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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
MESTRADO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
JULIO CESAR SANTANA ALVES
INFLUÊNCIA DE HORMÔNIOS GONADAIS NO EIXO
[ECA2/ANG(1-7)/Mas] ENCEFÁLICO PARA O
CONTROLE DA SEDE E APETITE POR SÓDIO EM
RATOS
ARACAJU
2013
JULIO CESAR SANTANA ALVES
INFLUÊNCIA DE HORMÔNIOS GONADAIS NO
EIXO [ECA2/ANG(1-7)/Mas] ENCEFÁLICO PARA O
CONTROLE DA SEDE E APETITE POR SÓDIO EM
RATOS
Dissertação apresentada ao Núcleo de Pós-
Graduação em Medicina da Universidade
Federal de Sergipe como requisito parcial à
obtenção do grau de Mestre em Ciências da
Saúde.
Orientador: Prof. Dr. Daniel Badauê Passos Júnior
ARACAJU
2013
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
A
474i
Alves, Julio Cesar Santana
Influência de hormônios gonadais no eixo [ECA2/ANG(1-7)/Mas] encefálico para o controle
da sede e apetite por sódio em ratos / Julio Cesar Santana Alves – Aracaju, 2013.
74 f. : il.
Orientador: Prof. Dr. Daniel Badauê Passos Júnior.
Dissertação (mestrado em Ciências da Saúde) – Universidade Federal de Sergipe, 2013.
1. Fisiologia endócrina. 2. Hormônios gonadais. 3. Enzima conversora da angiotensina. 4.
Sede. I. Passos Junior, Daniel Badauê, orient. II. Título.
CDU 612.459:612.39
JULIO CESAR SANTANA ALVES
INFLUÊNCIA DE HORMÔNIOS GONADAIS NO
EIXO [ECA2/ANG(1-7)/Mas] ENCEFÁLICO PARA
O CONTROLE DA SEDE E APETITE POR SÓDIO
EM RATOS
Dissertação apresentada ao Núcleo de Pós-
Graduação em Medicina da Universidade
Federal de Sergipe como requisito parcial à
obtenção do grau de Mestre em Ciências da
Saúde.
Aprovado em: ____/_____/____
__________________________________________________
1º Examinador: Prof. Dr. DANIEL BADAUÊ PASSOS JÚNIOR
__________________________________________________
2º Examinador: Prof. Dr. LUIS CARLOS REIS
__________________________________________________
3° Examinador: Profa.Dra. VIRGÍNIA MARA PEREIRA
PARECER
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho a minha esposa e aos
meus filhos como forma de retribuição ao
amor e a paciência com que suportaram as
etapas desta dissertação até este momento.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente, agradeço aos meus pais, José Augusto e Maria Helena que
sempre acreditaram que eu poderia chegar muito além dos meus limites. Obrigado pelo
incentivo e a afetividade com a qual pude contar durante toda a minha vida. Se hoje
galguei este degrau foi pela força e garra que vocês me ensinaram a ter.
Não poderia deixar de agradecer também a minhas irmãs, Cinthia e Laura por
brigar comigo sempre que falava em desistir, me fazendo acreditar em meu sonho acima
de qualquer dificuldade. Lau obrigado por plantar uma pequena semente de esperança
de que poderia seguir esta carreira tão bela que não é fácil, mas que possui seus
encantos. AMO VOCÊS.
A minha esposa, Franklane por suportar as minhas intempéries no decorrer desta
dissertação e principalmente a minha ausência em momentos importantes da nossa
família, sei que não foi nada fácil para você minha querida, TE AMO MUITO.
Aos meus filhos, Julia e Caio que no decorrer deste trabalho não permitiram que
a tristeza pudesse me envolver. PAPAI AMA MUITO VOCÊS!
À família LANBAC, Saulo, Laís, Marilia, Iura, Cibelle, Edênia, Demétrius,
Danielle e Cristiano Gaujac, Patrícia e Camilla pelo apoio científico e emocional
constante em que se dedicaram e se preocuparam para que o trabalho fosse cumprido da
melhor forma possível. Em especial, abro um parêntese para agradecer a Iura Gonzales
por compartilhar seus conhecimentos em estatística e ouvir pacientemente minhas
angústias, transmitindo serenidade. MUITO OBRIGADO!
