UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE FARMÁCIA ... · ESTUDO DO PERFIL DE PEPTÍDEOS...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE FARMÁCIA, ODONTOLOGIA E ENFERMAGEM PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA THYCIANA RODRIGUES RIBEIRO ESTUDO DO PERFIL DE PEPTÍDEOS SALIVARES DE CRIANÇAS COM CÁRIE DA PRIMEIRA INFÂNCIA: UMA VISÃO DA SALIVA COMO MEIO DIAGNÓSTICO FORTALEZA 2009
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE FARMÁCIA, ODONTOLOGIA E ENFERMAGEM
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA
THYCIANA RODRIGUES RIBEIRO
ESTUDO DO PERFIL DE PEPTÍDEOS SALIVARES DE CRIANÇAS COM CÁRIE
DA PRIMEIRA INFÂNCIA: UMA VISÃO DA SALIVA COMO MEIO
DIAGNÓSTICO
FORTALEZA
2009
1
THYCIANA RODRIGUES RIBEIRO
ESTUDO DO PERFIL DE PEPTÍDEOS SALIVARES DE CRIANÇAS COM CÁRIE DA
PRIMEIRA INFÂNCIA: UMA VISÃO DA SALIVA COMO MEIO DIAGNÓSTICO
Dissertação submetida à Coordenação do Curso de
Pós-Graduação em Odontologia da Universidade
Federal do Ceará, como requisito parcial para
obtenção do grau de Mestre em Odontologia.
Área de Concentração: Clínica Odontológica
Orientadora: Profa. Dra. Cristiane Sá Roriz Fonteles
Fortaleza
2009
2
R372e Ribeiro, Thyciana Rodrigues
Estudo do perfil de peptídeos salivares de crianças com cárie
da primeira infância : uma visão da saliva como meio
diagnóstico / Thyciana Rodrigues Ribeiro . – Fortaleza, 2009.
120 f. : il.
Orientador: Profa. Dra. Cristiane Sá Roriz Fonteles
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Ceará.
Programa de Pós-Graduação em Odontologia, Fortaleza-Ce,
2009
1.Cárie Dentária 2. Peptídeos 3. Saliva 4. Streptococcus
mutans I. Fonteles, Cristiane Sá Roriz (orient.) II. Título
CDD: 617.67
3
THYCIANA RODRIGUES RIBEIRO
ESTUDO DO PERFIL DE PEPTÍDEOS SALIVARES DE CRIANÇAS COM CÁRIE DA
PRIMEIRA INFÂNCIA. UMA VISÃO DA SALIVA COMO MEIO DIAGNÓSTICO
Dissertação apresentada à Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem da
Universidade Federal do Ceará como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em
Odontologia
Aprovada em:___/___/___
BANCA EXAMINADORA
Profa. Dra. Cristiane Sá Roriz Fonteles (Orientadora)
Universidade Federal do Ceará - UFC
Prof. Dr. Krishnamurti de Morais Carvalho
Universidade Estadual do Ceará – UECE
Prof. Dra. Anya Pimentel Gomes Fernandes Vieira
Universidade de Fortaleza - UNIFOR
4
Dedico este trabalho em primeiro lugar a Deus,
à minha mãe Lúcia e ao meu pai Silvio.
5
AGRADECIMENTOS
Agradeço em primeiro lugar a Deus pela minha vida, por tudo o que tenho e sou;
pela minha força de vontade e determinação, elementos essenciais na minha caminhada.
Ao meu pai Silvio e a minha mãe Lúcia, exemplos de dignidade e honestidade,
por todo amor, carinho e união da nossa família, pilares da minha educação e formação moral.
Agradeço por serem as duas pessoas mais importantes da minha vida.
À toda a minha família que se fez presente em algum momento da minha vida,
certamente trazendo alguma contribuição, principalmente à minha tia Silvia Fernandes, que
desde o início foi uma grande incentivadora para a minha carreira acadêmica.
À minha orientadora, professora Dra. Cristiane Sá Roriz Fonteles, por todos os
ensinamentos desde o segundo semestre da graduação, essenciais para meu crescimento
científico, profissional e pessoal. Pelo exemplo de força, caráter, determinação e superação; e
por ter estado presente em todos os momentos deste mestrado, sempre tendo soluções para
tornar possível o que parecia ser impossível.
À professora Dra. Cibele Barreto Mano de Carvalho, pela ajuda e facilidade de
acesso ao Laboratório de Anaeróbios do departamento de Patologia e Medicina Legal da
faculdade de Medicina da UFC, durante a etapa de análise microbiológica.
Ao professor Dr. Krishnamurti de Morais Carvalho, pela importante contribuição
e orientação no início da análise dos peptídeos através do HPLC, por ter me recebido no
laboratório sob sua coordenação na Universidade Estadual do Ceará para que essa etapa
pudesse ser realizada e, também, por aceitar o convite para fazer parte da banca avaliadora da
presente dissertação.
À professora Dra. Karen Gregso, da Indiana University Purdue University
Indianapolis (IUPUI), por ter viabilizado meu acesso ao Laboratório de Materiais Dentários
dessa universidade.
Ao professor Dr. Karl Dria, do departamento de Química da Indiana University
Purdue University Indianapolis pela atenção e auxílio essenciais para o processamento das
amostras de saliva na análise dos peptídeos.
Ao professor Dr. Manassés Fonteles pela importante colaboração neste trabalho.
Ao professor Dr. Sérgio Lima Santiago, coordenador do Programa de Pós-
Graduação em Odontologia da UFC, pelo apoio, exemplo de competência e pela atenção
sempre prestada.
6
Às professoras Dra. Cláudia Ferreira Santos e Dra. Andréa Silva Aguiar, pelo
auxílio em diferentes momentos deste estudo.
Ao professor Dr. André Jalles pela realização da análise estatística desse estudo.
Ao professor Dr. Masatoshi Ando, da Indiana University Purdue University
Indianapolis, pela atenção e pelo apoio durante o período em que o estudo foi realizado em
Indianápolis.
À professora Dra. Anya Pimentel Gomes Fernandes Vieira por ter aceito o convite
para compor a banca examinadora do presente trabalho.
A todos os professores do Programa de Pós Graduação em Odontologia da
Universidade Federal do Ceará.
Aos funcionários Olavo, do setor de microbiologia da UFC; Silvia, do laboratório
de Farmacologia Metabólica e Fisiologia Celular da UFC; Rosinha, do laboratório de
Neurofarmacologia da UECE e Júnior, do setor de Importação da UFC pelo importante
auxílio prestado em diferentes etapas deste estudo.
Aos funcionários do Programa de Pós Graduação em Odontologia, Lúcia e
Germano pela ajuda e atenção. Ao bibliotecário Nonato Ribeiro, da Universidade Federal do
Ceará, pela atenção com as padronizações bibliográficas.
A todos os colegas de mestrado pela convivência e momentos compartilhados. À
Dra. Dijane, Dra. Catarina, Ramille, Jorgeana e ao Luciano pelo companheirismo do nosso
grupo de pesquisa e pela amizade.
Às amigas da graduação Karla Shangela, Juliana Ximenes, Tatiana Maria, Tereza
Castro e Priscila Rolim, que auxiliaram com empenho e dedicação os procedimentos
realizados na Clínica de Odontopediatria da UFC.
À Michele Baffi Diniz pela amizade construída e companheirismo, muito
importantes durante a última etapa do estudo, realizada em Indianápolis. À Silvia Franklin
pela importante atenção e pelo apoio e incentivo prestados no mesmo período, mesmo à
distância.
À todos os meus amigos e colegas por contribuírem com meu desenvolvimento
pessoal.
À professora Josy pela realização da revisão gramatical, com tamanha dedicação e
eficiência.
À FUNCAP pelo apoio financeiro e manutenção da bolsa de auxílio.
Àqueles que injustamente não foram citados mas que certamente contribuíram
muito para a realização desse trabalho.
7
“Ele transformou a tempestade em leve brisa e as
ondas emudeceram.”
Salmos 107: 29
8
RESUMO
Este trabalho buscou estudar o perfil de peptídeos salivares de crianças com cárie
da primeira infância, relacionando-o com níveis de estreptococos do grupo mutans (EGM)
salivares e experiência de cárie. Cento e seis crianças, na faixa etária de 10 a 71 meses de
idade, participaram do estudo, sendo 48 com experiência de cárie e 58 sem cárie da primeira
infância. Duas amostras de saliva total foram coletadas de todos os participantes. A primeira
amostra era composta de saliva não estimulada, utilizada para análise dos peptídeos. Após
coletada, essa saliva foi centrifugada, o sobrenadante retirado, liofilizado, dividido em pools
com cárie, sem cárie e em amostras individuais e armazenado em freezer a -20oC até análise
em aparelho de LC-MS (Cromatografia Líquida acoplado ao Espectrômetro de Massa). A
busca por peptídeos foi baseada em massas conhecidas de peptídeos existentes em bancos de
dados. Saliva estimulada representou a segunda coleta, utilizada para o cultivo dos EGM
(UFC/mL) em meio ágar mitis salivarius bacitracina (MSB). Anamnese e exame dentário
foram realizados para cálculo do índice ceo-s e ceo-d. Os dados foram analisados por meio de
modelo logístico binário. Resultados foram considerados significantes quando p-valor < 0,05.
Os cromatogramas obtidos a partir dos pools de crianças com/sem cárie apresentaram
diferenças em relação aos picos apresentados. A identificação das massas moleculares
sugeriram a presença de nove peptídeos. Regressão logística mostrou que 3 peptídeos se
relacionaram com experiência de cárie. PRP IB-4 associou-se a um aumento de experiência
de cárie (p=0,035); α-defensina 3 (p=0,019) e β-defensina 3 (p=0,034) associaram-se à
redução de experiência de cárie. Em adição, aumento na idade (p=0,020) e aumento na
contagem de EGM (p=0,036) ocasionaram um aumento na experiência de cárie, mas sexo não
se relacionou com cárie dentária (p=0,877). A partir desses resultados, pôde-se concluir que a
presença de peptídeos específicos na saliva de crianças com e sem cárie dentária predispõem a
um maior ou menor risco à essa doença.
Palavras-chave: Cárie dentária. Peptídeos. Saliva. Streptococcus mutans.
9
ABSTRACT
The aim of the present study was to find a relation between salivary peptides,
caries experience and mutans streptococci (MS) levels in saliva of caries free (CF) and caries
susceptible (CS) children in early childhood. One hundred and six 10 – 71 month-old children
participated in the study. Fifty-eight children were CF and 48 who had experienced dental
caries formed the CS group. Two samples of whole saliva were collected from all
participants. Unstimulated whole saliva was collected, subsequently centrifuged. Supernatants
were lyophilized, divided into two pools (CF and CS) and individual samples, and stored at
-20oC for posterior analysis using LC-MS (Liquid Chromatography Mass Spectrometry) to
study the peptide profile. Identification of salivary peptides was based on theoretical
molecular masses available from online databases. Stimulated whole saliva was collected and
used for MS detection in MSB agar medium. MS concentration in saliva was reported in
cfu/mL. Dental examination was performed and dmfs/dmft scores were calculated. Data was
analysed by using logistic regression. The chromatograms from CF and CS pools of saliva
had different peak patterns. The identification of molecular masses suggested the presence of
9 peptides. Three of them were significantly related with caries experience. The presence of
HNP-3 (α-defensin 3) (p = 0.019) and HBD-3 (β-defensin 3) (p = 0.034) reduced the chances
of experiencing early childhood caries (ECC). The presence of PRP IB-4 significantly
increased caries experience (p = 0.035). In addition, age (p = 0.020) and MS counts (p =
0.036) increased caries experience, however gender was not associated with dental caries (p =
0.877). Our results suggest that presence of specific peptides in saliva of CF or CS children in
early childhood predisposes to a higher or lower risk of caries experience.
Key-words: Dental caries. Peptides. Saliva. Streptococcus mutans.
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LISTA DE FIGURAS, QUADROS E GRÁFICOS
FIGURA 1 Diagrama de Keyes ............................................................................................. 22
FIGURA 2 Cárie severa da primeira infância ........................................................................ 23
FIGURA 3 Localização das glândulas salivares .................................................................... 36
FIGURA 4 Principais funções da saliva ................................................................................. 41
FIGURA 5 Representação das estruturas das α e β-defensinas humanas .............................. 52
FIGURA 6 Tratamento odontológico realizado em um dos participantes do estudo ............. 66
FIGURA 7 Coleta de saliva realizada na clínica de Odontopediatria da UFC....................... 67
FIGURA 8 Acessórios utilizados durante a coleta de saliva .................................................. 68
FIGURA 9 Procedimentos realizados antes da liofilização ................................................... 68
FIGURA 10 Procedimentos feitos durante a preparação do meio de cultura .......................... 69
FIGURA 11 Desenho esquemático dos procedimentos de diluição ........................................ 71
FIGURA 12 Placa de Petri semeada......................................................................................... 71
FIGURA 13 Separação das amostras de saliva ........................................................................ 73
FIGURA 14 Amostras de saliva antes e depois da ressuspensão ............................................. 74
FIGURA 15 Sistema LC/MS utilizado ..................................................................................... 74
FIGURA 16 Cromatograma representativo do pool com cárie ................................................ 82
FIGURA 17 Cromatograma representativo do pool sem cárie ................................................ 82
FIGURA 18 Identificação no MS.Peptídeos das proteínas ricas em prolina IB-4 ................... 87
FIGURA 19 Identificação no MS. Peptídeos da alfa defensina 3 ............................................ 87
FIGURA 20 Identificação no MS. Peptídeos da beta defensina humana 3 .............................. 87
FIGURA 21 Cromatograma de criança com experiência de cárie ........................................... 88
FIGURA 22 Cromatograma de criança sem experiência de cárie............................................ 88
QUADRO 1 Trabalhos científicos mostrando diferentes tipos de peptídeos encontrados na
saliva ......................................................................................................................................... 58
GRÁFICO 1 Representação gráfica da relação tridimensional entre idade, presença/ausência
da α-defensina 3 (1744 m/z) e presença/ausência e cárie ......................................................... 86
11
LISTA DE TABELAS
1 Distribuição das crianças com cárie (ceo-d, ceo-s e CPI-s) por idade, sexo e contagem de
EGM, segundo a AAPD ........................................................................................................... 77
2. Distribuição das crianças sem cárie (ceo-d, ceo-s e CPI-s) por idade, sexo e contagem de
EGM, segundo a AAPD ........................................................................................................... 78
3 Distribuição da amostra de crianças com e sem cárie em função do gênero e da severidade
da doença .................................................................................................................................. 79
4 Distribuição de crianças (n = 96) segundo o número de superfícies cariadas, obturadas e
perdidas devido à cárie, e os diferentes níveis de contaminação por EGM ............................. 79
5 Distribuição dos níveis de contaminação por EGM em relação à idade ............................ 80
6 Distribuição dos pacientes com idade, ceo-s, contagem de EGM em relação ao tipo de
amamentação, duração da amamentação e escolaridade do responsável ................................. 81
7 Regressão logística da probabilidade de cárie considerando todas as variáveis ................ 84
8 Regressão logística da probabilidade de cárie considerando idade, EGM, sexo e os
peptídeos PRP IB-4, α-defensina 3 e β-defensina 3 ................................................................. 85
9 Relação entre presença/ausência de cada peptídio e presença/ausência de cárie de 106
crianças ..................................................................................................................................... 85
10 Relação entre presença/ausência de cárie e presença/ausência dos peptídeos α-defensina
3 (1744) e β-defensina 3 (2580) ............................................................................................... 86
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LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
AAPD Academia Americana de Odontologia Pediátrica
AIDS Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
ATP Adenosina Trifosfato
CAS Lesões de Cáries Anteriores Superiores
Ceo-d Número de Dentes Decíduos Cariados, Extraídos devido à Cárie ou
Obturados
Ceo-s Número de Superfícies de Dentes Decíduos Cariadas, Extraídas
devido à Cárie ou Obturadas
CFF Lesões de Cáries de Fóssulas e Fissuras
CP Crianças Prematuras
CPI Cárie da Primeira Infância
CPOD Número de Dentes Permanentes Cariados, Perdidos ou Obturados
CSI Índice de Severidade de Cárie
CN Crianças não Prematuras
EGM Estreptococos do Grupo Mutans
EUA Estados Unidos da América
FDA Administração Norte Americana de Comidas e Drogas
hBD3 Alfa-defensina 3 humana
HE Hipoplasia de Esmalte
HIV Vírus da Imunodeficiência Humana
HNP Alfa defensina
HPLC Cromatografia Líquida de Alta Pressão
ICC Indivíduos com Experiência de Cárie
IL-1 Interleucina 1
ISC Crianças Livres de Cárie
IUPUI Indiana University Purdue University Indianapolis
KDa Quilo Dalton
LC/MS Cromatografia Líquida associada ao Espectrômetro de Massa
Ln Logarítmo natural
LPS Lipopolissacarídeo
MSB Meio Ágar Mitis Salivarius Bacitracina
m/z Massa por Carga
13
ng Nanograma
PAs Peptídeos Antimicrobianos
PRPs Peptídeos Ricos em Prolina
PCC Pool de Pacientes com Cárie
RCP-TR Polimerase Transcriptase Reversa
PSC Pool de Pacientes sem Cárie
TFA Ácido Trifluoroacético
UFC/ml Unidades Formadoras de Colônia por Mililitro
α Alfa
β Beta
μL Microlitros
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 16
2 REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................................... 19
2.1 Cárie Dentária .................................................................................................................. 19
2.1.1 Epidemiologia .................................................................................................................. 19
2.1.2 Etiologia .......................................................................................................................... 21
2.2 Cárie da Primeira Infância .............................................................................................. 22
2.2.1 Problemas Decorrentes .................................................................................................... 23
2.2.2 Fatores Associados à CPI ................................................................................................ 24
2.2.2.1 Carboidratos Fermentáveis ........................................................................................... 24
2.2.2.2 Dente e Hospedeiro Suscetível ..................................................................................... 26
2.2.2.3 Fatores Comportamentais, Ambientais e Sociais ......................................................... 27
2.2.2.4 Microorganismos .......................................................................................................... 28
2.2.2.5 Estreotococos do Grupo Mutans .................................................................................. 29
2.3 Saliva .................................................................................................................................. 36
2.3.1 Composição ..................................................................................................................... 37
2.3.2 Funções ............................................................................................................................ 41
2.3.3 Xerostomia ...................................................................................................................... 44
2.3.4 Uso da Saliva como Meio Diagnóstico ........................................................................... 46
2.3.4.1 Testes Atualmente Disponíveis .................................................................................... 47
2.3.4.2 Relevância .................................................................................................................... 48
2.4 Peptídeos Antimicrobianos .............................................................................................. 49
2.4.1 Características Comuns ................................................................................................... 49
2.4.2 Presença de PAs em Diversos Seres Multicelulares ........................................................ 50
2.4.3 Sítios de Localização em Seres Humanos ....................................................................... 51
2.4.4 Relação com Doenças ...................................................................................................... 53
2.4.5 Importância de Estudos sobre PAs .................................................................................. 54
2.5 Peptídeos antimicrobianos da cavidade oral .................................................................. 55
2.5.1 Presença nos Tecidos Orais e no Sulco Ggengival.......................................................... 55
2.5.2 Presença na Saliva ........................................................................................................... 57
3 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 63
3.1 Objetivo Geral .................................................................................................................. 63
15
3.2 Objetivos Específicos ........................................................................................................ 63
4 MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................... 64
4.1 Protocolo Clínico .............................................................................................................. 64
4.1.1 Desenho ........................................................................................................................... 64
4.1.2 Examinadores .................................................................................................................. 64
4.1.3 Amostra ........................................................................................................................... 64
4.1.4 Critérios de Inclusão dos Participantes ............................................................................ 65
4.1.5 Critérios de Exclusão dos Participantes .......................................................................... 65
4.1.6 Entrada do Voluntário no Estudo .................................................................................... 65
4.1.7 Exame Dentário ............................................................................................................... 66
4.1.8 Coleta de Saliva ............................................................................................................... 67
4.2 Protocolo Analítico ........................................................................................................... 68
4.2.1 Transporte e Armazenagem da Saliva ............................................................................. 68
4.2.2 Análise Microbiológica ................................................................................................... 69
4.2.3 Preparo do Meio de Cultura ............................................................................................ 69
4.2.4 Preparo da Solução Salina ............................................................................................... 70
4.2.5 Processamento das Amostras........................................................................................... 70
4.2.6 Testes Bioquímicos ......................................................................................................... 72
4.3 Análise dos Peptídeos ....................................................................................................... 72
4.3.1 Preparo da Amostra ......................................................................................................... 72
4.3.2 Processamento das Amostras em LC/MS ........................................................................ 73
4.3.3 Identificação dos Peptídeos ............................................................................................. 75
4.4 Análise Estatística ............................................................................................................. 75
5. RESULTADOS ................................................................................................................... 76
5.1 Avaliação dos Peptídeos ................................................................................................... 82
6 DISCUSSÃO ........................................................................................................................ 89
7 CONCLUSÕES .................................................................................................................... 97
REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 98
APÊNDICES ......................................................................................................................... 114
ANEXO .................................................................................................................................. 119
16
1. INTRODUÇÃO
A cárie dentária é uma doença crônica, infecto-contagiosa, que se manifesta
clinicamente por meio da descalcificação das estruturas dentárias, assumindo na criança um
aspecto agudo, conhecido como cárie da primeira infância (CPI), relacionada diretamente ao
índice de estreptococos do grupo mutans (EGM) existentes na cavidade oral logo após a
erupção da primeira unidade dentária (MATTOS-GRANER et al., 1998). Etiologicamente,
essa doença é semelhante aos outros tipos de cáries dentárias, mas biologicamente pode
diferir em alguns aspectos, já que a flora bacteriana e a defesa imunológica ainda não estão
completamente desenvolvidas em crianças jovens e as superfícies de seus dentes erupcionados
ainda estão imaturas (SEOW, 1998), gerando uma doença clinicamente caracterizada pelo
aparecimento súbito, pela rápida disseminação e progressão, manifestada clinicamente como
cárie rampante (MC DONALD et al., 2005).
Segundo a Academia Americana de Odontologia Pediátrica (2009) (AAPD –
American Academy of Pediatric Dentistry), CPI refere-se à presença de uma ou mais
superfícies cariadas (cavitadas ou não cavitadas), ausentes (devido à cárie) ou restauradas, em
qualquer dente decíduo, de criança com idade igual ou inferior a 71 meses. No Brasil, quase
27% das crianças de 18 a 36 meses apresentam pelo menos um dente decíduo com
experiência de cárie dentária, chegando a uma proporção de 60% nas crianças com idade de 5
anos. De uma forma geral esses índices são considerados altos. Em média, uma criança
brasileira de 3 anos ou menos já possui, pelo menos, um dente com experiência de cárie
dentária. Aos 5 anos, esta média aumenta para quase 3 dentes afetados (MINISTÉRIO DA
SAÚDE, 2004).
Intimamente relacionada à atividade de cárie, encontra-se a saliva, uma secreção
exócrina complexa, de importância na manutenção da homeostase da cavidade bucal (DIAZ-
ARNOLD et al., 2002). Suas funções em relação ao fluxo salivar e à composição molecular
são bem específicas: capacidade tamponante, ação mecânica de limpeza, caráter
antibacteriano e ação mineralizadora (AMERONGEN et al., 2004; DOWD, 1999;
LENANDER-LUMIRAKI et al., 2000; TARABAY et al., 1997). Portanto, indivíduos que
apresentam xerostomia freqüentemente possuem uma elevada prevalência de cárie e doença
periodontal (NEDERFORS, 2000).
Nos últimos 10 anos, o uso da saliva como meio diagnóstico tem avançado
exponencialmente, por tratar-se de um fluido que pode ser coletado de forma não invasiva e
17
usado para medir e monitorar o risco de cárie (STRECKFUS et al., 2002). A colonização por
estreptococos do grupo mutans (EGM) geralmente está relacionada à alta incidência de cárie
durante a primeira infância, dessa forma a contagem de EGM permite a identificação de
crianças com alto risco à CPI (MATTOS-GRANER et al., 2001). A predição do risco a novas
cáries tem sido de grande interesse, tornando-se importante o desenvolvimento de uma nova
estratégia preventiva para a doença, especialmente significante para crianças sadias e crianças
portadoras de necessidades especiais (TAO et al., 2005). Para o Brasil, um país
subdesenvolvido, é relevante o fato de que os procedimentos preventivos podem se concentrar
mais eficientemente nos grupos de alto risco e não serem aplicados desnecessariamente nos
grupos de baixo risco, reduzindo o custo das estratégias de prevenção (JORDAN et al., 1987;
VAN HOUTE, 1993). Contudo, o melhor preditor de risco à cárie ainda é a experiência prévia
dessa doença, pois existem crianças altamente contaminadas com EGM, mas que não
desenvolvem lesões de cárie (BOWDEN, 1997).
Nesse cenário, a saliva exerce uma importante função protetora. Nela existem
quantidades apreciáveis de proteínas, peptídeos de baixo peso molecular e aminoácidos livres.
Em 1978, El Shobaki et al. relataram a presença de 16 aminoácidos na saliva de crianças na
faixa etária entre 6 a 36 meses de idade: leucina, fenilalanina, lisina, valina, treonina,
metionina, triptofano, alanina, glutamina, ácido aspártico, serina, glicina, tirosina, asparagina,
cisteína e ácido glutâmico. Posteriormente, foram encontrados altos índices de arginina e
lisina em indivíduos adultos livres de cárie (VAN WUYCKHUYSE et al., 1995). Mais
recentemente, verificou-se uma associação entre aminoácidos livres, experiência de cárie e
níveis de EGM em saliva, onde a presença de prolina aumentou o risco à cárie, enquanto com
a presença de glicina observou-se uma redução do risco à doença em crianças com cárie
(FONTELES et al., 2009).
