
in vivo. Enquanto a completa interrupção do CREB é letal em camundongos
(RUDOLPH et al., 1998), em humanos diversas condições patológicas existem nas
quais a função do CREB parece ter sido interrompida súbita ou parcialmente.
Algumas são desordens genéticas onde moléculas que interagem com o CREB são
defeituosas, como no caso da síndrome Coffin-Lowry, caracterizada por múltiplas
anormalidades físicas e retardamento mental, onde o gene da RSK-2, uma das
kinases que atua sobre o CREB, está mutada (TRIVIER et al., 1996).
O CBP (Creb Binding Protein) é um coativador transcricional não específico
para o CREB apenas. O CBP se liga através do seu domínio KIX à Ser133
fosforilada no domínio KID do CREB (PARKER et al., 1996; RADHAKRISHNAN et
al., 1997), e é o estímulo-dependente entre esses dois domínios que induz à
expressão gênica. A síndrome de Rubenstein-Taybi é similarmente caracterizada e
causada por uma mutação heterozigota no gene CBP (PETRIJ et al., 1995). O CBP
tem atividade de lisina acetiltransferase e é capaz de acetilar lisinas nas porções N-
terminais de histonas. Apontando a importância desses mecanismos via CREB para
a cognição humana, sabe-se que a perda da função de CBP nessa síndrome
(RUBINSTEIN; TAYBI, 1963; PETRIJ et al., 1995) provoca um distúrbio neurológico
congênito definido por deficiências características de crescimento pós-natal,
dismorfologia e deficiência intelectual. A identificação de desregulações na
acetilação de histonas devido a perda de CBP em pacientes com a Síndrome
Introdução 29
Rubinsteine-Taybi (MURATA et al., 2001) e em modelos animais correspondentes
(ALARCÓN et al., 2004; KORZUS et al., 2004; Wood et al., 2005) serve como um
dos primeiros exemplos de uma lista crescente de doenças em humanos com
déficits cognitivos que podem ser consideradas como cromatinopatias devido a
mutações casuais em reguladores da estrutura/ função da cromatina e,
consequentemente, da expressão gênica (LEVENSON; SWEATT, 2005; VAN
BOKHOVEN, 2011; HAGGARTY; TSAI, 2011). Tanto que pequenas moléculas
inibidoras de histona deacetilases (HDACs) agem como ativadoras da transcrição
regulada por CREB e moduladoras da neuroplasticidade mediada por cromatina
(FASS ET AL 2012).
A perda de neurônios está associada às principais doenças do sistema
nervoso central (SNC), as quais têm representado um elevado e crescente custo
para saúde pública nas últimas décadas, (MALTA et al., 2006). Principalmente
devido ao envelhecimento da população, acidentes vasculares (hemorrágicos ou
isquêmicos), por exemplo, provocam morte neuronal aguda e são a principal causa
de óbitos no Brasil desde 1980, assim como seu risco tem aumentado na região
Nordeste segundo dados do MINISTÉRIO DA SAÚDE, Sistema de Informação sobre
mortalidade, 2004. Diante de tal fato, estudos recentes têm procurado meios de
reduzir a lesão isquêmica, através de medidas neuroprotetoras com ação
especificamente na área de penumbra, onde a disfunção e o sofrimento ainda são
potencialmente reversíveis. As ações neuroprotetoras atuariam em diferentes sítios
da cascata de eventos da isquemia e embora haja evidências experimentais do
benefício destas medidas, até o momento, não existe droga neuroprotetora a ser
recomendada para uso no tratamento do AVC (ARQ. NEUROPSIQUIATRIA, 2001).
O rt-PA (recombinant tissue-type plasminogen activator) ainda é a única terapia
aprovada contra o AVC isquêmico (NINDS, 1995), pois dentre mais de 700 drogas
que tem sido estudadas e demonstradas como eficazes em modelos animais de
isquemia, nenhuma tem provado ser eficaz para aplicabilidade em humanos
(KASTE, 2005; LEES et al., 2006).
Alternativamente, diversos grupos de pesquisa têm buscado maneiras de
substituir grupos de neurônios perdidos no curso destas doenças. De maneira
simplificada, as estratégias utilizadas baseiam-se em dois principais paradigmas: 1)
Transplante de células capazes de diferenciar em tipos neuronais específicos ou 2)
Estímulo à produção de neurônios por células residentes no SNC. Independente da
Introdução 30
estratégia utilizada para a obtenção de novos neurônios no SNC adulto, esta é
apenas a primeira parte do desafio. Uma vez situados no tecido, estes novos
neurônios precisam sobreviver, crescer neuritos (axônios e dendritos) e estabelecer
conexões funcionais (sinapses) com os neurônios pré-existentes. Portanto, é
fundamental entender os mecanismos moleculares controlando estes fenômenos, a
fim de sermos capazes de usar estas terapias celulares para recuperar lesões do
SNC de forma eficaz.
É sabido que, no cérebro adulto, novos neurônios são constitutivamente
gerados na Zona Subventricular (SVZ) e na Zona Subgranular (SGZ) no giro
denteado e que insultos que causam morte neuronal, como é o caso da isquemia,
são acompanhados por um aumento neurogênico nessas áreas (SVZ: LOIS;
ALVAREZ-BUYLLA, 1993; LUSKIN, 1993; JIN et al., 2001; ZHANG et al., 2001.
SGZ: BENGZON et al., 1997; PARENT et al., 1997; LIU et al., 1998; ARVIDSSON et
al., 2001). Existe um grande número de dados indicando que esses novos neurônios
gerados na ZSV podem migrar para áreas atingidas por um insulto isquêmico
(ARVIDSSON et al., 2002; PARENT et al., 2002; JIN et al., 2003; GOINGS et al.,
2004; KOBAYASHI et al., 2006), porém, há evidências de que tanto a diferenciação
quanto a sobrevivência destas células na área lesada podem estar comprometidas
(DEIERBORG et al., 2009), o que poderia limitar o uso desta abordagem para
terapias celulares. Dados de Herold et al. (2011) demonstram um papel essencial da
sinalização por CREB sobre a maturação de neurônios recém formados e na
sobrevivência e manutenção da expressão gênica neuronal durante os estágios
iniciais da neurogênese. Em particular, a ativação da cascata CREB-PGC-1 contribui
para a sobrevivência neuronal em varias doenças neurológicas, incluindo AVC,
doença de Huntington e Parkinson (OKAMOTO et al., 2009; ST-PIERRE et al.,
2006).
Ramón y Cajal uma vez destacou que o córtex é um tecido extremamente
complexo, onde qualquer tipo de abordagem simplista está fadada ao fracasso
(RAMÓN Y CAJAL, 1893). Algumas das abordagens mais promissoras estão na
combinação de novas técnicas genéticas, ópticas e fisiológicas. Melhorias recentes
nos métodos de transferência gênica permitiram a transfecção e a alteração
genética de células em cérebros intactos (DITTGEN et al., 2004; HAAS et al., 2001).
A tremenda especificidade temporal e espacial de tais manipulações ajudará na
determinação de como os genes ou a atividade de células individuais contribuem
Introdução 31
para propriedades sistêmicas, como no caso da plasticidade. Desta forma, a
habilidade em manipular a morfologia dendrítica a partir de perturbações
moleculares propiciam uma oportunidade ímpar para tratar questões de longa data
sobre a relação entre forma e função (WHITFORD et al., 2002) e a caracterização de
propriedades das células progenitoras neurais do telencéfalo.
Em suma, o grande desafio na área de neuroterapia celular tem sido
identificar maneiras de melhorar a sobrevivência, crescimento e integração sináptica
de neurônios transplantados à circuitaria local. Por este motivo, acreditamos que a
análise sistemática dos mecanismos moleculares envolvidos na sobrevivência e
diferenciação neuronal durante o desenvolvimento é fundamental para a elaboração
de estratégias eficazes ao reparo celular no sistema nervoso adulto lesado. Desta
forma, neste trabalho, pretendemos avaliar a função do fator transcricional CREB,
importante mediador na neuroproteção (SUGIURA et al., 2004; MELLER et al., 2005;
TERASAKI et al., 2010). Focar no entendimento das vias de sinalização por CREB e
seu papel sobre a sobrevivência neuronal permitirá o direcionamento de promissoras
abordagens terapêuticas como, por exemplo, contra o dano isquêmico do Acidente
Vascular Cerebral.
Objetivos 32
2 OBJETIVOS
2.1 GERAIS
Avaliar os efeitos da atividade de CREB fosforilado (pCREB) por diferentes
vias de sinalização sobre o crescimento neurítico e sobrevivência neuronal.
2.2 ESPECÍFICOS
Estabelecer modelos de cultura de células que possam ser utilizados para
avaliar sinalizações via CREB sobre a diferenciação e sobrevivência
neuronal;
Discriminar efeitos da sinalização por CREB induzido por diferentes kinases
em neurônios corticais in vitro, através de manipulações farmacológicas;
Avaliar os efeitos de diferentes formas do CREB (dominante negativo A-CREB
e a forma constitutivamente ativa CREB-FY) em neurônios corticais in vitro
com o uso de técnicas genéticas;
Identificar os efeitos farmacológicos que podem ser revertidos com a
expressão forçada do CREB ativado;
Avaliar o efeito da sinalização mediada por CREB sobre a sobrevivência de
neurônios corticais.
