UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE … DE OLIVEIRA... · À amiga Ana Judith Pires Garcia...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO BIOLOGIA DE AGENTES INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS

CARACTERIZAÇÃO GENOTÍPICA E FENOTÍPICA DE Escherichia coli

DIARREIOGÊNICAS DE ORIGEM HUMANA E AMBIENTAL ISOLADAS NO

ESTADO DO PARÁ

CINTYA DE OLIVEIRA SOUZA

Belém-Pará 2013



DIARREIOGÊNICAS DE ORIGEM HUMANA E AMBIENTAL

ISOLADAS NO ESTADO DO PARÁ

Belém-Pará 2013

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará, como requisito parcial para obtenção do Grau de Doutor em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários. Orientador: Prof. Dr. Edvaldo Carlos Brito Loureiro

1



DIARREIOGÊNICAS DE ORIGEM HUMANA E AMBIENTAL ISOLADAS NO

ESTADO DO PARÁ

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará, como requisito para obtenção do grau de Doutor em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários.

Orientador: Prof. Dr. Edvaldo Carlos Brito Loureiro Instituto Evandro Chagas / SVS / MS

Banca Examinadora: Prof. Dr. Ricardo Ishak Instituto de Ciência Biológicas, UFPA

Profa. Dra. Lena Líllian Canto de Sá Morais Instituto Evandro Chagas / SVS / MS

Prof. Dr. Luiz Fernando Almeida Machado Instituto de Ciência Biológicas, UFPA

Profa. Dra. Karla Tereza Silva Ribeiro Instituto de Ciência Biológicas, UFPA

Profa. Dra. Marluisa de Oliveira Guimarães Ishak (Suplente) Instituto de Ciência Biológicas, UFPA

Belém, 10 de Julho de 2013

2

“Nosso limite nós mesmos o construímos; expandi-lo é apenas uma questão de vontade e de

coragem”.

Francisco Lúzio de Paula Ramos

3

À minha família, especialmente à minha querida mãe Neiva Monari e ao meu amado esposo

Alexandre Moraes.

"Há pessoas que transformam o sol

numa simples mancha amarela, mas há também aquelas

que fazem de uma simples mancha amarela o próprio sol" (Pablo Picasso).

Mãezinha, esta foi a forma que achei para descrever sua força e sua coragem. Você é uma grande e surpreendente mulher, na qual eu busquei o exemplo de superação.

Meu bem, você é um presente de Deus. Ao teu lado tornei-me uma pessoa melhor e mais feliz!

A Deus, sem o qual eu não teria coragem para lutar nem forças para amar!

4

AGRADECIMENTOS

A Deus, por estar comigo durante todos os momentos de minha vida. Obrigada por sua

infinita misericórdia e por guiar-me por seus caminhos.

Ao meu amado esposo Alexandre, seu amor, cuidado, compreensão e carinho foram

essenciais para a superação dos momentos difíceis desta conquista. Obrigada por sempre estar

ao meu lado!

À minha mãe Neiva e meu pai José Carlos, por todo amor, dedicação, carinho, respeito

e educação que me ensinaram a viver.

Aos meus irmãos Carlos César e Nádia, pelo verdadeiro exemplo de família, onde a

conquista de um é a vitória de todos. Ao meu querido sobrinho João Gabriel (6 anos) que

mesmo sem saber restaurava as minhas forças com o seu sorriso.

Ao meu orientador Dr. Edvaldo Carlos Brito Loureiro, por ter sido um grande

incentivador e orientador. Muito Obrigada!

À Universidade Federal do Pará e ao Curso de Pós-Graduação em Biologia de Agentes

Infecciosos e Parasitários do Centro de Ciências Biológicas, pela oportunidade de crescimento

profissional ofertado com o desenvolvimento e a conclusão deste doutorado.

Ao corpo docente do Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos

e Parasitários da UFPA pelos vários ensinamentos e experiências que me fizeram crescer no

conhecimento.

Aos Professores Doutores, Antonio Carlos Rosário Vallinoto, Lena Líllian Canto de

Sá Morais e Karla Tereza Silva Ribeiro, membros da banca examinadora, pelas importantes

contribuições no plano de qualificação.

Ao Instituto Evandro Chagas/SVS/MS e seu corpo técnico e administrativo pela

oportunidade de desenvolvimento desta tese.

À Dra Elizabeth Conceição de Oliveira Santos, diretora do Instituto Evandro Chagas, pelo

apoio às atividades de pesquisa e a qualificação profissional.

5

Às chefias da Seção de Bacteriologia e Micologia, Dra Maria Luiza Lopes e, da Seção

de Meio Ambiente, Dra Iracina Maura de Jesus, que viabilizaram a execução deste trabalho

por meio da concordância na utilização das coleções bacterianas.

À Dra Flávia Correa Bastos pela inestimável colaboração e orientação na execução e

análise dos testes de PFGE. Obrigada por ter estado sempre à disposição!

À Dr.ª Lena Líllian Canto de Sá Morais pela orientação direta e pessoal durante todo

processo de análise dos perfis de macrorrestrição enzimática, desde as importantíssimas

orientações sobre a utilização do programa Bionumerics até a análise e descrição final dos

resultados. Obrigada por sua valiosa contribuição, por sua paciência e disposição em ajudar!

À Profa Dra Karla Tereza Silva Ribeiro pela concordância e disponibilização das

amostras ambientais isoladas de água de consumo e de beber provenientes do município de

São Sebastião da Boa Vista.

À Dra Daniela Rocha pelas orientações durante a execução dos ensaios de PCR

multiplex.

À amiga Ana Judith Pires Garcia Quaresma pela disposição e colaboração ativa

durante a execução dos testes de suscetibilidade

Às amigas Maurimelia Mesquista da Costa, Karla Valéria Batista Lima, Daniele

Murici Brasiliensis e Ana Roberta Fusco da Costa pelas importantes contribuições durante as

etapas de revisão dos resultados.

À Geralda Resende e Elivan Vale (Seção de Meio Ambiente) pela atenção e

colaboração durante a localização e obtenção das informações referentes às amostras

ambientais.

À Denise Amorim e Raimundo Pio pela colaboração durante os ensaios de PFGE.

À amiga Fernanda Sagica e ao Prof. Dr. Édson Ramos pelas importantes contribuições

durante as análises estatísticas.

Às amigas Silvia Marques, Luana Nepomuceno, Ana Roberta, Karla Lima, Daniele

Murici, Ana Judith, Flavia Bastos e Maurimelia Costa pela amizade e palavras de incentivo

durante este período.

6

Ao Prof. Dr. Francisco Lúzio de Paula Ramos pelo apoio, atenção e incentivos na

busca do aprimoramento técnico e científico.

Aos estudantes, bolsistas e servidores do IEC e da Universidade Federal do Pará que

participaram do isolamento e identificação dos isolados de Escherichia coli: Taiany Bicalho,

Patricia Yoshida, Eveline Bezerra de Sousa, Dolores Dias, José Góes, Caetano, Raimundo

nonato, Madalena, Jardel, Vanderley, Maria Odete, Raquel, Rosinha Kaieda, Elivan Vale,

Geralda Rezende, Raimundo Pio.

Às amigas Ana Roberta Fusco da Costa e Eveline Bezerra de Sousa que foram

responsáveis pela identificação molecular das E.coli diarreiogênicas de origem humana.

Às coordenações dos Projetos Juruti (Dra Lourdes Garcez), Projeto HIV (Dra Yvone

Gabbay), Projeto Praias (Dr Edvaldo Loureiro), Projeto Ilhas (Dra Lena Líllian) e Projeto

Marajó (Dr. Ricardo Ishak) pela oportunidade de participar de alguns desses estudos e pela

disponibilidade das amostras que comporam este trabalho.

Aos amigos do Laboratório de Bacteriologia Geral, Entéricos I e II e do Setor de

esterilização da Seção de Bacteriologia e Micologia (SABMI/IEC) por toda colaboração no

preparo dos meios de cultura, cultivo e recuperação das amostras.

Aos profissionais e estudantes das áreas técnica e administrativa da SABMI/IEC/MS pelo

convívio, auxílio e amizade no decorrer desta etapa. Muito obrigada!

7

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS 9

LISTA DE TABELAS E QUADROS 11

RESUMO 12

ABSTRACT 13

1 INTRODUÇÃO ......................................................................................... 14

1.1 CARACTERÍSTICAS GERAIS DE Escherichia coli................................ 14

1.2 CARACTERÍSTICAS GENÉTICAS DE Escherichia coli ............................ 14

1.3 RECONHECIMENTO DE E. coli COMO PATÓGENO

GASTROINTESTINAL..............................................................................

15

1.4 Escherichia coli DIARREIOGÊNICAS...................................................... 16

1.4.1 E. coli enteropatogênica - EPEC.............................................................. 18

1.4.2 E. coli enterotoxigênica - ETEC............................................................... 21

1.4.3 E. coli enteroinvasora - EIEC................................................................... 22

1.4.4 E. coli produtora da Toxina de Shiga - STEC......................................... 24

1.4.5 E. coli enteroagregativa - EAEC.............................................................. 25

1.5 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL.......................................................... 27

1.6 RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA....................................................... 28

1.7 RELEVÂNCIA DA ANÁLISE CLONAL POR PFGE (PULSED FIELD

GEL ELETROFORESIS) NA EPIDEMIOLOGIA DE ISOLADOS DE

Escherichia coli...........................................................................................

30

1.8 OBJETIVOS................................................................................................ 33

1.8.1 Objetivo Geral ........................................................................................... 33

1.8.2 Objetivos Específicos ................................................................................ 33

2 MATERIAL E MÉTODOS...................................................................... 34

2.1 AMOSTRAS................................................................................................ 34

2.2 PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS................................................ 35

2.2.1 Reisolamento, Identificação e manutenção das culturas de E. coli....... 35

2.2.2 Detecção Molecular de E. coli diarreiogênicas...................................... 35

2.2.2.1 Extração do DNA bacteriano ...................................................................... 36

2.2.2.2 Reação em Cadeia mediada pela Polimerase - Multiplex (PCR-

multiplex).....................................................................................................

37

8

2.2.2.3 Reação em Cadeia mediada pela Polimerase - Simples (PCR-monoplex).. 38

2.2.2.4 Eletroforese................................................................................................. 39

2.2.3 Teste de Suscetibilidade aos antimicrobianos......................................... 40

2.2.3.1 Preparação do Inóculo................................................................................. 40

2.2.3.2 Semeadura nas placas.................................................................................. 40

2.2.3.3 Aplicação dos Discos de Antimicrobianos.................................................. 40

2.2.3.4 Leitura e interpretação do teste.................................................................... 41

2.2.4 Eletroforese em Gel de Campo Pulsante (PFGE) .................................. 41

2.2.4.1 Preparo da suspensão bacteriana ................................................................ 42

2.2.4.2 Montagem dos blocos de agarose ............................................................... 42

2.2.4.3 Processo de Lise in situ ............................................................................... 42

2.2.4.4 Digestão do DNA com a enzima de restrição XbaI..................................... 43

2.2.4.5 Montagem do gel de corrida e condições eletroforéticas............................ 43

2.2.4.6 Coloração e fotodocumentação do gel de agarose....................................... 44

2.2.4.7 Interpretação e análise dos perfis de macrorrestrição gerados pelo PFGE.. 44

2.3 APRESENTAÇÃO E ANÁLISE DOS DADOS........................................ 44

2.4 ASPECTOS ÉTICOS.................................................................................. 45

3 RESULTADOS.......................................................................................... 46

3.1 FREQUÊNCIA E DISTRIBUIÇÃO DAS E. coli DIARREIOGÊNICAS 46

3.2 PELFIL DE SUSCETIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS E

FENÓTIPOS DE RESISTÊNCIA EM E. coli DIARREIOGÊNICAS.......

50

3.3 VARIABILIDADE GENÉTICA DAS E. coli DIARREIOGÊNICAS ..... 56

4 DISCUSSÃO.............................................................................................. 64

4.1 DISTRIBUIÇÃO DAS E. coli DIARREIOGÊNICAS............................... 64

4.1.1 E. coli diarreiogênicas de origem humana.............................................. 65

4.1.2 E. coli diarreiogênicas de origem ambiental........................................... 69

4.2 RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA EM E. coli DIARREIOGÊNICAS 74

4.3 ANÁLISE DA VARIABILIDADE GENÉTICA EM E. coli

DIARREIOGÊNICAS................................................................................. 80

5 CONCLUSÕES.......................................................................................... 83

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................... 85

APÊNDICES ............................................................................................. 103

9

LISTA DE FIGURAS

Página

Figura 1- Padrão de aderência localizada de EPEC em cultura de células HeLa

(Hernades et al., 2009)............................................................................

19

Figura 2- Fímbria BFP de EPEC (Nataro & Kaper, 1998)..................................... 19

Figura 3- Estrutura em forma de pedestal vista na lesão A/E de EPEC (Kaper et

al., 2004).................................................................................................

20

Figura 4- Padrão de aderência localizada de EPEC em cultura de células HeLa

(Hernandes et al., 2009)..........................................................................

26

Figura 5- Distribuição e frequência das E. coli diarreiogênicas de acordo com a

categoria patogênica................................................................................

47

Figura 6- Amplificação dos alvos moleculares gerados pelo PCR-multiplex.

Linha 1: Mix de DNA das cepas padrões de E. coli diarreiogênica,

linha 2 a 8: Controles positivos para observação da amplificação

individual dos alvos moleculares............................................................

49

Figura 7- Frequência de resistência aos antimicrobianos entre as E. coli

diarreiogênicas.........................................................................................

50

Figura 8- Resistência antimicrobiana das E. coli diarreiogênicas de acordo com

a origem de isolamento...........................................................................

52

Figura 9- Perfis de macrorrestrição de E. coli diarreiogênicas gerados pela

enzima Xba I por meio do método de PFGE. Linhas 1, 7 e 13:

Marcador de peso molecular (48,5 a 1018,5 KB); linhas 2-5 e 6-8: E.

coli diarreiogênicas com perfil de macrorrestrição; linha 11: ETEC

615 (ambiental) com degradação do DNA genômico; linha 12:

Salmonella Braenderup...........................................................................

56

Figura 10- Dendograma da relação genética entre as E. coli diarreigênicas

baseado nos perfis de macrorrestrição gerados pela enzima Xba I e

definidos pelo PFGE. O agrupamento por similaridade foi

determinado pelo coeficiente de Dice e método UPGMA.

(Bionumerics Versão 6.5/ Applied Maths)..............................................

59

Figura 11- Dendograma da relação genética entre as amostras de E. coli

enteropatogênica (EPEC) baseado nos perfis de macrorrestrição

10

gerados pela enzima Xba I e definidos pelo PFGE. O agrupamento por

similaridade foi determinado pelo coeficiente de Dice e método

UPGMA. (Bionumerics Versão 6.5 / Applied Maths)............................

60


enteroagregativa (EAEC) baseado nos perfis de macrorrestrição




61


enterotoxigênica (ETEC) baseado nos perfis de macrorrestrição




62


enteroinvasora (EIEC) baseado nos perfis de macrorrestrição gerados

pela enzima Xba I e definidos pelo PFGE. O agrupamento por


UPGMA. (Bionumerics Versão 6.5/ Applied Maths).............................

63

11

LISTA DE TABELAS E QUADROS

Página

Quadro 1- Cepas de referência de Escherichia coli para PCR................................. 35

Quadro 2- Classificação molecular das categorias patogênicas de E. coli............. 36

Quadro 3- Componentes e concentrações utilizados na PCR-multiplex................ 37

Quadro 4- Oligonucleotídeos e produtos de amplificação utilizados na PCR-

multiplex.................................................................................................

38

Quadro 5- Programa de cliclagem utilizado na PCR-multiplex............................... 38

Quadro 6 - Componentes e concentrações utilizados na PCR-monoplex................ 39

Quadro 7 - Oligonucleotídeos e produtos de amplificação utilizados na PCR-

monoplex.................................................................................................

39

Quadro 8- Programa de cliclagem utilizado na PCR-monoplex.............................. 39

Quadro 9- Interpretação do diâmetro dos halos de inibição aos antimicrobianos

utilizados.................................................................................................

41

Tabela 1- Frequência das E. coli diarreiogênicas de origem ambiental de acordo

a origem de isolamento...........................................................................

46

Tabela 2- Frequência de E. coli diarreiogênicas de origem humana de acordo

com origem de isolamento......................................................................

46

Tabela 3- Distribuição e frequência das E. coli diarreiogênicas de acordo com os

fatores de virulência e a origem de isolamento.......................................

48

Tabela 4- Frequência da resistência antimicrobiana de E. coli diarreiogênica de

acordo com as origens de isolamento......................................................

50

Tabela 5- Perfil de suscetibilidade entre as E. coli diarreiogênicas de acordo com

os antimicrobianos utilizados.............................................................

51

Tabela 6- Resistência antimicrobiana das E. coli diarreiogênicas de acordo com

as categorias patogênicas........................................................................

53

Tabela 7- Fenótipos de resistência antimicrobiana das E. coli diarreiogênicas de

acordo com a origem de isolamento........................................................ 54

Tabela 8- Fenótipos de resistência antimicrobiana das E. coli diarreiogênicas de

acordo com as categorias patogênicas..................................................... 55

12

RESUMO

A Escherichia coli é uma enterobactéria comensal do trato intestinal de humanos e

animais e sua presença no ambiente é indicativo de contaminação fecal. A presença de

determinados genes de virulência tornam essas bactérias patogênicas, podendo ser

classificadas em categorias diarreiogênicas: E.coli enteropatogênica típica (EPEC-t) ou atípica

(EPEC-a), E.coli enterotoxigênica (ETEC), E.coli enteroinvasora (EIEC), E. coli produtora da

toxina de Shiga (STEC) e E. coli enteroagregativa (EAEC). Com objetivo de conhecer a

frequência, a resistência antimicrobiana e as relações genéticas entre estas categorias no

estado do Pará, foram pesquisados genes de virulência por PCR-multiplex e/ou monoplex

entre 410 amostras de E.coli, sendo 344 de origem ambiental e 66 de origem humana. A

resistência antimicrobiana foi avaliada pelo método de difusão em disco e as relações

genéticas por PFGE. As cinco categorias de E.coli diarreiogênicas foram identificadas, sendo

mais frequentes entre a origem humana (13,36%) do que ambiental (1,74%). A ETEC, EAEC

e EPEC atípicas foram frequentes entre as duas origens. A EIEC e STEC foram exclusivas de

origem humana, enquanto, a EPEC tipica foi exclusiva de origem ambiental. As maiores

resistências foram observadas ao sulfametoxazol-trimetoprim (44,44%), ampicilina (40,28%)

e tetraciclina (33,33%) e a única diferença de resistência entre as amostras humanas e

ambientais foi à amoxicilina-ácido clavulânico. Não houve diferença estatística de resitência

antimicrobiana entre as catogorias de E. coli, no entanto, a EAEC e EPEC apresentaram a

maior diversidade de fenótipos de resistência. Os fenótipos de resistência mais frequentes

foram AMP-STX-TE (24,32%), AM-STX (21,62%) e STX-TE (16,22%). A análise das

relações genéticas revelou uma ampla variabilidade dos perfis de macrorrestrição entre todas

as categorias de E. coli diarreiogênicas, tanto as de origem humana quanto ambiental, mesmo

assim, foi possível a identificação de clones de origem humana que estavam geograficamente

relacionados. Uma vez que as E. coli diarreiogênicas, puderam ser identificadas entre

amostras humanas e ambientais, sendo a maioria resistente, sugere-se que as E. coli isoladas

no Pará, podem apresentar potencial patogênico para o desenvolvimento de doença

gastrointestinal e, que a água de rio, pode servir de fonte de infecção para população.

Palavras chaves: E. coli diarreiogênicas, humana, ambiente, resistência e PFGE.

13

ABSTRACT

Escherichia coli is a commensal enterobacteria from the intestinal tract of humans and

animals and their presence in the aquatic environment is indicative of fecal contamination.

The presence of certain virulence genes make these pathogenic bacteria be classified into

diarrheogenic categories: enteropathogenic E.coli typical (EPECt) or atypical (EPECa),

enterotoxigenic E. coli (ETEC), enteroinvasive E. coli (EIEC), and. enterohemorrhagic E. coli

(EHEC) or E. coli Shiga toxin-producing (STEC) and enteroaggregative E. coli (EAEC). In

order to know the frequency, antimicrobial resistance and between these categories in the Pará

State, we investigated virulence genes by multiplex and/or monoplex-PCR among 410 E. coli

strains, among which, 344 were of environmental origin and 66 of human origin.

Antimicrobial resistance was evaluated by the disk diffusion and the genetic relationship by

PFGE. The six categories of diarrheagenic E. coli have been identified and the most common

were the ones from human origin (13.36%) than the environmental ones (1.74%). The ETEC,

EAEC and atypical EPEC were frequent between the two sources. The EIEC and STEC were

exclusive of human origin, while the typical EPEC was exclusive of environmental origin.

The highest resistance was observed to trimethoprim-sulfamethoxazole (44.44%), ampicillin

(40.28%) and tetracyclin (33.33%) and the only difference in resistance between the human

and environmental samples was to amoxicillin-clavulanic acid. There was no statistical

difference in antimicrobial resistance among E. coli categories, however, EAEC and EPEC

showed the highest diversity of resistance phenotypes. The most frequent resistance

phenotypes were AMP-STX-TE (24.32%), AM-STX (21.62%) and STX-TE (16.22%). The

genetic relationships analysis revealed a wide variability of macrorestriction profiles among

all categories of diarrheagenic E. coli, both of human origin as of environmental one, anyway,

it was possible to identify clones of human origin that were geographically related. Since

diarrheagenic E. coli, have been identified among human and environmental samples, being

the majority resistant, it is suggested that the E. coli strains isolated in Pará, may have

pathogenic potential for the development of gastrointestinal disease, and that river water, can

serve as source of infection for population.

Keywords: diarrhoeagenic E. coli, human, environment, resistance, PFGE.

14

1. INTRODUÇÃO

1.1. CARACTERÍSTICAS GERAIS DE Escherichia coli

A Escherichia coli é um bacilo Gram-negativo pertencente à família

Enterobacteriaceae que coloniza o trato gastrointestinal de humanos e animais, mede 1,1 - 1,5

m de diâmetro por 2,0 - 6,0 m de comprimento, são móveis por flagelos peritríquios ou

imóveis e apresentam metabolismo respiratório ou fermentativo com bom crescimento à

temperatura de 37ºC. As seguintes características bioquímicas são utilizadas para sua

identificação: fermentam a glicose e outros carboidratos com a formação de ácido e gás; são

oxidase-negativa, catalase-positiva, vermelho de metila e indol positivos, Voges-Proskauer e

citrato de Simmons negativos, não produzem H2S e não realizam a hidrólise da uréia; a

maioria das cepas fermenta a L-arabinose, maltose, D-manitol, D-manose, L-raminose, D-

xilose (Winn Jr et al., 2008).

Além das cepas de E. coli comensais, que fazem parte da microbiota do intestino

humano, existem cepas que podem ser patogênicas e causar doença, produzindo diferentes

quadros clínicos. As categorias que causam infecção intestinal são coletivamente chamadas de

E. coli diarreiogênicas com distintos mecanismos de patogenicidade; e as associadas às

infecções extraintestinais (urinárias, meningites, septicemias e outras) são conhecidas como

EXPEC (Extraintestinal Pathogenic E. coli) (Martinez & Trabulsi, 2008).

1.2. CARACTERÍSTICAS GENÉTICAS DE Escherichia coli

A E. coli K-12 é considerada uma E. coli comensal e devido sua ampla utilização

como modelo na biologia molecular e biotecnologia teve seu genoma primeiramente descrito.

O genoma da E. coli K-12 é constituído por uma sequência de DNA de fita dupla possuindo

4.639.221 pares de bases, sendo 87,8% dos genes codificantes para proteínas, 0,8% para RNA

estáveis, 0,7% consiste de repetições não-codificantes e, aproximadamente, 11% são

destinados para regulação e outras funções. O genoma também contém sequência de

elementos de inserção (IS), fragmentos de fagos, e muitas outras sequências de composição

incomum, indicando uma elevada plasticidade genômica através de transferência horizontal

de genes (Blattner et al., 1997).

15

As categorias patogênicas de E. coli são definidas pela presença ou ausência de

determinados segmentos de DNA codificantes de fatores de virulência que, em sua maioria

são adquiridos através de eventos de transferências horizontais de genes intra ou extra espécie

(Bielaszewska et al., 2007). Devido à aquisição de segmentos específicos como as ilhas de

patogenicidade e outros elementos genéticos móveis, os genomas de E. coli patogênicas

podem ser de até 1Mb maiores do que as comensais e pode codificar cerca de 5.000 genes

(Croxen & Finlay, 2010).

1.3. RECONHECIMENTO DE E. coli COMO PATÓGENO GASTROINTESTINAL

A Escherichia coli passou a ser reconhecida como patógeno intestinal primário após a

ocorrência de um surto de diarreia infantil relatado por Bray & Beavan (1948), no qual foi

isolada uma cepa particular de E. coli, identificada como Bacterium coli neopolitanum.

A partir desse relato, cada amostra epidêmica de E. coli identificada, recebia uma

designação de seus descobridores. Para padronizar a nomenclatura da E. coli, um

bacteriologista dinamarquês, Fritz Kauffmann, adaptou o esquema de sorotipagem

desenvolvido para Salmonella enterica, para o uso com E. coli (Kauffmann, 1954; Ewing,

1986). De acordo com este esquema, a E. coli é sorotipada com base na presença dos

antígenos somáticos (antígeno O), flagelares (antígeno H) e capsulares (antígeno K) (Nataro

& Kaper, 1998).

A utilidade imediata desse esquema foi demonstrada pelo fato de que várias cepas de

E. coli, que haviam sido isoladas em outros surtos de diarreia entre 1920 e 1940, pertenciam,

surpreendentemente, a um pequeno número de sorogrupos O, em particular O111 e O55.

Entretanto, nem todas as E. coli podem ser tipadas dessa forma, devido alguns isolados

autoaglutinarem e serem chamados “rugosos” (O rough ou OR) ou por não poderem ser

tipados pelos antissoros existentes (O non-typable ou ONT). São conhecidos mais de 180

sorogrupos O e mais de 60 sorogrupos H, sendo possíveis mais de 10.000 combinações entre

estes antígenos (Robins-Browne & Hartland, 2002). O antígeno O é responsável pela

designação do sorogrupo, enquanto que a determinação do antígeno somático e flagelar (O:H)

indica o sorotipo (Angeles, 2002).

De acordo com Nataro e Kaper (1998), as Escherichia coli podem ser classificada em

três grupos: comensais, patogênicas intestinais e extraintestinais. Entre as patogênicas

intestinais são identificadas seis diferentes categorias conhecidas como E. coli diarreiogênicas

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1438422107000380

16

descobertas ao longo do tempo: E. coli enteropatogênica (EPEC), E. coli enterotoxigênica

(ETEC), E. coli enteroinvasora (EIEC), E. coli entero-hemorrágica (EHEC) ou E. coli

produtora da toxina de Shiga (STEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) e E. coli aderente

difusa (DAEC).

A primeira categoria a ser reconhecida foi a E. coli enteropatogênica (EPEC), na

década de 1940 (Bray & Beavan 1948). Com o passar dos anos, as infecções por esta

categoria em países industrializados tornaram-se pouco frequentes e o interesse nesta bactéria

também. No final da década de 1960, observou-se que algumas variedades de E. coli

causavam diarreia semelhante à cólera, produziam enterotoxinas termolábil e termoestável e

foram nomeadas como E. coli enterotoxigênica (ETEC) (Sack et al., 1971).

Na década de 1970, foi observado que um grupo de E. coli era capaz de causar

disenteria bacilar e ceratoconjuntivite em cobaias pelo teste de Sereny, uma característica

encontrada até então no gênero Shigella. Essas amostras foram inicialmente classificadas

como Shigella e mais tarde identificadas como E. coli enteroinvasora (EIEC) (Dupont et al.,

1971).

No início de 1980, dois surtos de diarreia associados à colite hemorrágica e síndrome

hemolítica urêmica ocorreram na América do Norte (Estados Unidos e Canadá - 1982) devido

o consumo de sanduíches com carne bovina mal passada. Durante a investigação destes surtos

foi isolado das fezes dos pacientes um sorotipo incomum de E. coli, identificado como

O157:H7, produtor de citotoxinas e denominado de E. coli entero-hemorrágica (EHEC) (Riley

et al., 1983; Karmali et al., 1983).

Essas novas descobertas evidenciaram o potencial patogênico das Escherichia coli e

estimularam o interesse em E. coli diarreiogênicas, bem como a investigação de suas

propriedades patogênicas. Com a introdução de novos testes de investigação de

patogenicidade, como a adesão em cultura de células e inoculação em alças intestinais de

coelho, novas categorias foram sendo descritas como a E. coli enteroagregativa (EAEC) (Vial

et al., 1988; Cravioto et al., 1991).

1.4. Escherichia coli DIARREIOGÊNICAS

De acordo com Nataro & Kaper (1998), as E. coli diarreiogênicas representam

importante causa de diarreia endêmica e epidêmica no mundo. No entanto, a frequência

17

desses patógenos pode ser subestimada devido sua detecção exigir métodos diagnósticos

específicos, que não são utilizados na prática clínica.

A identificação de E. coli diarreiogênicas requer sua diferenciação das espécies não

patogênicas da microbiota normal (Toma et al., 2003). As E. coli que causam diarreia são

classificadas em categorias patogênicas de acordo com fatores de virulência específicos, que

são codificados por cromossomos, plasmídeos e DNA de bacteriófagos. Esses fatores de

virulência fornecem a cada categoria uma capacidade de causar síndrome clínica com

características epidemiológicas e patológicas distintas (Browne et al., 2004).

As seis categorias diarreiogênicas de E. coli são diferenciadas com base nos seus

mecanismos de patogenicidade em: E. coli enteropatogênica (EPEC), E. coli enterotoxigênica

(ETEC), E. coli enteroinvasora (EIEC), E. coli entero-hemorrágica (EHEC) ou E. coli

produtora da toxina de Shiga (STEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) e E. coli aderente

difusa (DAEC) que atuam de acordo com a presença de fatores de virulência como adesinas

fimbriais e afimbriais, toxinas e invasinas (Nataro & Kaper, 1998; Teng et al., 2004; Nguyen

et al., 2005). Destas, as principais categorias associadas à diarreia aguda em menores de 5

anos são EPEC e ETEC (Souza et al., 2002, Ochoa et al., 2011), mas recentemente, a

ocorrência de EAEC associada à diarreia vem sendo investigada e evidenciada nas regiões

Sudeste e Nordeste do Brasil (Spano et al., 2008; Regua-Mangia et al., 2009a; Moreno et al.,

2010).