Em relação aos peptídeos, muitos têm sido descobertos baseado em sua habilidade
de matar ou inibir a proliferação de microorganismos patogênicos. Peptídeos antimicrobianos
são bem conhecidos em plantas, insetos e animais, nos quais são a primeira linha de defesa
contra patógenos invasores (MURAKAMI et al., 2002). Peptídeos também já foram utilizados
para avaliar resposta de glândulas salivares em ratos com diabetes (YAMAMOTO et al.,
1997). Nos seres humanos, principalmente em adultos, alguns peptídeos com atividade
antibacteriana foram identificados, incluindo histatinas, defensinas e a única catelicidina
humana LL37 (MATHEWS et al., 1999; MURAKAMI et al., 2002; AYAD et al., 2000).
Tao et al. (2005) estudaram peptídeos salivares em crianças e encontraram três
peptídeos antimicrobianos relacionados à prevalência de cárie dentária, que são beta-
18
defensina-3 humana (hBD-3), catelicidina LL37 e alfa-defensina HNP1-3, havendo dois
peptídeos, LL37 e hBD-3, que não estavam relacionados com experiência de cárie. Em
adição, níveis de HNP1-3 foram maiores em crianças sem cárie do que em crianças com cárie.
Os aminoácidos e os peptídeos de baixo peso molecular são permutáveis com o
fluido da placa, sendo tanto substratos metabólicos da microflora da placa quanto produto das
vias metabólicas desses microorganismos (PERINPANAYAGAM et al., 1995), podendo
refletir a atividade bacteriana e suscetibilidade à cárie. O estudo dos peptídeos salivares é de
grande relevância, podendo levar ao desenvolvimento de um teste simples para avaliar risco
de cárie, além de permitir a utilização desses peptídeos de forma terapêutica no futuro.
Nenhuma pesquisa avaliou simultaneamente peptídeos salivares, experiência de cárie e índice
de EGM; permanecendo por ser verificada a existência dessa correlação, fato ainda inédito na
ciência.
19
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Cárie Dentária
O termo cárie dentária é utilizado para descrever os resultados – sinais e sintomas
– de uma dissolução química localizada na superfície do dente, causada por eventos
metabólicos no biofilme que cobre a área afetada. A destruição pode afetar esmalte, dentina e
cemento, as lesões podem se manifestar clinicamente com variedade de forma e coloração
(FEJERSKOV; KIDD, 2008).
2.1.1. Epidemiologia
Na segunda metade do século XX, a Associação Internacional de Odontologia
preparou um estudo sobre o período de 1950 a 1963 (FDI, 1964), com dois objetivos
principais nessa pesquisa: verificar o status da cárie dentária (puramente epidemiológico) e
verificar o efeito de inibição do flúor da água de abastecimento contra a cárie.
Historicamente, a cárie dentária tem mostrado uma maior prevalência em países
desenvolvidos quando comparados com os países subdesenvolvidos; fato justificado pela
dieta com a presença de alto consumo de carboidratos refinados em países ricos ao contrário
da dieta proveniente da agricultura de subsistência de países pobres (FEJERSKOV; KIDD,
2008). Esse padrão histórico, no entanto, sofreu mudanças. Segundo Behbehani e Scheutz
(2004), o Kuwait por exemplo apresentava o índice CPOD, entendido como a proporção de
indivíduos com dentes permanentes cariados, perdidos ou obturados na idade de 12 anos em
1982 de 2,0, passando para 2,6 em 1993. No mesmo país, houve uma elevação no CPOD na
idade de 6 anos de 0,2 em 1993 para 4,6 em 2000.
Um estudo feito com 528 crianças da Guatemala indicou que a prevalência de
cárie na dentição decídua dessa população foi duas vezes maior do que em crianças brancas
dos Estados Unidos, enquanto na dentição permanente não houve diferença. A experiência de
cárie foi significantemente maior em meninos. Até os 4 anos de idade, o ataque de cáries foi
maior no segmento anterior da cavidade oral (INFANTE; GILLESPIE, 1976).
Nos Estados Unidos, segundo o levantamento nacional de saúde e nutrição
(National Health and Nutrition Examination Survey - NHANES) em 2007, que publicou
dados de dois períodos nesse país (1988-1994 e 1999-2004), mostrou que embora a cárie
20
dentária tenha sofrido um declínio significante entre as crianças em idade escolar (6 a 12
anos), essa doença infecto-contagiosa tem permanecido como a mais prevalente doença
crônica da infância. Na faixa etária de 2 a 11 anos, a cárie na dentição decídua cresceu de
40% em 1988-1994 para 42% em 1999-2004. Na idade compreendida de 2 a 5 anos, houve
um crescimento de 24% para 28% no mesmo período. E, ainda na faixa etária de 2 a 4 anos, a
prevalência de cárie aumentou de 18% para 24%. Curiosamente, na dentição permanente na
população de 12 a 19 anos, a prevalência de cárie passou de 68% em 1988-1994 para 59% em
1999-2004.
No Brasil, o maior levantamento epidemiológico de âmbito nacional na área de
saúde bucal foi realizado no período de 2002 a 2003. Foi possível, dessa forma, ter uma visão
ampla do cenário nacional da saúde bucal. Dentre as crianças de 18 a 36 meses, 26,85%
apresentaram pelo menos um dente decíduo com experiência de cárie dentária, sendo que a
proporção chegou a 59,37% entre crianças de 5 anos de idade. Quanto à cárie dentária na
dentição permanente, 68,92% das crianças brasileiras de 12 anos e 88,94% dos adolescentes
de 15 a 19 anos apresentaram pelo menos um dente permanente com experiência de cárie.
Nos adultos ocorreu um efeito cumulativo, com uma tendência de crescimento na prevalência
em função da idade, por exemplo, na faixa etária de 35 a 44 anos e de 65 a 74 anos, observou-
se uma prevalência de cárie de 99,48%. Diversidades regionais também foram percebidas. Na
faixa etária de 18 a 36 meses, idades de 5 e 12 anos e na faixa etária de 15 a 19 anos, os
percentuais de CPOD/ceo-d=0 (ceo-d é entendido como dentes decíduos cariados, extraídos
devido à cárie e obturados) foram sempre inferiores nas regiões Norte e Nordeste quando
comparados com os das regiões Sul e Sudeste (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2004).
Observa-se uma tendência ao crescimento da prevalência da cárie no Brasil,
semelhante ao observado no mundo, que tem sido acompanhada por um fenômeno conhecido
como polarização, caracterizado pela concentração de maiores frequências da doença em
pequenos grupos populacionais (CARDOSO et al., 2003; MALTZ; SILVA, 2001;
TRAEBERT et al., 2001). Desta feita, faz-se importante a identificação de grupos de alto
risco à cárie para que os procedimentos preventivos possam se concentrar mais
eficientemente, ao invés de serem aplicados desnescessariamente em crianças de baixo risco
(JORDAN et al., 1987; VAN HOUTE, 1993).
21
2.1.2. Etiologia
Por volta do século XVIII, os antigos babilônios atribuíam as cáries à “beliscada
dos vermes de dente” . Segundo Galeno, considerado autoridade suprema em medicina após o
segundo século, a cárie tinha início nas porções internas do dente, em consequência de
condições anormais no sangue, isto é, os humores do corpo alteravam a estrutura interna dos
dentes causando a cárie. Hunter, em 1778, propôs uma teoria admitindo que a cárie tinha
origem na polpa dentária, sendo, na realidade um efeito secundário à inflamação da polpa
(BURNETT; SCHIRP; SCHUSTER, 1978). Depois de várias explicações formuladas para a
etiologia da cárie dentária, Miller (1890) formulou o conceito que mais tarde ficou conhecido
como teoria químico-parasitária da cárie, segundo o qual a cárie tinha duas causas principais:
ação dos ácidos e ação dos germes. A destruição do esmalte e da dentina seria conseqüência
primariamente de um processo de desmineralização, sendo o agente desmineralizante um
ácido oriundo da fermentação microbiana dos carboidratos provenientes da dieta.
Segundo Keyes (1968), existiam 2 visões em relação à etiologia e à prevenção das
cáries. A primeira abordava a lise do esmalte por ácidos produzidos pela interação
carboidrato-bactéria, sendo o tratamento da cárie proporcionado pelo aumento da resistência à
desmineralização ou pela redução da produção de ácidos. A segunda visão propunha que a
cárie era consequência patológica de doenças microbianas invasivas, podendo esse ataque do
esmalte por microorganismos acidogênicos ser prevenido com algum tipo de cobertura ou
tratamento com flúor.
Pesquisas com ratos que desenvolveram cárie dentária, quando infectados por
bactéria específica, demonstraram a transmissibilidade desta infecção de animal para animal
enquanto outros estudos demonstraram o papel fundamental dos açúcares na dieta (KEYES,
1960; FITZGERALD; KEYES, 1960). No estudo de Keyes (1960), a transmissão
interindividual da microbiota cariogênica podia ser interrompida por uma dieta contendo
penicilina originando “proles não infectadas”, que permaneciam livres de cáries mesmo com
uma dieta cariogênica. Todavia, quando esses animais “resistentes” entravam em contato com
animais “suscetíveis” ou com a placa bacteriana ou com fezes desses animais, tornavam-se
eles próprios cárie-suscetíveis desenvolvendo lesões.
Em resumo, é necessária a presença simultânea de três fatores etiológicos
principais para a ocorrência da CPI (Figura 2), são eles: carboidratos fermentáveis, dente e
hospedeiro suscetível e microorganismos cariogênicos (KEYES; JORDAN, 1963); além de
22
fatores comportamentais, ambientais (RAMOS-GOMEZ et al., 2002) e sociais
(O’SULLIVAN; TINANOFF, 1993).
Figura 1: Diagrama de Keyes - Três círculos sobrepostos retratando a possível relação do grupo de fatores
responsáveis pela atividade de cárie. Existem inúmeras variáveis em cada parâmetro.
Adaptado: Keyes, Jordan, 1963.
Nas crianças, a cárie pode estar relacionada com inapropriados hábitos de
amamentação (TINANOFF; O’SULLIVAN, 1997). Em 1978, a Academia Americana de
Odontologia Pediátrica (AAPD) numa declaração conjunta com a Academia Americana de
Pediatria criou o termo “cárie de mamadeira” para definir uma severa forma de cárie
relacionada com o uso de mamadeira. Depois de duas décadas, reconhecendo que essa distinta
apresentação clínica não estava associada exclusivamente com pobres práticas de alimentação
e que a cárie era uma doença infecciosa, a AAPD adotou o termo “cárie da primeira infância”
por melhor refletir sua etiologia multifatorial (AAPD, 2008).
2.2. Cárie da Primeira Infância
O termo Cárie da Primeira Infância refere-se à presença de uma ou mais
superfícies cariadas (cavitadas ou não), perdidas (devido à cárie) ou restauradas em qualquer
dente decíduo de criança com idade menor ou igual a 71 meses (AAPD, 2008). Essa condição
é considerada severa em indivíduos com menos de 3 anos de idade, apresentando qualquer
sinal de cárie em superfície lisa recebendo o nome de Cárie Severa da Primeira Infância
(CPI-s). Em adição, crianças de 3 a 5 anos de idade, apresentando 1 ou mais superfícies lisas
cavitadas, perdidas (devido à cárie) ou restauradas em dente súpero-anterior, ou a presença de
23
um número de superfícies cariadas, perdidas ou restauradas ≥ 4 (para 3 anos de idade), ≥ 5
(para 4 anos de idade), ≥ 6 (para 5 anos de idade) constitui CPI-s (AAPD, 2008).
CPI caracteriza-se clinicamente por afetar principalmente os dentes anteriores
superiores, seguido pelo envolvimento dos primeiros molares. Os incisivos inferiores
geralmente não são afetados por causa da posição de proteção ocupada pela língua contra o
desafio cariogênico (HOROWITZ, 1998; KELLY; BRUERD, 1987; MC DONALD et al.,
2005; MILNES, 1996; RIPA, 1988; PETTI; CAIRELLA; TARSITANI, 2000).
Figura 2: Cárie severa da primeira infância em criança de três anos de idade.
Fonte: Guedes Pinto, 1998.
2.2.1. Problemas decorrentes
A CPI é uma condição passível de prevenção que pode causar nas crianças dor,
infecção, abscessos, dificuldade de mastigação, desnutrição, desordens gastrintestinais e baixa
auto-estima (ACS et al., 1992). Além disso, leva a ocorrência de cáries na dentição
permanente, maloclusão, problemas fonoaudiológicos, retardo no crescimento e ostracismo
social (GREENWELL et al., 1990; KASTE et al., 1992; RIPA, 1988). A dor de dente
decorrente geralmente permanece por várias semanas, afetando as atividades regulares da
criança, como comer, dormir e brincar (VARGAS; RONZIO, 2006). É necessário intervenção
profissional imediata para prevenir destruição dentária subseqüente, além de outros problemas
de saúde generalizados (AAPD, 2008).
Extração dentária é um tratamento comum e às vezes necessário para as cáries
avançadas. Perda prematura dos primeiros molares decíduos freqüentemente resulta em
problemas ortodônticos futuros. Quando a população afetada possui baixo poder aquisitivo, a
situação se agrava, uma vez que a família não dispõe dos meios necessários ao provimento da
24
assistência odontológica necessária por falta de condições financeiras (GRINDEFJORD;
DAHLLOF; MODEER, 1995; JOHNSEN et al., 1986; O’SULLIVAN; TINANOFF, 1996).
O tratamento da CPI requer considerações especiais devido à imaturidade
emocional das crianças afetadas. Na maioria dos casos, o tratamento dentário deve ser feito
sob anestesia geral ou sedação (BANKEL et al., 2006). Normalmente, os odontopediatras são
os únicos profissionais capacitados para realização desses procedimentos (VARGAS;
RONZIO, 2006). O resultado dessas peculiaridades é o alto custo do tratamento (TINANOFF;
O’SULLIVAN, 1997). Todos esses fatores fazem da criança um importante público-alvo para
a prevenção (BANKEL et al., 2006).
2.2.2. Fatores associados à CPI
Embora a etiologia da CPI seja similar a outros tipos de cárie dentária como
oclusais ou de superfície lisa (KRASSE, 1965), a biologia pode diferir em alguns aspectos, já
que a flora bacteriana e o sistema imunológico das crianças estão em processo de
desenvolvimento. Em adição, as superfícies dentárias estão recém-erupcionadas e imaturas,
podendo mostrar defeitos hipoplásicos. Portanto, a CPI possui fatores de risco especialmente
voltados para as crianças (SEOW, 1998).
Existem fatores específicos relacionados à CPI. Os dentes decíduos, neste tipo de
cárie, assumem uma significância especial porque a progressão das lesões para o interior da
dentina é rápida devido à fina espessura do esmalte nos incisivos decíduos (~0,5mm
comparado a mais de 1mm em incisivos permanentes) (RIPA, 1988). Em relação à
amamentação, durante a sucção, o bico do peito ou da mamadeira é colocado contra o palato,
momento em que a língua é estendida sobre os incisivos inferiores; dessa forma o leite
materno ou proveniente de mamadeira entra em contato com todos os dentes, com exceção
dos incisivos inferiores que estão fisicamente protegidos pela língua (RIPA, 1988). Este
último leva ao padrão comumente encontrado na CPI, caracterizado pelos 4 incisivos
superiores sendo mais afetados, enquanto os 4 incisivos inferiores permanecem hígidos (MC
DONALD et al., 2005).
2.2.2.1. Carboidratos Fermentáveis
Hábitos dietéticos são importantes fatores de risco à cárie dentária. O primeiro
contato da criança com a comida e o gradual estabelecimento do padrão de alimentação
25
durante a infância formam uma base importante para o futuro desenvolvimento de hábitos
alimentares e de outros hábitos relacionados à saúde (BANKEL et al., 2006).
Os principais açúcares associados com as cáries nas crianças são sacarose, glicose
e frutose (SEOW, 1998). O carboidrato mais importante na formação da placa dental e na
etiologia da cárie é o dissacarídeo sacarose, mais conhecido como açúcar da cana
(BURNETT; SCHIRP; SCHUSTER, 1978; GUSTAFSSON et al., 1954). A molécula de
sacarose está constituída de glicose e frutose (LEHNINGER; NELSON; COX, 2000),
substratos facilmente convertidos em ácidos orgânicos pelo metabolismo glicolítico
(anaeróbio) das bactérias acidogênicas da placa. A sacarose sofre ação de uma enzima
(dextranosucrase) sintetizada pelo estreptococos do grupo mutans, sendo convertida em
dextrano, que é um importante fator na formação e manutenção da placa dental. Pode também
ser convertida em levano, outro constituinte importante da placa. Logo após a formação da
placa, a sacarose prontamente penetra, sendo convertida em dextrano, levano ou outro
glucano, ou passa a constituir um substrato para a microbiota da placa. Os ácidos orgânicos
resultantes do metabolismo anaeróbico na via glicolítica ficam concentrados na placa
bacteriana, penetram nos diversos tegumentos e , finalmente atingem o esmalte, causando a
dissolução do seu componente inorgânico e a lesão cariosa (BURNETT; SCHIRP;
SCHUSTER, 1978). Estudos in vitro sugerem que a frutose e a glicose são tão cariogênicas
quanto a sacarose na capacidade desses açúcares em causar queda no nível do pH (NEFF,
1967) e desmineralização do esmalte (KOULOURIDES, 1976).
Vários estudos publicados sugerem que crianças com cárie da primeira infância
têm alta freqüência de consumo de açúcar, não somente por fluidos dados em mamadeiras
(HALLETT; O’ROURKE, 2006; HALLONSTEN et al., 1995; MATTOS-GRANER et al.,
1998), mas também por alimentos de consistência sólida contendo açúcar (NOBRE DOS
SANTOS et al., 2002). As práticas de amamentação estão associadas com o padrão e
severidade de cárie. Segundo Hallett e Rourke (2006), crianças que utilizaram mamadeira
apresentaram um padrão de CPI anterior de 37-42% comparado com um padrão de 27% das
crianças que não utilizaram mamadeira (p=0,04). Além disso, também foi verificado que o
padrão anterior de cáries era significativamente maior em crianças postas para dormir com
mamadeira (44%), ou que a tomavam durante o dia (50%), quando comparado a crianças que
não tinham esses hábitos.
Hallonsten et al. (1995) verificaram que a média de ceo-s (número de superfícies
dentárias cariadas, extraídas devido à cárie ou obturadas na dentição decídua) era de 5,3 em
26
grupo de crianças com cárie que tomavam mamadeira, sendo de 4,9 no grupo de crianças com
cárie, mas que não tinham o hábito de tomar mamadeira.
Bankel et al. (2006) realizaram um estudo com o objetivo de identificar fatores
relacionados com a CPI em crianças suecas de 2 e 3 anos de idade, no qual foi avaliado o
consumo de produtos contendo sacarose. Seus resultados demonstraram que 38% das crianças
que ingeriam produtos contendo açúcar mais de 28 vezes por semana tinham cáries;
comparado a 8% das que ingeriam numa freqüência menor. Foi encontrada CPI em 42% das
crianças que tomavam mamadeira durante a noite e em 29% das que comiam ou bebiam
produtos contendo açúcar à noite.
A maioria das fórmulas contendo leite são sintetizadas para simular o leite
humano (SEOW, 1998). Erickson et al. (1998), utilizando métodos in vitro, relataram que
algumas dessas fórmulas mais comuns têm o mesmo potencial cariogênico da sacarose. Em
contraste, os resultados de Bowen et al. (1997), usando ratos, sugeriram que as fórmulas
testadas contendo leite causavam menos cáries quando comparadas com a água contendo
sacarose. Mattos-Graner et al. (1998), em estudo com crianças de 1 a 2,5 anos de idade de
Piracicaba para avaliar a relação entre prevalência de cárie e fatores clínicos, microbiológicos
e fatores da dieta verificou que das crianças com cárie que tomavam mamadeira, 5,6%
tomavam somente leite, 11,5% leite com açúcar e 30,4% uma mistura de leite, açúcar e
cereais. Ressaltando dessa forma a maior cariogenicidade da fórmula contendo leite.
2.2.2.2.Dente e hospedeiro suscetível
Logo após a erupção, a superfície de esmalte recém exposta sofre o estágio final
da maturação pós eruptiva e endurecimento, quando íons como o fluoreto são incorporados
(CURY, 2002). Estudos epidemiológicos sugerem que esse período compreendido após a
erupção e antes do final da maturação é quando o dente está mais suscetível às cáries
(CARLOS; GITTELSOHN, 1965). Em várias crianças, a combinação de esmalte imaturo
recém erupcionado em um ambiente de flora cariogênica com ingestão freqüente de
carboidratos fermentáveis proporciona ao dente suscetibilidade às cáries (SEOW, 1998).
Em adição à falta de maturação, a presença de desenvolvimento de defeitos na
estrutura do esmalte pode aumentar o risco à cárie (SEOW, 1998). Defeitos de
desenvolvimento do esmalte podem manifestar-se como perda parcial ou total do esmalte
(amelogênese imperfeita) ou como uma mudança na translucência (opacidade) (NEVILLE et
al., 2009).
27
A hipoplasia de esmalte é explicada morfologicamente como um
subdesenvolvimento primário do dente, o qual geralmente apresenta fóssulas e fissuras
profundas, coalescentes e fragmentárias, particularmente nos primeiros e segundos molares
decíduos. Essas fóssulas e fissuras promovem sítios propícios para que bactérias cariogênicas
possam aderir e colonizar, permitindo que a bactéria fique retida na base do defeito em
contato com a dentina exposta. Conseqüentemente o processo de cárie dentária nessas
superfícies alteradas pode acontecer mais rapidamente que nas superfícies de dentes hígidos
(LI; NAVIA; BIAN, 1996). Li et al. (1996) fizeram um estudo para verificar experiência de
cárie na dentição decídua de crianças com 3 a 5 anos de idade em relação à presença ou
ausência de hipoplasia de esmalte (HE); tendo sido encontrado como resultado uma forte
associação entre HE e experiência de cárie na população estudada. Nesse estudo, das crianças
que possuíam HE, 92,8% tinham cáries e 7,2% estavam livres de cáries. Enquanto dentre as
crianças sem HE, 79% possuíam lesões cariosas e 21% não tinham cáries.
Deficiências nutricionais têm um impacto importante no desenvolvimento do
dente e na suscetibilidades às doenças orais, uma vez que o baixo peso ao nascer e a
prematuridade estão significantemente associados com o desenvolvimento de hipoplasia de
esmalte (LI; NAVIA; CAUFIELD, 1994). Todavia, essa relação não é encontrada em todos os
estudos. Na dissertaçao de mestrado de Mota (2008), foram examinadas 120 crianças
desnutridas, com idade média de 41 meses, das quais 75 não apresentaram lesões de cárie
(62,5%), enquanto 45 apresentaram essa doença (37,5%).
2.2.2.3. Fatores comportamentais, ambientais e sociais
Ramos-Gomez et al. (2002), objetivando buscar uma associação entre fatores
bacterianos, comportamentais e ambientais com a CPI em população de crianças espanholas e
afro-americanas com menos de 60 meses de idade, verificaram que não havia diferença
estatisticamente significante na dieta, nos padrões de amamentação, no nível de educação dos
pais, na renda familar e em relação ao país de origem em crianças com e sem cárie. Foi
encontrada relação significante entre CPI e perda de seguro dental da criança. Indivíduos
infantis sem seguro dental encontravam-se duas vezes mais propícios a terem CPI do que
crianças com seguro (público ou privado).
Contrastando com alguns dados acima, Bankel et al. (2006), identificaram em
população infantil na faixa etária de 2 a 3 anos de idade de Götemborg, que quando a mãe
possui menos que 10 anos de educação escolar, 63% dos filhos têm cáries comparado a 12%
28
de crianças acometidas pela CPI, cujas mães tiveram uma longa educação. Hallett e O’Rourke
(2006) realizaram um estudo com crianças de 4 a 5 anos de idade da Austrália, no qual foi
verificado que, quanto menor o nível educacional da mãe, maior a prevalência de CPI-s.
Também foi constatado que renda familiar anual menor que US$20.000 (vinte mil dólares)
está significativamente associada com CPI anterior e com CPI-s.
Em um estudo realizado com crianças de 3 e 4 anos de idade de Connecticut
(EUA), com o objetivo de avaliar fatores sociais e biológicos que contribuem com cáries nos
dentes anteriores superiores, ao explorar diferenças entre crianças com padrão anterior de
lesões de cárie em relação àquelas com padrão anterior e posterior, foram encontradas
diferenças nas respostas dos pais em relação aos seguintes questionamentos: frequência de
ingestão de sorvete, convicção dos pais em evitar as cáries dos filhos e deles próprios
(O’SULLIVAN; TINANOFF, 1993).
2.2.2.4. Microorganismos
Várias espécies microbianas da cavidade oral têm a capacidade de produzir cárie
em ratos e cricetos gnotobióticos mantidos em regime de dieta rica em sacarose; tais como:
Streptococcus faecalis, Streptococcus sanguis, Streptococcus salivarius, Streptococcus
mutans, Lactobacillus acidophilus, Lactobacilos casei, Actinomyces viscosus e Actinomyces
naeslundii (BURNETT; SCHIRP; SCHUSTER, 1978). Em 1986, Loesche verificou que a
cárie dentária é uma infecção específica e que os principais patógenos envolvidos são os
EGM. Vários estudos relacionando microorganismos envolvidos no processo patológico da
cárie foram realizados na tentativa de explicar esse complexo processo.
Em relação ao risco de cárie, as atenções voltaram-se para a contagem de
lactobacilos e EGM, devido à associação positiva desses microorganismos com as cáries
humanas e à proximidade dessa relação com consumo de carboidratos. Sendo assim, a
contagem de lactobacilos e EGM serve não somente como um preditor do risco de cárie, mas
também como um indicador do consumo de carboidratos, que é outro fator de risco à cárie
(VAN HOUTE, 1993).