Metodologia 33
3 METODOLOGIA
3.1 ANIMAIS
Utilizamos, nesse estudo, camundongos fêmea da linhagem C57/Bl6 (n=9)
em período gestacional E14 (o dia da detecção do plug vaginal foi considerado como
o dia embrionário zero, E0) e foram utilizados uma média de 7 embriões por
experimento. As fêmeas estavam com idade entre 2 a 9 meses e foram mantidas em
ciclos claro/escuro de 12h (07:00 to 19:00 h) com alimentação ad libitum. Todos os
procedimentos realizados foram previamente aprovados pelo comitê de ética das
instituições envolvidas (CEUA/UFRN e Helmholtz Zentrun München).
3.2 PLASMÍDEOS E VETORES RETROVIRAIS
Retrovírus “defectivos” ou incompetentes para replicação são produzidos a
partir de uma linhagem celular estável (293T) transfectada transitoriamente com o
plasmídeo de expressão, o pCMV (packaging plasmid) e o pVSVG (pseudotyping
plasmid). As partículas virais são removidas do sobrenadante e ressuspendidas em
DMEM ou PBS (Phosphate Buffered Saline), aliquotadas e armazenadas a -80 °C
até o uso (COSTA et al., 2009b).
Os plasmídeos de expressão contendo o promotor CAG, uma região de
ligação a ribossomos IRES (Internal Ribossomal Entry Site) e o gene da proteína
fluorescente verde (GFP) foram utilizados para a produção de retrovírus. O vetor
usado como controle possui apenas o gene para a proteína fluorescente e foi
denominado CAG-IRES-GFP. Os plasmídeos contêm sítios de restrição para as
enzimas SfiI e PmeI entre o promotor CAG e o IRES, permitindo a inserção da
sequência codificadora das diferentes formas de CREB, descritas a seguir.
Os vetores resultantes da clonagem destas diferentes formas de CREB foram
denominados CAG-ACREB-IRES-GFP (A-CREB) e CAG-CREBFY-IRES-GFP
(CREB-FY). Todos os vetores retrovirais contendo os plasmídeos foram gentilmente
cedidos pelo Dr. Chichung Lie, Helmholtz Zentrum, Alemanha.
Metodologia 34
3.2.1 Dominante negativo do CREB
O dominante negativo A-CREB possui uma região acídica-anfipática que se
liga com grande afinidade ao CREB endógeno e bloqueia sua ligação ao DNA (AHN
et al., 1998). O vetor resultante da clonagem desta forma de CREB denomina-se
CAG-ACREB-IRES-GFP.
3.2.2 Forma constitutivamente ativa do CREB
O CREB-FY, forma de CREB constitutivamente ativa, contém uma alteração
do aminoácido tirosina (Y) 134 pela fenilalanina (F), tornando o CREB mais
suscetível a fosforilação por PKA e é suficiente para estimular a transcrição gênica
em células não estimuladas, devido a fosforilação constitutiva na Ser133 (DU et al.,
2000). Seus experimentos indicam que a mutação na tirosina 134 para fenilalanina
diminui o km do CREB pela PKA; pois estudos com o inibidor farmacológico da PKA
(o H-89) implica o envolvimento da atividade basal de PKA nesse processo. O vetor
resultante da clonagem desta forma de CREB denomina-se CAG-CREB-FY-IRES-
GFP.
Desta maneira, comparamos os efeitos de duas formas do CREB descritas
previamente na literatura, o dominante negativo A-CREB e a forma
constitutivamente ativa CREB-FY, para nos ajudar a entender o papel da sinalização
por vias ativadoras de CREB.
3.3 CULTURA DE CÉLULAS
Neste trabalho, fizemos uso de células embrionárias do telencéfalo dorsal em
E14 e E18 (Figura 4) para cultivo primário e de neurosferas, respectivamente.
Embriões de camundongos foram removidos após sacrifício materno por
deslocamento cervical, imersos em solução PBS e mantidos em gelo. Em ambiente
estéril, com o auxílio de um microscópio, os cérebros foram extraídos da caixa
craniana e a pia-máter foi cuidadosamente removida. Em seguida, a porção lateral
do telencéfalo dorsal foi cuidadosamente separada das eminências ganglionares e
Metodologia 35
primórdio hipocampal e as células foram dissociadas como já descrito (HEINS et al.,
2001).
Figura 4: Organização anatômica do córtex embrionário de camundongo. O período de gestação do camundongo dura 19 dias e a neurogênese cortical 8 dias, do 11º dia embrionário (E11) ao E19. Zona Ventricular (VZ), Subplaca (SP), placa cortical (CP), zona marginal (MZ), camada de fibras (FL). Em nossos experimentos utilizamos células embrionárias do córtex (telencéfalo dorsal) em E14 e E18 (similar a E17). (Modificada de SMART et al., 2002)
Para os cultivos de neurosferas, após dissociação química e mecânica, as
células foram plaqueadas em DMEM / 1% penicilina e estreptomicina suplementado
com B27, 10 ng/mL de FGF (Fibroblast Growth Factor) e 10 ng/mL de EGF
(Epidermal Growth Factor) como descrito previamente (REYNOLDS; WEISS, 1996;
CHOJNACKI; WEISS, 2004). FGF e EGF na concentração de 10 ng/mL deve ser
adicionado a cada 3 dias. Passados 7 dias in vitro (DIV) a 37oC em 5%CO2 / 95%O2,
as neurosferas foram plaqueadas para diferenciação (1-2 x 105 células) sobre
lamínulas pré-tradadas com poli-D-lisina (PDL) em DMEM / B27. 24 horas após o
plaqueamento, as células foram tratadas com as diferentes drogas bloqueadoras de
kinase (acima citadas). A fim de acessar a capacidade de auto-renovação de tais
células, as neurosferas primárias foram novamente dissociadas e plaqueadas (cerca
de 3 x 103 células) em 500 μL de DMEM suplementado com B27 (COSTA et al.,
2007); esse procedimento foi repetido 3 vezes, até a terceira passagem. Os dados
são provenientes de pelo menos 2 experimentos diferentes com dez lamínulas
analisadas por experimento (cada variável em duplicata). Os dados foram plotados e
mostrados como média ± sem.
Metodologia 36
No caso dos cultivos primários, logo após a dissociação, as células foram
plaqueadas em DMEM FCS 10%, cuja concentração é diminuída para 5% 24h
depois, quando da adição de DMEM suplementado com B27 (1:50). Após 2 horas,
as culturas foram infectadas com os vetores retrovirais (A-CREB ou CREB-FY) em
baixa concentração (<30 partículas) e 24 horas após o plaqueamento, foram
tratadas com as diferentes drogas bloqueadoras de kinase. Os dados são
provenientes de clones contendo, no máximo, 3 neurônios e de 7 experimentos
diferentes (cada variável em duplicata); sendo os grupos: GFP / GFP + DMSO / A-
CREB / CREB-FY / GFP + H-89 / CREB-FY + H-89 / GFP + KN-62 / CREB-FY + KN-
62 / GFP + U0126 / CREB-FY + U0126 / GFP + Wort / CREB-FY + Wort. Os dados
foram plotados e mostrados como média ± sem.
3.4 ENSAIOS FARMACOLÓGICOS
2h após a adição do meio de diferenciação nos cultivos de neurosferas, e 24h
após o plaqueamento no caso dos cultivos primários, as culturas foram tratadas com
10 mM do H-89 (Sigma), inibidor da ativação de PKA, 10 mM do KN-62 (Sigma),
inibidor da CaM kinase II - para bloquear a fosforilação de CREB por vias
dependentes de AMPc e cálcio, respectivamente, 10 mM de U0126 (Sigma), inibidor
de MAPK e 10 nM de Wortmannin (Sigma), inibidor da PI3K. As drogas foram
diluídas em DMSO (Dimetilsulfóxido), que foi usado como controle.
3.5 INFECÇÃO VIRAL
Após 2 horas, as culturas foram infectadas com vírus em baixa titulação (<30
partículas) contendo os plasmídeos de interesse contendo o gene de interesse (A-
CRE ou CREB-FY) e a proteína repórter verde (GFP), como descrito acima, e
fixadas após 7 dias in vitro como previamente descrito (HEINS et al., 2001). Ao
utilizar um número reduzido de partículas virais para transduzir as células, nós
pudemos submeter as culturas a experimentos de vídeo-microscopia de tempo
intervalado e, após imunocitoquímica, identificar células bem separadas com um
aumento de 20x no microscópio de fluorescência (Zeiss).
Em experimentos subsequentes, essas manipulações foram combinadas com
as manipulações farmacológicas (inibidores das kinases: PKA, MAPK, CaMKII e
Metodologia 37
PI3K) e os efeitos comparados ao grupo controle (GFP + DMSO) a fim de observar
se os efeitos do bloqueio das kinases seriam anulados ou não.
3.6 IMUNOCITOQUÍMICA
As culturas celulares derivadas de neurosferas foram submetidas a reações
imunocitoquímicas com os anticorpos anti-GFP (Chicken, Aves Lab Inc., 1:500), para
visualização de células transfectadas com os diferentes vetores, TUJ1 (mouse
IgG2b, Sigma, 1:1000), que marca uma proteína específica do citoesqueleto
neuronal, a βIII-tubulina; já no caso dos cultivos primários, utilizamos o anticorpo
anti-MAP2 (mouse IgG1, Sigma, 1:1000) ao invés do TUJ1. O objetivo era analisar a
morfologia dos neurônios transfectados (através do programa IMAGE J) e a
densidade de células (proporção de células MAP2+ em relação ao total de células
DAPI) entre os diferentes grupos experimentais, quantificando e comparando
estatisticamente com o uso de ANOVA.