Percebe-se que a ocorrência das E. coli é um processo dinâmico e a cada época uma

modificação de prevalência ou surgimento de uma nova categoria pode ser observada. Um

exemplo foi o que ocorreu com a E. coli enteropatogênica típica (EPEC-t), anteriormente

associada às diarreias infantis. Atualmente, há poucos relatos dessa categoria (EPEC-t), e a

mesma vem sendo substituída pelas E. coli enteropatogênica atípica (EPEC-a) e E. coli

enteroagregativa (EAEC) (Souza et al., 2002; Gomes et al., 2004; Rodrigues et al., 2004;

Araújo et al., 2007; Moreno et al., 2010). Estudos epidemiológicos, sorológicos e moleculares

desenvolvidos com EPEC atípica, sugerem que esta pode ser uma nova categoria e não um

subgrupo de EPEC com ausência do plasmídeo EAF (Schmidt, 2010). Outro exemplo foi a

descoberta de uma nova variante híbrida de E. coli (STEC-EAEC), sorotipo O104:H4,

relacionada a um surto de colite hemorrágica e síndrome hemolítica urêmica, ocorrido na

Alemanha e em outros países da Europa com relato de vários óbitos (Kim et al., 2011).

18

1.4.1. E. coli enteropatogênica – EPEC

A primeira categoria de E. coli diarreiogênica foi a EPEC, identificada na década de

1940. Esta categoria foi considerada, em países em desenvolvimento, uma importante causa

de diarreia aguda e eventual diarreia persistente em crianças menores de 5 anos, com

prevalência em crianças menores de 2 anos de idade (Albert, 1996; Gomes et al., 1991) e

responsáveis por surtos de diarreia hospitalar em berçários no período de inverno (Smith et

al., 1996).

O quadro clínico causado por EPEC se manifesta com diarreia aguda, que pode ser

leve ou grave, acompanhada de febre e vômito (Fagundes-Neto & Scaletsky, 2000; Angeles,

2002).

Em 1995, durante o 2º Simpósio Internacional sobre EPEC, realizado em São Paulo,

foi reconhecida a existência de duas subcategorias de EPEC denominadas EPEC típica e

EPEC atípica. Nesse simpósio ficou definido que EPEC típica de origem humana é aquela que

possui um gene cromossômico eae (E. coli attachment-effacement) e um plasmídeo de

virulência conhecido como EAF (EPEC adherence factor) que codifica a fímbria BFP

(Bundle Forming Pilus), responsável pelo padrão de aderência em células epiteliais; enquanto

que EPEC atípica é aquela que não possui o plasmídeo EAF ou fímbria BFP (Kaper, 1996;

Trabulsi et al., 2002).

Uma ampla definição de EPEC pode não requerer a presença do plasmídeo EAF ou

fímbria BFP, mas apenas a habilidade de causar a lesão A/E (attaching and effacing), ou seja,

presença de eae, com ausência de Stx (Toxina de Shiga) (Kaper, 1996).

Em estudos com voluntários, verificou-se que algumas amostras destituídas de EAF

causavam diarreia de menor intensidade nos pacientes do que as EAF-positivas (Nataro &

Kaper, 1998). O mecanismo central da patogênese de EPEC é a lesão A/E, habilidade também

presente em E. coli produtora de toxina de Shiga (STEC) e outras espécies bacterianas. O

mecanismo pelo qual EPEC típicas promovem diarreia é complexo e provavelmente resulta

dos efeitos de adesão na célula epitelial que inclui alterações na estrutura da membrana e na

secreção de íons (Vidal et al., 2007).

De acordo com Frankel et al. (1996), Nataro & Kaper (1998) e Vidal et al. (2007), o

processo enteropatogênico ocorre em três estágios:

1º) Aderência localizada: as EPEC típicas produzem um padrão de aderência

característico em culturas de células Hep-2 (células epiteliais de laringe humana) e HeLa

(células epitelial de cervix humano), chamado de aderência localizada. Neste padrão, a

19

bactéria adere em pontos localizados da membrana plasmática dos enterócitos formando

microcolônias compactas (Figura 1). Este fenômeno está associado com a presença da fímbria

BFP que é codificada pelo plasmídeo EAF. Cleary et al. (2004) demonstraram que além do

papel de interação entre as EPEC, a fímbria BFP é o fator de fixação inicial predominante,

entretanto, na ausência de BFP (Figura 2), os filamentos EspA (EPEC secreted protein) são

capazes de promover uma fixação bacteriana inicial, porém de menor eficiência;

2º) Transdução de sinais: a aderência de EPEC à célula epitelial induz uma variedade

de rotas de sinalização na célula eucariótica. Os genes responsáveis pela ativação da

transdução de sinais são codificados em uma ilha de patogenicidade chamada de “Locus of

enterocyte effacement” ou região LEE, que codifica um Sistema de Secreção do Tipo III,

secretor de várias proteínas como as Esp (EPEC secreted proteins) e receptor Tir

(Translocated intimin receptor). Nessa etapa ocorrem alguns eventos como fosforilação de

proteínas com ativação da tirosina quinase e aumento da concentração de Ca2+ intracelular

que inibe a absorção de Na+ e Cl-;

3º) Aderência íntima: a aderência íntima à célula epitelial é mediada pela ação da

intimina (IntEPEC) que é uma proteína de membrana codificada pelo gene cromossômico eae

(E. coli attachment-effacement). Abaixo da região de aderência ocorre a condensação dos

filamentos de actina das microvilosidades dos enterócitos que resulta na formação de

estruturas semelhantes a pedestais (Figura 3). Este conjunto de modificações representa a base

da lesão A/E (attaching and effacing).

Figura 1- Padrão de aderência localizada de EPEC em cultura de células HeLa (Hernades et al., 2009).

Figura 2- Fímbria BFP de EPEC (Nataro & Kaper, 1998).

20

A classificação de EPEC em típicas e atípicas tem importante implicação na

patogenicidade e desfecho da diarreia, antes não totalmente apreciada (Trabulsi et al., 2002).

As EPEC típicas (EPEC-t) são isoladas somente de humanos, enquanto as EPEC atípicas

(EPEC-a) são encontradas em humanos e em vários animais como gado bovino, bubalino,

equinos, aves e animais domésticos como cães e gatos (Ishii et al., 2007; Morato et al., 2009;

Moura, 2009; Chase-Topping et al., 2012). Por muitos anos, as EPEC típicas foram associadas

à diarreia infantil, mas têm-se observado, frequentemente, a redução desta subcategoria e um

aumento relativo do isolamento de EPEC atípicas (Souza et al., 2002; Ghosh & Ali, 2010;

Moreno et al., 2010) inclusive como única categoria entre as E. coli diarreiogênicas associadas

aos casos diarreicos (Ferrer, 2007).

A alta prevalência de EPEC-atípica em pacientes com diarreia comparada aos

indivíduos controles (sem diarreia) em muitos países e em algumas regiões do Brasil e, a

ocorrência de surtos fortemente associados a esta categoria, faz com que as EPEC-a sejam

consideradas como verdadeiros patógenos intestinais (Hernandes et al., 2009; Sousa, 2010). De

acordo com Scaletsky et al. (2009), há evidências que mesmo entre as EPEC atípicas ocorra

subgrupos patogênicos relacionados à doença diarreica.

Os principais sorotipos de EPEC encontrados são: O55:[H6], O86:H34, O111:[H2],

O114:H2, O119:[H6], O127:H6, O142:H6, O142:H34 (típicas) e O26:H[11], O55:[H7],

O55:H34, O86:H8, O111ac:[H8], O111:[H9], O111:H25, O119:H2, O125ac:H6, O128:H2

(atípicas) (Trabulsi et al., 2002). Várias EPEC atípicas de humanos e animais, que não

Figura 3 - Estrutura em forma de pedestal vista na lesão A/E (attaching and effacing) de EPEC (Kaper et al., 2004).

21

pertencem aos sorogrupos clássicos, tem sido identificadas (Blanco et al., 2005; Bando et al.,

2007).

1.4.2. E. coli enterotoxigênica – ETEC

A segunda principal categoria de E. coli a ser associada com diarreia foi a ETEC, que

emergiu no final dos anos 60 e início dos anos 70, devido principalmente ao trabalho

desenvolvido por Sack et al. (1971) em Calcutá. As cepas de ETEC estão associadas à causa

de diarreia em crianças com maior incidência na faixa etária de 2 a 3 anos (Albert et al., 1995)

e a diarreia dos viajantes de características semelhante à cólera (Black, 1990; Nataro et al.,

2006).

Estão distribuídas numa grande variedade de sorogrupos, que abrangem pelo menos 78

grupos O e 34 H. Os sorogrupos “O” mais comuns são: O6, O8, O15, O20, O25, O27, O49,

O63, O78, O128, O148, O153, O159, O167 e O169, e os grupos O e H mais fortemente

associados: O8:H9, O78:H12 e O25:H42 (Wolf, 1997; Nataro et al., 2006).

Investigações epidemiológicas têm implicado a água e os alimentos contaminados,

com dose infectante de 108 UFC/mL (unidades formadoras de colônia), como veículos

comuns de transmissão de ETEC sendo, a diarreia dos viajantes, diretamente relacionada à

contaminação de alimentos e água (Mattila, 1994; Angeles, 2002). O sintoma predominante é

a diarreia aquosa profusa, acompanhada de câimbras abdominais leves, vômitos e febre; esta

diarreia pode ser leve e autolimitada, mas em alguns casos pode ser grave (Angeles, 2002).

Em contraste com a patogenia da EPEC, o mecanismo pelo qual a ETEC promove

diarreia se deve a aderência na mucosa intestinal e produção de enterotoxinas.

A aderência à mucosa intestinal está relacionada às adesinas conhecidas como Pili tipo

1 e CFA I e II (colonization factor antigens) também chamados de antígenos CS (coli surface

antigens), sendo ambos considerados como os fatores de virulência mais importantes para a

colonização da mucosa intestinal por ETEC. Os genes codificadores dos CFA são encontrados

em plasmídeos que também podem conter informações genéticas para as enterotoxinas. A

investigação de CFA para a detecção de ETEC é pouco prática devido ao seu grande número

e heterogeneidade (Nataro & Kaper, 1998).

A partir da colonização inicia-se a elaboração de enterotoxinas. As cepas de ETEC

produzem dois tipos de enterotoxinas: toxinas termolábeis LT – I e LT – II (heat-labile toxin)

e toxinas termoestáveis STa e STb (heat-stable toxin) (Nataro & Kaper, 1998).

22

A LT – I é expressa por E. coli que são patogênicas ao homem e animais, enquanto

que LT-II é encontrada primariamente em amostras de animais (Costa et al., 2006). LT-I é

uma toxina oligomérica, antigenicamente semelhante à toxina produzida por V. cholerae,

possuindo uma subunidade A e cinco subunidades B. O mecanismo de patogenicidade de LT-

I consiste na ligação das subunidades B ao mesmo receptor da toxina colérica (gangliosídio

GM1), permitindo a entrada da subunidade A. O principal alvo da subunidade A é uma

proteína de membrana (Gs) que regula a adenilato-ciclase; como efeito final, tem-se o

aumento de AMPc (monofostato de adenosina cíclico), com ativação dos íons sódio, cloreto,

bicarbonato de potássio e água da célula para luz intestinal, promovendo assim a diarreia

aquosa (Nataro & Kaper, 1998).

Há duas classes distintas de ST, a STa (também chamada de ST-I) e STb, que diferem

em estrutura e mecanismo de ação. Existem algumas variantes de STa, a STp (ou STIa) e STh

(ou STIb). A STp ou STIa é isolada de humanos e animais, a STh ou STIb é encontrada

predominantemente em humanos (Nataro & Kaper, 1998). A classe STb está associada

primariamente a cepas ETEC isoladas de suínos, entretanto, algumas cepas ETEC

expressando STb, de origem humana, foram observadas (Trabulsi et al., 2002; Kaper et al.,

2004). De modo semelhante, a enterotoxina STa liga-se à guanilato-ciclase, resultando em

elevação dos níveis de monofosfato de guanosina cíclico e hipersecreção subsequente de

líquidos (Nataro & Kaper, 1998).

1.4.3. E. coli enteroinvasora – EIEC

Em 1971, DuPont et al. (1971) descreveram certas amostras de E. coli que causavam

doença diarreica invasiva ou disenteria em voluntários. Estas amostras, de sorotipos distintos

de ETEC e EPEC, eram extremamente semelhantes à Shigella. Hoje, há evidências de que

EIEC e Shigella spp estão relacionadas genética e bioquimicamente (Angeles, 2002), no

entanto, há diferenças no processo patogênico e na resposta imunológica do hospedeiro que

evidenciam que a diarreia causada por EIEC é mais branda que a provocada por Shigella

(Ferreira et al., 2012).

As EIEC são frequentemente lactose-negativas, lisina descarboxilase-negativa,

imóveis, com exceção do sorotipo O124:H30 e produzem uma doença semelhante à shigelose

(Gibotti et al., 2004).

A doença é mais comumente descrita em surtos do que em casos esporádicos (Gordillo

et al., 1992), afetam, principalmente, crianças acima de dois anos de idade e adultos de baixa

23

renda em países em desenvolvimento, causando uma diarreia aguda aquosa que precede a

disenteria bacilar (fezes contendo muco, sangue e leucócitos), acompanhada de dor

abdominal, vômito, tenesmo e febre (Taylor et al., 1988, Nataro & Kaper, 1998). No Brasil,

há relatos de que na cidade de São Paulo a frequência com que esta categoria está associada a

diarreia varia de 2,3 a 15,8% dependendo da população de estudo e de que em outras cidades

essa frequência é mais baixa (Toledo & Trabulsi, 1990, Ferreira et al., 2012).

O mecanismo patogênico inclui a capacidade de invadir os enterócitos da mucosa do

cólon e proliferar no interior dessas células, resultando em processo inflamatório, morte

celular e propagação para células vizinhas; a produção de enterotoxinas é outro fator

considerado de importância para patogênese da infecção por EIEC, pois são responsáveis pela

secreção de água e eletrólitos no intestino delgado, promovendo assim, a fase de diarreia

aquosa (Nataro & Kaper, 1998).

Um processo complexo de colonização e permanência da EIEC nas células intestinais

envolve múltiplos genes, tanto cromossomais como plasmidiais. Os genes necessários para a

invasão se encontram em um plasmídeo de 140 MDa chamado pInv (plasmídeo de invasão),

que codifica proteínas invasivas, como as Ipa (invasion plasmid antigen) e outras que estão

envolvidas no processo patogênico (Angeles, 2002).

O conjunto do gene ipa codifica quatro proteínas (IpaA, IpaB, IpaC e IpaD) sendo um

dos loci essencial à invasão e está próximo a uma região do plasmídeo onde ocorrem deleções

espontâneas. A perda do plasmídeo de invasão ou deleção espontânea de uma pequena região

contendo genes ipa ocorre com relativa frequência (1 em 103 a 104 células), tornando a

bactéria não invasiva, e portanto, avirulenta. O gene ipaH codificador de um polipeptídeo

semelhante a proteína IpaB, mas distinto imunológica e geneticamente, está presente em

múltiplas cópias, tanto em plasmídeo quanto no cromossomo, e não faz parte do conjunto dos

genes ipaBCDA. Portanto, a pesquisa de ipaH é pouco comprometida pela perda do plasmídeo

e/ou eventos de deleção seletiva do plasmídeo de invasão, sendo assim, mais sensível para

diagnóstico laboratorial (Venkatesan et al., 1989).

Os principais sorotipos desta categoria são: O28ac:Nomotile (NM - não móvel),

O29:NM, O112ac:NM, O121:NM, O124:NM, O124:H30, O136:NM, O143:NM, O144:NM,

O152:NM, O164:NM e O167:NM. O número de antígenos O associados à EIEC são

limitados, sendo que três deles estão presentes em Shigella (O112ac, O124 e O152) (Gibotti

et al., 2004).

24

1.4.4. E. coli produtora da Toxina de Shiga – STEC

Em 1982, um surto de colite hemorrágica, ocorrido nos Estados Unidos, chamou

atenção para uma síndrome clínica incomum de doença diarreica e para um novo patógeno

bacteriano entérico. O agente etiológico se tratava da E. coli O157:H7, um sorotipo não

reconhecido, anteriormente, como causador de doença diarreica em humanos (Riley et

al.,1983).

As STEC são reconhecidas como importante causa de diarreia aquosa, sanguinolenta

com desenvolvimento de colite hemorrágica e síndrome hemolítica urêmica (HUS – hemolytic

uremic syndrome) em todo o mundo, causadoras de surtos tanto em países desenvolvidos

como em países em desenvolvimento (Morabito et al., 1998; Gomes et al., 2011). A maioria

dos casos e dos surtos tem sido atribuída ao consumo de carne bovina e suína (Stephan &

Schumacher, 2001) e outras fontes como frutas, saladas, sucos, iogurte e água, quando

contaminados por fezes de animais infectados (Feng, 1995; Costa et al., 2006; Von Sydow et

al., 2006).

Diferentes quadros clínicos são observados nas infecções por STEC: quadro de

diarreia cujo período de incubação é de 3-4 dias e perduram por 5-10 dias, são acompanhados

por câimbras e dores abdominais, febre baixa e vômito em 30-50% dos casos; o quadro de

síndrome hemolítica urêmica é caracterizado por manifestações de insuficiência renal aguda,

trombocitopenia e anemia hemolítica microangiopática (López et al., 2000).

As manifestações diarreicas promovidas por STEC são atribuídas a duas enterotoxinas

semelhantes à toxina de Shiga, denominadas SLT-I e SLT-II (Toxina Shiga Like), também

conhecidas como Verotoxinas (VT-1 e VT-2) ou toxinas de Shiga (Stx-1 e Stx-2). A Stx-1 é

idêntica à toxina de Shiga produzida por Shigella dysenteriae tipo 1 e a Stx-2 possui 60% de

homologia; como esta, ambas possuem cinco subunidades B e uma subunidade A, estando a

subunidade B ligada a um glicolipídio específico na célula hospedeira. Uma vez internalizada,

a subunidade A é clivada em duas moléculas, e o fragmento A1, liga-se a um ácido

ribonucléico ribossomal 28S (rRNA) e interrompe a síntese protéica. A síndrome hemolítica

urêmica tem sido preferencialmente associada à produção de Stx-2, que destrói seletivamente

as células endoteliais renais (Levine, 1987; Browne, 2005).

Stx-1 e Stx-2 são codificadas por genes encontrados em dois distintos bacteriófagos,

que são integrados ao cromossomo do hospedeiro (Browne, 2005). Outros potenciais fatores

de virulência são codificados pelo cromossomo e um plasmídeo de 60 MDa encontrado em

todas as amostras do sorotipo O157:H7, dentre os quais podemos citar: proteína intimina,

25

enterohemolisina citolítica (Ehly- Enterohaemolysin), proteínas séricas e uma catalase (Nataro

& Kaper, 1998).

Trabalhos realizados em alguns países da América do Sul (Chile e Argentina) citam

além do sorotipo O157:H7, outros sorogrupos envolvidos nos quadros de HUS (Síndrome

Hemolítica Urêmica): O11:H- (H- - antígeno flagelar ausente), O21:H- , O26:H-, O26:H11,

O75:H- e O87:H- (Morabito et al., 1998; López et al., 2000; Browne, 2005). O sorogrupo

O157, antes característico de EHEC, foi descrito por Blank et al. (2003) no Brasil em

amostras de EPEC, o que evidencia o fato da não correlação de sorogrupos com determinada

categoria patogênica. Segundo Schmidt (2010), outros sorogrupos como O111, O103 e O145

tem sido reconhecidos como importante causa de colite hemorrágica e HUS.

Dentre os determinantes de virulência acessórios das amostras O157:H7 e O26:H11

temos a ilha de patogenicidade conhecida como LEE (Locus of enterocyte effacement). Esta

ilha consiste num agrupamento de genes associados à virulência incluindo eae, que codifica a

adesina intimina (como em EPEC) que é utilizada como alvo em alguns ensaios diagnósticos.

A ilha de patogenicidade LEE foi primeiramente identificada em EPEC (que causa diarreia

em crianças, mas não produz Stx ou causa HUS) (Browne, 2005).

Em estudos de evolução de E. coli patogênicas verificou-se que, na análise

comparativa de sequências completas do genoma de amostras E. coli não patogênicas e EHEC

O157:H7, estas bactérias compartilham um arcabouço genético comum com ilhas de DNA

interceptadas. Há evidências de que muitos fatores podem ter sido adquiridos de outras

bactérias por transferência horizontal de gene (por exemplo, através dos bacteriófagos,

transposons e plasmídeos). Nesse contexto, é preciso lembrar que a evolução bacteriana é um

processo que pode conduzir indubitavelmente a emergência de outro clone patogênico de E.

coli bem sucedido no futuro (Schmidt, 2010).

1.4.5. E. coli enteroagregativa – EAEC

Pesquisadores em 1987, ao examinarem amostras de E. coli isoladas em um estudo

epidemiológico sobre a etiologia da diarreia no Chile encontraram amostras que apresentavam

um padrão exclusivo de aderência, semelhante a empilhados de tijolos, que foi chamada

aderência agregativa (AA) (Cravioto et al., 1991) (Figura 4).

As cepas de E. coli que se aderem às células de cultura de Hep-2 (célula epitelial de

laringe humana) ou HeLa (célula epitelial de cérvix humano) são classificadas em três

diferentes categorias de acordo com o tipo de aderência: aderência localizada (AL), aderência

26

agregativa (AA) e aderência difusa (AD). As E. coli de aderência agregativa são denominadas

Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) (Nataro et al., 1987).

As EAEC são consideradas como agente causador de diarreia aguda e persistente em

crianças e adultos de países em desenvolvimento como Peru e Brasil (Ochoa et al., 2011;

Souza et al., 2002; Moreno et al., 2010) e desenvolvidos como Estados Unidos e Reino Unido

(Navarro-Garcia & Elias, 2011). Alguns surtos de gastroenterites foram relatados no Japão

envolvendo crianças em idade escolar e na Iuguslávia entre recém-nascidos de 2 a 11 dias de

idade, internados em unidade neonatal (Itoh et al., 1997). A Escherichia coli enteroagregativa

(EAEC) é considerada uma categoria emergente de E. coli diarreiogênica com distribuição e

importância mundial (Okhuysen & DuPont, 2010).

De acordo com Chan et al. (1994), alguns sintomas como vômito e febre foram

relacionados aos casos de diarreia causada por EAEC.

O mecanismo pelo qual a EAEC causa diarreia não esta bem definido, porém vários

fatores de virulência vêm sendo identificados: fímbria de aderência agregativa – I e II (AAF I

e II) responsáveis pela aderência à mucosa intestinal (Nataro et al., 1992), hemolisina e a

produção de uma toxina termo estável chamada EAST, semelhante a STa produzida pelas

cepas de ETEC e outra toxina codificada por plasmídeos conhecida como Pet (plasmid-

encoded toxin) (Garcia et al., 1999), além desses fatores, fazem parte da patogênese desta

categoria a produção de biofilme e a inflamação da mucosa intestinal (Navarro-Garcia &

Elias, 2011).

Figura 4- Padrão de aderência localizada de EAEC em cultura de células HeLa (Hernandes et al., 2009)

27

O diagnóstico padrão para classificação de EAEC é a observação da aderência

agregativa (AA) em cultura de células HEp-2, no entanto, a investigação do gene pCVD432

(plasmídeo de aderência agregativa - pAA) ou a presença do gene aggR (ativador

transcricional das fímbrias de aderência agregativa - AAF) são utilizadas como marcador

molecular em estudos epidemiológicos que buscam esclarecer a associação de EAEC às

doenças diarreicas (Baudry et al., 1990; Schmidt et al., 1995; Jenkins et al., 2006).

Vários estudos sugerem que as cepas de EAEC são genética e fenotipicamente

heterogêneas (Nataro et al., 1995; Czeczulin et al., 1999).

1.5. DIAGNÓSTICO LABORATORIAL

O diagnóstico laboratorial das infecções diarreicas é realizado pela identificação direta

ou indireta do agente etiológico. No caso das infecções de origem bacteriana, a maioria dos

diagnósticos é realizada pelo método convencional, que consiste no isolamento do agente

bacteriano das fezes e posterior identificação bioquímica e sorológica (Winn Jr et al., 2008;

Martinez & Trabulsi, 2008).

Para o isolamento de bactérias da família Enterobacteriaceae, especificamente de E.

coli, as amostras fecais são semeadas em meios seletivos indicadores como o ágar Mac

Conkey – MC e/ou ágar EMB (Eosina Azul de Metileno); após incubação, as colônias

suspeitas são submetidas aos meios de triagem Triple Sugar Iron Agar – TSI e a

caracterização bioquímica realizada por meio de testes bioquímicos convencionais (Winn Jr et

al., 2008) ou em aparelhos semi-automatizados (Mini API- bioMèrieux) ou automatizados

(Vitek II-bioMèrieux). Após identificação do gênero ou espécie bacteriana, a amostra é

submetida à caracterização sorológica através da técnica de soroaglutinação que pode ser

realizada em lâminas ou tubos, segundo recomendações de Ewing (1986) e Kauffmann

(1954).

O método convencional utilizado na identificação da maioria dos enteropatógenos

bacterianos não é suficiente para o diagnóstico das E. coli diarreiogênicas. Um estudo mais

amplo envolvendo aspectos moleculares, como a pesquisa de genes codificantes de fatores de

virulência e experimentos “in vivo” como os testes de aderência e invasão à cultura de

células, são necessários para a identificação destas categorias (Nataro et al., 1987; Cravioto et

al., 1991).

28

A detecção dos genes codificantes de fatores de virulência por meio da Reação em

Cadeia Mediada pela Polimerase (Polymerase Chain Reaction – PCR) está sendo amplamente

utilizada para a diferenciação de E. coli patogênicas das comensais e classificação das

diferentes categorias diarreiogênicas (Frankel et al., 1989; Wang et al., 1997; Paton & Paton,

1998; Pennisi, 1999; Phantoumath et al., 2003).

Os principais fatores de virulência utilizados na pesquisa molecular para diferenciação

entre as E. coli diarreiogências são: a fímbria BFP (Bundle-forming pilus) codificada pelo gene

bfpA localizado no plasmídeo EAF (EPEC Adherence Factor) e a proteína intimina codificada

pelo gene cromossomal eaeA (E. coli attachment-effacement) para identificação de EPEC; a

proteína de invasão codificadas pelo plasmídeo Ipa (invasion plasmid antigen) para

identificação de EIEC; as enterotoxinas termolábil (LT) e a termoestável (ST) para

identificação de ETEC e toxinas de Shiga (Stx-1 e Stx-2) codificadas pelos identificação de

STEC (Campos et al., 2004; Franzolin et al., 2005). Para investigação de EAEC pesquisa-se os

genes pCVD432 (plasmídeo de aderência agregativa - pAA) ou gene aggR (ativador

transcricional das fímbrias de aderência agregativa - AAF) (Jenkins et al., 2006).

Apesar da técnica de PCR convencional ser utilizada rotineiramente para a pesquisa de

E. coli diarreiogênicas, a investigação dos isolados bacterianos requer um grande número de

reações individuais para a detecção de vários fatores de virulência (Kimata et al., 2005). Para

reduzir o número de testes necessários para a identificação dessas E. coli, vários sistemas de

PCR multiplex, para a amplificação simultânea de dois ou mais loci em uma única reação,

têm sido desenvolvidos. Estes sistemas de detecção múltipla representam apropriada solução

para laboriosa identificação de categorias diarreiogênicas de E. coli, além de se mostrar como

uma tecnologia mais eficiente e econômica (Saucedo et al., 2003).

Usualmente mais de uma PCR multiplex é requerida (Toma et al., 2003, Costa et al.,

2010), no entanto, uma única PCR multiplex já foi utilizada para determinação simultânea de

cinco categorias diarreiogênicas de Escherichia coli (Aranda et al., 2007; Sousa, 2010).

1.6. RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA

Ao longo das últimas quatro décadas, desde a descoberta das penicilinas naturais, o

avanço da indústria farmacêutica levou ao surgimento de diversos antimicrobianos, com

espectro de ação cada vez mais amplo, porém não houve, paralelamente, a preocupação com

as consequências futuras de tal desenvolvimento. Hoje, é notório o uso inadequado destes

29

antimicrobianos tendo como principal consequência a emergência de micro-organismos

multirresistentes (Martins et al., 2000).

Para que os antimicrobianos sejam utilizados adequadamente, conhecimentos

específicos relacionados a estes, às características epidemiológicas dos pacientes e às

infecções em questão, devem ser avaliados. A exposição aos antimicrobianos pode

desencadear resistência bacteriana, mesmo quando empregado de forma correta. O uso

inadequado desses fármacos agrava esta ocorrência, sendo este, o principal fator envolvido na

emergência de micro-organismos multirresistentes, limitando as opções terapêuticas para o

tratamento de processos infecciosos (Brasil, 1998).

A multirresistência abrange muitos grupos bacterianos, inclusive Escherichia coli

diarreiogênicas e comensais isoladas de diferentes fontes: intestinais e extraintestinais de

humanos, animais e ambientais (Estrada-Garcia et al., 2005; Melo, 2006; Aslani et al., 2008;

Ochoa et al., 2009; Gibson et al., 2010; Patoli et al., 2010; Johnson et al., 2010).

Nos países em desenvolvimento, a multirresistência aos antimicrobianos

sulfametoxazol-trimetoprim (SXT), ampicilina (AMP) e tetraciclina (TE) em E. coli

diarreiogênicas isolada de pacientes com diarreia, é considerado um problema emergente

(Estrada-Garcia et al., 2005; Oteo et al., 2005; Ochoa et al., 2009; Garcia et al., 2011).

Estrada-Garcia et al. (2005), no México, evidenciaram que 73% das E. coli

diarreiogênicas foram resistentes a ampicilina (AMP) e 65% ao sulfametoxazol-trimetoprima

(SXT); além, do fenômeno de multirresistência (3 ou mais antimicrobianos) encontrado em

58% das amostras. Entre as diferentes categorias diarreiogênicas, pode-se constatar que a

resistência a ampicilina (AMP) e ao sulfametoxazol-trimetoprim (SXT) foi maior entre ETEC

(E. coli enterotoxigênica) e EAEC (E. coli enteroagregativa) do que entre EPEC-a (E. coli

enteropatogênica atípica).

No Peru, os percentuais de resistência a estes antimicrobianos foram maiores do que

no México: 85% a ampicilina (AMP) e 65% a tetraciclina (TE). As multirresistências mais

frequentes foram aos antimicrobianos AMP-SXT-TE e AMP-SXT, em 24% e 19% das

amostras, respectivamente. A multirresistência variou de 44 a 100%, sendo a EAEC (E. coli

enteroagregativa) a mais resistente entre as categorias diarreiogênicas (Ochoa et al., 2010).

No Brasil, Garcia et al. (2011) encontraram menores percentuais de resistência entre

E. coli diarreiogênicas, sendo 39,7% de resistência a tetraciclina (TE) e 30,9% a ampicilina e

ao sulfametoxazol-trimetoprim (SXT), no entanto, identificaram resistência de 5,9% a

cefalotina e de 3% a levofloxacina. A EAEC apresentou o maior percentual de resistência

30

(81%), seguida pela ETEC (62,8%) e EPEC (60%). A resistência aos antimicrobianos tem

sido identificada como característica relevante entre EAEC, que já apresentou 81,5% de

resistência com definição de 15 perfis distintos, sendo 11, com padrão de multirresistência

(Regua-Mangia et al., 2009b).