2.2.2.5. Estreptococos do grupo mutans
Vários estudos mostram que o principal microorganismo envolvido com a cárie
são os estreptococos do grupo mutans, uma vez que crianças altamente infectadas por esse
29
microorganismo desenvolvem mais cáries do que aquelas que o possuem em baixo nível
(ALALUUSUA, et al., 1996; ALALUUSUA; RENKONEN, 1983; BOUE; ARMAU;
TIRABAY, 1987; DOUGLASS; O’SULLIVAN; TINANOFF, 1996; ERSIN et al., 2006;
FUJIWARA et al., 1991; GRANATH et al., 1993; GRINDEFJORD et al., 1991; NOBRE
DOS SANTOS et al., 2002; O’SULLIVAN; TINANOFF, 1993; THIBODEAU;
O’SULLIVAN, 1999; ZICKERT; EMILSON; KRASSE, 1983; ZOITOPOULOS et al.,
1996). Embora a microflora oral de bebês seja consideravelmente diferente da que está
presente em adultos ou crianças mais velhas, o grande nível de infecção por EGM pode
indicar alto risco de cárie não somente em adultos e crianças mais velhas (MC CARTHY;
SNYDER; PARKER, 1965), mas também em crianças durante a primeira infância
(ALALUUSUA; RENKONEN, 1983; VAN HOUTE; GIBBS; BUTERA, 1982). O sorotipo
mais freqüente é o “c”, sendo isolado tanto nas crianças quanto nas mães (ALALUUSUA et
al., 1996).
A capacidade cariogênica do EGM depende de sua capacidade de produzir
(acidogênica) e de tolerar (acidúrica) grandes quantidades de ácido lático. Três mecanismos
desse grupo de bactérias contribuem para a proliferação e produção de ácidos. Primeiro, a
maioria dos outros estreptococos são homofermentativos (produzem somente ácido lático),
que, em termos de rendimento de energia, significa que eles são limitados à produção de 2
mols de ATP por mol de glicose metabolizada (SIMMONDS; TOMPKINS; GEORGE,
2000). Em contraste, os EGM são heterofermentativos (produzem tanto ácido lático quanto
outros ácidos), podendo mudar a concentração relativa de enzimas na sua via glicolítica para
produzir produtos ácidos mistos resultando numa produção de energia de 2 a 3 mols de ATP
produzidos por mol de glicose metabolizada. Segundo, quando o pH declina, é extremamente
difícil para uma bactéria manter a produção de energia. Os EGM conseguem manter o
processo glicolítico em pH tão baixo quanto 5.0, que é um nível no qual outros
microorganismos da placa, com exceção dos lactobacilos, são inibidos. Terceiro, como outras
poucas bactérias da placa, o EGM estoca carboidrato não metabolizado na forma de
polissacarídeos intracelulares, ou seja, quando as fontes externas tornam-se limitadas, a célula
pode metabolizar os carboidratos de reserva e continuar crescendo e produzindo ácidos
(SIMMONDS; TOMPKINS; GEORGE, 2000).
O interesse em pesquisar os EGM levou à criação de um método de isolamento
preciso. Dessa forma Gold, Jordan e VanHoute (1973) desenvolveram um meio seletivo para
esses microorganismos, no qual o ágar mitis salivarius foi utilizado como meio-base, após a
descoberta de que este meio, seletivo para estreptococos orais, seria nutricionalmente
30
adequado e não inibiria o crescimento dos EGM. Os autores testaram diversas concentrações
de sacarose capazes de inibir o crescimento de outros estreptococos de amostras de placa
bacteriana. Concentração de 20% inibia S. sanguis e S. Mitis, mas não o S. salivarius. A
adição de 0,2 unidades de bacitracina por mililitro de meio foi suficiente para a completa
eliminação dos S. salivarius e S. mitis, mas não dos S. sanguis. Nem a sacarose, nem a
bacitracina, quando utilizadas nessas concentrações, interferiram no crescimento dos EGM.
Dessa forma, a concentração de sacarose a 20% e 0,2 unidades de bacitracina por mililitro de
ágar mitis salivarius foi efetiva na seleção de EGM, passando esse meio a ser denominado
ágar mitis salivarius bacitracina (MSB). Apenas um pequeno grupo de enterococos e
leveduras demonstraram crescimento nesse meio, em amostras de pacientes com lesões
dentinárias avançadas ou amostras do dorso da língua; entretanto, as colônias de enterococos
ou leveduras seriam facilmente diferenciadas dos EGM pela aparência da colônia.
a) Colonização Inicial por Estreptococos do grupo mutans
Foi realizado um estudo longitudinal numa população de crianças de 2, 3 e 4 anos
de idade, que residiam em Helsinqui, na qual foi avaliado o estabelecimento inicial, a
frequência de isolamento e as mudanças na proporção de EGM na placa de incisivos e
molares decíduos e na saliva com referência à experiência de cárie. Verificou-se que as 5
crianças que possuíam maior contaminação por EGM eram os indivíduos mais cárie-ativos e
que o estabelecimento precoce de EGM na placa de incisivos decíduos pode indicar ataque de
cárie precoce e extensivo na dentição decídua (ALALUUSUA; RENKONEN, 1983).
Estudos sobre a colonização da cavidade oral pelos EGM têm indicado que as
crianças adquirem esse microorganismo no começo da vida, mas não antes que o primeiro
dente tenha erupcionado (BERKOWITZ; JORDAN; WHITE, 1975). Carlsson et al. (1970)
encontrou dados referentes à não detecção de EGM em amostras de saliva de 27 crianças
durante o primeiro ano de vida. Berkowitz, Jordan e White (1975) pesquisaram sobre o
estabelecimento precoce dos EGM na cavidade oral de 138 crianças com idade de 3 semanas
a 14 meses. EGM foram encontrados somente em 40 crianças. Estas, subseqüentemente,
tiveram todos os incisivos superiores extraídos aos 18 meses de idade por causa de cárie
rampante. Saliva foi obtida de três sujeitos antes e depois da erupção do primeiro incisivo.
EGM não foram detectados no período anterior à erupção, entretanto as amostras de placa
foram positivas para EGM em espécimes obtidas 10 a 12 semanas após a erupção do primeiro
incisivo decíduo.
31
Ao contrário da crença comum, existe evidência preliminar de que o EGM pode
ser encontrado na cavidade oral antes da erupção dos dentes. Comparando crianças
prematuras (CP) com crianças que nasceram após gestação de 9 meses (CN), foi observado
que as CN tiveram uma maior prevalência de EGM. Esse resultado pode estar relacionado ao
fato de que as CP têm menos contato pessoal com suas mães e, portanto menos exposição ao
EGM, ou pelo fato de que seus tecidos orais estão menos desenvolvidos em relação às
condições ótimas para a colonização por EGM (WAN et al., 2001a). Em um outro estudo,
também realizado com crianças pré-dentadas prematuras e CN, foi constatado que a
prevalência de EGM foi de 50% nas CP e de 60% nas CN. A média de EGM foi menor nas
CP (53 ± 117 CFU/mL) comparado às CN (166 ± 47 CFU/mL, p < 0.001), entretanto a
análise de risco mostrou que não há diferenças para CP e CN (WAN et al., 2001b).
b) Presença de EGM após a erupção do primeiro dente decíduo
A prevalência de cárie e EGM salivar foram pesquisados em 356 crianças de 0 a 2
anos de idade do Japão, nas quais não houve detecção desses microorganismos em crianças
com idade inferior a 6 meses. Todas as crianças nas quais foram detectados EGM já possuíam
o primeiro dente. A concentração salivar de EGM foi correlacionada significativamente com o
número de dentes erupcionados (r=0.339, P<0.0001). Um grande aumento no número de
EGM foi observado com a erupção dos primeiros molares decíduos. As 80 crianças que não
tinham cárie, mas possuíam EGM em 1988 mostraram um aumento significativamente maior
de cáries do que as 181 crianças que não tinham cáries dentárias nem EGM em 1988
(FUJIWARA et al., 1991).
Em estudo sobre a prevalência de EGM, realizado em 1189 crianças de 1 ano de
idade residentes nos subúrbios de Estocolmo, foi feita a coleta bacteriana dos dois terços
anteriores do dorso da língua, verificando-se presença de EGM em apenas 6,3% da população
estudada. O consumo noturno e total de bebida contendo açúcar e a amamentação por um
período maior que 10 meses foram associados à presença de EGM. Os resultados indicaram
nessa população um padrão de comportamento predisposto, maternalmente determinado já
estabelecido. A colonização precoce por EGM implica no aumento do risco às cáries na
dentição decídua, e nesses casos, medidas preventivas precoces devem ser tomadas
(GRINDEFJORD et al., 1991).
Mattos-Graner et al. (1998), estudando sobre a associação entre prevalência de
cárie e variáveis clínicas, microbiológicas e da dieta em crianças brasileiras de 1 a 2 anos e 6
32
meses de idade, detectaram EGM em 80,3 % das crianças estudadas. Entre essas, 58,5%
tiveram 1-50 unidades formadoras de colônia (UFC) de EGM e 21,8% demonstraram mais
que 50 UFC de EGM. As crianças que apresentavam mais que 50 UFC de EGM apresentaram
significativamente maior número de lesões de cáries do que as que apresentaram níveis
menores (p<0.05).
c) “Janela de infectividade”
Fujiwara et al. (1991) realizaram estudo com 356 crianças de 0 a 2 anos de idade.
EGM foram encontrados em somente 7,3% na população com idade maior ou igual a 6 meses
e menor que 1 ano. Aumentando a proporção para 29,7% na idade maior ou igual a 1 ano e 6
meses e menor que 2 anos; e para 43,4% na população com faixa etária maior ou igual a 2
anos e menor que 2 anos e 6 meses.
Posteriormente esses resultados puderam ser explicados pelo estudo de Caufield;
Cutter e Dasanayke (1993), que comprovou a ocorrência de maior aquisição de EGM na
infância em uma média de idade bem delineada, que vai dos 19 aos 31 meses de idade (média
de 26 meses de idade), designada de “janela de infectividade”. Para esse estudo, os autores
recrutaram pares de mães e filhos, os quais foram acompanhados desde o nascimento até os 3
e 6 anos de idade; e as mães foram selecionadas no seu terceiro mês de gravidez por terem
altos níveis de EGM em saliva não estimulada. Trinta e oito das 46 crianças estudadas
adquiriram EGM numa média de idade de 26 meses.
Estudo foi realizado com crianças brasileiras situadas na faixa etária entre 12 e 30
meses de idade, tendo como um dos objetivos investigar as variações da infecção por EGM
durante o período de 1 ano de acompanhamento. Como resultados, observou-se que, no grupo
que tinha de 12 a 24 meses de idade, houve um aumento na infecção por EGM em 33,9% dos
casos, comparado a 16,9% dos casos de diminuição. Porém no grupo com 25 a 30 meses de
idade, em 23,8% das crianças ocorreu aumento da infecção contra 38,1% nos quais observou-
se redução (MATTOS-GRANER et al., 2001).
Em contraste com o conceito da “janela da infectividade” para o tempo de
colonização dos EGM, Wan et al. (2003) encontraram um crescimento constante da categoria
de infecção com as idades das crianças e com o aumento do número de dentes erupcionados.
A prevalência cumulativa da colonização de EGM em todas as crianças foi 5%, 18%, 49%,
53%, 62%, 68%, 70%, 74,5% e 79% aos 0, 6, 9, 12 ,15, 18, 21 e 24 meses de idade,
33
respectivamente. Demonstrando haver um aumento nos níveis de infecção por EGM com um
aumento na idade.
d) Colonização por EGM dos 3 aos 5 anos
As cáries dentárias e os microorganismos associados na saliva e placa de crianças
afro-caribeanas e caucasianas de 3 a 4 anos de idade foram avaliadas no sul de Londres, sendo
verificado que o ceo-d sofreu significante aumento com a idade e com os grupos étnicos.
Tanto para crianças afro-caribeanas quanto para caucasianas, o ceo-d foi significantemente
maior naqueles em que foram isolados na saliva EGM e lactobacillus (ZOITOPOULOS et al.,
1996).
Avaliando associações entre prevalência de cárie e EGM, desenvolveu-se um
estudo com 2.728 crianças pré-escolares sul-africanas com idade de 4 ou 5 anos, no qual cerca
de 70% das crianças tinham ceo-s (número de superfícies cariadas, extraídas devido à cárie ou
obturadas na dentição decídua) ≤ 6 e 60% tinham EGM detectáveis em quantidade ≤ 105
UFC∕mL de saliva. Os resultados mostraram que cáries dentárias estavam associadas com
EGM (p<0,001) de forma que, quanto menor fosse a contagem de EGM, menor seria o CPOS
(número de superfícies cariadas, perdidas e obturadas) (GRANATH et al., 1993).
e) EGM versus Padrão de localização das cáries
O’Sullivann e Tinanoff (1993) fizeram uma pesquisa com uma população de 3 e 4
anos de idade de Connecticut, na qual se realizaram exames clínicos e estimação dos níveis de
EGM obtidos de 481 crianças para definir a prevalência de cárie e padrões de lesões nos
dentes anteriores dessa população comparada com níveis de EGM. Quarenta e quatro por
cento das crianças tinham cárie. Elas foram categorizadas em ter somente cáries anteriores
superiores (CAS), somente cáries posteriores (CP) ou ambos os padrões. CAS foram
encontradas em apenas 16% da população. Das crianças com padrão anterior, 87% também
possuíam padrão posterior. A percentagem de crianças que eram levadas com mamadeira para
a cama, nas quais foram encontrados EGM, mas não tinham CAS, foi de 79%.
Três anos depois, com o objetivo de acessar a experiência de cáries, níveis de
EGM e padrões de cárie em crianças americanas, foi realizado um estudo com 127 crianças de
4 anos de idade do Arizona com coleta de saliva. Foram examinados quatro padrões de cárie:
anterior superior, fissuras, posterior proximal e posterior de superfície lisa vestibular ∕ lingual.
34
O padrão anterior superior teve o menor percentual de superfícies restauradas e o maior
percentual de superfícies extraídas. Foram obtidas amostras de EGM salivares de 120
crianças. As médias de ceo-s e ceo-d das crianças categorizadas com alta infecção por
(>50CFU) foram significativamente maiores que as classificadas na categoria moderada (1-
50CFU) (p<0,05) (DOUGLASS; O’SULLIVAN; TINANOFF, 1996).
f) Associação de fatores ligados à criança e à mãe com EGM
Matee et al. (1992) realizaram o primeiro estudo para avaliar prevalência de EGM
em crianças com e sem cárie rampante que mamavam no peito. O grupo de estudo
compreendia 34 crianças, sendo 17 com cárie rampante e 17 livres de cárie com idade entre 1
e 2,5 anos, provenientes da Tanzânia. Os autores verificaram que EGM e lactobacilli foram
isolados da placa dental de todas as crianças com cárie rampante e da maioria daquelas livres
de cárie. Foi concluído que a amamentação no peito permitia a colonização e proliferação de
EGM e lactobacilos nos dentes de crianças jovens e que a cárie rampante pode ocorrer em
crianças que mamam no peito na ausência de mamadeira ou qualquer outra forma de
alimentação durante o desmame.
Três mil crianças com 6 a 18 meses de idade foram avaliadas em 46 centros de
assistência social para crianças em diferentes partes da Suécia. Dessas, 200 foram
selecionadas para um exame mais detalhado, envolvendo investigação da dieta, escovação e
hábitos de sucção, uso de flúor e determinação salivar dos níveis de EGM e Lactobacilli. 63
de 3000 crianças (2,1%) tinham cáries e 61 (2,0%) ainda eram amamentados. Vinte (19,7%)
dessas 61 crianças que ainda eram amamentadas comparado a 51 (1,7%) de 2939 crianças que
não eram amamentadas representaram estatística significante (p<0,01). Em relação à
escovação, a maioria das crianças (85%) tinham os dentes escovados diariamente, 34%
usavam dentifrícios (27% sem e 7% com flúor). Mais de 39% dos pais afirmaram que as
crianças usavam tabletes contendo flúor diariamente. 76% dos indivíduos da pesquisa tinha
hábito de sucção digital. Em relação às crianças que eram amamentadas, aquelas que não
apresentavam cáries tinham menos EGM (102 a 10
4 UFC/amostra) e Lactobacilli comparado
às que apresentavam lesões cariosas (104 a 10
6 UFC/amostra). Comparando as crianças
amamentadas, com presença ou ausência de cárie em relação à contagem microbiológica, não
houve diferença no número de EGM e Lactobacilli (HALLONSTEN et al., 1995).
Em pesquisa feita com crianças com idade de 18 a 48 meses de uma escola
pública de Piracicaba, estado de São Paulo, havia 3 grupos: cáries presentes (CP), cáries de
35
fóssulas e fissuras (CFF) e livres de cárie. Foi mostrado que os grupos CP e CFF tiveram
baixa concentração de polissacarídeos insolúveis e EGM e altas freqüências de exposição
diária ao acúcar (NOBRE DOS SANTOS et al., 2002).
Ersin et al. (2006) investigaram a relação entre microorganismos relacionados à
cárie na saliva e a prevalência de CPI em crianças turcas com idade de 15 a 35 anos e suas
associações com características das mães, critérios sócio-econômicos e hábitos de
amamentação das crianças. Houve uma relação positiva entre CPI e níveis de EGM, e entre
uso prolongado de mamadeira (maior que 12 meses) com leite adoçado e EGM. Não houve
relação estatisticamente significante de contagem de EGM com os seguintes fatores:
contagem microbiológica do principal cuidador e CPI, escovação e CPI, renda familiar,
duração da amamentação. Foi observada correlação negativa entre educação materna e
contagem de EGM nas crianças.
g) Risco de cárie e EGM
Contagem do número de EGM em saliva estimulada tem sido utilizada para
predição de cárie dental por décadas (IKEDA, SANDHAM, BRADLEY, 1973; LOESCHE et
al, 1995). Em estudo com pré-escolares feito por Granath et al (1993) foi verificado que a
baixa contagem de EGM é mais indicativa de menor número de cáries do que altas contagens
indicando alta incidência da doença. Além disso o baixo poder predivo do número de EGM,
principalmente em indivíduos com cáries, mostra ser necessário uma reavalização desse fator
de risco (GRANATH et al., 1993).
Em estudo realizado com 20 pré-escolares de Piracicaba, estado de São Paulo, foi
verificado uma maior concentração de EGM em placa dentária de crianças com cárie da
primeira infância e com cárie de fóssulas e fissuras do que em crianças livres de cárie
(NOBRE DOS SANTOS et al., 2002). Porém, Mattos-Graner et al. (2000) haviam mostrado
que a incidência de cárie nas crianças estava mais dependente da capacidade dos EGM
sintetizarem glucanos insolúveis do que do número dessa bactéria na placa.
Foi investigada a distribuição quantitativa de EGM em população rural de 307
crianças com idade estimada de 12 anos do Sudão com baixa prevalência de cárie. Cáries em
dentes permanentes foi diagnosticada em 12% das crianças com média de CPOD de 0,17.
EGM foram encontrados em 96% das crianças e altas contagens foram obtidas em 45% .
Concluindo-se que EGM pode ser encontrado em população humana com prevalência de cárie
extremamente baixa (CARLSSON et al., 1987).
36
Está bem estabelecido que o melhor preditor de risco à cárie é a experiência
prévia de cárie (BOWDEN, 1999), uma vez que crianças altamente contaminadas por EGM,
podem ou não desenvolver a doença cárie (BEIGHTON, 2005). Nesse cenário, a saliva exerce
uma importante função protetora (LENANDER-LUMIRAKI; LOIMARANTA, 2000).
2.3. Saliva
A saliva é uma mistura complexa de fluidos, com contribuições das glândulas
salivares maiores (parótida, submandibular e sublingual) (Figura 3), glândulas acessórias ou
menores e fluido do sulco gengival (EDGAR, 1992). A função dessas glândulas salivares é
mediada pelo receptor muscarínico M3. A produção da saliva ocorre em resposta a impulsos
nervosos aferentes enviados ao núcleo salivar , localizado próximo à junção da medula e
pons. Esses núcleos são excitados por estímulos gustatórios e táteis da língua e da mucosa
oral, assim como por outros estímulos corticais como odor, ansiedade e depressão. Em
resposta, os centros salivares enviam impulsos por meio de nervos do sistema nervoso
autônomo simpático e parassimpático para as glândulas salivares, fazendo com que ocorra a
excreção de saliva (BAUM, 1987).
Figura 3: Localização das glândulas salivares maiores, a parótida, a submandibular e a sublingual em humanos.
Fonte: Fejerskov; Kidd, 2008.
Glantz et al. (1989) sugeriram que a saliva deve ser melhor classificada como um
tecido fluido do que como uma solução. Em seguida, foi proposto um modelo de estrutura
para a saliva. De acordo com esse modelo, a saliva seria composta por 4 níveis de
organização: (a) uma fase contínua composta de eletrócitos em água, (b) uma estrutura em
37
vários níveis parecendo uma rede, (c) proteínas solúveis em água, micelas salivares e/ou
outras estruturas globulares salivares observadas no interior dos filamentos da rede de saliva e
(d) material lipóide e células bacterianas e epiteliais (GLANTZ, 1997).
O volume diário de saliva produzido varia de 500 a 1500mL (HUMPHREY;
WILLIAMSOM, 2001) e a média de volume presente na cavidade bucal é aproximadamente
1mL (LAGERLOF; DAWES, 1984). O padrão de secreção segue o ritmo circadiano,
diminuindo durante o sono e aumentando quando se está acordado (DAWES, 1987).
2.3.1. Composição
A saliva é composta em sua maior parte por água (99%) (BAUM, 1987). Íons
inorgânicos como Ca+2
, Mg+2
, Na+, K
+, Cl
-, HCO3
-, H3PO4
+, HPO4
-, F
- mantêm o balanço
osmótico e proporcionam capacidade tampão e remineralizadora. Outros componentes
incluem albumina, amônia, amilase, creatinina, cistatinas, esterases, glicose, gustina,
histatinas imunoglobulinas (IgA, IgG, IgM), iodo, calicreína, lactoferrina, lactoperoxidase,
calicreína dihidrogeno lática, lisozima, mucinas, nitrogênio, Proteínas ricas em prolina,
ribonucleases, ácido lático, estaterina, sulfatos, tiocianato e uréia (FOX, 1989, HUMPHREY;
WILLIAMSON, 2001; TENOVUO, 1998). Sua composição varia em resposta a diferentes
estímulos (DAWES, 1990). O mais importante é o fluxo (LAGERLOF; OLIVERBY, 1994).
Quando comidas aquosas são consumidas ocorre aumento do fluxo de secreção serosa com a
finalidade de melhorar a digestão do bolo alimentar (DIAZ-ARNOLD; MAREK, 2002).
Dos constituintes inorgânicos, os maiores íons (sódio, potássio, cloreto e
bicarbonato) são os principais contribuintes para a osmolaridade da saliva, que é
aproximadamente a metade do plasma. Bicarbonato é o principal tampão na saliva. Tiocianato
relaciona-se com função antibacteriana da sialoperoxidase. O conteúdo de fluoreto é
aproximadamente similar ao do plasma, mas é bem elevado naqueles que bebem água
fluoretada ou usam dentifrícios fluoretados, tendo uma importante ação anti-cáries (EDGAR,
1992).
Dos constituintes orgânicos, as proteínas compreendem aproximadamente 200mg
por 100mL, aproximadamente 3% da concentração de proteínas do plasma. Elas incluem
enzimas, imunoglobulinas e outros fatores antibacterianos, glicoproteínas mucosas (mucinas),
traços de albumina, certos polipeptídeos e oligopeptídeos de importância na saúde oral
(EDGAR, 1992).
38
a) Enzimas
A amilase é a principal enzima encontrada na saliva. Em estudo feito com 10
crianças de 1, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180 dias de vida, foi observada secreção elevada
de saliva entre os 90 e 180 dias de idade precedendo a erupção primária dos dentes. A
concentração de amilase salivar no recém-nascido foi baixa. Aos 12 meses, a concentração
dessa enzima atingiu valores próximos aos observados em crianças com idade entre 20 e 36
meses bem como em adultos jovens. A secreção da amilase salivar foi elevada a partir dos 60
dias de vida, podendo este fato ser responsável pela relativa tolerância ao amido do lactente
pequeno (COLLARES; BRASIL; KAWAZAKI, 1979).
O sistema peroxidase humano é composto por duas enzimas: peroxidase salivar,
que é produzida nas células acinares e mieloperoxidase, a qual se origina dos leucócitos
gengivais (PRUITT, 1987). As principais funções do sistema são atividade antimicrobiana e
proteção das proteínas do hospedeiro e das células contra a toxicidade do peróxido de
hidrogênio (TENOVUO; PRUITT, 1984). A atividade da peroxidase salivar em crianças pré-
dentadas é alta. Ação da mieloperoxidase aumenta com a idade (HYYPPA, 1989).
b) Imunoglobulinas
A imunoglobulina predominante é a IgA, aproximadamente 2mg/100mL de
saliva, sendo seguida por IgG (1 – 5mg/100mL) e por IgM (0 – 2mg/100mL), que está
presente em baixa quantidade, possivelmente surgindo do sulco gengival (EDGAR, 1992).
IgA age agregando bactéria (KRASSE; GAHNBERG, 1983). Essa imunoglobulina também é
direcionada contra moléculas bacterianas específicas, como as adesinas, ou contra enzimas
como as glicosiltransferases (SMITH; TAUBMAN; EBERSOLE, 1979). Em estudo realizado
com 33 crianças (pré-dentadas e dentadas) e 24 adultos, com média de idade entre 21 e 31
anos, foi observado que os níveis de IgA salivares totais foram significantemente maiores em
adultos do que em crianças. Em relação a IgM, não foi encontrada diferença entre os grupos.
Os níveis de IgG foram significativamente elevados entre crianças dentadas quando
comparados a crianças pré-dentadas, e também foram altos entre o grupo de adultos estudados
(HYYPÄ, 1989).
39
c) Proteínas antibacterianas
Lisozima presente em saliva total é proveniente das glândulas salivares maiores e
menores, fluido do sulco gengival e leucócitos salivares. O conceito clássico da ação dessa
enzima está baseado na sua habilidade de hidrolizar ligações β(1-4) entre ácido N-
acetilmurâmico e N-acetilglicosamina da camada de peptidoglicano da parede das células
bacterianas gram-positivas. Em adição, lisozima é uma proteína catiônica forte que pode
ativar enzimas autolíticas bacterianas, podendo destruir componentes da parede celular
(LAIBLE; GERMAINE, 1982).
