UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ PROGRAMA DE PÓS … · para ser cada dia melhor, pois bondade...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

FACULDADE DE FARMÁCIA, ODONTOLOGIA E ENFERMAGEM

DEPARTAMENTO DE FARMÁCIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

ANA GEORGINA OLIVEIRA PONTES

ESTUDO FARMACOGNÓSTICO DAS RAÍZES DE IPECA-DA-PRAIA (Pombalia calceolaria (L.) Paula-Souza): ASPECTOS BOTÂNICOS, QUÍMICOS E

FARMACOLÓGICOS

FORTALEZA

2015



FARMACOLÓGICOS

Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em Ciências

Farmacêuticas da Faculdade de Farmácia,

Odontologia e Enfermagem da Universidade

Federal do Ceará, como requisito parcial para

a obtenção do grau de Mestre em Ciências

Farmacêuticas. Área de concentração:

Biologia para a Saúde.

Orientadora: Profª. Dra. Mary Anne Medeiros

Bandeira

Co-orientadora: Profª. Dra. Nirla Romero

Rodrigues

FORTALEZA

2015

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Federal do Ceará Biblioteca de Ciências da Saúde

P858e Pontes, Ana Georgina Oliveira. Estudo farmacognóstico das raízes de ipeca-da-praia (Pombalia calceolaria (L.) Paula-Souza):

aspectos botânicos, químicos e farmacológicos. / Ana Georgina Oliveira Pontes. – 2015. 92 f.: il. color.

Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará; Centro de Ciências da Saúde; Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem; Departamento de Farmácia; Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas; Mestrado em Ciências Farmacêuticas, Fortaleza, 2015.

Área de Concentração: Biologia para a Saúde. Orientação: Profa. Dra. Mary Anne Medeiros Bandeira. Co-Orientação: Profa. Dra. Nirla Romero Rodrigues. 1. Raízes de Plantas. 2. Farmacognosia. 3. Inulina. I. Título. CDD 615.321



FARMACOLÓGICOS

Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em Ciências

Farmacêuticas da Faculdade de Farmácia,

Odontologia e Enfermagem da Universidade

Federal do Ceará, como requisito parcial para

a obtenção do grau de Mestre em Ciências

Farmacêuticas. Área de concentração:

Biologia para a Saúde.

Aprovada em: 14 / 12 / 2015

BANCA EXAMINADORA

__________________________________________________________ Profª. Drª. Mary Anne Medeiros Bandeira (Orientadora)

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

__________________________________________________________ Profª. Drª. Fabiana Pereira Soares

UNIVERSIDADE DE FORTALEZA

__________________________________________________________ Profª. Drª. Regina Claudia Matos Dourado

UNIVERSIDADE DE FORTALEZA

À minha família, em especial:

Ao meu querido pai, José Maria, pelo seu

exemplo de luta, de perseverança, de

dignidade e amor pela vida.

À minha querida mãe, Joaquina Vilmaci, que

com seu amor incondicional e sua força de

superação foi e é uma grande inspiração para

eu chegar até aqui.

AGRADECIMENTOS

À Deus, fonte inesgotável de luz, força e amor.

À Profª. Drª. Mary Anne Medeiros, pela orientação, dedicação, confiança e tantos

aprendizados ao longo desses bons anos de convivência entre nós e com as raízes de ipeca da

praia. Sua atitude acolhedora, paciente, persistente são exemplos de sabedoria de vida que

trarei comigo com carinho.

Ao meu esposo Daniel Costa nos diversos momentos presentes, na coleta do material vegetal

comigo ao sol a pino, de importância fundamental, na presença ao meu lado nos momentos

que muito precisei de uma força amiga, sincera e compreensiva.

À minha família, nas pessoas do meu irmão Daniel Pontes, minha mãe Joaquina Vilmaci e

meu pai, José Maria pelo apoio incondicional em todos os momentos.

À minha irmã Mariana pela compreensão dos meus momentos ausentes.

À Profª. Drª Nirla Rodrigues Romero, pela co-orientação, seu jeito autêntico, leve e agradável

na disponibilidade de auxiliar e contribuir com o enriquecimento desse trabalho sempre que

possível.

Ao Prof. Dr. Said Gonçalves da Cruz Fonseca, com sua sabedoria compartilhada, paciência de

ouvir tantas dúvidas e alegria de ensinar e contribuir de forma valorosa, além de ceder um

espaço do Laboratório de Farmacotécnica por todas as vezes necessárias na realização de

ensaios.

Ao Prof. Dr. Pedro Jorge Caldas Magalhães, que gentilmente me acolheu em seu laboratório e

contribuiu com sincera dedicação na obtenção dos resultados farmacológicos.

A Profª Drª. Judith Pessoa de Andrade Feitosa do Laboratório de Polímeros do Departamento

de Química e seus bolsistas Venícios e Natália Pires.

Profª. Drª. Arlete Aparecida Soares, do Departamento de Biologia – Anatomia Vegetal, por

sua contribuição valorosa nesse trabalho, a quem reconheço sincera dedicação.

Ao técnico do laboratório de Anatomia Vegetal do Departamento de Biologia, Robson de

Jesus Mendes, por seu imprescindível auxílio, assim como à Doutoranda Ana Lúcia Castelo

Branco do Laboratório de Anatomia Vegetal.

Aos doutorandos Franzé Batista e Terezinha Brito que tiveram muita paciência para me

ensinar e pela convivência agradável no LAFARMULI.

À mestranda Aparecida Josino (Cida) e ao Técnico do laboratório de Farmacotécnica,

Ederson Laurindo, pelo auxílio em diversos momentos.

Às colegas de pós-graduação Gabrieli da Penha Bezerra e Wellyda Rocha Aguiar pelo

companheirismo nessa jornada, que muitas vezes parece uma aventura, por vezes bem

desafiadoras e outras de agradáveis aprendizados, que é a pós-graduação.

À Karine e Érica bolsistas de iniciação científica do laboratório de Farmacognosia pelo

auxílio em diversos momentos.

À D. Lourdes pela agradável companhia em diversos momentos, dentre eles, na coleta das

raízes, e sua prontidão em auxiliar sempre que possível.

Aos servidores Dino e “Seu” Geo pela disponibilidade de me acompanhar em diversos

momentos à praia da Tabuba para proceder à coleta do material vegetal.

Aos amigos e familiares que me auxiliaram de uma forma direta ou indireta nessa jornada de

baixos e altos que é a pós-graduação.

Ao Centro Nordestino de Aplicação e Uso de Ressonância Magnética Nuclear -

CENAUREMN.

À Fundação Cearense de Apoio à Pesquisa e Desenvolvimento Científico, pela concessão da

bolsa acadêmica.

Procuro semear otimismo e plantar sementes

de paz e justiça. Digo o que penso, com

esperança. Penso no que faço, com fé. Faço o

que devo fazer, com amor. Eu me esforço

para ser cada dia melhor, pois bondade

também se aprende. Mesmo quando tudo

parece desabar cabe a mim decidir entre rir

ou chorar, ir ou ficar, desistir ou lutar; porque

descobri, no caminho incerto da vida, que o

mais importante é o decidir.

Cora Coralina

RESUMO

ESTUDO FARMACOGNÓSTICO DAS RAÍZES DE IPECA-DA-PRAIA (Pombalia

calceolaria (L.) Paula-Souza): ASPECTOS BOTÂNICOS, QUÍMICOS E

FARMACOLÓGICOS. Ana Georgina Oliveira Pontes. Orientadora: Profª. Drª. Mary Anne

Medeiros Bandeira. Dissertação de mestrado: Programa de Pós-graduação em Ciências

Farmacêuticas. Departamento de Farmácia. Universidade Federal do Ceará.

Pombalia calceolaria L., Violaceae, popularmente conhecida por ipeca-da-praia, ipeca-

branca, ipecacunha dos raizeiros é uma herbácea perene, predominante no sertão nordestino.

Embora não existam dados na literatura comprovando sua atividade farmacológica, por

décadas, suas raízes são preparadas na forma de decocto, lambedor e maceração, cujas

principais indicações populares são para tosse, expectoração, como vermífugo, antidiarréico e

para dentição. O presente estudo teve por objetivo realizar a caracterização farmacognóstica

das raízes de P. calceolaria nos aspectos botânicos, químicos e farmacológicos. A

importância da caracterização morfoanatômica está no fato de que não há registro em

literatura descrevendo o perfil botânico desta espécie vegetal. Assim, as raízes recém-

coletadas de P. calceolaria foram caracterizadas morfologicamente com vista desarmada e em

seguida realizada a caracterização anatômica através de secção histológica, reação

histoquímica, registro fotomicrográfico em campo de luz claro, onde foi evidenciado que a

raiz em estudo apresenta o xilema secundário oriundo do câmbio com dimorfismo no tamanho

dos vasos e floema secundário constituído de poucas camadas circundando o xilema. No

parênquima cortical foi visualizado e fotomicrografado, sob luz polarizada, a presença de

cristais de inulina. O estudo fitoquímico foi precedido por ensaios preliminares para a

obtenção da droga vegetal, onde foram obtidos as especificações de qualidade, como a

determinação do rendimento da droga vegetal, da umidade residual, do teor de cinzas totais,

seguida da prospecção fitoquímica que resultou majoritariamente em presença de saponinas,

açúcares redutores e esteróides. Em seguida, o extrato aquoso obtido por decocção foi

dividido em duas amostras, onde uma foi liofilizada e por meio da outra, foi obtido por

precipitação na presença de metanol, um polissacarídeo, com teor de 13,0% p/p, sendo este

submetido a análises por técnicas cromatográficas como CLAE e GPC, as quais indicaram a

presença de frutose e glicose, e o peso molecular de 4,0 x 10³ Da, respectivamente.

Posteriormente, após a obtenção de espectros uni- e bidimensionais de RMN de ¹H, ¹³C,

DEPT-135 e HSQC, a estrutura química do polissacarídeo foi identificada como sendo

inulina. Os testes farmacológicos foram realizados em traqueia isolada de rato tanto com o

polissacarídeo quanto com o extrato aquoso liofilizado das raízes de P. calceolaria (EALPC)

para avaliar a atividade miorrelaxante sobre a contratilidade do órgão. Após adição de CCh

1µM, para induzir contração sustentada no órgão isolado no sistema de cubas, em ensaio com

o polissacarídeo houve ausência de relaxamento significativo na contração sustentada. No

teste realizado com EALPC foi observado relaxamento da contração, o qual apresentou uma

redução efetiva da resposta contrátil do EALPC de aproximadamente 20% em relação ao

controle, caracterizando uma leve atividade broncodilatadora.

Palavras-chave: Pombalia calceolaria L. Raízes. Farmacognosia. Inulina.

ABSTRACT

PHARMACOGNOSTIC STUDY FROM IPECA-DA-PRAIA (Pombalia calceolaria (L.)

Paula-Souza) ROOTS: BOTANICAL, CHEMICAL AND PHARMACOLOGICAL

ASPECTS. Ana Georgina Oliveira Pontes. Orientadora: Profª. Drª. Mary Anne Medeiros

Bandeira. Dissertação de mestrado: Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas.

Departamento de Farmácia. Universidade Federal do Ceará.

Commonly known as “ipeca-da-praia”, “ipeca-branca” or “ipecacunha dos raizeiros”,

Pombalia calceolaria L., a perennial herb of the family Violaceae, is predominant throughout

the Northeast Brazilian drylands. Despite the absence of studies demonstrating its

pharmacological properties, P. calceolaria has for decades been used in traditional medicine

as expectorant, cough medicine, anthelmintic, antidiarrheal and teething relief, in the form of

decoction, syrup and maceration. The aim of this study was to draw a pharmacognostic profile

of the roots of P. calceolaria, including botanical, chemical and pharmacological aspects. The

importance of morphoanatomical is the fact that there is no record in the literature describing

the botanical profile of this plant species. Therefore, newly collected roots of P. calceolaria

were characterized morphologically with the naked eye. Then histological sections were

submitted to anatomical and histochemical study documented by non-polarized light

photomicrography. The root of P. calceolaria has a vascular cylinder with exarch structure,

i.e. the phloem develops outward and the xylem inward. Inulin crystals observed in the

cortical parenchyma were registered by polarized light photomicrography. In preliminary

assays preceding the phytochemical analysis, quality specifications were determined,

including the plant drug yield, residual moisture, total ashes, followed by a phytochemical

prospection which revealed a predominance of saponins, reducing sugars and steroids.

Subsequently, an aqueous extract produced by decoction was divided into two samples. One

of these was lyophilized, while the other was submitted to precipitation with methanol,

yielding a polysaccharide with a content of 13,0% w/w. On HPLC and GPC, fructose and

glucose were identified and the molecular weight was determined (4.0 x 10³ Da), respectively.

After obtaining the 1D and 2D NMR spectra ¹H, ¹³C, DEPT-135 and HSQC, the chemical

structure of the polysaccharide was identified as inulin. Pharmacological tests were performed

on isolated rat tracheal smooth muscle using both polysaccharide and lyophilizate in order to

evaluate the myorelaxant properties of the compound. In the polysaccharide test, when 1µM

CCh was added to induce sustained contraction in an isolated organ bath assay, no change in

contraction was observed. In the lyophilizate test, the contractile response was reduced by

~20% in relation to controls, indicating a mild bronchodilatory effect.

Key-words: Pombalia calceolaria L. Roots. Pharmacognosy. Inulin.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 – Primeiro ciclotídeo isolado - espécie Oldenlandia affins (Rubiaceae)................... 32

Figura 2 - Pombalia calceolaria em seu habitat natural....................................................... 32

Figura 3 - Pombalia calceolaria - A: Flor; B: Folha; C: Fruto; D: Sementes. .................... 32

Figura 4 – Hyco A, evidenciando os loops e a estrutura tridimensional.

Em destaque amarelo, as pontes dissulfeto............................................................................ 32

Figura 5 - Estrutura inespecífica da inulina......................................................................... 37

Figura 6 - Coleta das raízes de P. Calceolaria e registro fotográfico da exsicata depositado no

Herbário Prico Bezerra – UFC............................................................................................... 42

Figura 7 - Fluxograma de obtenção do liofilizado e do

polissacarídeo......................................................................................................................... 47

Figura 8 -. Amostras do polissacarídeo bruto com extrato aquoso remanescente, antes de secos

em concentrador a vácuo.......................................................................................................... 49

Figura 9 – Esquema de eluição de amostra com polímero em coluna cromatográfica de

permeação em gel..................................................................................................................... 51

Figura 10 - Representação esquemática do sistema de cubas isoladas e captação de

dados........................................................................................................................................ 53

Figura 11 – Amostras in natura das raízes de Pombalia calceolaria...................................... 56

Figura 12 – Secções transversais da raiz de P. calceolaria. A- G. A. Corte transversal, da

epiderme ao cilindro vascular. B. Secção à mão livre da raiz in vivo. C: Células do

parênquima cortical da raiz in vivo, sob luz polarizada. D e F. Secção após 72 horas de

imersão em álcool absoluto. E e G: Células do córtex da raiz após imersão em etanol absoluto,

evidenciando cristais de inulina sob luz polarizada. ............................................................... 58

Figura 13 – Gráfico da distribuição granulométrica da droga................................................. 60

Figura 14 – Caracterização macroquímica do polissacaarídeo. 1: Polissacarídeo ao qual foi

realizado teste macroquímico; 2: a) Polissacarídeo após adição de timol 10%; b)

Polissacarídeo após adição de alfa-naftal

10%......................................................................................................................................... 63

Figura 15 – Cromatograma obtido a partir de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência,

presente nas raízes de Pombalia calceolaria..