À todos que fazem o Laboratório de Biologia Celular (LBCE), professor
Waldecy de Lucca Junior, aos alunos de mestrado e iniciação científica, em especial,
Rodrigo, Ramon, Elis, Renan e outros. MUITO OBRIGADO!
À equipe do LAFAC (Laboratório de Farmacologia Cardiovascular) pela
gentileza em atender a demanda por espaço para realização das cirurgias. OBRIGADO.
Agradeço também ao Prof. Dr. Robson Augusto Souza dos Santos, do
Departamento de Fisiologia e Biofísica da UFMG, pelas drogas gentilmente cedidas
para a realização deste estudo.
Não poderia deixar de agradecer aos docentes, discentes e funcionários do
Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da UFS, pela enorme contribuição
dada a minha formação de mestre.
Gostaria de agradecer ainda ao CNPq e a FAPITEC/SE pelo suporte financeiro
dado a este projeto, e a Universidade Federal de Sergipe pela infraestrutura oferecida
para a realização deste trabalho.
Devo aqui registrar o meu reconhecimento à importância do uso de animais para
experimentação, permitindo o avanço do conhecimento nas ciências biológicas e da
saúde, e assim, salvando muitas vidas, humanas e animais. Claro, reconheço, sobretudo,
a importância dos animais utilizados neste estudo, que, adicionalmente, contribuiram
para minha formação científica.
Por fim, não poderia deixar de agradecer ao meu orientador, professor Daniel
Badauê Passos Júnior por acreditar em minha capacidade para desenvolver este
fascinante projeto de pesquisa onde aprendi que não podemos desanimar na primeira
dificuldade. MUITO OBRIGADO pela oportunidade e a honra de ser orientado durante
esses anos. Professor, hoje termino essa etapa com a certeza de que posso vencer
qualquer desafio acreditando em minha capacidade, com comprometimento e
dedicação. Obrigado mais uma vez por tudo o que aprendi com o senhor, jamais poderei
esquecer das palavras de incentivo e críticas que sempre me ajudaram a querer fazer
sempre o melhor.
RESUMO
INFLUÊNCIA DE HORMÔNIOS GONADAIS NO EIXO [ECA2/ANG(1-7)/Mas]
ENCEFÁLICO PARA O CONTROLE DA SEDE E APETITE POR SÓDIO EM RATOS,
Julio Cesar Santana Alves, Universidade Federal de Sergipe, 2013.
Os comportamentos de ingestão de sódio e água constituem importantes componentes
regulatórios do equilíbrio hidroeletrolítico. Neste contexto, o organismo humano regula seu
déficit hidromineral através de uma resposta neuroimunoendócrina e comportamental
comandada majoritariamente pelo sistema nervoso central (SNC). Reconhecidamente, os
hormônios gonadais representam importantes fatores moduladores dos comportamentos
ingestivos. O presente estudo objetivou estudar a influência dos hormônios gonadais
masculinos e femininos no eixo ECA2/ANG(1-7)/Mas sobre o controle da ingestão de água e
NaCl 0,3 M em ratos e ratas. Neste experimento, fêmeas ovariectomizadas foram tratadas
com benzoato de estradiol (20µg/animal/dia, s.c.; OVXE), ou com veículo (óleo de girassol;
OVXV). Machos foram submetidos à orquiectomia bilateral (ORQX) ou cirurgia fictícia
(SHAM). Por meio de cirurgia estereotáxica, cânulas-guia foram implantadas no ventrículo
lateral direito para administração intracerebroventricular (icv) das drogas utilizadas. Foram
utilizados o ativador da enzima conversora de angiotensina tipo 2 (ECA2), DIZE (Aceturato
de Diminazeno, 40 nmol / 2 µL, i.c.v.) ou o antagonista do receptor Mas de ANG (1-7), o D-
Ala7-ANG(1-7) (A779, 10 nmol / 2 µL, i.c.v.). O veículo para ambas as drogas foi líquido
cerebro-espinhal artificial (LCEa), administrado nos animais controle em igual volume. Para
indução da sede e apetite por sódio, os animais foram submetidos a depleção hidrossalina por
administração de um diurético de alça (furosemida, 20 mg / kg, s.c.) e acesso à água destilada