Lactoferrina é uma proteína com efeito antimicrobiano atribuído a sua alta
afinidade por ferro e à conseqüente privação desse metal essencial aos microorganismos. No
seu estado livre de ferro, lactoferrina pode ligar-se diretamente à superfície de células
bacterianas, levando à aglutinação de, por exemplo, EGM (ARNOLD; COLE; MCGHEE,
1977). Em contrapartida, a sialoperoxidase oxida o íon tiocianato salivar (SCN-) para
hipotiocianato (OSCN-), uma potente substância antibacteriana, utilizando peróxido de
hidrogênio produzido pelas bactérias orais como oxidante (EDGAR, 1992).
d) Glicoproteínas
O maior grupo das glicoproteínas consiste de duas classes de glicoproteínas
mucosas (MG1 e MG2) encontradas na saliva submandubular e sublingual e do grupo de
proteínas ricas em prolina encontradas na saliva da parótida (EDGAR, 1992).
Proteínas ricas em prolina (PRPs) também podem ser encontradas em alta
concentração em secreções submandibulares. Essas PRPs representam aproximadamente 70%
do total de proteínas secretadas. Elas podem ser divididas em ácidas, básicas e glicosiladas.
As ácidas caracterizam-se pela abundância de prolina, ácido glutâmico/glutamina e glicina
(HAY et al., 1988).
e) Outros polipeptídeos
Estaterina é um polipeptídio de 43 resíduos. É a única proteína salivar que inibe a
precipitação espontânea do sal de fosfato de cálcio da saliva supersaturada. O fragmento
amino-terminal de 18 resíduos inibe o crescimento de cristais e parcialmente inibe
precipitação espontânea. O peptídio amino-terminal de 6 resíduos mostra uma quádrupla
40
inibição para o crescimento de cristais quando comparado com estaterina intacta, mas tem
inibição mínima contra precipitação espontânea (HAY; MORENO; SCHLESINGER, 1979).
Cistatinas paticipam do processamento proteolítico, tendo sido isoladas formas de
121 resíduos de saliva total. Várias cistatinas salivares são fosforiladas e também se ligam a
hidroxiapatita, inibindo o crescimento de cristais de sais de fosfato de cálcio, embora sua
atividade seja aproximadamente um décimo comparada às estaterinas (SHOMERS et al.,
1982).
f) Associação de componentes salivares com doenças orais e com idade
Tenovuo et al. (1987) realizaram uma pesquisa procurando relacionar fatores
antimicrobianos da saliva com a saúde oral. Três grupos de indivíduos foram estudados:
crianças pré-dentadas (n=20, idade de 2 a 6 meses) e dentadas (n=16, idade de 1 a 3,8 anos) e
adultos jovens (50 recrutas navais com idade de 19 a 21 anos). Nesse estudo, foi reportado
que concentrações salivares de lisozima, peroxidase e hipotiocianato já estavam no mesmo
nível dos adultos quando os dentes decíduos erupcionavam, considerando que concentrações
de imunoglobulinas (IgA, IgG e IgM), lactoferrina, mieloperoxidase e tiocianato foram
significativamente mais baixas em crianças que em adultos. Crianças dentadas apresentaram
mais IgG, tiocianato e proteínas na saliva total do que crianças pré-dentadas.
Estudo foi realizado com saliva total não estimulada para verificar a composição
da saliva em crianças saudáveis relacionando com a idade. Foi coletada saliva de 136
indivíduos divididos em 5 grupos de acordo com a idade: (1) 25 crianças, 7-11 meses de
idade; (2) 28 crianças, 2-3 anos de idade; (3) 28 crianças, 6-8 anos de idade; (4) 28
adolescentes, 12-14 anos de idade; (5) 27 adultos, 25-63 anos de idade. As concentrações de
Na, K, proteínas totais, IgA e atividade de amilase foram mensuradas. Foi encontrada uma
significante correlação linear ascendente com a idade para concentrações de Na, proteínas
totais, IgA e atividade de amilase. Houve diferença significante entre os grupos com relação
às concentrações de K e IgA. Atividade de amilase salivar foi variável, sendo encontrado
diferença apenas nos dois primeiros grupos. Concluiu-se que a composição da saliva sofre
mudança significante durante a infância, implicando em um processo de desenvolvimento e
maturação das glândulas salivares e indicando a necessidade de controles divididos por idade
para o uso clínico da saliva (BEN-ARYEN et al., 1990).
Acreditando serem os estudos transversais controversos, Kirstilä et al. (1998)
realizaram um estudo longitudinal com acompanhamento de 2 anos a fim de encontrar
41
associações entre variáveis antimicrobianas salivares , bactéria cariogênica e incremento de
cárie. A população estudada era composta de 63 sujeitos, sendo que todos completaram 13
anos de idade durante o primeiro ano do estudo. Durante o período de dois anos, um aumento
estatisticamente significante foi observado no fluxo, tiocianato, níveis de aglutinação,
anticorpo IgA anti EGM, lactobacilos e anaeróbios totais, considerando que lisozima,
lactoferrina e anticorpos IgG totais e anti EGM declinaram significativamente. Baseado
nessas várias análises, pôde-se concluir que IgG total e hipotiocianato tiveram uma relação
inversa com os subseqüentes 2 anos de incremento de cáries. Anticorpos IgG anti EGM
aumentaram com o desenvolvimento das cáries. EGM e lactobacilos correlacionaram-se
positivamente com o nível de cárie no início da pesquisa e com o incremento de cárie.
Microflora anaeróbia total foi consistentemente mais abundante entre indivíduos sem cárie.
2.3.2. Funções
As principais funções da saliva são auxílio na digestão, lubrificação, reparo de
tecido mole, manutenção do balanço ecológico, debridamento, agregação, antibacteriana,
manutenção do pH, manutenção da integridade do dente e ainda funções excretoras, balanço
hídrico e função hormonal (MANDEL, 1987).
Van Nieuw Amerongen, Bolscher e Veerman (2004) construíram um quadro com
as principais funções da saliva, relacionando-o com a composição salivar (Figura 4).
Figura 4: Principais funções da saliva em relação aos seus constituintes
Adaptado: Van NieuwAmerongen; Bolscher; Veerman, 2004.
42
a) Auxílio na digestão
Embora a amilase seja a maior componente da secreção da parótida e esteja
presente em nível apreciável no fluido submandibular, a função da saliva na digestão dos
carboidratos é mínima. A única conversão efetiva de amido em maltose que ocorre na
cavidade oral são nos sítios retentivos, e isso beneficia primariamente as bactérias da placa. A
maior parte da comida é engolida rapidamente, e no estômago, a amilase salivar é
minimamente efetiva devido ao baixo pH e à alta atividade proteolítica do suco gástrico
(MANDEL, 1987).
A saliva também exerce um papel gastronômico, solubilizando vários
componentes da comida e atuando como meio para interação com os receptores das células
gustativas. Tem sido proposto que uma proteína salivar ligada ao zinco específica pode ser
responsável pelo paladar (HATTON et al., 1985).
b) Lubrificação e propriedade demulcente
Uma das mais importantes funções da saliva é de lubrificação, que é a habilidade
de reduzir a fricção de uma substância entre duas superfícies em movimento, por exemplo, no
caso das superfícies orais. Sem a propriedade de lubrificação, ocorreria irritação, destruição
do tecido do dente e rápido efeito abrasivo nas superfícies epiteliais. Lubrificação da
superfície oral pode ser devido à associação com filmes salivares como película do dente e à
presença de um bom lubrificante (SCHIPPER; SILLETTI; VINGERHOEDS, 2007).
Outro efeito da água contida na saliva é a diluição de substâncias introduzidas na
boca e a subseqüente remoção por deglutição ou colocação para fora da boca. Comidas
sólidas são primeiramente dissolvidas, entrando em ação o paladar e, em seguida, diluídas
com o fluxo de saliva dentro da boca. Depois da deglutição do bolo de saliva ou comida, os
resíduos de comida são removidos lentamente pelo fluxo de saliva não estimulada (EDGAR,
1992).
c) Debridamento e agregação
O fluxo de saliva aumentado pela atividade muscular dos lábios e da língua
remove um grande número de potentes bactérias nocivas do dente e das superfícies mucosas.
Esse mecanismo de limpeza é similar ao da lágrima no olho, espirro no nariz e tosse e
43
expectoração para os pulmões (MANDEL, 1987). Estudos experimentais em agregação tem
focado atenção nas mucinas de alto peso molecular. A presença de múltiplos complexos de
oligossacarídeos e micro heterogeneicidade torna viável um grande número de possibilidades
para interação com muitas bactérias (TABAK et al., 1982)
d) Antibacteriana
Os fatores da defesa inata identificados na saliva têm sido extensivamente
estudados in vitro. Eles expressam diferentes propriedades antimicrobianas (TENOVUO;
LUMIRAKI, 1991, TENOVUO; LUMIRAKI; SOUKKA, 1991). Os principais constituintes
da defesa inata oral são sistema peroxidase, lisozima, lactoferrina e histatinas. In vitro, já foi
estabelecido que essas proteínas: (1) limitam crescimento de fungos ou bactérias, (2)
interferem com a captação de glicose pela bactéria e com o metabolismo da glicose e (3)
promovem agregação e, portanto eliminação da bactéria. Deve ser enfatizado que, em adição
à ação antimicrobiana dos sistemas da peroxidase salivar e mieloperoxidase (MÄNSON et al.,
1987), um dos principais propósitos desse sistema é eliminar H2O2, que é altamente tóxico
para as células dos mamíferos (HÄNSTROM; JOHANSSON; CARLSSON, 1983).
As imunoglobulinas IgG, IgM, IgA e IgA secretora (sIgA) formam a base para
defesa salivar específica contra flora oral microbiana, incluindo EGM. A mais abundante
imunoglobulina na saliva, assim como em outras secreções humanas, é a sIgA dimérica, que é
produzida pelas células do plasma localizadas nas glândulas salivares. Duas subclasses de IgA
estão presentes na saliva: IgA1 forma o maior componente das imunoglobulinas, embora a
quantidade relativa de IgA2 seja maior em saliva do que em outras secreções (TAPPUNI;
CHALLACOMBRE, 1994).
e) Manutenção do pH e capacidade tampão
Saliva é efetiva em ajudar a manter pH relativamente neutro na cavidade oral, na
placa bacteriana e no esôfago (MANDEL, 1987). A capacidade tampão da saliva estimulada e
não-estimulada envolve três sistemas: bicarbonato (HCO-3), fosfato e sistema de proteínas-
tampão. Esses sistemas têm diferentes faixas de pH na capacidade tampão máxima
(BARDOW et al., 2000). Os sistemas bicarbonato e fosfato têm valores de pH de 6,1 a 6,3 e
6,8 a 7, respectivamente. Desde que a maior parte da capacidade tampão salivar, durante a
ingestão de comida e mastigação, é devido ao sistema bicarbonato (baseada no equilíbrio
44
HCO-3 + H
+ ↔ CO2 + H2O), a cavidade oral providencia suficiente fluxo salivar com
componentes neutralizantes (BIRKHED; HEINTZE, 1989). O fosfato e o sistema tampão de
proteínas têm uma contribuição menor para a capacidade tampão total, relativamente ao
sistema bicarbonato. O sistema fosfato é, a princípio, análogo ao sistema bicarbonato, mas
sem a importante capacidade tampão-fase, e ele é relativamente independente da secreção
salivar (LENANDER-LUMIRAKI; LOIMARANTA, 2000).
f) Manutenção da integridade do dente
Em adição ao fato de ajudar a manter o pH, a saliva auxilia a proteger o dente de
várias maneiras. Essa função protetora começa imediatamente após a erupção do dente na
cavidade bucal. Embora a coroa esteja totalmente formada quando erupciona, ela está
cristalograficamente incompleta. Interação com saliva proporciona uma maturação
pós-eruptiva via difusão de íons como cálcio, fósforo, magnésio e fluoreto, assim como outros
componentes para a superfície de esmalte. Essa maturação aumenta a dureza da superfície,
diminui permeabilidade e tem demonstrado experimentalmente resistência às cáries (SHAW;
WOLLMAN, 1958).
2.3.3. Xerostomia
Xerostomia é definida por Fox et al. (1985) como percepção de boca seca.
Segundo Nederfors (2000), boca seca não deve ser considerada um problema trivial na
população, desde que constitua um fenômeno com muitos aspectos relativos à função oral e à
qualidade de vida. Nenhum consenso global foi alcançado em relação à terminologia de boca
seca, criando um problema substancial para pesquisa, educação, diagnóstico e terapia. Esse
autor diferencia três aspectos: xerostomia, hipossalivação e saliva com composição alterada,
concluindo que esses aspectos da hipofunção das glândulas salivares são entidades separadas,
que estão relacionadas em vários aspectos, constituindo não apenas uma preocupação dental,
mas também, médica e social.
Xerostomia pode resultar de várias causas como redução da hidratação dos tecidos
moles orais. Uma redução no fluxo salivar está associada com marcado crescimento na
incidência de cáries (DANIELS; FOX, 1992). Provavelmente, o mais trágico efeito no fluxo
salivar levando à xerostomia é o efeito terapêutico da radiação de cabeça e pescoço (GARG;
MALO, 1997). Radiação aplicada à glândula salivar pode levar a uma significante redução do
45
fluxo salivar. Pacientes tratados contra câncer de cabeça e pescoço sempre se submetem à
radiação danosa contra as glândulas salivares, resultando em redução da secreção. O dano
mais extenso ocorre nos elementos secretores chamadas unidades acinares, que são mais
afetadas pela radiação que os ductos (DANIELS; FOX, 1992).
Certas doenças também podem estar relacionadas à xerostomia, como a diabetes
melito, mas a principal enfermidade associada é a síndrome de Sjögren, que é uma doença
autoimune caracterizada por inflamação das glândulas com infiltração de linfócitos
(DANIEL; FOX, 1992).
O uso de drogas é a fonte mais comum de xerostomia. Como várias drogas
causam esse problema, a combinação do uso aumenta esse sintoma. Várias classes estão
associadas com xerostomia. Elas reduzem a estimulação de certos receptores nas glândulas ou
afetam o nível de hidratação dos tecidos moles orais. Drogas que afetam direta ou
indiretamente os receptores nas glândulas incluem antimuscarínicos, anticolinérgicos,
primeira geração de antagonistas de receptores de histamina (H1), antidepressivos tricíclicos e
agentes anti-hipertensivos centrais (HUNTER; WILSON, 1995). Um estudo mostrou
mudanças na composição de proteínas, mas não do total de proteínas por causa do tratamento
com propanolol. Ao mesmo tempo, a incidência de cárie aumentou (WATSON et al., 1990).
Dawes (1987) relaciona xerostomia com dois fatores. O primeiro é absorção de
água pela mucosa oral, já que a saliva humana é sempre hipotônica com relação ao fluido
intersticial, há sempre o potencial para absorção de água pela mucosa. De fato existe
evidência de que possa ocorrer essa absorção, porém ainda permanecem incertezas de como
ocorre. O segundo é evaporação de água da cavidade oral, para a qual tem sido dada pouca
atenção, porém está bem definido que nos cachorros ocorre evaporação de água da língua
como substituto para evaporação de doce. Fatores contribuintes para a evaporação incluem
volume respiratório por minuto, percentagem de ar inspirado que passa pela boca e
temperatura e umidade relativa do ar.
Para compensar a sensação seca da cavidade oral, pacientes não devem mascar e
devem preferir dieta líquida ou semilíquida rica em carboidratos fermentáveis. Pelo fato de
que a redução da mastigação piora a condição, pacientes devem procurar aconselhamento
nutricional para limitar os efeitos danosos das modificações na dieta (DIAZ-ARNOLD;
MAREK, 2002).
46
2.3.4. Uso da saliva como meio diagnóstico
O uso da saliva como fluido diagnóstico tem se tornado um sucesso na história da
pesquisa. Tecnologias disponibilizam a saliva para ser usada com finalidade diagnóstica de
doenças e predizer sua progressão (STRECKFUS; BIGLER, 2002).
Para ser pesquisada, a saliva pode ser coletada estimulada ou não estimulada.
Dawes (1987) descreveu técnicas para coleta desses dois tipos:
Saliva não-estimulada: existem diferentes formas de se fazer essa coleta, mas
um período de tempo adequado é normalmente 5 minutos. Os sujeitos devem estar sentados
confortavelmente, com os olhos abertos e em seguida um dos procedimentos é adotado: (1) o
indivíduo curva a cabeça para frente e, depois de engolir a secreção inicial, permite o
gotejamento de saliva através do lábio inferior em um cilindro graduado ou em um recipiente
pré pesado. O sujeito pode ou não cuspir ao final do período da coleta; (2) mesmo anterior ,
mas a pessoa cospe depois de 60 minutos; (3) saliva é sugada continuamente do assoalho da
boca por meio de um tubo de sucção, e depois acumulada em uma vasilha coletora; (4) swabs
pré pesados e absorventes são inseridos na boca e removidos para pesagem no fim do período
de coleta.
Saliva estimulada: a importância de se coletar saliva estimulada está na
obtenção de informações a respeito da capacidade secretora das glândulas. Estimulação
farmacológica raramente é utilizada. Geralmente emprega-se estimulação gustatória
(usualmente com ácido) ou mecânica (através da mastigação de materiais inertes, como
parafina ou elásticos).
Estimação de alguns componentes orgânicos da saliva tem se tornado de
considerável interesse diagnóstico. Os componentes orgânicos que têm sido estimados não
são aqueles especificamente excretados pelas glândulas salivares. A indústria farmacêutica e
os pesquisadores, e ainda os endocrinologistas têm percebido que a via de difusão para
substâncias lipídio-solúveis para a saliva permite que níveis sangüíneos de cada substância
sejam estimados através de análise de saliva. Além disso, as concentrações salivares são
proporcionais não ao total de concentração de substâncias no plasma, mas à concentração de
substâncias livres, que não estão ligadas. Por exemplo, concentrações salivares podem
exceder concentrações sangüíneas, mas a proporcionalidade é mantida (FERGUSON, 1987).
As maiores vantagens no uso da saliva para diagnóstico em relação ao sangue são o fácil
acesso e o fato de ser uma coleta não-invasiva (FERGUSON, 1987, MALAMUD, 1992,
MANDEL, 1990).
47
2.3.4.1. Testes atualmente disponíveis
Desordens autoimunes podem ser identificadas através de teste salivares, como a
síndrome de Sjögren. Um painel de determinantes salivares foi proposto para ser usado
clinicamente como diagnóstico dessa síndrome. Esses incluem fluxo, pH, capacidade tampão,
lactobacilos e concentração de leveduras. Vários desses testes individuais foram aprovados
pela Administração Norte Americana de Comidas e Drogas (FDA). Foi sugerido que esses
testes, quando feitos com saliva total, podem fornecer evidência para a presença da síndrome
de Sjögren. Benefícios adicionais são o fato de serem não invasivos e poderem ser conduzidos
em qualquer consultório médico ou odontológico (SREEBNY; ZHU, 1996).
Na endocrinologia, várias avaliações clínicas da função endócrina requerem um
monitoramento temporal dos níveis de esteróides no plasma. Técnicas padrão de amostra de
plasma ou urina não necessariamente fornecem amostras em condições ótimas requeridas
nesse tipo de monitoramento (QUISSEL, 1993). Níveis salivares de hormônios esteróides
refletem seus níveis na forma livre e, portanto ativa, enquanto medições no sangue refletem o
nível total (livre e ligado). Conseqüentemente o uso da saliva para monitorar níveis de
hormônio esteróide tem crescido (READ, 1989).
Em doenças infecciosas, teste para o vírus da imunodeficiência humana (HIV) é
um bom exemplo para a utilidade da saliva no diagnóstico de doenças. O desenvolvimento de
anticorpos direcionados para a proteína viral específica e o desenvolvimento de tecnologias
capazes de mensurar essas proteínas têm facilitado o uso do teste para infecção por HIV
(SCULLY, 1997). Também tem existido interesse no uso da saliva para diagnóstico de
infecção por Helicobacter pilory (KOUNTOURAS, 1998).
Saliva pode ser útil também como teste diagnóstico adjunto para câncer sistêmico,
ou o teste salivar pode substituir metododologias diagnósticas atuais. Por exemplo, teste de
saliva de baixo custo utilizado juntamente com imagens (como a mamografia) pode aumentar
o valor diagnóstico desse teste e reduzir o número de falsos positivos e falsos negativos
associados com os exames por imagem (KERLIKOWSKE et al., 1995). Esse fato pode
permitir que o diagnóstico de câncer seja feito em um estágio precoce, proporcionando ao
paciente mais chances de sobrevivência por causa de várias opções de tratamento
(STRECKFUS; BIGLER, 2002).
Vários estudos utilizam a saliva para detecção de EGM (ALALUUSHUA et al.,
1996, BERKOWITZ; JORDAN; WHITE, 1975; FUJIWARA et al., 1991, GRANATH et al.,
1993, GRINDEFJORD et al., 1991, MATEE et al., 1992, MATTOS-GRANER et al., 1998,
48
MATTOS-GRANER et al., 2001, RUDNEY; STAIKOV, 2002, THIBODEAU;
O’SULLIVAN, 1996, THIBODEAU; O’SULLIVAN, 1999, WAN et al., 2003, ZICKERT;
EMILSON; KRASSE, 1983, ZOITOPOULOS et al., 1996).
Estudo foi realizado com o objetivo de encontrar uma associação entre níveis de
EGM salivares e prevalência, incidência e padrão de distribuição de cáries na primeira
infância. Foram examinadas 146 crianças com média de idade de 3,8 anos. Saliva foi coletada
no início da pesquisa e depois, anualmente por 2 anos. Foi observado que o risco relativo de
ter cáries depois de dois anos nas crianças do grupo altamente infectado por EGM (>50 CFU)
foi 2 vezes maior do que em crianças com baixo nível de infecção por esse microorganismo (0
CFU). O risco relativo entre todos os grupos foi significativamente diferente (p<0,05)
(THIBODEAU; O’SULLIVAN, 1996).
Ainda existem testes salivares para monitoramento de drogas e detecção do
consumo de drogas ilícitas (SLAVKIN, 1998) e aplicação na área de psiquiatria (YAMADA;
YAJIMA; HARANO, 1998). Por exemplo, saliva tem sido usada para monitorar respostas
terapêuticas no tratamento da ansiedade através da mensuração de níveis salivares de 3-
metoxi-4-hidroxifenilglicol (YAMADA; YAJIMA; HARANO, 1998).
2.3.4.2. Relevância
Saliva está sendo cada vez mais usada no diagnóstico e avaliação de doenças.
Testes diagnósticos têm surgido para doenças onde há mudanças na composição salivar. Esses
exames têm sido de maior utilidade quando a composição salivar reflete a composição do
plasma (FERGUSON, 1987). O estudo e o uso do diagnóstico baseado na saliva têm
aumentado exponencialmente durante os últimos 10 anos. Testes salivares clínicos mostram
serem promissores. Existe, entretanto, uma grande necessidade de pesquisa adicional nessa
área antes do valor real clínico da saliva poder ser determinado (STRECKFUS; BIGLER,
2002).
A saliva tem recebido crescente interesse científico, não apenas pela excreção de
vários componentes , mas também pela sua bem documentada relação com doenças sistêmicas
virais e bacterianas. A natureza relativamente simples não-invasiva da coleta e sua relação
com níveis plasmáticos fazem desse fluido uma atrativa ferramenta diagnóstica (SCHIPPER;
SILLETTI; VINGERHOEDS, 2007).
49
2.4. Peptídeos Antimicrobianos
A imunidade inata é a primeira barreira que os micróbios invasores têm de
ultrapassar quando estão entrando no organismo. Essa barreira consiste de elementos como
por exemplo continuidade epitelial, secreção de glândula mucosa, movimentos ciliares, baixo
pH no trato gastrintestinal e superfície da pele, presença de fagócitos, fatores humorais não-
específicos e cascata complemento ativada alternativamente. Os peptídeos antimicrobianos
(PAs) são um dos mais importantes elementos do sistema imune inato. Esses peptídeos são
comuns entre todos os seres eucariontes, incluindo mamíferos, anfíbios, insetos, plantas e
protozoários (GABAY, 1994).
Os PAs têm emergido como promissores agentes contra patógenos antibióticos
resistentes. Esses peptídeos de genes codificados são encontrados principalmente em
fagócitos e células epiteliais, mostrando atividade direta contra uma vasta gama de
microorganismos (ZAIOU, 2007).
2.4.1. Características Comuns
Os PAs compreendem uma família quimicamente e estruturalmente heterogênea.
Todavia, três características partilhadas pelos peptídeos antimicrobianos conhecidos podem
ser distinguidas (VAN T’HOF et al., 2001):
Em geral, esses peptídeos são moléculas pequenas, com massa molecular entre
1 e 5 KDa;
A maioria é cátiônica ou contém elementos modificados positivamente,
possuindo de 10 a 25 aminoácidos, mas variações maiores também são
observadas;
Em solventes não-polares, eles mostram a tendência de formar estruturas
anfipáticas, por exemplo, estruturas com domínios hidrofóbicos e hidrofílicos
separados.
Por causa dessas características físico-químicas, esses peptídeos possuem
tendência a se associarem com superfícies ou membranas microbianas modificadas
negativamente (VAN T’HOF et al., 2001).
As principais propriedades do sistema imune clássico são a alta especificidade e
memória. Para os imunologistas, existem dois desafios intelectuais pendentes ligados ao
50
entendimento dessas duas propriedades. O valor intrínseco atribuído à resolução desses dois
problemas é alto. A exigência pela alta especificidade tem necessariamente de ser ligada à
propriedade de evitar auto-destruição e prevenir reinfecção imprescindíveis ao valor de
sobrevivência do sistema imune. A principal vantagem dos PAs como fatores da imunidade
inata é que eles podem funcionar sem alta especificidade e memória. Eles evitam o problema
da auto-destruição pela compartimentalização celular ou pela especificidade a um alvo
ausente no hospedeiro. Se a auto-destruição pode nesse sentido ser evitada sem um
mecanismo complicado, isso é uma vantagem (BOMAN, 1995).