Sabe-se que antibioticoterapia é indicada apenas nos casos de infecções

extraintestinais por Escherichia coli e outras enterobactérias, principalmente nas infecções

urinárias, septecemias e outras, sendo desaconselhável nos casos de infecções intestinais

(Silva, 2002; Brasil, 2009). Mesmo assim, observam-se quadros diarreicos causados por

bactérias multirresistentes, sendo essa situação, reconhecida como um importante problema

de saúde pública nos países em desenvolvimento e, sua investigação é prioritária para o

Programa de Controle das Doenças Diarreicas estabelecido pela Organização Mundial de

Saúde (Vila et al., 1999).

Em relação à resistência de Escherichia coli isoladas de ambientes aquáticos, Melo

(2006) e Patoli et al. (2010), observaram que os maiores percentuais de resistência aos

antimicrobianos foram detectados em ambientes com maior ação antrópica, sendo a presença

de dejetos de origem humana ou animal, a principal fonte de contaminação da água por E. coli

multirresistentes (Reinthaler et al., 2003). Os maiores percentuais de resistência dos isolados

ambientais foram aos antimicrobianos ampicilina e acido nalidíxico, que são indicados no

manejo clínico de casos diarreicos graves (Estrada-Garcia et al., 2005; Silva, 2002; Brasil,

2009).

1.7. RELEVÂNCIA DA ANÁLISE CLONAL POR PFGE (PULSED FIELD GEL

ELETROFORESIS) NA EPIDEMIOLOGIA DE ISOLADOS DE Escherichia coli

A Eletroforese de Campo Pulsante (PFGE) é uma técnica de tipagem molecular

baseada no estudo da similaridade cromossomal. Esta técnica consiste na separação de

fragmentos de DNA de alto peso molecular, obtidos pela digestão do DNA genômico com

enzimas de restrição com baixa frequência de corte (Gandra et al., 2008).

É reconhecida como técnica “padrão ouro” para identificação de linhagens bacterianas

e apresenta poder discriminatório elevado, sendo utilizada como instrumento eficaz para as

análises de diversidade genética de diferentes micro-organismos e nos estudos de relações

epidemiológicas (Persing & Tenover, 2004; Magalhães et al., 2005; Goering, 2010).

31

O PFGE vem sendo utilizado na rotina da pesquisa epidemiológica e molecular de

Escherichia coli em diferentes contextos relacionados à saúde humana, dando resposta a uma

série de questionamentos, como na determinação de possíveis fontes de infecções

comunitárias e hospitalares para elucidação de surtos ou origem de contaminação (Regua-

Mangia et al., 2003; Borges et al., 2010), na inspeção de alimentos e manipuladores de

alimentos para avaliação do processo produtivo e qualidade do produto final (Badri et al.,

2009; Campos et al., 2009) e, no estudo das relações genéticas entre amostras isoladas de

humanos e animais para o reconhecimento de possíveis reservatórios e o esclarecimento das

prováveis vias de transmissão (Santos et al., 2010; Chase-Topping et al., 2012).

No Brasil, a maioria dos estudos com E. coli, utilizando PFGE, é desenvolvido com

E. coli produtora de toxina de Shiga (STEC), que avalia a diversidade de fatores de virulência

entre principais sorogrupos: O26, O111, O113 e O157, e demonstram a heterogeneidade

genética entre amostras isoladas de humanos, de animais e de alimentos (Guth et al., 2002;

Bastos et al., 2006; Vaz et al., 2006; Santos et al., 2010).

A utilização do PFGE foi essencial para determinar aspectos epidemiológicos de

EPEC atípicas. Enquanto as EPEC típicas raramente são isoladas de animais, sendo o homem

seu principal hospedeiro suscetivel, as EPEC atípicas são isoladas de animais (cães, gatos,

bovinos, macacos) e humanos e, os resultados dos perfis eletroforéticos gerados pelo PFGE

permitiram a identificação de clones comuns entre humanos e animais, sendo possível

considerar que animais atuam como reservatórios e fonte de infecção de EPEC atípica para

humanos (Moura, 2009).

Johnson et al. (2008) identificaram por meio do PFGE que E. coli uropatogênica

(UPEC) isoladas de animais de companhia e de humanos apresentam os mesmos clones e que

a trasmissão cruzada desta categoria de E. coli entre humanos e animais pode ocorrer no

ambiente domiciliar.

A técnica de PFGE permitiu o reconhecimento da diversidade genética entre amostras

de Escherichia coli pertencentes aos mesmos sorotipos e a similaridade genética entre cepas

de diferentes sorotipos e sorogrupos. Estes achados indicam que cepas pertencentes ao mesmo

sorogrupo O podem ter evoluído separadamente umas das outras e que o sorogrupo O em si

não deve ser tomado por indicador de relações genéticas entre as cepas de E. coli (Bando et

al., 2007; Peroto, 2007).

De acordo com Afset et al. (2008), a análise das relações genéticas, entre EPEC atípica

isoladas de crianças com ou sem diarreia, por PFGE e MLST (Multilocus sequence typing),

32

permitiu evidenciar elevada heterogeneidade entre as amostras avaliadas e, que os resultados

de PFGE confirmaram um padrão de infecção endêmica entre as crianças durante o período

de estudo, demonstrando que o PFGE possuiu maior poder discriminatório do que o MLST na

diferenciação entre EPEC atípicas não relacionadas epidemiologicamente.

33

1.8. OBJETIVOS

1.8.1. Objetivo Geral

Caracterizar genotípica e fenotipicamente os isolados de Escherichia coli

diarreiogênicas de origem humana e ambiental identificados no Estado do Pará.

1.8.2. Objetivos Específicos

Identificar sequências gênicas (eae, bfp, st, lt, stx, ipaH, aggR) codificantes dos fatores de

virulência em E. coli de origem humana e ambiental e classificá-las em categorias

diarreiogênicas E. coli enteropatogênica - EPEC; E. coli enterotoxigênica - ETEC, E. coli

produtora de Toxina Shiga - STEC, E. coli enteroinvasora – EIEC e E. coli

enteroagregativa - EAEC);

Determinar e comparar as frequências de E. coli diarreiogênicas (EPEC, ETEC, STEC,

EIEC e EAEC) entre as origens humana e ambiental;

Identificar o perfil de suscetibilidade das E. coli diarreiogênicas frente aos

antimicrobianos;

Determinar e comparar a frequência e os fenótipos de resistência aos antimicrobianos

entre as E. coli diarreiogênicas de origem humana e ambiental e entre as categorias

patogênicas;

Determinar a variabilidade genética das categorias diarreiogênicas de E. coli de origem

humana e ambiental;

Avaliar e comparar os perfis de macrorrestrição das categorias diarreiogênicas de E. coli

de acordo com a origem e data de isolamento.

34

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1. AMOSTRAS BACTERIANAS

O estudo incluiu um total de 410 amostras de Escherichia coli coletadas em projetos

anteriores entre os anos de 2000 a 2012, sendo 344 de origem ambiental e 66 de origem

humana.

2.1.1. Amostras Ambientais: Das 344 E. coli ambientais, 146 foram isoladas de águas

superficiais de rio no entorno das ilhas Grande e Murutucu no município de Belém/PA, no

período de 2002 a 2004; 106 foram isoladas de areia das praias de Mosqueiro e Salinópolis -

Belém/PA, no ano de 2002 e, as 92 E. coli restantes foram isoladas de água de beber ou de

consumo doméstico que abasteciam residências no município de São Sebastião da Boa Vista –

Marajó/PA, no ano de 2012.

2.1.2. Amostras Humanas: Das 66 E. coli diarreiogênicas de origem humana (fezes), 24

foram provenientes de indivíduos HIV-positivo com ou sem diarreia, atendidos nas Unidades

de Referência para doenças infecto-parasitárias localizadas em Belém/PA e identificadas

segundo Costa et al. (2010). As demais 42 E. coli diarreiogênicas foram provenientes de

indivíduos com ou sem diarreia residentes no município de Juruti-Pará e, identificadas

segundo Sousa (2010). A seleção destas amostras e as informações referentes à data de

isolamento e números de indivíduos positivos para E. coli diarreiogênicas foram obtidas por

meio de consulta às fichas epidemiológicas e aos registros laboratoriais.

35

2.2. PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS

2.2.1. Reisolamento, reidentificação e manutenção das culturas de E. coli

As amostras estavam estocadas em ágar nutriente e foram semeadas em tubos

contendo caldo TSB (Tryptic Soy Broth, Merck) e incubadas à temperatura de 35-37 ºC por

18-24 horas. Após crescimento, as amostras foram plaqueadas em ágar MC (Mac-Conkey,

Merck) e incubadas à temperatura de 35-37 ºC por 18-24 horas. Uma colônia isolada e

representativa do cultivo foi semeada em tubos contendo ágar TSI (Triple Sugar Iron, Merck)

e incubada à temperatura de 35-37 ºC por 18-24 horas. Após crescimento, as amostras foram

repicadas para dois tubos contendo ágar nutriente, um deles foi direcionado para

reidentificação bioquímica utilizando o sistema API 20E e outro mantido à temperatura

ambiente para utilização no decorrer do trabalho. As amostras originais foram devolvidas e

novamente estocadas nas coleções biológicas.

2.2.2. Detecção Molecular de E. coli diarreiogênicas

A pesquisa das sequências gênicas para detecção molecular de E. coli diarreiogênicas

foi realizada por PCR-multiplex e/ou PCR-monoplex seguindo as recomendações de Sousa

(2010).

As E. coli de origem ambiental foram testadas inicialmente por PCR-multiplex para

triagem das E. coli diarreiogênicas e, posteriormente, por PCR-monoplex para confirmação e

classificação. As E. coli de origem humana, já classificadas como E. coli diarreiogênicas,

foram testadas apenas por PCR-monoplex para confirmação da presença dos genes

característicos de cada categoria.

Foram utilizadas cepas padrões de cada categoria diarreiogênica como controles

positivos, além de um controle negativo (Quadro 1), cedidas pela Dra Tânia Vaz do Instituto

Adolfo Lutz – IAL / São Paulo.

Quadro 1- Cepas de referência de Escherichia coli para PCR

Cepas de Referência Categoria E2348/69 EPEC H10407 ETEC-LT/ST

EDL1284 EIEC EDL933 STEC

EAEC O42 EAEC E. coli K12 DH5α E. coli comensal

36

As E. coli diarreiogênicas foram classificadas de acordo com a presença dos seguintes

genes ou sequências de DNA utilizando os critérios estabelecidos nos trabalhos de Campos et

al. (2004) e Franzolin et al. (2005) (Quadro 2). Essa classificação orientou a seleção dos alvos

moleculares utilizados na PCR.

Quadro 2- Classificação molecular das categorias patogênicas de E. coli

Categorias patogênicas

Genes Característicos

EPEC típica Gene eaeA (intimina), gene bfpA (fímbria BFP) e/ou Região EAF com ausência dos genes stx-1 e stx-2 (toxina de Shiga)

EPEC atípica Gene eaeA (intimina) com ausência dos genes stx-1 e stx-2 (toxina de Shiga)

ETEC Genes codificadores das enterotoxinas LT (termolábil) e/ou ST (termoestável)

EIEC Gene ipaH (plasmídeo de invasão)

STEC Genes eaeA (intimina) e stx (Stx-1 e/ou Stx-2); ou somente Stx-1 e/ou Stx-2

EAEC Gene aggR (ativador transcricional para AAF -fímbria de aderência agregativa)

Fonte: Adaptado de Campos et al., 2004; Franzolin et al., 2005.

2.2.2.1 Extração do DNA bacteriano

A extração do DNA bacteriano foi realizada por fervura e congelamento seguindo às

recomendações de Starnbach et al. (1989), Olsvik & Strockbine (1993) e Baloda et al. (1995)

como descrito a seguir:

um repique da cultura de trabalho foi transferida para tubo contendo 3 mL de caldo Luria,

e incubado à temperatura de 35-37 ºC por 12 horas;

1,5 mL da cultura foi transferido para um microtubo de 1,5 mL e centrifugado a 9.660 g

durante 5 minutos;

o sobrenadante foi descartado, e o precipitado solubilizado em 400 L de água purificada

(milli-Q) estéril;

a suspensão foi homogeneizada em agitador mecânico do tipo vortex e levada ao

termobloco (100 ºC) por 10 minutos; após este tempo, a suspensão foi imediatamente,

submetida à temperatura de _ 20º C para congelamento.

após congelamento, a suspensão foi descongelada a temperatura ambiente e centrifugada

a 9.660g por 5 minutos para separação e estocagem do sobrenadante a - 20 ºC.

37

Para realização do PCR-multiplex, a extração do DNA bacteriano foi reunida em grupos

(pools) que continham 2 a 5 amostras de E. coli. Para PCR-monoplex o DNA foi extraído

individualmente por amostra.

2.2.2.2. Reação em Cadeia mediada pela Polimerase – Multiplex (PCR-multiplex)

As reações foram realizadas com volume final de 25 µL, utilizando os componentes e

suas respectivas concentrações de acordo com o Quadro 3. A descrição dos oligonucleotídeos

utilizados para amplificação dos genes de virulência está apresentada no Quadro 4. Os ciclos

de temperaturas estão apresentados no Quadro 5 e para realização das ciclagens foi utilizado o

aparelho termociclador Veriti Thermal Cycler (Applied Biosystems).

Quadro 3- Componentes e concentrações utilizados na PCR-multiplex

Componentes e concentrações Volume

Água purificada estéril 4,75

Tampão de reação 10X (Invitrogen) 2,5 µL

Cloreto de magnésio - MgCl2 50mM (Invitrogen) 1,0 µL

Desoxinucleotídeos - dNTP 10mM (Invitrogen) 1,25 µL

EAE 1/2 (10 pmol)

BFP 1/ 2 (2,5 pmol)

Stx f/r (2,5 pmol)

Iniciadores LT f/r (2,5 pmol)

ST f/r (10 pmol)

EI 1/2 (2,5 pmol)

aggR1/ 2 (2,5 pmol)

(1,5 µL/1,5 µL)

(1,0 µL/1,0 µL)

(1,0 µL/1,0 µL)

(0,5 µL/0,5 µL)

(1,0 µL/1,0 µL)

(0,5 µL/0,5 µL)

(1,0 µL/1,0 µL)

Platinum -Taq DNA Polymerase 5U/µL (Invitrogen) 0,5 µL

DNA da Escherichia coli 2,0 µL

Volume final da reação 25,0 µL

38

Quadro 4- Oligonucleotídeos e produtos de amplificação utilizados na PCR-multiplex.

Designação Sequência de oligonucleotídeos

(5’– 3’) Fator de virulência

(gene) Produto

Referência

LT-f LT-r

GGCGACAGATTATACCGTGC CGGTCTCTATATTCCCTGTT

Enterotoxina termolábil-LT (lt)

450 pb

Aranda et al. (2004)

BFP-1 BFP-2

AATGGTGCTTGCGCTTGCTGC GCCGCTTTATCCAACCTGGTA

Fímbria BFP (bfpA) 326 pb

EAE-1 EAE-2

CTGAACGGCGATTACGCGAA CGAGACGATACGATCCAG Intimina (eaeA) 917 pb

ST-f ST-r

ATTTTTMTTTCTGATTTRTCTT CACCCGGTACARGCAGGATT

Enterotoxina termoestável-ST (st)

190 pb

EI-1 EI-2

GTTCCTTGACCGCCTTTCCGATACCGTC GCCGGTCAGCCACCCTCTGAGAGTAC

Plasmídeo de invasão (ipaH)

600 pb

STX-f STX-r

GAGCGAAATAATTTATATGTG TGATGATGGCAATTCAGTAT

Toxina de Shiga 1 e 2 (Stx)

518 pb Toma et al.

(2003) AggR-1 AggR-2

GTATACAAAAGAAGGAAGC ACAGAATCGTCAGCATCAGC

Fimbria de aderência agregativa (aaf)

254 pb

Quadro 5- Programa de cliclagem utilizado na PCR-multiplex

Estágios Etapas Temperatura Tempo Nº de Ciclos Estágio 1 Desnaturação 95 °C 7 min. 1

Estágio 2

Hibridização 60 °C 1 min. 15 Extensão 72 °C 1 min e 20 seg.

Desnaturação 94 °C 1 min.

Estágio 3

Hibridização 55 °C 1 min.

25 Extensão 72 °C 1 min e 20 seg.


Estágio 4 Extensão 72 °C 30 min. 1

2.2.2.3. Reação em Cadeia mediada pela Polimerase - Simples (PCR-monoplex)

A PCR-monoplex foi realizada em três situações: 1ª) confirmação das E. coli

ambientais que apresentaram amplificação para um ou mais genes investigados na PCR-

multiplex, 2ª) confirmação das E. coli humanas já identificadas como E. coli diarreiogênicas e

3ª) diferenciação dos genes que codificam para as toxinas de Shiga 1 e 2 (Stx-1 e 2) em

STEC.

As reações de PCR-monoplex foram realizadas com volume final de 25 µL, utilizando

os componentes e suas respectivas concentrações de acordo com o Quadro 6. A descrição dos

oligonucleotídeos utilizados para amplificação dos genes está apresentada no Quadro 4 (1ª e

2ª situação) e Quadro 7 (3ª situação). Os ciclos de temperaturas estão apresentados no Quadro

8 e para realização das ciclagens foi utilizado o aparelho termociclador Veriti Thermal Cycler

(Applied Biosystems).

39

Quadro 6 - Componentes e concentrações utilizados na PCR-monoplex

Componentes Quantidade Água purificada estéril 17 L

Tampão de reação 10X (Invitrogen) 2,5 L

Cloreto de magnésio - MgCl2 50mM (Invitrogen) 0,75 L

Desoxinucleotídeos - dNTP 10mM (Invitrogen) 1,25 µL

Oligonucleotídeos - 2,5pmol/L (Invitrogen) 1,0 L/1,0 L

Platinum -Taq DNA Polymerase 5U/µL (Invitrogen) 0,5 L

DNA da Escherichia coli 1,0 L

Volume final da reação 25 L

Quadro 7 - Oligonucleotídeos e produtos de amplificação utilizados na PCR-monoplex

Designação Sequência de oligonucleotídeos

(5’– 3’) Fator de

virulência/gene Produto

Referência

STX- 1a STX- 1b

CAACACTGGATGATCTCAG CCCCCTCAACTGCTAATA

Toxina de Shiga -1 (stx1)

349 pb Pal et al. (1999) STX- 2a

STX- 2b ATCAGTCGTCACTCACTGGT CTGCTGTCACAGTGACAAA

Toxina de Shiga -2 (stx2)

110 pb

Quadro 8 - Programa de cliclagem utilizado na PCR-monoplex

Etapas Temperatura Tempo Nº de Ciclos

Desnaturação Inicial 95 °C 5 min. 1


40 Hibridização 50 – 55 °C 1 min.

Extensão 72 °C 1 min.

Extensão Final 72 °C 10 min. 1

2.2.2.4. Eletroforese

Os produtos da PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 2,0%

contendo 1,5 µL de Sybr Safe (Invitrogen) para visualização e determinação dos fragmentos

de DNA amplificados. Juntamente com as amostras, os controles positivos e o marcador de

peso molecular (Ready-load 100pb DNA Ladder, Invitrogen) foram aplicados aos géis para

comparação. A corrida eletroforética foi realizada sob voltagem máxima e constante de 100 V

em tampão TE (Tris-EDTA Buffer) por 1 hora. Após a corrida, os géis foram visualizados em

40

transiluminador (luz ultravioleta) para análise visual dos fragmentos de DNA amplificados e,

o registro fotográfico foi realizado pelo sistema de fotodocumentação UPV Biolmaging

Systems (EpiChemi Darkroom).

2.2.3 Teste de Suscetibilidade aos antimicrobianos

A suscetibilidade aos agentes antimicrobianos das E. coli diarreiogênicas foi avaliada

pelo método de difusão em sistema de disco, de acordo com Bauer et al. (1966), observando

as recomendações do Clinical and Laboratory Standards (CLSI, 2012).

2.2.3.1. Preparo do inóculo

Cada amostra de E. coli foi repicada para tubos contendo caldo Mueller-Hinton

(Oxoid) e incubadas à temperatura de 35 °C durante 24 horas. Após esse período, foram

novamente repicadas para outro tubo contendo caldo Mueller-Hinton (Oxoid) e incubadas à

temperatura de 35 °C por 6 horas para obtenção do inóculo equivalente a 0,5 da escala de Mc

Farland que corresponde a 1,5 x 108 UFC/mL. A concentração do inóculo foi observada por

meio de densitômetro (VITEK Densichek - bioMèrieux).

2.2.3.2. Semeadura nas placas

A partir da suspensão bacteriana equivalente a 0,5 da escala de Mc Farland e com

auxílio de um swab (J.Prolab), cada amostra foi semeada na superfície das placas contendo

4,0 mm de altura de ágar Mueller Hinton (Oxoid). O swab foi aplicado sobre toda a superfície

do meio de cultura por três vezes, girando a placa num ângulo de 60° após cada aplicação.

Para finalizar a semeadura, o swab foi aplicado ao redor das bordas da superfície do ágar e as

placas permaneceram por 10 minutos à temperatura ambiente com tampa fechada para

secagem do inóculo.

2.2.3.3. Aplicação dos discos de antimicrobianos

A aplicação dos discos de antimicrobianos foi realizada com auxílio do dispensador

automático Disc dispenser (Oxoid). Em seguida, as placas foram incubadas à temperatura de

35 °C por 16-18 horas. Foram utilizados os antimicrobianos (Oxoid) a seguir nas respectivas

concentrações: ampicilina 10µg (AMP), amoxicilina 20µg / ácido clavulânico 10µg (AMC),

cloranfenicol 30µg (C), ceftazidima 30µg (CAZ), ciprofloxacina 5µg (CIP), gentamicina

41

10µg (CN), cefotaxima 30µg (CTX), nitrofurantoína 300µg (F), ácido nalidíxico 30µg (NA),

sulfametoxazol 23,75µg / trimetoprim 1,25µg (SXT), tetraciclina 30µg (TE) e canamicina

30µg (K).

2.2.3.4. Leitura e interpretação do teste

O diâmetro das zonas de inibição foi medido com auxílio de um paquímetro

(Digimatic Caliper, Mitutoyo Corporation) e a interpretação do diâmetro dos halos foi

realizada conforme especificações apresentadas no Quadro 9 (CLSI, 2012). Foram

consideradas resistentes as amostras que apresentaram resistência a pelo menos um

antimicrobiano e amostras multirresistentes as que apresentaram resistência simultânea a

três ou mais antimicrobianos com diferentes mecanismos de ação (Magiorakos et al., 2012).

Quadro 9- Interpretação do diâmetro dos halos de inibição aos antimicrobianos utilizados

Agentes Antimicrobianos

Concentração /Disco

Diâmetro do halo de inibição (mm)* Resistentes Intermediários Sensíveis

Ácido nalidíxico (NA) 30µg 13 ou menos 14-18 19 ou mais Ampicilina (AMP) 10µg 13 ou menos 14-16 17 ou mais Amoxicilina – Acido Clavulânico (AMC)

20µg/10µg 13 ou menos 14-17 18 ou mais

Canamicina (K) 30µg 13 ou menos 14-17 18 ou mais Ceftazidima (CAZ) 30µg 14 ou menos 15-17 18 ou mais Cefotaxima (CTX) 30µg 14 ou menos 15-22 23 ou mais Ciprofloxacina (CIP) 5µg 15 ou menos 16-20 21 ou mais Cloranfenicol (C) 30µg 12 ou menos 13-17 18 ou mais Gentamicina (CN) 10µg 12 ou menos 13-14 15 ou mais Nitrofurantoína (F) 300µg 14 ou menos 15-16 17 ou mais Sulfametoxazol – trimetoprim (SXT)

23,75µg /1,25µg 10 ou menos 11-15 16 ou mais

Tetraciclina (TE) 30µg 14 ou menos 15-18 19 ou mais

* Milímetros

O controle de qualidade da potência dos discos de antimicrobianos foi realizado com

cepas padrões de Escherichia coli (ATCC 25.922) e Pseudomonas aeruginosa (ATCC:

27853).

2.2.4. Eletroforese em Gel de Campo Pulsante (PFGE)

A identificação dos perfis de macrorrestrição das amostras de E. coli diarreiogênicas foi

realizada por meio de extração e digestão do DNA genômico por enzima de restrição, seguido

de eletroforese em gel de campo pulsante (PFGE – Pulsed Field Gel Electrophoresis)

42

utilizando o sistema Contour-Clamped Homogeneuos Electric Field DRIII apparatus (CHEF-

DR III/ Bio-Rad). As etapas e os procedimentos realizados estão descritos abaixo e foram

realizados conforme as recomendações de Gautom (1997).

2.2.4.1. Preparo da suspensão bacteriana

As amostras foram semeadas em tubos contendo 5 mL de caldo TSB (Tryptic Soy

Broth, Merck) e incubadas à temperatura de 37 ºC por 18 horas. Após esse período, as

amostras foram semeadas em placas contendo meio TSA (Tryptic Soy Agar, Merck) e

incubadas nas mesmas condições anteriores para obtenção de colônias isoladas. A partir de

uma colônia, a amostra bacteriana foi semeada em placa contendo meio TSA (Tryptic Soy

Agar) para obtenção de crescimento confluente após incubação à temperatura de 37 °C por 18

horas.

A partir desse crescimento confluente e com o auxílio de swab foi preparada uma

suspensão bacteriana em 3 mL de solução tampão TE (Tris EDTA – Apêndice 1.3) até a

obtenção de turbidez igual a 1 da escala de Mc Farland que corresponde a 3,0 x 108 UFC/mL.

2.2.4.2. Montagem dos blocos de agarose

Uma alíquota de 300 µL da suspensão bacteriana de cada amostra foi transferida para

um microtubo de 1,5 mL e adicionado 15 µL de proteinase K (20mg/mL) para obtenção de

uma concentração final de 1mg/mL. Em seguida, foi preparada uma solução de agarose

(Seakem Gold Agarose, Lonza) a 1,2%, em tampão TE (Apêndice 1.3). O volume de 300 µL

desta agarose foi distribuído para os tubos contendo a suspensão bacteriana mais a proteinase

K. Antes da solidificação e com o auxílio de uma micropipeta, as amostras foram suavemente

homogeneizadas e distribuídas em moldes apropriados (Bio-Rad Laboratories) para a

confecção dos blocos (plugs) de agarose. Foram preparados três blocos por amostra.

2.2.4.3. Processo de lise in situ

Após solidificação à temperatura ambiente por 10 minutos, os blocos de agarose,

referentes a cada amostra, foram transferidos para distintos tubos cônicos de 50 mL contendo

10 mL de solução de lise celular (Apêndice 1.8) e incubados à temperatura de 54 °C por 2

horas para que ocorresse o processo de lise celular e liberação do DNA cromossômico in situ.

43

Após incubação, a solução de lise foi desprezada e os blocos de agarose foram lavados

a fim de eliminar todos os resíduos do processo de lise celular. Foram realizadas duas

lavagens com 10 mL de água milli-Q esterilizada (pré-aquecida à temperatura de 50 oC) na

qual os tubos permaneceram incubados por 15 minutos em banho maria à temperatura de

50°C, seguida de mais quatro lavagens com 10 mL de solução tampão TE (Apêndice 1.3)

repetindo-se as condições de tempo e incubação (15 minutos a 50 ºC). Após a última lavagem,

os blocos de agarose foram mantidos em solução tampão TE e armazenados à temperatura de

4 ° C, até o momento de uso.

2.2.4.4. Digestão do DNA com a enzima de Restrição Xba I

Para cada amostra foi selecionado um bloco de agarose do qual foi retirado um corte

de 2 mm com o auxílio de lâmina e de bisturi. Este corte foi transferido para microtubos de

1,5 mL contendo 200 µL de solução de pré-digestão (solução tampão da enzima de restrição

XbaI à 10% (Roche) e incubado à temperatura de 37 ºC por 10 minutos. Em seguida, a

solução de pré-digestão foi retirada e substuida por 200 µL da solução de digestão (Apêndice

1.11) contendo a enzima de restrição Xba I (Roche) na concentração de 50U por amostra e os

tubos foram novamente incubados à temperatura de 37 °C por 18 a 24 horas. A enzima de

restrição Xba I reconhece o DNA alvo na sequência T/CTAGA. A cepa padrão universal

Salmonella Braenderup H9812 foi utilizada como controle do processo de digestão das

amostras.

2.2.4.5. Montagem do gel de corrida e condições eletroforéticas

Após o período de digestão, o corte de 2 mm foi colocado nos orifícios de um gel de

agarose e em seguida esses orifícios foram selados com o próprio gel para que as frações não

se desprendessem. Este gel de agarose (For Pulsed Field Electrophoresis: Running Gel/

Sigma) foi preparado na concentração de 1% em TEB 0,5X (Apêndice 1.10) e montado sobre

o molde do próprio aparelho CHEF-DR III System (Bio-Rad). Nas posições externas e

centrais dos géis foi utilizado o marcado de peso molecular de 48,5 a 1018,5 KB (Lambda

Ladder PFGE marker/BIOLABS, Beverly, MA, USA).

A separação dos fragmentos de DNA do cromossoma bacteriano clivado pela enzima

de restrição foi realizada em sistema de eletroforese do tipo CHEF-DR III System (Bio-Rad)

utilizando tampão de corrida TE 0,5X (Apêndice 1.10) sob as seguintes condições

44

eletroforéticas: tempo de pulso inicial de 5 segundos e final de 30 segundos por 24 horas,

ângulo de 120º, gradiente de 6 V/cm correspondendo aproximadamente a 120-150V,

velocidade de recirculação do tampão de 70 e temperatura de 14 ºC.

2.2.4.6. Coloração e fotodocumentação do gel de agarose

Após a eletroforese, o gel foi corado por imersão em solução de brometo de etídio

(5mg/mL) por 30 minutos e em seguida lavado uma vez com água milli-Q destilada. Os perfis

de marrestrição foram visualizados sob iluminação ultravioleta e as imagens capturadas no

formato TIFF e digitalizadas pelo sistema de fotodocumentação GEL LOGIC 2200 Imaging

System (Molecular Imaging System, Carestream Health, Inc.).

2.2.4.7. Interpretação e análise dos perfis de macrorrestrição gerados pelo PFGE

Os perfis de macrorrestrição foram analisados com o auxílio do programa de

computação Software Bionumerics Versão 6.5 (Applical Maths, Inc., Austin, TX) que permitiu

a comparação entre diferentes perfis eletroforéticos (diferentes géis) que apresentaram em

comum uma mesma escala de referência (marcador de peso molecular). As bandas foram

selecionadas automaticamente pelo programa e em seguida, procedeu-se a inspeção visual

para correção. Os perfis considerados geneticamente idênticos foram aqueles que

apresentaram percentual de similaridade de 100%, e aqueles com uma ou mais bandas foram

considerados diferentes.