................................................................................................................................................. 63

Figura 16 – Espectro de RMN - ¹³C (125 MHz, DMSO-6) do polissacarídeo de P.

calceolaria.............................................................................................................................. 64

Figura 17 – Espectro de RMN - DEPT 135 (125 MHz, DMSO-6) do polissacarídeo de

Amostras in natura das raízes de P. calceolaria..................................................................... 64

Figura 18 - Espectro de RMN - ¹H (500 MHz, DMSO-6) do polissacarídeo de Amostras in

natura das raízes de P. calceolaria.......................................................................................... 66

Figura 19 - Espectro de RMN - HSQC (500 MHz, DMSO-6) do polissacarídeo da Amostras

in natura das raízes de P. calceolaria..................................................................................... 66

Figura 20 – A. Estrutura química prevista para a inulina das raízes de P. calceolaria; B. Estrutura química da sacarose................................................................................................. 67

Figura 21 – Curva de calibração dos padrões de pululana Shodex P-82................................ 68

Figura 22 - Cromatograma do polissacarídeo de P. calceolaria obtido por Cromatografia de

Permeação em Gel................................................................................................................. 69

Figura 23 – Curvas dos padrões de pululanas.......................................................................... 69

Figura 24 - Gráfico com valores médios para a contração submáxima de anéis de traqueia de

rato na presença de diferentes concentrações de polissacarídeo

(n=7)........................................................................................................................................ 70

Figura 25 - Traçado representativo do efeito de EALPC sobre a contração induzida por

CCh......................................................................................................................................... 71

Figura 26 - Gráfico com efeito do EALPC sobre a contração induzida por CCh em traqueia

isolada de rato........................................................................................................................ 72

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Classificação de tamises utilizados na análise granulométrica do pó da raiz de

Pombalia calceolaria.............................................................................................................. 45

Tabela 2 - Resultado do rendimento da droga veegtal e da umidade residual das raízes de P.

calceolaria.............................................................................................................................. 57

Tabela 3 - Resultados da análise granulométrica da droga vegetal........................................ 59

Tabela 4 - Perfil fitoquímico das raízes de P. calceolaria..................................................... 61

Tabela 5 - Resultado da solubilidade do polissacarídeo extraído das raízes de P. calceolaria.62

Tabela 6 - Dados de espectros de RMN 1H e RMN 13C da inulina de P. calceolaria versus

inulina da literatura................................................................................................................ 67

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AACT Academia Americana de Toxicologia

AAP Academia Americana de Pediatria

ANOVA Análise de variância

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

ATPase Adenosina trifosfatase

Ca Cálcio

CCD Cromatografia em camada delgada

CCE Curva concentração-efeito

CCh Carbacol

CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

COSY Homonuclear correlation spectroscopy

Da Daltons

DAE Diacilglicerol

DEPT-135 Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

DMF Dimetilformamida

DMSO Dimetilsulfóxido

EALPC Extrato aquoso liofilizado de Pombalia calceolaria

et al. ... e colaboradores

E.P.M. Erro padrão da média

FOS Fosfoligossacarídeo

GP Grau de polimerização

GPC Cromatografia de permeação em gel

HRB Hiperresponsividade brônquica

HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence

IP3 Inositol trifosfato

KCl Cloreto de potássio

LAFARMULI Laboratório de Farmacologia do Músculo Liso

NaNO3 Nitrato de Sódio

OMS Organização Mundial da Saúde

Mg Magnésio

MF Medicamento Fitoterápico

PLC Fosfolipase C

p/p Peso por peso

PTF Produto tradicional fitoterápico

p/v Peso por volume

RDC Resolução da diretoria colegiada

RE Resolução específica

RID Detector de índice de refração

RMN ¹H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio

RMN ¹³C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono-13

ROCC Canais de cálcio operados por receptor

SOCC Canais de cálcio operados por estoque

SUS Sistema Único de Saúde

TFA Ácido trifluoracético

UFC Universidade Federal do Ceará

v/v Volume por volume

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 21

1.1 O contexto do uso de plantas medicinais no Nordeste brasileiro ............................... 23

2 JUSTIFICATIVA ........................................................................................................... 25

3 OBJETIVOS ................................................................................................................... 27

3.1 OBJETIVO GERAL .................................................................................................... 27

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...................................................................................... 27

4 REFERENCIAL TEÓRICO .......................................................................................... 29

4.1 A família Violaceae e o gênero Pombalia ..................................................................... 29

4.2 Pombalia calceolaria L. ................................................................................................ 31

4.2.1 Distribuição geográfica, aspectos botânicos e farmacoquímicos ............................. 31

4.2.2 Aspectos etnofarmacológicos .................................................................................... 33

4.2.3 Toxicidade ................................................................................................................. 34

4.3 Inulina........................................................................................................................... 35

4.4 Estudo da atividade broncodilatadora ........................................................................ 37

4.4.1 Canais de cálcio e a contratura do músculo liso das vias aéreas ............................. 37

5 MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................... 42

5.1 Material ........................................................................................................................ 42

5.1.1 Material Botânico ...................................................................................................... 42

5.1.2 Animais ...................................................................................................................... 43

5.1.3 Solventes e reagentes ................................................................................................. 43

5.1.4 Composição das soluções ........................................................................................... 43

5.1.5 Equipamentos ............................................................................................................ 43

5.1.6 Outros materiais ........................................................................................................ 44

5.2 Métodos ........................................................................................................................ 44

5.2.1 Caracterização morfoanatômica das raízes de Pombalia calceolaria ...................... 44

5.2.2 Ensaios preliminares para caracterização dos parâmetros de qualidade da droga

vegetal ................................................................................................................................. 44

5.2.3 Trituração da droga vegetal ...................................................................................... 45

5.2.4 Determinação granulométrica da droga vegetal ...................................................... 46

5.2.5 Determinação do Teor de Cinzas Totais ................................................................... 45

5.2.6 Prospecção fitoquímica ............................................................................................. 46

5.2.7 Obtenção do extrato aquoso liofilizado e do polissacarídeo .................................... 46

5.2.8 Testes de solubilidade ............................................................................................... 49

5.2.9 Caracterização macroquímica do polissacarídeo ..................................................... 50

5.2.10 Hidrólise e análise por CLAE ................................................................................. 50

5.2.11 Análise por Ressonância Magnética Nuclear (RMN)............................................. 50

4.2.12 Determinação da massa molar por Cromatografia de permeação em gel (GPC) . 51

5.2.13 Protocolo experimental para avaliação do potencial miorrelaxante ..................... 52

5.3 Análise estatística ......................................................................................................... 54

6 RESULTADOS ............................................................................................................... 56

6.1 Análises morfoanatômicas das raízes de Pombalia calceolaria L. .............................. 56

6.1.1 Descrição macroscópica ............................................................................................ 56

6.1.2 Descrição microscópica ............................................................................................. 57

6.2 Operações de secagem .................................................................................................. 57

6.3 Determinação granulométrica ..................................................................................... 59

6.4 Determinação do Teor de Cinzas Totais ..................................................................... 60

6.5 Prospecção fitoquímica ................................................................................................ 60

6.6 Determinação do teor do liofilizado e do polissacarídeo obtidos ................................ 62

6.7 Testes de solubilidade ................................................................................................... 62

6.8 Caracterização macroquímica do polissacarídeo ........................................................ 62

6.9 Análise química do polissacarídeo em CLAE ............................................................. 63

6.10 Análise química do polissacarídeo por RMN ............................................................ 64

6.11 Análise química do polissacarídeo em CPG .............................................................. 68

6.12 Efeito da adição in vitro do polissacarídeo na contração induzida por CCh............ 70

6.13 Efeito da adição in vitro do EALPC na contração induzida por CCh ...................... 71

7 DISCUSSÃO ................................................................................................................... 74

8 CONCLUSÕES ............................................................................................................... 81

REFERÊNCIAS ................................................................................................................. 84

ANEXO .............................................................................................................................. 93

INTRODUÇÃO

21

1 INTRODUÇÃO

O uso de plantas medicinais pelo ser humano é tão antigo quanto à origem das

civilizações, sendo uma prática encontrada em todas as populações e em todos os grupos

étnicos conhecidos. No início dos tempos, a fitoterapia representava a principal forma

terapêutica conhecida, sendo que a partir dela foram descobertos diversos medicamentos

usados na medicina tradicional (MARTINS, 2000), e todas as informações referentes ao

conhecimento oriundo da utilização de plantas medicinais foram transmitidas às gerações

posteriores, que as compilou e documentou através da escrita.

A utilização da fitoterapia vem se expandindo em todo o mundo sendo uma

conseqüência, dentre outros fatores, do alto custo dos medicamentos industrializados e da

falta de uma assistência médica e farmacêutica eficazes, principalmente no sistema público de

saúde dos países em desenvolvimento. No entanto, o crescente consumo de medicamentos à

base de plantas em todo o mundo levanta uma preocupação sobre o uso racional do

fitoterápico. A Organização Mundial da Saúde (OMS) reconheceu o risco potencial de uso

descontrolado de fitoterápicos e de plantas medicinais em conjunto com outros medicamentos

e emetiu em 2004 a "Guide lines on safety monitoring of herbal medicines in

pharmacovigilance systems" que, em tradução livre, trata-se das diretrizes sobre

monitoramento de segurança de medicamentos à base de plantas em sistema de

farmacovigilância (MAZZARI; PRIETO, 2014).

Em países desenvolvidos, como o Reino Unido, aproximadamente 50% da

população tem utilizado plantas medicinais pelo menos uma vez na vida e,

surpreendentemente, quase 100% dos pacientes HIV positivos nesse país admite o uso de

plantas medicinais (HOMAR, 2005). Em países em desenvolvimento, a OMS estimou que 65-

80% da população confia em plantas medicinais como a primeira fonte de tratamento. Estas

estatísticas estão de acordo com a realidade brasileira, onde 66% da população não tem acesso

a medicamentos industrializados (MAZZARI; PRIETO, 2014; TROJAN-ROGRIGUES et al.,

2012).

A Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) está em fase de mudança

no que diz respeito à regulação das plantas medicinais no Brasil e desde sua criação em 1999,

muitos avanços tem sido realizados a fim de controlar e garantir a eficácia e segurança do uso

medicinal de produtos de origem vegetal (BALBINO; DIAS, 2010). Nesse sentido, segundo

ANVISA (2015), a tradicionalidade de uso é uma forma de comprovação de segurança e

efetividade de fitoterápicos permitida no Brasil desde a publicação da RDC nº17/2000, que foi

22

revogada pela RDC nº48/2004, que por sua vez foi revogada pela RDC nº14/2010, todas

referentes ao registro de medicamentos fitoterápicos. Em todas essas normas era possível

utilizar quatro formas de comprovação de segurança e eficácia de fitoterápicos: por meio de

estudos não-clínicos e clínicos, por dados de literatura, por registro simplificado ou por

tradicionalidade. Porém, a população não tinha a informação sobre qual foi a forma utilizada

para comprovação de segurança e eficácia quando o produto era registrado. A RDC nº14/2010

foi revogada para a publicação da RDC nº26/2014 que separa os fitoterápicos em duas

classes: medicamento fitoterápico (MF) e produto tradicional fitoterápico (PTF), traz o

conceito de PTF, tendo a demonstração do tempo de uso por meio de literatura técnico-

científica como a principal forma de comprovação de segurança e efetividade. Os requisitos

para comprovar a tradicionalidade permanecem os mesmos preconizados pela ANVISA desde

2000 na RDC nº17.

Os requisitos básicos para o uso correto de uma planta medicinal ou um

fitoterápico são o controle de qualidade, a segurança e a eficácia. Para isso são necessários

anos de dedicação para: proceder à identificação botânica correta da espécie em estudo e os

aspectos agronômicos que a circundam; preparar o extrato adequado; identificar os

marcadores ativos e/ou analíticos, ou seja, os compostos presentes em maior quantidade que

podem ou não ter correlação com o princípio ativo; isolar e elucidar quimicamente os mesmos

para ser possível, então, realizar estudos farmacológico e toxicológico que comprovem sua

segurança e eficácia (SIMÕES et al., 2003).

No Brasil, em 2006, foi publicada a Política Nacional de Práticas Integrativas e

Complementares no Sistema único de Saúde (SUS), que visa ampliar as opções terapêuticas

oferecidas aos usuários do SUS, com garantia de acesso a plantas medicinais, fitoterápicos e

outros serviços relacionados, com segurança, eficácia e qualidade (BRASIL, 2006). Além

disso, há no país um enorme potencial a ser explorado na área dos fitoterápicos devido a sua

grande biodiversidade, que abrange uma imensa quantidade de espécies endêmicas, dentre

elas, aquelas que são morfologicamente similares, sendo motivo de uso incorreto no meio

popular e que põe em risco a saúde de muitos pacientes. Dessa forma, é premente o

desenvolvimento da pesquisa científica a fim de elucidar, comprovar e racionalizar o uso de

plantas medicinais e seus derivados (SILVA, 2009), através do desenvolvimento e validação

de métodos analíticos para o controle de qualidade das drogas vegetais e dos produtos

acabados.

23

1.1 O contexto do uso de plantas medicinais no Nordeste brasileiro

O nordeste brasileiro é constituído por três biomas, sendo eles, Caatinga

(predominante), Cerrado e Mata Atlântica e dentro dos mesmos há regiões chamadas

“ecótonos” que se caracterizam por áreas de transição ambiental, ou seja, pode haver em uma

mesma região espécies vegetais características da Caatinga, do Cerrado e da Mata Atlântica.

Esta característica é o que define a ampla biodiversidade desta região brasileira.

Muitos pesquisadores tem despertado o interesse de estudar a rica flora dessa

região na busca de conhecer as principais plantas com propriedades medicinais, de acordo

com o uso popular de plantas medicinais (CARTAXO; SOUZA; ALBUQUERQUE, 2010).