Dessa forma, ao contrário de antibióticos convencionais, como as penicilinas, que
os micróbios rapidamente invadem; a aquisição de resistência por microorganismos contra
peptídeos antimicrobianos é surpreendentemente improvável (ZASLOFF, 2002). Várias
propriedades têm sido atribuídas aos PAs, como atividade antitumoral, indutor de mitose
podendo estimular crescimento de fibroblastos e células epiteliais in vitro, moléculas
sinalizadoras e ainda podem ligar a imunidade inata com a imunidade adaptativa (KAMYSZ;
OKROJ; LUKASIAK, 2003), podendo modular outros componentes da imunidade inata, por
exemplo, defensinas e PR-39 atuam como fatores quimiotáticos para monócitos e neutrófilos,
respectivamente (HUANG; ROSS; BLECHA, 1997, TERRITO et al., 1989).
Os detalhes precisos do mecanismo de ação dos PAs permanece desconhecido
(ZAIOU, 2007). Todavia, geralmente é aceito que os peptídeos modificados positivamente
agem diretamente nas membranas modificadas negativamente das células bacterianas
causando aumento da permeabilidade da membrana, levando rapidamente à morte celular
(EPAND; VOGEL, 1999, FRIEDRICH et al., 2000).
2.4.2. Presença de PAs em diversos seres multicelulares
a) Insetos
Depois da descoberta de PAs induzíveis em seda de mariposa (STEINER et al.,
1981) e Drosophila (KYLSTEIN; SAMAKOVLIS; HULTMARK, 1990), os genes
correspondentes foram clonados e sequenciados. Os genes foram expressos em células do
sangue, epitélio e corpo de insetos, o qual é um órgão semelhante ao fígado de vertebrados
que secreta proteínas e peptídeos diretamente para a hemolinfa animal (ZASLOFF 2002).
51
b) Vertebrados
Expressão de peptídeos β-defensinas TAP (DIAMOND et al., 1994) em células
epiteliais do trato respiratório bovino e de β-defensina LAP, que é um peptídio antimicroniano
encontrado na língua (SCHONWETTER; STOLZENBERG; ZASLOFF, 1995), é estimulada
por lipopolissacarídeos (LPS), interleucina-1β e fator de necrose tumoral. Regulação in vivo
desses peptídeosdos ocorre na inflamação e após desafio bacteriano agudo (ZASLOFF, 2002).
c) Plantas
Como animais, plantas também expressam PAs como defensinas e tioninas tanto
constitutivamente quanto em resposta à invasão microbiana. O insulto inicial é transmitido
por padrão de reconhecimento de alta especificidade, como o sítio nucleotídeo-vinculado mais
leucina com Toll e receptores homólogos aos receptores IL-1 (Interleucina 1), análogos aos
de mamíferos; em resposta, eles ativam a reação conectada relativamente específica contra
organismos para os quais estão voltados, um conceito denominado estratégia de defesa “gene
por gene” (DANGL; JONES, 2001).
2.4.3. Sítios de localização em seres humanos
Todas as superfícies epiteliais dos seres humanos são protegidas por PAs como
α-defensina humana (LEHER; GANZ, 1996) e β-defensina humana (hBD) (HARDER et al.,
1997) como parte da defesa inata. Um dos passos cruciais na defesa imunológica, levando à
elimininação de micróbios invasores, é o combate aos microorganismos ingeridos através de
proteínas antimicrobianas, incluindo as BPI (proteína com ação bactericida e permeabilidade
aumentadas) e lactoferrina, assim como por meio de peptídeos, incluindo defensinas,
catelicidinas e indolicidinas (GIROIR et al., 1997, GUDMUNDSSON et al., 1996, LEHRER;
GANZ, 1996).
52
Figura 5: Representação das estruturas das α e β-defensinas humanas.
Fonte: Ganz, 2003.
Zhao, Wang e Lehrer (1996) fizeram um estudo para comparar a expressão de α- e
β-defensinas em vários tecidos humanos. RNAm para α-defensinas HNP1-3, abundante em
osso esponjoso foi detectado nos leucócitos de sangue periférico, baço e timo por reação em
cadeia de polimerase, que revelou α-defensinas HD5 e HD6 somente no intestino delgado.
Em contraste, o pâncreas e os rins expressaram alto níveis de hBD-1 e baixos níveis dessa β-
defensina foram encontrados em vários órgãos (glândulas salivares > traquéia > próstata e
placenta > timo, testículo e intestino delgado). O RNAm de hBD-1 foi produzido
constitutivamente por células epiteliais normais humanas derivadas da traquéia, brônquios,
vias aéreas pequenas e glândulas mamárias.
Em pesquisa realizada para verificar a complexidade da família das defensinas
humanas, verificou-se a diversidade desta família, não estando restrita à expressão em
leucócitos. Análises de “southern blot” e clone genômico revelaram que numerosas
seqüências relacionadas a defensinas estão presentes no genoma humano. Foi caracterizado
um gene para uma nova família de defensina humana, designado como defensina humana-5,
altamente expresso em células de Paneth no intestino delgado (JONES; BEVINS, 1992).
No trabalho feito por MALLOW et al. (1996), também com células de Paneth, a
amostra submetida à reação em cadeia de polimerase sugeriu que apenas duas isoformas de
defensinas (HD-5 e HD-6) são expressas no intestino delgado, sendo menor que o número
encontrado em ratos.
53
2.4.4. Relação com doenças
Baixa expressão do peptídio da catelicidina humana LL-37, hBD-2 e hBD-3 em
lesões da pele causada por dermatite atópica coincide com a suscetibilidade reforçada para
infecções na pele (ONG et al, 2002). Na Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS),
foi verificado que as β-defensinas podem bloquear a replicação do HIV-1 (Vírus da
Imunodeficiência Humana -1) e foi interessante perceber que um polimorfismo em gene de
β-defensina tem sido associado com manifestações clínicas da infecção por HIV-1, sugerindo
que as β-defensinas humanas exercem importante função na defesa contra HIV (BRAIDA et
al., 2004).
Tem sido crescente a incidência e severidade de micoses invasivas e a resistência
de patógenos dos fungos contra drogas antifúngicas atualmente disponíveis, levando os
cientistas a explorarem as propriedades antifúngicas dos PAs (ZAIOU, 2007). Nesse sentido,
foi demonstrada evidência na função dos PAs na proteção contra fungos em estudo,
mostrando que baixos níveis de histatina em saliva de grupo de pacientes com AIDS estavam
correlacionados com alta incidência de candidíase oral (MANDEL; FATEHI, 1992).
Outra enfermidade que pode ser citada é a Acne vulgaris, que é uma desordem
inflamatória crônica das unidades pilo-sebáceas, que afeta amplamente adolescentes e adultos
jovens (GUARNA; COULSON; RUBINCHIK, 2006). Os principais eventos no
desenvolvimento da lesão inflamatória Acne vulgaris envolve colonização e proliferação de
Propionibacterium acnes, o qual tem mostrado resistência aos antibióticos convencionais. Por
causa de sua habilidade em neutralizar endotoxinas e conseqüentemente inibir secreção de
citocinas pró-inflamatórias (por exemplo, TNF-α, IL-1) pelas células de defesa, peptídeos
catiônicos podem ser potenciais candidatos para o tratamento da acne (ZAIOU, 2007). Vários
peptídeos e proteínas antimicrobianas incluindo lisozima, lactoferrina, defensinas e
catelicidinas são produzidos pelo epitélio das vias aéreas e células inflamatórias e envolvidos
em vários processos como defesa do hospedeiro, estimulação de resposta imune adaptativa e
modulação da resposta inflamatória para doença pulmonar (BALS; HIEMSTRA, 2006).
Os PAs também estão relacionados com doença periodontal, que pode ser causada
através de infecção por uma variedade de mudanças microbianas relacionada ao rompimento
da mucosa oral . Nessa linha de observação, pacientes com neutropenia congênita severa com
deficiência de PAs foram associados com ocorrência de infecção e doença periodontal
(PUTSEP et al., 2002).
54
O tratamento contra o câncer utilizando quimioterapia apresenta numerosas
limitações, incluindo toxicidade e desenvolvimento de resistência contra várias drogas pelas
células cancerosas. Os PAs também têm sido uma classe emergente e promissora de novas
drogas naturais com atividade tóxica contra células cancerosas (ZAIOU, 2007). Dentre várias
outras doenças, os PAs ainda podem estar relacionados com o processo inflamatório da
aterosclerose. Um aumento do processo de transcrição do peptídio catelicidina LL-37 em
lesões ateroscleróticas humanas comparado a artérias normais foi reportado (EDFELDT et al.,
2006).
2.4.5.Importância de estudos sobre PAs
O tipo de atividade biológica dos PAs geralmente depende de sua concentração,
por exemplo, em uma concentração mais baixa, eles podem influenciar transdução ou
proliferação de sinais e, em uma concentração maior, podem ocasionar lise da célula.
Provavelmente essa característica universal dos peptídeos contribui para sua conservação
durante a evolução (KAMYSZ; OKROJ; LUKASIAK, 2003).
É necessário observar os peptídeos terapêuticos de maneira diferente da utilizada
para os antibióticos convencionais. Uma vez que a maioria dos PAs são simples produtos da
tradução de genes, são relativamente simples para produção por métodos de expressão
recombinante, evitando problemas associados com proteólise e rápida destruição (VAN
T’HOF et al., 2001).
Os PAs possuem funções além das atividades antimicrobianas e representam um
alvo atrativo para a produção de futuros agentes terapêuticos. Adicionalmente, ainda existem
vários problemas não resolvidos a serem considerados como: técnicas padrão para assessar
atividade desses peptídeos, mecanismos de regulação celular de certas α-defensinas são
pobremente definidos, habilidade para essas futuras medicações atingirem o alvo das doenças
permanece como um desafio, nível de tolerância e toxicidade desses peptídeos precisam ser
definidos e finalmente o entendimento da expressão dos PAs na saúde e na doença permanece
como um desafio na área da pesquisa. Ou seja, pesquisas que envolvem esses assuntos
fornecem importantes descobertas na patofisiologia dos PAs nas doenças (ZAIOU, 2007).
55
2.5. Peptídeos antimicrobianos da cavidade oral
A cavidade oral é um meio ambiente com características intrínsecas. A mucosa
oral é uma interface protetora crítica entre o meio externo e interno e serve como barreira para
os milhares de microorganismos existentes na boca. Saliva, superfície epitelial e leucócitos
polimorfonucleares (neutrófilos) são elementos que contribuem para manter a saúde da
cavidade oral e do periodonto. Os PAs estão presentes em cada um desses elementos,
contribuindo de maneira importante para o balanço entre saúde e doença como parte da
resposta imune inata do hospedeiro (DALE et al., 2006). Diversos peptídeos têm sido
relatados no meio oral, tais como os derivados das seguintes proteínas: catelicidinas
(ALTMAN et al., 2006, MURAKAMI et al., 2002, TAO et al., 2005, WOO et al., 2003),
defensinas (DALE et al., 2001, DUNSCHE et al., 2002, MATHEWS et al., 1999, McKAY et
al., 1999, MIZUKAWA et al., 1999a, MIZUKAWA et al., 1999b, SAHASRABUDHE et al.,
2000, TAO, 2005), proteínas ricas em prolina (PRPs) (AYAD et al., 2000,
PERINPANAYAGAM; VANWUYCKHUYSE; TABAK, 1995), histatinas e estaterinas
(PERINPANAYAGAM; VANWUYCKHUYSE; TABAK, 1995).
Um dos métodos que tem emergido na caracterização de peptídeos de baixo peso
molecular é o LC/MS (Cromatografia líquida de alta pressão acoplada ao espectrômetro de
massa) (LINSCHEID et al., 2009). LC/MS comparativo pode ser feito determinando o
volume do pico formado através desse método para cada massa e comparando esses
resultados através de vários processamentos de diferentes amostras, que irão prover uma visão
quantitativa compreensiva de milhares de concentrações de peptídeos entre as amostras. A
partir dessa visão geral, uma lista de diferentes peptídeos selecionados pode ser produzida
para subseqüente fragmentação através do LC-MS/MS com a finalidade de se obter
informação sobre seqüência de peptídeos selecionados (AMERICA; CORDEWENER, 2008).
2.5.1. Presença nos tecidos orais e no sulco gengival
Em estudo realizado para verificar a presença de defensina no sulco gengival,
microesferas paramagnéticas revestidas com anticorpos contra defensinas foram utilizadas
para recuperar esses peptídeos do sulco gengival. A amostra constava de 20 sítios; defensinas
foram encontradas em 100% dos sítios, variando de uma quantidade de 270 a 2000 ng/sítio.
As grandes concentrações locais de defensinas, estimadas em mg/mL, provavelmente
possuem importantes efeitos na microbiologia do sulco gengival (McKAY et al., 1999)
56
Dale et al. (2001), utilizando anticorpos e hibridização in situ, procuraram estudar
a presença de PAs no epitélio variado do periodonto e em células epiteliais gengivais
cultivadas. No tecido gengival, RNAm para as β-defensinas hBD-1 e hBD-2 foi localizado
predominantemente no epitélio estratificado suprabasal, e os peptídeos foram detectados nas
camadas epiteliais superiores consistentes com a formação de barreira epitelial estratificada.
Nas células epiteliais cultivadas, os peptídeos hBD-1 e hBD-2 foram detectados somente no
período da diferenciação, apesar de hBD-2 requerer estimulação por mediadores pró-
inflamatórios ou produtos bacterianos para expressão. β-defensinas não foram detectadas no
epitélio juncional, em contraste, α-defensinas e o membro LL-37 da família das catelicidinas
foram detectados em neutrófilos polimorfonucleares que migraram através do epitélio
juncional.
Dunsche et al. (2002) investigaram a expressão de hBD em tecidos por reação em
cadeia de polimerase transcriptase-reversa (RCP-TR). Foram examinados queratinócitos
(n=3) e fibroblastos (n=3), amostras de tecido, sendo 64 sem inflamação e 40 inflamados e 10
amostras de glândulas salivares. Foi demonstrado a expressão de hBD-3 (61/64), hBD-1
(64/64) e hBD-2 (64/64) em tecidos orais não inflamados. Em contraste, apenas 23, 22 e 24
dos 40 tecidos inflamados mostraram hBD-1, hBD-2 e hBD-3 detectáveis, respectivamente.
Nas glândulas salivares, a expressão de RNAm foi constitutiva para hBD-1, freqüente para
hBD-2 (9/10) e infreqüente para hBD-3 (4/10). Queratinócitos orais, mas não fibroblastos,
continham transcritos para β-defensina sugerindo que hBD-3 também é produzida nos
compartimentos epiteliais dos tecidos orais.
Para examinar a expressão do peptídio LL-37, proveniente da catelicidina, nas
glândulas salivares humanas e investigar a regulação da catelicidina em condições
inflamatórias, foi realizado um estudo com reação transcriptase-polimerase reversa e
imunohistoquímica em 20 tecidos de glândulas salivares. Tendo como resultado a presença
desse peptídio em glândulas salivares normais e com sialoadenite crônica (WOO et al., 2003).
Em trabalho realizado por Altman et al. (2006), foi comparada a ação do peptídio derivado de
anfíbio K4-S4(1-15) contra patógenos orais associados à cárie e periodontite com a atividade
dos peptídeos humanos LL-37, anteriormente encontrado em glândulas salivares, e dhvar4a.
As espécies cariogênicas Estreptococos do grupo mutans, Streptococcus sobrinus,
Lactobacillus paracasei e Actinomyces viscosus foram resistentes a LL-37 encontrada na
cavidade oral. Porphyromonas gingivalis foram as espécies mais resistentes aos três peptídeos
testados. K4-S4(1-15) mostrou maior atividade contra uma bactéria planctônica testada, e esse
peptídio foi bactericida na superfície atacada por EGM assim como em biofilme contendo
57
EGM in vitro. Contudo, o ataque à superficie aumenta a resistência do EGM ao peptídio
antimicrobiano.
2.5.2. Presença na saliva
A saliva humana contém apreciáveis quantidades de aminoácidos livres
(FONTELES et al., 2009, VANWUYCKHUYSE, 1995) e peptídeos de baixo peso molecular
(MADAPALLIMATTAM; BENNICK, 1990). Espécies desse tamanho estão submetidas a
mudanças com a fase aquosa da placa dentária (TATEVOSSIAN, 1990), podendo representar
substratos metabólicos potenciais para a microflora da placa. Várias funções têm sido
atribuídas aos peptídos salivares, como: antifúngica contra Candida albicans (OPPENHEIM
et al., 1988, RAJ; ANTONYRAJ; KARUNAKARAN, 2000), antiviral contra HIV (ZHANG
et al., 2002), antibacteriana contra EGM, F. nucleatum, A. actinomycetemcomitans
(OUHARA et al., 2005, TANAKA; MIYASAKI; LEHRER, 2000).
Histatinas 1, 3 e 5 da secreção da parótida humana foram isoladas por meio de
filtração em Bio-Gel P-2 e cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) de fase reversa. Foi
determinada a estrutura da amostra, sendo sugerido que histatinas 1 e são derivadas de
diferentes genes estruturais, considerando que histatina 5 é um produto proteolítico da
histatina 3. Todas as três histatina demonstraram ação letal contra Candida albicans
(OPPENHEIN et al., 1988).
A atividade microbicida das defensinas também foi avaliada contra Candida
albicans, duas bactérias Gram-negativas (Actinobacillus actinomycetemcomitans e
Porphyromonas gingivalis) e duas bactérias Gram-positivas (Streptococcus gordonnii e
Estreptococos do grupo mutans). Os peptídeos HNP1 e HNP2 foram potentes contra Candida
albicans. As bactérias Gram negativas e Gram positivas foram insensíveis para as defensinas
humanas. Todavia, a inserção de dois resíduos básicos na arginina, tanto na região N-terminal
como na região C-terminal da HNP 2, permitiu o desenvolvimento de atividade antifúngica e
antibacteriana (RAJ; ANTONYRAJ; KARUNAKARAN, 2000).
Os linfócitos T CD8 de certos indivíduos infectados por HIV-1 que estão
imunologicamente estáveis secretam um fator solúvel denominado CAF, que suprime a
replicação de HIV-1. Foi identificado, em uma pesquisa, um grupo de proteínas que são
secretadas quando células T CD8 de pacientes estáveis infectados por HIV-1 são estimuladas.
Esse grupo é formado pelas α-defensinas 1, 2 e 3 (ZHANG et al., 2002).
58
Peptídeos antimicrobianos sintéticos das β-defensinas-1 humanas (hBD1), hBD2,
hBD3 e LL-37 foram avaliados quanto à atividade microbiana contra bactéria oral. Foram
incluídas no estudo as seguintes bactérias: Actinobacillus actinomycetemcomitans,
Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Fusobacterium nucleatum, Estreptococos
do grupo mutans, Streptococcus sobrinus, Streptococcus salivarius, Streptococcus sanguis,
Streptococcus mitis e Lactobacillus casei. Embora os quatro peptídeos estudados tenham
apresentado atividade antimicrobiana contra todas as bactérias testadas, o nível de atividade
antibacteriana foi variável entre as diferentes estirpes e espécies. A atividade antibacteriana de
hBD1 foi menor que a dos outros peptídeos. Entre as bactérias testadas no estudo, F.
nucleatum foi a mais suscetível a hBD3 e LL-37 e S. mutans foi a mais suscetível a hBD3
(OUHARA et al., 2005).
Atividade bactericida da LL-37 sintética, que é uma catelicidina, foi testada contra
Actinobacillus actinomycetemcomitans (três estirpes) e Capnocytophaga spp. (três estirpes).
Todas as estirpes foram sensíveis à LL-37 e exibiram dose 99% efetiva de 7,5 a 11,6 μg/mL
(TANAKA; MIYASAKI; LEHRER, 2000).
Diversos PAs foram encontrados na saliva como está demonstrado no quadro 1.
Quadro 1: Trabalhos científicos mostrando diferentes tipos de peptídeos encontrados na saliva
Seqüência do peptídio Proteína
precursora Relação
com cárie População Bibliografia
SPPGKPQGPPPQ, PPPPGKPQGPP, PPGKPQGPPPQGG, PPGKPQGPPPQG
Proteína Rica em Prolina
(IB-7) sim 18 adultos AYAD et al., 2000
SPPGKPQGPPPQGGNQPQGPPPP PGKPQGPPPQGGNKPQGPPPP GKPQGP
PPQGDNKSR (IB-7) não 1 adulto
PERINPANAYAGAM et al., 1995
GRPQGPPQQGGHQQ, PPPPPPG, GPPPQ Proteína Rica
em Prolina (IB-8b)
sim 18 adultos AYAD et al., 2000
GRPQGPPQQGGHQQGPP PPPPGKPQGPPPQGGRPQGPP QGQSPQ
(IB-8b) não 1 adulto PERINPANAYAGAM
et al., 1995
GPPPQGGRPQ Proteína Rica
em Prolina não 3 adultos HUANG et al., 2008
PQAPPA, PQQPQAPPAGQPQ Proteína Rica
em Prolina (IB-4)
sim 18 adultos AYAD et al., 2000
YPPGPLAPPQPFGPGFVPPPPPPPYGPG Proteína Rica
em Prolina (P-B)
sim 18 adultos AYAD et al., 2000
PQQPQAPPAGKPQGP, PPRPAQGQQ Proteína Rica
em Prolina (IB-5)
sim 18 adultos AYAD et al., 2000
59
Seqüência do peptídio (continuação)
Proteína precursora
Relação com cárie
População Bibliografia
GQSPQ aPRP-1,
aPRP-2, aPIF-s, bPRP IB-8b
não 1 adulto PERINPANAYAGAM
et al., 1995
SKSRSA bPRP IB-8c não 1 adulto PERINPANAYAGAM
et al., 1995
GKSRSPR bPRP IB-9 não 1 adulto PERINPANAYAGAM
et al., 1995
GKSRSPR bPRP IB-1 não 1 adulto PERINPANAYAGAM
et al., 1995
GKSRSPR bPRP II-2 não 1 adulto PERINPANAYAGAM
et al., 1995
GPPQPPQGPP, GPPGQ IB-7 sim 18 adultos AYAD et al., 2000
GPPG, DRPP IB-4 sim 18 adultos AYAD et al., 2000
SPVLDEVPA IB-5 sim 18 adultos AYAD et al., 2000
DSHAK, DSHAKR, SHAKR, HEKHHSHRGY, HSHRGY, SNYLYDN, NYLYDN, LYDN
Histatina 3 não 1 adulto PERINPANAYAGAM
et al., 1995
FGYGYGPY Estaterina não 1 adulto PERINPANAYAGAM
et al., 1996
CZQRIKDFLRNLVPRTES, CZNLYRLLDLDPRPTMD
Catelicidina LL-37
não 2 adultos MURAKAMI et al.,
2002
Não seqüenciado Catelicidina
LL-37 não
149 crianças entre 11 e 15 anos de idade
TAO et al., 2005
Não seqüenciado
Beta defensina humana-1
(hBD-1)
não 8 adultos SAHASRABUDHE et
al., 2000
Não seqüenciado hBD-1 não 5 adultos MATHEWS et al.,
1999
AYRIPAIAGERRYGTIYQGRLWAF hBD-1 não 39 adultos MIZUKAWA et al.,
1999a
AYRIPAIAGERRYGTIYQGRLWAF hBD-1 não 28 adultos MIZUKAWA et al.,
1999b
Não seqüenciado hBD-2 não 5 adultos MATHEWS et al.,
1999
Não seqüenciado hBD-3 não 149 crianças entre 11 e 15 anos de idade
TAO et al., 2005
Não seqüenciado Alfa-
defensina HNP1-3
sim 149 crianças entre 11 e 15 anos de idade
TAO et al., 2005
O primeiro estudo existente na literatura relacionando fracionamento de peptídeos
de baixo peso molecular em saliva de crianças com cárie foi feito por Kohyama, Shimomura e
Sanada (1984). Nesse trabalho, foi obtido saliva total de 48 crianças de 3 a 9 anos de idade,
com cáries. Utilizou-se o índice de severidade de cáries (CSI) durante o exame clínico. As
amostras de saliva foram purificadas em colunas de Bio Gel P-6 e processadas no HPLC.
60
Foram encontrados dois picos diferentes entre os grupos com alto CSI e baixo CSI. Esses
picos tinham peso molecular entre 1500Da e 4000Da, e encontravam-se em maior
concentração nas crianças com alto CSI.
Perinpanayagam et al. (1995) caracterizaram e fizeram a análise da seqüência de
vários peptídeos de baixo peso molecular, que foram purificados da saliva de parótida humana
de 1 indivíduo através de colunas de Bio Gel P-2, processadas no HPLC e caracterizadas com
as respectivas seqüência de aminoácidos. Através das seqüências obtidas, os PAs encontrados
provavelmente são derivados da proteólise das proteínas histatinas, proteínas ricas em prolina
e estaterinas. Como a saliva da parótida é um líquido que não possui microorganismos, muitos
dos PAs fracionados dessa secreção parecem ter derivado do processo proteolítico de grandes
proteínas.
Posteriormente, a saliva foi utilizada para encontrar relação de PAs com várias
doenças orais em um estudo que verificou a presença do peptídio antimicrobiano HNP-1 em
21 pacientes. Saliva total foi coletada, isolada e purificada por meio de HPLC, a seqüência de
aminoácidos foi determinada e o peso molecular da HNP-1 foi mensurado através do
espectrômetro de massa. Como resultados, foi mostrado que a concentração de HNP-1 na
saliva de pacientes com líquen plano (n=5), leucoplasia (n=4), glossite associada com
deficiência de ferro (n=4) foi 8,3 ± 4,3μg/mL, 13,2 ± 7,9μg/mL e 11,4 ± 4,9μg/mL,
respectivamente. Essas concentrações foram significantemente maiores que aquelas de
sujeitos saudáveis (0,8μg/mL). Em contraste, concentrações salivares de HNP-1 em pacientes
com glossodínia (n=4) e descomforto oral (n=4) foi similar àquele de indivíduos saudáveis
(Mizukawa et al., 1999a).
No mesmo ano, foi realizado trabalho semelhante, mas em 10 pacientes com
inflamação oral, no qual foi verificado que a concentração de HNP-1 era significativamente
maior em pacientes com inflamação oral do que em voluntários saudáveis. Em pacientes com
inflamação oral, a concentração foi significativamente maior antes do que depois do
tratamento. Ainda foi encontrado nessa população uma forte correlação positiva entre a
concentração de defensina-1 salivar e a concentração da proteína C-reativa (Mizukawa et al.,
1999b).