Os anticorpos primários (anti-GFP, anti-βIII tubulina e anti-MAP2) foram
diluídos em tampão fosfato (PBS) 0,1 M, triton a 0,5% e soro normal de cabra (NGS)
a 10%. Após 24h a 4 ºC, as culturas foram lavadas (3 vezes) por 5 minutos com PBS
0,1 M e incubadas com uma solução (PBS 0,1 M, 0,5% de triton) contendo os
anticorpos secundários, conjugados a diferentes fluoróforos (Alexa 488, verde e
Alexa 546, vermelho. Em experimentos subsequentes, essas manipulações foram
combinadas com a superexpressão do CREB ativo (CREB-FY) e os efeitos
comparados ao grupo controle (GFP + DMSO) a fim de observar se os efeitos do
bloqueio das kinases seriam anulados ou não), por 2h em temperatura ambiente.
Findo este período, mais três lavagens com PBS foram feitas e os núcleos celulares,
corados com DAPI antes da montagem das células em Acqua Polymount.
3.7 ANÁLISE MORFOLÓGICA
Para a análise morfológica fizemos uso do programa ImageJ (v. 1.46e) e do
plugin NeuronJ (v. 1.4.2). Após 7 DIV, as culturas celulares foram fixadas e os
neurônios que se encontravam mais isolados (neurônios TUJ1-positivos, no caso
das culturas derivadas de neurosferas e neurônios GFP-positivos, no caso dos
cultivos primários) foram fotografados em microscópio de fluorescência da Zeiss,
Metodologia 38
afim de que seu soma e seus neuritos pudessem ser desenhados com o auxílio do
programa acima citado para análise morfológica. Todos os testes foram realizados
com o auxílio do software GraphPad Prism 5.
Além da medição do tamanho do corpo celular (área do soma em duas
dimensões), foram definidos como critério de medida para a análise morfológica dos
neuritos os seguintes parâmetros:
Número total de neuritos: a quantidade total de neuritos de cada neurônio,
considerando os neuritos primários mais suas ramificações (ramos);
Número de neuritos primários: quantidade de neuritos que partem do soma;
Comprimento dos neuritos: considera a média do tamanho de todos os
neuritos, levando em conta os valores de cada um deles;
Soma dos comprimentos dos neuritos: considera a soma dos
comprimentos de todos os neuritos.
Comprimento do neurito mais longo: medida do tamanho do neurito mais
longo, desde o soma até a extremidade mais distal;
Número de bifurcações por neurônio: quantidade de pontos onde os
neuritos se ramificam ou se separam em dois.
Número de bifurcações por neurito: quantidade de vezes que o neurito se
ramifica ou bifurca; relação entre o número de bifurcações por neurônio e o
número total de neuritos.
3.8 ANÁLISE DA SOBREVIVÊNCIA - VÍDEO-MICROSCOPIA
O estudo de linhagens celulares no córtex de roedores in situ depende do uso
de um marcador que possa ser incorporado por uma célula progenitora e,
subsequentemente, transmitido para a sua progênie. O uso de vetores retrovirais
preenche os requisitos acima, pois os seus materiais genéticos, devido à ausência
da proteína transportase, só podem ser incorporados aos núcleos de células
mitóticas. Em geral, são utilizados como repórteres, genes que codificam proteínas
identificáveis por métodos de imunologia.
A definição de clone baseia-se na relação espacial entre as células que
incorporaram um gene repórter. Basicamente, os autores consideram como
pertencentes a um mesmo clone, células que estavam separadas por uma curta
distância ou se apresentavam radialmente dispostas. Através da morfologia das
Metodologia 39
células encontradas, os autores concluíram que, em sua maioria, os clones eram
formados por um único tipo celular (LUSKIN et al., 1988) A fim de observamos
diretamente a geração de células neurais a partir de um precursor individual, as
culturas foram continuamente monitoradas através de vídeo microscopia de tempo
intervalado. Esta técnica permite a quantificação de uma série de parâmetros não
mensuráveis através de outras técnicas, tais como número de neurônios por clone e
tipo de divisão (COSTA et al., 2008). Além disso, podemos observar diretamente a
ocorrência de morte celular, diferenciando o efeito desta do de uma diminuição na
capacidade proliferativa das células, ambas capazes de gerar clones menores.
Outros fenômenos, tais como migração e diferenciação celular (COSTA et al., 2007;
BERNINGER et al., 2007) também podem ser visualizados através deste método,
oferecendo uma poderosa ferramenta para o estudo de fenômenos celulares.
Utilizamos um paradigma experimental baseado na incorporação do material
genético de vetores retrovirais por células em divisão mitótica. Desta forma, a
linhagem de uma célula pode ser reconstruída através da análise da expressão de
um gene repórter contido nos retrovírus (PRICE et al., 1988). Os cultivos foram
mantidos a 37 °C, ventilados com 5%CO2 e 24 após o plaqueamento foram
posicionados para captura de vídeo em um microscópio Cell Observer (Zeiss)
equipado com uma incubadora e sistema de ventilação (COSTA et al., 2007, 2008;
BERNINGER et al., 2007; EILKEN et al., 2009). Com o auxílio de uma câmera digital
(AxioCam HR3) controlada pelo software AxioVision Rel 4.8.2.0 (Zeiss) com a macro
Timm’s Acquisition Tool; TAT (RIEGER et al., 2010). As culturas foram fotografadas
a cada 2 minutos em contraste de fase e imagens fluorescentes a cada 3 horas por
3 ½ dias (84h). As imagens obtidas (1388 x 1040 pixels) foram montadas como
vídeo e analisadas com o auxílio do software Timm’s Tracking Too; TTT (RIEGER et
al., 2009). Células transduzidas foram reconhecidas pela presença da proteína
fluorescente verde (GFP) e rastreadas em contraste de fase, permitindo a
identificação da linhagem de uma célula individual. Para mensurar a taxa de
sobrevivência acumulada, consideramos a porcentagem de células que sobreviviam
a cada ciclo de 12h. Por exemplo, se em 12h a célula se dividiu 2 vezes e, das 4
células geradas apenas 3 sobreviveram, tem-se que a taxa de sobrevivência foi de
75%. No total, foram analisadas 262 árvores: 124 (Controle), 64 (A-CREB) e 74
(CREB-FY).
Metodologia 40
3.9 DENSIDADE DE CÉLULAS NEURONAIS
A fim de determinar a densidade de células neuronais nos cultivos primários
submetidos aos ensaios farmacológicos com as drogas inibidoras de kinases (H-89,
KN-62, U0126 e Wort), foram feitas contagens do número de células MAP2 positivas
em relação ao número total de células através da contagem de núcleos celulares
corados com DAPI (MAP2/DAPI). As contagens foram feitas no programa ImageJ a
partir das imagens (1388 x 1040 pixels) adquiridas no microscópio de fluorescência
da Zeiss (aumento de 20x) após 7 dias de cultivo in vitro. Foi contado um total de 10
imagens por variável.
3.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados provenientes das análises morfológicas em neurônios dos cultivos
de neurosferas, como “número total de neuritos”, por exemplo, foram comparados
estatisticamente com o uso do teste de Mann-Whitney (teste-t, não-pareado, não-
paramétrico), com o auxílio do programa GraphPad Prism 5.0.
Todos os dados provenientes das análises morfológicas e de sobrevivências
dos cultivos primários foram comparados estatisticamente com o auxílio do mesmo
progama acima citado, porém com o teste One-way ANOVA (não-paramétrico) e pós
teste de Dunnett.
Resultados 41
4 RESULTADOS
4.1 CULTURAS CELULARES
4.1.1 Cultura de neurônios corticais diferenciados a partir de neurosferas
Células do telencéfalo dorsal de camundongos no período embrionário E18
foram isoladas e mantidas durante 7 dias em condições apropriadas para formar
neurosferas. Ao fim deste período, as células compondo as neurosferas foram
dissociadas e plaqueadas para diferenciação e, 2 horas depois, receberam
tratamento farmacologógico com os inibidores de kinase já citados anteriormente.
Passados 7 dias in vitro (7DIV), as culturas celulares, já diferenciadas, foram fixadas
e submetidas a reações imunocistoquímicas com o anticorpo anti-βIII tubulina
(TUJ1). Imagens dos neurônios que se encontravam mais isolados em cultura
puderam ser utilizadas para a análise morfológica através do programa ImageJ. A
Figura 5 mostra um neurônio marcado com TUJ1 (vermelho) e os traçados dos
neuritos (ciano). A Tabela 1 foi gerada pelo programa e mostra, dentre outras coisas,
a quantidade de traçados (tracing) e seus respectivos comprimentos (lenght), em
micrômetros.
Resultados 42
Figura 5: Traçado dos neuritos. A) Neurônio TUJ1 positivo do grupo controle (DMSO); aumento de 40x. B) Em cor ciano, traçado dos neuritos feitos com auxílio do programa ImageJ.
Tabela 1: Exemplo de tabela gerada pelo programa ImageJ a partir do traçado dos neuritos.
Image Tracing Cluster Type Label Length [µm]
Mean Val [a.u.]
SD Val [a.u.]
Min Val [a.u.]
Max Val [a.u.]