Muitas dessas plantas já foram ou continuam sendo objetos de estudo, tais como,

Myracrodruon urundeuva Allemão (BANDEIRA, 2002), Hymenaea courbaril

L.(BEZERRA,2013), Anadenanthera columbrina (Vell.) Brenan, Amburana cearensis A. C.

Smith (LEAL,2006), Aloe Vera (L.) Burm (LORENZI; MATOS, 2008; MORAIS et al.,

2005), entre outras. Enquanto muitas outras continuam sendo largamente usadas pela

comunidade, sem, no entanto, ter havido nenhum estudo que indicasse aquele uso

comprovado cientificamente, como é o caso da espécie Pombalia calceolaria.

Sendo a região nordestina uma das mais desassistidas do ponto de vista sócio-

econômico do Brasil, a falta de acesso a profissionais de saúde faz com que a comunidade,

principalmente das regiões mais afastadas dos centros urbanos, tenha como único recurso para

o tratamento de saúde, o uso empírico das plantas medicinais desta região. Assim, o

conhecimento popular sobre plantas medicinais passado oralmente através de gerações e que

muitas vezes é a fonte primária da maioria das pesquisas científicas com espécies vegetais, é o

grande legado da população local.

Nesse contexto, o presente estudo farmacognóstico das raízes de Pombalia

calceolaria L. (ipeca-da-praia), Violaceae, visa contribuir, além dos aspectos botânicos,

químicos e farmacológicos, com dados que possibilitem a diferenciação farmacognóstica

entre esta espécie e outra espécie também conhecida como ipeca, pepaconha, papaconha e

ipecacuanha, Psychotria ipecacuanha Stokes, Rubiaceae, para que haja o uso seguro de

ambas.

24

JUSTIFICATIVA

25

2 JUSTIFICATIVA

A Pombalia calceolaria é extensamente conhecida e utilizada popularmente,

principalmente, no Nordeste brasileiro. O conhecimento tradicional do uso das raízes desta

espécie medicinal repassado de geração a geração ainda não foi tópico de estudos científicos

que comprovassem sua eficácia e segurança terapêuticas. Uma vez que a referida espécie é

comumente confundida com a ipeca verdadeira (Psychotria ipecacuanha), revela-se de grande

importância o seu estudo farmacognóstico.

É válido ressaltar que em estudos anteriores (PONTES, 2012), as raízes de P.

calceolaria foram submetidas a várias purificações dos extratos alcoólicos e acetato de etila,

obtendo-se frações de baixo rendimento e com aspecto caramelizado de difícil purificação.

Procedeu-se, então, à decocção das raízes, onde se detectou a presença de açúcar redutor, o

que direcionou para a obtenção, neste extrato, de alto teor de um polissacarídeo. Esta

descoberta despertou a necessidade do desenvolvimento de uma metodologia que possibilite

identificar sua composição química e investigar suas propriedades farmacológicas.

Nesse contexto, tendo como base o uso tradicional de P. calceolaria nas formas

de chá e lambedor com indicação broncodilatadora foi importante observar esta eficácia no

referido extrato aquoso. Por ser uma espécie de ocorrência predominantemente litorânea –

principalmente no Nordeste e em parte do Sudeste – de fácil acesso, merece maiores

investimentos a fim de validar e racionalizar seu uso como planta medicinal de acordo com as

diretrizes da Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos.

Assim, a realização do presente trabalho se propõe a contribuir com a validação

científica das propriedades farmacoquímicas e farmacognósticas desta espécie vegetal.

26

OBJETIVOS

27

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Realizar o estudo farmacognóstico das raízes de Pombalia calceolaria (L.)

Schulze et Menz (ipeca-da-praia) com vista aos seus aspectos botânicos, químicos e

farmacológicos.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

- Realizar a caracterização morfoanatômica das raízes de P. calceolaria;

- Determinar parâmetros de qualidade para a droga vegetal a partir das raízes frescas de P.

calceolaria;

- Avaliar preliminarmente a constituição química e os parâmetros físico-químicos do

polissacarídeo extraído das raízes de P. calceolaria;

- Realizar a identificação estrutural do polissacarídeo por espectrometria uni- e

bidimensionais de ressonância magnética nuclear (RMN);

- Avaliar o potencial miorrelaxante do extrato aquoso liofilizado e do polissacarídeo extraído

das raízes de P. calceolaria sobre a contratilidade do músculo liso traqueal de ratos.

28

REFERENCIAL TEÓRICO

29

4 REFERENCIAL TEÓRICO

4.1 A família Violaceae e o gênero Pombalia

A família Violaceae Batsch está constituída de 21 gêneros e aproximadamente

800 espécies, das quais 70 são nativas do Brasil. Além disso, a maior diversidade genérica de

Violaceae está na América Latina, onde ocorrem 14 dos 21 gêneros, sendo os mais

representativos primeiramente, o gênero Viola, predominantemente herbáceo, seguido do

Rinorea e Pombalia (SOUZA, 2009).

Descobertas tem indicado que a importância da família Violaceae do ponto de

vista farmacológico é potencialmente muito mais expressiva. Estudos tem demonstrado que as

plantas dessa família são ricas em um grupo especial de proteínas circulares, chamadas

ciclotídeos cuja função natural parece ser parte do sistema de defesa das plantas. O primeiro

ciclotídeo foi isolado da espécie Oldenlandia affinis, o qual apresenta a estrutura mostrada na

Figura 1. Resumidamente, a estrutura desse peptídeo compreende um anel formado por duas

pontes dissulfeto (I-IV e V-II) e uma terceira ponte de dissulfeto (III-VI) transpassando

ambas. Todo esse arranjo promove uma conformação que está associada a existência de

folhas-β, 6 loops e dobras (PINTO, 2013). Embora isto possa parecer um motivo estrutural

improvável, é, na verdade, comum em uma grande variedade de proteínas (CRAIK, 2010).

Estas proteínas possuem uma vasta gama de atividades biológicas, incluindo

citotóxicas, sendo um potente agente anti-cancerígeno, anti-HIV, inseticida e antimicrobiano,

conferindo-lhes um potencial interessantíssimo para pesquisas farmacêuticas e agroquímicas

(TRABI et al., 2004; CHEN et al., 2005; HALLOCK et al., 2005; JENNINGS et al., 2004).

Até o momento, sabe-se que aproximadamente dois terços das sequências já publicadas de

ciclotídeos são derivados de espécies de Violaceae (TRABI et al., 2004; SIMONSEN et al.,

2005; BROUSSALIS et al., 2001). Tais proteínas são interessantes, não apenas sob o ponto de

vista comercial, mas também científico, tendo Simonsen et al., (2005) referido que elas

representam uma ferramenta quimiotaxonômica bastante conveniente para a classificação da

família.

No ano de 2014, o gênero desta espécie passou por atualização, uma vez que

anteriormente era conhecido por Hybanthus, o qual, a partir de estudo realizado por Paula-

Souza; Ballard (2014) foi restabelecido como Pombalia Vand. pois descobriu-se que é a mais

antiga designação genérica para a predominante linhagem polifilética sul americana de

Hybanthus.

30

A Figura 1 ilustra em “A” as seis cisteínas conservadas, indicadas em negrito

(números romanos), e as ligações dissulfeto (I-IV, V-II, III-VI) mostradas pelo cruzamento

das linhas. O início do peptídeo é indicado pela seta (G1). E em “B” o diagrama de fita. A

estrutura cíclica (CCK) é caracterizada por três pontes de dissulfeto mostrados na

representação (em cinza) e uma pequena folha-β antiparalelo (setas).

O gênero Pombalia (Violaceae) compreende mais de 100 espécies que são

distribuídas nas regiões tropicais e subtropicais do novo e do velho mundo. A maioria é

concentrada na América Latina com aproximadamente 70 espécies (SEO, 2009). Dentre os

países da América do Sul sua predominância está na Argentina, no Uruguai, no Paraguai e no

Brasil (SEO; SANSO; XIFREDA, 2011).

Fonte: Pinto, 2013

Figura 1: Primeiro ciclotídeo isolado, da espécie Oldenlandia affinis (Rubiaceae).

31

Em estudo realizado por Seo, Sanso; Xifreda (2011) foram caracterizadas

microestruturas das superfícies das folhas e margens de algumas espécies de Pombalia

provenientes da América do Sul usando a microscopia de varredura eletrônica, com o objetivo

de verificar se é possível determinar se esses caracteres possam ser utilizados para distinguir

os táxons ou grupos de táxons. E o que foi revelado por meio desta técnica foi que as margens

das folhas variam de acordo com a presença ou ausência de alguns tricomas e papilas. O

registro dessas diferenças na micromorfologia foliar forneceu características úteis na

diferenciação de espécies e grupos de espécies do gênero Pombalia.

4.2 Pombalia calceolaria L.

4.2.1 Distribuição geográfica, aspectos botânicos e farmacoquímicos

A Pombalia calceolaria (Figura 2) caracteriza-se como uma erva rasteira, cuja

raiz apresenta-se enrugada e tortuosa com casca espessa e pálida (LORENZI; MATOS, 2002),

onde, no Brasil, é predominante nas regiões costeiras e arenosas do Nordeste brasileiro, sendo

nativas do Maranhão até São Paulo. É uma herbácea perene, pouco ramificada, inteiramente

pubescente, de 10 a 30 cm de altura (LORENZI; MATOS, 2008). Caracteriza-se pela

presença de folhas elípticas, alternadas, pecioladas, de margens denteadas, 2-4 cm de

comprimento; flor branca com uma única pétala grande que se dilata em forma de bandeirola,

revirando-se para fora; os frutos são cápsulas oblongas e deiscentes contendo muitas sementes

escuras, conforme mostrado na Figura 3 (LORENZI; MATOS, 2002; MATOS, 2007).

Em estudo realizado por Seo; Sanso; Xifreda (2011), os autores, através de

fotomicrografia, registraram as características micromorfológicas das folhas de Pombalia

calceolaria, através de microscopia de varredura eletrônica, onde constatou-se a presença de

densa pelagem em ambas as faces e de margem denteada com presença de glândulas globosas

ou ovóides, características estas importantes para distinguir essa espécie de outras espécies do

gênero Pombalia.

Embora seja uma das plantas de uso muito antigo na medicina popular nordestina,

ainda não foi submetida a estudos de validação suficientes. Na literatura, dados a respeito de

seus constituintes químicos ou de suas propriedades farmacológicas são quase inexistentes.

Beauvisage (1889) indicou a presença de inulina nas raízes de P. calceolaria, Leal et al.

(2000) demonstraram a presença de cumarina em seu extrato e leve atividade

broncodilatadora, provavelmente compatível com seu uso popular, e Pinto (2013) isolou

ciclotídeos a partir dos extratos etanólicos das folhas, caules e sementes de P. calceolaria.

Neste último estudo as sementes da referida espécie destacaram-se pela maior diversidade

32

peptídica, de onde foi possível isolar e elucidar a estrutura de um ciclotídeo denominado Hyco

A (Figura 4).

Fonte: Autoria própria

Figura 2 - Pombalia calceolaria em seu habitat natural.


Figura 3 - Pombalia calceolaria - A: Flor; B: Folha; C: Fruto; D: Sementes.

Fonte: PINTO, 2013

Figura 4 - Hyco A, evidenciando os loops e a estrutura tridimensional.

Em destaque amarelo, as pontes dissulfeto.

33

4.2.2 Aspectos etnofarmacológicos

Em estudo realizado no Ceará, ficou demonstrada a alta frequência do uso dessa

planta em fitoterapia, incluindo a utilização pelos índios Tapebas (MORAIS et al., 2005). É

rara a mãe cearense que não tenha mantido na água de beber das crianças um pedaço dessa

raiz, como prática de medicina caseira para tratamento preventivo ou curativo de bronquite,

tosse rouca, “gripe velha”, diarreia e dos “males da dentição” (MATOS, 2007). Melhor

explicando esta última indicação, em um glossário de termos usados na medicina popular do

Ceará, a raiz de P. calceolaria encontra-se registrada como “remédio para nascer dente em

criança”, ou seja, ao chá da raiz é atribuída, popularmente, influência benéfica sobre a

odontogênese, evitando suas complicações (MATOS, 2002).

Segundo Matos (2007), as raízes de P. calceolaria são coletadas, em quantidades

relativamente grandes, na vegetação de dunas e preparadas para o mercado de ervas em forma

de pequenos feixes, sendo motivo de amplo comércio, vendidas em bancas de raizeiros como

raiz de pepaconha. Não é incomum a população indicar como remédio caseiro para expectorar

o cozimento das raízes de P. calceolaria preparado em mistura com folhas de malvarisco

(Plectanthus amboinicus), courama-branca ou courama comum (Kalanchoe crenata) e

cebola-branca (Allium ascalonicum).

A grande procura pela espécie das farmacopeias, Psychotria ipecacuanha,

denominada popularmente de ipeca, ipecacuanha, fez com que também fossem

comercializadas as falsas ipecas, que possuem propriedades semelhantes à P. ipecacuanha, e

que, segundo Gomes (2007), tais propriedades se devem à presença de emetina, porém com o

teor bem menor que na ipeca verdadeira. As principais espécies apontadas são: Richardia

brasiliensis Gomes (poaia-branca) e Richardia rosea St. Hil (poaia do campo ou rosa), da

família Rubiaceae; Pombalia calceolaria L., da família Violaceae; e Polygala angulata DC,

da família Polygalaceae.

Importante ressaltar que enquanto Gomes (2007) relata a presença de emetina em

baixo teor em P. calceolaria, como citado anteriormente, Matos (2007) relata que embora se

desconheça a presença de emetina, esta espécie de ipecacuanha tem sido indicada, em

medicina popular, também para o tratamento da amebíase, provavelmente por ser confundida

com a Psychotria ipecacuanha.

Em estudo realizado por Chaves (2008), na Paraíba, intitulado “Lambedor: um

conhecimento popular em abordagem científica”, a raiz de P. calceolaria apresentou uma

frequência de 18 citações frente a 22 raizeiros entrevistados. A planta é empregada na

medicina popular por grande número de pessoas, distribuído em várias classes sociais.

34

Pesquisas etnofarmacológicas procedidas nos estados nordestinos pelos autores

Agra et al. (2007), Albuquerque et al. (2007) e Cartaxo et al. (2010), principalmente no Ceará,

Paraíba, Pernambuco, Alagoas, Sergipe e Bahia, em coleta de dados quanto ao uso popular de

plantas medicinais, registraram em todas elas a presença do uso popular de P. calceolaria. O

objeto de pesquisa dos respectivos estudos era estabelecer “qual o conhecimento popular a

respeito das plantas medicinais, quais as plantas mais usadas na comunidade e como se dava

seu uso”. É válido salientar que de todas as espécies citadas nos três estudos, a Pombalia

calceolaria foi sempre mencionada, porém sua importância relativa (IR) era baixa.