O grau de homologia entre as amostras foi determinado pelo coeficiente de Dice e a

correlação para agrupamento e construção do dendoograma foi calculada por UPGMA

(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean) com tolerância de 2,5%. O

algorítimo (cluster cut off algorithm) do Bionumerics Version 6.5 foi utilizado para a

definição dos agrupamentos significantes.

2.3. APRESENTAÇÃO E ANÁLISE DOS DADOS

As informações referentes à origem e data de isolamento das E. coli diarreiogênicas e

os resultados sobre fatores de virulência e fenótipos de resistência foram organizados em

banco de dados utilizando-se o programa Microsoft Office Access 2007 e apresentados por

meio de gráficos ou tabelas gerados pelo programa Microsoft Office Excel 2010.

45

Para análise estatística, foram realizados o teste binomial para duas proporções, o teste

exato de Fisher e o teste X2 de partição para comparação entre as variáveis, estes testes foram

executados por meio do programa BioEstat Versão 5.0 (Ayres et al., 2007) considerando o

nível de confiança de 95% (p ≤ 0,05).

2.4. ASPECTOS ÉTICOS

O presente estudo foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com

Seres Humanos (CEP) do Instituto Evandro Chagas com registro CEP/IEC Nº 0046/11

(CAAE: 0045.0.072.000-11) (Apêndice 2).

46

3. RESULTADOS

3.1 FREQUÊNCIA E DISTRIBUIÇÃO DAS E. coli DIARREIOGÊNICAS

Do total de 344 amostras de E. coli de origem ambiental, seis (1,74%) foram

classificadas como E. coli diarreiogênicas. Estas amostras foram identificadas apenas entre as

E. coli isoladas de água superficial de rio e, dentro desta amostragem, o percentual foi de

4,11% (6/146) (Tabela 1). Destas seis amostras, três foram provenientes do entorno da ilha

Murutucu e três da ilha Grande.

Tabela 1- Frequência das E. coli diarreiogênicas de origem ambiental de acordo com a origem

de isolamento.

Isolamento de origem ambiental

Escherichia coli avaliadas Escherichia coli diarreiogênica

Nº Nº % Agua superficial de rio 146 6 4,11 Agua de beber/consumo 92 0 0 Areia de Praia 106 0 0

Total 344 6 1,74 Todas as 66 E. coli de origem humana foram confirmadas como diarreiogênicas e

foram isoladas das fezes de 64 indivíduos. Em dois deles foram detectadas infecções mistas

por dois tipos diferentes de E. coli diarreiogênica (EPEC+EAEC e EPEC+EIEC).

Considerando o número de indivíduos participantes destes projetos, o percentual de

ocorrência de E. coli diarreiogênica de origem humana foi de 13,36% (64/479) (Tabela 2).

Tabela 2- Frequência de E. coli diarreiogênicas de origem humana de acordo com a origem de

isolamento.

Isolamento de origem humana

Indivíduos Participantes Indivíduos com Escherichia coli

diarreiogênica

Nº Nº %

Portadores do HIV 181 24 13,25

Indivíduos de Juruti-PA 298 42 14,09

Total 479 64 13,36

As diferenças entre estes percentuais (1,74% e 13,36%) ou (4,11% e 13,36%) foram

estatisticamente significantes (Teste binomial: p<0,0001 e p=0,0019, respectivamente),

47

demonstrando que houve diferença quanto à frequência de E. coli diarreiogênica entre as

origens ambiental e humana.

As 66 E. coli de origem humana e as seis de origem ambiental perfazem um total de

72 E. coli diarreiogênicas que estão distribuidas em cinco categorias, sendo a E. coli

enterotoxigênica-ETEC a mais frequente (29,17%-21/72), seguida pelas E. coli

enteropatogênica-EPEC e E. coli agregativa-EAEC (ambas com 26,39%-19/72), E. coli

enteroinvasora-EIEC (15,28%-11/72) e E. coli produtora de toxina de Shiga-STEC (2,78%-

2/72) (Figura 5).

Figura 5- Distribuição e frequência das E. coli diarreiogênicas de acordo com a categoria patogênica. ETEC: E. coli enterotoxigênica; EPEC: E. coli enteropatogênica; EAEC: E. coli enteroagregativa; EIEC: E. coli enteroinvasora; STEC: E. coli produtora de toxina de Shiga.

De acordo com as origens de isolamento, as ETEC (3,96%-19/479), EAEC (3,76%-

18/479) e as EPEC atípicas (3,34%-16/479) foram as mais frequentes entre as amostras

humanas, seguidas pela EIEC (2,29%-11/479) e STEC (0,41%-2/479). Entre as amostras

ambientais foram detectadas ETEC e EPEC atípica na frequência de 0,58% (2/344) (ambas) e

EPEC típica e EAEC, ambas com frequência de 0,29% (1/344) (Tabela 3).

48

Tabela 3- Distribuição e frequência das E. coli diarreiogênicas de acordo com a origem de

isolamento.

E. coli diarreiogênicas e Fatores de Virulência

Origem de Isolamento Total p-valorc Humana (479)a

Nº (%) Ambiental (344)b

Nº (%)

ETECd 19 (3,96) 2 (0,58) 21 0,9930

LT (Enterotoxina termolábel) 7 1 8 1,000

ST (Enterotoxina termoestável) 8 1 9 1,000

ST e LT 4 0 4 1,000

EPECe atípica 16 (3,34) 2 (0,58) 18 0,6326

EPECe típica 0 ( - ) 1 (0,29) 1 0,0833

EAECf 18 (3,76) 1 (0,29) 19 0,6795

EIECg 11 (2,29) 0 ( - ) 11 0,5812

STECh 2 (0,41) 0 ( - ) 2 1,000

Stx-1 1 0 1

Stx-1, Stx-2 e Intimina/EAE 1 0 1

Somatória das linhas em negrito 66 6 72

a Número total de indivíduos; b Número de amostras avaliadas; c Teste exato de Fisher.

dETEC: E. coli enterotoxigênica; eEPEC: E. coli enteropatogênica; fEAEC: E. coli enteroagregativa; gEIEC: E. coli enteroinvasora; hSTEC: E. coli produtora de toxina de Shiga.

Das 19 ETEC identificadas de origem humana, sete (36,84%) foram positivas para

enterotoxina termolábil (LT), oito (42,10%) para enterotoxina termoestável (ST) e quatro

(21,06%) para as duas enterotoxinas (ST e LT). Destas duas ETEC de origem ambiental, uma

foi ETEC-LT e outra ETEC-ST. Entre as 19 EPEC, 18 (94,7%) foram classificadas como

EPEC atípicas produtoras da proteína de adesão íntima (intimina/EAE- E. coli attachment-

effacement) e apenas uma foi classificada como típica (1,36%) de origem ambiental, que

apresentou além da proteína intimina, a fímbria BFP (Bundle Forming Pilus). Das 18 EPEC

atípicas, 16 foram de origem humana e duas de origem ambiental. As EIEC (2,29%) e as

STEC (0,41%) foram identificadas apenas entre as amostras de origem humana. Entre as duas

STEC, uma foi positiva apenas para toxina de Shiga tipo 1 (Stx-1) e a outra positiva para Stx-

1 e 2 além de apresentar a proteína intimina/EAE (Tabela 3).

A diferença de ocorrência de cada categoria de E. coli diarreiogênica considerando as

origens de isolamento (humana e ambiental) não foi estatisticamente significativa (p> 0,05).

A relação das 72 E. coli diarreiogênicas e a distribuição dos genes que codificam os

fatores de virulência que permitiram a classificação das mesmas em categorias patogênicas ou

patotipos estão demonstradas no Apêndice 3 e as amplificações referentes aos alvos

49

moleculares que permitiram a identificação das categorias de E. coli diarreiogênicas podem

ser observados abaixo na Figura 6.

Figura 6- Amplificação dos alvos moleculares gerados pelo PCR-multiplex. Linha 1: Ladder

1 Kb, linha 2: Mix de DNA das cepas padrões de E. coli diarreiogênica, linha 3 a 9:

Controles positivos para observação da amplificação individual dos alvos moleculares.

1 2 3 4 5 6 7 8 9

eae (917pb)

ipaH (600pb) stx (518pb)

lt (450pb)

bfp (326pb)

aggR (254pb)

st (190pb)

50

3.2 PELFIL DE SUSCETIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS E FENÓTIPOS DE

RESISTÊNCIA EM E. coli DIARREIOGÊNICAS.

A resistência antimicrobiana entre as E. coli diarreiogênicas foi de 51,39% (37/72)

(Figura 7) sendo de 53,03% (35/66) entre as de origem humana e de 33,33% (2/6) entre as de

origem ambiental (Tabela 4). A diferença de resistência entre E. coli diarreiogênicas de

origem humana e ambiental não foi significativa (p=0,4230).

Figura 7- Frequência de resistência aos antimicrobianos entre as E. coli diarreiogênicas. Tabela 4- Frequência da resistência antimicrobiana de E. coli diarreiogênica de acordo com as

origens de isolamento.

Origem de isolamento E. coli diarreiogênicas E. coli diarreiogênica resistentes

Nº Nº %

Humana 66 35 53,03

Ambiental 6 2 33,33

Total 72 37 51,39

Teste exato de Fisher: (Humana x Ambiental) p=0,4230

51

A resistência entre as E. coli diarreiogênicas foi mais frequente aos antimicrobianos

sulfametoxazol-trimetoprim (44,44% - 32/72), ampicilina (40,28% - 29/72) e tetraciclina

(33,33% - 24/72) e, considerada estatisticamente significativa (X2 de partição= 98,2252;

p>0,0001) quando comparada à resistência ao cloranfenicol (11,12% - 8/72), a amoxicilina-

ácido clavulânico (5,56% - 4/72), a canamicina (2,77% - 2/72) e a gentamicina (1,39% - 1/72)

(Tabela 5). Ao se comparar os percentuais de resistência aos três principais antimicrobianos

sulfametoxazol-trimetoprim, ampicilina e tetraciclina, observou-se que não houve diferença

estatística de resistência entre os mesmos (X2 de partição= 2,4597; p=0,1168).

Todas as E. coli diarreiogênicas foram sensíveis aos antimicrobianos ácido nalidíxico,

ceftazidima, cefotaxima e ciprofloxacina (Tabela 5).

Tabela 5- Perfil de suscetibilidade entre as E. coli diarreiogênicas de acordo com os

antimicrobianos utilizados.

Antimicrobiano Perfil de Suscetibilidade (72)*

Sensível % Intermediário % Resistente % Acido Nalidixico 72 100,00 0 - 0 - Ampicilina 41 56,94 2 2,78 29 40,28 Amoxicilina-ácido clavulânico 64 88,88 4 5,56 4 5,56 Canamicina 48 66,67 22 30,56 2 2,77 Ceftazidima 72 100,00 0 - 0 - Cefotaxima 72 100,00 0 - 0 - Ciprofloxacina 72 100,00 0 - 0 - Cloranfenicol 64 88,88 0 - 8 11,12 Gentamicina 68 94,44 3 4.17 1 1,39 Nitrofurantoina 69 95,83 3 4,17 0 0,00 Sulfametoxazol trimetoprim 39 54,17 1 1,39 32 44,44 Tetraciclina 43 59,72 5 6,95 24 33,33

* Número de amostras avaliadas.

52

Entre as E. coli diarreiogênicas de origem humana, destacam-se os percentuais de

resistência aos antimicrobianos sulfametoxazol-trimetoprim (46,97% - 31/66), ampicilina

(40,91% - 27/66), tetraciclina (34,85% - 23/66) e cloranfenicol (10,61% - 7/66). As E. coli

diarreiogênicas de origem ambiental foram resistentes à ampicilina e amoxicilina-ácido

clavulânico, ambos (40,00%-2/6) e, aos antimicrobianos cloranfenicol, sulfametoxazol-

trimetoprim e tetraciclina (20% -1/6) (Figura 8). A diferença percentual de resistência à

amoxicilina-ácido clavulânico foi a única significativa entre os dois grupos, sendo as E. coli

diarreiogênicas de origem ambiental, as mais resistentes a este antimicrobiano do que as de

origem humana (Teste exato de Fisher: p=0,0228).

Figura 8- Resistência antimicrobiana das E. coli diarreiogênicas de acordo com a origem de isolamento. AMP: Ampicilina; AMC: Amoxicilina-Acido Clavulânico; K: Canamicina; C: Cloranfenicol; CN: Gentamicina; SXT: Sulfametoxazol – trimetoprim; TE: Tetraciclina.

53

Avaliando-se a resistência antimicrobiana por categoria de E. coli diarreiogênica,

verificou-se que a EPEC (X2 de partição=6.5469; p=0,0108) e a EAEC (X2 de

partição=6.5769; p=0,0103) apresentaram resistência significativa aos antimicrobianos

ampicilina, sulfametozaxol-trimetoprim (ambos 63,16% - 12/16) e tetraciclina (36,84% - 7/19

e 47,37% - 9/19, respectivamente). As ETEC (X2 de partição=6.5469; p=0,0105) foram

significativamente resistentes à ampicilina (33,33%-7/21) e ao sulfametozaxol-trimetoprim

(28,57%-6/21), enquanto as EIEC (X2 de partição=5.3036; p=0,0213) apresentaram

resistência significativa aos antimicrobianos sulfametozaxol-trimetoprim (45,45% - 5/11) e

tetraciclina (54,55% - 6/11). Entre as duas STEC foi observada resistência ao sulfametozaxol-

trimetoprim (50,00% - 1/2) e à tetraciclina (50,00% - 1/2) (Tabela 6). Analisando-se a

resistência entre os principais antimicrobianos de cada categoria, observou-se que não houve

diferença estatística da resistência entre os mesmos (Tabela 6).

Tabela 6- Resistência antimicrobiana das E. coli diarreiogênicas de acordo com as categorias patogênicas.

E. coli diarreiogênicas

Antimicrobiano ETEC (21)* EPEC (19)* EAEC (19)* EIEC (11)* STEC (2)*

Nº % Nº % Nº % Nº % Nº %

Ampicilina 7 33,33 9 47,37 12 63,16 1 9,09 0 -

Amoxicilina /Ac. Clavulânico 1 4,76 2 10,53 1 5,26 0 - 0 -

Canamicina 0 - 0 - 2 10,53 0 - 0 -

Cloranfenicol 0 - 3 15,79 5 26,32 0 - 0 -

Gentamicina 0 - 0 - 1 5,26 0 - 0 -

Sulfametoxazol trimetoprim 6 28,57 8 42,11 12 63,16 5 45,45 1 50,00

Tetraciclina 1 4,76 7 36,84 9 47,37 6 54,55 1 50,00

* Número de amostras avaliadas

54

Foram identificados 13 diferentes fenótipos de resistência antimicrobiana variando de

um a cinco antimicrobianos e distribuídos entre 37 E. coli diarreiogênicas.

Os mais frequentes fenótipos de resistência entre as E. coli diarreiogênicas de origem

humana foram AMP-SXT-TE (25,71% - 9/35), AMP-SXT (22,86% - 8/35) e SXT-TE

(17,14% - 6/35). Dois fenótipos de resistência foram identificados entre as amostras

ambientais, sendo um deles, representado por cinco antimicrobianos (AMP-AMC-C-SXT-TE)

e o outro por dois (AMP-AMC). O fenótipo ambiental AMP-AMC-C-SXT-TE também

ocorreu entre as E. coli diarreiogênicas de origem humana na frequência de 5,71% (2/35), no

entanto, o fenótipo AMP-AMC foi exclusivo de amostra ambiental (Tabela 7). Das 37 E. coli

diarreiogênicas que apresentaram resistência, 17 (45,94%) foram multirresistentes.

Tabela 7- Fenótipos de resistência antimicrobiana das E. coli diarreiogênicas de acordo com a

origem de isolamento.

Origem de isolamento Total de Fenótipos

Fenótipos de Resistência Humana Ambiental

Nº % Nº % Nº %

AMP-K-C-CN-SXT 1 2,86 0 - 1 2,70

AMP-K-C-SXT-TE 1 2,86 0 - 1 2,70

AMP-AMC-C-SXT-TE 2 5,71 1 50,00 3 8,11

AMP-C-SXT-TE 2 5,71 0 - 2 5,41

AMP-C-SXT 1 2,86 0 - 1 2,70

AMP-SXT-TE 9 25,71 0 - 9 24,32

AMP-SXT 8 22,86 0 - 8 21,62

AMP-AMC 0 - 1 50,00 1 2,70

AMP-TE 2 5,71 0 - 2 5,41

SXT-TE 6 17,14 0 - 6 16,22

SXT 1 2,86 0 - 1 2,70

TE 1 2,86 0 - 1 2,70

AMP 1 2,86 0 - 1 2,70

Total de fenótipos 35 100,00 2 100,00 37 100,00

55

A E. coli diarreiogênica que apresentou maior frequência e diversidade de fenótipos

de resistência foi a EAEC (73,68% - 14/19). Em seguida, destacou-se as frequências de EIEC

(54,54% - 6/11) e EPEC (42,10% - 8/19), porém estas diferenças não foram significativas (X2

de partição=3.9075; p=0,1417). Entre as EAEC e as EPEC o fenótipo mais comum foi AMP-

SXT-TE, com percentuais de 28,60% (4/14) e 37,50% (3/8), respectivamente. Entre as ETEC,

o mais frequente foi AMP-SXT (83,33% - 5/6) e entre as EIEC o SXT-TE (66,66% - 4/6). Os

fenótipos constituídos por cinco ou quatro antimicrobianos foram identificados somente entre

amostras de EAEC e EPEC, sendo o AMP-AMC-C-SXT-TE e o AMP-C-SXT-TE presentes

nestas duas categorias enquanto os fenótipos AMP-K-C-CN-SXT e AMP-K-C-SXT-TE,

envolvendo a canamicina, ocorreram somente entre as EAEC (Tabela 8).

Tabela 8- Fenótipos de resistência antimicrobiana das E. coli diarreiogênicas de acordo com

as categorias patogênicas.

Origem de Isolamento

E. coli diarreiogênica Fenótipos de Resistência Frequência

Nº %

ETEC (6/21)* (28,57%)** AMP-SXT-TE 1 16,64

AMP-SXT 5 83,33

EPEC (8/19)* (42,10%)** AMP-AMC-C-SXT-TE 1 12,50

AMP-C-SXT-TE 1 12,50

AMP-SXT-TE 3 37,50

AMP-SXT 2 25,00

AMP-TE 1 12,50

EAEC (14/19)* (73,68)** AMP-K-C-CN-SXT 1 7,14

Humana AMP-K-C-SXT-TE 1 7,14

AMP-AMC-C-SXT-TE 1 7,14

AMP-C-SXT-TE 1 7,14

AMP-C-SXT 1 7,14

AMP-SXT-TE 4 28,60

AMP-SXT 1 7,14

AMP-TE 1 7,14

SXT-TE 1 7,14

SXT 1 7,14

AMP 1 7,14

EIEC (6/11)* (54,54%)** AMP-SXT-TE 1 16,67

SXT-TE 4 66,66

TE 1 16,67

STEC (1/2)* (50,00%)** SXT-TE 1 100,00

Ambiental ETEC (1/2)* (50,00%)** AMP-AMC 1 100,00

EPEC atípica (1/2)* (50,00)** AMP-AMC-C-SXT-TE 1 100,00

* Número de amostras resistentes por número de amostras avaliadas.

** Percentual de amostras resistentes.

56

3.3. VARIABILIDADE GENÉTICA DAS E. coli DIARREIOGÊNICAS

Na análise do perfil de macrorrestrição cromossômica pela enzima Xba I foram tipadas

70 das 72 E. coli diarreiogênicas identificadas. As duas amostras não tipadas apresentaram

degradação do DNA genômico, mesmo após inúmeras tentativas de extração. Estas amostras

foram identificadas como ETEC-ST, uma de origem ambiental e outra humana. Entre as 70 E.

coli diarreiogênicas foram identificados 67 distintos perfis de macrorrestrição com número

mínimo de 13 e máximo de 23 fragmentos variando na faixa de 48,5 a 485,0 kb. A

demonstração da variação dos tamanhos dos fragmentos de macrorrestrição e da corrida

eletroforética está apresentada abaixo na Figura 9.

97,0

Figura 9- Perfis de macrorrestrição de E. coli diarreiogênicas gerados pela enzima Xba I por meio do método de PFGE. Linhas 1, 7 e 13: Marcador de peso molecular (48,5 a 1018,5 kb); linhas 2-6 e 8-10: E. coli diarreiogênicas com perfil de macrorrestrição; linha 11: ETEC 615 (ambiental) com degradação do DNA genômico; linha 12: Salmonella Braenderup.

Uma ampla variabilidade genética foi detectada na análise global das amostras deste

estudo, estando as categorias de E. coli diarreiogênicas dispostas em diferentes topologias do

dendograma (Figura 10).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

485,0 kb 436,5 kb 388,0 kb

339,5 kb

291,0 kb

242,5 kb

194,0 kb

145,5 kb

97,0 kb

48,5 kb

57

Foi possível identificar dois grupos que concentraram a maioria das amostras. O grupo

G1 com 71,2% de similaridade contendo 10 amostras e o grupo G2 com 69,2% de

similaridade e reunindo o maior número de amostras (41). Outros nove agrupamentos

menores (G3 a G11) contendo até quatro amostras foram formados. Tanto os agrupamentos

maiores (G1 e G2) quanto os menores com duas a quatro amostras (G3, G6 a G10) ocorreram

independentes da categoria de E. coli diarreiogênica, da origem e da data de isolamento.

Observou-se nos grupos G1 e G2 que as amostras que agruparam em torno de 93 a

97% de similaridade pertenciam a mesma categoria de E. coli diarreiogênica. No grupo G1, as

amostras 537HIV (posição 11), 792MC1PJ (posição 12), 849HIV (13) e 1364HIV (14), com

93,3% de similaridade, foram identificadas como E. coli enteroinvasora (EIEC). No grupo

G2, as amostras 2077MC1PJ (19), 762MU (20) e 701HIV (21) com similaridade de 93,7 a

97,4% foram identificadas como E. coli enteropatogênica atípica (EPEC-a). Estas EPEC

foram identificadas de diferentes origens de isolamento, as amostras 2077MC1PJ (19) e

701HIV (20) são de origem humana, enquanto a amostra 762MU (20) é de origem ambiental.

As amostras, 106PJ (30) e 1078MC1PJ (31), com 94,4% de similaridade pertencem à

categoria EPEC-a, enquanto as amostras 2094MC2PJ (41) e 7562MC1PJ (42) pertencem à

categoria EAEC (E. coli enteroagregativa).

Por meio do PFGE foram identificadas três ocorrências com amostras apresentando

perfis idênticos (100% de similaridade), duas delas no grupo maior G2 e uma no grupo menor

G10. As amostras 1085MC2PJ (25) e 7242MC3PJ (26) pertencem à categoria EAEC e foram

isoladas em 02/2008 e 07/2009, respectivamente; enquanto, a amostra 887MC1PJ (50),

isolada em 02/2008, e a amostra 7551MC1PJ (51), isolada em 07/2009, pertencem à categoria

ETEC. As amostras 2164MC1PJ (67) e 7556MC3PJ (68) pertencem à categoria EAEC e

foram isoladas em 06/2008 e 07/2009, respectivamente.

Das cinco amostras ambientais tipadas, duas categorias diferentes: 770IG (2) - EPEC e

784IG (3) - EAEC, com mesmo período de isolamento (04/2004), foram agrupadas com

74,7% de similaridade no grupo G3, juntamente, com uma amostra de EPEC de origem

humana. As outras três amostras, 762MU (20) - EPEC, 743MU (34) -ETEC/ST e 813(1)IG

(53) - EPEC típica, ficaram dispersas no maior agrupamento identificado (G2).

Um reduzido grau de similaridade também foi observado quando realizada a análise

segundo as categorias diarreiogênicas. Em análise isolada, o grupo de amostras classificadas

como EPEC exibiu o menor percentual de similaridade (49,1%) (Figura 11), seguido por

EAEC (60,4%) (Figura 12) e ETEC (64,24) (Figura 13). Diferentemente destas, a categoria

58

EIEC apresentou amostras com maiores similaridades (68,2%), sustentadas por dois

agrupamentos com 71 e 74% de similaridade (Figura 14).

Na análise de agrupamento por categoria de E. coli diarreiogênica, observou-se, que

entre as categorias com apenas uma E. coli diarreiogênica de origem ambiental, as amostras

(14) 784IG - EAEC (Figura 12) e (15) 743MU - ETEC (Figura 13), continuaram dispersas no

dendograma. Especificamente, entre as EPEC (Figura 11), que apresentaram três amostras de

origem ambiental, essas amostras, também permaneceram dispersas em diferentes topologias

do dendograma, no entanto, evidenciou-se uma próxima relação genética, com 97% de

similaridade, entre uma amostra de origem humana [2077MC1 (1)] e outra de origem

ambiental [762MU (2)], não relacionadas geograficamente.

59

Figura 10- Dendograma da relação genética entre as E. coli diarreiogênicas baseado nos perfis de

macrorrestrição gerados pela enzima XbaI e definidos pelo PFGE. O agrupamento por similaridade foi

determinado pelo coeficiente de Dice e método UPGMA. (Bionumerics Versão 6.5/ Applied Maths).

60

Figura 11- Dendograma da relação genética entre as amostras de E. coli enteropatogênica

(EPEC) baseado nos perfis de macrorrestrição gerados pela enzima XbaI e definidos pelo

PFGE. O agrupamento por similaridade foi determinado pelo coeficiente de Dice e método

UPGMA. (Bionumerics Versão 6.5 / Applied Maths).

61

Figura 12- Dendograma da relação genética entre as amostras de E. coli enteroagregativa

(EAEC) baseado nos perfis de macrorrestrição gerados pela enzima XbaI e definidos pelo



62

Figura 13- Dendograma da relação genética entre as amostras de E. coli enterotoxigênica

(ETEC) baseado nos perfis de macrorrestrição gerados pela enzima XbaI e definidos pelo



63

Figura 14- Dendograma da relação genética entre as amostras de E. coli enteroinvasora

(EIEC) baseado nos perfis de macrorrestrição gerados pela enzima XbaI e definidos pelo


UPGMA. (Bionumerics Versão 6.5/ Applied Maths).

64

4. DISCUSSÃO

4. 1. DISTRIBUIÇÃO DAS E. coli DIARREIOGÊNICAS

As E. coli são consideradas micro-organismos versáteis variando de uma simples

integrante da microbiota normal até patotipos especializados em infecções intestinais e

extraintestinais. Sua especialização é ainda mais evidente quando se observa a diversidade de

categorias de E. coli diarreiogênicas e sua ampla distribuição entre humanos, animais e

ambientes naturais (Sousa, 2006).

Geralmente, os estudos que demonstram a distribuição das E. coli diarreiogênicas em

diferentes fontes de isolamento ocorrem de forma particularizada: somente em humanos com

interesse de esclarecer a causa da infecção intestinal (Moreno et al., 2010); somente em

animais para esclarecimento da causa diarreica ou elucidação de possíveis reservatórios

(Morato et al., 2009); em humanos e animais em busca de relações genéticas entre os isolados

(Ishii et al., 2007; Moura, 2009) e somente em amostras ambientais com o objetivo de

investigar a frequência e distribuição das E. coli diarreiogênicas em ambientes aquáticos

(Sidhu et al., 2013).

Neste estudo, a oportunidade de se investigar as E. coli diarreiogênicas de duas

diferentes origens (ambiental e humana) permitiu demonstrar sua circulação no estado do Pará

e confirmar sua ocorrência tanto em amostras humanas (13,36%) como em ambientais

(1,74%). Entre as ambientais, destacou-se a ocorrência das E. coli diarreiogênicas,

especificamente, em água superficial de rio (4,11%). Essa diferença percentual significativa

entre as duas origens (humana e ambiental) era esperada, pois as E. coli comensais ou

patogênicas não estão naturalmente distribuídas em ecossistemas aquáticos naturais como rios

ou lagoas. Elas são encontradas no ambiente intestinal de humanos e animais e sua presença

nestes ambientes aquáticos naturais ou não é atribuída à contaminação de origem fecal

humana ou animal (Albertini et al., 2009; Mohamed et al., 2012).

Em relação às categorias de E. coli diarreiogênicas pesquisadas neste estudo, os

resultados evidenciaram que todas as cinco categorias de E. coli diarreiogênicas estiveram em

circulação no estado do Pará. Das 72 amostras identificadas, as mais frequentes foram a

ETEC (29,17%) e as EAEC e EPEC na frequência de 26,39%. As EIEC (15,28%) e STEC

(2,78%) ocorreram em frequências menores e foram identificadas apenas em amostras de

origem humana, enquanto a única EPEC típica identificada foi de origem ambiental. Apesar

65

da ocorrência de EIEC e STEC somente em humanos e EPEC típica no ambiente aquático, o

estudo evidenciou que não houve diferença significativa quanto à ocorrência destas categorias

entre as origens humana e ambiental.

4.1.1. E. coli diarreiogênicas de origem humana

A existência de cinco categorias de E. coli potencialmente associadas à diarreia faz

com que esta bactéria seja a mais pesquisada e a mais frequentemente identificada como

causa de processos diarreicos na população infantil, principalmente, nos países em

desenvolvimento, onde as condições sanitárias são insatisfatórias. Nestes países, todas as

categorias de E. coli diarreiogênicas (EPEC típica, EPEC atípica, EAEC, STEC, ETEC e

EIEC) aparecem associadas à diarreia, variando apenas na frequência com que as mesmas

ocorrem. Esta variação depende, geralmente, da área geográfica e da população estudada

(Orlandi et al., 2006; Paniagua et al., 2007; Ochoa et al., 2011).

Em países desenvolvidos a maior ocorrência de E. coli diarreiogênica está relacionada

aos surtos de origem alimentar ocasionados pelo consumo de carne bovina, leite e derivados

contaminados por duas principais categorias: STEC e EAEC (Morabito et al., 1998, Scavia et

al., 2008; Mora et al., 2011; Werber et al., 2012). Nestes países, os casos isolados de diarreia,

geralmente estão associados às categorias EPEC atípica, STEC e EAEC, que são categorias

também isoladas em animais e que apresentam potencial zoonótico (Hernandes et al., 2009;

Santona et al., 2013).

Em alguns estudos realizados na Venezuela, Argentina e México, a frequência de E.

coli diarreiogênicas associadas à diarreia em crianças foi de 18,93% a 36,6 % com variação de

prevalência entre as categorias patogênicas investigadas.

Na Venezuela, Hannaoui et al. (2010) identificaram 32 casos (18,93%) de E. coli

diarreiogênica entre 169 crianças menores de 5 anos sendo isoladas 16 EPEC atípica (9,47%),

2 EPEC típica (1,18%), 10 ETEC-ST (5,91%), 3 EAEC (1,78%) e 1 EIEC (0,59%). As

amostras foram negativas para os genes Stx que codificam para as toxinas de Shiga

específicas de STEC.

Na Argentina, das 112 E. coli isoladas de crianças, as E. coli diarreiogênicas foram

detectadas em 36,6% (41) das amostras, com frequência similar entre as cinco categorias

identificadas, sendo: STEC, EPEC e EIEC (6,35% cada) e, EAEC e ETEC (ambas com 8,9%)

(Medina et al., 2010).