e dieta pobre em sódio (fubá de milho) por 24 horas. Após a microinjeção das drogas, água e
de NaCl 0,3 M foram reapresentados e registrados os volumes ingeridos nos tempos 15, 30,
60, 90, 120, 180, 240 min e 24 h. Foram realizadas análises de variância de duas vias seguidas
do pós-teste de Bonferroni, quando necessário. O nível de significância foi de p < 0,05. Os
dados demonstraram que, em fêmeas tratadas com DIZE ou veículo, a ingestão de água, NaCl
0,3 M e o índice de preferência ao sódio (IPS) não diferiram entre os grupos. Porém, fêmeas
OVXV ingeriram menos água quando comparadas às femeas OVXE, quando ambas foram
tratadas com A779 (p < 0,05). Vinte e quatro horas após a reapresentação de fluidos, a
ingestão de NaCl 0,3 M foi maior em ratas OVXV que nas OVXE, quando ambas receberam
A779 (p < 0,05). No mesmo sentido, ratas OVXV apresentaram maior preferência por sódio
que as OVXE, ambas tratadas com A779. Machos ORQX microinjetados com LCEa
ingeriram mais água quando comparados aos animais do grupo SHAM+LCEa. Todavia, aos
30 min, os machos SHAM+DIZE apresentaram maior ingestão de água quando comparado ao
seu respectivo controle. Até 15 min após a reapresentação de fluidos, a ingestão de NaCl 0,3
M em ratos ORQX foi menor em comparação aos ratos SHAM independente do tratamento
com DIZE (p<0,05), o IPS não diferiu entre os grupos. Os dados referentes a ingestão de água
e ao IPS em machos submetidos ao tratamento icv com A779, revelam não haver diferença
entre os grupos estudados, porém para ingestão de NaCl 0,3 M, os ratos ORQX+A779
demonstraram menor ingestão quando comparados aos animais ORQX+LCEa (p<0,05) nos
tempos 30, 60, 90, 120, 180 e 240 min. Assim, podemos concluir que o estrógeno parece
exercer influencia inibitória na ingestão de sódio independente da atividade do eixo
ECA2/ANG(1-7)/Mas. Por outro lado, os hormônios gonadais masculinos atuam elevando a
ingestão hidrossalina para a regulação do eixo no protocolo proposto.
Palavras-chave: sede, apetite por sódio, hormônios gonadais, ECA2, Mas.
ABSTRACT
INFLUENCE OF GONADAL HORMONES IN THE CEREBRAL ACE2/ANG(1-7)/Mas
AXIS FOR THE CONTROL OF THIRST AND SODIUM APPETITE IN RATS, Julio Cesar
Santana Alves, Federal University of Sergipe, 2013.
Sodium and water intake are important regulatory components of the hidromineral balance. In
this context, human body regulates hidromineral imbalance through the neuro-immune-
endocrine and behavioral response. Gonadal hormones are important players for the
modulation of ingestive behaviors. The present study aimed to investigate the influence of
male and female gonadal hormones in cerebral ECA2/ANG-(1-7)/Mas axis over the control of
water sodium intake in rats. In this experiment, ovariectomized female rats were treated with
estradiol benzoate (20μg/animal/day, sc; OVXE) or vehicle (sunflower oil; OVXV). Male rats
underwent bilateral orchiectomy (ORQX) or sham surgery (SHAM). Guide cannulae were
implanted into the right lateral ventricle for intracerebroventricular administration (icv) of
drugs. We used angiotensin-converting enzyme type 2 (ACE2) activator, DIZE (diminazene
of aceturate, 40 nmol / 2µl , icv ) or the antagonist of Ang-(1-7) Mas recetor, D-Ala7-ANG-
(1-7) (A779, 10 nmol / 2µl, icv). The vehicle for both drugs was artificial cerebrospinal fluid
(aCFS) administered in the same volume. For induction of thirst and sodium appetite, animals
were subjected to hydrossaline depletion by administration of furosemide (20 mg / kg, sc) and
access to distilled water and low sodium diet (corn ) for 24 hours. After microinjection of
drugs, water and 0.3 M NaCl were reoffered and the ingested volume were recorded at the
following 15, 30 , 60, 90 , 120, 180, 240 min and 24 h. Two-way analysis of variance was
performed, followed by Bonferroni posthoc test when appropriate. The level of significance