Esse parâmetro de avaliação (IR) trata-se de um método quantitativo que

demonstra a importância de uma espécie baseada em sua versatilidade, ou seja, a espécie é

analisada baseada no número de propriedades medicinais dadas pelos informantes. O valor

máximo do RI é 2. Esta técnica presume que uma espécie é mais importante, ao apresentar um

grande número de propriedades, independente do número de pessoas que citam sua utilização

(CARTAXO et al., 2010) . Portanto, em ambos os estudos, o IR foi abaixo de 1, significando

que esta espécie apresenta pequena diversidade de propriedades medicinais atribuídas a ela,

mesmo que tenha havido altos índices de citações.

4.2.3 Toxicidade

Embora pesquisas envolvendo a espécie P. calceolaria sejam praticamente

escassas na literatura e em fontes primárias, como artigos científicos, em estudo recente,

publicado em revista científica, constatou-se que a presente espécie vegetal apresenta

potencial tóxico.

Carvalho et al. (2014) verificaram em estudo realizado em dois municípios dos

estados de Piauí e Pernambuco, no Nordeste brasileiro, que P. calceolaria em seu período de

frutificação, apresentou elevado grau de toxicidade, levando os animais que ingeriram suas

partes aéreas a um severo quadro neurológico reversível que poderia levar ao óbito,

dependendo da quantidade e frequência da ingestão. Nesta pesquisa, o quadro clínico da

neuropatia foi observado espontaneamente em relatos de muitos fazendeiros e,

experimentalmente, através da administração da planta fresca com frutos, em duas doses

diárias de 40 g/kg/peso corporal. Evidenciou-se assim, que a toxicidade está associada

exclusivamente à ingestão dos frutos, uma vez que a ingestão das folhas sem os frutos não

havia a ocorrência de nenhum quadro clínico com os animais.

Embora a parte da planta usada popularmente seja a raiz, e esta, por sua vez, ao

longo dos anos de seu uso tradicional não apresentou relatos de toxicidade, e que a pesquisa

35

científica está direcionada para identificar suas propriedades farmacológicas, é importante

essa informação do elevado grau de toxicidade de seus frutos, para contribuir com o uso

medicinal racional dessa espécie.

4.3 Inulina

A inulina é um polissacarídeo de reserva natural derivado de vegetais e

amplamente distribuída em uma variedade de plantas pertencentes às famílias Liliaceae,

Asteraceae, Campanulaceae, Violaceae entre outras (APOLINÁRIO et al., 2014;

OLIVEIRA; AKISUE, 2009). Está presente em mais de 30000 espécies, em particular nas

raízes. Dentre as espécies mais conhecidas ricas em inulina estão: tubérculos de Helianthus

tuberosus (alcachofra de Jerusalém), Cichorium intybus (chicória) e Smallanthus sonchifolius

(Yacon).

Trata-se de uma mistura de oligo- e/ou polissacarídeos compostos por unidades de

frutose com configuração β de um carbono anomérico, o que faz com que frutano do tipo

inulina resista a hidrólises por enzimas digestivas do intestino humano que tem uma

especificidade para ligações α-glicosídicas. Por essas razões, esses compostos tem sido

classificados como oligossacarídeos não-digeríveis (APOLINÁRIO et al., 2014;

ROBERFROID, 2002). A inulina é composta por polímeros de frutose lineares ou

ramificados com grau de polimerização (GP) variando de 2-100, geralmente com uma

unidade terminal de glicose ligada através de ligações glicosídicas β(2→1), conforme

mostrado na Figura 5 (JUDPRASONG et al., 2011; LI et al., 2015). A oligofrutose e/ou

oligossacarídeos são termos sinônimos utilizados para denominar frutanos do tipo inulina com

GP inferior a 10, enquanto que inulina com GP superior a 10 é definida como polissacarídeo

(SAAD, 2006).

O GP da inulina é espécie-dependente e também terá correlação com o estágio de

desenvolvimento da planta, o tempo de colheita, da duração e das condições de

armazenamento pós-colheita, uma vez que pode haver, na espécie vegetal, a presença de

endo-inulinazes capazes de hidrolisar a inulina antes de sua extração. Além disso, no processo

extrativo, o tempo de fervura, o pH e a polidispersão podem influenciar tanto no GP, quanto

nas propriedades físico-químicas finais da inulina obtida (KRUGER, 2002; MENSINK,

2015).

Cinco tipos de frutanos, com diferentes estruturas, já foram descritos em plantas

superiores, sendo a inulina o tipo de frutano mais conhecido e estudado. O eixo central da

estrutura da inulina é relativamente flexível quando comparado com outros polissacarídeos,

36

uma vez que em sua cadeia central não há a presença de anéis de açúcar (estruturas

aromáticas). Isso, combinado com uma temperatura de transição vítrea elevada faz com que a

inulina seja um estabilizador adequado das proteínas em estado seco para ambas as

aplicações, alimentares e farmacêuticas (MENSINK, 2015).

Na indústria de alimentos é amplamente aplicada e tem sido usada como

edulcorantes de baixo teor calórico, para formação de géis, para o aumento da viscosidade,

para melhorar as propriedades organolépticas dos alimentos, entre outras aplicações.

Entretanto, é usada principalmente como substituto do açúcar e da gordura em produtos

lácteos, como exemplo: leite, sorvete, iogurte, pães e biscoitos (MEYER et al., 2011) .

As aplicações da inulina como excipientes farmacêuticos são ainda mais diversos

e incluem: (1) a ação crioprotetora em vacinas, no campo dos sistemas de liberação de

fármacos, devido sua alta temperatura de transição vítrea e baixa taxa de cristalização

(AUDOY, 2011); (2) seu uso na avaliação da função renal, pois atua como marcador exógeno

da taxa de filtração glomerular em testes de função renal, uma vez que ela é completamente

filtrada e não é reabsorvida pelos túbulos (STEINMAN, 1989); (3) segundo pesquisa in vivo

realizada por Roberfroid (2005), atua no aumento da absorção de minerais pelo intestino, uma

vez que a capacidade natural de absorção de cálcio (Ca) pelo organismo diminui com o

avançar da idade e o aumento relativo dessa absorção, induzida pela inulina, aumenta à

medida que os animais envelhecem. Já em humanos, estudos indicam que a influência

positiva da inulina na absorção de Ca e Magnésio (Mg) é provável que aconteça na parte

inferior do intestino onde há maior atividade da microbiota intestinal. E, de acordo com Kaur

e Gupta (2002), outro fator favorável ao aumento da biodisponibilidade do Ca no cólon, tem

relação com a hidrólise do complexo cálcio-fitato, por ação de fitases bacterianas,

provavelmente aumentadas em virtude da fermentação causada pela inulina e que podem

promover a liberação do cálcio para sua absorção; e (4), como fibra dietética, por ser um

carboidrato resistente à digestão na parte superior do trato gastrointestinal, fermentando no

cólon, exercendo um efeito de aumento de volume, como consequência do aumento da

biomassa microbiana resultante de sua fermentação e, assim, promove o aumento da

frequência de evacuações o que caracteriza as fibras da dieta (SAAD, 2006).

Logo, a inulina apresenta a propriedade de um carboidrato não-digerível,

caracterizando-se por um alimento funcional de nome prebiótico. Os prebióticos afetam

beneficamente o hospedeiro, por estimularem seletivamente a proliferação e/ou atividade de

populações de bactérias desejáveis no cólon. Adicionalmente, o prebiótico pode inibir a

37

multiplicação de patógenos garantindo benefícios adicionais à saúde do hospedeiro (SAAD,

2006).

4.4 Estudo da atividade broncodilatadora

Uma vez que o uso tradicional de Pombalia calceolaria faz referência à ação

broncodilatadora tanto do extrato aquoso quanto do lambedor caseiro preparado com suas

raízes, foi considerado importante discorrer sobre essa temática – vias aéreas respiratórias.

4.4.1 Canais de cálcio e a contratura do músculo liso das vias aéreas

A musculatura lisa, presente em muitos órgãos, inclusive na traqueia, tem sua

inervação proveniente do Sistema Nervoso Autônomo. Além disso, o estado contrátil de suas

células pode ser controlado por hormônios, agentes autócrinos e/ou parácrinos e outros sinais

químicos locais (WEBB, 2003). Didaticamente, esse tecido é classificado em dois tipos

principais, o multiunitário e o unitário, sendo este último, o padrão encontrado nas vias

aéreas. Essas fibras denominadas unitárias ocorrem, em geral, em feixes ou camadas e suas

membranas celulares são aderentes entre si, possuindo diversos pontos de adesão

denominados junções abertas, pelos quais ocorre o fluxo de íons de uma célula a outra, de

forma que a força gerada por uma fibra muscular seja prontamente transmitida à seguinte e,

dessa maneira, todas as fibras musculares se contraiam a um só tempo (GUYTON; HALL,

2011).

Figura 5 - Estrutura inespecífica da inulina.

Fonte: CALEFFI et al., 2015

38

A contração do músculo liso ocorre por uma interação entre os filamentos de

actina e miosina. O aumento na concentração de Ca livre no sarcoplasma, citoplasma de

células musculares lisas, promovido por qualquer um dos estímulos contráteis já citados

anteriormente, resulta na ligação desse íon à calmodulina, uma proteína reguladora que, após

reagir com quatro íons cálcio (Ca++), ativa a miosina quinase, enzima responsável por

fosforilar as cadeias leves de miosina, permitindo a sua fixação ao filamento de actina,

resultando, então, na contração muscular (GUYTON; HALL, 2011).

A cadeia de processos que liga um estímulo a seus efeitos na modificação da

concentração de Ca no citoplasma é denominada acoplamento excitação-contração

(STEPHENS, 2002). Dois mecanismos principais controlam esse acoplamento na musculatura

lisa: a cascata de sinalização mediada pela alteração na concentração intracelular de Ca e a via

de sinalização Rho-quinase, que atua através de uma alteração na sensibilidade do sistema

contrátil ao Ca. Enquanto este último parece estar mais envolvido com função modulatória,

existe uma grande variação no mecanismo de sinalização mediado pelo Ca, sendo este o mais

relevante para o presente estudo (BERRIDGE, 2008).

Duas maneiras fundamentais possibilitam o aumento da concentração intracelular

de Ca: a liberação dos estoques intracelulares de Ca via receptores especializados presentes no

retículo sarcoplasmático ou o influxo de cálcio a partir do meio extracelular através de uma

variedade de canais iônicos na membrana plasmática ou ainda, por ambos os processos

(PEREZ-ZOGHBI et al., 2009).

Uma das vias de Ca mais bem caracterizadas utiliza canais de Ca operados por

voltagem (VOCC), ativados por variações no potencial de membrana. No entanto, existem

também na membrana das células musculares lisas outros canais que não são dependentes de

voltagem, incluindo os canais de Ca operados por receptor (ROCC), onde a ocupação de

receptores por agonistas específicos confere-lhe um estado de ativação e os canais de Ca

operados por estoque (SOCC) em que a depleção de estoques intracelulares de Ca ativa este

outro tipo de canal presente na membrana plasmática, os quais são permeáveis ao Ca e

possibilitam a recarga dos estoques de Ca do retículo através da entrada capacitativa deste íon

(SOMLYO et al., 1999; STEPHENS, 2002; PAREKH; PUTNEY, 2005).

O acoplamento eletromecânico opera uma mudança no potencial de membrana

devido ao efeito da concentração de Ca no citoplasma. O contato da membrana do tecido de

músculo liso traqueal com altas concentrações de potássio gera a despolarização desta e, em

seguida, os VOCC são ativados o que causa um influxo de Ca através da membrana. Portanto,

esse acoplamento excitação-contração consiste do controle da contração muscular por

39

potencial de membrana e é denominado acoplamento eletromecânico (SOMLYO; SOMLYO,

1994). Por outro lado, a ligação de agonistas colinérgicos como o carbacol (CCh), aos

receptores presentes na membrana promove a sua ativação através de acoplamento

farmacomecânico (SOMLYO et al., 1999). Uma vez estimulado o receptor, a proteína G se

cliva, ativando a fosfolipase C (PLC), que ativada, hidrolisa o fosfoinositídeo da membrana

celular produzindo pelo menos dois segundos mensageiros: o diacilglicerol (DAG) e o

inositoltrifosfato (IP3). A ligação do IP3 a receptores específicos na membrana do retículo

sarcoplasmático resulta na liberação de Ca para o citosol (WEBB, 2003; PAREKH;

PUTNEY, 2005).

A contratilidade da musculatura lisa das vias aéreas contribui para o aumento da

resistência das vias aéreas em doenças semelhantes à asma (KIM; HOQUE; HAI, 2004), pois

a musculatura lisa destas vias tem efeito no controle do calibre das vias aéreas, sendo

susceptível a disfunções na musculatura, contribuindo, assim, para a patogênese da asma

(BASTOS, 2009). A contração excessiva das células da musculatura das vias aéreas é uma

das causas do desencadeamento dessa patogênese. Essa mudança na função contrátil da

musculatura secundária à inflamação das vias aéreas pode contribuir para o aumento da

resistência do fluxo aéreo, devido à presença de hipersecreção e a espessura das vias aéreas

(BAI; ZHANG; SANDERSON, 2007). Tais alterações podem ser induzidas em animais de

laboratório através de sensibilização e desafio, por inalação de substâncias alérgenas irritantes

(HARKEMA; WAGNER, 2005). A musculatura lisa pode ser estimulada por agonistas, tais

como: colinérgicos (NAKAZAWA et al., 1990), norepinefrina (INOUE; KURIYAMA,

1993), endotelina (CHEN; WAGONER, 1991), histamina (KOMORI et al., 1992).

Em contrapartida, o relaxamento do músculo liso ocorre como resultado da

remoção do estímulo contrátil ou pela ação direta de substâncias que estimulem a inibição do

mecanismo contrátil. Independente disso, o processo de relaxamento requer uma diminuição

da concentração celular de Ca e o aumento na atividade da miosina fosfatase, enzima capaz de

remover o fosfato da cadeia leve de miosina, cessando a contração. O sarcolema contém Ca,

Mg-ATPases que proporcionam um mecanismo adicional para a redução da concentração

desse íon na célula. A inibição dos canais de Ca voltagem-dependentes e operados por

receptores também promovem o relaxamento do músculo liso (WEBB, 2003).