66

No México, das 300 E. coli isoladas de crianças, 32,3% (97) foram positivas para E.

coli diarreiogênica entre as crianças com diarreia, enquanto este percentual foi de apenas 5%

(4/80) entre as crianças sem diarreia. Entre as amostras diarreicas, as frequências foram de

13,3% para ETEC (40), 9,3% para EPEC (28), 8,6% para STEC (26) e 1% para EIEC (1)

(Paniagua et al. 2007).

No presente estudo, a frequência geral de 13,36% de E. coli diarreiogênicas de origem

humana foi inferior às observadas nos países citados acima e em algumas cidades brasileiras.

Em Porto Velho, a ocorrência de E. coli diarreiogênica entre crianças com e sem diarreia

(controles) foi de 14,25% (Orlandi et al., 2006), em Salvador de 17,31% (Bueris et al., 2007),

no Rio de Janeiro de 27,6% (Regua-Mangia et al., 2004) e no Espirito Santo de 32,23%

(Spano et al., 2008). Esta frequência pode ser realmente menor, ou pode ter ocorrido em

função da população deste estudo ter envolvido tanto crianças como indivíduos adultos com

ou sem diarreia, enquanto a frequência de E. coli diarreiogênica nestes outros estudos foi

apenas em relação à população infantil.

No nordeste brasileiro, Moreno et al. (2010), em João Pessoa, identificaram entre

2.344 E. coli isoladas de 290 crianças com diarreia e 290 saudáveis, a frequência de 25% para

EAEC, 9,3% e 1,7% para EPEC atípica e típica, respectivamente, 10% para ETEC e 1,4%

para EIEC. Não foram identificadas amostras de STEC e a comparação dos percentuais entre

casos diarreicos e controles indicaram associação de EAEC e EPEC atípica à diarreia aguda

infantil. Em Salvador, Franzolin et al. (2005) investigando E. coli isoladas de 119 crianças

com diarreia, observaram que 25,2% (30) foram positivas para E. coli diarreiogênicas sendo a

EPEC atípica (10,1%), ETEC (7,5%) e EAEC (4,2%) as categorias mais frequentes.

Percentuais menores foram registrados para STEC (1,6%), EIEC e EPEC típica, ambas com

0,8%.

No Espírito Santo, Spano et al. (2008) analisando 218 amostras de crianças com

diarreia e 86 controles, também identificaram as EPEC atípica e EAEC (5,5% e 4,6%,

respectivamente) em casos diarreicos e 6,9% (ambas) no grupo controle como as mais

frequentes e, observaram que a ETEC esteve associada aos casos diarreicos (3,2%) quando

comparada aos controles (1,2%). As EPEC típicas (0,9%) e EIEC (0,4%) foram identificadas

apenas em crianças com diarreia.

Um estudo prospectivo desenvolvido na cidade de São Paulo e Ribeirão Preto,

envolvendo crianças menores de 5 anos com diarreia, hospitalizadas (H) e atendidas em

ambulatórios (A), demonstrou que as de E. coli diarreiogênica foram mais frequentes entre as

67

crianças do atendimento ambulatorial (36,6% - 120/328) do que as crianças internadas (27,6%

- 123/446). Com exceção das categorias STEC (1,7%) e EPEC típica (0,4%) identificadas

apenas em crianças hospitalizadas, as demais categorias apresentaram frequências

semelhantes: EAEC (11%-H; 7,4%-A), ETEC (1,5-H; 0,9%-A) e EIEC (0,6%-H; 0,4%-A)

(Araújo et al., 2007).

Como observado nestes estudos brasileiros, as categorias patogênicas EAEC, EPEC

atípica e ETEC são as mais comuns detectadas em amostras de origem humana, sendo, em

algumas situações, associadas aos casos diarreicos, enquanto que as EPEC típica e STEC

acontecem de maneira menos frequente (Franzolin et al., 2005; Spano et al, 2008; Moreno et

al. 2010). Esse perfil é semelhante ao detectado no presente estudo, que destacou estas três

categorias como as mais frequentes E. coli diarreiogênicas entre as amostras humanas isoladas

no estado do Pará, no entanto, uma diferença importante foi observada: as EIEC foram mais

frequentes neste estudo do que nos estudos realizados em outras regiões brasileiras, que não

identificaram EIEC entre as amostras ou as identificaram em frequência inferior a observada

neste estudo.

A frequência de EIEC em amostras humanas foi destacada em outro estudo

desenvolvido na região norte. Na cidade de Porto Velho - Rondônia, Orlandi et al. (2006)

identificaram as E. coli diarreiogênicas como o principal grupo bacteriano associado à diarreia

em crianças menores de 6 anos de idade. Entre os grupos pesquisados, os autores detectaram a

frequência de 18,27% (86/470) de E. coli diarreiogênicas no grupo diarreico (D) e 9,58%

(39/407) no grupo controle (C). As EAEC (5,53%-D; 4,17%-C), ETEC (4,46%-D; 3,43%-C)

e EPEC típica (2,13%-D; 1,47%-C) foram as mais frequentes e ocorreram de forma

semelhante entre os dois grupos. As EPEC atípicas (4,04%-D; 0,49%-C) e EIEC (1,48%-D;

0%-C) estiveram associadas à diarreia. As EIEC e STEC (0,63%-D; 0%-C) foram

identificadas apenas no grupo diarreico.

Em vários países, incluindo o Brasil, essa baixa prevalência de EIEC se mantém

constante, mesmo com o passar dos tempos, e pode ser observada em estudos anteriores como

o desenvolvido por Medeiros et al. (2001) em que das 1.836 amostras de crianças abaixo de

10 anos com diarreia, avaliadas durante os anos de 1994 a 1997 na cidade de Ribeirão Preto -

São Paulo, as EIEC foram identificadas apenas em dois casos, um em 1994 e o outro em

1997. Em revisão realizada por Sabrá (2002) sobre a etiologia da diarreia em países como

México, Costa Rica, Bangladesh e Brasil, durante os anos de 1977 a 1983, a ocorrência de

EIEC variou de 0,6 a 2,0.

68

Considerando que as EIEC são patógenos exclusivos de humanos e o primer utilizado,

neste estudo, para detecção de ETEC abrange as variantes ST1a e ST1b da enterotoxina

termoestável (ST), encontrada principalmente em humanos, a contaminação destes indivíduos

pode ter ocorrido pela transmissão fecal-oral direta (homem-homem) ou indireta devido ao

consumo de água ou alimentos contaminados, sendo este tipo de contaminação diretamente

influenciado pelas condições higiênicas e/ou sanitárias insatisfatórias (Barreto et al., 2007).

Com relação às ocorrências das outras categorias diarreiogênicas identificadas em

humanos, observa-se as maiores frequências para ETEC (3,96%-19/479) e EAEC (3,76%-

18/479). A ETEC-ST (1,87%-9/479) ocorreu em frequência semelhante à ETEC-LT (1,67%-

8/479), enquanto que a ETEC-ST/LT foi menos frequente (0,83%). A ETEC continua sendo

um problema de saúde em países em desenvolvimento, como mostram os resultados de

Estrada-García et al. (2005), no México, onde esta categoria ocorreu em 27% dos casos

diarreico e, de Gomes et al. (1991) que descreveram a importância das ETEC em São Paulo,

sendo responsáveis por 7 a 20% de casos de diarreia infantil. Quanto as EAEC, sua frequência

reflete a revisão realizada por Huang et al. (2006) que evidenciou que a EAEC é cada vez

mais identificada em humanos e reconhecida como causa de diarreia aguda e crônica entre

crianças e adultos de forma semelhante em países desenvolvidos e em desenvolvimento.

Entre as EPEC, somente a categoria EPEC atípica foi encontrada entre as amostras

humanas na frequência de 3,34% (16/479). A diminuição e até mesmo a ausência de isolados

de EPEC típica em amostras de fezes humanas é um cenário atual no Brasil e em outros

países. Em 2004, essa mudança foi registrada por Rodrigues et al. (2004) ao observarem que

os sorotipos clássicos que caracterizam as EPEC típicas (O26, O55, O86, O111, O114, O119,

O125, O126, O127, O128, O142 e O158) estavam associados com EPEC atípicas (padrão de

aderência LAL - adesão localizada like) e EAEC (padrão de aderência agregativa). O registro

destes sorogrupos clássicos continuou frequente nos estudos sobre a etiologia da diarreia,

porém, atualmente, associados a diferentes categorias de E. coli diarreiogênicas como EPEC

atípica e EAEC (Ghosh & Ali, 2010; Moreno et al., 2010).

Um estudo com EPEC-a (eae+EAF-stx-), isoladas de pacientes com diarreia

sanguinolenta, utilizando o MLST (multi-locus sequence typing), os perfis de virulência e a

sorotipagem, identificou estas amostras como EHEC que perderam o gene stx durante a

infecção (Bielaszewka et al., 2008). Este evento é conhecido como interconversão de E. coli

A/E. O aumento das ocorrências de EPEC-a em detrimento a diminuição de EPEC-t, pode

estar acontecendo devido à interconversão de EPEC-t em EPEC-a pela perda do plasmídeo

69

EAF. Este evento de interconvesão colabora para a difícil caracterização das E.coli

diarreiogênica, principalmente, entre as E. coli produtoras de lesão A/E que apresentam o

gene eae+ (Schmidt, 2010).

Embora a transmissão direta de EPEC atípicas entre animais e humanos não esteja

estabelecida, a observação de alguns sorogrupos envolvidos na doença humana, e que foram

isolados também em animais, sugere a possibilidade de que esses animais sejam reservatórios

de EPEC atípicas e possam transmiti-las aos humanos (Hernandes et al., 2009; Monaghan et

al., 2013).

As únicas STEC encontradas no presente estudo foram de origem humana e,

identificadas na frequência de 0,41% (2/479), considerada inferior às registradas em outros

estados brasileiros, com exceção de Rondônia, que apresentou a frequência de 0,63%. Das

duas STEC, uma apresentou apenas o gene para toxina de Shiga-1, enquanto a outra

apresentou o gene eae (intimina) e os genes para ambas as toxinas de Shiga tipo 1 e 2. As

infecções por STEC podem evoluir de uma simples diarreia à colite hemorrágica e síndrome

hemolítica urêmica (SHU), que é uma síndrome causada por lesão renal, trombocitopenia e

anemia hemolítica que pode levar a morte (Blanco et al., 2004) e os casos graves de SHU

estão comprovadamente associados à ação da toxina de Shiga tipo 2 (Stx-2) (Gomes et al.,

2011).

A principal fonte de contaminação para o homem é o consumo de carne bovina

(principalmente a carne moída), de leite ou derivados contaminados, pois o gado bovino e

outros ruminantes são os principais reservatórios de STEC, sendo que, a transmissão direta

por meio destes animais também pode ocorrer (Montenegro et al., 1990; Zschock et al.,

2000).

Com exceção da Argentina, considerada região endêmica para Síndrome Hemolítica

Urêmica (SHU) (Fernandez-Brando et al., 2011), os países sul-americanos registram baixas

frequências de STEC comparado às outras categorias (EAEC, EPEC atípica e ETEC). Nestes

países, elas são isoladas de casos diarreicos leves e esporadicamente associadas à SHU

(Franzolin et al., 2005; Paniagua et al., 2007; Guth et al., 2002).

4.1.2. E. coli diarreiogênicas de origem ambiental

As categorias de E. coli diarreiogênicas estão sendo frequentemente identificadas em

vários ambientes aquáticos, desde ecossistemas naturais até reservatórios de abastecimento de

70

água e redes de esgoto, em diversas regiões do mundo (Nascimento & Van Der Sand, 2007;

Hamilton et al., 2010; Carlos et al., 2011; Ibkewe et al., 2011; Oliveira et al., 2012).

Em Taiwan, Huang et al. (2011) detectaram a presença de genes de E. coli

diarreiogênicas em 29,1% das amostras de abastecimento de água não tratada, sendo as

maiores frequências para STEC (10,9%), EPEC (9,1%) e EIEC (9,1,%). A frequência para

EAEC (3,6%) foi baixa e não houve identificação dos genes codificantes para toxinas LT e

ST de ETEC. Em outro país asiático, Bangladesh, Akter et al. (2013) utilizando a PCR para

detecção de genes de virulência, diretamente de sistemas aquáticos naturais, evidenciaram a

maior frequência de genes codificantes para os fatores de virulência de ETEC, EPEC e STEC

em comparação com os de EIEC e EAEC e, observaram que a distribuição destes genes

ocorria em função dos diferentes períodos sazonais.

Um estudo, realizado nos Estados Unidos, sobre a avaliação microbiológica da

qualidade da água de bacias hidrográficas utilizadas como fonte de abastecimento urbano,

Ibkewe et al. (2011) pesquisaram a ocorrência de genes de virulência para ETEC, STEC e

EPEC em 389 E. coli isoladas de água superficial e sedimentos destas bacias e, identificaram

uma positividade de 3,85% (15/389). Todas as 15 E. coli diarreiogênicas identificadas

possuiam o gene eae e foram classificadas como EPEC atípicas.

Na Austrália, Sidhu et al. (2013) avaliando a presença de genes de virulência em 300

E. coli isoladas da água de rios e enseadas, detectaram altas frequências de E. coli

diarreiogênica com variação maior ou menor entre as categorias de acordo com as períodos

sazonais, as EAEC (23%), STEC (11%) e EPEC (11%) prevaleceram sobre as outras

categorias durante os períodos secos, porém, depois de constantes chuvas fortes, que

caracterizam o período mais úmido, houve prevalência de todas as categorias, EPEC típicas

(14%) e atípica (3%), EAEC (12%), EIEC (10%), EHEC (7%) e ETEC (7%). Essas

observações levaram os autores a concluir a importância do controle das fontes de

contaminação humana e do gerenciamento de fontes de águas residuais para minimizar os

riscos para saúde humana, como também, destacaram para aquele país, a necessidade de

tratamento da água da chuva captada antes da reutilização para fins potáveis ou domésticos.

As observações destes estudos que destacam a ocorrência de E. coli diarreiogênicas

nos ecossistemas aquáticos naturais ou nas águas de abastecimento público, indicam a

participação destes ambientes como possíveis fontes de surtos ou de infecções por E. coli

diarreiogênicas para população geral em várias localidades do mundo, independente do estado

de desenvolvimento do país.

71

No Brasil, as E. coli diarreiogênicas já foram pesquisadas e identificadas em

ambientes aquáticos como águas de lastro e de regiões portuárias (Albertini, 2009), águas de

praia, de lagoas, de rios, de córregos e de represas (Melo, 2006; Orsi et al., 2007; Oliveira et

al., 2012; Rebello, 2012). Estes estudos avaliaram a presença de E. coli diarreiogênicas por

meio da pesquisa de genes codificantes dos diferentes fatores de virulência que as

caracterizam, utilizando-se para isso a reação em cadeia mediada pela polimerase - PCR.

Albertini (2009) identificou a presença de 11 (3,33%) E. coli diarreiogênicas entre as

331 E. coli isoladas de água de lastro e de regiões portuárias brasileiras, destas, quatro eram

EAEC, três ETEC, três EPEC atípica e uma STEC-Stx2.

Melo (2006), após avaliar 80 E. coli isoladas de lagoas em Minas Gerais, identificou

sete E. coli diarreiogênicas (8,75%), sendo cinco STEC-Stx2, uma ETEC-LT e uma EPEC

atípica. Rebello (2012) ao analisar as águas provenientes de rios, lagoas e canais, no Rio de

Janeiro, com influência de contaminação de esgoto urbano ou rural, identificou seis E. coli

diarreiogênicas (3,37%) sendo cinco STEC-Stx1 e uma ETEC-LT.

No estado de São Paulo, região metropolitana, Orsi et al. (2007) avaliaram 133 E. coli

isoladas de duas represas (Guarapiranga e Bilings) utilizadas com fins recreativos e

identificaram 11 E. coli patogênicas (8,2%), destas, seis eram EAEC, duas ETEC-LT, duas

EPEC atípica e uma STEC-Stx2.

Um interessante estudo envolvendo E. coli isoladas de águas de praias permanentes de

rios, foi desenvolvido por Oliveira et al. (2012) no estado do Tocantins. Essas praias são

artificiais oriundas das praias fluviais sazonais, típicas de alguns rios como o Tocantins e o

Araguaia, na região Centro-Norte do Brasil, que se formam durante a estação seca (julho e

agosto). Das 149 E. coli isoladas de seis diferentes praias e submetidas à pesquisa dos genes

de virulência para EPEC, ETEC e STEC por PCR, foram identificadas quatro (2,68%) E. coli

diarreiogênicas durante a estação seca, sendo duas EPEC atípicas e duas ETEC-LT .

Com base nos estudos citados acima, percebe-se que a frequência com que as

categorias de E. coli diarreiogênicas foram encontradas nos ambientes aquáticos no Brasil,

variou de 2,68% a 8,75%, percentual superior a frequência geral detectada neste estudo, que

foi 1,74% (6/344). Considerando, no entanto, as diferentes fontes ambientais investigadas

neste estudo, a identificação de E. coli diarreiogênica ocorreu, exclusivamente, entre as E. coli

provenientes de água superficial de rio na frequência de 4,11% (6/146). Este percentual ficou

em torno da média observada entre os estudos brasileiros que investigaram a presença de E.

coli diarreiogênica entre amostras de origem ambiental. Essa variação provavelmente ocorre

72

em função dos períodos sazonais ou/e posição das marés durante as coletas de água e, pela

presença, ausência ou proximidade com fontes contaminantes de origem humana ou animal.

Neste estudo, a frequência de 4,11% de E. coli diarreiogênica de origem ambiental

pode ser em decorrência da exposição destas águas superficiais de rios aos contaminantes

oriundos de esgoto urbano provenientes de Belém, de dejetos lançados pelas embarcações que

navegam pelo rio ou pela contaminação direta por dejetos animais ou humanos provenientes

da população ribeirinha.

Existe uma diversidade na frequência com que as E. coli diarreiogênicas estão

distribuidas entre os ambientes aquáticos brasileiros, sendo frequente a identificação de

EAEC, ETEC-LT, STEC (Stx-2) e EPEC atípica. No presente estudo, das seis E. coli

diarreiogênicas identificadas: ETEC-ST (1), ETEC-LT (1), EAEC (1), EPEC atípicas (2) e

EPEC típica (1), destaque-se a presença de ETEC-ST e EPEC típica, que são categorias não

frequentemente identificadas entre as amostras ambientais brasileiras e, a ausência de STEC

que é comumente identificada nestes estudos. A ausência de identificação de EIEC entre

amostras ambientais está de acordo com os achados brasileiros e alguns internacionais (Orsi et

al., 2007; Rebello, 2012; Oliveira et al., 2012; Mohamed et al., 2012).

Para algumas categorias de E. coli diarreiogênicas identificadas somente em humanos,

como as EPEC típicas e a EIEC, a presença nestes ambientes aquáticos sugere contaminação

de origem fecal humana, já no caso de outras categorias como a EAEC e a EPEC atípica,

identificadas em humanos e em uma variedade de animais, esta contaminação pode ser de

origem fecal humana ou animal. No caso específico de EPEC típica, entre as amostras de água

deste estudo, demonstra a possível influência de contaminação de origem humana e,

indiretamente, aponta para a circulação desta categoria na população local. Fato este, que se

destaca, em virtude da ausência de EPEC típica entre as amostras humanas de outras

localidades, como as avaliadas neste estudo e, da ocorrência cada vez mais rara das EPEC

típicas em detrimento de novas categorias que estão surgindo e se adaptando ao ambiente

intestinal e ambiental como as EPEC atípicas e EAEC.

A diversidade de E. coli diarreiogênicas identificadas entre as amostras de água

superficial do entorno das ilhas Grande e Murutucu, demonstra a possibilidade de risco de

transmissão destas categorias patogênicas à população ribeirinha que, pelos próprios hábitos

culturais impostos pela baixa condição socioeconômica, realiza a captação dessa água

contaminada para utilização no consumo, no uso doméstico e nas atividades de lazer. Há de se

considerar, também, o ambiente aquático não só como fonte de contaminação como também

73

de manutenção destes patógenos, contribuindo assim, com o ciclo das infecções intestinais

(Rebello, 2012).

A possibilidade de monitoramento ambiental realizado com a inclusão da identificação

destas categorias de E. coli diarreiogênica pode ajudar na avaliação sazonal de risco que estes

patógenos oferecem e minimizar o impacto das doenças diarreicas causadas pelo consumo de

água contaminada (Sidhu et al., 2013). O monitoramento ambiental também foi sugerido por

Batabyal et al., (2013) ao constatarem em Bengal, na Índia, a frequência de E. coli

diarreiogênica em 21,4% das amostras de água potável com multirresistência em 9% delas.

O reconhecimento do potencial patogênico de E. coli diarreiogênica isolada de

ambiente aquático é evidenciado no estudo de Lascowski et al. (2013) ao analisarem 1.850

amostras de E. coli isoladas de água de beber provenientes de 41 municípios do Estado do

Paraná e identificaram 12 STEC sendo 11 amostras isoladas de água tratada e uma não

tratada. Estas amostras foram positivas tanto para Stx-1 quanto para Stx-2 e apresentaram

mais outros cinco fatores de virulência, levando os autores a concluir que a água de beber,

especialmente de abastecimento de água não tratada, pode ser fonte de STEC potencialmente

patogênica ao homem.

A ausência de isolamento de qualquer categoria de E. coli diarreiogênica em água de

beber ou de uso doméstico coletadas no município de São Sebastião da Boa Vista, no

arquipélogo do Marajó, deve ser reflexo da baixa frequência com que estas categorias

ocorrem na região ou de características ambientais próprias que desfavoreçam a permanência

das mesmas no ambiente aquático, pois de acordo com as informações epidemiológicas a

maioria destas amostras não era tratada. Estas hipóteses poderão ser observadas com mais

propriedade através dos resultados que serão gerados pelo projeto “Marcadores

epidemiológicos em saúde no arquipélago do Marajó”, onde as E. coli de origem humana de

São Sebastião da Boa Vista serão testadas para categorias de E. coli diarreiogênicas, como

também, as amostras ambientais e humanas provenientes de outros municípios deste

arquipélago.

No estudo desenvolvido por Lothigius et al. (2009) ao analisarem experimentalmente

a sobrevivência e viabilidade de amostras de ETEC em água por meio da expressão de genes

envolvidos no metabolismo bacteriano, os autores constataram que as células bacterianas de

ETEC, na água doce ou salgada, podem entrar em um estado viável não cultivado durante

situações de estresse e permaneceram intactas por um período de três meses, apresentando

portanto, um potencial infeccioso mesmo após um longo período de incubação na água, que

74

consequentemente, potencializa o risco de transmissão de E. coli diarriogênica pelo ambiente

aquático.

A importância da presença de E. coli patogênica na água foi evidenciada por Ribeiro et

al. (2011) ao descobrirem o potencial citotóxico e enterotóxico de E. coli isoladas do

abastecimento de água potável do município de Ouro Preto, Minas Gerais. Estas amostras

foram capazes de produzir uma citotoxina termoestável com ação enterotóxica diferente das

produzidas por ETEC (LT), STEC (Stx-1 ou Stx-2) e EAEC (EAST-1) e que, até o momento,

não tinha sido descrita.

Considerando a presença de E. coli nos ambientes aquáticos como águas de praias

(Oliveira et al., 2012), é fato a constatação das mesmas nas areias, no entanto, são poucos os

registros que descrevem sua ocorrência, talvez por não existir legislação que regulamente a

qualidade microbiológica das areias como acontece com a análise da água da praia para

determinação dos critérios de balneabilidade (Andraus, 2006).

Pelo levantamento bibliográfico realizado, não foi identificado nenhum estudo que

demonstrasse a pesquisa de E. coli diarreiogênica em amostras de areia de praias,

caracterizando este trabalho como pioneiro na área. Apesar dos resultados negativos,

demonstrando ausência de E. coli diarreiogênica entre as 106 amostras isoladas das areias das

praias de Mosqueiro e Salinópolis, o risco da contaminação das areias pela presença de E. coli

e consequente transmissão ao homem é evidenciado por Andraus (2006) ao constatar que a

contaminação da areia da praia, não ocorre exclusivamente pela água do mar, e sim pelo

fenômeno de bioaculação de bactérias neste ambiente e, por Bevesrdorf et al., (2007) que

constatou que a areia de praia serve como reservatório e que pode favorecer a replicação e

contribuir para a persistência das E. coli neste ambiente.

4.2. RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA EM E. coli DIARREIOGÊNICAS

O fenômeno de resistência bacteriana é considerado um problema mundial que vem se

agravando com o aumento do percentual de isolados resistentes e com o surgimento de

multirresistências, principalmente, as que incluem antimicrobianos considerados de última

escolha terapêutica como as quinolonas, os carbapenêmicos e as cefalosporinas de espectro

estendido (Vila et al., 1999; Shahrokhi et al., 2011).

Os resultados deste estudo demonstraram que as E. coli diarreiogênicas apresentaram

uma resistência antimicrobiana geral de 51,39% (37/72) e multirresistência de 45,94%

75

(17/37). As resistências mais frequentes foram observadas ao sulfametoxazol-trimetoprim

(44,44%-32/72), à ampicilina (40,28%-29/72) e à tetraciclina (33,33%-24/72) e, consideradas

significativas quando comparadas aos outros antimicrobianos como o cloranfenicol (11,12%-

8/72) e a amoxicilina-ácido clavulânico (5,56%-4/72). De acordo com Mosquito et al. (2011),

com exceção deste último, os demais, juntamente com o ácido nalidíxico, são os

antimicrobianos para os quais as E. coli diarreiogênicas apresentam os mais elevados

percentuais de resistência. Mesmo estes sendo, os principais antimicrobianos, o padrão de

resistência é variável para cada amostragem e local de estudo e, deve ser monitorado para o

acompanhamento das multirresistências.

No Brasil, Garcia et al. (2011) observaram que os maiores percentuais de resistência

entre as E. coli diarreiogênicas foram à tetraciclina (39,7%), à ampicilina (30,9%) e ao

sulfametoxazol-trimetoprim (30,9%), valores similares aos observados neste estudo. Além

desses antimicrobianos, foi registrada resistência à cefalotina de 5,9 % e à levofloxacina de

3%, que são antimicrobianos das classes das cefalosporinas e quinolonas, cuja resistência, não

foi detectada no presente estudo.

No Iran, a resistência antimicrobiana geral entre as E. coli diarreiogênica foi de 55%,

sendo os maiores percentuais para tetraciclina (63%), ampicilina (62%), amoxicilina-ácido

clavulânico (44,5%), sulfametoxazol-trimetoprim (39,5%), cefalotina (37%) e cloranfenicol

(31%); percentuais menores foram encontrados para ciprofloxacina e ácido nalidixico (ambos

2,5%) (Aslani et al., 2008).

Em dois trabalhos realizados no Peru, pode-se constatar, que os maiores percentuais de

resistência entre as E. coli diarreiogênicas foram para ampicilina (74 a 85%), cotrimoxazole

(70 a 79%), tetraciclina (61 a 65%) e ácido nalidíxico (28 a 30%); percentuais menores foram

registrados para amoxicilina-ácido clavulânico (9%), cefatoxima, ceftazidima, cloranfenicol e

gentamicina (4% cada) (Medina et al., 2010; Ochoa et al., 2010).

Ao contrário do que se observa nestes estudos, as E. coli diarreiogênicas desta

casuística, foram todas sensíveis aos antimicrobianos pertencentes as classes das quinolonas

(ciprofloxacina e àcido nalidíxico) e das cefalosporinas de espectro estendido (ceftazidima e

cefotazima), demonstrando que a resistência a estes antimicrobianos ainda não foi introduzida

entre as categorias de E. coli diarreiogênica da nossa região, isoladas durante o período de

estudo. Em outras localidades do Brasil e do mundo, a resistência a estes antimicrobianos é

frequente entre ETEC e EAEC de origem humana (Aslani et al., 2011; Regua-Mangia et al.,

2009b; Shahrokhi et al., 2011), esta consolidada entre categorias de ETEC animal (Lee et al.,

76

2009) e, é, frequentemente, relatada entre E. coli isoladas de infecções urinárias e

extraintestinais (Oteo et al., 2005; Pereira et al., 2007; Farshad et al., 2011).

A preocupação com o aumento da resistência à ciprofloxacina e às cefalosporinas,

entre humanos, é devido ao surgimento da multirresistência, pois como observado por Pereira

et al. (2007). As amostras de E. coli resistentes à ciprofloxacina, geralmente, apresentam

mecanismos de resistência adicionais, como a produção de β-lactamases de espectro

estendido, que reduzem as opções terapêuticas. Além disso, a constatação do aumento de

tratamento empírico da diarreia infantil com cefalosporinas, em hospitais brasileiros, pode

colaborar para seleção de isolados multirresistentes (Moura et al., 2012).

Apesar de terem sido identificadas apenas seis E. coli diarreiogênicas de origem

ambiental, os testes estatísticos permitiram evidenciar que não houve diferença significativa

entre os percentuais de resistência, detectados entre as E coli diarreiogênicas de origem

humana (53,03%-35/66) e ambiental (33,33%-2/6).

A comparação, entre E. coli diarreiogênicas de origem humana e ambiental,

demonstrou que os percentuais de resistência aos antimicrobianos sulfametoxazol-

trimetoprim, ampicilina, tetraciclina e cloranfenicol foram frequentes entre as duas origens. A

única diferença, considerada significativa, foi a resistência à amoxicilina-ácido clavulânico,

maior entre as E. coli diarreiogênicas de origem ambiental (40,00%) do que entre as de

origem humana (3,03%). Esta diferença pode ter sido influenciada pela pressão seletiva do

ambiente, uma vez que este antimicrobiano é considerado um metabólito secundário

produzido, naturalmente, por Streptomyces clavuligerus presentes no solo (Brown, A.G. et al.,

1976; Brown, D. et al., 1979).

A resistência antimicrobiana ao sulfametoxazol-trimetoprim, ampicilina, tetraciclina e

cloranfenicol identificada tanto em amostras de origem ambiental e humana, é reconhecida

como uma tendência global entre as E. coli diarreiogênicas isoladas de casos clínicos,

variando entre elas, apenas em relação a uma maior ou menor frequência entre estes

antimicrobianos (Ochoa et al., 2009; Shahrokhi et al., 2011; Garcia et al., 2011).

Neste estudo, por exemplo, todas as categorias apresentaram resistência aos três

principais antimicrobianos (sulfametoxazol-trimetoprim, ampicilina e tetraciclina), no

entanto, essas resistências variaram de acordo com as categorias diarreiogênicas. As EPEC e

EAEC estiveram igualmente associadas à resistência à ampicilina (47,37% e 63,16%,

respectivamente), ao sulfametoxazol-trimetoprim (42,11% e 63,16%, respectivamente) e à

tetraciclina (36,84% e 47,37%, respectivamente) e, as ETEC à ampicilina (33,33%) e ao

77

sulfametoxazol-trimetropim (28,57%), enquanto que as EIEC estiveram associadas ao

sulfametoxazol-trimetoprim (45,45%) e à tetraciclina (54,55%), confirmando a tendência de

resistência para estes antimicrobianos.