Mattews et al. (1999) analisaram a produção de peptídio derivado da β-defensina
por mucosa oral e glândulas salivares. Nesse estudo, foi caracterizada a expressão de RNAm
de hBD-1 e hBD-2 nas glândulas salivares, na língua, gengiva e mucosa bucal e detectado
peptídeos de β-defensina em secreções salivares. A expressão de RNAm foi quantificada por
ensaios de proteção RNAse, sendo detectado RNAm de hBD-1 em gengiva, glândula
61
parótida, mucosa bucal e língua. Western Blot, cromatografia líquida e espectrômetro de
massa foram utilizados para identificar peptídeos de hBD-1 e hBD-2 em saliva humana. A
expressão de hBD-1 foi constitutiva, enquanto a expressão de hBD-2 foi induzida por IL-1β e
LPS.
Outra pesquisa foi delineada para detectar a expressão e localização do peptídio
de hBD-1 em glândulas salivares e na saliva. Foram feitas biópsias de pacientes com
mucocele (n=20), havendo a detecção desse peptídio por imunohistoquímica e expressão
localizada em células ductais e não em células acinares nessas glândulas. O peptídio estava
localizado apicalmente próximo ao lúmen nas células do ducto. Análise de Western-Blot
também detectou peptídio de hBD-1 em saliva total, acidificada, não estimulada de
voluntários sadios (SAHASRABUDHE et al., 2000).
PAs de catelicidinas também foram encontrados em glândulas salivares e saliva
em pesquisa realizada para examinar a expressão de RNAm e proteínas em ratos e saliva
humana (MURAKAMI et al., 2002).
Buscando uma associação dos PAs derivados das Proteínas Ricas em Prolina
(PRPs) com a experiência de cárie foi realizado um estudo com 18 adultos, sendo 9 livres de
cárie e 9 com cárie. A análise identificou 18 peptídeos que pareciam ser produtos de clivagem
proteolítica das PRPs IB-4, IB-5, IB-7, IB8b e P-B. Os peptídeos mais abundantes no grupo
sem cárie diferiu daqueles isolados do grupo com cárie. A concentração média de peptídeos
de uma possível proteína precursora denominada IB-7 foi encontrada em maior quantidade na
saliva coletada de indivíduos sem cárie. Os resultados desse trabalho mostraram que o
processo proteolítico de proteínas da saliva da parótida difere entre indivíduos com e sem
cárie (AYAD et al., 2000).
Posteriormente foi realizado um estudo com o objetivo de determinar a possível
relação entre a prevalência de cárie e e as concentrações salivares dos peptídeos hBD-3,
catelicidina LL 37 e α-defensina HNP1-3 (mistura de HNP1, 2, 3). Saliva total foi coletada de
149 crianças com idade entre 11 e 15 anos. Enquanto os níveis de LL-37 e hBD-3 não se
correlacionaram com experiência de cárie, a média dos níveis de HNP1-3 foi
significantemente maior nas crianças sem cárie do que nas crianças com cárie. Crianças com
altos níveis de cárie não possuíam altos níveis de EGM, portanto HNP1-3 não foi
correlacionado com EGM salivar. Através de imunohistoquímica, foi localizado HNP1-3 em
células do ducto salivar das glândulas submandibulares (TAO et al., 2005).
No estudo realizado por Huang et al. (2008), nove peptídeos ricos em prolina
foram sequenciados. O peptídio GPPPQGGRPQ liga-se à bactéria Gram positiva
62
Propionibacterium acnes e inibe consideravelmente o crescimento bacteriano. Esse , por
exibir imunidade inata, pode ser aplicado no tratamento de várias doenças humanas
associadas ao P. acnes.
63
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo geral
Estudar o perfil de peptídeos salivares de crianças com e sem cárie da primeira
infância.
3.2. Objetivos específicos
Determinar perfil qualitativo de peptídeos de saliva total humana de crianças
com e sem cárie da primeira infância;
Avaliar níveis de EGM salivares;
Avaliar experiência de cárie da população estudada;
Correlacionar composição dos peptídeos presentes em saliva total humana,
níveis de EGM salivares e experiência de cárie.
64
4. MATERIAIS E MÉTODOS
O projeto dessa pesquisa foi submetido à avaliação pelo Comitê de Ética em
Pesquisa (COMEPE) da Universidade Federal do Ceará, tendo sido aprovado em 22/03/07
sob o protocolo no 53/07, ofício n
o 234/07 (Anexo A).
4.1. Protocolo clínico
4.1.1. Desenho
O desenho consistiu de um estudo observacional transversal.
4.1.2. Examinadores
A coleta das amostras foi realizada com auxílio de 2 (dois) alunos do curso de
Odontologia da Universidade Federal do Ceará (UFC), sendo um único examinador
(pesquisadora) responsável pelo exame clínico para detecção de cárie dos participantes
cadastrados. Os alunos e a examinadora desconheciam os resultados das análises concernentes
a esses indivíduos, pois as amostras foram submetidas à análise contendo apenas um número
de identificação. A pesquisadora contou com o auxílio dos alunos bolsistas durante a análise
microbiológica e bioquímica das amostras e foi responsável pela contagem dos
microorganismos, pela leitura dos testes bioquímicos para identificação dos microorganismos
e pela análise dos peptídeos salivares.
4.1.3. Amostra
Este estudo foi desenvolvido no município de Fortaleza, na Universidade Federal
do Ceará (UFC). Um total de 106 voluntários sadios, com (48) e sem (58) cárie da primeira
infância, de ambos os sexos, com idade de 10 a 71 meses (média = 45,97; desvio padrão =
15,61), foram selecionados para participação no estudo.
65
4.1.4. Critérios de inclusão dos participantes
Os seguintes critérios foram adotados no processo de recrutamento dos
voluntários:
Crianças de ambos os sexos;
Sadias;
Com idade situada na faixa de 6 a 71 meses;
Com padrão normal de crescimento e desenvolvimento;
Ausência de doenças conhecidas;
Ausência de terapia medicamentosa no período de coleta de material;
Livres de cárie (ausência de lesões cariosas clinicamente detectadas)
(Grupo 1);
Portadoras de cárie da primeira infância (presença de lesões cariosas
clinicamente detectadas) (Grupo 2).
4.1.5. Critérios de exclusão dos participantes
Foram excluídos do estudo voluntários que se enquadrem nos seguintes critérios:
Presença de doenças sistêmicas ou congênitas identificadas durante o momento
da anamnese;
Fazendo uso de quaisquer medicamentos;
Crianças cujos pais ou responsáveis legais se recusaram a assinar o termo de
consentimento informado.
Crianças com comportamento agitado, que choraram durante a coleta de saliva.
4.1.6. Entrada do voluntário no estudo
Para a entrada do voluntário no estudo, foi imprescindível a presença de um dos
pais ou responsável legal pela criança para que fosse esclarecido em detalhes a natureza e os
objetivos do estudo do qual fosse obtido o consentimento informado por escrito
(Apêndice A). Para o responsável pela criança que soubesse ler e escrever, foi solicitado
assinatura do termo de consentimento. Para aqueles que não sabiam ler, foi feita leitura verbal
do termo de consentimento para solicitação de impressão digital, com subseqüente assinatura
66
de uma testemunha. Houve liberdade para a retirada da criança do estudo a qualquer
momento. Não houve ressarcimento em espécie para os pais, responsáveis ou crianças. Foi
dado para a criança o direito de ter, livre de custos, tratamento odontológico completo e
acompanhamento até o término da pesquisa (Figura 6).
Figura 6: Tratamento odontológico realizado em um dos participantes do estudo.
Nota: A) Situação clínica encontrada durante a coleta de saliva; B) Resultado clínico após tratamento.
Fonte: O autor.
Após devida assinatura do termo de consentimento informado, os voluntários
foram submetidos a uma anamnese para obtenção de informações concernentes ao seu estado
geral de saúde (Apêndice B).
4.1.7. Exame dentário
Durante o procedimento de exame dos dentes, os seguintes parâmetros foram
averiguados e anotados na ficha dentária (Apêndice C):
1. Situação dos tecidos moles intra-orais;
2. Dentes presentes na cavidade oral: decíduos e permanentes;
3. Dentes decíduos presentes na cavidade já com mobilidade fisiológica;
4. Número de dentes:
Cariados (cavitados e não cavitados)
Restaurados
Extraídos devido à cárie
5. Número de superfícies:
Cariadas (cavitadas e não cavitadas)
Ausentes (devido à cárie)
Restauradas
67
4.1.8. Coleta de saliva
A coleta de saliva (Figura 7) foi realizada na Clínica de Odontopediatria do Curso
de Odontologia da Universidade Federal do Ceará. Após conclusão do exame dentário, duas
amostras de saliva foram coletadas de cada participante, entre 8 e 11 horas da manhã para
reduzir possíveis contribuições circadianas, após um mínimo de três horas de jejum. Foi
requerido por parte dos pais que os procedimentos rotineiros de higienização da cavidade oral
fossem realizados uma hora antes da coleta. A primeira amostra constituiu-se de saliva não
estimulada, ou seja, a criança permaneceu em repouso no colo da mãe por um período de 30
minutos e, logo após, a saliva foi coletada fazendo-se uso de uma pipeta plástica (Figura 8).
Uma segunda amostra foi coletada com estímulo. A criança teve que mascar um pedaço de
parafina Parafilm “M”® Laboratory Film (American National Can, Grenwich, CT) (Figura 8)
presa a um pedaço longo de fio dental para evitar a deglutição do material (Figura 8). A
mastigação desse material teve por objetivo deslocar os Streptococcus mutans dos dentes
(JORDAN et al., 1987). Após o período de 60 (sessenta) segundos, o Parafilm “M”®
Laboratory Film (American National Can, Grenwich, CT) foi retirado da boca da criança,
descartado, e a saliva coletada durante o primeiro minuto foi colocada em tubos Eppendorfs®
(Figura 8) para posterior análise, conforme descrito por Dawes, 1987.
Figura 7: Coleta de saliva realizada na clínica de Odontopediatria da UFC.
Fonte: O autor
68
Figura 8: Acessórios utilizados durante a coleta de saliva
Nota: A) pedaço de parafina Parafilm “M”® Laboratory Film (American National Can, Grenwich, CT) presa a
um pedaço longo de fio dental; B) Tubo Eppendorf® e pipeta plástica
Fonte: O autor.
Figura 9: Procedimentos realizados antes da liofilização.
Nota: A) Amostras de saliva colocadas na centrífuga; B) Retirada do sobrenadante com auxílio de micropipeta.
Fonte: O autor.
4.2. Protocolo analítico
4.2.1. Transporte e armazenagem da saliva
As amostras de saliva foram transportadas em tubos Eppendorfs®, sob gelo. Para
análise do perfil de peptídeos salivares, foram utilizadas amostras de saliva não estimuladas.
Tendo sido centrifugadas (centrífuga Janetzki) a 3000 rpm por 5 minutos a 32oC, sendo
retirado 100μL do sobrenadante, que foi liofilizado e armazenado a -20oC até análise (Figura
9).
As amostras de saliva estimuladas foram utilizadas para a análise microbiológica.
Esse processamento ocorreu no mesmo dia, no Laboratório de Anaeróbios do Departamento
69
de Patologia e Medicina Legal da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará
(UFC), até no máximo 2 horas após a coleta (RUOFF; WHILEY; BEIGHTON, 2003).
4.2.2. Análise microbiológica
O meio de cultura utilizado para a contagem de EGM foi o ágar mitis salivarius
bacitracina (MSB) (Difco, Detroi, Michigan, USA), suplementado com telurito de potássio
(Vetec Química fina LTDA, Rio de Janeiro) a 1%, bacitracina (Sigma) a 1% e sacarose
(Merck) a 15%. Esse meio é seletivo para EGM porque a presença de telurito de potássio e
bacitracina em concentrações críticas não é tolerada por outros estreptococos do grupo
Viridans (GOLD; JORDAN; VAN HOUTE, 1973).
4.2.3. Preparo do meio de cultura
Para o preparo do meio MSB, foram utilizados 15g de sacarose, 9g de meio base
mitis salivarius e 100mL de água destilada. Esses produtos foram misturados em Erlenmeyer,
que posteriormente foi levado ao autoclave a 121oC por 15 minutos. Após a retirada do frasco
de Erlenmeyer do autoclave, esperou-se a temperatura da mistura sofrer uma redução até
atingir aproximadamente 45oC, sendo acrescentado, nesse momento, 1mL da solução de
telurito de potássio a 1% e 1mL da solução de bacitracina a 1%.
Empregaram-se pipetas estéreis para a separação do meio nas placas de Petri,
sendo colocado 10mL do meio em cada placa.
Figura 10: Procedimentos feitos durante a preparação do meio de cultura.
Nota: A) Sacarose sendo pesada na balança; B) Meio sendo espalhado nas placas por meio de pipeta; C)Meio
dividido entre algumas placas.
Fonte: O autor.
70
4.2.4. Preparo da solução salina
Foram utilizados 0,9g de cloreto de sódio e 100mL de água destilada para o
preparo da solução salina a 0,9%. A homogeneização dos componentes resultou em uma
solução, que foi levada ao autoclave a 121oC por 15 minutos. A solução salina estéril foi
armazenada em tubos de hemólise (0,9mL em cada tubo).
4.2.5. Processamento das amostras
A fim de ser analisada microbiologicamente, a saliva foi diluída para possibilitar a
contagem dos Streptococcus mutans (Figura 11), sendo utilizadas nesse estudo as diluições
1:100 e 1:1000. Dessa forma, 0,1mL de saliva estimulada de cada tubo Eppendorf® foi
transferida assepticamente para o tubo de hemólise contendo 0,9mL de solução salina estéril.
A saliva e a solução salina foram misturadas, constituindo uma solução (diluição 1:10). Logo
em seguida, retirou-se 0,1mL do tubo de hemólise de concentração 1:10, colocando-se em
outro tubo de hemólise de 0,9mL de solução salina, tendo resultado em uma concentração de
1:100. Repetiu-se o processo de diluição para a obtenção da diluição 1:1000. Um volume de
0,1mL de cada diluição utilizada foi cultivado em duplicata no meio MSB, sendo espalhado
com a utilização de alça Drigalski previamente flambada. As placas de Petri semeadas foram
incubadas em estufa bacteriológica (Biomatic) a 37oC em ambiente de microaerofilia (jarra
com vela) por 48 horas. Após esse período, as placas foram submetidas à leitura para a
contagem das colônias de S.mutans (WESTERGREN; KRASSE, 1978).
A leitura foi feita por observação visual através da contagem manual na placa de
Petri e transformada em UFC/mL de saliva, multiplicando-se o número de colônias
encontradas pela respectiva diluição, sendo anotados os valores encontrados em cada placa
semeada (Figura 12).
71
Figura 11: Desenho esquemático dos procedimentos de diluição.
Nota: 1) 0,1mL de saliva é colocada em tubo de hemólise contendo 0,9mL de solução salina, formando a
diluiçao 1:10; 2) 0,1mL da solução de 1:10 é colocada em outro tubo de hemólise, formando a diluição de 1:100;
3) 0,1 mL da solução com diluição de 1:100 é colocada na placa e Petri; 4)0,1mL da solução de 1:100 é colocada
em um terceiro tubo de hemólise, formando a diluição de 1:1000; 5) 0,1mL da solução com diluição de 1:1000 é
colocada em uma segunda placa de Petri.
Fonte: O autor.
Figura 12: Placa de Petri semeada, podendo-se visualizar colônias de Streptococcus mutans.
Fonte: O autor.
Os EGM apresentam características peculiares em meio de culturas ricos em
sacarose. Eles são distinguidos das demais espécies bacterianas por apresentarem colônias
com características morfológicas ovaladas, de cor azul, medindo aproximadamente 0,5 a
0,75μm de diâmetro, apresentando bordas irregulares, fortemente aderidas ao meio e, quando
observados ao microscópio, são vistos agrupados aos pares ou em cadeia (KONEMAN et al.,
2001)
72
4.2.6. Testes bioquímicos
A série bioquímica para caracterização de espécies de Streptococcus mutans
utilizou o meio tioglicolato de sódio (Difco), suplementado por carboidratos (manitol) para
fermentação e ágar esculina para hidrólise (RUOFF; WHILEY; BEIGHTON, 2003). Esses
meios são utilizados como prova bioquímica na identificação das bactérias Gram-positivas.
Retirou-se uma colônia com uma alça bacteriológica previamente flambada e
inoculou-se em um tubo de hemólise contendo manitol sólido. O procedimento foi repetido
colocando-se outra colônia em um tubo de hemólise contendo esculina. Os tubos foram
levados à estufa a 37oC. Após 72 horas de incubação, foi feita a análise do teste, sendo
considerado positivo quando ocorreu mudança de cor do manitol de roxo para amarelo, e da
esculina, de cinza para preto (MURRAY et al., 2003).
4.3. Análise dos peptídeos
4.3.1. Preparo da amostra
Os procedimentos preliminares concernentes à saliva realizados após a
centrifugação e obtenção do sobrenadante foram realizados no laboratório de
Neurofarmacologia do departamento de Ciências Fisiológicas do Centro de Ciências da Saúde
da Universidade Estadual do Ceará.
Em cada tubo Eppendorf® contendo saliva não estimulada liofilizada, foram
acrescentados 300μL de água bidestilada para ressuspensão do material. A solução foi
homogeneizada com auxílio de um agitador Vortex (Fischer Scientific, EUA). Posteriormente
a amostra contida em cada tubo foi dividida em três partes. Cem microlitros de cada amostra
permaneceram no tubo Eppendorf® para que fossem analisadas individualmente. Das amostras
dos voluntários com experiência de cárie, os 200μL restantes foram misturados em um béquer
para constituir o pool de pacientes com cárie (PCC). Da mesma forma, os 200μL restantes das
amostras dos pacientes livres de cárie foram misturados para compor o pool de pacientes sem
cárie (PSC). O conteúdo de cada béquer foi separado em 2 béqueres. Tendo-se obtido, ao
final, 4 amostras de pools contidas em 4 béqueres.
Todo o material composto pelo pool de pacientes com cárie (2 béqueres), pool de
pacientes sem cárie (2 béqueres) e 106 amostras individuais de pacientes foram novamente
liofilizadas. Após a liofilização, o conteúdo de 2 béqueres (1 com PCC e o outro com PSC)
73
foi dividido em 10 tubos Eppendorfs® , cada qual contendo 2mg do conteúdo de pool
liofilizado, sendo que 5 tubos continham PCC e 5 tubos estavam com PSC (Figura 13). Todo
o material dos pools e das 106 amostras individuais (1 béquer com PCC, 1 béquer com PSC, 5
Eppendorfs® com PCC, 5 Eppendorfs® com PSC e 106 Eppendorfs® com amostras
individuais) foram armazenadas em freezer a -20oC.
Figura 13: Separação das amostras de saliva.
Nota: 1) A saliva contida em cada Eppendorf® foi dividida, sendo que 1/3 permaneceu no tubo para análise e 2/3
foram colocados em um béquer; 2) O conteúdo de 1 béquer foi dividido em dois, sendo 1 armazenado e o outro
utilizado; 3)O béquer utilizado teve seu conteúdo dividido em 5 Eppendorfs®.
Fonte: O autor.
4.3.2. Processamento das amostras em LC/MS
A análise dos peptídeos foi realizada no departamento de Química e Biologia
Química da Indiana University Purdue University Indianapolis (IUPUI).
O conteúdo de saliva liofilizada dos tubos Eppendorfs® (106 de amostras
individuais, 5 de PCC e 5 de PSC) foram ressuspendidos. Sendo acrescentados 50μL de
solução de água bidestilada com 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA) em cada amostra
individual e 100μL da mesma solução em cada pool, por ser este último um material mais
concentrado. Por meio de agitador Vortex (Fischer Scientific), as amostras ressuspendidas
foram homogeneizadas e colocadas em frascos certificados para LC/MS (Figura 14).
74
Figura 14: Amostras de saliva antes e depois da ressuspensão.
Nota: A) Amostras de saliva liofilizadas em tubos Eppendorfs®; B) Amostras de saliva após ressuspensão
colocadas em frascos certificados para LC/MS.
Fonte: O autor.
Um aparelho de cromatografia líquida de alta pressão acoplado ao espectrômetro
de massa (LC/MS) foi utilizado por ser considerado um método de escolha para a
caracterização quantitativa de complexas misturas de proteína (LINSCHEID et al., 2009).
O sistema LC/MS era da Agilent Technologies (Agilent 1100 Series LC/MSD;
Santa Clara, CA, EUA) com software LC/MSD ChemStation (Figura 15). Foi aplicado um
fluxo de 0,6mL/min compatível com a coluna C18 usada (2,1 x 50mm; 3,5μm; Bridge,
Irlanda) e com a fonte de elétrons (electrospray) do espectrômetro de massa. A eluição
ocorreu com o gradiente do eluente A (água bidestilada – 0,1% de TFA) para o eluente B
(acetonitrila – 0,1% de TFA). O gradiente otimizado para a separação foi: 0 - 0,5 minutos,
100%A; 0,5 – 10minutos, 60%B.
Figura 15: Sistema LC/MS utilizado.
Fonte: O autor.
O espectrômetro de massa foi operado no modo íon positivo com voltagem do
capilar 4KV, voltagem do cone 180V, temperatura da fonte 350oC, pressão do nebulizador
60PSI. O espectro de massa foi obtido na unidade m/z (massa por carga), podendo ser
identificados compostos de até 3000 m/z ou simplesmente 3000Da (MANN, MENG; FENN,
1989). Para cada corrida, 10μL da amostra foram injetadas pelo LC/MS.
75
4.3.3. Identificação dos peptídeos
As massas dos peptídeos foram determinadas através da deconvolução do espectro
de massa médio, automaticamente realizado pelo software do equipamento (LC/MSD
ChemStation). Foi realizada uma busca na literatura dos peptídeos previamente identificados
em saliva, sendo a massa desses peptídeos verificada nos bancos de dados: Swiss-Prot
(http://www.expasy.org), EMBL (http://www.emblheidelberg.de) e NCBI (http://www.ncbi.
nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi). Como o sistema utilizado identificava peptídeos com massa
de até 3000Da, os peptídeos de baixo peso molecular que tinham massa entre 3000 e 5000Da
foram pesquisados por meio da massa de seus íons modificados, sendo aplicada a massa
original em um algoritmo para obtenção da massa do íon modificado (MANN, MENG,
FENN, 1989).
Posteriormente foi feita uma busca das massas por meio do software nos
cromatogramas obtidos dos pools. Também foram analisadas as diferenças que havia em
relação aos picos obtidos nos cromatogramas entre os pools com cárie e sem cárie, e se essas
diferenças se repetiam nos cromatogramas das amostras individuais.
4.4. Análise estatística
Com o intuito de reduzir as grandes assimetrias observadas nas contagens de
EGM, logaritmo natural (Ln) desta variável foi utilizado nas análises estatísticas. Para avaliar
a contribuição simultânea das variáveis: presença/ausência de cada peptídeo, níveis de EGM,
idade e sexo, na experiência de cárie utilizou-se um modelo de regressão logística binária.
Neste modelo experiência de cárie foi considerada como a variável dependente, enquanto as
demais variáveis, Ln de EGM, idade, sexo, presença/ausência de cada peptídeo foram
consideradas como variáveis indepedentes. Valores de p < 0,05 foram considerados
significativos. Teste t (Student) foi utilizado para todas as comparições bivariadas e para a
construção de gráfico box-and-whisker plot para relacionar presença/ausência de peptídeo
HNP e presença/ausência de cárie com idade das crianças.
76
5. RESULTADOS
Cento e seis crianças foram examinadas e tiveram a saliva coletada para as duas
análises (microbiológica e bioquímica), no entanto as amostras de saliva de 10 dessas crianças
não puderam ser analisadas microbiologicamente. Uma vez que a saliva a ser cultivada para
contagem de EGM não podia ser armazenada por mais de 4 horas, essas amostras de saliva
que iriam para o laboratório de Microbiologia foram descartadas. Para a análise dos peptídeos
por meio do LC/MS, as salivas puderam ser centrifugadas , liofilizadas e armazenadas em
freezer, de forma que todas as 106 amostras de saliva foram processadas em LC/MS. Nas
análises em que foram utilizados EGM, considerou-se n=96. Uma avaliação dos questionários
sobre estado de saúde geral da criança revelou que nenhuma criança estava sob tratamento
médico, tomando quaisquer tipos de medicamentos, nem possuíam quaisquer tipos de doenças
crônicas ou alergias.
Sete crianças (14,58%) só apresentaram cárie em dentes anteriores, 24 (50%)
exibiram cárie em dentes posteriores e 17 (35,42%) em dentes anteriores e posteriores
concomitantemente. Duas crianças (4,17%) apresentaram lesões de manchas brancas, sendo
que uma (2,08%) só mostrou lesão de mancha branca, não exibindo cavitação. As lesões de
mancha branca localizaram-se nos dentes incisivos. Nas crianças que tinham cárie apenas nos
dentes posteriores, 9 só apresentaram lesão no 1º molar decíduo, 8 no 2º molar decíduo e 7
tinham cárie nos dois molares. O dente mais afetado foi o 1º molar inferior decíduo (37
dentes), seguido pelo 2º molar inferior decíduo (30 dentes). No arco superior, os 1os
molares
decíduos foram os dentes mais acometidos (28 dentes), enquanto incisivos centrais superiores
foram os dentes anteriores mais afetados (26 dentes), seguido dos incisivos laterais (23
dentes) e 2os
molares superiores decíduos(20 dentes). Foi observado um total de 12 incisivos
centrais inferiores, 10 incisivos laterais inferiores e 8 caninos inferiores sendo acometidos por
lesões de cárie. O canino superior foi o dente menos afetado, apresentando 7 dentes com
lesões de cárie.
De acordo com o índice de cárie proposto pela AAPD (2008), o ceo-d e o ceo-s
nas crianças com cárie variaram de 1 – 16 e 1 – 52, respectivamente. Ver tabelas 1 e 2 para
dados de ceo-s, ceo-d, sexo, idade e Logaritmo Natural (Ln) de EGM de todas as crianças
participantes do estudo.