Assim, o presente trabalho, objetivou investigar as características fitoquímicas

preliminares da parte subterrânea de P. calceolaria e obter informações quanto aos seus

aspectos morfoanatômicos, de forma a contribuir com sua caracterização farmacognóstica e

com dados relativos à família Violaceae, a qual pertence. Além disso, foram realizados

40

estudos químicos e farmacológicos com o polissacarídeo já extraído das raízes de P.

calceolaria, quanto ao seu teor e aos seus aspectos físico-químicos e também estudos

farmacológicos de avaliação da atividade broncodilatadora do extrato aquoso das raízes da

referida espécie.

41

METODOLOGIA

42

5 MATERIAIS E MÉTODOS

5.1 Material

5.1.1 Material Botânico

O material botânico foi constituído de raízes de ipeca-da-praia (Pombalia calceolaria),

as quais foram coletadas na Praia da Tabuba, Município de Caucaia, cuja exsicata foi

depositada no Herbário Prisco Bezerra da Universidade Federal do Ceará (UFC), sob o

número 54070, para certificação botânica (Figura 6).

Fonte: Autoria própria.

Figura 6 – Coleta das raízes de P. Calceolaria e registro fotográfico da exsicata depositado no Herbário Prico Bezerra - UFC

43

5.1.2 Animais

Foram utilizados ratos wistar machos do Biotério do Departamento de Fisiologia e

Farmacologia da Faculdade de Medicina da UFC mantidos em condições adequadas de luz,

temperatura e umidade, em gaiolas apropriadas, recebendo água e ração ad libitum. Os

protocolos utilizados nesse trabalho foram feitos de acordo com os padrões éticos

estabelecidos pela Comissão Ética em Pesquisa com Animais da UFC.

5.1.2.1 Aspectos éticos

Esse projeto foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal

(Parecer nº 145/14) da UFC (Anexo).

5.1.3 Solventes e reagentes

Acetona, ácido sulfúrico, diclorometano, etanol, metanol, N,N-dimetilformamida

foram adquiridos da VETEC (Brasil), padrões de galactose, arabinose, xilose, glicose, frutose,

manose e maltose adquiridos da Sigma-Aldrich (EUA), ácido trifluoroacético,

dimetilsulfóxido deuterado, azul de toluidina, α-naftol, timol, 2,2,2-tribromoetanol, cloreto de

potássio (KCl), carbacol (CCh), nitrato de sódio (NaNO3), padrões de pululana Shodex P-82.

5.1.4 Composição das soluções

Solução de Krebs-Henseleit (mmol/L): NaCl (118,0), KCl (4,7), CaCl2 (2,5), MgSO4

(1,2), NaHCO3 (25,0), KH2PO4 (1,2), glicose (10,0).

FAA 70: Formaldeido, ácido acético glacial e etanol 70%, nas proporções 1:1:8

(v:v:v).

Solução etanólica de α-naftol 10%: 1 g de α-naftol solubilizado em 10 mL de etanol.

Solução etanólica de timol 10%: 1 g de timol solubilizado em 10 mL de etanol.

5.1.5 Equipamentos

Espectrômetros Bruker modelos Avance DPX-300 e Avance DRX-500;

cromatógrafo Shimadzu LC-20AD com detector de índice de refração RID-10A;

cromatógrafo líquido de alta eficiência marca Shimadzu, composto dos módulos CBM -

Sistema de 10A, detector de RI (Shimatzu RID - 6A); concentrador de vácuo (modelo

Thermo Scientific Sorvall, modelo MTX 150 Micro-ultra-centrifuge); superfreezer (marca

Thermocientific); microscópio equipado com polarizador modelo Leica DM4000 B LED;

bomba a vácuo (Quimis, modelo Q.355.2. VC), balança analítica (marca Precisa, modelo 205

44

A SCS); chapa aquecedora retangular (marca Quimis, modelo Q313.22); cedidor de umidade

por infravermelho modelo IV2500 (marca GEHAKA); liofilizador de bancada Labconco

Freezone, com capacidade para 4,5 L, refrigeração 1/3 hp, temperatura -50ºC e acoplado à

bomba de vácuo da marca Labconco® com potência de 86 L/min; tamizador vibratório

(marca ERWEKA); transdutor de força isométrico (ML870B60/C-V, AD Instruments,

Australia); moinho de rotor tipo ciclone TE 651/2 Tecnal; forno mufla Linn Elektro Therm

modelo 06567 Bad Frankenhausen Kyfth;

5.1.6 Outros materiais

Funil de vidro sinterizado tamanho de porosidade nº 4 (10 a 16 µm); lâmina de

comum para corte histológico a mão livre; material cirúrgico; seringas e filtro de seringa

Nylon 25 mm x 0,45 µm.

5.2 Métodos

5.2.1 Caracterização morfoanatômica das raízes de Pombalia calceolaria

As raízes coletadas de P. calceolaria foram analisadas quanto ao seu

comprimento e ramificações sob vista desarmada.

Para análise anatômica, amostras da raiz fresca foram fixadas em FAA 70. As

lâminas foram confeccionadas segundo técnicas convencionais de corte à mão livre

(JOHANSEN, 1940). A coloração foi realizada com azul de toluidina (SAKAI, 1973).

Para a localização de frutanos do tipo inulina, amostras da raiz foram fixadas em

etanol absoluto por 48 h para verificar a formação de cristais do polissacarídeo.

Posteriormente, as secções transversais das amostras foram feitas à mão livre e com o auxílio

de lâmina comum e analisados sob luz polarizada (OLIVEIRA; AKISUE, 2009; JOHANSEN,

1940).

Os resultados foram registrados através de microscópio Leica DM4000 B LED

sob luz de campo claro e escuro.

5.2.2 Ensaios preliminares para caracterização dos parâmetros de qualidade da droga

vegetal

5.2.2.1 Obtenção e determinação do rendimento da droga vegetal

As raízes frescas de P. calceolaria foram desidratadas em estufa de circulação de

ar, a 50 ºC, até peso constante. Em seguida, foi determinado o rendimento da droga vegetal

obtido através desta operação.

45

5.2.2.2 Umidade residual

Em determinador de umidade por infravermelho foram pesadas três alíquotas da

raiz, aproximadamente 3 g cada, previamente secas em estufa de circulação de ar a qual foi

distribuída uniformemente no coletor de alumínio e a leitura realizada à 105ºC por 1 hora. Os

resultados foram expressos em perda de massa percentual, através da média das três

determinações.

5.2.3 Trituração da droga vegetal

O material vegetal foi triturado em moinho de facas usando malha de 2 mm. O pó

obtido foi identificado e armazenado em recipiente de vidro.

5.2.4 Determinação granulométrica da droga vegetal

A distribuição granulométrica foi realizada conforme metodologia descrita na

Farmacopeia Brasileira 5ª edição (método 5.2.11), (BRASIL, 2010b). Utilizou-se uma série

de tamizes, com abertura nominais de malha (µm) apresentados na Tabela 1. Esta série de

tamizes e a bandeja de recolhimento foram montados de acordo com a sequência apresentada,

todos previamente tarados e colocados no tamizador. Cerca de 170 g do pó da droga vegetal

foram pesados e colocados sob o tamis superior da série. Este tamis do peneirador foi

tampado e toda a série fixada para o início do teste, o qual durou 15 minutos, em tamizador

vibratório (marca ERWEKA). Finalizado o tempo, os tamises foram cuidadosamente pesados

para quantificação da porção retida em cada tamis.

Tabela 1 - Classificação de tamises utilizados na análise granulométrica do pó da raiz de P. calceolaria.

Abertura nominal do tamis (µm)

Nº do tamis (ABNT/ASTM)

2000 10

1400 14

1000 18

710 25

500 35

350 45

250 60

180 80

46

O percentual da Droga Retida (DR) em cada tamis foi calculado conforme equação que se

segue:

DR = 100 x

5.2.5 Determinação do Teor de Cinzas Totais

O ensaio foi realizado conforme metodologia descrita na Farmacopeia Brasileira

5ª edição (método 5.4.2.4), (BRASIL, 2010b): pesou-se aproximadamente 3 g da amostra

triturada, a qual foi transferida para cadinho previamente limpo, seco e calcinado em forno-

mufla a 600°C, resfriado em dessecador e tarado. Em seguida, a amostra foi distribuída

uniformemente no cadinho, que foi conduzido ao forno-mufla. O material foi submetido à

aquecimento, com aumento de temperatura gradual (30 minutos a 200 °C, 60 minutos a 400

°C e 90 minutos a 600 °C). Em seguida, resfriou-se o cadinho em dessecador e pesou-se a

amostra. O cadinho foi novamente aquecido em forno-mufla em temperatura de 600 °C por

90 minutos, resfriado em dessecador e novamente pesado, repetindo-se o processo até a

obtenção de peso constante. A porcentagem de cinzas foi calculada através da relação entre a

massa final obtida após a incineração e a massa inicial da amostra:

Teor de Cinzas Totais (%) =

5.2.6 Prospecção fitoquímica

A prospecção fitoquímica foi realizada de acordo com metodologias de COSTA

(1987), MATOS E MATOS (1989) e MATOS (1988).

5.2.7 Obtenção do extrato aquoso liofilizado e do polissacarídeo

Para melhor compreensão da metodologia desenvolvida nas etapas envolvidas

para liofilização do extrato aquoso e obtenção do polissacarídeo, ver figura 7.

Massa Final (g)

Massa inicial (g) x 100

Massa retida no tamis (g)

Soma das massas retidas em cada tamis e no coletor (g)

47

Figura 7 - Fluxograma de obtenção do liofilizado e do

polissacarídeo.

48

5.2.7.1 Preparação, liofilização do extrato aquoso e determinação do teor do liofilizado

O extrato aquoso, 20% p/v, foi obtido a partir das raízes de P. calceolaria

dessecadas, trituradas e após tamisadas, o pó, reunido no intervalo de 500 a 1400 µm,

homogeneizado e submetido à decocção (em triplicata) sob agitação constante, durante 5

minutos, seguida de filtração com algodão (Figura 6). O extrato aquoso obtido foi divido em

duas amostras. Uma (900 mL), foi reservada para obtenção do polissacarídeo, e a outra, (120

mL) distribuída para três tubos de falcon de 50 mL (três volumes de 40 mL em cada tubo). Os

tubos fechados com tampa própria foram levados à resfriamento em superfreezer até

temperatura de -70 ºC.

A liofilização foi realizada da seguinte forma: primeiro o equipamento foi ligado

para iniciar o resfriamento até -50 ºC, o qual demorou cerca de 20 minutos até chegar a essa

temperatura. Em seguida, o material previamente congelado a -70 ºC foi destampado,

colocado nos frascos de vidro do liofilizador, os quais posteriormente foram hermeticamente

fechados com tampa de borracha própria e adaptável para o acoplamento ao equipamento.

Uma vez acoplados, o sistema de vácuo foi ligado até atingir a pressão de 0,014 mBarr. O

critério de escolha do tempo de liofilização se deu através do teste com duas amostras em dois

períodos distintos: 48 h e 72 h, com o objetivo de avaliar qual deles o produto final obtinha

melhor secagem.

O teor do liofilizado obtido foi calculado segundo a equação abaixo:

Teor (%) =

5.2.7.2 Obtenção e determinação do teor do polissacarídeo

Ao extrato aquoso (900mL), condicionado em béquer, obtido conforme ítem

5.2.7.1 foi adicionado lentamente metanol, com auxílio de bureta, até atingir concentração de

33% v/v. Em seguida, esta amostra foi armazenada sob refrigeração por 48 h, condição esta

que otimiza a precipitação do polissacarídeo. O excesso de sobrenadante foi decantado e o

polissacarídeo resultante, ainda na presença de pequena alíquota do extrato aquoso, foi

cuidadosamente transferido para os tubos de ensaio do concentrador à vácuo (10h, a 50°C),

conforme Figura 8, para obtenção do polissacarídeo bruto. A purificação do polissacarídeo

obtido foi realizada através de lavagem com acetona em triplicata (100mL cada lavagem),

seguida por filtração à vácuo, por meio de funil de vidro sinterizado, e seco em estufa de

circulação de ar a 80°C até peso constante.

Massa obtida do liofilizado (g)

Raiz seca utilizada na obtenção do extrato aquoso (g) x 100%

49

O teor final do polissacarídeo purificado foi calculado segundo a equação abaixo:

5.2.8 Testes de solubilidade

Os testes de solubilidade foram realizados em quatro condições distintas: água a

temperatura ambiente, água quente (aproximadamente 100 ºC), etanol e diclorometano.

5.2.8.1 Teste de solubilidade em água a temperatura ambiente

Conforme metodologia descrita por Larsson (2010) pesou-se 0,1 g da amostra e

deixou-se sob agitação com 25 mL de água, a temperatura ambiente, durante 24 horas. Ao

final do tempo, o líquido foi filtrado em filtro de 0,45 μm, de modo a recolher pelo menos 10

mL. Após medir exatamente 10 mL e transferir para béquer tarado, foi posto para dessecar em

estufa a 100 ºC até peso constante. O peso obtido, em mg, correspondeu

à quantidade dissolvida em 10 mL de água, representando a solubilidade da amostra. O

resultado foi expresso em percentagem.

Polissacarídeo purificado (g)

Raiz seca utilizada na obtenção do polissacarídeo (g) x 100% Teor (%) =

Figura 8 - Amostras do polissacarídeo bruto com extrato aquoso remanescente, antes de secos em concentrador a vácuo.


50

5.2.8.2 Teste de solubilidade em água quente, etanol e diclorometano

Foram realizadas três pesagens do polissacarídeo, de 20 mg cada uma e, em

seguida, transferidas para três tubos de ensaio. Posteriormente, foram adicionados 2 mL de

cada solvente, sendo no primeiro tubo água quente, a temperatura de aproximadamente

100ºC, no segundo etanol e ao terceiro tubo foi adicionado diclorometano seguida de agitação

manual.

5.2.9 Caracterização macroquímica do polissacarídeo

A determinação macroquímica do polissacaraídeo foi realizada segundo Johansen

(1940), com solução de timol 10% e ácido sulfúrico e para confirmação, procedeu-se ao

ensaio com solução de α-naftol a 10% e ácido sulfúrico (BRASIL, 2010b).

5.2.10 Hidrólise e análise por Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)

A hidrólise foi realizada com ácido trifluoroacético, segundo recomendação de

Matos (1988).

Realizou-se a análise do hidrolisado por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

(CLAE), utilizando-se como padrão interno galactose, arabinose, xilose, glicose, frutose,

manose e maltose nas seguintes condições: coluna Phenomenex Rezex ROA-Organic Acid

H+ (8%); fase móvel: Ácido sulfúrico, 8 mmol L-1, e fluxo 0,8 mL/min (HARRIS, 2008).

Em seguida a análise foi complementada com dados de espectros de Ressonância

Magnética de 1H, 13C, DEPT-135, HSQC expandido e Cromatografia de Permeação em Gel.