Estrada-Garcia et al. (2005), no México, constataram que as resistências à ampicilina,

ao sulfametoxazol-trimetoprim e à tetraciclina foram maiores entre EPEC típicas, EAEC e

ETEC do que entre EPEC atípicas. Scaletsky et al. (2010), avaliando a resistência de EPEC,

no Brasil, observaram maiores percentuais de resistência entre as EPEC típicas

(sulfametoxazol-trimetoprim - 62,8%, ampicilina - 60%, tetraciclina -34,3% e cloranfenicol -

20%) enquanto essa frequência foi 25,3%, 24%, 10,1% e 2,5% (respectivamente) para as

EPEC atípicas. Todas as EPEC (típicas e atípicas) foram sensíveis à ceftazidima,

ciprofloxacina e ácido nalidíxico. Contrário a estes resultados, a única EPEC típica,

identificada no presente estudou, foi sensível a todos os antimicrobianos testados.

Dentre as duas STEC identificadas, neste estudo, apenas uma apresentou resistência ao

sulfametoxazol-trimetoprim e à tetraciclina (SXT-TE). Este fenótipo também foi observado

por Cergole-Novella et al. (2011) ao analisarem 31 STEC isoladas de humanos (21) e bovinos

(11) e detectarem resistência à tetraciclina (100%) e ao sulfametoxazol-trimetoprim (68%), no

entanto, resistências a outros antimicrobianos como a estreptomicina (78%) e a ampicilina

(35%) foram observadas.

Os estudos sobre resistência entre as categorias são mais frequentes com as ETEC e,

assim como observado neste estudo, alguns confirmam que esta categoria é mais resistente à

ampicilina e ao sulfametoxazol-trimetoprim. Rodas et al. (2011), na Bolívia, detectaram as

resistências à ampicilina (53,5%), à ampicilina-sulbactam (46,5%) e ao sulfametoxazol-

trimetoprim (32,5%) como as mais frequentes, enquanto, Shahrokhi et al. (2011), no Iran,

detectaram resistências ainda mais elevadas à ampicilina (88,93%) e ao sulfametoxazol-

trimetoprim (82,3%).

Neste estudo, os resultados evidenciaram a presença de seis fenótipos de

multirresistência envolvendo de três a cinco antimicrobianos, com destaque para o AMP-

SXT-TE encontrado em 24,32% das amostras. As maiores frequências para este fenótipo de

multirresistência e para os de dupla resistência como o AMP-SXT (21,62%) e o SXT-TE

(16,22%) funcionam como reflexo do elevado percentual de resistência encontrado para estes

antimicrobianos individualmente (ampicilina - 40,28%; sulfametoxazol-trimetoprim -

44,44%; tetraciclina - 33,33%) e evidencia a possibilidade do compartilhamento de genes de

resistência em uma mesma estrutura genética como os integrons, evidenciando uma possível

78

coseleção de resistência para estes antimicrobianos (Di Conza & Gutking, 2010; Mosquito et

al., 2011).

Resultados semelhantes foram observados por Ochoa et al. (2010) e Rivera et al.

(2010), no Peru, onde evidenciaram que os fenótipos AMP-SXT-TE (24%) e AMP-SXT

(19%) foram os mais frequentes entre as categorias de E. coli diarreiogênicas e que as ETEC e

EAEC foram as que apresentaram maiores percentuais de multirresistência.

A partir da observação de Pinto (2013) ao avaliarem E. coli humanas e ambientais e,

demonstrarem a ocorrência de genes de resistência aos aminoglicosídeos e ao trimetoprim

localizados em integrons de classe 1, que já possuem no segmento conservado 3’ os genes de

resistência às sulfonamidas, é possível considerar a hipótese de que, entre as amostras deste

estudo, a existência dos fenótipos de multirresistência mais comuns, envolvendo a ampicilina,

o sulfametoxazol-trimetoprim e a tetraciclina, seja em decorrência da presença concomitante

de genes de resistência nestes integrons e da pressão seletiva ocorrida por várias décadas de

utilização destes antimicrobianos na rotina clínica.

Neste estudo, a observação dos fenótipos de resistência por categoria de E. coli

dirreiogênica, identificou a EAEC (73,68%) e a EIEC (54,54%) como as categorias com

maior frequência de resistência. A maior diversidade de fenótipos de multirresistência foi

observada entre as EAEC e EPEC, sendo AMP-SXT-TE o mais frequente em ambas. Essa

diversidade de fenótipos, principalmente, em EAEC e EPEC também foi observada por

Garcia et al. (2011), sendo o percentual de multirresistência de 81,9% para EAEC e de 60%

para EPEC. Destaca-se também que somente entre estas duas categorias foram observadas

resistência ao cloranfenicol e identificados fenótipos de resistência com mais de 4

antimicrobianos, incluindo o fenótipo AMP-AMC-C-SXT-TE que foi detectado tanto nas

amostras humanas como ambientais.

A EAEC é apresentada por Aslani et al. (2011) e Regua-Mangia et al. (2009b) como

uma categoria isolada de casos diarreicos com emergente resistência. Além da consolidada

resistência aos antimicrobianos de escolha para o tratamento da diarreia: ampicilina (100%),

eritromicina (100%), co-trimoxazole (71,4%) e tetraciclina (64,3%), as EAEC apresentaram

elevados percentuais de resistência ao ácido nalidíxico (57,1%), as cefotazime e ceftriaxone

(42,9%) e ao cloranfenicol (35,7%) (Aslani et al., 2011). A multirresistência para até seis

antimicrobianos foi observada em 81,5% das EAEC, que apresentaram 11 diferentes fenótipos

de multirresistência contendo os antimicrobinos ciprofloxacina, ácido nalidíxico, cefotaxima,

ceftazidima e nitrofurantoína (Regua-Mangia et al., 2009b).

79

Entre as seis amostras de E. coli diarreiogênicas de origem ambiental (água de

superfície de rio), duas foram resistentes a dois e a três antimicrobianos. Os fenótipos de

resistência foram AMP-AMC em ETEC e AMP-AMC-C-SXT-TE em uma EPEC atípica.

Alguns trabalhos, no Brasil, demonstraram a ocorrência de multirresistência entre E. coli

diarreiogênicas isoladas de ambientes aquáticos que incluem, além da amoxicilina-ácido

clavulânico e do cloranfenicol, as quinolonas e as cefalosporinas (Albertini, 2009; Oliveira et

al., 2012).

Oliveira et al., (2012) detectaram multirresistência entre quatro E. coli diarreiogênicas

isoladas de água de praias urbanas da cidade de Palmas-Tocantins, duas EPEC apresentaram

resistência aos fenótipos SXT-TE-CEF (cefalotina) e o outro AMP-C-SXT-TE, enquanto os

fenótipos de resistência para as ETEC-LT foram AMP-TE e AMP-AMC-SXT-TE-TIC-CEF,

sendo TIC (Ticarcilina+ácido clavulânico).

Albertini (2009) identificou entre as E. coli isoladas de água de lastro e de regiões

portuárias brasileiras, 49,6% de resistência variando de dois a oito antimicrobianos, com

destaque para os fenótipos AMP-CTX-CAZ-CPX-ERI-PPT-SUT e AMI-AMC-AMP-CTX-

CAZ-CRX-ERI-SUT [AMI (amicacina), CTX (cefotaxima), CAZ (ceftazidima), CPX

(ciprofloxacina), CRX (cefuroxima), ERI (eritromicina), SUT (sulfametoxazol-trimetoprim].

Nos trabalhos de Oliveira et al. (2012) e Albertini (2009), as E. coli foram isoladas de

água urbanas próximas a descarga de efluentes e este fato é considerado como favorecedor

para o isolamento de E. coli com fenótipos de multirresistência, no entanto, Melo (2006) ao

avaliar E. coli diarreiogênicas e não diarreiogênicas isoladas de água de lagoas em área de

preservação ambiental e com baixa contagem de coliformes fecais, identificaram 65% de

resistência a pelo menos um antimicrobiano e 16% de multirresistência para até sete

antimicrobianos, incluindo a ampicilina (AMP), o sulfametoxazol-trimetropim (SXT), a

tetraciclina (TE), amoxicilina-ácido clavulânico (AMC), cloranfenicol (C), ceftazidima

(CAZ), ceftriazona (CRO), cefalotina (CFL), cefoxitina (CFO) entre outros.

Esse perfil de multirresistência entre E. coli diarreiogênicas de origem ambiental

também foi observado em Bangladesh, onde as ETEC e EPEC típicas apresentaram

multirresistências que envolviam além da ampicilina, sulfametoxazol-trimetoprim e

tetraciclina, as cefalosporinas de espectro estendido, quinolonas e fluoroquinolonas (Talukdar

et al., 2013).

A presença de resistência antimicrobiana entre micro-organismos aquáticos é

considerada frequente, mais de 90% dos isolados bacterianos naturalmente encontrados na

80

água são resistentes a pelo menos um antimicrobiano e 20% apresentam multirresistência, de

forma que o meio ambiente, é considerado como um grande reservatório de genes de

resistência (Martinez, 2003; Dantas et al., 2008; Caumo et al., 2010). A água constitui, não

somente um meio de disseminação de organismos resistentes aos antimicrobianos, ela é

também, considerada a via pela qual os genes de resistência são introduzidos em bactérias

naturais ou transitórias, alterando a microbiota ambiental (Caumo et al., 2010).

A capacidade que as bactérias possuem de trocar informação genética, por captação de

DNA livre (transformação) ou através do contato entre as mesmas (conjugação), associada à

pressão seletiva no ambiente, devido à presença de substâncias antimicrobianas naturais

produzidas pela própria microbiota ambiental ou de efluentes industriais, agrícolas ou

hospitalares, favorece a disseminação da resistência antimicrobiana entre bactérias presentes

no ambiente aquático (Alonso, 2001; Baquero et al., 2008).

4.3. ANÁLISE DA VARIABILIDADE GENÉTICA DE E. coli DIARREIOGÊNICA DE

ORIGEM HUMANA E AMBIENTAL

A análise dos perfis de macrorrestrição enzimática revelou uma ampla variabilidade

genética entre as amostras de E.coli diarreiogênicas indicando as diferentes origens clonais

dos isolados.

A variabilidade de perfis entre amostras de uma mesma categoria diarreiogênica,

encontrada neste estudo, reforça a hipótese de que a diversidade genômica de E. coli é

resultado de um conjunto de mudanças ocasionadas por mecanismos como mutações,

deleções e inserções de DNA (plasmídeos, bacteriófagos, transposons, elementos de inserção

e ilhas genômicas) de outros micro-organismos, eventos que ocorrem de forma

independentemente, nas diversas categorias patogênicas. Esta propriedade dinâmica do DNA

de se modificar é chamada de plasticidade genômica (Schmidt & Hensel, 2004; Rasko et al.,

2008; Schmidt, 2010).

No contexto das E. coli diarreiogênicas o fenômeno de plasticidade genômica está

diretamente envolvido na determinação das categorias patogênica, pois como observado por

Kaper et al. (2004) e Bielaszewska et al. (2007), a riqueza de elementos genéticos móveis que

caracterizam os fatores de virulência das categorias de E. coli diarreiogênicas como: os

transposons codificantes da enterotoxina termoestável (ST) de ETEC, os plasmídeos para

produção de enterotoxina termolábel (LT) de ETEC e de invasão de EIEC, os bacteriófagos


81

carreadores dos genes para as toxinas de Shiga (Stx) de STEC e as ilhas de patogenicidade

como o LEE (locus of enterocyte effacement) em EPEC/EHEC, permite e contribui de forma

expressiva para a constante evolução e diversidade de E. coli patogênicas. A presença desses

elementos genéticos móveis, desde que inseridos no genoma cromossômico, podem, portanto,

aumentar a variabilidade dentro dos perfis gerados através do PFGE (Gurtler & Mayall,

2001).

A comparação entre o genoma de E. coli diarreiogênicas de mesma categoria, permitiu

a Rasko et al. (2008) a observação de que cada isolado patogênico pode ter se desenvolvido,

independentemente da capacidade de virulência, este fato, portanto, também contribui para

variabilidade genética entre as categorias diarreiogênicas e justifica, até mesmo, a

variabilidade genética entre categorias patogênicas caracterizadas pelos mesmos fatores de

virulência.

A potencialidade da metodologia de PFGE também pode ter contribuído para elevada

variabilidade entre as E. coli diarreiogênicas deste estudo, observada pelas diferentes posições

na topologia do dendograma geral e pelos baixos percentuais de similaridade encontrados por

categoria patogênica (EPEC: 49,1%; EAEC: 60,4%; ETEC: 64,24 e EIEC: 68,2%) (Ribot et

al., 2006).

Os estudos comparando uma categoria específica de E. coli diarreiogênica entre

diferentes ou mesmas fontes de isolamento, demonstraram esta ampla variabilidade. Santos et

al. (2010), comparando STEC O113:H21 de origem animal e humana, observaram que o

percentual de similaridade entre as amostras foi 75%, com formação de um pequeno

agrupamento com 87% de similaridade, somente entre as amostras humanas. Blanco et al.

(2006) avaliando 57 amostras de EPEC isoladas de crianças com diarreia, identificaram 44

distintos perfis de macrorrestrição gerando 12 agrupamentos, evidenciando a diversidade

clonal entre as EPEC associadas à diarreia infantil.

As relações genéticas entre E. coli diarreiogênicas, utilizando-se o PFGE, que

evidenciam a ocorrência de altos ou idênticos percentuais de similaridade genética, ocorrem

entre amostras geograficamente ou epidemiologicamente relacionadas, como demonstrado

nos resultados encontrados por Shaheen et al. (2009) e Vaz et al. (2006), descritos abaixo.

Apesar da ampla diversidade genética encontrada entre ETEC ST, LT ou ST/LT

expressando o mesmo fator de colonização antigênico (CFA-I) e, isoladas de crianças com

diarreia grave, algumas amostras com o mesmo fator de virulência (ST ou LT ou ST/ST)

82

apresentaram 100% de similaridade e foram procedentes do mesmo local e período de

atendimento (Shaheen et al., 2009).

No estudo desenvolvido por Vaz et al. (2006) ao avaliarem 46 STEC e não-STEC dos

sorogrupos O26, O111 e O157 observaram que dois perfis com 100% de similaridade

ocorreram entre sorotipos O157:H7 isolados de surto na mesma região geográfica.

Neste estudo, a identificação de E. coli diarreiogênicas apresentando padrões de PFGE

indistinguíveis, permitiu caracterizá-las como clones, que se encontravam geograficamente

relacionados, circulando na mesma localidade, em diferentes anos (Magalhães et al., 2005).

Essas amostras eram de origem humana, provenientes de indivíduos participantes do mesmo

projeto de pesquisa “Saúde no município de Juruti, Pará: cenário atual, desafios e

possibilidades” e, portanto, residentes no mesmo município. Em contra partida, a ocorrência

de ampla variedade genética entre as amostras de E. coli diarreiogênicas de origem humana,

envolvendo amostras de uma mesma localidade e período de estudo, como as provenientes de

Juruti, permitiu a observação de um padrão de infecção endêmica por E. coli diarreiogênicas

nesta localidade (Afset et al., 2008).

Quando se estuda a relação genética, por PFGE, entre amostras não relacionadas

epidemiologicamente ou geograficamente, como neste estudo, que comparou os perfis de

macrorrestrição entre E. coli diarreiogênicas de origem ambiental e humana de diferentes

localidades, a possibilidade de ocorrência de clones entre os isolados é baixa, no entanto, o

estudo evidenciou estreita relação genética (97% de similaridade) entre duas amostras de

EPEC de origem humana e ambiental, indicando a possibilidade de circulação de E. coli

diarreiogênicas, geneticamente relacionadas, em diferentes ambientes (Badri et al., 2009;

Melo, 2010).

83

5. CONCLUSÕES

As cinco categorias de E. coli diarreiogênicas - E. coli enteropatogênica (EPEC), E.

coli enteroagregativa (EAEC), E. coli enterotoxigênica (ETEC), E. coli enteroinvasora

(EIEC) e E.coli produtora de toxina de Shiga (STEC) - estiveram em circulação no

estado do Pará, no período de 2000 a 2012, sendo mais frequentes entre as amostras de

origem humana do que entre as amostras de origem ambiental;

Entre as E. coli diarreiogênicas de origem humana, foram identificadas as categorias

ETEC, EAEC, EPEC atípicas, EIEC e STEC, sendo as três primeiras as mais

frequentes e, também identificadas entre as amostras de origem ambiental;

As EIEC e STEC foram identificadas apenas entre as E. coli de origem humana,

enquanto, a EPEC típica foi, exclusivamente, de origem ambiental;

A presença de ETEC, EAEC, EPEC atípica e típica na água superficial de rio,

evidencia que o ambiente aquático pode servir de fonte de infecção para população;

Embora sem significância estatística, a resistência antimicrobiana foi maior entre as E.

coli diarreiogênicas de origem humana do que entre as de origem ambiental;

As E. coli diarreiogênicas apresentaram resistência aos antimicrobianos

sulfametoxazol-trimetoprim, ampicilina e tetraciclina, porém foram sensíveis ao ácido

nalidíxico, ciprofloxacina, ceftazidima e cefotaxima, demonstrando que a resistência

às quinolonas e às cefalosporinas de espectro estendido ainda não foi introduzida entre

as categorias de E. coli diarreiogênica identificadas no estado do Pará;

A resistência antimicrobiana entre as E. coli diarreiogênicas de origem humana e

ambiental foi semelhante para os antimicrobianos testados, à exceção da resistência à

amoxicilina-ácido clavulânico, que foi maior entre as E. coli diarreiogênicas de origem

ambiental;

Os fenótipos de resistência mais frequentes entre as E. coli diarreiogênicas de origem

humana foram AMP-SXT-TE, AMP-SXT e SXT-TE, diferentes dos fenótipos de

resistência apresentados pelas amostras ambientais: AMP-AMC-C-SXT-TE e AMP-

AMC;

84

Apesar de não ter sido observada diferença na frequência de resistência antimicrobiana

entre as categorias de E. coli diarreiogênicas, a EAEC e a EPEC foram as categorias

que apresentaram maior diversidade de fenótipos de resistência;

Os perfis de macrorrestrição enzimática revelou uma ampla variabilidade genética

entre as amostras de E.coli diarreiogênicas indicando diferentes origens clonais dos

isolados.

Foi evidenciada estreita relação genética entre uma amostra de EPEC de origem

humana e outra ambiental, indicando a possibilidade de circulação de E. coli

diarreiogênicas, geneticamente relacionadas, em diferentes ambientes.

85

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AFSET, J.E., ANDERSSEN, E., BRUANT, G., HAREL, J., WIELER, L., BERGH, K. Phylogenetic background and virulence profiles of atypical enteropathogenic Escherichia coli strains from a case-control study using multilocus sequence typing and DNA microarray analysis. Journal of Clinical Microbiology 46 (7): 2280 - 2290, 2008.

AKTER, S., ISLAM, M., AFREEN, K.S., AZMUDA, N., KHAN, S.I., BIRKELAND, N.K. Prevalence and distribution of different diarrhoeagenic Escherichia coli virulotypes in major water bodies in Bangladesh. Epidemiology and Infection 28: 1-10, 2013.

ALBERT, M. J.,FARUQUE, S.M., FARUQUE, A.S., NEOGI, P.K., ANSARUZZAMAN, M., BHUIYAN, N.A., ALAM, K., AKBAR, M.S. Controlled study of Escherichia coli diarrheal infections in Bangladesh children. Journal of Clinical Microbiology 33 (4): 973-977, 1995.

ALBERT, M.J. Epidemiology of enteropathogenic Escherichia coli infection in Bangladesh. Revista de Microbiologia 27 (l): 17-20, 1996.

ALBERTINI, L.S. Ecologia, fatores associados à virulência e diversidade de Escherichia coli isoladas de amostras de água de lastro, água de regiões portuárias e moluscos bivalvel no Brasil. Tese (Doutorado em Ciências) – São Paulo, Universidade de São Paulo, 2009. 215p.

ALONSO, A., SANCHEZ, P., MARTINEZ, J. L. Environmental selection of antibiotic Resistance genes. Environmental Microbiology 3:1 - 9, 2001.

ANDRAUS, S. Aspectos Microbiológicos da Qualidade Sanitária das Águas do Mar e areias das Praias de Matinhos, Caiobá e Guaratuba-Pr. Dissertação (Mestrado) - Curitiba, Universidade Federal Do Paraná, 2006. 142p.

ANGELES, G.R. Principales características y diagnóstico de los grupos patógenos de Escherichia coli. Artículo de Revisión. Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos. Salud Pública de México 44 (5): 464-475, 2002.

ARANDA, K.R.S., FABBRICOTTI, S.H., FAGUNDES-NETO, U., SCALETSKY, I.C.A. Single multiplex assay to identify simultaneously enteropathogenic, enteroaggregative, enterotoxigenic, enteroinvasive and Shiga toxin-producing Escherichia coli strains in Brazilian children. FEMS Microbiology Letters 267 (2):145-150, 2007.

ARANDA, K.R.S., FAGUNDES-NETO, U., SCALETSKY, I.C.A. Evaluation of Multiplex PCRs for Diagnosis of Infection with Diarrheagenic Escherichia coli and Shigella spp. Journal of Clinical Microbiology 42 (12): 5849-5853, 2004.

ARAUJO, J.M., TABARELLI, G.F., ARANDA, K.R., FABBRICOTTI, S.H., FANGUNDES-NETO, U., MENDES, C.M.F., SCALETSKY, I.C.A. Typical enteroaggregative and atypical enteropathogenic types of Escherichia coli are the most prevalent diarrhea-associated pathotypes among Brazilian children. Journal of Clinical Microbiology 45 (10): 3396-3399, 2007.

ASLANI, M.M., AHRABI, S.S., ALIKHANI, Y.M., JAFARI, F., ZALI, R.M., MANI, M. Molecular detection and antimicrobial resistance of diarrheagenic Escherichia coli strains

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Akter%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23445775

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Islam%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23445775

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Afreen%20KS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23445775

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Azmuda%20N%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23445775

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Khan%20SI%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23445775

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Birkeland%20NK%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23445775

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Faruque%20SM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Faruque%20AS%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Neogi%20PK%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ansaruzzaman%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ansaruzzaman%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bhuiyan%20NA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Alam%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Akbar%20MS%22%5BAuthor%5D

86

isolated from diarrheal cases. Saudi Medical Journal 29 (3): 388-392, 2008.

ASLANI, M.M., ALIKHANI, M.Y, ZAVARI, A., YOUSEFI, R., ZAMANI, A.R. Characterization of enteroaggregative Escherichia coli (EAEC) clinical isolates and their antibiotic resistance pattern. International Journal of Infectious Diseases 15: 136–139, 2011.

AYRES, M.; AYRES JUNIOR, M.; AYRES, D.L.; SANTOS, A.A.S. BioEstat 5.0.: aplicações estatísticas nas áreas das Ciências Biomédicas. Sociedade Civil Mamirauá: Belém, Pará-Brasil. 2007. 324p.

BADRI, S., FASSOUANE, A., FILLIOL, I., HASSAR, M., COHEN, N. Clonal analysis of Escherichia coli strains isolated from food by pulsed field electrophoresis. Internet Journal of Food Safety 11: 44-49, 2009.

BALODA, S.B., KROVACEK, K., ERICSSON, L., LINNE, T., MANSSON, I. Detection of aerolysin gene in Aeromonas strains isolated from drinking water, fish and foods by polymerase chain reaction. Comparative Immunology and Microbiology Infections Diseases 18: 17-26, 1995.

BANDO, S.Y., TRABULSI, L.R., MOREIRA-FILHO, C.A. Genetic relationship of diarrheagenic Escherichia coli pathotypes among the enteropathogenic Escherichia coli O serogroup. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz 102 (2): 169-174, 2007.

BAQUERO, F., MARTÍNEZ, J. L., CANTÓN, R. Antibiotics and antibiotic resistance in water environments. Current Opinion in Biotechnology 19, 260 - 265, 2008.

BARRETO, M.L.; BARRETO, M.; GENSER, B.; STRINA, A.; TEIXEIRA, M.G.; ASSIS, A.M.O; REGO, R.F.; TELES, C.A; PRADO, M. ; MATOS, S. M. A. ; SANTOS, D. N.; CAIRNCROSS, S. Effect of city-wide sanitation programme on reduction in rate of childhood diarrhoea in northeast Brazil: assessment by two cohort studies. Lancet, 9599: 1622 – 1628, 2007.

BASTOS, F.C., VAZ, T.M.I., IRINO, K., GUTH, B.E.C. Phenotypic characteristics, virulence profile and genetic relatedness of O157 Shiga toxin-producing Escherichia coli isolated in Brazil and other Latin American countries. FEMS Microbiology Letters 265 (1): 89–97, 2006.

BATABYAL, P., MOOKERJEE, S., SUR, D., PALIT, A. Diarrheogenic Escherechia coli in potable water sources of West Bengal, India. Acta Tropica 127 (3): 153-157 2013.

BAUDRY, B., SAVARINO, S.J.,VIAL, P., KAPER, J.B., LEVINE, M.M. A sensitive and specific DNA probe to identify enteroagregative Escherichia coli, a recently discovered diarrheal pathogen. Journal Infection Diseases 161: 1249-1251, 1990.

BAUER, A. W., BAUER, A.W., KIRBY, W.M., SHERRIS, J.C., TURCK, M. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. American Journal of Clinical Pathology 45: 493-496, 1966.

BEVERSDORF, L.J., BORNSTEIN-FORST, S.M., MCLELLAN, S.L. The potential for beach sand to serve as a reservoir for Escherichia coli and the physical influences on cell

http://www.smj.org.sa/

http://lattes.cnpq.br/9452201661974835



http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0001706X13001265




http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Kaper%20JB%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=2189007

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Levine%20MM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=2189007

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bauer%20AW%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kirby%20WM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sherris%20JC%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Turck%20M%22%5BAuthor%5D

87

die-off. Journal of Applied Microbiology 102: 1372 – 1381, 2007.

BIELASZEWSKA, M., DOBRINDT, U., GÄRTNER, J., GALLITZ, I., HACKER, J., HARCH, H., MÜLLER, D., SCHUBERT, S., SCHMIDT, M.S., SORSA, L.J., ZDZIARSKI, J. Aspects of genome plasticity in pathogenic Escherichia coli. International Journal of Medical Microbiology 297: (7-8), 625 - 639, 2007.

BIELASZEWSKA, M.; MIDDENDORF, B.; KÖCK, R.; FRIEDRICH, A.W.; FRUTH, A.; KARCH, H. Shiga toxin-negative attaching and effacing Escherichia coli: distinct clinical associations with bacterial phylogeny and virulence traits and inferred in host-pathogen evolution. Clinical Infectious Disease 47: 208–217, 2008.

BLACK, R.E. Epidemiology of traveler’s diarrhea and relative importance of various pathogens. Reviews Infection Disease 12 (1):73-79, 1990.

BLANCO, M., BLANCO, J.E., DAHBI, G., MORA, A., ALONSO, A.P., VARELA, G., GADEA, M. P., SCHELOTTO, F., GONZÁLEZ, E.A., BLANCO, J. Typing of intimin (eae) genes from enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) isolated from children with diarrhoea in Montevideo, Uruguay: identification of two novel intimin variants (mB and jR/b2B). Journal of Medical Microbiology 55:1165-1174, 2006.

BLANCO, M., PADOLA, N.L., KRUGER, A. Genes de virulencia y tipos de intiminas de Escherichia coli productoras de toxinas Shiga aisladas de ganado bovino y carne de vacuno en Argentina. International Microbiology 7 (4): 269-276, 2004.

BLANCO, M., SCHUMACHER, S., TASARA, R., ZWEIFEL, C., BLANCO, J.E., DAHBI, G., BLANCO, J., STEPHAN, R. Serotypes, intimin variants and other virulence factors of eae positive Escherichia coli strains isolated from healthy cattle in Switzerland. Identification of a new intimin variant gene (aea-eta2). BioMed Central Microbiology 5: 23-34, 2005.

BLANK, T.E., LACHER, D.W., SCALETSKY, I.C.A., ZHONG, H., WHITTAM, T.S., DONNENBERG, M.S. Enteropathogenic Escherichia coli O157 Strains from Brazil. Emerging Infectious Diseases 9 (1): 36-42, 2003.

BLATTNER, F.R., PLUNKETT III, G., BLOCH, C.A., PERNA, N.T., BURLAND, V., RILEY, M., COLLADO-VIDES, J., GLASNER, J.D., RODE, C.K., MAYHEW, G.F., GREGOR, J., DAVIS, N.W., KIRKPATRICK, H.A., GOEDEN, M.A., ROSE, D.J., MAU, B., SHAO, Y. The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12. Science 277, 1453 - 1462, 1997.

BORGES, L.J., CAMPOS, M.R.H., CARDOSO, J.L., ANDRE, M.C.D.P.B., SERAFINI, A.B. Molecular epidemiology of microorganisms isolated from food workers and enteral feeding of public hospitals. Journal of Food Sciense 75 (7): M449- M454, 2010.

BRASIL, Ministério da Saúde. Coordenação de Controle de Infecção Hospitalar. Consenso sobre o uso racional de antimicrobianos. Brasília: MS, 57p. 1998.

BRASIL, Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de Vigilância Epidemiológica. Doenças Diarreicas Agudas. In: Guia de Vigilância Epidemiológica. Brasília – (Série A: Normas e Manuais Técnicos): MS, 2009. P. 33-47.











http://www.sciencedirect.com/science/journal/14384221

http://scielo.isciii.es/cgi-bin/wxis.exe/iah/?IsisScript=iah/iah.xis&base=article%5edlibrary&format=iso.pft&lang=e&nextAction=lnk&indexSearch=AU&exprSearch=BLANCO,+MIGUEL

http://scielo.isciii.es/cgi-bin/wxis.exe/iah/?IsisScript=iah/iah.xis&base=article%5edlibrary&format=iso.pft&lang=e&nextAction=lnk&indexSearch=AU&exprSearch=PADOLA,+NORA+L.

http://scielo.isciii.es/cgi-bin/wxis.exe/iah/?IsisScript=iah/iah.xis&base=article%5edlibrary&format=iso.pft&lang=e&nextAction=lnk&indexSearch=AU&exprSearch=KRUGER,+ALEJANDRA

88

BRAY, J., BEAVAN, T.E.D. Slide Agglutination of Bacterium coli var. neapolitanum in Summer Diarrhoea. Journal of Pathology and Bacteriology 60: 395-401, 1948.

BROWN, A.G., BUTTERWORTH, D., COLE, M., HANSCOMB, G., HOOD, J.D., READING, C., ROLINSON, G.N. Naturally-occurring β-Lactamase inhibitors with antibacterial activity. The Journal of antibiotics, XXIX (6): 668-669, 1976.

BROWN, A.G., BUTTERWORTH, D., COLE, M., HANSCOMB, G., HOOD, J.D., READING, C., ROLINSON, G.N. Naturally occurring β-lactamase inhibitor with antibacterial activity. The Journal of Antibiotics 29 (6): 668-669, 1976.