was p < 0.05. In females treated with vehicle or DIZE, sodium and water intake, as well as
sodium preference index (SPI) did not differ between groups. However, OVXV ingested less
water than OVXE when both were treated with A779 (p < 0.05). Twenty-four hours after
reintroduction of fluids intake sodium ingestions was higher in OVXV than in OVXE when
both received A779 (p<0.05). Similarly, OVXV rats showed greater preference for sodium
when compared to OVXE, if both received icv injection of A779. Males ORQX microinjected
with aCFS ingested more water than SHAM+aCSF. However, at 30 min, SHAM+DIZE male
rats presented higher water intake when compared to their respective control. Up to 15 min
after reintroduction of fluids, ORQX rats ingested less sodium than SHAM rats, regardless
DIZE administration (p < 0.05). Water intake as well as SPI did not differ between groups in
males undergoing A779 administrarion. However sodium intake was lower in ORQX+A779
than in ORQX+aCFS (p < 0.05) at 30, 60 , 90, 120 , 180 and 240 min after fluid presentation.
Thus, we conclude that estrogen seems to exert inhibitory influences on sodium intake
independent ECA2/ANG (1-7)/Mas activity. On the other hand, the male gonadal hormones
act by raising intake for the regulation of salt intake shaft in the proposed protocol.
Keywords: thirst, sodium appetite, gonadal hormones, ACE2, Mas.
LISTA DE TABELAS E FIGURAS
Figura 1. Diagrama esquemático demonstrando cascata enzimática do Sistema Renina-
Angiotensina (SRA) e demais endopeptidases. ___________________________________ 24
Figura 2. Cirurgia de ovariectomia em ratas. ____________________________________ 32
Figura 3. Microscopia demonstrando fases do ciclo estral.__________________________ 33
Figura 4. Cirurgia de Orquiectomia em machos. _________________________________ 34
Figura 5. Cirurgia de estereotaxia. ____________________________________________ 36
Figura 6. Figura mostrando área de injeção ventricular no encéfalo de ratos (as). ________ 36
Figura 7. Efeito da ovariectomia no índice uterino de ratas castradas sem (OVXV) e com
(OVXE) reposição estrogênica. _______________________________________________ 40
Figura 8. Efeito da orquiectomia no Índice prostático e vesículas seminais (IPVS) em ratos 40
Figura 9. Efeito do DIZE (40 nmol/2μL.) na ingestão cumulativa de água em fêmeas sem
(OVXV) e com (OVXE) reposição hormonal. ____________________________________ 42
Figura 10. Efeito do DIZE (40nmol/2μL.) na ingestão cumulativa de NaCl 0,3M em fêmeas
sem (OVXV) e com (OVXE) reposição hormonal. ________________________________ 43
Figura 11. Efeito do DIZE (40 nmol/2μL) no índice de preferência ao sódio (IPS) em fêmeas
ovariectomizadas com (OVXE) e sem (OVXV) reposição hormonal após ingestão induzida.44
Figura 12. Efeito do A779 (10 nmol/2μL.) na ingestão cumulativa de água em fêmeas sem
(OVXV) e com (OVXE) reposição hormonal. ____________________________________ 46
Figura 13. Efeito do A779 (10 nmol/2μL.) na ingestão cumulativa de sódio em fêmeas sem
(OVXV) e com (OVXE) reposição hormonal. ____________________________________ 47
Figura 14. . Efeito do A779 (10 nmol/2μL.) no índice de preferência ao sódio (IPS) em
fêmeas sem (OVXV) e com (OVXE) reposição hormonal. __________________________ 49
Figura 15. Efeito do DIZE (40 nmol/2μL) na ingestão cumulativa de água em machos com
cirurgia fictícia (SHAM) e orquiectomizados (ORQX). ____________________________ 51
Figura 16. Efeito do DIZE (40 nmol/2μL) na ingestão cumulativa de NaCl 0,3M em machos
com cirurgia fictícia (SHAM) e orquiectomizados (ORQX). ________________________ 52
Figura 17. Efeito do DIZE (40 nmol/2μL) no índice de preferência ao sódio (IPS) em machos