5.2.11 Análise por Ressonância Magnética Nuclear (RMN)

Os espectros unidimensionais de RMN de 1H, 13C e DEPT 135 e bidimensional

RMN HSQC expandido foram obtidos em espectrômetros Bruker, modelo Avance DRX-500,

pertencente ao Centro Nordestino de Aplicação e Uso da Ressonância Magnética Nuclear da

UFC (CENAUREMN-UFC), operando na frequência do hidrogênio a 500 MHz, e na

frequência do carbono a 125 MHz. Os experimentos uni e bi-dimensionais de 1H, 13C, DEPT

135 e HSQC foram efetuados em sonda multinuclear de 5 mm com detecção inversa ou em

sonda dual de 5 mm com detecção direta. Os deslocamentos químicos (δH e δC) foram

expressos em ppm, tendo como referência interna o sinal residual do solvente deuterado

utilizado para a obtenção dos espectros. Foi empregado o solvente dimetilsulfóxido-d6

(DMSO-6).

51

Figura 9: Esquema de eluição de amostra com polímero em coluna cromatográfica

de permeação em gel.

FONTE: Florenzano, 2015

5.2.12 Determinação da massa molar por Cromatografia de Permeação em Gel (GPC)

A GPC (sigla em inglês) também conhecida por cromatografia de exclusão de

tamanho é um método de separação aplicada a polímeros. Dentre as diversas características

das técnicas cromatográficas, duas são pertinentes, a fase móvel e a fase estacionária. No

GPC, a fase estacionária é constituída por uma resina gel com poros e cavidades de diferentes

tamanhos. A separação das substâncias (polímeros) se dá pelo seu volume hidrodinâmico,

sendo as menores partículas capazes de acessar um volume maior de eluente, e assim passam

mais tempo retidas na coluna. Já as partículas maiores não acessam todo o volume da fase

estacionária e por isso eluem mais rápido (BILLMEYER, 1984) (Figura 9). O raio

hidrodinâmico apresenta relação com a massa molar, de forma que é esperada a relação entre

volume de eluição e a massa molar. Essa relação depende da coluna, do sistema de solvente,

da temperatura e da natureza do polímero. Para a determinação da massa molar por GPC

realizou-se no presente trabalho a calibração clássica, onde foi usado padrões de massa molar

conhecida (pululanas) de onde se obteve a curva analítica, ou seja, a relação entre a massa e o

volume de eluição. Assim, a determinação da massa molar do polissacarídeo em estudo se deu

52

em relação à massa molar do padrão determinada na curva analítica.

A massa molar da amostra foi determinada por GPC. As análises foram realizadas

com coluna PolySep Linear (7,8 mm × 300 mm), fluxo de 1,0 mL/min, tendo NaNO3 0,1

mol/L como eluente com forno mantido a 30 °C. O volume injetado de amostra foi de 50 μL.

Para a construção da curva de calibração foram utilizados padrões de pululana Shodex P-82.

A amostra foi dissolvida em água na concentração de 1 mg/mL e filtrada em membrana 0,45

μm.

5.2.13 Protocolo experimental para avaliação do potencial miorrelaxante

5.2.13.1 Avaliação do efeito do polissacarídeo e do extrato aquoso liofilizado de P.

calceolaria (EALPC) sobre a contratilidade de traqueia de rato:

Os animais foram mantidos em caixas de polipropileno, em condições térmicas

adequadas (22 a 26ºC), com sistema de exaustão de ar e com ciclo claro/escuro de 12 horas,

tendo livre acesso à água e ração padrão (Biotec®). Os animais foram anestesiados com

2,2,2,tribromoetanol (250 mg/kg, i.p.) e, então, sacrificados por exsanguinação,

imediatamente antes do início dos protocolos experimentais para obtenção do tecido. O

animal foi colocado na posição de decúbito dorsal para a rápida excisão da traqueia. A região

cérvico-torácica anterior foi aberta cirurgicamente e a traqueia então removida

cuidadosamente e levada a uma placa de petri contendo solução de Krebs-Henseleit, onde foi

feita a remoção do tecido conectivo.

Após esta remoção, a traqueia foi cortada transversalmente em segmentos

cilíndricos com aproximadamente 3 - 4 mm de comprimento e ligados a peças triangulares de

fio de aço (0,3 mm de diâmetro) que foram suspensas em cuba para órgão isolado de 5 mL

contendo solução de Krebs a 37 °C, continuadamente aerada com mistura carbogênica (95%

de O2 e 5% de CO2) e conectadas a transdutor de força isométrico (ML870B60/C-V, AD

Instruments, Australia) conectado a sistema de aquisição de dados (PowerLab™ 8/30, AD

Instruments, Austrália), conforme mostrado na Figura 9.

A tensão aplicada à cada seguimento traqueal foi ajustada em 1 g. Dentro do

período com esta tensão (60 min) houve a troca do líquido de incubação a cada 15 min.

Para avaliar a responsividade do tecido no início do experimento, as preparações

foram expostas a solução despolarizante de concentração 60 mM de KCl até que fossem

obtidas duas respostas de amplitudes semelhantes, quando então o tecido tenha sido

considerado responsivo e apto ao experimento.

53

5.2.13.2 Quantificação dos dados para elaboração da curva concentração-efeito (CCE)

A curva concentração-efeito (CCE) foi elaborada a partir dos dados captados pelo

sistema de aquisição de dados. Estes, por sua vez, inicialmente, foram obtidos pela adição de

carbacol (CCh) 1 μM para obtenção de contração submáxima do músculo liso traqueal.

Posteriormente, foi adicionado, sequencialmente, em intervalos de tempo de 10 minutos,

concentrações cumulativas crescentes (1 – 1000 μg/mL) da substância estudada em questão,

ou seja, do polissacarídeo ou do EALPC. Ao final, após adição da última concentração, o

tecido foi lavado com solução de Krebs e sua responsividade foi novamente avaliada com

solução de KCl 60 mM, para verificar a viabilidade do tecido após a exposição a substância

teste.

A Figura 10 ilustra todo o processo da obtenção da CCE a partir do órgão já

isolado: 1- Sistema de captação de dados onde são obtidos os traçados que registram as

contrações no tecido, 2: Transdutor de força acoplado, através de fio de algodão, a uma das

extremidades da peça triangular de aço, onde contém os anéis de traqueia e transmite as

alterações contráteis para o sistema de aquisição de dados, 3: Haste fixa à qual se acopla a

outra extremidade da peça triangular de aço com a traqueia e o ponto de aeração com mistura

carbogênica, 4: cuba para banho de tecido com circulação de água a 37ºC.

Fonte: Figura adaptada de AGUIAR, 2009

Figura 10 - Representação esquemática do sistema de cubas isoladas e captação de

dados.

54

5.3 Análise estatística

A análise estatística foi realizada com o auxílio do programa SigmaPlot 11.0. Os

resultados foram expressos calculando-se a média aritmética de cada determinação, sendo a

amplitude de variação em torno da média determinada através do cálculo do erro padrão da

média (E.P.M.). A comparação entre grupos foi realizada utilizando análise de variância

(ANOVA) seguido de teste de Tukey. A significância estatística foi considerada quando a

probabilidade de ocorrência da hipótese de nulidade foi menor que 5% (p < 0,05). Os dados

de contratilidade foram expressos em percentual (%) da pré-contração induzida com CCh (1

μM) durante os protocolos experimentais.

55

RESULTADOS

56

6 RESULTADOS

6.1 Análises morfoanatômicas das raízes de Pombalia calceolaria

6.1.1 Descrição macroscópica

As raízes de coloração amarelo-claro é do tipo pivotante, com ramificações nas

extremidades a medida em que vai crescendo em profundidade (Figura 11). O diâmetro

dificilmente ultrapassa 1,5 cm, variando entre raízes finas, de desenvolvimento primário, e

raízes mais grossas, de desenvolvimento secundário. O comprimento médio é de 70 cm,

podendo chegar até um metro. Apresenta aspecto tortuoso, com casca espessa. Quando frescas

retem alto teor de umidade e caracterizam-se por consistência interna macia e suculenta. Após

secas, as raízes finas são quebradiças, porém aquelas de maior diâmetro apresentam um cerne

muito rígido, devido ao crescimento secundário.

A

B C

Figura 11 - Amostras in natura das raízes de Pombalia calceolaria. A: Comprimento da raiz P. calceolaria L.; B: Aspecto natural da raiz após coleta; C: Secção tranversal da raiz in natura.


57

6.1.2 Descrição microscópica

A Figura 12 mostra a raiz de P. calceolaria em início de crescimento secundário

com periderme desenvolvida, parênquima cortical constituído de células isodiamétricas, as

quais ricas em frutanos do tipo inulina, está demonstrada sob luz polarizada após as raízes

serem submetidas a etanol absoluto. O xilema secundário, oriundo do câmbio, apresenta

dimorfismo no tamanho dos vasos e os raios parenquimáticos em geral são bi ou trisseriados.

O floema secundário, em menor proporção que o xilema, é constituído de poucas camadas

circundando o xilema. De acordo com a respectiva figura é possível visualizar com melhor

nitidez em 12B e 12C, a característica isodiamétrica das células parenquimáticas.

6.2 Operações de secagem

As operações de secagem com as raízes de P. calceolaria foram realizadas em

triplicata e os valores médios foram expressos em porcentagem, como mostra a Tabela 2. O

rendimento equivale à quantidade de droga vegetal obtida após a secagem em estufa de

circulação de ar até peso constante.

Figura 12 - Secções transversais da raiz de P. calceolaria. A- G. A. Corte transversal, da epiderme ao cilindro vascular. B. Secção à mão livre da raiz in natura. C: Células do parênquima cortical da raiz in natura, sob luz polarizada. D e F. Secção após 72 horas de imersão em álcool absoluto. E e G: Células do córtex da raiz após imersão em etanol absoluto, evidenciando cristais de inulina sob luz polarizada. Escalas: A: 200 μm; B,C: 50 μm; D-G: 200 μm.

Operações de secagem das raízes de P. calceolaria

Rendimento (%) 51,0

Umidade residual (%) 5,4

Tabela 2 - Resultado do rendimento da droga vegetal e da umidade residual das raízes de P. calceolaria


58


59

6.3 Determinação granulométrica

Como pode ser observado pelos resultados mostrados na tabela 3 e na Figura 13, o

pó obtido da divisão das raízes de P. calceolaria apresenta distribuição granulométrica

heterogênea. Além disso, como mostrado em destaque na tabela 3, o tamanho médio das

partículas é classificado como pó grosso segundo BRASIL, 2010. Os tamises que reteram

maior porcetagem da droga vegetal foram os de intervalo de 1400 a 500 µm, que variou de

17,21% a 13,83%, respectivamente e que equivale a 70,42% do total da raiz tamisada.

Tabela 3 - Resultados da análise granulométrica da droga vegetal.

Abertura nominal da malha (mm)

% Retida dos pós

1 2 3 Média (%)

2,00 6,47 17,93 2,71 9,03

1,40 20,69 20,43 10,51 17,21

1,00 26,63 24,30 22,65 24,53

0,710 14,04 12,17 18,35 14,85

0,500 11,32 10,49 19,68 13,83

0,350 5,22 5,03 9,77 6,67

0,250 3,56 3,02 4,27 3,61

0,180 4,12 3,00 4,57 3,89

<0,180 7,92 3,61 7,49 6,34

Tamanho médio das partículas

(mm)

0,951 1,06 0,709 -----


60

6.4 Determinação do Teor de Cinzas Totais

De acordo com a metodologia descrita no ítem 5.2.5, a amostra constituída de

raízes de P. calceolaria apresentou teor de cinzas totais e de cinzas insolúveis em ácido de 3,7

e 2,8%, respectivamente.

6.5 Prospecção fitoquímica

Como mostrado na Tabela 4, os principais constituintes químicos encontrados

após prospecção fitoquímica das raízes de P. calceolaria foram saponinas, açúcares redutores

e esteróides, tendo sido encontrado também em quantidade menos significante a presença de

cumarina e alcalóide.

Figura 13 - Gráfico da distribuição granulométrica da droga vegetal.


70,42% do total da

raiz tamisada.

61

Forte: +++ Médio: ++ Fraco: + Vestígio: V Ausente: O

Tabela 4 - Perfil fitoquímico das raízes de P. calceolaria.

CLASSE

QUÍMICA

TIPO DE

AMOSTRA MÉTODO

REAÇÃO

POSITIVA RESULTADO

Saponinas Extrato

Aquoso Agitação vigorosa

Espuma estável

por mais de 30

min.

+++

Alcalóides Extrato

Aquoso

Dragendorff

Bertrand Hager

Presença de

precipitado V

Flavonóides Extrato

Hidroalcoólico HCl-R e fita de Mg

Coloração rósea

ou vermelha O

Antociânico Extrato

Hidroalcoólico Alteração do pH

Mudança de

coloração O

Taninos Extrato

Aquoso

Sol.alcaloídica

Sol. de FeCl3

Sol. K2Cr2O7

Formação de

precipitado O

Fenóis Totais Extrato

Aquoso Sol. de FeCl3

Mudança de

coloração O

Açúcares

Redutores

Extrato

Aquoso e

Polissacarídeo

Reagente de Benedict Coloração

vermelho tijolo +++

Amilo Polissacarídeo Lugol Azul violácea

intenso O

Cumarinas Extrato

Hidroalcoólico

CCD em sílica.Eluente:

Hex:AcOET:MeOH

(6:13:1) Revelada com

KOH 5%

Fluorescência

verde sob luz +

Esteróides Extrato Etéreo Anidrido Acético e

H2SO4 Coloração verde ++

Triterpenóides Extrato Etéreo Anidrido Acético e

H2SO4

Coloração

castanha O

Fonte: Adaptado de Bezerra, 2013

62

6.6 Determinação do teor do liofilizado e do polissacarídeo obtidos

O tempo de liofilização definida para a obtenção do produto final em condições

apropriadas de desidratação foi de 72 horas. Para a amostra do extrato aquoso submetido à

liofilização, foi utilizado o total de 32,69 g de raiz, resultando em 17,71% de massa residual

de liofilizado.

Quanto à amostra do extrato aquoso, da qual foi obtido o polissacarídeo, foi

utilizado o equivalente à 147,14 g da raiz dessecada e triturada, no intervalo granulométrico

de 500 µm a 1400 µm e resultou em 13,0% de polissacarídeo seco e purificado.

6.7 Testes de solubilidade

A tabela 5 mostra o resultado encontrado para a solubilidade do polissacarídeo nas

quatro condições estabelecidas na metodologia: água a 100 ºC, etanol, diclorometano e água a

temperatura ambiente. Dessas quatro condições, foi quantificado apenas a solubilidade em

água a temperatura ambiente, a qual resultou em 7%.