4_BIII N1 DMSO Neurite n1 81.093 81.817 27.546 18 124
4_BIII N2 DMSO Neurite n1 58.472 58.262 20.588 30 118
4_BIII N3 DMSO Neurite n1 50.164 38.789 16.506 18 78
4_BIII N4 DMSO Neurite n1 16.382 40.917 20.327 18 77
4_BIII N5 DMSO Neurite n1 36.975 52.357 25.908 12 124
4_BIII N6 DMSO Neurite n1 75.997 87.741 28.965 33 134
4_BIII N7 DMSO Neurite n1 174.964 105.794 19.148 42 147
4_BIII N8 DMSO Neurite n1 21.142 57 22.836 30 107
4_BIII N9 DMSO Neurite n1 84.39 100.377 24.523 48 151
4_BIII N10 DMSO Neurite n1 14.993 29.636 19.096 5 72
4_BIII N11 DMSO Neurite n1 18.549 29.714 18.91 12 86
4_BIII N12 DMSO Neurite n1 23.506 58.647 22.616 22 94
4_BIII N13 DMSO Neurite n1 11.066 108 24.957 86 158
4_BIII N14 DMSO Neurite n1 16.146 24.286 18.062 5 77
4_BIII N15 DMSO Neurite n1 7.412 26.286 25.158 5 69
A
TUJ1 TUJ1
B
Resultados 43
4.1.2 Cultura primária de neurônios corticais
Células do telencéfalo dorsal de camundongos no período embrionário E14
foram dissociadas e plaqueadas para diferenciação. Após 2 horas, células foram
infectadas com retrovirus carregando plasmídeo com o gene para a proteína
fluorescente verde (GFP) e o gene A-CREB ou CREB-FY (o grupo controle continha
apenas a proteína fluorescente verde - GFP). Passadas 24 horas, as culturas
receberam tratamento farmacologógico com os inibidores de kinase H-89 (inibidor da
PKA), KN-62 (inibidor da CaMKII), U0126 (inibidor da MAPK) e Wort (inibidor da
PI3K). Após 7 dias in vitro (7DIV), as culturas celulares foram fixadas e submetidas a
reações imunocitoquímicas com os anticorpos anti-GFP e anti-MAP2, permitindo a
identificação de neurônios transfectados com os plasmídeos supracitados. Imagens
dos neurônios que se encontravam mais isolados em cultura puderam ser utilizadas
para a análise morfológica através do programa ImageJ. Neurônios GFP-positivos
(verde) e MAP2-positivos (vermelho) (Figura 6) tiveram seus neuritos traçados para
posterior análise morfológica.
Figura 6: Neurônio expressando a proteína fluorescente verde (GFP). Neurônio gerado em cultura primária infectada com o vírus contendo o plasmídeo CAG-IRES-GFP (controle). Imunocitoquímica para MAP2 e GFP após 7 dias in vitro, mostrando um neurônio expressando MAP2 (vermelho) e a proteína fluorescente verde (GFP). Aumento de 40x.
MAP2 GFP
Resultados 44
4.2 ANÁLISE MORFOLÓGICA
Por serem os principais sítios onde os neurônios recebem e integram
informação de um vasto número de contatos sinápticos, os dendritos e seu padrão
específico de arborização determinam não só o número, mas também o tipo das
sinapses recebidas por um neurônio (WHITFORD et al., 2002). Vê-se, então, que o
desenvolvimento dendrítico é essencial para a formação do circuito neuronal; e
porque o padrão especial da arborização dendrítica influencia na função neuronal,
faz-se importante determinar como os neuritos adquirem seu tamanho característico
e sua morfologia durante o desenvolvimento. Para tanto, analisamos diversos
parâmetros morfológicos cujas alterações podem corromper a transmissão sináptica
afetando por fim a comunicação neuronal. São eles: comprimento médio e total dos
neuritos, comprimento do neurito mais longo, número de neuritos por neurônio,
número de bifurcações por neurônio e por neurito.
Para as culturas diferenciadas a partir de neurosferas, analizamos as células
TUJ1 positivas. Para as culturas primárias, onde foram utilizados retrovírus
carreando o plasmídeo contendo a proteína fluorescente verde (GFP), identificamos
e analisamos as células que incorporaram o plasmídeo, indicando que elas
expressavam o gene A-CREB e GFP, CREB-FY e GFP, ou apenas GFP (controles).
A fim de avaliar parâmetros morfológicos neuronais, após 7DIV, as culturas
foram fixadas e submetidas a reações imunocitoquímicas com o anticorpo anti-βIII
tubulina ou anti-GFP (culturas derivadas de neurosferas e culturas primárias,
respectivamente). Imagens dos neurônios que se encontravam mais isolados em
cultura foram feitas com microscópio de fluorescência da Zeiss e foram utilizadas
para a análise morfológica através do programa ImageJ.
4.2.1 Manipulações farmacológicas – Cultura de neurônios corticais
diferenciados a partir de neurosferas
Ensaios farmacológicos com inibidores de vias de sinalização específicas
(PKA, CaMK, MAPK e PI3K) foram realizados com o intuito de avaliar a importância
dessas vias sobre a diferenciação neuronal, em termos de crescimento dos neuritos,
arborização dendrítica e tamanho do soma.
Resultados 45
Para avaliar os efeitos da inibição das vias de sinalização mediados pela
Proteína Kinase A (PKA) e Proteína Kinase Ca2+/Calmodulina-dependente II
(CaMKII) sobre o crescimento de neuritos, neurônios derivados de neurosferas
foram tratados com dois diferentes agentes farmacológicos (Figura 7A, B). O
bloqueio da PKA com o H-89 causou uma redução tanto no comprimento do neurito
mais longo quanto na soma dos comprimentos dos neuritos (Figura 7B, teste de
Mann-Whitney *p < 0,05). Vale ressaltar que, em culturas tratadas com H-89, o
número de neurônios observados foi extremamente reduzido (cerca de 100x menos
do que os controles). Tal resultado implica uma forte influência da via da PKA sobre
a complexidade da arborização dendrítica (bifurcação dos neuritos) e sugere uma
redução na geração de neurônios e/ou um aumento na taxa de morte celular uma
vez que os neurônios analisados (n = 10) correspondiam ao total de neurônios em
cultura, aproximadamente 1% da quantidade de neurônios observada no controle.
O bloqueio da CaMKII com o KN-62 diminuiu significativamente o tamanho
dos neuritos individuais, embora o número total de neuritos e o número de neuritos
primários pareçam estar normais em relação ao controle (DMSO) (Figura 7B).
Para medir os efeitos da inibição das vias de sinalização mediadas por
(MAPK) e a (PI3K) sobre o crescimento de neuritos, neurônios derivados de
neurosferas foram tratados com inibidores farmacológicos correspondentes (U0126
e Wortmannin). Nossos experimentos revelaram que, em condições basais, o
inibidor da PI3K não parece afetar o crescimento neuronal, ao passo que o inibidor
da MAPK, U0126, aumenta o número de neuritos (Figura 8).
Resultados 46
A
B
Figura 7: Análise morfológica de neurônios tratados farmacologicamente com os inibidores da PKA (H-89) e da CaMKII (KN-62). A. Neurônios após 7 DIV marcados com TUJ1 e tratados farmacologicamente com DMSO (controle), H-89 (inibidor da PKA ) ou KN-62 (inibidor da CAMKII). B. Avaliação da complexidade dendrítica dos neurônios tratados com H-89 e KN-62. O bloqueio da PKA pelo H-89 diminuiu significativamente o tamanho dos neuritos mais longos e também diminuiu a soma do cumprimento dos neuritos; enquanto a inibição da CaMKII pelo KN-62 influenciou o comprimento dos neuritos. (DMSO, n = 18 / H-89, n = 10 / KN-62, n = 25). * p<0,05, comparado ao tratamento controle (DMSO) usando Mann-Whitney test.
Resultados 47
A
B
Figura 8: Análise morfológica de neurônios tratados farmacologicamente com os inibidores da MAPK (U0126) e da PI3K (Wort). A. Neurônios marcados com TUJ1 após 7 dias de diferenciação em cultura e tratados farmacologicamente com DMSO (controle), U0126 (inibidor da MAPK) ou Wortmannin (inibidor da PI3K). B. Neurônios tratados com U0126 apresentaram um aumento no número de neuritos, enquanto os tratados com Wortmannin (Wort) não apresentaram diferenças significativas sobre parâmetros de crescimento neuronal avaliados. (DMSO, n = 18 / U0126, n = 12 / Wort, n = 35). * p<0,05, comparado ao tratamento controle (DMSO) usando Mann-Whitney test.
4.2.1.1 Tamanho do Soma Neuronal
Para mensurar o tamanho médio do soma de neurônios corticais gerados a
partir de neurosferas e tratados farmacologicamente com inibidores da PKA,
Resultados 48
CaMKII, MAPK e PI3K, usamos o programa ImageJ para desenhar o contorno do
corpo celular e calcular a área. Não foram encontradas mudanças significativas de
tamanho no soma entre os grupos testados (Figura 9).
A B
Figura 9: Tamanho do soma de neurônios corticais tratados farmacologicamente com os bloqueadores de kinases. O tamanho do soma de neurônios corticais não apresentou diferença significativa em comparação ao controle (DMSO) quando tratados com H-89 (inibidor de PKA), KN-62 (inibidor da CaMKII), U0126 (inibidor da MAPK) e Wortmannin (inibidor da PI3K). A. Visão geral do soma de neurônios corticais após 7 DIV. B. Tamanho do soma em µm
2. (DMSO, n = 22 / H-89, n = 12
/ KN-62, n = 44 / U0126, n = 29 / Wort, n = 37). Quantificação através de ANOVA.