com cirurgia fictícia (SHAM) e orquiectomizados (ORQX). ________________________ 53
Figura 18. . Efeito do A779 (10 nmol/2μL) na ingestão cumulativa de água em machos com
cirurgia fictícia (SHAM) e orquiectomizados (ORQX). ____________________________ 55
Figura 19. Efeito do A779 (10 nmol/2μL) na ingestão cumulativa de sódio em machos com
cirurgia fictícia (SHAM) e orquiectomizados (ORQX). ____________________________ 56
Figura 20. Índice de Preferência ao Sódio em machos com cirurgia fictícia (SHAM) e
orquiectomizados (ORQX) microinjetados com A779 ou LCEa. _____________________ 57
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
A779 – D-Ala7 ANG(1-7)
ACTH – Hormônio Adrenocorticotrópico
AGT – Angiotensinogênio
ANG (1-7) – Angiotensina (1-7)
ANG I – Angiotensina I
ANG II – Angiotensina II
AP – Área Postrema
APO – Área Pré-óptica
AT1 – Receptor de ANG II tipo 1
AT2 - Receptor de ANG II tipo 2
AV3V – Parede Antero-ventral do terceiro ventrículo
BHE – Barreira Hematoencefálica
BVLR – Bulbo ventrolateral rostral
CEPA – Comitê de Ética e Pesquisa com Animais
DIZE – Aceturato de Diminazeno
E2 – Estrógeno
ECA – Enzima Conversora de Angiotensina
ECA2 – Enzima Conversora de Angiotensina tipo 2
EM – Eminência Mediana
FEC – Fluido Extracelular
FIC – Fluido Intracelular
HAD - Hormônio Antidiurético
IPS – Índice de Preferência ao Sódio
IPVS – Índice de Próstata e Vesiculas Seminais
LANBAC – Laboratório de Neuroendocrinologia Básica
LCEa – Líquido Cerebroespinhal Artificial
Mas – Receptor de ANG (1-7)
MnPO – Núcleo Mediano Pré-óptico
MS – Ministério da Saúde
NaCl – Cloreto de Sódio
NDR – Núcleo Dorsal da Rafe
NOS – Núcleo Supra-óptico
NEP – Endopeptidase neutra
NPB – Núcleo Parabraquial
NPV – Núcleo Paraventricular
NTS – Núcleo do Trato Solitário
OCV – Órgão Circumventricuar
OMS – Organização Mundial de Saúde
ON – Óxido Nítrico
ORQXA – Ratos orquiectomizados+A779
ORQXD – Ratos orquiectomizados+DIZE
ORQXV – Ratos orquiectomizados+veículo
OSF – Órgão subfornical
OT – Ocitocina
OVLT – Órgão Vasculoso da Lamina Terminal
OVXA – Ratas ovariectomizadas+A779
OVXD - Ratas ovariectomizadas + DIZE
OVXEA – Ratas ovariectomizadas com reposição estrogênica+A779
OVXED - Ratas ovariectomizadas com reposição estrogênica+DIZE
OVXEV – Ratas ovariectomizadas com reposição estrogênica+veículo
OVXV – Ratas ovariectomizadas+veículo
PEP – Prolil-endopeptidase
PNA – Peptídeo Natriurético Atrial
REN – Renina
REα – Receptor Estrogênico α
REβ – Receptor Estrogênico β
RNA – Ácido Ribonucleico
SHAMA – Ratos submetidos a orquiectomia fictícia+A779
SHAMD – Ratos submetidos a orquiectomia fictícia+DIZE
SHAMV – Ratos submetidos a orquectomia fictícia
SNC – Sistema Nervoso Central
SNS – Sistema Nervoso Simpático
SRA Sistema Renina-Angiotensina
UFMG – Universidade Federal de Minas Gerais
UFS – Universidade Federal de Sergipe
VP – Vasopressina
SUMÁRIO
RESUMO _________________________________________________________________i
ABSTRACT_______________________________________________________________ii
LISTA DE TABELAS E FIGURAS___________________________________________iii
LISTA DE ABREVIATURAS________________________________________________iv
1. INTRODUÇÃO _________________________________________________________ 15
2. REVISÃO DE LITERATURA _____________________________________________ 17
2.1. Controle central da sede e apetite por sódio ...................................................................... 17
2.1.1. Sede ................................................................................................................................. 17
2.1.2. Apetite por sódio ............................................................................................................. 18
2.2.Regulação central do balanço hidroeletrolítico pelo Sistema Renina-Angiotensina (SRA) ..