77
Tabela 1: Distribuição das crianças com cárie (ceo-d, ceo-s e CPI-s) por idade, sexo e
contagem de EGM, segundo a AAPD.
N⁰ DE
IDENTIFICAÇÃO
IDADE
(meses) SEXO ceo-d ceo-s CONTAGEM
DE EGM (Ln)
1 48 M 5 5 7,18
3 66 M 2 2 14,91
4 28 F 1 1 4,81
14 32 F 1 1 14,91
16 53 F 1 1 9,44
21 54 M 6 6 8,73
26 38 M 11 19 5,86
32 43 F 5 5 13,06
33 25 F 3 2 10,62
41 61 F 1 1 8,02
43 43 M 8 19 5,91
56 50 M 1 5 11,29
57 44 F 4 4 9,37
60 28 M 2 2 11,21
64 47 F 1 1 5,86
65 57 F 1 5 6,46
66 71 M 5 6 12,91
69 48 F 5 6 11,89
70 67 F 6 6 13,47
71 31 M 2 2 13,83
76 61 M 7 8 12,41
82 71 M 10 18 10,03
85 24 M 10 37 8,01
86 17 M 4 4 9,02
88 71 M 2 2 6,91
89 46 F 3 7 10,58
91 59 M 1 1 8,80
94 35 M 1 1 11,47
98 24 M 8 13 12,44
102 60 M 11 15 0,00
103 39 F 16 52 11,63
105 40 F 16 44 14,80
106 61 M 3 3 0,00
107 46 M 6 8 11,57
108 70 F 2 3 8,61
110 68 M 3 3 9,18
113 30 M 11 19 12,25
114 48 F 2 2 11,61
115 20 F 2 4 7,60
116 65 M 8 24 14,06
117 44 M 2 2 11,58
119 68 M 2 5 9,90
122 45 F 2 2 12,85
124 64 M 13 30 11,24
125 30 F 1 1 11,25
78
Tabela 2: Distribuição das crianças sem cárie (ceo-d, ceo-s) por idade, sexo e contagem de
EGM, segundo a AAPD.
N⁰ DE
IDENTIFICAÇÃO
IDADE
(meses) SEXO ceo-d ceo-s CONTAGEM DE
EGM (Ln)
7 60 F 0 0 6,10
9 43 M 0 0 5,56
11 66 M 0 0 9,31
13 36 M 0 0 6,88
15 44 F 0 0 4,26
18 69 M 0 0 14,91
19 52 F 0 0 10,33
20 22 M 0 0 6,41
22 60 M 0 0 9,70
23 34 M 0 0 7,79
29 39 M 0 0 7,83
34 41 F 0 0 14,91
35 46 F 0 0 5,95
42 59 F 0 0 8,97
45 46 F 0 0 9,80
47 62 F 0 0 14,91
54 69 M 0 0 9,29
55 45 M 0 0 8,21
58 27 M 0 0 10,44
59 62 M 0 0 11,01
61 26 M 0 0 11,21
62 71 F 0 0 0,00
63 17 M 0 0 5,89
67 18 M 0 0 8,67
68 38 M 0 0 7,68
73 57 F 0 0 10,42
74 23 F 0 0 6,21
75 41 M 0 0 0,00
77 58 M 0 0 0,00
78 10 M 0 0 0,00
79 42 F 0 0 0,00
80 18 M 0 0 0,00
81 19 M 0 0 0,00
83 53 F 0 0 0,00
84 34 M 0 0 8,62
87 36 F 0 0 7,72
90 43 F 0 0 5,52
92 29 M 0 0 10,97
93 47 F 0 0 11,74
95 42 F 0 0 9,88
96 42 F 0 0 11,92
99 36 F 0 0 12,48
100 50 M 0 0 5,11
101 27 M 0 0 11,21
104 63 F 0 0 7,31
109 27 M 0 0 9,59
111 43 M 0 0 12,41
118 50 M 0 0 0,00
120 47 F 0 0 12,14
121 27 M 0 0 12,38
123 47 M 0 0 11,60
79
Quanto à severidade da cárie precoce da infância (CPI-s), das 48 crianças que
tiveram experiência de cárie, 27 (56,25%) apresentaram cárie severa da primeira infância
(Tabela 3).
Tabela 3: Distribuição da amostra de crianças com e sem cárie em função do gênero e da
severidade da doença.
SEXO SEVERIDADE
LIVRE DE CÁRIE TOTAL SEVERA NÃO SEVERA
MASCULINO 17 11 36 64
FEMININO 10 10 22 42
TOTAL 27 21 58 106
Foram detectados EGM na saliva da maioria das crianças (85 crianças; 88,54%).
Das 51 crianças que não apresentaram lesões de cárie, 42 (82,35%) apresentaram contagem de
EGM superior ou igual a 1 (Tabela 4). Os níveis salivares de EGM variaram desde não
detectáveis a 3x106 ufc/mL e, conforme vemos nas tabelas 4 e 5, foram agrupados em 3
categorias de contagem: 0, 1 a 105 e >10
5. Das crianças contaminadas, 34 (40%) apresentaram
contaminação moderada (1 a 105) e 51 (60%) apresentaram altos níveis de contaminação
(>105) (JORDAN et al., 1987).
Tabela 4: Distribuição de crianças (n = 96) segundo o número de superfícies cariadas,
obturadas e perdidas devido à cárie, e os diferentes níveis de contaminação por EGM.
CEO-s CONTAMINAÇÃO POR EGM
TOTAL 0 1 a 10
5 > 10
5
0 9 19 23 51
1 a 5 1 11 16 28
6 a 10 0 1 5 6
> 10 1 3 7 11
TOTAL 11 34 51 96
80
Tabela 5: Distribuição dos níveis de contaminação por EGM em relação à idade.
IDADE (meses) CONTAMINAÇÃO POR EGM TOTAL
0 1 a 105 > 10
5
10 a 21 3 4 0 7
22 a 33 0 4 14 18
34 a 45 2 12 11 25
46 a 57 2 6 12 20
58 a 71 3 8 15 26
TOTAL 10 34 52 96
% 10,43 35,41 54,16 100
Foram coletados dados sobre amamentação de 47 crianças (Tabela 6). Não foi
possível a coleta desse dado de todas as 106 crianças porque este foi um dado coletado por
telefone, 2 meses depois da coleta de saliva; sendo assim, muitos números de telefone e
endereços haviam sido modificados, ou não foi possível entrar em contato com o responsável
por algum outro motivo. Desses 47 pacientes, 46 (97,87%) foram amamentados no peito,
tendo a duração dessa amamentação variado de 0 a 48 meses (média = 14,40,
desvio padrão = 12,49). Em relação à escolaridade do responsável, a maioria dos pais tinha
ensino médio completo (57,44%). Dois (4,25%) dos responsáveis não possuíam escolaridade.
81
Tabela 6: Distribuição dos pacientes com idade, ceo-s, contagem de EGM em relação ao tipo
de amamentação, duração da amamentação e escolaridade do responsável.
ID Idade
(meses)
ceo-s
Contagem
de EGM
Amamentação
(peito)
Duração da
amamentação
(meses)
Escolaridade do responsável
Pacientes
7* 60 0 450 não 0 Ensino médio completo
11 66 0 11100 sim 17 Ensino médio completo
13 36 0 975 sim 6 Ensino fundamenal completo
15 44 0 71 sim 6 Ensino fundamenal completo
18 69 0 3000000 sim 26 Ensino médio completo
19 52 0 30750 sim 21 Ensino médio completo
22 60 0 16318 sim 8 Ensino médio completo
55 45 0 3675 sim 3 Ensino fundamenal completo
58 27 0 34250 sim 6 Ensino médio completo
59 62 0 60375 sim 6 não estudou
61 26 0 74250 sim 6 Ensino médio completo
62 71 0 0 sim 2 Ensino fundamenal completo
63 17 0 362 sim 3 Ensino médio completo
67 18 0 5837 sim 24 Ensino médio completo
68 38 0 2165 sim 36 Ensino fundamental incompleto
73 57 0 33541 sim 15 Ensino fundamental incompleto
77 58 0 0 sim 36 Ensino médio completo
78 10 0 0 sim 3 Superior completo
79 42 0 0 sim 8 Ensino fundamental incompleto
80 18 0 0 sim 12 Superior incompleto
81 19 0 0 sim 28 Ensino médio completo
83 53 0 0 sim 3 Ensino médio completo
84 34 0 5541 sim 9 Ensino médio completo
87 36 0 2250 sim 31 Ensino fundamental incompleto
90 43 0 250 sim 48 Ensino fundamental incompleto
92 29 0 57916 sim 6 Ensino médio completo
93 47 0 125916 sim 4 Ensino médio completo
99 36 0 262016 sim 36 Superior completo
3 66 2 3000000 sim 30 Ensino médio completo
56 50 5 79800 sim 4 Ensino fundamenal completo
57 44 4 11700 sim 24 Ensino médio completo
65 57 5 637 sim 8 Ensino médio completo
66 71 6 406600 sim 5 Superior completo
71 31 2 1019499 sim 3 Ensino médio incompleto
82 71 18 22791 sim 3 Ensino médio completo
85 24 37 3000 sim 9 Superior completo
88 71 2 1000 sim 31 Ensino médio completo
89 46 7 39250 sim 31 Ensino médio completo
91 59 1 6666 sim 9 Ensino fundamenal completo
94 35 1 95458 sim 12 Ensino médio completo
102 60 15 0 sim 33 Superior completo
107 46 8 106000 sim 24 Ensino médio completo
110 68 3 9666 sim 6 Ensino médio completo
113 30 19 208250 sim 1 Ensino médio completo
114 48 2 110500 sim 5 Ensino médio completo
115 20 4 2000 sim 6 Ensino médio completo
116 65 24 1272000 sim 24 não estudou
82
5.1. Avaliação dos peptídeos
Na identificação dos peptídeos, utilizaram-se os pools a fim de encontrar
peptídeos que pudessem se apresentar de forma diferente nas salivas individuais de crianças
com cárie e crianças sem cárie. As amostras de saliva foram separadas em dois diferentes
pools, sendo o pool I representado por amostras de indivíduos com experiência de cárie (ICC)
e o pool II, por amostras de crianças livres de cárie (ISC). Após processadas por meio do LC-
MS, cromatogramas representativos foram obtidos desses dois grupos ilustrando as diferenças
obtidas entre os perfis. (figuras 16 e 17).
Figura 16: Cromatograma representativo do pool com cárie.
Fonte: O autor.
Figura 17: Cromatograma representativo do pool sem cárie.
Fonte: O autor.
83
Os picos 13, 14 e 17 foram mais abundantes em ISC. Os picos 2 e 22
encontraram-se presentes no pool sem cárie, mas virtualmente ausentes em ICC. Os picos 18
e 20 foram abundantes em ICC, porém ausente em ISC. Esses resultados sugeriram a
existência de diferentes padrões de peptídeos nas crianças dependendo da experiência de
cárie.
Levando-se em consideração peptídeos com massas já conhecidas na literatura, foi
feita uma busca nos cromatogramas dos pools a fim de se encontrar peptídeos que
apresentassem alguma diferença em relação à presença/ausência de experiência de cárie.
Peptídeos com massa acima de 3000Da foram pesquisados nos cromatogramas com a massa
de seus íons, obtida através do logaritmo apresentado por Mann, Meng e Fenn (1989). A
partir dessa varredura baseada nas massas por meio do LC-MS, obteve-se uma lista com nove
peptídeos (diferentes massas) que estavam presentes em um pool, mas ausentes em outro: IB-
8b (1471m/z), estaterina (923 m/z e 924 m/z), α-defensina 3 (íons 1744m/z e 1163m/z), α-
defensina HNP1-4 (íon 1722m/z), histatina 3 (íon 1017m/z), β-defensina 1 (íons 1134m/z e
1512m/z), β-defensina 2 (íons 2165m/z, 1444m/z e 1060m/z), β-defensina 3 (íons 2580m/z e
1291m/z) e catelicidina LL-37 (íons 1393m/z e 1499m/z). Baseando-se nos tempos em que
essas massas se apresentaram nos pools, foram identificados os picos nos quais esses
peptídeos, provavelmente, estariam presentes, a partir desta informação foram buscados nas
salivas individuais.
Ao ser aplicado regressão logística do aumento ou da redução da probabilidade de
se ter experiência de cárie frente às variáveis presença/ausência de cada peptídio, idade, sexo
e contagem de EGM (logaritmo natural da contagem de EGM), foi demonstrado que a
presença do peptídio α-defensina 3, íon com massa 1744 m/z (p=0,0183) reduz a chance de se
ter experiência de cárie. Enquanto a presença do peptídio PRP IB-4, com massa 1344 m/z
(p = 0,0261) aumenta a chance de se ter experiência de cárie. Esse modelo logístico binário
demonstrou que idade (p=0,0785), níveis de EGM (p=0,0704) e sexo (p=0,5094) não
demonstraram influência significativa sobre a chance de se ter experiência de cárie (Tabela 7).
84
Tabela 7: Regressão logística da probabilidade de cárie considerando todas as variáveis.
Variáveis
Coeficiente de
regressão
Soma dos
quadrados
Estatística
Wald
Grau de
liberdade
Significância
Exponencial (B)
Idade 0,036 0,021 3,096 1 0,0785 1,037
EGM 0,138 0,076 3,274 1 0,0704 1,148
Sexo -0,388 0,587 0,435 1 0,5094 1,473
PRP IB-8B 0,937 1,421 0,435 1 0,5095 0,392
PRP IB-4 3,663 1,647 4,946 1 0,0261 0,026
Histatina 3 -0,563 0,782 0,518 1 0,4719 1,755
Estaterina (924) 0,174 0,720 0,058 1 0,8095 0,841
Estaterina (925) 21,685 21433,076 0,000 1 0,9992 0,000
α-defensina 3 (1744) -1,878 0,796 5,569 1 0,0183 6,542
α-defensina 3 (1163) 19,419 20504,866 0,000 1 0,9992 0,000
Histatina 3 (1017) -19,969 21433,076 0,000 1 0,9993 470487081,795
α-defensina HNP1-4 (1722) -0,342 0,782 0,191 1 0,6622 1,407
β-defensina 3 (2580) -2,185 1,250 3,058 1 0,0803 8,893
β-defensina 3 (1291) -23,097 40193,043 0,000 1 0,9995 10732689620,741
β-defensina 1 (1134) -21,429 40192,948 0,000 1 0,9996 2024540577,025
β-defensina 1 (1512) 1,254 1,641 0,584 1 0,4447 0,285
β-defensina 2 (1060) -0,535 0,556 0,928 1 0,3354 1,708
β-defensina 2 (2165) 22,760 40193,043 0,000 1 0,9995 0,000
β-defensina 2 (1444) -39,658 28998,259 0,000 1 0,9989 167182993863528000,000
Catelicidina LL37 (1393) 21,220 40192,948 0,000 1 0,9996 0,000
Catelicidina LL37 (1499) -0,114 0,942 0,015 1 0,9038 1,121
A partir dos dados da tabela 7, foram utilizadas as variáveis com significância
menor que 10%, que eram idade, contagem de EGM, sexo, PRP IB-4, α-defensina 3 (1744
m/z) e β-defensina 3 (2580 m/z) para aplicação de regressão logística entre esses parâmetros,
obtendo-se a tabela 8.
Levando-se em consideração somente esses 6 parâmetros na regressão logística
aplicada, foi observado que idade (p=0,020) e contagem de EGM (p=0,036) relacionavam-se
com a presença de cárie, ao contrário do observado em relação a sexo (p=0,074), que não
estava relacionado com cárie. Em se tratando dos peptídeos, a presença de α-defensina 3
(1744 m/z) reduziu a chance de se ter cárie (p=0,019), como visto anteriormente. E, além
disso, a presença da β-defensina 3 (2580 m/z), também, reduziu risco de cárie (p=0,034). Em
contrapartida, a presença do peptídio PRP IB-4 aumentou a chance de se ter a doença
(p=0,035).
85
Tabela 8: Regressão logística da probabilidade de cárie considerando idade, EGM, sexo e os
peptídeos PRP IB-4, α-defensina 3 e β-defensina 3.
Variáveis
Coeficiente de
regressão
Soma dos
quadrados
Estatística Wald
Grau de
liberdade
Significância
Exponencial (B)
Idade 0,041 0,018 5,388 1 0,020 1,042
EGM 0,141 0,067 4,381 1 0,036 1,151
Sexo -0,074 0,474 0,024 1 0,877 1,076
PRP IB-4 2,731 1,295 4,449 1 0,035 0,065
α-defensina 3 (1744) -1,588 0,677 5,499 1 0,019 4,894
β-defensina 3 (2580) -2,451 1,156 4,492 1 0,034 11,600
Relacionando-se presença/ausência de cárie com presença/ausência dos peptídeos
PRP IB-4, α-defensina 3 (1744 m/z) e β-defensina 3 (2580 m/z), os quais tiveram significância
estatística na regressão logística logo acima representada, foi obtida a tabela 9.
Tabela 9: Relação entre presença/ausência de cada peptídio e presença/ausência de cárie de
106 crianças.
Peptídeos Cárie
Ausente Presente Total
PRP IB-4 Ausente 4 (6,8%) 3 (6,2%) 7
Presente 54 (93,2%) 45 ( 93,8) 99
α-defensina 3 (1744) Ausente 39 (67,2%) 42 (87,5%) 81
Presente 19 (32,8%) 6 (12,5%) 25
β-defensina 3 (2580) Ausente 4 (6,8%) 10 (20,8%) 14
Presente 54 (93,2%) 38 (79,2%) 92
Cárie ausente (N=58); cárie presente (N=48)
Utilizando-se dados de ausência/presença de cárie e ausência/presença dos
peptídeos α-defensina 3 (1744 m/z) e β-defensina 3 (2580 m/z), pôde - se verificar que: (1) de
14 crianças que não apresentaram nenhum desses 2 peptídeos, apenas 10 tiveram experiência
de cárie; (2) de 25 crianças que apresentaram esses 2 peptídeos, apenas 6 tiveram experiência
de cárie; e (3) de 67 crianças que apresentaram a β-defensina 3 (2580 m/z) e não apresentaram
a α-defensina 3 (1744 m/z), praticamente a metade (35) não tiveram cárie e a outra metade
(32) tiveram experiência de cárie (Tabela 10). Com esses dados, sugeriu-se que a β-defensina
3 (2580 m/z) sozinha não infuenciou a variável experiência de cárie. Mas a presença da α-
defensina 3 (1744 m/z) juntamente com a β-defensina 3 (2580 m/z) protegeu os indivíduos em
relação à cárie.
86
Tabela 10: Relação entre presença/ausência de cárie e presença/ausência dos peptídeos α-
defensina 3 (1744) e β-defensina 3 (2580).
Cárie β-defensina 3 (2580)
Ausente Presente Total
Ausente α-defensina 3 (1744) Ausente 4 35 39
Presente 0 19 19
Presente α-defensina 3 (1744) Ausente 10 32 42
Presente 0 6 6
Por meio do teste t (Student), foi construído o gráfico tipo box – and – whisker
plot, sendo observado que a α-defensina 3 (1744 m/z) está presente em indivíduos mais velhos
(11 meses a mais do que os que não tem esses peptídio), atuando como proteção à cárie nessas
pessoas (p=0,147) (Gráfico 1).
Gráfico 1 – Representação gráfica da relação tridimensional entre idade, presença/ausência
da α-defensina 3 (1744 m/z) e presença/ausência e cárie.
Cromatogramas representativos, obtidos por meio do espectrômetro de massa, da
presença dos peptídeos PRP IB-4, α-defensina 3 (1744 m/z) e β-defensina 3 (2580 m/z), que
tiveram diferença significante entre amostras de crianças com cárie e sem cárie, segundo a
tabela 8, estão mostrados nas figuras 18, 19 e 20, respectivamente.
Alfa-defensina 3 (1744)
Ausente
Presente
87
Figura 18: Identificação no MS. Peptídeos das proteínas ricas em prolina IB-4 (1343 m/z).
Fonte: O autor.
Figura 19: Identificação no MS. Peptídeos da alfa defensina 3 (íon 1744m/z).
Fonte: O autor.
Figura 20: Identificação no MS. Peptídeos da beta defensina humana 3 (íon 2580m/z).
Fonte: O autor.
Os peptídeos PRP IB-4, α-defensina 3 (1744 m/z) e β-defensina 3 (2580 m/z)
surgiram nos picos correspondentes aos tempos 7,3 minutos, 6,8 minutos e 4,7 minutos,
respectivamente. A figura 21 mostra um cromatograma representativo de uma criança com
experiência de cárie, que possui o pico 7,3, no qual, provavelmente, se encontra o peptídio
PRP IB-4. Em seguida, é demonstrado um cromatograma de criança sem cárie que possui
picos nos tempos correspondentes a 6,8 e 4,7 minutos, onde, possivelmente, encontram-se os
peptídeos α-defensina 3 (1744 m/z) e β-defensina 3 (2580 m/z) (Figura 22).
88
Figura 21: Cromatograma de criança com experiência de cárie, com destaque para o pico no tempo 7,3, no qual
se encontram peptídeos da Proteína Rica em Prolina IB-4.
Fonte: O autor.
Figura 22: Cromatograma de criança sem experiência de cárie, com destaque para os picos nos tempos 4,7 e 6,8,
no qual se encontram peptídeos da β-defensina 3 e α-defensina 3, respectivamente.
Fonte: O autor.
89
6. DISCUSSÃO
Peptídeos de baixo peso molecular encontrados na saliva são formados a partir da
atividade proteolítica ocorrida nesse meio (PERINPANAYAGAM et al., 1995). As proteínas
que dão origem aos peptídeos presentes em saliva total são derivadas principalmente de
secreções das glândulas parótidas, submandibulares, sublinguais e glândulas salivares
menores. Todavia, uma pequena quantidade de proteínas presentes em saliva total origina-se
de microorganismos orais, fluido crevicular, células epiteliais, leucócitos polimorfonucleares
e componentes da dieta (TENOVUO, 1989). Como os componentes salivares podem sofrer
mudanças na presença de doenças orais como a cárie dentária (TENOVUO, 1989), no
presente trabalho, buscou-se encontrar uma possível relação entre peptídeos salivares e a
presença/ausência de experiência de cárie em crianças durante a primeira infância.
No presente estudo, o método utilizado para a caracterização dos peptídeos de
baixo peso molecular foi o LC-MS por ser um dos métodos que têm emergido nessa área de
identificação (LINSCHEID et al., 2009). O equipamento usado identificou peptídeos com até
3000Da. Por esse motivo, os peptídeos que tinham massa entre 3000Da e 5000Da, para serem
identificados, tiveram suas massas aplicadas em um algoritmo conforme sugerido por Mann,
Meng e Fenn (1989) para obtenção das massas dos íons modificados (charges). Durante a
identificação dos peptídeos, no presente trabalho, as diferenças encontradas nos
cromatogramas em relação aos picos sugerem diferentes composições para cada indivíduo,
dependendo da experiência de cárie, estando de acordo com Ayad et al. (2000).
Vários estudos procuraram analisar peptídeos em saliva (AYAD et al., 2000,
KOHYAMA; SHIMOMURA; SANADA, 1984, HUANG et al., 2008, MATHEWS et al.,
1999, MIZUKAWA et al., 1999a, MIZUKAWA et al., 1999b, MURAKAMI et al., 2002,
PERINPANAYAGAM et al., 1995, SAHASRABUDHE et al., 2000, TAO et al., 2005,
VITORINO et al., 2004, VITORINO et al., 2005). Entretanto, poucos trabalhos relacionaram
peptídeos salivares com cárie (AYAD et al, 2000, TAO et al., 2005, VITORINO et al., 2005).
Apenas 2 trabalhos relataram a participação de crianças nesses estudos (KOHYAMA;
SHIMOMURA; SANADA, 1984, TAO et al., 2005)
O primeiro estudo existente na literatura com fracionamento de peptídeos de
baixo peso molecular em saliva de crianças com cárie foi realizado por Kohyama, Shimomura
e Sanada (1984). Nesse estudo, obteve-se saliva total de 48 crianças de 3 a 9 anos de idade,
com experiência de cárie. Utilizou-se o CSI durante o exame clínico. As amostras de saliva
foram purificadas em colunas de Bio Gel P-6 e processadas em aparelho de HPLC. Foram
90
encontrados dois picos diferentes entre os grupos com alto CSI e baixo CSI. Esses picos
tinham peso molecular entre 1500Da e 4000Da e encontravam-se em maior concentração nas
crianças com alto CSI. A faixa etária do grupo de estudo em questão incluiu crianças que
possuíam somente dentição decídua e crianças com dentição mista. Esse fato pode ter levado
a problemas na análise da saliva, tendo em vista que ocorrem mudanças com a idade na
composição da saliva de crianças saudáveis (BEN-ARYEH et al., 1990). Nesse estudo, os
peptídeos não foram caracterizados, sendo encontrado apenas o peso molecular dos picos,
provavelmente por causa da limitação dos equipamentos disponíveis na época.
TAO et al. (2005) também desenvolveram trabalho com crianças, porém a idade
dos participantes se encontrava entre 11 e 15 anos. Os autores procuraram determinar uma
possível relação entre prevalência de cárie e concentrações salivares dos peptídeos hBD-3,
catelicidina LL 37 e α-defensina HNP1-3 . Com este propósito, saliva total foi coletada de
149 crianças e analisada por meio de slot blot. Nos resultados, enquanto os níveis de LL-37 e
hBD-3 não se correlacionaram com experiência de cárie, a média dos níveis de HNP1-3 foi
significantemente maior nas crianças sem cárie do que nas crianças com cárie. Crianças com
altos níveis de cárie não expressaram altas concentrações de SM, portanto, HNP1-3 não foi
correlacionado com SM salivar.