4.2.2 Manipulações farmacológicas e genéticas - Culturas primárias de
neurônios corticais
Células do telencéfalo dorsal de camundongos no período embrionário E14
foram dissociadas e plaqueadas para diferenciação. Após 2 horas, células foram
infectadas com retrovirus carregando plasmídeo com o gene para a proteína
fluorescente verde (GFP) e o gene A-CREB ou CREB-FY (o grupo controle continha
apenas a proteína fluorescente verde - GFP) (Figura 10). Passadas 24 horas, as
culturas receberam tratamento farmacologógico com os inibidores de kinase já
cidados anteriormente, Imagens dos neurônios expressando GFP foram capturadas
em microscópio de fluorescência, aumento de 20x, e seus neuritos foram
desenhados no programa Image J. No total foram desenhados e analizados 302
neurônios (GFP: n = 22; GFP + DMSO, n = 22; A-CREB: n = 36; CREB-FY, n = 19;
GFP + H-89: n = 33; CREB-FY + H-89: n = 30; GFP + KN-62, n = 34; CREB-FY: +
KN-62: n = 31; GFP + U0126, n = 24; CREB-FY + U0126, n = 24; GFP + Wort, n =
25; CREB-FY + Wort, n = 12).
Resultados 49
Figura 10: Neurônios GFP-positivos. Neurônios corticais após 7 DIV expressando a proteína fluorescente verde (GFP). Aumento de 20x. Barra de calibração: 25 µm.
Resultados 50
4.2.2.1 Comprimento dos neuritos
Em condições basais, o fator de transcrição CREB, não parece exercer função
sobre o comprimento médio dos neuritos, uma vez que não houve diferença
significativa entre o grupo controle, o A-CREB e o CREB-FY (Figura 11).
Embora a inibição da PKA pelo H-89 e a inibição da CaMKII pelo KN-62
tenham reduzido significativamente o comprimento médio dos neuritos (Figura 11), o
CREB-FY conseguiu recuperar a nível do controle o tamanho médio dos neuritos em
neurônios tratados com H-89 (CREB-FY + H-89), indicando a participação da via de
sinalização da PKA na ativação do CREB sobre o crescimento neurítico.
Contr
ole
A-C
REB
CREB-F
Y
GFP
+ H
-89
CREB-F
Y + H
-89
GFP
+ K
N-6
2
CREB-F
Y + K
N-6
2
GFP
+ U
0126
CREB-F
Y + U
0126
GFP
+ W
ort
CREB-F
Y + W
ort
0
20
40
60
***
*
Co
mprim
ento
do
s n
eurito
s (m
)
Figura 11: Comprimento médio de cada neurito (µm). Para a avaliação desse parâmetro morfológico, consideramos a média do comprimento de todos os neuritos, do total de neurônios analisados. O A-CREB não teve ação sobre o comprimento neurítico médio. A inibição da PKA (GFP + H-89) e da CaMK (GFP + KN-62) reduziu em aproximadamente 60% e 50%, respectivamente, o comprimento médio dos neuritos. A expressão do CREB-FY conjuntamente à inibição da PKA (CREB-FY + H-89) foi suficiente para recuperar os valores para níveis normais (similares ao controle). Os valores são médias + sem * p<0,05 e ** p<0,01; ANOVA pós-teste de Dunnett.
As vias de sinalização da MAPK e da PI3K não agem sobre o comprimento
médio dos neuritos e os valores obtidos nos grupos CREB-FY + U0126 e CREB-FY
+ Wort indicam que a ativação do CREB através dessas duas vias de sinalização
Resultados 51
não está exercendo influência sobre a variável avaliada, ou seja, o comprimento
médio dos neuritos neuronais.
4.2.2.2 Soma dos comprimentos dos neuritos
A avaliação desse parâmetro morfológico indicou que a atividade do CREB
altera o comprimento total dos neuritos, ou seja, a soma dos comprimentos de todos
os neuritos de um neurônio. Com a inibição do CREB endógeno (grupo A-CREB)
houve uma diminuição significativa (41%) no comprimento total dos neuritos (Figura
12).
Con
trole
A-C
REB
CREB-F
Y
GFP
+ H
-89
CREB-F
Y + H
-89
GFP
+ K
N-6
2
CREB-F
Y + K
N-6
2
GFP
+ U
0126
CREB-F
Y + U
0126
GFP
+ W
ort
CREB-F
Y + W
ort
0
300
600
900
1200
1500
**
*** ******
So
ma d
os c
om
pri
men
tos
do
s n
eu
rito
s (
m)
Figura 12: Soma dos comprimentos dos neuritos (µm). Essa variável foi analisada levando-se em consideração o valor da soma dos comprimentos dos neuritos de cada neurônio. O H-89 e o KN-62 reduziu significativamente a soma dos comprimentos dos neuritos. O CREB-FY, expresso concomitante ao bloqueio farmacológico, não recuperou os valores para níveis similares ao controle. ** p<0,01 e ***p<0,001; quantificação através de ANOVA.
Quando a PKA (GFP + H-89) e a CaMKII (GFP + KN-62) foram inibidas,
observamos uma redução significativa (*** p < 0,001) na soma dos comprimentos
dos neuritos (94% e 80%, respectivamente), ao passo que a inibição das vias da
MAPK e da PI3K não causaram alterações de comprimento. Apenas o efeito do
bloqueio da PKA pôde ser parcialmente revertido com a expressão de CREB-FY,
Resultados 52
porém não para o nível dos controles. O efeito do bloqueio da CaMKII não pode ser
revertido, nem mesmo parcialmente, com o CREB-FY. Contra-intuitivamente, a
expressão de CREB-FY em neurônios tratados com U0126 e Wortmannin reduziu a
soma dos comprimentos dos neuritos (Figura 12).
4.2.2.3 Neurito mais longo
Mensuramos o comprimento dos neuritos que partiam do soma, ou seja, os
neuritos primários; a fim de avaliar o maior tamanho que podiam atingir (em
micrômetros). De acordo com o gráfico (Figura 13), pode-se notar que o fator de
transcrição CREB exerce um importante papel no crescimento do maior neurito
primário. Quando comparado ao controle, a expressão do A-CREB reduziu em 55%
o comprimento do neurito mais longo.
Todos os fármacos reduziram significativamente o comprimento do neurito
mais longo (H-89: 92%; KN-62: 85%; U0126: 37% e Wort: 47%), sendo mais
acentuada a redução gerada pelo bloqueio da PKA (H-89), CaMKII (KN-62), PI3K
(Wort) e MAPK (U0126), nessa ordem.
Em nenhum dos casos onde o CREB-FY foi expresso concomitante ao
bloqueio farmacológico (CREB-FY + H-89; CREB-FY + KN-62; CREB-FY + U0126 e
CREB-FY + Wort), houve recuperação para comprimentos próximos aos do controle.
Porém, a expressão de CREB-FY recuperou parcialmente o efeito do bloqueio da
PKA. Mais uma vez de forma contra-intuitiva, a expressão de CREB-FY em
neurônios tratados com U0126 e Wortmannin afetou de maneira mais intensa o
crescimento do neurito mais longo do que o tratamento com as drogas apenas.
Resultados 53
Con
trole
A-C
REB
CREB-F
Y
GFP
+ H
-89
CREB-F
Y + H
-89
GFP
+ K
N-6
2
CREB-F
Y + K
N-6
2
GFP
+ U
0126
CREB-F
Y + U
0126
GFP
+ W
ort
CREB-F
Y + W
ort
0
150
300
450
600
750
****
*** ***
**
Neu
rito
mais
lo
ng
o (
m)
Figura 13: Comprimento do neurito mais longo (µm). O A-CREB, assim como o bloqueio das quatro vias (PKA, CaMKII, MAPK e PI3K) pelos fármacos correspondentes (H-89, KN-62, U0126 e Wort) reduziu significativamente o comprimento do neurito mais longo. Em nenhum dos grupos, o CREB-FY recuperou o comprimento do neurito mais longo. * p<0,05; ** p<0,01 e ***p<0,001; quantificação através de ANOVA.
4.2.2.4 Número total de neuritos (Primários x Ramos)
A árvore dendrítica cresce pela adição e elongação de ramos: dendritos
primários emergem do corpo neuronal, e ramificam para formar dendritos
secundários e terciários.
A padronização precisa dos dendritos é importante na determinação de como
a informação é processada pelo neurônio (VETTERET al., 2001; SCHAEFER et al.,
2003). Quando há um decréscimo anormal no número de ramos dendríticos no
neurônio, este não consegue receber informação apropriadamente, e
consequentemente resulta na ruptura da rede de sinalização adequada (CHEN et
al., 2005). Assim, existe um grande interesse em entender como o número de
dendritos de um neurônio é determinado
Foi possível observar que o fator de transcrição CREB exerce influência sobre
o número total de neuritos do neurônio, uma vez que a expressão do dominante
Resultados 54
negativo A-CREB reduziu significativamente (p < 0,01) a quantidade total de
neuritos, embora a expressão da sua forma ativa, o CREB-FY, não tenha
aumentado essa quantidade quando comparado ao grupo controle. Pelo gráfico
(Figura 14) pode-se perceber que essa redução no número total de neuritos deve-se
à diminuição significativa do número de ramos, uma vez que o número de neuritos
primários manteve-se praticamente similar entre os três grupos (Controle: 6,18; A-
CREB: 5,06; CREB-FY: 6,16).
O fármaco H-89, inibidor da PKA, reduziu drasticamente o número total de
neuritos, diminuindo significativamente não só o número de neuritos primários
(Figura 14, barras brancas) quanto também, de forma bem mais acentuada, o
número de ramos por célula (Figura 14, barras pretas). Essa ampla redução no
número total de neuritos ocasionada pela droga H-89 (cerca de 74% em relação ao
controle) não foi amenizada pela expressão concomitante do CREB-FY, que não
recuperou, nem mesmo para valores próximos aos do controle, a quantidade total de
neuritos. Semelhantemente, o KN-62, inibidor da CaMK, reduziu o número total de
neuritos por célula, embora em menor porcentagem (61%). Esse efeito, como no
caso do H-89, também se deu pela redução significativa do número de neuritos
primários (25%) e foi, principalmente, influenciado pela redução do número de ramos
(75%).