........................................................................................................................ 19
2.2.1.O eixo ECA/ANGII/AT1 na regulação central da sede e apetite por sódio .................... 20
2.2.2.O eixo ECA2/ANG(1-7)/Mas e suas funções regulatórias .............................................. 22
2.3.Os hormônios gonadais e a sua influência na sede e no apetite por sódio ......................... 25
3.OBJETIVOS ____________________________________________________________ 29
3.1.OBJETIVO GERAL .......................................................................................................... 29
3.2.OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................ 29
4.MATERIAL E METODOS _________________________________________________ 30
4.1.Animais utilizados .............................................................................................................. 30
4.2.Drogas Utilizadas ............................................................................................................... 30
4.3.Procedimentos Cirúrgicos................................................................................................... 31
4.3.1.Anestesia .................................................................................................................. 31
4.3.2.Gonadectomia .................................................................................................................. 32
4.3.3.Implantação de cânula intracerebroventricular (icv) ....................................................... 34
4.4.Reposição hormonal ........................................................................................................... 37
4.5.Indução da sede e do apetite por sódio e administração icv de drogas .............................. 37
4.6.Perfusão para fixação do tecido cerebral ............................................................................ 38
4.7.Delineamento experimental ................................................................................................ 38
4.8.Análise estatística ............................................................................................................... 39
5.RESULTADOS __________________________________________________________ 40
5.1.Efeito da gonadectomia em machos e fêmeas. ................................................................... 40
5.2.Estudo da participação da ECA2 encefálica na ingestão induzida de água e de NaCl 0,3M
em ratas. ........................................................................................................................ 41
5.3.Estudo da participação do receptor Mas encefálico na ingestão induzida de água e de NaCl
0,3M em ratas: ........................................................................................................................ 45
5.4.Estudo da participação da ECA2 encefálica na ingestão induzida de água e de NaCl 0,3M
em ratos. ........................................................................................................................ 50
5.5.Estudo da participação do receptor Mas encefálico na ingestão induzida de água e de NaCl
0,3M em ratos . ....................................................................................................................... 54
6.DISCUSSÃO ____________________________________________________________ 58
7.CONCLUSÃO ___________________________________________________________ 66
8.REFERÊNCIAS _________________________________________________________ 67
ANEXO A _______________________________________________________________ 74
15
1. INTRODUÇÃO
As desordens dos fluidos corporais estão entre os maiores desafios encontrados na
prática clínica, visto que diversas doenças podem potencialmente promover mudanças nos
mecanismos neuroendócrinos controladores da ingestão hidromineral. A manutenção da
volemia para que os órgãos e tecidos sejam adequadamente perfundidos, relaciona-se com a
concentração de sódio extracelular dos líquidos corporais. Assim, diversos estudos em
neurobiologia atribuem a gênese de doenças cardiovasculares, aos desequilíbrios entre o
consumo e a perda de sódio e água do organismo (FITZSIMONS, 1998; VERBALIS, 2003)
De acordo com dados da Organização Mundial de Saúde (OMS), o consumo
individual máximo de sódio deve ser inferior a 5 gramas diários. O uso excessivo de sal
(cloreto de sódio ou NaCl), constituinte da dieta diária em humanos, pode acarretar problemas
de saúde relacionados principalmente ao sistema cardiovascular, como a hipertensão,
considerada na atualidade, o principal fator de risco associado a mortalidade mundial. Dados
publicados pelo Ministério da Saúde (MS) apontam o crescimento da hipertensão arterial
entre os brasileiros, acarretado pelo consumo abusivo de NaCl chegando a 12 gramas diários
por pessoa (LESHEM, 2009; MECAWI et al., 2008).