6.8 Caracterização macroquímica do polissacarídeo

A caracterização macroquímica do polissacarídeo foi positiva para inulina nos dois

testes aplicados, conforme mostrado na Figura 14.

Tabela 5 - Resultado da solubilidade do polissacarídeo extraído

das raízes de P. calceolaria.

SOLVENTE RESULTADOS

ÁGUA (25°C) PRATICAMENTE INSOLÚVEL

ÁGUA (100°C) SOLÚVEL

ETANOL (25° C) INSOLÚVEL

DICLOROMETANO (25°C) INSOLÚVEL


63

6.9 Análise química do polissacarídeo por CLAE

Após a hidrólise do polissacarídeo, realizou-se análise por Cromatografia Líquida

de Alta Eficiência como mostrado na Figura 15, nos tempos de retenção 13,24 para frutose e

12,37 para glicose.


Figura 14 – Caracterização macroquímica do polissacarídeo. 1: Polissacarídeo ao qual foi realizado teste macroquímico; 2: a) Polissacarídeo após adição de timol 10%; b) Polissacarídeo após adição de alfa-naftal 10%.

Figura 15 - Cromatograma obtido a partir de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência,

presente nas raízes de Pombalia calceolaria.


64

6.10 Análise química do polissacarídeo por ressonância magnética nuclear (RMN)

O espectro de RMN 13C (Figura 16) ilustra um espectro típico de inulina. De

acordo com a literatura, em um mesmo espectro podem haver sinais sobrepostos e não

sobrepostos (YANG et al., 2011). Dessa forma, são divididos em duas categorias. No espectro

de RMN 13C, os sinais de átomos de carbono em δ 92,05, 71,61, 72,97, 70,03, 72,66 e 60,65

ppm foram atribuídos a uma unidade α- D-glucose, correspondendo a uma categoria. Os

sinais δ 61,28-61,64, 102,81-103,72, 77,14-77,83, 74,28-76,02, 81,75-82,21 e 61,77-62,06

ppm foram sinais de sobreposição, aos quais, devido à pequena diferença de desvios químicos

em cada faixa foram atribuídos as cadeias de unidades de frutose com ligações β (2→1)-D-

frutosil-frutose. A presença da ligação β-D- fructofuranosil foi confirmada pelos sinais em δ

81,75-82,21 ppm (CH-5). Além disso, o mesmo espectro evidencia claramente a presença de

seis sinais sobrepostos do carbono anomérico da frutose (C-2), como indicado na Figura 15,

sugerindo, de acordo com a literatura (APOLINÁRIO et al., 2014), um alto grau de

polimerização, GP>20.

Figura 16 - Espectro de RMN - ¹³C (125 MHz, DMSO-6) do polissacarídeo de P. calceolaria.


65

No espectro do DEPT- 135 (Figura 17) é possível identificar pelos sinais em δ

61,28 – 62,06 os CH2 presentes nas moléculas de frutose que correspondem aos carbonos C1

e C6.

Os espectros de RMN 1H (Figura 18) e HSQC foram realizados para atribuir

prótons correlacionados ao carbono (Figura 19). Esta experiência demonstrou sinais de

correlação CH para o grupo D-glicosil: CH-1g (δ 92,05 / 5,3 ppm), CH-2g (δ 71,6 / 3,68

ppm), CH-3g (δ 72,97 / 3,10 ppm), CH-4g (δ 70,03 / 3,45 ppm), CH-5g (δ 72,66 / 3,2 ppm) e

CH2-6g (δ 60,55 / 3,82 ppm), onde “g” corresponde aos “CH”s da glicose. Três correlações

CH foram visivelmente atribuídos ao grupo frutosil: CH-3 (δ 77,14-77,83 / 4,38 ppm, banda

larga), CH-4 (δ 74,28-76,02 / 4,02-4,38) e CH-5 (δ 81,75-82,21 / 3,82-3,85 ppm) (LIU et al.,

2012).

Na Tabela 6, pode-se observar os sinais dos espectros de RMN 1H e RMN 13C da

inulina de P. calceolaria os quais apresentaram-se aproximados com os da inulina descrita na

literatura (YANG et al., 2011), de acordo com a Figura 20 e com os da sacarose, exceto que

os sinais da inulina provenientes de P. calceolaria foram mais sobrepostos.

Figura 17 - Espectro de RMN - DEPT 135 (125 MHz, DMSO-6) do polissacarídeo de P. calceolaria.


66

Figura 18 - Espectro de RMN - ¹H (500 MHz, DMSO-6) do

polissacarídeo de P. calceolaria.


Figura 19 - Espectro de RMN - HSQC (500 MHz, DMSO-6) do polissacarídeo de P. calceolaria.


67

Amostra

Monossacarideos

e resíduos

δ 1H/13C (ppm)

H-1/C-1 H-2/C-2 H-3/C-3 H-4/C-4 H-5/C-5 H-6/C-6

Sacarose

(literatura)*

δ Glcp (1→

β – Fruf(2→

5,29

92,1

3,57

61,3

3,44

71,0

-

103,6

3,65

72,5

4,10

76,4

3,36

69,2

3,94

71,9

3,88

69,2

3,94

73,9

3,81

60,1

3,71

62,3

Inulina

(literatura)**

δ Glcp (1→

-β -Fruf(2 →

5,34 92,1

3,44 71,1

3,68 72,5

3,37 69,2

3,75 72,3

3,74 60,1

3,57-3,83 60,5-61,0

103,0-103,6

4,01-4,18 76,7-77,4

3,93-4,01 73,8-74,4

3,74-3,77 81,0-81,2

3,72-3,83 61,0-62,3

Inulina

(P.

calceolaria)

δ Glcp (1→

β – Fruf (2 →

5,3 92,05

3,68 71,6

3,10 72,97

3,45 70,03

3,20 72,66

3,82 60,55

3,57-3,68

61,2- 61,6

-

102,8-

103,7

4,38 largo

77,1-77,8

4,02-4,38

74,2-76,0

3,82-3,85

81,7-82,2

3,83-3,99

61,7- 62,0

Tabela 6 - Dados de espectros de RMN 1H e RMN 13C da inulina de P. calceolaria

versus inulina da literatura.


* Oliveira et al., 2007

** Jarrell et al, 1979

Figura 20 – A. Estrutura química prevista para a inulina das raízes de P. calceolaria; B. Estrutura química da sacarose.

OHO

OH

HO

OOHO

OH

OHO

OHOH

OH

HO

O

OHO

OH

HO

OH

On

1g

2g3g

4g

5g

6g

1

2

34

5

6

n+1

n+2

n+3n+4

n+5

n+6

A. B.

Fonte: A. Jarrell et al, 1979; B. Oliveira et al., 2007

68

6.11 Análise química do polissacarídeo em CPG

Para o volume de eluição (Ve) do pico da amostra, em 10,24 mL (Figura 22) foi

estimada uma massa molar de pico (Mp) correspondente a 4,0 x 10³ Da, quando substituído

esse valor (Ve) na equação de regressão linear (1) obtida pela curva de calibração (Figura 21)

com padrões de pululana, como mostrado na Figura 23.

Figura 21 - Curva de calibração dos padrões de pululana Shodex P-82.

logMp = 17,186 - 1,327 Ve (1)


69

Figura 22: Cromatograma do polissacarídeo de P. calceolaria

obtido por Cromatografia de Permeação em Gel.


Figura 23 – Curvas do padrões de pululana.


70

6.12 Efeito da adição in vitro do polissacarídeo na contração induzida por CCh

No início dos experimentos com o polissacarídeo, uma vez que este é insolúvel

em água a temperatura ambiente, foi preparada uma solução mãe do mesmo, solubilizando-o

em água a temperatura de aproximadamente 100ºC. A solução, após retornar à temperatura

ambiente, foi então diluida para as concentrações realizadas no experimento.

Conforme metodologia descrita na seção 5.2.13, no início dos ensaios, o tecido

traqueal teve sua responsividade avaliada através da exposição do mesmo à solução

despolarizante de K+ (60 mM), o qual produziu contrações sustentadas. Após a confirmação

da responsividade do tecido, foi realizada a lavagem da preparação e por conseguinte o

retorno à linha de base. Em seguida, foi adicionado CCh (1 μM) à cuba, produzindo

contrações submáximas a partir de onde, após se estabelecido o platô, foi iniciada a adição

cumulativa de concentrações crescentes do polissacarídeo (1-1000 μg/mL), com intervalo de 5

minutos entre as concentrações. Conforme pode se observar na Figura 24, a exposição do

tecido traqueal à solução do polissacarídeo não provocou alteração na contração sustentada

induzida pelo CCh 1 μM, onde o máximo de relaxamento obtido ocorreu na última

concentração, 5,2 ± 1,5% (n=7, p>0,05 ANOVA).

Figura 24 - Gráfico com valores médios para a contração submáxima de anéis de traqueia

de rato na presença de diferentes concentrações de polissacarídeo (n=7).


71

6.12 Efeito da adição in vitro do EALPC na contração induzida por CCh

Após o período de avaliação da viabilidade tecidual com K+ (60 mM), deu-se

início ao ensaio. Este experimento foi realizado fazendo a comparação entre a resposta do

controle e a resposta do EALPC simultaneamente. Ficou estabelecido como controle as cubas

contendo anéis de traqueia apenas na presença de CCh, com o objetivo de avaliar a contração

sustentada no tecido traqueal ao longo do experimento sem a adição do EALPC.

Simultaneamente, em outras cubas, além do CCh inicialmente adicionado, foram adicionadas

as concentrações cumulativas de EALPC (1-1000 μg/mL), com intervalo de 10 min entre as

concentrações. Foi observado que tanto o grupo controle quanto o grupo tratado com EALPC

relaxaram, embora tenha havido uma diminuição mais pronunciada em função da adição de

EALPC a partir da concentração de 300 μg/mL (p<0,05, ANOVA seguido de teste de Tukey).

O valor de tensão chegou a 38,46±5,10% da pré-contração de CCh na concentração de 1000

μg/mL de EALPC, enquanto no ponto equivalente do controle a queda atingiu 55,4±9,5%

(Figuras 25 e 26), resultando em uma redução efetiva da resposta contrátil do EALPC de

aproximadamente 20% em relação ao controle.

Figura 25 - Traçado representativo do efeito de EALPC sobre a contração

induzida por CCh


72

Gráfico com valores médios para a contração submáxima de anéis de traqueia de

rato na presença de diferentes concentrações de EALPC (n=8). Cada ponto

representa a média ± E.P.M.

Figura 26 - Gráfico com efeito do EALPC sobre a contração induzida por CCh em traqueia

isolada de rato.


73

DISCUSSÃO

74

7 DISCUSSÃO

O presente estudo com as raízes de Pombalia calceolaria, herbácea perene, pouco

ramificada, predominante no Nordeste brasileiro, trata-se de uma pesquisa farmacognóstica

inédita em muitos aspectos, uma vez que dessa espécie vegetal existem poucos registros em

literatura.

Na raiz de P. calceolaria a presença de frutanos do tipo inulina, caracterizam este

sistema como sendo de reserva. Como descrito no ítem 5.1.1, a retenção de alto teor de

umidade nas raízes (frescas) de P. calceolaria, tem relação direta com o alto teor de inulina

presente em suas raízes, uma vez que este polissacarídeo exerce função biológica de proteção

contra a desidratação deste órgão vegetal que, no caso dessa espécie, é nativa de regiões

salinas e semi-áridas..

Além disso, o registro do predomínio deste carboidrato de reserva nas células do

córtex parenquimático caracteriza com mais precisão o local de reserva da inulina nas raízes

de P. calceolaria, uma vez que em muitas outras espécies vegetais, o local de reserva

acontece tanto no córtex parenquimático, quanto no córtex cambial, ou apenas no córtex

cambial. Este registro, somado ao registro morfoanatômico isodiamétrico das células

parenquimáticas, do floema e xilema, demonstradas na Figura 11, ambos inéditos, é de alta

relevância, pois além de caracterizar melhor esta espécie, também demonstra a diferença

anatômica desta raiz frente à raiz de Psychotria ipecacuanha, esta por sua vez já

extensamente registrada em literatura (GOMES, 2007). Na raiz de P. calceolaria essas

reservas, provavelmente, são utilizadas para a propagação vegetativa da planta (RIZZINI;

HERINGER, 1961; CARVALHO, 1999; BELL, 1993).

Diferentemente do que está registrado na literatura por Lorenzi & Matos (2002),

de que a propagação de P. calceolaria é somente por sementes, foi constatado por Silva

(2011), que houve enraizamento desta espécie utilizando a propagação vegetativa por

estaquia. Desta forma, pode-se dizer também que é possível o enraizamento de estacas desta

espécie sem necessidade do uso de reguladores de crescimento para estimular a rizogênese.

Isto facilita a propagação por estaquia da P. calceolaria em casa de vegetação.

Atualmente o uso da planta medicinal como recurso alternativo para o tratamento

da saúde está em contínua expansão em nível mundial. Para o desenvolvimento de

medicamentos a partir de uma droga vegetal algumas barreiras necessitam serem vencidas,

dentre elas a questão da contaminação microbiana da matéria-prima. As preparações obtidas a

partir de drogas vegetais, geralmente, são oriundas de plantas coletadas, secas e empacotadas

sem muitos cuidados de higiene e/ou controle sanitário, situação essa muito comum com as

75

plantas medicinais dessecadas a sombra vendidas em mercados populares, como é o caso das

raízes de P. calceolaria. Nesse sentido, a literatura registra que a qualidade microbiológica de

matérias-primas vegetais e produtos derivados geralmente apresentam índice de contaminação

microbiana acima dos níveis internacionalmente aceitos para medicamentos (SOUZA,

LIONZO, PETROVICK, 2006).

Para o controle de qualidade da droga vegetal, a secagem, tem uma alta relevância

na obtenção da mesma, uma vez que o produto final, que chega ao consumidor, deve ser

isento de condições favoráveis ao crescimento microbiano e às reações de hidrólise. Tais

condições comprometem tanto a qualidade do material vegetal, através da degradação de seus

constituintes químicos, quanto também a saúde do consumidor, além de facilitar o

armazenamento e o transporte sem riscos de deterioração (SHARAPIN, 2000).

A Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) publicou em Maio de

2014 a RDC nº 26, a qual define droga vegetal a planta medicinal ou suas partes, que

contenham as substâncias responsáveis pela ação terapêutica, após processos de

coleta/colheita, estabilização, quando aplicável, e secagem, podendo estar na forma íntegra,

rasurada, triturada ou pulverizada. Por isso a preocupação da ANVISA ao publicar a RDC nº

10 de março de 2010 que dispõe sobre a notificação de drogas vegetais e a RDC Nº 26 de

maio de 2014 que dispõe sobre o registro de medicamentos fitoterápicos e o registro e a

notificação de produtos tradicionais fitoterápicos. A publicação destas RDCs demonstram, por

parte da agência regulatória de saúde do país, a preocupação em garantir matéria-prima

vegetal de qualidade, sejam para a produção de fitoterápicos ou ainda para o uso pelo

consumidor, da droga vegetal ou do produto tradicional fitoterápico em preparações caseiras.