Nenhum trabalho tinha sido realizado até o momento analisando perfil de
peptídeos salivares exclusivamente durante a primeira infância, sendo o presente trabalho
pioneiro nessa faixa etária. Anteriormente, foram executados trabalhos com crianças durante a
primeira infância pelo nosso grupo de pesquisa, mas foram estudados aminoácidos em
crianças saudáveis (FONTELES et al., 2009), aminoácidos em crianças desnutridas (COSTA,
2008) e proteínas em crianças com desnutrição energético-protéica (MOTA, 2008). Dessa
forma, nosso grupo foi pioneiro na exploração de proteínas, aminoácidos e peptídeos nessa
faixa etária. Acredita-se ser este fato devido às grandes dificuldades encontradas durante o
momento de coleta das amostras de saliva, já que essa coleta para a medição de parâmetros
salivares requer uma padronização com o intuito de minimizar a interferência de processos
fisiológicos inerentes (COSTA, 2008). A idade, também, é um fator importante no momento
da coleta já que crianças podem ter um comportamento agitado neste momento, podendo
inclusive chorar, o que torna a saliva desses indivíduos mais turva e com composição
comprovadamente afetada (TENOVUO et al., 1986). Algumas crianças tiveram de ser
excluídas do presente trabalho como forma de controle deste viés.
Anteriormente, outros estudos buscaram pesquisar o perfil de peptídeos na saliva
de adultos. Perinpanayagam et al. (1995) analisaram a saliva de parótida de um indivíduo de
91
25 anos de idade através de filtração por meio de colunas de Bio-Gel P-2, processamento por
meio de HPLC e cararacterização das seqüências de aminoácidos. Através das seqüências
obtidas, concluiu-se que os PAs encontrados provavelmente são derivados da proteólise das
proteínas ricas em prolina, histatinas e estaterinas. Os autores relataram também que como a
saliva da parótida é um líquido que não possui microorganismos, muitos dos PAs fracionados
desta secreção parecem ter-se derivado do processo proteolítico de grandes proteínas. Nesse
estudo, não foi explorada a relação dos peptídeos com a cárie dentária.
Posteriormente, Mizukawa et al. (1999a) utilizaram saliva total para encontrar
alguma relação de PAs com várias doenças orais em um estudo que verificou a presença do
peptídio antimicrobiano HNP-1 (α-defensina 1) em 21 pacientes (22 a 82 anos de idade). A
saliva foi coletada, isolada e purificada por meio de HPLC, o peso molecular do HNP-1 foi
mensurado através do espectrômetro de massa, e a seqüência de aminoácidos foi determinada
por um seqüenciador de proteínas. Os autores obtiveram como resultados que a concentração
de HNP-1 na saliva de pacientes com líquen plano (n=5), leucoplasia (n=4), glossite associada
com deficiência de ferro (n=4) foi 8,3 ± 4,3μg/mL, 13,2 ± 7,9μg/mL e 11,4 ± 4,9μg/mL,
respectivamente. Essas concentrações foram significantemente maiores que aquelas de
sujeitos saudáveis (0,8μg/mL). Em contraste, concentrações salivares de HNP-1 em pacientes
com glossodínia (n=4) e desconforto oral (n=4) foram similares àquelas de indivíduos
saudáveis. No mesmo ano, foi realizado trabalho semelhante por Mizukawa et al. (1999b),
mas em 10 pacientes (28 – 84 anos de idade) com inflamação oral, no qual foi verificado que
a concentração de HNP-1 era significativamente maior em pacientes com inflamação oral do
que em voluntários saudáveis. Ainda foi encontrado nessa população uma forte correlação
positiva entre a concentração de α-defensina-1 salivar e a concentração da proteína C-reativa.
No nosso estudo, foi encontrada α-defensina HNP1-4 (mistura das α-defensinas 1, 2, 3 e 4) no
pool de pacientes com cárie, mas não houve significância estatística quando foram avaliadas
as amostras de salivas individualmente.
Posteriormente, Mattews et al. (1999) analisaram a produção de peptídio derivado
da β-defensina por mucosa oral e glândulas salivares. Nesse estudo, foi caracterizada a
expressão de RNAm de hBD-1 e hBD-2 nas glândulas salivares, na língua, gengiva e mucosa
bucal, e foram detectados peptídeos de β-defensina em secreções salivares. A expressão de
RNAm foi quantificada por ensaios de proteção RNAse, sendo detectado RNAm de hBD-1
em gengiva, glândula parótida, mucosa bucal e língua. Western Blot, cromatografia líquida e
espectrômetro de massa foram utilizados para identificar peptídeos de hBD-1 e hBD-2 em
saliva humana. A expressão de hBD-1 foi constitutiva, enquanto a expressão de hBD-2 foi
92
induzida por IL-1β e LPS. Os autores não relataram relação com cárie. Ayad et al. (2000)
buscaram uma associação dos PAs derivados das PRPs com experiência de cárie. Esse estudo
foi realizado com 18 adultos (50 anos de idade ou mais), sendo 9 livres de cárie e 9 com cárie.
No exame clínico, a cárie foi avaliada através de CPOS. Na análise dos peptídeos, foram
utilizados imunobloting, colunas de Bio-Gel P-2 e P-6 e analisador Aminoquant II.
Identificaram-se 18 peptídeos que pareciam ser produtos de clivagem proteolítica das PRPs
IB-4, IB-5, IB-7, IB-8b e P-B. Os peptídeos mais abundantes no grupo sem cárie diferiu
daqueles isolados do grupo com cárie. O único peptídio relacionado à cárie foi IB-7,
encontrado em maior quantidade na saliva coletada de indivíduos sem cárie. Com os
resultados, os autores puderam afirmar que o processo proteolítico de proteínas da saliva da
parótida diferem entre indivíduos com e sem cárie.
No presente estudo, foi demonstrado que o peptídio PRP IB-4 aumenta a chance
de se ter experiência de cárie. Esses resultados contrastaram com o trabalho de Ayad et al.
(2000), no qual, embora sem significância estatística, foram encontrados peptídeos das
proteínas ricas em prolina IB-4 em pacientes livres de cárie. Essa diferença nos resultados
pode ser justificada pelo pequeno tamanho das inúmeras proteínas ricas em prolina, que são
mais fáceis de serem perdidas durante os passos do processamento como a diálise e a
propensão dessas proteínas de sofrerem clivagem proteolítica pós-translacional. Além disso,
existe o fato de que a amostra estudada no presente estudo é bem mais jovem (10 a 71 meses
de idade) do que a amostra estudada por Ayad et al. (2000) (adultos de 20 anos ou mais). Em
trabalho feito anteriormente por nosso grupo de pesquisa (FONTELES et al., 2009) com
crianças na mesma faixa etária do presente estudo, que teve como objetivo identificar
aminoácidos livres na saliva total de crianças com e sem cárie, relacionando-os à experiência
de cárie e SM na saliva, foi concluído que presença de prolina livre e ausência de glicina livre
estavam relacionadas ao aumento da experiência de cárie. Esses resultados estão de acordo
com o presente estudo, uma vez que a prolina é um aminoácido precursor dos peptídeos ricos
em prolina. Em adição, as proteínas ricas em prolina são inibidores secundários da
precipitação de fosfato de cálcio, inibindo o crescimento de cristais de fosfato de cálcio
precipitado. Essa função resulta em um estado estável, mas supersaturado das secreções
salivares, constituindo um meio ambiente protetor e reparador, importante para manter a
integridade do dente (TENOVUO, 1989). Os nossos resultados, com o peptídio IB-4 sendo
relacionado com aumento da experiência de cárie, sugerem que peptídeos IB-4, precursores
de PRPs em sua forma não ligada a outro peptídio não exerce o papel protetor exercido por
sua forma ligada, que é a proteína rica em prolina.
93
Posteriormente, Sahasrabudhe et al. (2000) delinearam um estudo para detectar a
expressão e localização do peptídio de hBD-1 em glândulas salivares e na saliva. Foram feitas
biópsias de pacientes com mucocele (n=20), havendo a detecção desse peptídio por
imunohistoquímica e expressão localizada em células ductais, e não em células acinares
nessas glândulas. O peptídio estava localizado apicalmente próximo ao lúmen nas células do
ducto. Análise de Western-Blot, também, detectou peptídio de hBD-1 em saliva total,
acidificada, não estimulada de voluntários sadios. Nesse estudo, os peptídeos não foram
relacionados à cárie, como ocorreu no presente trabalho. Uma falha encontrada foi o fato de
que não foi citada a idade dos pacientes, sendo informado apenas que eram adultos.
Murakami et al. (2002), utilizando Western-blot, RT-PCR e imunohistoquímica, encontraram
PAs de catelicidinas em glândulas salivares e saliva de ratos e seres humanos ao examinar a
expressão de RNAm e proteínas em embriões de ratos de 17 dias de gestação, ratos recém-
nascidos com 4 dias e 2 voluntários sadios humanos, cujas idades não foram citadas. No
presente estudo, foram detectadas catelicidinas em saliva de crianças, mas não houve
diferença na expressão destes peptídeos entre crianças com e sem experiência de cárie.
Mais recentemente, Vitorino et al. (2005) utilizaram uma população de 20 adultos
com o objetivo de verificar possível correlação entre composição de peptídeos da saliva e
cáries dentárias. Os indivíduos foram divididos em dois grupos: com cárie e sem cárie, de
acordo com os índices CPOD/CPOS. A análise foi feita utilizando-se HPLC-MS, extração
sequencial com 6M de guanidina seguida por trifluoroacetato, e, da mesma forma que no
presente trabalho, a identificação dos peptídeos foi baseada em pesos moleculares teóricos
disponíveis em bancos de dados na Internet. Os autores tiveram como resultado uma forte
correlação entre ausência de cárie e grandes quantidades de PRP 1-3, histatina 1 e estaterina;
mostrando, dessa forma, a importância desses peptídeos na manutenção da integridade do
dente. Nesse estudo, não foi feita contagem de EGM. Embora a metodologia utilizada por
esses autores assemelhe-se aos procedimentos metodológicos da presente pesquisa, os
peptídeos detectados e relacionados à experiência de cárie no estudo de Vitorino et al. (2005)
diferiram daqueles encontrados em nossos resultados, onde relacionamos presença de α-
defensina 3 e β-defensina 3 com redução da experiência de cárie, e PRP IB4 com o aumento
dessa variável. Provavelmente essa diferença nos tipos de peptídios encontrados pode ser
justificada pela diferença na idade da população dos dois estudo, podendo, nas crianças
durante a primeira infância, prevalecer tipos diferentes de peptídios em relação aos adultos.
Em relação às defensinas, foi encontrado no presente trabalho que β-defensina 3
sozinha não influencia na ausência/presença de cárie, mas a presença da α-defensina 3
94
juntamente com a β-defensina 3 protege os indivíduos em relação à cárie. Esses resultados
estão de acordo com o trabalho de Tao et al. (2005), no qual embora não tenha sido avaliada a
presença simultânea desses dois peptídeos, os autores encontraram que níveis de α-defensina
1-3 (uma mistura de α-defensina 1, 2 e 3) são significantemente maiores em crianças com
cáries do que em crianças sem cáries. Além disso, no mesmo trabalho, não foi encontrada
relação da β-defensina 3 sozinha com experiência de cárie. A falta de um maior número de
estudos que corroborem com esses achados pode ser explicada pelo fato de que pouca atenção
tem sido dada ao papel das defensinas na imunidade inata da cavidade oral (DUNSCHE et al.,
2002). A relação encontrada no presente trabalho se deve, possivelmente, ao fato de que as
defensinas em geral têm ação contra bactérias gram positivas e gram negativas (JOLY et al.,
2004; HARDER et al., 2001). Embora tenha sido comprovado in vitro o efeito da β-defensina
contra EGM (OUHARA et al., 2005), e especificamente da β-defensina 3 contra EGM
(MAISETTA et al., 2003), provavelmente esse efeito é potencializado quando da existência
simultânea deste peptídio com a α-defensina. Inclusive, Maisetta et al. (2003) fizeram um
trabalho para avaliar a ação do peptídio β-defensina 3 isolado e combinado com outros
agentes antimicrobianos. Nesse estudo, os autores relataram atividade antibacteriana
aumentada deste peptídio quando associado a outros agentes antimicrobianos como lizosima,
metronidazol, amoxicilina e clorexidina.
As defensinas fazem parte de uma família de pequenos peptídeos ricos em
arginina (LEHRER, GANZ, SELSTED, 1991). VanWuyckuyse et al. (1995), ao analisarem
aminoácidos em saliva de parótida de indivíduos com e sem cárie (20 adultos livres de cárie,
19 adultos e 17 crianças de 10 a 14 anos com cárie), reportaram uma tendência a um maior
nível de glutamina, histidina, arginina e lisina nos grupos de adultos e crianças livres de cárie.
Entretanto, a alta significância estatística ao comparar as concentrações desses aminoácidos
em cada grupo só foi verificada para os aminoácidos arginina e lisina. Foi sugerido pelos
autores que a maior disponibilidade desses aminoácidos em indivíduos sem cárie viabilizaria
uma produção aumentada de poliaminas como putrescina e cadaverina, levando à síntese de
NH4+, aumentando o pH da placa nestes indivíduos, tornando-os menos susceptíveis à cárie
dentária. Nossos resultados estão de acordo com este estudo de VanWuyckuyse et al. (1995),
ao mostrar que as defensinas (α-defensina 3 juntamente com a β-defensina 3) possuem a
mesma propriedade de proteção contra as cáries, apresentada pelo seu aminoácido constituinte
arginina.
O presente trabalho foi baseado em critérios adaptados da Academia Americana
de Odontologia Pediátrica (2009), onde manchas brancas na primeira infância foram
95
computadas no cálculo do número de dentes cariados, perdidos ou obturados devido à cárie.
Afinal, ao longo dos tempos, o conhecimento relacionado à cárie dentária teve grandes
mudanças, tendo-se atualmente uma compreensão bem diferente da doença, seus critérios
diagnósticos e fatores de risco. Estatisticamente, investigaram-se-se, em conjunto, as variáveis
capazes de influenciar risco à cárie dentária: idade, sexo, contagem de SM e presença de cada
peptídio identificado por meio de regressão logística. Essa abordagem estatística,
possivelmente, permite uma melhor avaliação da capacidade de cada variável em aumentar ou
reduzir a probabilidade ao desenvolvimento da cárie. Sendo a cárie uma doença que sofre
influência de múltiplos fatores, não podemos atribuir a um fator isolado o poder de alterar o
risco à doença (COSTA, 2008).
No presente trabalho, a contagem de EGM foi utilizada como forma de medir o
risco de cárie da população estudada, já que EGM são considerados os principais fatores
etiológicos para as cáries, e seus níveis salivares podem ser utilizados como preditores do
risco de cárie (ALALUUSHUA et al., 1996, BERKOWITZ; JORDAN; WHITE, 1975),
embora o uso dos EGM como um fator isolado é um dado controverso de risco à cárie, já que
a cárie é uma doença de natureza multifatorial (KEYES; JORDAN, 1963). Nossos resultados
estão de acordo com Tao et al. (1995) em relação a menores níveis de EGM em crianças com
cárie. Esse fato pode ser explicado por um reflexo do aumento da aderência da bactéria à
superfície dentária ou devido à presença de espécies mais aderentes e/ou mais cariogênicas
(RUDNEY; STAIKOV, 2002). Idade foi significantemente correlacionada com experiência
de cárie de forma diretamente proporcional, concordando com o estudo de Fujiwara et al.
(1991), que realizaram estudo com 356 crianças de 0 a 2 anos de idade. EGM foram
encontrados em somente 7,3% na população com idade maior ou igual a 6 meses e menor que
1 ano. Aumentando a proporção para 29,7% na idade maior ou igual a 1 ano e 6 meses e
menor que 2 anos; e para 43,4% na população com faixa etária maior ou igual a 2 anos e
menor que 2 anos e 6 meses.
Outros fatores avaliados em praticamente metade da população desse estudo
foram amamentação e nível de escolaridade dos pais já que há uma relação desses fatores com
a cárie da primeira infância (RAMOS-GOMEZ et al., 2002; TINANOFF; SULLIVAN,
1997). Segundo Tinanoff e Sullivan (1997), nas crianças, a cárie pode estar relacionada com
inapropriados hábitos de amamentação. Hallonsten et al. (1995) verificaram que a média de
ceo-s (número de superfícies dentárias cariadas, extraídas devido à cárie ou obturadas na
dentição decídua) era de 5,3 em grupo de crianças com cárie que tomavam mamadeira, sendo
de 4,9 no grupo de crianças com cárie, mas que não tinham o hábito de tomar mamadeira.
96
Contrastando com esses resultados, Ramos-Gomez et al. (2002), objetivando buscar uma
associação entre fatores bacterianos, comportamentais e ambientais com a CPI em população
de crianças espanholas e afro-americanas com menos de 60 meses de idade, verificaram que
não havia diferença estatisticamente significante na dieta, nos padrões de amamentação, no
nível de educação dos pais, na renda familar e em relação ao país de origem em crianças com
e sem cárie. Foi encontrada relação significante entre CPI e perda de seguro dental da criança.
Indivíduos infantis sem seguro dental encontravam-se duas vezes mais propícios a terem CPI
do que crianças com seguro (público ou privado).
Existem fatores específicos relacionados à CPI. Os dentes decíduos, neste tipo de
cárie, assumem uma significância especial porque a progressão das lesões para o interior da
dentina é rápida devido à fina espessura do esmalte nos incisivos decíduos (~0,5mm
comparado a mais de 1mm em incisivos permanentes) (RIPA, 1988). Em relação à
amamentação, durante a sucção, o bico do peito ou da mamadeira é colocado contra o palato,
momento em que a língua é estendida sobre os incisivos inferiores; dessa forma, o leite
materno ou proveniente de mamadeira entra em contato com todos os dentes, com exceção
dos incisivos inferiores que estão fisicamente protegidos pela língua (RIPA, 1988). Este
último leva ao padrão comumente encontrado na CPI, caracterizado por um quadro onde os 4
incisivos superiores são mais afetados, enquanto os 4 incisivos inferiores permanecem hígidos
(MC DONALD et al., 2005). As cáries anteriores dos indivíduos do presente estudo seguiam
esse padrão de maior ocorrência nos incisivos superiores.
No presente estudo, vários parâmetros foram avaliados em relação à experiência
de cárie. Os resultados encontrados com relação aos peptídeos e demais fatores estiveram de
acordo com a literatura. Vários peptídeos foram encontrados, baseando-se naqueles
previamente existentes em bancos de dados, mas apenas 3 foram significantemente
correlacionados com experiência de cárie. Devido ao pioneirismo desse trabalho, em que
foram avaliados vários fatores de risco à cárie, incluindo peptídeos salivares de baixo peso
molecular, na faixa etária concernente à primeira infância, há a necessidade de estudos
aprofundados para verificar a associação de outros peptídeos com experiência de cárie nessa
faixa etária e, possivelmente, descobrir peptídeos que ainda não foram seqüenciados, os quais,
provavelmente, podem exercer papel fundamental no universo multifatorial da cárie dentária.
97
7. CONCLUSÕES
A partir dos resultados obtidos, pôde-se concluir que:
1. Grande quantidade de peptídeos de baixo peso molecular foi encontrada em
saliva total humana durante a primeira infância;
2. Houve diferença no perfil de peptídeos da saliva total de crianças com e sem
cárie da primeira infância;
3. Na presente amostra, os peptídeos PRP IB-4, α-defensina 3 e β-defensina 3
relacionaram-se com experiência de cárie, sendo o primeiro com aumento do
risco e os dois últimos com proteção à cárie;
4. O peptídio α-defensina 3 encontra-se presente em crianças de maior idade (11
meses a mais) e atua como proteção à cárie nessas pessoas;
5. Os EGM e a idade foram relacionados positivamente à experiência de cárie, ao
contrário do que foi observado com o sexo.
98
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114
APÊNDICES
115
APÊNDICE A : Termo de Consentimento Livre Esclarecido
“ESTUDO DO PERFIL DE PEPTÍDIOS SALIVARES DE CRIANÇAS COM
CÁRIE DA PRIMEIRA INFÂNCIA. UMA VISÃO DA SALIVA COMO MEIO
DIAGNÓSTICO”
Seu filho ou filha está sendo convidado a participar de um projeto de pesquisa. Sua
participação é importante, porém, ele(a) não deve participar contra vontade própria ou contra
a sua vontade. Leia com atenção as informações abaixo, sentindo-se livre para fazer qualquer
pergunta que desejar, para que não haja dúvida alguma sobre os procedimentos a serem
realizados.
Ao assinar este termo que consta de seu nome, nome de seu filho ou filha, idade, e
número do prontuário, você estará declarando que por meio de livre e espontânea vontade sua
e de seu filho ou filha, ele(a) estará participando como voluntário do projeto de pesquisa
citado acima, de responsabilidade da Cirurgiã-Dentista Thyciana Rodrigues Ribeiro da
Faculdade de Odontologia, da Universidade Federal do Ceará. O abaixo-assinado estará ciente
que:
a) O objetivo da pesquisa é verificar se existe alguma diferença entre a saliva de uma
criança com cárie e a de outra sem cárie.
b) Durante o estudo você deverá fornecer informação sobre o estado geral de saúde
do seu filho ou filha.
c) A participação neste estudo consistirá de um exame dentário de seu filho ou filha
para verificar os dentes presentes na boca e o tipo de cárie que ele (a) possa ter, e
da coleta de saliva.
d) Nem a coleta de saliva, nem o exame ocasionarão DOR ao seu filho ou filha.
e) Duas amostras de saliva serão colhidas conforme segue:
Na primeira amostra, haverá coleta da saliva já presente na boca do seu filho
ou filha com o uso de uma pequena cânula (semelhante a um pequeno pedaço
de borracha), enquanto se encontra em repouso no seu colo.
Na segunda amostra, seu filho ou filha terá que chupar um pequeno pedaço de
parafina por um minuto, e o mesmo se encontrará ligada a um pedaço de fio
dental, para evitar que o seu filho ou filha engula o material. Após decorrido o
tempo o mesmo será retirado da boca e a saliva será colocada em um pequeno
frasco.
116
Para que seja feita a coleta é preciso que seu filho ou filha, esteja em jejum por
no mínimo 3 horas, e que tenha escovado os dentes uma hora antes da consulta.
f) Seu filho ou filha NÃO RECEBERÁ INJEÇÃO de anestésico local.
g) Essa saliva após recolhida será analisada para que se possa verificar o tipo de
peptídio, anticorpo e bactéria presente.
h) Você tem a liberdade de desistir ou interromper a participação do seu filho ou filha
neste estudo no momento que desejar, sem necessidade de qualquer explicação.
i) A participação neste estudo lhe dá o direito do seu filho ou filha ter, sem custos,
profilaxia (limpeza dos dentes) e aplicação tópica de flúor para a prevenção,
evitando novas cáries.
j) Os resultados obtidos durante este estudo serão mantidos em sigilo. Não haverá
identificação por ocasião da exposição e/ou publicação dos mesmos.
k) É condição indispensável para participação no estudo que seu filho ou filha não
tenha nenhuma doença crônica e, portanto, não esteja no momento sob tratamento
médico ou fazendo uso crônico de drogas ou medicações.
l) O surgimento de resfriados ou viroses, com conseqüente uso de medicações por
período de tempo limitado, não exclui seu filho ou filha do estudo.
m) Caso venham a surgir dúvidas ou perguntas, sinta-se livre para contactar a
Cirurgiã-Dentista. Thyciana Rodrigues Ribeiro (responsável pelo projeto) na
Faculdade de Odontologia (sala 1), rua Monsenhor Furtado, s/n, Rodolfo Teófilo
ou nos telefone 3366 8408 / 9974 6688. Pode-se ainda contactar o Comitê de Ética
em Pesquisa da Universidade Federal do Ceará no telefone 3366 8338.
Fortaleza, ________________________
______________________________
Assinatura do pai ou responsável
Impressão digital do pai ou responsável, caso não assine
_________________________________________
Assinatura da testemunha
_________________________________________
Thyciana Rodrigues Ribeiro
Pesquisadora Responsável
117
APÊNDICE B: Ficha de Anamnese
DADOS PESSOAIS
NOME _________________________________________________________________
IDADE _______ DATA DE NASCIMENTO _______________________________
NOME DO PAI __________________________________________________________
NOME DA MÃE _________________________________________________________
RESPONSÁVEL LEGAL __________________________________________________
ENDEREÇO _____________________________________________________________
TELEFONE PARA CONTATO ______________________________________________
NOME DA ESCOLA ______________________________________________________
ENDEREÇO DA ESCOLA __________________________________________________
ESTADO DE SAÚDE GERAL DA CRIANÇA
FAVOR LER E RESPONDER COM ATENÇÃO.
1) O seu filho ou filha se encontra sob tratamento médico? SIM NÃO
Para que? Caso a sua resposta tenha sido SIM.______________________________
2) O seu filho ou filha tem alguma doença crônica? SIM NÃO
Qual? Caso a sua resposta tenha sido SIM. _________________________________
3) O seu filho ou filha está tomando algum remédio? SIM NÃO
Quais? Caso a sua resposta tenha sido SIM. ________________________________
4) O seu filho ou filha tem algum tipo de alergia? SIM NÃO
A que? Caso a sua resposta tenha sido SIM. ________________________________
5) O seu filho ou filha esteve recentemente hospitalizado? SIM NÃO
Para que? Caso a sua resposta tenha sido SIM. ______________________________
Afirmo que as informações acima são verdadeiras.
Data:__________________
Assinatura:____________________________________________
118
APÊNDICE C: Ficha de exame dentário
FICHA DE EXAME DENTÁRIO
NOME DA CRIANÇA ___________________________________________________
IDADE _______ DATA DE NASCIMENTO ________________________
DATA _____________________
EXAME EXTRA-ORAL
LINFADENOPATIA: PRESENTE AUSENTE
ASSIMETRIA FACIAL POR INFECÇÃO: PRESENTE AUSENTE
EXAME INTRA-ORAL
TECIDOS MOLES: NORMAIS PATOLÓGICOS
EXAME DENTÁRIO
55 54 53 52 51 61 62 63 64 65
85 84 83 82 81 71 72 73 74 75
Cor vermelha – corresponde a superfícies cariadas
Cor azul – corresponde a superfícies restauradas
X – corresponde a superfícies ausentes devido à cárie
COMENTÁRIOS:
__________________________________________________________
119
ANEXO
120
ANEXO: Aprovação do comitê de ética