O U0126, inibidor da MAPK, não causou diminuição nem no número total de
neuritos nem no número de neuritos primários, embora tenha havido uma redução
(54%) do numero total de neuritos quando da manipulação conjunta do fármaco com
o CREB-FY. Exatamente o mesmo ocorreu com o Wortmannin, inibidor da PI3K;
embora a redução do número total de neuritos quando foi feita a manipulação
farmacológica e genética juntas tenha sido inferior (30%) à redução causada pelo
U0126 (54%).
Resultados 55
Figura 14: Número total de neuritos por neurônio: Primários e Ramos. O número total de neuritos está diminuído quando o CREB endógeno é bloqueado com seu dominante negativo A-CREB. O bloqueio da via da PKA (GFP + H-89), além de reduzir significativamente o número total de neuritos, também reduziu o número de neuritos primários. O bloqueio da CaMKII (GFP + KN-62) diminuiu apenas o número total de neuritos, mas não o número de neuritos primários. O CREB-FY, não foi capaz de recuperar as alterações causadas pelos bloqueios farmacológicos; enquanto que juntamente com o U0126 e o Wort acabou por provocar a redução do número total de neuritos. * p<0,05; ** p<0,01 e *** p<0,001; quantificação através de ANOVA.
Resultados 56
4.2.2.5 Número de bifurcações por neurônio
Consideramos como bifurcação o local onde o neurito se ramifica ou se
separa em dois e quantificamos o número de vezes que os neuritos de um neurônio
bifurcam ou ramificam. O A-CREB reduziu o número de bifurcações em 36% (A-
CREB: 10,86 + 6,76) quando comparado ao grupo controle (controle: 17,27 + 7,74;),
embora o CREB-FY não tenha aumentado esse número, mantendo os valores
praticamente iguais aos do grupo controle (Figura 15).
A inibição das vias da PKA (GFP + H-89) e da CaMKII (GFP + KN-62)
diminuiu enormemente o número de bifurcações de cada célula neuronal. Já a
inibição das outras duas vias, MAPK e PI3K (GFP + U0126 e GFP + Wort,
respectivamente) não provocou alteração alguma. Por outro lado, o número de
bifurcações totais por neurônio decaiu para todos os grupos onde as manipulações
farmacológicas foram realizadas em conjunto a expressão genética do CREB-FY
(CREB-FY + H-89; CREB-FY + KN-62; CREB-FY + U0126; CREB-FY + Wort)
(Figura 15).
Figura 15: Número de bifurcações por neurônio. A expressão do dominante negativo A-CREB, assim como o bloqueio da PKA (H-89) e da CaMKII (KN-62) reduziram significativamente o número de bifurcações por neurônio, ou seja, os neuritos ramificaram menos que o normal. Por algum motivo desconhecido, a expressão do CREB-FY juntamente com o bloqueio farmacológico (CREB-FY + H-89, KN-62, U0126 ou Wort) provocou uma diminuição do número de bifurcações neuronais; talvez por aumentar estabilidade dos neuritos. * p<0,05; ** p<0,01 e ***p<0,001; quantificação através de ANOVA.
Resultados 57
4.2.2.6 Número de bifurcações por neurito
Uma relação entre o número total de neuritos e o número de bifurcações por
neurônio foi feita a fim de se obter o número médio de bifurcações por neurito
(bifurcações por neurito = n° total de neuritos / n° de bifurcações por neurônio). A
partir do gráfico (Figura 16) pôde-se observar que esse parâmetro morfológico não
sofreu influência do fator de transcrição CREB, uma vez que a inibição da sua
atividade a partir do seu dominante negativo A-CREB não reduziu nem aumentou o
número de bifurcações por neurito.
Com exceção do bloqueio da CaMKII (GFP + KN62) que aumentou o número
de bifurcações por neurito em cerca de 39% (Controle: 1,44 + 0,26; GFP + KN-62:
2,34 + 1,40), efeito este que foi abolido pela expressão concomitante do CREB-FY
(Figura 16), as demais drogas (H-89, U0126 e Wort) inibidoras das vias de
sinalização da PKA, MAPK e PI3K, respectivamente, não causaram alterações no
número de bifurcações por neurito, da mesma forma que a expressão de A-CREB e
CREB-FY não o fizeram.
Con
trole
A-C
REB
CREB-F
Y
GFP
+ H
-89
CREB-F
Y + H
-89
GFP
+ K
N-6
2
CREB-F
Y + K
N-6
2
GFP
+ U
0126
CREB-F
Y + U
0126
GFP
+ W
ort
CREB-F
Y + W
ort
0
1
2
3
*
Nd
e b
ifu
rcaçõ
es p
or
neu
rito
Figura 16: Número de bifurcações por neurito. O número de vezes que um neurito bifurca ou ramifica não sofreu alteração em nenhum dos grupos, exceto para o KN-62, onde houve um aumento. * p<0,05; quantificação através de ANOVA.
Resultados 58
4.3 ANÁLISE DA SOBREVIVÊNCIA - VÍDEO-MICROSCOPIA
Para acompanharmos, por vídeo-microscopia, a progênie dos progenitores do
telencéfalo dorsal, as células em cultivo foram infectadas com retrovírus carregando
o gene para GFP apenas (controle), A-CREB + GFP ou CREB-FY + GFP após duas
horas de cultivo. Estes vírus são caracterizados pela sua incapacidade de
reprodução e pela incompetência de transportar seu material genético para o núcleo
de células não mitóticas. Desta forma, apenas as células em mitose durante o
período de atividade viral incorporam o seu material genético contendo o gene da
proteína GFP, a qual é transmitida para as células filhas, que a expressam
permitindo a análise dos clones gerados a partir de um progenitor.
Células GFP-positivas nos diferentes grupos foram acompanhadas por um
período de 84h, permitindo a quantificação da taxa de morte celular nos diferentes
grupos (ver metodologia). Nossos dados demonstraram que o fator de transcrição
CREB exerce um papel importante para a sobrevivência de neurônios corticais em
cultura, uma vez que a inibição dessa molécula feita pelo dominante negativo A-
CREB reduziu significativamente a taxa de neurônios (%) que sobrevivem a partir de
60h in vitro (Figura 17).
12 24 36 48 60 72 84
50
60
70
80
90
100Controle
A-CREB
CREB-FY***
*** *
Tempo (h)
So
bre
viv
ên
cia
acu
mu
lad
a (
%)
Figura 17: Taxa de sobrevivência neuronal (%). As células em cultura foram infectadas com o retrovírus carreando os plasmídeos com o gene GFP (Controle), A-CREB (dominante negativo) e CREB-FY (forma constitutivamente ativa). As culturas foram submetidas à vídeo-microscopia por 84h. Pôde-se observar que a inibição do CREB endógeno, feita pelo A-CREB, reduziu 12,53% (*** p<0,001) a sobrevivência em 60h, 13,45% (*** p<0,001) em d3 e 7,94% em 84h (* p<0,05).
Resultados 59
4.4 DENSIDADE DE CÉLULAS NEURONAIS
Durante as análises morfológicas dos neurônios corticais em cultura na
presença de bloqueadores de kinases, observamos que em algumas condições o
número de neurônios parecia menor do que nos controles. Tendo em vista o efeito
de tais kinases sobre a fosforilação do CREB e a importância deste evento para a
sobrevivência neuronal, é possível que nos experimentos com drogas estivéssemos
afetando a geração e/ou sobrevivência neuronal.
Com a finalidade de avaliar a taxa de neurogênese (geração + sobrevivência)
em culturas expostas a diferentes tratamentos com bloqueadores de kinases, foram
quantificadas as densidades de neurônios após 7 dias in vitro. Um total de 50
imagens (10 por variável: DMSO, H-89, KN-62, U0126 e Wort), adquiridas no
microscópio de fluorescência da Zeiss (aumento de 20x), foram analisadas.
Contagens do número de células MAP2-positivas e do número de núcleos celulares
corados com DAPI (MAP2/DAPI) foram feitas a fim de determinarmos a densidade
de células neuronais nos cultivos primários que foram submetidos aos ensaios
farmacológicos. Os cultivos primários tratados com os inibidores da PKA (H-89),
CaMKII (KN-62) e Wort (PI3K) tiveram uma redução significativa da densidade
celular, sugerindo que, quando bloqueadas essas vias de sinalização interferem na
quantidade de neurônios existentes em cultura após 7 dias in vitro. Enquanto que o
bloqueio da PKA e da CaMKII reduziu em cerca de 52% a densidade neuronal em
cultura, o bloqueio da PI3K reduziu esses valores em 61% (Figura 18).
DM
SOH-8
9
KN-6
2
U01
26
Wort
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
****
***
MA
P2 /
DA
PI
Figura 18: Densidade de neurônios em cultura. A proporção de neurônios (células MAP2-positivas) em relação ao número de células totais (DAPI) decaiu significativamente em culturas tratadas farmacologicamente com o H-89, KN-62 e Wort (inibidores da PKA, CaMK II e PI3K, respectivamente).** p<0,01; *** p<0,001, quantificação através de ANOVA.
Discussão 60
5 DISCUSSÃO
Assim como em nosso trabalho, cultivos primários de células corticais têm
sido usados extensivamente no estudo da diferenciação e sobrevivência celular
(veja, por exemplo: COSTA et al., 2007, 2009a; BARTKOWSKA et al., 2007).
Nossos cultivos celulares foram feitos a partir de progenitores do telencéfalo dorsal
embrionário (E14 e E18). Além da importância desses progenitores para o
desenvolvimento do córtex cerebral, que potencialmente contribuiriam para a
geração de diferentes tipos de neurônios glutamatérgicos encontrados nesta
estrutura, estas células apresentam um elevado potencial terapêutico.