Por esta razão, a realização de estudos para obtenção tanto da droga vegetal quanto do

produto tradicional fitoterápico de qualidade, que atenda a legislação vigente, se faz

necessária (AGUIAR, 2013).

A etapa de secagem e determinação final da droga seca é um ensaio que determina

a quantidade de água presente na droga. Segundo Oliveira, Akisue e Akisue (1991) o teor de

umidade nos vegetais frescos é conhecido. As raízes apresentam teor de umidade de 50 a 85%

de tal forma que condiz com os valores encontrados para as operações de secagem (p. 57). As

raízes de P. calceolaria predominante nas regiões litorâneas, salinas e do semi-árido

nordestino, são ricas em frutanos do tipo inulina, a qual exerce função biológica de proteção

contra a desidratação na própria raiz, de forma que esta retém um alto teor de umidade. Nesse

contexto, a produção da droga vegetal a partir dessas raízes exige um cuidado a mais pelo

caráter higroscópico de seu marcador químico, a inulina.

76

Segundo BRASIL (1988), pelos motivos já descritos nos parágrafos anteriores, o

estabelecimento do teor de umidade residual para drogas vegetais é de 8 a 14%, valor este

compatível com o resultado expresso na Tabela 2 (p. 57), o qual demonstra que a escolha do

método de secagem para a obtenção de droga vegetal das raízes de P. calceolria foi

satisfatória.

Quanto aos aspectos granulométricos, a heterogeneidade obtida deve-se às

características morfológicas da raiz, a qual tem um aspecto tortuoso e com diâmetro bastante

diversificado ao longo de seu comprimento. O grau de divisão pode ser expresso por meio da

referência à abertura nominal da malha do tamis utilizado. Segundo Sharapin (2000), a

extração de uma droga em partes inteiras ou dividida em fragmentos grossos seria incompleta

devido a pobre penetração de solvente no tecido vegetal. O processo de extração seria ainda

igualmente muito lento, uma vez que as membranas celulares atuam como verdadeiras

barreiras que dificultam o processo de extração. A partir do cálculo do tamanho médio das

partículas, obtido do pó triturado homogeneizado de P. calceolaria, é possível classificar este,

segundo a Farmacopeia Brasileira 5ª edição, como pó grosso, o qual não seria apropriado para

a extração aquosa de seus ativos.

De outra forma, a divisão excessiva, com formação de pós muito finos, pode

causar problemas durante a extração, como por exemplo, compactação do pó nos processos de

percolação o que dificulta a passagem do solvente e gera uma extração incompleta da droga.

Nos processos de maceração, as partículas muito finas podem passar para o extrato causando

turbidez. Por essa razão, a preparação do extrato foi procedida com a raiz de P. calceolria no

intervalo granulométrico entre 500 a 1400 µm (p. 60).

A determinação do teor de cinzas totais permite a verificação de impurezas

inorgânicas não-voláteis que podem estar presentes como contaminantes, (FARIAS,

2003), assim como a determinação do teor de cinzas insolúveis em ácido destina-se à

verificação da presença de sílica e constituintes silicosos na droga (BRASIL, 2010). As

raízes de ipeca-verdadeira devem apresentar no máximo um teor de 5% de cinzas

totais (BRASIL, 1977). Observa-se, assim, que a P. calceolaria atende a esse parâmetro.

Essas determinações constituem referências de qualidade e caracterização da matéria-prima

vegetal.

Todo extrato vegetal, seja ele de natureza aquosa ou orgânica, refere-se a um

fitocomplexo, ou seja, é constituído por substâncias chamadas metabólitos vegetais, primários

e/ou secundários, que apresentam uma potencial ação farmacoterapeutica quando

administrados como medicamentos. Enquanto medicamentos farmacoterápicos apresentam

77

como principal característica a presença do princípio ativo isolado. Os fitoterápicos ou

produtos tradicionais fitoterápicos caracterizam-se pela ação sinérgica de um conjunto de

substâncias químicas, dentre as quais podem existir uma prevalente, chamada de marcador, ou

seja, aquela que terá uma influência mais evidente na ação farmacoterapeutica ou no controle

de qualidade daquela espécie vegetal. Segundo a RDC nº 26/2014, marcador é definido como

substância ou classe de substâncias (ex.: alcaloides, flavonoides, ácidos graxos) utilizada

como referência no controle da qualidade da matéria-prima vegetal e do fitoterápico,

preferencialmente tendo correlação com o efeito terapêutico. O marcador pode ser do tipo

ativo, quando relacionado com a atividade terapêutica do fitocomplexo, ou analítico, quando

não demonstrada, até o momento, sua relação com a atividade terapêutica do fitocomplexo.

A constituição química das raízes de P. calceolaria foi inicialmente investigada

através do preparo de extratos orgânicos, etanólico e acetônico, os quais foram purificados,

em trabalhos anteriores (PONTES, 2012), em coluna cromatográfica clássica onde foram

obtidas frações de baixo teor e alta polaridade. Na sequência, ao ser realizada a prospecção

fitoquímica nas raízes dessa espécie vegetal, foi verificada a presença de saponinas, esteróides

e açúcares redutores. Uma vez conhecido o potencial terapêutico de polissacarídeos extraídos

de espécies vegetais como arabinogalactanas, as quais, segundo Matos (2007), apresentam

mais de seiscentos trabalhos científicos referenciando a sua atividade imunoestimulante,

procedeu-se o preparo do extrato aquoso a partir das raízes de P. calceolaria seguida da

adição de solvente orgânico (como descrito no item 5.2.7) com o intuito de investigar a

presença e o teor de açúcar, onde foi obtido um polissacarídeo branco, com aspecto amorfo,

com odor e sabor neutros.

A separação de misturas complexas de oligossacarídeos não é fácil devido à

semelhança estrutural e o peso molecular, além de que também a sua identificação é

dificultada pela falta de produtos comerciais disponíveis (BROKL et al., 2011).

Uma vez que os frutanos são normalmente encontrados na forma de misturas

complexas de carboidratos com diferentes GPs, composição de monômeros e ligações

glicosídicas, a sua análise é um passo fundamental para adquirir a informação básica sobre o

próprio polímero, bem como para aprofundar a compreensão do seu mecanismo de ação, que

é dependente da sua estrutura química.

A inulina está presente em plantas com misturas heterogêneas, com diferentes

graus de polimerização (GP) e estruturas químicas variadas. Os tipos de frutanos encontrados

em plantas (moléculas oligoméricas ou poliméricas) são dependentes da espécie relacionados

com as condições ambientais e estágios de desenvolvimento da planta (MANCILLA-

78

MARGALLI; LOPEZ, 2006). As propriedades físico-químicas e funcionais da inulina estão

diretamente correlacionados com o GP, assim como com a presença de ramificações.

Dentre o amplo leque de pesquisas a serem realizadas em estudos posteriores com

as raízes de P. calceolaria, um diz respeito a investigação das propriedades farmacológicas

atribuídas ao frutano proveniente dessas raízes. Ao considerar o resultado obtido de 13,0% de

inulina presente nas raízes de P. calceolaria e correlacionando-o com o teor obtido do

liofilizado a partir do extrato aquoso nas referidas raízes, que foi de 17,71%, é possível

verificar o alto teor desse polissacarídeo nas mesmas. Além disso, tendo como referência os

registros em literatura do teor de inulina na chicória (Cichorium intybus) 28% (SILVA et al.,

2008), na alcachofra de Jerusalém (Helianthus tuberosus), 12,21% (GUO et al., 2015) e na

batata Yacon (Smallanthus sonchifolius) 19,75% (ALLES; TESSARO; NOREÑA, 2015) o

valor encontrado nas raízes de P. calceolaria mostraram-se como resultados promissores, para

torná-la uma fonte de extração de inulina proveniente de espécie de origem brasileira,

diferentemente das três citadas anteriormente, principais fontes atuais de extração de inulina

no mercado mundial e que são de origem estrangeira

Atualmente já é conhecido na literatura que a inulina pode ser uma alternativa

como adjuvantes de medicamentos por apresentar estabilidade na presença das enzimas

gástricas e intestinais. Uma ampla revisão publicada recentemente por Imran et al. (2012)

aborda diversas aplicações da inulina como carreadores de fármacos. Além de ser um

estabilizador adequado de vacinas, vários trabalhos têm relatado um papel adjuvante na

obtenção da inulina para resposta imune após a vacinação (MENSINK et al., 2015). O fato da

inulina não ser destruída no trato gastrointestinal (TGI) representa uma alternativa para

proteger o TGI de fármacos anti-inflamatórios não-esteroidais (AINE´S) (IMRAN et al.,

2012).

Segundo Kim, Faqih, Wang (2001), a solubilidade da inulina na água aumentou

notavelmente com a temperatura, sendo praticamente insolúvel a 25ºC e atingindo cerca de

35% (p/v) a 90ºC, além de que a produção industrial é baseada na difusão em água quente.

Este estudo, mais uma vez, corrobora com as propriedades de solubilidade da inulina extraída

das raízes de P. calceolaria, onde foi encontrado 7% de solubilidade em água a temperatura

ambiente, insolubilidade em solventes orgânicos como etanol e diclorometano e solubilidade

em água quente. Normalmente a solubilidade dos polímeros diminuem com o aumento do

grau de polimerização (WADA, 2005).

Segundo revisão realizada por Mensink (2015), uma transição vítrea (Tg) mais

elevada está correlacionada com um peso molecular mais elevado, de forma que este também

79

indica que os cristais de inulina que se dissolvem a temperaturas mais elevadas são compostos

de inulina de maior peso molecular. Ainda segundo o mesmo autor, a inulina pode apresentar

uma variação de peso molecular no intervalo de 5,0 x 10² a 1,3 x 104 Da. Exemplos mais

conhecidos são as inulinas comercializadas provenientes da marca Sigma®, sendo aquela

extraída da chicória (Cichorium intybus) com peso molecular de 4,6 x 10³ Da e a inulina

obtida da Alcachofra de Jerusalém (Helianthus tuberosus) de peso molecular aproximado de

3x10³ Da. Enquanto que para a inulina extraída do extrato aquoso das raízes de P. calceolaria

foi encontrado, neste trabalho, o peso molecular estimado de 4,0 x 10³ Da, evidenciando que

este resultado encontra-se dentro do esperado descrito em literatura para esse tipo de

polissacarídeo.

Pelas razões expostas acima, o presente trabalho fez um estudo preliminar com a

inulina proveniente das raízes de P. calceolaria, uma vez que o polissacarídeo, ao ser obtido

do extrato aquoso das raízes, no início do estudo, ainda tinha sua natureza química

desconhecida. Este estudo preliminar foi realizado através de avaliação miorrelaxante do

polissacarídeo em traqueia isolada de rato, a fim de investigar a correlação deste com a ação

antitussígena e expectorante popularmente atribuída ao extrato aquoso. Porém, não houve,

nessa avaliação, um resultado significativo que justificasse o polissacarídeo como responsável

pelo conhecido uso popular dessa raiz ainda que o teor encontrado no extrato aquoso tenha

sido alto. Para verificar o grau de polimerização, as ramificações, os tipos de ligações

presentes nesse polímero, serão necessários maiores investimentos nessa pesquisa.

No entanto, ainda que a inulina, isoladamente, tenha inúmeras atividades

terapêuticas já relatadas na literatura, este trabalho também teve o propósito de avaliar a

atividade miorrelaxante em traqueia de rato, tanto do polissacarídeo isolado, como já foi

mensionado anteriormente, quanto do extrato aquoso obtido das raízes. O principal motivo

para a realização deste experimento farmacológico no modelo citado é pelo fato de o amplo

uso popular do extrato aquoso das raízes de P. calceolaria fazer referência à conhecida ação

antitussígena e expectorante (CARTAXO, SOUZA, ALBUQUERQRE, 2010; LORENZI,

MATOS, 2008; SARAIVA et al., 2015). Porém, a avaliação miorrelaxante do extrato aquoso

liofilizado de P. calceolaria (EALPC) como possível agente miorrelaxante sobre traqueia

isolada de rato pré-contraída com carbacol foi de apenas 20%, resultado este insuficiente para

justificar o efeito expectorante conhecido popularmente. No entanto, outros modelos

farmacológicos podem ainda ser avaliados com o intuito de investigar o potencial uso

antitussígeno e expectorante do extrato aquoso da raízes de P. calceolaria.

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CONCLUSÕES

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8 CONCLUSÕES

O estudo inédito morfoanatômico das raízes de Pombalia calceolaria é uma

contribuição relevante na diferenciação das raízes dessa espécie vegetal em relação às

raízes de Psychotria ipecacuanha, muitas vezes confundidas pela semelhança

morfológica.

A confirmação da presença de cristais de inulina nas raízes de P. calceolaria, revela,

no aspecto botânico, que trata-se de orgão vegetal de reserva, pelo alto teor de

polissacarídeo.

O presente estudo é de importante contribuição para o controle de qualidade desta

espécie vegetal, uma vez que traz ao conhecimento do meio científico resultados

farmacopeicos até então desconhecidos como o teor de umidade residual, o teor de

cinzas totais, a determinação granulométrica das raízes trituradas de P. calceolaria, de

forma a contribuir com o desenvolvimento da droga vegetal dentro das especificações

estabelecidas pelas normas vigentes do Brasil;

Revela que no Nordeste brasileiro a ipecacunha dos raizeiros (Pombalia calceolaria)

tem como marcador analítico a inulina, constituindo-se como um parâmetro de

diferenciação da espécie Psychotria ipecacuanha, conhecida por ipecacuanha

verdadeira, que de acordo com a literatura (GOMES, 2007) indica a presença de

amido em sua constituição química.

O polissacarídeo encontrado nas raízes de Pombalia calceolaria apresenta potenciais

propriedades, no campo farmacêutico e alimentar, que tem despertado interesse

crescente em pesquisas em todo o mundo.

Os primeiros estudos farmacológicos registrados em literatura com as raízes de

Pombalia calceolaria, cujos resultados estão descritos neste trabalho, mostraram-se ainda

preliminares, evidenciando a necessidade de continuidade na pesquisa de novos modelos

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farmacológicos para comprovar o uso popular broncodilatador extensamente difundido

no Nordeste Brasileiro.

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ANEXO

DECLARAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA ANIMAL

(CEPA) DA UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ.

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ PROGRAMA DE PÓS … · para ser cada dia melhor, pois bondade...

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