BROWN, D., EVANS, J.R., FLETTON, R.A. Structures of three novel β-lactams isolated from Streptomyces clavuligerus. Journal of the Chemical Society, Chemical Communications, 282-283, 1979.

BROWNE, R.M.R. The Relentless Evolution of Pathogenic Escherichia coli. Editorial Commentary. Clinical Infectious Diseases 41: 793-794, 2005.

BROWNE, R.M.R., BORDUN, A.M., TAUSCHEK, M., BENNETT-WOOD, V.R., RUSSELL, J., OPPEDISANO, F., LISTER, N.A., BETTELHEIM, K.A., FAIRLEY, C.K., SINCLAIR, M.I., HELLARD, M.E. Escherichia coli and Community Acquired Gastroenterits, Melbourne, Australia. Emerging Infectius Diseases 10 (10): 1797-1805, 2004.

BUERIS, V., SIRCILI, M.P., TADDEI, C.R., SANTOS, M.F., FRANZOLIN, M.R., MARTINEZ, M. B., FERRER, S.R., BARRETO, M.L.,TRABULSI, L.R. Detection of diarrheagenic Escherichia coli from children with and without diarrhea in Salvador, Bahia, Brazil. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz 102 (7): 839-844, 2007.

CAMPOS, L.C., FRANZOLIN, M.R., TRABULSI, L.R. Diarrheagenic Escherichia coli Categories among the Traditional Enteropathogenic E. coli O Serogroups – A Review. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz 99 (6): 545-552, 2004.

CAMPOS, M.R.H., ANDRE, M.C.D.P.B., BORGES, L.J., KIPNIS, A., PIMENTA, F.C., SERAFINI, A.B. Genetic heterogeneity of Escherichia coli strains isolated from raw milk, minas frescal cheese, and food handlers. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia 61 (5): 1203-1209, 2009.

CARLOS, C., ALEXANDRINO, F., VIEIRA, M.A., STOPPE, N.C., SATO, M.I., GOMES, T.A., OTTOBONI, L.M. Prevalence of virulence factors in Escherichia coli isolated from healthy animals and water sources in Brazil. Journal of water and health 9 (1): 138 – 142, 2011.

CAUMO, K., DUARTE, M., GARGNIN, S.T., RIBEIRO, V.B., TASCA, T., MACEDO, A.J. Resistência bacteriana no meio ambiente e implicações na clínica hospitalar. Revista Liberato 11 (16): 180 - 186, 2010.

CERGOLE-NOVELLA, M.C., PIGNATARI, A.C., CASTANHEIRA, M., GUTH, B.E. Molecular typing of antimicrobial-resistant Shiga-toxin-producing Escherichia coli strains (STEC) in Brazil. Revista de Microbiologia 162 (2): 117-123, 2011.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bordun%20AM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Tauschek%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bennett-Wood%20VR%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Russell%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Oppedisano%20F%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lister%20NA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bettelheim%20KA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Fairley%20CK%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sinclair%20MI%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Hellard%20ME%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Carlos%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21301122

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Alexandrino%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21301122

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Vieira%20MA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21301122

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Stoppe%20NC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21301122

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Sato%20MI%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21301122

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Gomes%20TA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21301122

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Gomes%20TA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21301122

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ottoboni%20LM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21301122

89

CHAN, K. N., PHILLIPS, A.D., KNUTTON, S., SMITH, H.R., WALKER-SMITH, J.A. Enteroaggregative Escherichia coli: Another cause of acute and chronic diarrhea in England? Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition 18: 87-91, 1994.

CHASE-TOPPING, M.E., ROSSER, T., ALLISON, L.J., COURCIER, E., EVANS, J., MCKENDRICK, I.J., PEARCE, M.C., HANDEL, I., CAPRIOLI, A., KARCH, H., HANSON, M.F., POLLOCK, K.G.J., LOCKING, M.E., WOOLHOUSE, M.E.J., MATTHEWS,L., LOW, J.C., GALLY, D.L. Pathogenic Potential to Humans of Bovine Escherichia coli O26, Scotland. Emerging Infectious Diseases 18 (3): 439 - 448, 2012.

CLEARY, J., LAI, L.C., SHAW, R.K., STRAATMAN-IWANOWSKA, A., DONNENBERG, M.S., FRANKEL, G., KNUTTON, S. Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) adhesion to intestinal epithelial cells: role of bundle-forming pili (BFP), EspA filaments and intimin. Microbiology 150: 527–538, 2004.

CLSI. Clinical and Laboratory Standards Institute – Performance standards for antimicrobial Susceptibility Testing. Twenty Second Informational Supplement. M100-S22 32(3), Replaces M100-S21 31 (1). Wayne, PA, USA, 2012. 177p.

COSTA, A.R.F, LIMA, K.V.B, SOUZA, C.O., LOUREIRO, E.C.B. Desenvolvimento de PCR multiplex para detecção e diferenciação de categorias de Escherichia coli diarreiogênicas. Revista Pan-Amazônica da Saúde 1 (2): 77-84, 2010.

COSTA, M.M., SILVA, M.S., SPRICIGO, D.A., WITT, N.M., MARCHIORO, S.B., KOLLING, L., VARGAS, A.P.C. Caracterização epidemiológica, molecular e perfil de resistência aos antimicrobianos de Escherichia coli isoladas de criatórios suínos dos sul do Brasil. Pesquisa Veterinária Brasileira 26 (1): 5-8, 2006.

CRAVIOTO, A., TELLO, A., NAVARRO, A., RUIZ, J., VILLAFÁN, H., URIBE, F., ESLAVA, C. Association of Escherichia coli Hep-2 adherence patterns with type and duration of diarrhea. Lancet 337: 262-264, 1991.

CROXEN, M.A., FINLAY, B.B. Molecular mechanisms of Escherichia coli pathogenicity. Nature 8, 26 - 38, 2010.

CZECZULIN, J. R., WHITTAM, T.S., HENDERSON, I.R., NAVARRO-GARCIA, F, NATARO, J.P. Phylogenetic analysis of enteroaggregative and diffusely adherent Escherichia coli. Infection and Immunity 67: 2692-2699, 1999.

DANTAS, G., SOMMER, M.O.A, OLUWASEGUN, R.D., CHURCH, G.M. Bacteria Subsisting on Antibiotics. Science 320: 100 - 103, 2008.

DI CONZA, J.A., GUTKING, G.O. Integrons: gene collectors. Revista Argentina de Microbiologia 42: 63-78, 2010.

DUPONT, H.L., FORMAL, S.B., HORNICK, R.B., SNYDER, M.J., LIBONATI, J.P., SHEAHAN, D.G., LABREC, E.H., KALAS, J.P. Pathogenesis of Escherichia coli diarrhea. New England Journal of Medical 285: 1-9, 1971.

ESTRADA-GARCIA, T., CERNA, J.F., PAHECO-GIL, L., VELÁZQUEZ, R.F., OCHOA, T.J., TORRES, J., DUPONT H.L. Drug-resistant diarrheogenic Escherichia coli, Mexico.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Phillips%20AD%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Knutton%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Smith%20HR%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Walker-Smith%20JA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lai%20LC%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Shaw%20RK%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Straatman-Iwanowska%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Donnenberg%20MS%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Frankel%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Knutton%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Whittam%20TS%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Henderson%20IR%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Navarro-Garcia%20F%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Nataro%20JP%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Cerna%20JF%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Paheco-Gil%20L%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Vel%C3%A1zquez%20RF%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ochoa%20TJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ochoa%20TJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Torres%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22DuPont%20HL%22%5BAuthor%5D

90

Emerging Infectious Disease 11 (8): 1306-1308, 2005.

EWING, W.H. Edwards and Ewind’s identification of Enterobacteriaceae. New York, Elsevier Science Pulblishing, 1986. 536p.

FAGUNDES-NETO, U., SCALETSKY, I.C.A. The gut at war: the consequences of enteropathogenic Escherichia coli infection as a factor of diarrhea and malnutrition. Revista Paulista de Medicina 118 (1): 21-29, 2000.

FARSHAD, S., ANVARINEJAD, M., TAVANA, A.M., RANJBAR, R., JAPONI1, R., ZADEGAN, R.M., ALBORZI, A. Molecular epidemiology of Escherichia coli strains isolated from children with community acquired urinary tract infections. African Journal of Microbiology Research 5 (26): 4476-4483, 2011.

FENG, P. Escherichia coli serotype O157:H7: Novel vehicles of infection and emergence of phenotypic variants. Emerging Infectious Diseases 1 (2): 47-52, 1995.

FERNANDEZ-BRANDO, R.J., BENTANCOR, L.V., MEJIAS, M.P., PANEK, A.C., CABRERA, G.G., EXENI, R.A., PALERMO, M.S. Actualizacion en el tratamiento del sindrome uremico hemolitico endemico patogenesis y tratamiento de la complicacion sistemica mas grave de las infecciones por Escherichia coli productor de toxina Shiga. Medicina 71: 383-389, 2011.

FERREIRA, L.G., SANTOS, H.C.A.S., MARTINEZ, M.B. Escherichia coli enteroinvasora: Características, fatores de virulência e relação parasita-hopedeiro. Microbiologia in foco (5): 5-11, 2012.

FERRER, S.R. Fatores de Risco das Diarréias em crianças em Salvador, Bahia. Tese (Doutorado em Saúde Pública) – Salvador, Universidade Federal da Bahia, 2007. 385p.

FRANKEL, G. GIRON J.A., VALMASSOI, J., SCHOOLNIK, G.K. Multi-gene amplification: simultaneous detection of three virulence genes in diarrhoeal stool. Molecular Microbiology 3: 1729–1734, 1989.

FRANKEL,G., LIDER, O., HERSHKOVIZ, R., MOULD, A.P., KACHALSKY, S.G., CANDY, D.C., CAHALON, L., HUMPHRIES, M.J., DOUGAN, G. Intimin-mediated adherence to epithelial cells. Revista de Microbiologia 27 (1): 99-103, 1996.

FRANZOLIN, M..R., ROSELY, CABETTE, B., KELLER, R., GOMES, T. A.T., BEUTIN, L., BARRETO, M.L., MILROY, C., STRINA, A., RIBEIRO, H., TRABULSI, L.R. Prevalence of Diarrheagenic Escherichia coli in Children with Diarrhea in Salvador, Bahia, Brasil. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz 100 (4): 359-363, 2005.

GANDRA, E.A., GANDRA, T.K.V., MELO, W. S., GODÓI, H. S. Técnicas moleculares aplicadas à microbiologia de alimentos. Acta Scientiarum Technology 30 (1): 109-118, 2008.

GARCIA, C., CHINCHA, O., LEON, M., IGLESIAS, D., BARLETTA, F., MERCADO, E., OCHOA. T.J. Short Report: High Frequency of Diarrheagenic Escherichia coli in Human Immunodeficiency Virus (HIV) Patients with and without Diarrhea in Lima, Peru. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene 82 (6), 1118 - 1120, 2010.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Giron%20JA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Valmassoi%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Schoolnik%20GK%22%5BAuthor%5D

http://www.ajtmh.org/

91

GARCIA, F.N., SEARS, C., ESLAVA, C., CRAVIOTO, A., NATARO, J.P. Cytoskeletal effects induced by Pet, the Serine Protease enterotoxin of enteroaggregative Escherichia coli. Infection and Immunity 67 (5): 2184 – 2192, 1999.

GARCIA, P.G., SILVA, V.L., DINIZ, C.G. Occurrence and Antimicrobial Drug Susceptibility Patterns of Commensal and diarrheagenic Escherichia coli in Fecal Microbiota from Children with and without acute diarrhea. The Jornal of Microbiology 49 (1): 46-52, 2011.

GAUTOM, R. K. Rapid pulsed-field gel electrophoresis protocol for typing of Escherichia coli O157:H7 and other Gram-negative organisms in 1 day. Journal Clinical Microbiology 35: 2977-2980, 1997.

GHOSH, P.K, ALI, A. Isolation of atypical enteropathogenic Escherichia coli from children with and without diarrhea in Delhi and the National Capital Region, India. Journal of Medical Microbiology 59 (10): 1156-1162, 2010.

GIBOTTI, A., TANAKA, T.L., OLIVEIRA, V.R., TADDEI, C.R., MARTINEZ, M.B. Molecular Characterization of Enteroinvasive Escherichia coli ipa genes by PCR-RFLP Analysis. Brazilian Journal of Microbiology 35: 74 – 80, 2004.

GIBSON, J.S., COBBOLD, R.N., TROTT, D.J. Characterization of multidrug-resistant Escherichia coli isolated from extraintestinal clinical infections in animals. Journal of Medical Microbiology 59: 592-596, 2010.

GOERING, R. V. Pulsed field gel electrophoresis: A review of application and interpretation in the molecular epidemiology of infectious disease. Review. Infection, Genetics and Evolution 7 (7): 866 - 875, 2010.

GOMES, P.A.D.P., FERREIRA, R.C.C., PALERMO, M.S., FERREIRA, L.C.S. A síndrome Hemolítica Urêmica (SHU) e a busca de uma estratégia de controle para a doença. Microbiologia in foco 4: 41-47, 2011.

GOMES, T.A.T., IRINO, K., GIRÃO, D.M., GIRÃO, V.B.C., GUTH, B.E.C., VAZ, T.M.I., MOREIRA, F.C., CHINARELLI, S.H., VIEIRA, M.A.M. Emerging Enteropathogenic Escherichia coli Strains? Emerging Infectious Diseases 10 (10): 1851-1855, 2004.

GOMES, T.A.T., RASSI, V., MACDONALD, K.L., RAMOS, S.R., TRABULSI, L.R., VIERA, M.A., GUTH, B.E., CANDEIAS, J.A., IVEY, C., TOLEDO, M.R.F. Enteropathogens associated with acute diarrheal disease in urban infants in São Paulo, Brazil. Journal Infection Diseases 164: 331-337, 1991.

GORDILLO, M. E., REEVE, G. R., PAPPAS, J., MATHEWSON, J.J., DUPONT, H.L., MURRAY, B.E. Molecular characterization of strains of enteroinvasive Escherichia coli O143, including isolates from a large outbreak in Houston, Texas. Journal of Clinical Microbiology 30: 889-893, 1992.

GÜRTLER, V., MAYALL, B.C. Genomic approaches to typing, taxonomy and evolution of bacterial isolates. International Journal Systematic and Evolucionary Microbiology 51 (1): 3 - 16, 2001.

GUTH, B.E.C., RAMOS, S.R.T.S., CERQUEIRA, A.M.F., ANDRADE, J.R.C., GOMES,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=G%C3%BCrtler%20V%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11211268

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Mayall%20BC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11211268

92

T.A.T. Phenotypic and Genotypic Characteristics of Shiga Toxin-producing Escherichia coli strains isolated from children in São Paulo, Brazil. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz 97 (8): 1085-1089, 2002.

HAMILTON, M.J., HADI, A.Z., GRIFFITH, J.F., ISHII, S., SADOWSKY, M.J. Large Scale Analysis of Virulence Genes in Escherichia coli Strains Isolated from Avalon Bay, CA. Water Research 44 (18): 5463 – 5473, 2010.

HANNAOUI, E., VILLALOBOS, L., MARTINES, R., MALDONADO, A., HAGEL, I., BASTARDO, J. Escherichia coli diarreiogênica asociada a casos de diarrea aguda em niños de Cumaná, Venezuela. Investigatión Clínica 51 (4): 489 - 500, 2010.

HERNANDES, R.T., ELIAS, W.P., VIEIRA, M.A.M., GOMES, T.A.T. An overview of atypical enteropathogenic Escherichia coli. FEMS Microbiology Letters 297: 137-149, 2009.

HUANG, D.B., MOHANTY, A., DUPONT, H., OKHUYSEN, P.C., CHIANG, T. A review of an emerging enteric pathogen: enteroaggregative Escherichia coli. Journal of Medical Microbiology 55: 1303 - 1311, 2006.

HUANG, S.W., HSU, B.M., SU, Y.J., JI, D.D., LIN, W.C., CHEN, J.L., SHIH, F.C., KAO, P.M., CHIU, Y.C. Occurrence of diarrheagenic Escherichia coli genes in raw water of water treatment plants. Environmental Science and Pollution Research International 19 (7): 2776- 2783, 2011.

IBKEWE, A.M., MURINDA, S.E., GRAVES, A.K. Microbiological Evaluation of Water Quality from Urban Watersheds for Domestic Water Supply Improvement. International Journal of Environmental Research and Public Health 8: 4460 – 4476, 2011.

ISHII, S., MEYER, K.P., SADOWKY, M.J., Relationship between Phylogenetic Groups, Genotypic Clusters, and Virulence Gene Profiles of Escherichia coli Strains from Diverse Human and Animal Sources. Applied and Environmental Micorbiology 73 (18): 5703 – 5710, 2007.

ITOH, Y., NAGANO, I., KUNISHIMA, M., EZAKI, T. Laboratory Investigation of enteroaggregative Escherichia coli O untypeable:H10 associated a massive outbreak of gastrointestinal illness. Journal of Clinical Microbiology 35 (10): 2546-2550, 1997.

JENKINS, C., TEMBO, M., CHART, H., CHEASTY, T., WILLSHAW, G.A., PHILLIPS, A.D., TOMPKINS, D. SMITH, H. Detection of enteroaggregative Escherichia coli in faecal samples from patients in the community with diarroea. Journal of Medical Microbiology 55: 1493-1497, 2006.

JOHNSON, J.R, OWENS, R., GAJEWSKI, A., CLABOTS, C. Escherichia coli colonization pattern among human household members and pets, with attention to acute urinary tract infection. Journal Infection Diseases 197: 218-224, 2008.

JOHNSON, J.R., JOHNSTON, B., CLABOTS, C., KUSKOWSKI, M.A., CASTANHEIRA, M. Escherichia coli Sequence Type ST131 as the Major Cause of Serious Multidrug-Resistant E. coli Infections in the United States. Clinical Infectious Diseases 51 (3): 286–294, 2010.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Hamilton%20MJ%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Hadi%20AZ%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Griffith%20JF%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ishii%20S%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Huang%20SW%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22327641

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Hsu%20BM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22327641

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Su%20YJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22327641

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ji%20DD%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22327641

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Lin%20WC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22327641

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Chen%20JL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22327641

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Shih%20FC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22327641

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Kao%20PM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22327641

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Kao%20PM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22327641

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Chiu%20YC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22327641

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22327641


93

KAPER, J. B. Defining EPEC. Revista de Microbiologia 27 (1): 130-133, 1996.

KAPER, J.B., NATARO,J.P, MOBLE, H.L.T. Pathogenic Escherichia coli. Nature Reviews 2: 123 - 140, 2004

KARMALI, M.A., STEELE, B.T., PETRIC, M., LIM, C. Sporadic cases of haemolytic uremic syndrome associated with faecal cytotoxin and cytotoxin-producing Escherichia coli in stools. Lancet i: 619-620, 1983.

KAUFFMANN, F. Enterobacteriaceae. Copenhagem, Munksgaard, 1954. 382p.

KIM, J., OH, K., JEON, S., CHO, S., LEE, D., HONG, S., CHO, S., PARK, M., JEON, D., KIM., S. Escherichia coli O104:H4 from 2011 European Outbreak and Strain from South Korea. Emerging Infectious Diseases 17 (9): 1755-1756, 2011.

KIMATA, K., SHIMA, T., SHIMIZU, M., TANAKA, D., ISOBE, J., GYOBU, Y., WATAHIKI, M., NAGAI, Y. Rapid Characterization of Pathogenic Escherichia coli by Multiplex PCR. Microbiology and Immunology 49 (6):485-492, 2005.

LASCOWSKI, K.M.S, GUTH, B.E.C., MARTINS, F.H., ROCHA, S.P.D., IRINO, K., PELAYO, J.S. Shiga toxin-producing Escherichia coli in drinking water supplies of north Paraná State, Brazil. Journal of Applied Microbiology 114 (4): 1230 – 1239, 2013.

LEE, S.I., RAYAMAHJI, N., LEE, W.J., CHA, S.B., SHIN, M.K., ROH, Y.M., YOO, H.S. Genotypes, antibiogram, and pulsed-field gel eletrophoresis profises of Escherichia coli Strains from piglets in Korea. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 21: 510-516, 2009.

LEVINE, M. M. Escherichia coli that cause diarrhea: enterotoxigenic, enteropathogenic, enteroinvasive, enterohemorrhagic, and enteroadherent. The Journal Infectious Diseases 155: 377-389, 1987.

LÓPEZ, E.L., PRADO-JIMÉNEZ, V., O'RYAN-GALLARDO, M., CONTRINI, M.M. Shigella and Shiga toxin-producing Escherichia coli causing bloody diarrhea in Latin America. Infectious Disease Clinics of North America 14 (1): 41-65, 2000.

LOTHIGIUS, A., SJÖLING, A., SVENNERHOLM, M., BÖLIN, I. Survival and gene expression of enterotoxigenic Escherichia coli during long-term incubation in sea water and freshwater. Journal of Applied Microbiology 108: 1441–1449, 2010.

MAGALHÃES, V.D., FERREIRA, J,C., BARELLI, C., DARINI, A.L.C. Eletroforese em campo pulsante em bacteriologia – uma revisão técnica. Revista do Instituto Adolfo Lutz 64 (2):155-161, 2005.

MAGIORAKOS, A.P., SRINIVASAN, A., CAREY, R.B., CARMELI, Y., FALAGAS, M.E., GISKE, C.G., HARBARTH, S., HINDLER, J.F., DAHLMETER, G., OLSSON LILJEQUIST, B., PATERSON, D.L., RICE, L.B., STELLING, J., STRUELENS, M.J., VATOPOULOS, A., WEBER, J.T., MONNET, D.L. Multidrug-resistent, extensiley drug-resistant and pandrug-resistant bacteria: an international expert proposal for interim standar definitions for acquired resistence. Clinical Microbiology and Infection 18 (3): 268-281, 2012.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Shima%20T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Shimizu%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Tanaka%20D%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Isobe%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gyobu%20Y%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Watahiki%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Nagai%20Y%22%5BAuthor%5D

http://vdi.sagepub.com/

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Prado-Jim%C3%A9nez%20V%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22O'Ryan-Gallardo%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Contrini%20MM%22%5BAuthor%5D

94

MARTINEZ, J. L. Recent advances on antibioticresistance genes. Molecular Genetics of Marine Organisms 10:13 - 32, 2003.

MARTINEZ, M.B., TRABULSI, L.R. Enterobacteriaceae. In: Microbiologia. Trabulsi, L. R.; Alterthum, F. (Eds). São Paulo, Atheneu, 2008. P. 271 – 279.

MARTINS, I.S., NOGUEIRA, I.A., CONCEIÇÃO, M., BRASIL, P. Recomendações para o uso adequado de antimicrobianos. Secretaria Estadual de Saúde, Rio de Janeiro, 2000.

MATTILA, L. Clinical features and duration of traveler’s diarrhea in relation of its etiology. Clinical Infection Diseases 19: 728-734, 1994.

MEDEIROS, M.I.C., NEME, S.N., SILVA, P., CAPUANO, D.M., ERRERA, M.C., FERNANDES, S.A.; VALLE, G.R. & AVILA, F.A. - Etiology of acute diarrhea among children in Ribeirão Preto-SP, Brazil. Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo 43 (1): 21-24, 2001.

MEDINA, M.G., ESQUIVEL, P., LIFSCHITZ, V., MEDINA, M.L., LÖSCH, L.S., MERINO, L.A. Detection of diarrheagenic Escherichia coli in children from poor neighborhoods in Corrientes, Argentina. Revista Cubana de Medicina Tropical 62 (1): 42 – 47, 2010.

MELO, D.B. Padrão clonal e perfil de suscetibilidade aos antimicrobianos de cepas de Escherichia coli isoladas de alimentos e de espécimes clínicas. Dissertação (Mestrado em Ciência de Alimentos) – Salvador, Universidade Federal da Bahia, 2010. 80p.

MELO, S.K. Caracterização de fatores de virulência em amostras de Escherichia coli isoladas de lagoas do Parque Estadual Rio Doce, Minas Gerais. Dissertação (Mestrado em Engenharia Ambiental) – Ouro Preto, Universidade Federal de Ouro Preto, 2006. 100p.

MOHAMED, M. M.A., MOHAMED, Z. K., KLENA, K.J., AHMED, S.F., MOUSSA, T.A.A., GHENGHESH, K.S. Molecular Characterization of Diarrheagenic Escherichia coli from Libya. The American Society of Tropical Medicine and Hygiene 86 (5): 866 - 871, 2012.

MONAGHAN, Á., BYRNE, B., FANNING, S., SWEENEY, T., MCDOWELL, D., BOLTON, D.J. Serotypes and virulence profiles of atypical enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) isolated from bovine farms and abattoirs. Journal of Applied Microbiology 114 (2): 595 – 603, 2013.

MONTENEGRO, M.A., BUÈ I. M., TRUMPF T. Detection and characterisation of faecal verotoxin-producing Escherichia coli from healthy cattle. Journal of Clinical Microbiology 28: 1417-1421, 1990.

MORA, A., HERRERA, A., LÓPEZ,C., DAHBI,G., MAMANI, R., PITA, J.M., ALONSO, M.P., LLOVO, J., BERNÁRDEZ, M.I., BLANCO, J.E., BLANCO, M., BLANCO, J. Characteristics of the Shiga-toxin-producing enteroaggregative Escherichia coli O104:H4 German outbreak strain and of STEC strains isolated in Spain. International Microbiology 14: 121 - 141, 2011.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Monaghan%20%C3%81%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23163884

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Byrne%20B%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23163884

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Fanning%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23163884

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Sweeney%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23163884

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=McDowell%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23163884

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Bolton%20DJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23163884

95

MORABITO, S., KARCH, H., MARIANI-KURKDJIAN, P., SCHMIDT, H., MINELLI, F., BINGEN, E., CAPRIOLI, A. Enteroaggregative, Shiga toxin-producing Escherichia coli O111:H2 associated with an outbreak of hemolytic-uremic syndrome. Journal of Clinical Microbiology 36 (3):840 – 842, 1998.

MORATO, E. P., LEOMIL, L., BEUTIN, L., KRAUSE, G., MOURA, R. A., PESTANA DE CASTRO, A. F. Domestic Cats Constitute a Natural Reservoir of Human Enteropathogenic Escherichia coli Types. Zoonoses and Public Health 56 (5): 229 - 237, 2009.

MORENO, A.C.; FILHO, A.F.; GOMES, T.D.O.A.; RAMOS, S.T.; MONTEMOR, L.P.; TAVARES, V.C.; FILHO, L.D.O.S.; IRINO, K; MARTINEZ, M.B. Etiology of childhood diarrhea in the northeast of Brazil: significant emergent diarrheal pathogens. Diagnostic Microbiology Infection Diseases 66 (1): 50-7, 2010.

MOSQUITO, S., RUIZ, J., BAUER, J.L., OCHOA, T.J. Mecanismos moleculares de resistência antibiótica em Eschechiria coli asociadas a diarreia. Revista Peruana de Medicina Experimental y Salud Publica 28 (4): 648-656, 2011.

MOURA, M.R.S.A.L., MELO, M.J.G., CALÁBRIA, W.B., GERMANO, E.M., MAGGI, R.R.S, CORREIA, J.B. Frequência de Escherichia coli e sua sensibilidade aos antimicrobianos em menores de cinco anos hospitalizados por diarreia aguda. Revista Brasileira de Saúde Materno Infantil 12 (2): 173 - 182, 2012.

MOURA, R.A. Estudo das relações clonais entre amostras de Escherichia coli atípica de origem animal e humana. Tese (Doutorado em Microbiologia) - São Paulo, Universidade de São Paulo, 2009. 67p.

NASCIMENTO, A.M, VAN DER SAND, S.T. Uso da PCR na detecção de E. coli enterotoxigênica em amostras de água de esgoto. Acta Scientiae Veterinariae 35 (2): 181-188, 2007.

NATARO, J. P., DENG, Y., COOKSON, S., CRAVIOTO, A., SAVARINO, S.J., GUERS, L.D., LEVINE, M.M., TACKET, C.O. Heterogeneity of enteroaggregative Escherichia coli virulence demonstrated in volunteers. Journal of Infectious Diseases 171: 465-468, 1995.

NATARO, J. P., DENG, Y., MANEVAL, D.R., GERMAN, A.L., MARTIN, W.C., LEVINE, M.M. Aggregative adherence fimbriae I of enteroaggregative Escherichia coli mediate adherence to Hep-2 cells and hemogglutination of human erythrocytes. Infection and Immunity 60 (6): 2297-2304, 1992.

NATARO, J. P., KAPER, J.B., ROBINS-BROWNE, R., PRADO, V., VIAL, P., LEVINE, M.M. Patterns of adherence of diarrheagenic Escherichia coli to Hep-2 cells. Pediatric Infection Disease Journal 6: 829-831, 1987.

NATARO, J.P., KAPER, J.B. Diarrheagenic Escherichia coli. Clinical Microbiology Reviews 11 (1): 142-201, 1998.

NATARO, J.P., MAI, V., JOHNSON, J., BLACKWELDER, W. C., HEIMER, R., TIRREL, S., EDBERG, S. C., BRADEN, C. R., MORRIS, J. G. e HIRSHON, J. M. Diarrheagenic Escherichia coli infection in Baltimore, Maryland, and New Haven, Connecticut. Clinical

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Moreno%20AC%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Filho%20AF%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gomes%20Tdo%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ramos%20ST%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Montemor%20LP%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Tavares%20VC%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Filho%20Ldos%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Irino%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Martinez%20MB%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Deng%20Y%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Cookson%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Cravioto%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Savarino%20SJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Guers%20LD%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Guers%20LD%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Levine%20MM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Tacket%20CO%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Deng%20Y%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Maneval%20DR%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22German%20AL%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Martin%20WC%22%5BAuthor%5D



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kaper%20JB%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Robins-Browne%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Prado%20V%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Vial%20P%22%5BAuthor%5D



96

Infection Diseases 43: 402-407, 2006.

NAVARRO-GARCIA, F., ELIAS, V.P. Autotransporters and virulence of enteroaggregative E. coli. Gut Microbe 2 (1): 13-24, 2011.

NGUYEN, T. V., LE, V. P., LE, H. C., GIA, K.N., WEINTRAUB, A. Detection and Characterization of Diarrheagenic Escherichia coli from Young Children in Hanoi, Vietnam. Journal of Clinical Microbiology 43 (2): 755–760, 2005.

OCHOA, T.J., MERCADO, E.H., DURAND, D., RIVERA, F.P., MOSQUITO, S., CONTRERAS, C., RIVEROS, M., LLUQUE, A., BARLETTA, F., PRADA, A., RUIZ, J. Frequencia y patotipos de Escherichia coli diarrogénica en niños peruanos con y sin diarrea. Revista Peruana de Medicina Experimental e Salud Publica 28 (1): 13-20, 2011.

OCHOA, T.J., RUIZ, MOLINA, M., DEL VALLE, L.J., VARGAS, M., GIL, A.I., ECKER, L., BARLETTA, F., HALL, E.R., CLEARY, T.G., LANATA, C.F. Hich frequency of antimicrobial resistance of diarrheagenic E. coli in Peruvian infants. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene 81 (2): 296-301, 2009.