Em nenhum lugar, o ditado ''a forma segue a função'' é mais apropriado do
que no campo da neurobiologia. O desenvolvimento da arborização dendrítica é
especialmente importante, já que este é o local primário em que o input sináptico é
integrado na célula. Fatores que influenciam a morfologia dendrítica incluem pistas
genéticas intrínsecas, pistas extrínsecas, tais como fatores de crescimento e
neurotrofinas, e input sináptico vindo de outros neurônios. A árvore dendrítica é
esculpida de maneira altamente dinâmica por meio da adição e eliminação de
dendritos, assim como elongação e ramificação. A ostentação incrivelmente diversa
de estruturas dendríticas vistas dentre as várias classes de neurônios é uma das
indicações do quão fortemente ligada à função é a forma de um neurônio (ALVANIA;
CHEN; GINTY, 2006). Experimentos clássicos onde o estímulo sensório é
bloqueado demonstram que a atividade neuronal é necessária para a apropriada
arborização dendrítica (RAJAN; CLINE, 1998; REDMOND; KASHANI; GHOSH,
2002; LOHMANN; MYHR; WONG, 2002). Nosso trabalho tem o objetivo de avaliar
os efeitos da arborização dendrítica em estados basais, ou seja, sem aplicação
alguma de estímulos, diferentemente da maioria dos trabalhos já descritos na
literatura, que aplicam algum tipo de estímulo externo, como despolarização
neuronal com o uso de KCl (REDMOND; KASHANI; GHOSH, 2002), por exemplo.
A partir de nossos experimentos, observamos que tanto o H-89, quanto o KN-
62, inibidores da Proteína Kinase A (PKA) e da Proteína Kinase Ca2+/Calmodulina-
dependente II (CaMKII), respectivamente, exercem grande influência sobre
crescimento neurítico, tanto em nosso modelo de cultivo de neurônios derivados de
neurosfera quanto em culturas primárias de neurônios corticais. Estes efeitos foram
recuperados, total ou parcialmente, pela expressão do CREB-FY, indicando que os
Discussão 61
efeitos da PKA e CaMKII sobre o crescimento de neuritos em condições basais é
dependente de CREB. De acordo com esta interpretação, o tratamento com o
inibidor H-89 provoca uma redução de 53% na transcrição dependente de CRE,
enquanto a superexpressão da subunidade catalítica da PKA aumenta de 3 vezes
na ativação da transcrição CRE-dependente (LIANG et al., 2008). Da mesma forma,
a regulação transcricional positiva de genes CRE-dependentes induzidos por PKA é
completamente bloqueada pela inativação endógena do CREB com dominantes
negativos (dn-CREB133: mutado no site de fosforilação especifica da PKA, a Serina
133, evitando assim a transcrição; e dn-KCREB: mutado no domínio de ligação ao
DNA, bloqueando assim a habilidade do CREB em ligar-se à CRE) (LIANG et al.,
2008). Em conjunto, nossos resultados e os de Liang e colaboradores demonstram a
competência da sinalização via PKA em ativar genes CRE-dependentes via CREB
em neurônios.
Por outro lado, nem todos os efeitos observados sobre o crescimento
neurítico após o bloqueio da PKA e CaMKII foram recuperados pela expressão de
CREB-FY. De maneira similar, nem todos os efeitos foram mimetizados com a
expressão de A-CREB, indicando que CREB não seria o único alvo da PKA e
CaMKII envolvidas no crescimento neurítico. Por exemplo, a redução no número de
neuritos totais do neurônio ocasionada pela droga H-89 é tão acentuada (diminuição
de 90% em relação ao controle) que a expressão do CREB-FY não consegue
recuperar para valores próximos aos do controle a quantidade de neuritos,
possivelmente devido a participação de outras vias de sinalização por PKA
independentes de CREB.
Os efeitos do bloqueio da PKA observados em nossos estudo poderiam estar
associados com a estabilidade de microtúbulos. De fato, MAP2 (Microtubule-
associated protein 2), a MAP mais abundante no cérebro, está principalmente
localizada em compartimentos somatodendríticos dos neurônios e está envolvida na
associação dos microtúbulos e estabilização dos dendritos (GOEDERT et al., 1991;
MATUS, 1994). A MAP2 é também componente principal de pontes cruzadas
(ligações cruzadas) entre microtúbulos (MTs) ou entre MTs e outros componentes do
citoesqueleto nos dendritos, como já revelado por métodos de microscopia
(SHIOMURA; HIROKAWA, 1987; HIROKAWA et al., 1988). A superexpressão de
MAP2 resulta na agregação intracelular de MTs e formação de neuritos em células
não-neuronais (LEWIS et al., 1989; CHEN et al., 1992; TAKEMURA et al.,1992;
Discussão 62
HIROKAWA, 1994). Esses resultados indicam que MAP2 é essencial para o
crescimento dos dendritos por estabilizar os MTs. Sabe-se também que MAP2
possui um domínio de ligação à subunidade regulatória II da proteína kinase
dependente de cAMP (PKA) (VALLEE; DIBARTOLOMEIS; THEURKAUF, 1981;
THEURKAUF; VALLEE, 1982). Como a MAP2 é altamente concentrada no
citoesqueleto dendrítico, assume-se que é uma das principais proteínas de
ancoragem da PKA nos dendritos, e assim acredita-se que ela desempenha um
papel na transdução de sinal via PKA (HARADA et al., 2002). Esses mesmos
autores reportaram que MAP2 é importante como proteína estrutural e como
pronteína de ancoramento para a PKA em dendritos, cuja perda conduz a redução
de PKA nos dendritos e de PKA total, assim como provoca redução na ativação de
CREB. Por tudo isso, é tentador especular que os efeitos sobre o crescimento
dendrítico encontrados em nossas avaliações quando do bloqueio farmacológico da
PKA, sejam devido à intrínseca relação dessa via com MAP2 e a estabilização dos
microtúbulos dendríticos.
As proteínas kinase Cálcio/Calmodulina dependentes (CaMKs) também tem
sido implicadas no desenvolvimento dendrítico, no entanto quais das muitas
isoformas da CaMK estão envolvidas na arborização dendrítica é um ponto que tem
sido difícil de discernir. WAYMAN et al. (2006) fornece evidências da importância da
atividade da CaMKI (uma via de sinalização por cálcio ainda não descrita até então)
sobre a arborização dendrítica induzida por estímulo e sugere que a CaMKIV
desempenha um papel menos importante. Por outro lado, Redmond; Kashani;
Ghosh (2002) demonstram que a CaMKIV exerce sim influência sobre a morfologia
dendrítica atividade dependente. No entanto, as variações no modo de entrada de
cálcio poderiam explicar porque diferentes grupos observam requisitos distintos para
as várias vias de sinalização da CaMK (ALVANIA; CHEN; GINTY, 2006). Além de
revelar crosstalk entre as vias de sinalizações CaMK e Erk afetando a extensão do
prolongamento axonal em resposta a despolarização da membranda, SCHMITT et
al., 2004 também demonstraram que a CaMKI ativa a transcrição mediada por
CREB e que essa ativação é necessária para o crescimento dendrítico induzido pela
atividade. Tomados conjuntamente, esses achados sugerem que tanto a CaMKI
quanto a CaMKIV estão envolvidas no processo de ativação do CREB dependente
de atividade e no crescimento dendrítico, embora suas relativas contribuições devem
depender do tipo neuronal e da natureza do estímulo (ALVANIA; CHEN; GINTY,
Discussão 63
2006). De forma geral, a atividade da CaM Kinase IV (CaMKIV), mas não da CaMKII
(REDMOND; KASHANI; GHOSH, 2002) e a atividade da CaMKI (WAYMAN et al.,
2006) têm sido apontadas quando se fala em crescimento dendrítico dependente de
atividade.
Nossos resultados sugerem que em estados basais, sem aplicação de
estímulo externo, outra isoforma da CaMK, a CaMKII, exerce papel sobre a
morfologia dendrítica. Vários parâmetros da morfologia neuronal foram alterados
pelo tratamento com KN-62 e apenas algumas destas alterações puderam ser
parcialmente revertidos com a expressão de CREB-FY, indicando que a sinalização
por CamKII é importante para o crescimento de neuritos em neurônios imaturos. O
fato de não conseguirmos reverter os efeitos com CREB-FY podem indicar que a
CaMKII está agindo por outras vias ou que a maior tendência de fosforilação do
CREB-FY pela PKA não permita a recuperação (DU et al., 2000).
As outras duas vias de sinalização inibidas em nossos experimentos, MAPK e
PI3K, não parecem exercer grande influência sobre o crescimento neurítico em nível
basal (exceto em relação ao neurito mais longo, cujo comprimento mostrou-se
diminuído). No entanto, outros trabalhos na literatura tem sugerido um papel da
MAPK e PI3K sobre o crescimento neurítico (GHOSH; GREENBERG, 1995;
POSERN et al., 2000; WU; DEISSEROTH; TSIEN, 2001), principalmente em
condições de despolarização forçada dos neurônios em cultura. Por exemplo, o
aumento do crescimento dendrítico induzido por KCl é suprimido tanto por KN62
quanto por U0126, indicando que tanto a CaM kinase quanto a MAPK contribuem
para o crescimento dendrítico dependente de atividade/cálcio (GHOSH;
GREENBERG, 1995). As diferenças entre estes trabalhos e os nossos resultados
podem ser explicadas pelo fato de não utilizarmos quaisquer estímulos que
induzissem a despolarização neuronal.
Existem consideráveis evidências de que o BDNF regula o crescimento
dendrítico durante o desenvolvimento, mas os mecanismos permanecem incertos. A
fim de identificar vias de sinalização mediando os efeitos por BDNF sobre o
crescimento dendrítico, Finsterwald et al. (2010) estimularam neurônios corticais
com BDNF na presença ou ausência de inibidores farmacológicos específicos da
MAPK e PI3K e a morfologia dos dendritos foi subsequentemente analisada. Em
comparação a culturas que não foram estimuladas, os neurônios expostos a BDNF
exibiram um número aumentado de pontos de ramificação e comprimento total dos
Discussão 64
dendritos, um efeito que foi totalmente abolido pelo inibidor da MAPK, o U0126.
Contrariamente, o bloqueio da PI3K apenas atenuou, mas não preveniu os efeitos
do BDNF sobre a morfologia dendrítica. Em adição, a exposição de neurônios
corticais ao BDNF induziram fosforilação sustentada do CREB, que foi suprimido
pelo U0126. A expressão de A-CREB suprimiu o aumento no comprimento
dendrítico induzido por BDNF, sugerindo que a regulação do desenvolvimento
dendrítico por BDNF requer a transcrição de genes CREB-dependentes
(FINSTERWALD et al. 2010). A expressão de uma forma constitutivamente ativa de
MAPK foi suficiente para aumentar o comprimento total e o número de bifurcações
em neurônios corticais, embora a transfecção de neurônios corticais com a forma
constitutivamente ativa da PI3K não tenha aumentado a extensão nem a
complexidade dos prolongamentos dendríticos (FINSTERWALD et al., 2010). Esses
dados indicam que a ativação da cascada de sinalização da MAPK, mas não da
PI3K, é suficiente para aumentar o comprimento dendrítico e a arborização de
neurônios corticais.
Chan et al. (2011) também observaram que em camundongos knockout para
PIKE (Phosphoinositide 3-kinase enhancer), um ativador da PI3K, havia reduzida
dendritogênese. A fim de averiguar se a diminuição na atividade da PI3K era a
causa de tal fenômeno, neurônios corticais knockouts para PIKE foram infectados
com adenovírus superexpressando a forma selvagem PIKE-L; o dominante negativo
PIKE-L KS (PIKE-L K413A-S414N), o qual previne a estimulação da PI3K (RONG et
al., 2003) e as formas constitutivamente ativas da PI3K (PI3K-CA) e da Akt (Akt-CA).
Três dias após a infecção, a superexpressão, exceto do PIKE-L KS, aumentou
proeminentemente a complexidade dendrítica e, também, da morfologia das
espinhas dendríticas. A análise quantitativa revelou que o número de terminais e o
comprimento total dendrítico estavam marcantemente elevados em neurônios PIKE
-/- infectados com PIKE-L, PI3K-CA, e Akt-CA, fato esse que demonstra a influência
da PI3K sobre a morfologia dendrítica. O resultado contraditório dos nossos
experimentos pode ser devido à diferença no modo de bloqueio da via, pois
enquanto fizemos o bloqueio direto da PI3K com o Wort, os autores do artigo
utilizaram camundongos knockout para PIKE.
Conforme citado acima, o U0126, fármaco inibidor da MAPK, não causou
diminuição nem no número total de neuritos nem no número de neuritos primários,
embora tenha havido uma redução (54%) do numero total de neuritos quando da
Discussão 65
manipulação conjunta do fármaco com o CREB-FY, talvez por um aumento na
estabilização dos neuritos via CREB ativado (pCREB). Curiosamente, no entanto, a
expressão de CREB-FY na presença de bloqueadores da MAPK (e também da
PI3K) provocou uma diminuição do crescimento neurítico, especialmente no número
de neuritos e suas bifurcações. Esses resultados poderiam indicar que tanto a
MAPK quanto a PI3K agem através de vias CREB dependentes e independentes, de
modo que o balanço de ativação entre estas vias seria determinante do crescimento
neuronal.
Quanto ao tamanho do soma, nossos resultados revelaram não haver
alteração significativa do mesmo quando do bloqueio das vias da PKA, CaMKII,
MAPK e PI3K, indicando que os efeitos das nossas manipulações farmacológicas
eram específicas para os neuritos e não uma alteração generalizada do crescimento
celular. Em contraste, Chan et al. (2011) detectaram que a inibição da via da PI3K
reduz em 76.9% o corpo celular de neurônios corticais (E18) de camundongos
knockout para PIKE, potencialmente ligado à atividade reduzida da PI3K/Akt, uma
vez que PIKE normalmente se liga à PI3K/Akt elevando sua atividade. Essa redução
dos neuritos e do soma de neurônios em animais PIKE -/- pode ser um efeito
generalizado da mutação sobre o crescimento neuronal, ao invés de indicar um
efeito específico da PI3K sobre a arborização dendrítica.
A proporção de neurônios (células MAP2-positivas) em relação ao número de
células totais (DAPI) decaiu significativamente em culturas tratadas
farmacologicamente com o H-89, KN-62, e Wortmannin (Wort), o que sugere que o
bloqueio dessas vias (PKA, CaMKII e PI3K, respectivamente) interfere no número de
neurônios existentes ao final dos 7 dias de cultura. Essa observação nos inclina a
supor que tais vias estariam relacionadas à sobrevivência neuronal, embora esse
efeito de redução da densidade neuronal também possa ser devido a uma
diminuição na proliferação. De uma forma ou de outra, é fato que ao inibir qualquer
uma dessas vias, a redução na proporção MAP2/DAPI é significativamente elevada,
diminuindo a densidade neuronal para valores inferiores a 50%, o que pode ser
devido a uma menor sobrevivência dessas células quando tratadas com drogas que
inibem a PKA, CaMKII e PI3K. Além disso, as análises de vídeo-microscopia
revelaram que a expressão do A-CREB (inibição da atividade de CREB) ocasionou
uma redução significativa da sobrevivência neuronal a partir de 60h (2,5 dias) in
vitro, enquanto que a taxa de sobrevivência em células transfectadas com o CREB-
Discussão 66
FY permaneceu similar ao grupo controle. Conjuntamente, nossos dados indicam
que o bloqueio da sinalização mediada por CREB prejudica a sobrevivência
neuronal.
É possível que a expressão do CREB-FY não tenha sido suficiente para
recuperar os valores dos parâmetros morfológicos analisados quando comparado ao
grupo controle e aumentar a sobrevivência devido ao fato de o CREB-FY ser uma
forma mutada do CREB que é apenas mais facilmente fosforilada pela PKA (DU et
al., 2000). Talvez, repetir os experimentos fazendo uso de outra forma
constitutivamente ativa do CREB, como o CREB-s142l (RAVNSKJAER et al., 2007),
que contém uma alteração do aminoácido serina 142 por leucina e é suficiente para
estimular a transcrição gênica independentemente do aumento de AMPc intracelular
e consequentemente ativação de PKA. Essa abordagem talvez possa nos ajudar a
esclarecer e/ou confirmar nossos dados sobre a influências das vias de sinalização
da PKA, CaMKII, MAPK e PI3K sobre a diferenciação neuronal através da ativação
de CREB.
É razoável sugerir que o entendimento das vias moleculares envolvidas na
geração e sobrevivência de novos neurônios durante o desenvolvimento poderá
fornecer importantes informações para a elaboração de terapias celulares para o
tratamento de doenças neurodegenerativas e lesões isquêmicas ou traumáticas do
sistema nervoso central. De fato, um grande desafio na área de neuroterapia celular
tem sido identificar maneiras de melhorar a sobrevivência e a incorporação de
células transplantadas à circuitaria local. Por este motivo, acreditamos que a análise
sistemática dos mecanismos moleculares envolvidos na sobrevivência e
diferenciação neuronal (crescimento dendrítico/axonal) durante o desenvolvimento é
fundamental para a elaboração de estratégias eficazes ao reparo celular no sistema
nervoso adulto lesado.
Conclusões 67
6 CONCLUSÕES
I. Gerais
A sinalização por CREB afeta diferentes aspectos da diferenciação
neuronal, tais como sobrevivência e crescimento de neuritos,
independentemente de atividade sináptica;
Os efeitos da fosforilação de CREB por diferentes kinases sobre a
diferenciação neuronal são distintos, indicando a participação de
outras moléculas.
II. Cultura de neurônios corticais diferenciados a partir de neurosferas
A inibição da PKA e da CaMKII diminui o comprimento dos
neuritos;
A inibição da MAPK não afeta o comprimento, mas aumenta o
numero de neuritos;
O bloqueio da PI3K não altera a morfologia neuronal;
O tamanho do soma neuronal não parece estar sob influência das
proteínas kinase inibidas aqui (PKA, CaMKII, MAPK e PI3K).
III. Cultura primária de neurônios corticais
A ativação do CREB via PKA e CaMKII exerce influência sobre o
comprimento neurítico;
Alguns efeitos do bloqueio de kinases não podem ser explicados
apenas através da mediação por CREB;
A ativação de CREB na presença de bloqueadores da MAPK e
PI3K tem um efeito negativo sobre o crescimento neurítico.
IV. Densidade e Sobrevivência neuronal
A densidade neuronal em cultura estava significativamente
reduzida quando do bloqueio farmacológico das vias da PKA,
CaMKII e PI3K, mas não da MAPK;
A expressão do A-CREB diminuiu significativamente a
sobrevivência de neurônios corticais in vitro a partir de 60h;
Conclusões 68
Os neurônios expressando CREB-FY mantiveram uma taxa de
sobrevivência similar àquela observada no grupo controle.
Referências 69
REFERÊNCIAS
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