OKHUYSEN, P.C., DUPONT, P.C. Enteroaggregative Escherichia coli (EAEC): A cause of acute and persistent diarrhea of worldwide importance. The Journal of Infectious Diseases 202 (4): 503-505, 2010.

OLIVEIRA, K.W., GOMES, F. C. O., BENKO, G., PIMENTA, R. S., MAGALHÃES, P.P., MENDES, E. N., MORAIS, P. B. Antimicrobial resistance profiles of diarrheagenic Escherichia coli strains isolated from bathing waters of the Lajeado reservoir in Tocantins, Brazil. Revista Ambiente & Água - An Interdisciplinary Journal of Applied Science 7 (2): 30 - 41, 2012.

OLSVIK, O., STROCKBINE, N.A. PCR detection of heat-stable, heat-labile, and Shiga-like toxin genes in Escherichia coli. Diagnostic Molecular Microbiology Principles and Applications 18: 271-276, 1993.

ORLANDI, P.P., MAGALHÃES, G.F., MATOS, N.B., SILVA, T., PENATTI, M., NOGUEIRA, P.A., SILVA, L.H.P.DA. Etiology of diarrheal infections in children of Porto Velho, Rondonia, Western Amazon region, Brazil. Brazilian Journal of Medical and Biological Research 39: 507-517, 2006.

ORSI, R.H., STOPPE, N.C., SATO, M.I.Z., GOMES,T.A.T., PRADO, P.I., MANFIO, G.P.,

OTTOBONI, L.M.M. Genetic variability and pathogenicity potential of Escherichia coli isolated from recreational water reservoirs. Research in Microbiology 158 (5): 420 – 427, 2007.

OTEO, J. LÁZARO, E., ABAJO, F.J., BAQUERO, F., CAMPOS, J. Antimicrobial-resistante Invasive Escherichia coli, Spain. Emerging Infectious Diseases 11 (4): 546-553, 2005.

PAL, A., GHOSH, S., RAMAMURTHY, T., YAMASAKI, S., TSUKAMOTO, T., BHATTACHARYA, S.K. Shiga-toxin producing Escherichia coli from healthy cattle in a semi-urban community in Calcutta, India. Indian Journal of Medical Research 110: 83-85, 1999.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Le%20Van%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Le%20Huy%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gia%20KN%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Weintraub%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.google.com.br/url?sa=t&source=web&cd=1&sqi=2&ved=0CBsQFjAA&url=http%3A%2F%2Fwww.ajtmh.org%2F&ei=AZJ8TsCGG4eitge42_hc&usg=AFQjCNEzXDyIcfF30Xju-K2VBnrzCirf2A

http://www.google.com.br/url?sa=t&source=web&cd=1&sqi=2&ved=0CBsQFjAA&url=http%3A%2F%2Fwww.ajtmh.org%2F&ei=AZJ8TsCGG4eitge42_hc&usg=AFQjCNEzXDyIcfF30Xju-K2VBnrzCirf2A







http://www.sciencedirect.com/science/journal/09232508

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22L%C3%A1zaro%20E%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22de%20Abajo%20FJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Baquero%20F%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Campos%20J%22%5BAuthor%5D

97

PANIAGUA, G.L., MONROY, E., GONZÁLEZ, O.G., ALONSO, J., NEGRETE, E., VACA, S. Two or more enteropathogens are associated with diarrhoea in Mexican children. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials 6: 17 - 25, 2007.

PATOLI, A.A., PATOLI, B.B., MEHRAJ, V. High prevalence of multi-drug resistant Escherichia coli in drinking water samples from Hyderabad. Gomal Journal of Medical Sciences 8 (1): 23-26, 2010.

PATON, A.W., PATON, J.C. Detection and characterization of Shiga Toxigenic E. coli using multiplex PCR assay. Journal of Clinical Microbiology 36 (2): 598-602, 1998.

PENNISI, E. First Food – Borne Pathogen Sequenced. Sciense 283 (26): 19, 1999.

PEREIRA, A.S., ANDRADE, S.S., MONTEIRO, J., SADER, H.S., PIGNATARI, A.C.C., GALES, A.C. Evaluation of the susceptibility profiles, genetic, similarity and presence of qnr gene in Escherichia coli resistant to ciprofloxacin isolated in Brazilian hospitals. The Brazilian Journal of Infectious Diseases 11 (1): 40-43, 2007.

PEROTO, M.C. Estudo de cepas de Escherichia coli portadoras dos genes da toxina citoletal distensora isoladas de humanos, animais e alimentos. Dissertação (Mestrado em Genética e Biologia Molecular) – Campinas, Universidade Estadual de Campinas, 2007. 96p.

PERSING, D.H., TENOVER, F.C. Molecular microbiology: diagnostic principles and practice. Washington, ASM Press, 2004. 724p.

PHANTOUMATH, B., SITHIVONG, N., INSISIENGMAY, S., HIGA, N., TOMA, C., NAKASONE, N., IWANAGA, M. The incidence of Escherichia coli Having Pathogenic Genes for Diarrhea: A Study in the People’s Democratic Republic of Lao. The Journal Infectious Diseases 56: 103-106, 2003.

PINTO, C.O. Pesquisa de integron classe 1 e cassete gênico em Escherichia coli recuperadas de indivíduos sadios e infectados e em DNA de sedimento contaminado por arsênio. Dissertação (Mestrado em Genética) – Belo Horizonte, Universidade Federal de Minas Gerais, 2013. 88p.

RASKO, D.A., ROSOVITZ, M.J., MYERS, G.S.A., MONGODIN, E.F.,FRICKE, W.F., GAJER, P., JONATHAN, C., SEBAIHIA, M., THOMSON, N.R., CHAUDHURI, C., HENDERSON, I.R., SPERANDIO, V., JACQUES RAVEL. The pangenome structure of Escherichia coli: comparative genomic analysis of E. coli commensal and pathogenic isolates. Journal of Bacteriology 190: 6881- 6893, 2008.

REBELLO, R. C.L. Características biogenéticas e de resistência ao mercúrio em amostras de Escherichia coli isoladas de sistemas aquáticos no Rio de Janeiro. Dissertação (Mestrado) - Rio de Janeiro, Escola Nacional de Saúde Pública Sergio Arouca, 2012. 121p.

REGUA-MANGIA, A.H., BEZERRA, R.M., ESPARIS, C.M., TEIXEIRA, L.M. Escherichia coli enteroagregativa (EAEC): Filotipagem e resistência a antimicrobianos em um enteropatógeno emergente. Revista de Patologia Tropical 38 (1): 27-34, 2009b.

REGUA-MANGIA, A.H., GOMES, T.A., VIEIRA, M.A., IRINO, K., TEIXEIRA, L.M.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sithivong%20N%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Insisiengmay%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Higa%20N%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Toma%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Nakasone%20N%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Iwanaga%20M%22%5BAuthor%5D

http://jb.asm.org/search?author1=Jonathan+Crabtree&sortspec=date&submit=Submit

http://jb.asm.org/search?author1=Mohammed+Sebaihia&sortspec=date&submit=Submit

http://jb.asm.org/search?author1=Nicholas+R.+Thomson&sortspec=date&submit=Submit

http://jb.asm.org/search?author1=Roy+Chaudhuri&sortspec=date&submit=Submit

http://jb.asm.org/search?author1=Ian+R.+Henderson&sortspec=date&submit=Submit

http://jb.asm.org/search?author1=Vanessa+Sperandio&sortspec=date&submit=Submit

http://jb.asm.org/search?author1=Jacques+Ravel&sortspec=date&submit=Submit

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Regua-Mangia%20AH%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gomes%20TA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Vieira%20MA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Irino%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Teixeira%20LM%22%5BAuthor%5D

98

Molecular typing and virulence of enteroaggregative Escherichia coli strains isolated from children with and without diarrhea in Rio de Janeiro city, Brazil. Journal of Medicine Microbiology 58 (4): 414-22, 2009a.

REGUA-MANGIA, A.H., GOMES, T.A.T., ANDRADE, J.R.C., VIEIRA, M.A.M., GONZALEZ , A.G.M., ZAHNER, V., IRINO, K., TEIXEIRA, L.M. Genetics analysis of Escherichia coli strains carrying enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) markes, isolated from children in Rio de Janeiro city, Brazil. Brazilian Journal of Microbiology 34 (1): 38-41, 2003.

REGUA-MANGIA, A.H., GOMES, T.A.T., VIEIRA, M.A.M., ANDRADE, J.R.C., IRINO, K., TEIXEIRA, L.M. Frequency and characteristics of diarrhoeagenic Escherichia coli strains isolated from children with and without diarrhea in Rio de Janeiro, Brazil. Journal of infection 48 (2): 161-167, 2004.

REINTHALER, F.F., POSCH, J. FEIER, L.G., WÜST, G., HAAS, D., RUCKENBAUER, F., MASCHER, F., MARTH, E. Antibiotic resistance of E. coli in sewage and sludge. Water Research 37 (8): 1685-1.690, 2003.

RIBEIRO, D.A., NIEMANN, F.S., GATTI, M.S.V., LANNA, M.C.S., TSUJI, T., YANO, T. Putative new heat-stable cytotoxic and enterotoxic factors in culture supernatant of Escherichia coli isolated from drinking water. The Journal of Venomous Animals and Toxins including Tropical Diseases 17 (1): 103 – 107, 2011.

RIBOT E.M., FAIR M.A., GAUTOM R., CAMERON D.N., HUNTER S.B., SWAMINATHAN B. and BARRET T.J. Standardization of pulsedfield gel electrophoresis protocols for the subtyping of Escherichia coli O157:H7, Salmonella, and Shigella for

PulseNet. Foodborne Pathogens and Disease 3: 59 - 67, 2006.

RILEY, L.W., REMIS, R.S., HELGERSON, S.D., MCGEE, H.B., WELLS, J.G., DAVIS, B.R., HEBERT, R.J., OLCOTT, E.S., JOHNSON, L.M., HARGRETT, N.T., BLAKE, P. A., COHEN, M.L. Hemorrhagic colitis associated with a rare Escherichia coli serotype. New England Journal of Medicine 308: 681-685, 1983.

RIVERA, F.P., OCHOA, T.J, MAVES, R.C., BERNA, L. M., MEDINA, A.M., MEZA, R., BARLETTA, F., MERCADO, E., ECKER, L., GIL, A.I., HALL, E.R., HUICHO, L., LANATA, C.F. Genotypic and phenotypic characterization of enterotoxigenic Escherichia coli strains isolated from Peruvian children. Journal of Clinical Microbiology 48 (9): 3198 -3203, 2010.

ROBINS-BROWNE, R.M.; HARTLAND, E.L. Escherichia coli as a cause of diarrhea. Journal of Gastroenterology and Hepatology 17: 467-475, 2002.

RODAS, C., MAMANI, R., BLANCO, J., BLANCO, J.E., WIKLUND, G., SVENNERHOLM , A.M., SJÖLING, A., INIGUEZ, V. Enterotoxins, colonization factores, sertypes and antimicrobial resistance of enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) strains isolated from hopitalized children with diarrhea in Bolivia. Brazilian Journal Infection Diseases 15 (2): 132 - 137, 2011.

RODRIGUES, J., THOMAZINI, C.M., MORELLI, A., BATISTA, G.C.M. Reduced Etiological Role for Enteropathogenic Escherichia coli in Cases of Diarrhea in Brazilian

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Rivera%20FP%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20631096

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ochoa%20TJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20631096

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Maves%20RC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20631096

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Bernal%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20631096

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Medina%20AM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20631096

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Meza%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20631096

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Barletta%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20631096

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Mercado%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20631096

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ecker%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20631096

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Gil%20AI%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20631096

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Hall%20ER%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20631096

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Huicho%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20631096

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Lanata%20CF%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20631096



99

Infants. Journal of Clinical Microbiology 42 (1): 398 – 400, 2004.

SABRÁ, A. Escherichia coli subtypes EPEC, ETEC, EAEC, EHEC, EIEC, and DAEC in acute diarrhea. Jornal de Pediatria 77 (1): 5 - 7, 2002.

SACK, R.B., GORBACH, S.L., BANWELL, J.G., JACOBS, B., CHATTERIEE, B.D., MITRA, R.C. Enterotoxigenic Escherichia coli isolated from patients with severe cholera-like disease. Journal of Infectious Diseases 123 (4): 378-85, 1971.

SANTONA, S., DIAZ, N., FIORI, P.L., FRANCISCO, M., SIDAT, S., CAPPUCCINELLI, P., RAPPELLI, P. Genotypic and phenotypic features of enteropathogenic Escherichia coli isolated in industrialized and developing countries. The Journal of Infection in Developing Countries 7 (3): 214 – 219, 2013.

SANTOS, L.F., IRINO, K., VAZ, T.M.I., GUTH, B.E.C. Set of virulence genes and genetic relatedness of O113 : H21 Escherichia coli strains isolated from the animal reservoir and human infections in Brazil. Journal of Medical Microbiology 59: 634-640, 2010.

SAUCEDO, C. L., CERNA, J.F., VILLEGAS-SEPULVEDA, N., THOMPSON, R., VELAZQUEZ, F.R., TORRES, J.,TARR, P.I., ESTRADA-GARCÍA, T. Single Multiplex Polymerase Chain Reaction to Detect Diverse Loci Associeted With Diarreagenic Escherichia coli. Dispatches. Emerging Infectius Diseases 9 (1): 127-131, 2003.

SCALETSKY, I.C.A, SOUZA, T.B., ARANDA, K.R.S., OKEKE, I.N. Genetic elements associated with antimicrobial resistance in enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) from Brazil. BioMed Center Microbiology 10: 25, 2010. Disponível em: http://www.biomedcentral.com/1471-2180/10/25>Acesso em: 31/05/2013.

SCALETSKY, I.C.A., ARANDA, K.R.S., SOUZA, T.B., SILVA, N.P., MORAIS, M.B. Evidence of pathogenic subgroups among atypical enteropathogenic Escherichia coli strains. Journal of Clinical Microbiology 47 (11): 3756-3759, 2009.

SCAVIA, G., STAFFOLANI, M., FISICHELLA, S., STRIANO, G., COLLETTA, S., FERRI, G., ESCHER, M., MINELLI, F., CAPRIOLI, A. Enteroaggregative Escherichia coli associated with a foodborne outbreak of gastroenteritis. Journal of Medical Microbiology 57: 1141 - 1146, 2008.

SCHMIDT, H., HENSEL, M. Pathogenicity islands in bacterial pathogenesis. Clinical Microbiology Review 14 (1): 14-56, 2004.

SCHMIDT, H., KNOP, C., FRANKE, S., FRANKE, S., ALEKSIC, S., HEESEMANN, J., KARCH, H. Development of PCR for screening of enteroaggregative Escherichia coli. Journal of Clinical Microbiology 33 (3): 701-705, 1995.

SCHMIDT, M.A. LEEways: tales of EPEC, ATEC and EHEC. Celular Microbiology 12 (11): 1544-1552, 2010.

SHAHEEN, H.S., MESSIH, I.A.A., KLENA, J.D., MANSOUR, A., EL-WAKKEEL, Z., WIERZBA, T.F., SANDERS, J.W., KHALIL, S.B., ROCKABRAND, D.M., MONTEVILLE, M.R., ROZMAJZL, P.J., SVENNERHOLM, A.M., FRENCK, R.W. Phenotypic and Genotypic Analysis of Enterotoxigenic Escherichia coli in Samples Obtained from Egyptian Children Presenting to Referral Hospital. Journal of Clinical

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Cerna%20JF%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Villegas-Sepulveda%20N%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Thompson%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Velazquez%20FR%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Torres%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Tarr%20PI%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Estrada-Garc%C3%ADa%20T%22%5BAuthor%5D

http://www.biomedcentral.com/1471-2180/10/25

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Schmidt%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14726454

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Hensel%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14726454

100

Microbiology 47 (1): 189 - 197, 2009.

SHAHROKHI, N., BOUZARI, S., JAFARI, A. Comparison of virulence markes and antibiotic resistance in enterotoxigenic Escherichia coli isolated ten years apart in Tehran. The Journal of Infection in Developing Countries 5 (4): 248 – 254, 2011.

SIDHU, J.P.S, AHMED, W., HODGERS, L.,TOZE,S. Occurrence of Virulence Genes Associated with Diarrheagenic Pathotypes in Escherichia coli Isolates from Surface Water. Applied and Environmental Microbiology 79 (1): 328 – 335, 2013.

SILVA GAP. Fatores de risco e Manejo. Revista de Pediatria do Ceará 3 (1): 5-9, 2002.

SMITH, H. R., SCOTLAND , S., CHEASTY, T., WILLSHAW, G., ROWE, B. Enteropathogenic Escherichia coli infections in the United Kingdom. Revista de Microbiologia 27 (1): 45-49, 1996.

SOUSA, C.P. Escherichia coli as a specialized bacterial pathogen. Revista de Biologia e Ciências da Terra 6 (1): 341-352, 2006.

SOUSA, E.B. Aspectos Microbiológicos e Epidemiológicos da Doença Diarreica Aguda no Município de Juruti, Pará. Dissertação (Mestrado em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários) – Belém, Universidade Federal do Pará, 2010. 136p.

SOUZA, E.C., MARTINEZ, M.B., TADDEI, C.R., MUKAI, L., GILIO, A.E., RACZ, M.L., SILVA, L., EJZENBERG, B., OKAY, Y. Perfil etiológico das diarreias agudas de crianças atendidas em São Paulo. Revista de Pediatria 78 (1): 31-38, 2002.

SPANO, L.C., SADOVSKY, A.D., SEGUI, P.N., SAICK, K.W., KITAGAWA, S.M., PEREIRA, F.E., FAGUNDES-NETO, U., SCALETSKY, I.C. Age-specific prevalence of diffusely adherent Escherichia coli in Brazilian children with acute diarrhea. Journal Medicine Microbiology 57 (3): 359-63, 2008.

STARNBACH, M.AL., FALKOW, S., TOMPKINS, L.S. Species-specifc detection of Legionella pneumophila in water by DNA amplification and hybridization. Journal of Clinical Microbiology 27: 1257-1261, 1989.

STEPHAN, R., SCHUMACHER, S. Resistance patterns of non-O157 Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) strains isolated from animals, food and asymptomatic human carriers in Switzerland. Letters in Applied Microbiology 32: 114-117, 2001.

TALUKDAR, P.K., RAHMAN, M., RAHMAN, M. NABI, A., ISLAM, Z., HOQUE, M.M., ENDTZ, H.P., ISLAM, M.A. Antimicrobial Resistance, Virulence factors and genetic diversity of Escherichia coli isolates from Household water supply in Dhaka, Bangladesh. PLOS ONE 8 (4),2013.Disponível em: < http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0061090>Acessado em: 03/06/2013.

TAYLOR, D. N., ECHEVERRIA, P., SETHABUTR, O., PITARANGSI, C., LEKSOMBOON, U., BLACKLOW, N.R., ROWE,B., GROSS, R., CROSS, J. Clinical and microbiologic features of Shigella and enteroinvasive Escherichia coli infections detected by DNA frequência. Journal of Clinical Microbiology 26: 1362-1366, 1988.

http://www.google.com.br/url?sa=t&rct=j&q=J+Infect+Dev+Ctries&source=web&cd=1&cad=rja&ved=0CCoQFjAA&url=http%3A%2F%2Fwww.jidc.org%2F&ei=60GrUaurKYzV0gGSxYG4Bw&usg=AFQjCNEml-aIjMYQRWNtblnydgVJ7OPqbw&bvm=bv.47244034,d.dmQ

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Spano%20LC%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sadovsky%20AD%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Segui%20PN%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Saick%20KW%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kitagawa%20SM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Pereira%20FE%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Fagundes-Neto%20U%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Scaletsky%20IC%22%5BAuthor%5D

http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0061090

101

TENG, L.J., HSUEH, P.R., LIAW, S.J., HO, S.W., TSAI, J.C. Genetic Detection of Diarrheagenic Escherichia coli Isolated from Children with Sporadic Diarrhea. Journal of Microbiology and Immunology Infectious 37: 327-334, 2004.

TOLEDO, M.R.F., TRABULSI, L.R. Frequency of enteroinvase Escherichia coli in children with diarrhea and healthy controls, in São Paulo, SP, Brazil. Revista de Microbiologia 21: 1 – 4, 1990.

TOMA, C., LU, Y., HIGA, N., NAKASONE, N., CHINEN, I., BASCHKIER, A., RIVAS, M., IWANAGA, M. Multiplex PCR Assay for Identification of Human Diarrheagenic Escherichia coli. Journal of Clinical Microbiology 41 (6): 2669-2671, 2003.

TRABULSI, L.R., KELLER, R., GOMES, T.A.T. Typical and Atypical Enteropathogenic Escherichia coli. Synopsis. Emerging Infectious Diseases 8 (5): 508-513, 2002.

VAZ, T.M.I., IRINO, K., NISHIMURA, L.S., CERGOLE-NOVELLA, M.C., GUTH, B.E.C. Genetic heterogeneity of Shiga Toxin-producing Escherichia coli strains isolated in Sao Paulo, Brazil, from 1976 through 2003, as revealed by pulsed-field gel electrophoresis. Journal of Clinical Microbiology 44 (3): 798-804, 2006.

VENKATESAN, M.M., BUYSSE J.M., KOPECKO, D.J. Use of Shigella flexneri ipaC and ipaH sequences for the general identification of Shigella spp. and enteroinvasive Escherichia coli. Journal of Clinical Microbiology 27 (12): 2687-2691, 1989.

VIAL, P.A., ROBINS-BROWNE, R., LIOR, H., PRADO, V., KAPER, J.B., NATARO, J.P., MANEVAL, D., ELSAYED, A., LEVINE, M.M. Characterization of enteroadherent-aggregative Escherichia coli, a putative agent of diarrheal disease. Journal of Infectious Diseases 158 (1): 70-79, 1988.

VIDAL, J.E., CANIZÁLEZ-ROMÁN, A., GUTIÉRREZ-JIMÉNEZ. J., NAVARRO-GARCIA, F. Patogénesis molecular, epidemiologia y diagnóstico de Escherichia coli enteropatógena. Salud Pública de México 49 (5): 376-386, 2007.

VILA, J., VARGAS,M., CASALS, C., URASSA, H., MSHINDA, H., SCHELLEMBERG, D., GASCON, J. Antimicrobial resistance of diarrheagenic Escherichia coli isolated from children under the age of 5 years from Ifakara, Tanzânia. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 43 (12): 3022-3024, 1999.

VON SYDOW, A.C.M., COOGAN, D.G., MORENO, J.A., MELVILLE, A.M., BENITES, N.R. Ocorrência de fatores de virulência em estirpes de Escherichia coli isoladas de fezes de cães errantes. Arquivo do Instituto Biológico 73 (4): 401-407, 2006.

WANG, R.F., CAO,W.W., CERNIGLIA, C.E. A universal protocol for PCR detection of 13 species of foofborne pathogens in foods. Journal applied Microbiology 83: 727-736, 1997.

WERBER, D., KRAUSE, G., FRANK, C., FRUTH, A., FLIEGER, A., MIELKE, M., STARK, K. Outbreaks of virulent diarrheagenic Escherichia coli - are we in control? BioMed Center Medicine 10:11, 2012. Disponível em:< http://www.biomedcentral.com/1741-7015/10/11> Acesso em: 28/05/2013.

WINN Jr, W., ALLEN, S., JANDA, W., KONEMAN, E., PROCOP, G.,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Hsueh%20PR%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Liaw%20SJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ho%20SW%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Tsai%20JC%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Vial%20PA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Robins-Browne%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lior%20H%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Prado%20V%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kaper%20JB%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Nataro%20JP%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Maneval%20D%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Elsayed%20A%22%5BAuthor%5D


http://www.biomedcentral.com/1741-7015/10/11

102

SCHRECKENBERGER, P., WOODS, G. Koneman Diagnóstico Microbiológico: Texto e Atlas. Rio de Janeiro, Guanabara Koogan, 2008. 1488p.

WOLF, M.K. Occurrence, distribution, and associations of O and H serogroups, colonization factor antigens, and toxins of enterotoxigenic Escherichia coli. Clinical Microbiologic Review 10 (4): 569-84, 1997.

ZSCHOCK, H. P., HAMANN, B., WOLTER, W. Shiga-toxin-producing Escherichia coli in faeces of healthy dairy cows, sheep and goats: prevalence and virulence properties. Letters in Applied Microbiology 31: 203-208, 2000.

103

APÊNDICES

APÊNDICE 1: PREPARO DE SOLUÇÕES

1.1-Solução Tris 1M pH 8,0

Trizma-base (Bio-Rad) 121,1g

Água destilada 1000mL

Após a dissolução de 121,1g de Trizma-base em 800 mL de água bidestilada, o pH deverá

ser ajustado para 8,0 com solução de HCl (aproximadamente 50 mL) e o volume completado

com água bidestilada para 100 mL. A solução final após sua esterilização em autoclave a

121C por 15 minutos, deverá ser mantida a temperatura ambiente até o momento do uso.

1.2- Solução EDTA 0,5M pH 8,0

EDTA (Sigma) 93,06g

Água destilada 500mL

Após a dissolução de 93,06g de EDTA em 300 mL de água bidestilada, o pH deverá

ser ajustado para 8,0 com solução de NaOH (aproximadamente 10g) e o volume foi

completado com água bidestilada para 500 mL. A solução final após sua esterilização em

autoclave a 121C por 15 minutos, deverá ser mantida a temperatura ambiente até o momento

do uso.

1.3- Solução tampão Tris-EDTA (TE) – pH 8,0

Tris 1M pH8 (item 1.1) 10mL

EDTA 0,5M pH8 (item 1.2) 2mL

Água destilada q.s.p 1000mL

A solução deverá ser preparada no momento do uso.

1.4- Solução N-Lauryl-Sarcosine 10% (Sarcosyl )

Sarcosyl 10g

H2O q.s.p 100 mL

A solução deverá ser mantida em temperatura ambiente até o momento do uso.

104

1.5- Solução Dodecyl Sulfato de Sódio 20% (SDS)

SDS 20g

H2O q.s.p 100 mL

A solução deverá ser mantida em temperatura ambiente até o momento do uso.

1.6- Proteinase K 20mg/mL (Sigma)

Proteinase K (100mg) 0,02g

H2O destilada 1 mL

A solução deverá ser mantida a -70C até o momento do uso.

1.7- Solução de suspensão celular (SSC)

Tris 1M pH8,0 (item 1.1) 10mL

EDTA 0,5M pH8,0 (item 1.2) 20mL



1.8- Solução de lise celular

Tris 1M pH8,0 (item 1.1) 2,5mL

EDTA 0,5M pH8,0 (item 1.2) 5mL

Sarcosyl 10% (item 1.4) 5mL

Proteinase K 20mg/mL (item 1.6) 0,25mL



1.9- Solução tampão Tris-EDTA-Borato (TEB) – pH 8,0 (10x)

Trizma-base 108g

H3BO3 55g

Na2EDTA 8,4g

H2O destilada q.s.p 1000 mL

A solução depois de preparada deverá ser esterilizada em autoclave a 121C por 15

minutos, sendo mantida em temperatura ambiente até o momento do uso.

105

1.10- Solução tampão TEB – pH 8,0 (0,5x)

TEB – pH 8,0 (10x) (item 1.9) 100 mL

H2O MiliQ estéril 1900 mL


1.11- Solução de Digestão

Buffer 10X (10x) 200 mL

H2O MiliQ estéril 1750 mL

Enzima 50μ (50U por amostra)

106

APÊNDICE 2: PARECER DE APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA

107

APÊNDICE 3: Distribuição dos genes codificantes de fatores de virulência entre as E. coli

diarreiogênicas de origem humana e ambiental.

ORIGEM

Amostras ETEC

EPEC

EAEC EIEC STEC

lltt sstt eeaaee bbffppAA aaggggRR iippaaHH ssttxx--11 ssttxx--22

H U M A N A

815 HIV + - - - - - - - 121 PJ + - - - - - - - 157 PJ + - - - - - - - 174 PJ + - - - - - - - 849MC1 PJ + - - - - - - - 7271MC2 PJ + - - - - - - - 7549MC1 PJ + - - - - - - - 139 HIV - + - - - - - - 795 HIV - + - - - - - - 139 PJ - + - - - - - - 184 PJ - + - - - - - - 222(1) PJ - + - - - - - - 798MC2 PJ - + - - - - - - 887MC1 PJ - + - - - - - - 7551MC1 PJ - + - - - - - - 2078MC2 PJ + + - - - - - - 7561MC2 PJ + + - - - - - - 2076MC3 PJ + + - - - - - - 7275MC1 PJ + + - - - - - - 09 HIV - - + - - - - - 331 HIV - - + - - - - - 397 HIV - - + - - - - - 551 HIV - - + - - - - - 701 HIV - - + - - - - - 887 HIV - - + - - - - - 1322 HIV - - + - - - - - 106 PJ - - + - - - - - 166 PJ - - + - - - - - 794MC1 PJ - - + - - - - - 877MC1 PJ - - + - - - - - 1078MC1 PJ - - + - - - - - 2077MC1 PJ - - + - - - - - 2159MC1 PJ - - + - - - - - 7240MC3 PJ - - + - - - - - 7529MC1 PJ - - + - - - - - 857 HIV - - - - + - - - 2072MC1 PJ - - - - + - - - 2094MC2 PJ - - - - + - - - 2164MC1 PJ - - - - + - - - 2092MC1 PJ - - - - + - - - 7245MC2 PJ - - - - + - - - 615 HIV - - - - + - - - 705 HIV - - - - + - - - 795MC3 PJ - - - - + - - - 844 SS4 - - - - + - - - 1085MC2 PJ - - - - + - - - 2171MC1 PJ - - - - + - - - 7242MC3 PJ - - - - + - - - 7530MC3 PJ - - - - + - - - 7542MC2 PJ - - - - + - - - 7556MC3 PJ - - - - + - - - 7562MC1 PJ - - - - + - - - 1088MC4 PJ - - - - + - - - 74 HIV - - - - - + - - 358 HIV - - - - - + - - 556 HIV - - - - - + - - 849 HIV - - - - - + - -

108

Apêndice 3: Distribuição dos genes codificantes de fatores de virulência entre as E. coli

diarreiogênicas de origem humana e ambiental. (Continuação)

ORIGEM

H U M A N A

Amostras ETEC

EPEC

EAEC EIEC STEC

lltt sstt eeaaee bbffppAA aaggggRR iippaaHH ssttxx--11 ssttxx--22 962 HIV - - - - - + - - 1081 HIV - - - - - + - -

1276 HIV - - - - - + - - 1325 HIV - - - - - + - - 1364 HIV - - - - - + - -

537 HIV - - - - - + - - 792MC1 PJ - - - - - + - - 1033 HIV - - - - - - + -

7281MC1 PJ - - + - - - + +

AMBIENTAL

615 MU + - - - - - - - 743 MU - + - - - - - - 813(1) IG - - + + - - - - 770 IG - - + - - - - - 762 MU - - + - - - - - 784 IG - - - - + - - -

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE … DE OLIVEIRA... · À amiga Ana Judith Pires Garcia...

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