Neste contexto, é sabido que sistemas fisiológicos, como o Sistema Renina
Angiotensina (SRA), atuam simultaneamente na regulação das funções cardiovasculares,
endócrinas e comportamentais de ingestão de água e sódio, envolvidos na manutenção da
homeostase hidroeletrolítica e hemodinâmica (ANTUNES-RODRIGUES et al., 2004;
FITZSIMONS, 1998).
Nas últimas décadas, tem sido demonstrado que a hiperatividade do SRA está
implicada na gênese de diversas doenças causadoras de patologias cerebrovasculares,
cardíacas e renais, com destaque para as doenças cardiovasculares, endócrinas e
comportamentais que resultam no desequilíbrio hidroeletrolítico e hemodinâmico, geradores
da hipertensão arterial (FERRARIO, 1990; GEERLING; LOEWY, 2008).
Ademais, evidências clínicas e experimentais têm reforçado a idéia de que mulheres
em idade reprodutiva são mais protegidas que os homens da mesma idade no que diz respeito
16
ao desenvolvimento de doenças cardiovasculares, e ao consumo excessivo de sódio. Este
percentual tende a se igualar após a menopausa, quando a atividade endócrina ovariana está
reduzida (HILLIARD et al., 2013; MECAWI et al., 2008).
Assim, tem sido imputado ao estrógeno, principal hormônio gonadal feminino, um
importante papel protetor do estabelecimento de doenças hemodinâmicas associadas a
distúrbios de comportamentos de ingestão de sódio e água (OPARIL; MILLER, 2005;
PECHÈRE-BERTSCHI; BURNIER, 2004). Paralelamente, estudos experimentais tem
demonstrado que o estrógeno é capaz de modular a atividade de componentes
contrarregulatórios do SRA, como a recém-descoberta Enzima Conversora de Angiotensina
tipo II (ECA2) (CLARKE; TURNER, 2012).
Neste trabalho, buscamos verificar a possível influência dos hormônios gonadais
masculinos e femininos, sobre mecanismos contrarregulatórios do SRA que atuam no controle
do comportamento de ingestão de água e sódio submetidas ao desafio experimental de
depleção hidrossalina.
17
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Controle central da sede e apetite por sódio
2.1.1. Sede
A sede é definida como uma percepção subjetiva da necessidade de ingerir água em
animais e humanos. A ingestão de líquidos é necessária para contrabalancear quaisquer perdas
que possam ocorrer durante processos fisiopatológicos do organismo. Essa ingestão é
regulada pelo mecanismo de sede experimentado por animais desidratados que buscam
avidamente por água. O hormônio antidiurético (HAD) mantém o controle preciso da
osmolalidade do líquido extracelular e da concentração de sódio. Constantemente os animais
terrestres perdem água e sódio, com isto são necessários reflexos e respostas comportamentais
com a finalidade de corrigir os desequilíbrios e manter a homeostase dos líquidos corporais
(ANTUNES-RODRIGUES et al., 2004; MCKINLEY; JOHNSON, 2004; SHAHID, 2011).
O aumento de 1 a 2% na osmolalidade plasmática é suficiente para gerar sede,
enquanto que para produzir este mesmo efeito torna-se necessária uma queda de 10 a 15% do
volume ou da pressão, que através da ativação de mecanismos reflexos autonômicos
associados a respostas endócrinas, causam liberação de aldosterona e vasopressina, com
objetivo de prevenir perdas renais de sódio e água evitando a desidratação (DE LUCCA et al.,
2007; STRICKER; WOODS, 2004).
A perda de água pode ocorrer tanto ao nível do compartimento intracelular quanto
extracelular, ou seja, apresentando dois tipos de sede: a intracelular ou hiperosmótica e
extracelular ou hipovolêmica. A redução do volume de liquido celular ou desidratação celular
pode ocorrer por perda de água para o meio extracelular resultante do aumento na
concentração de solutos osmoticamente ativos. A redução exclusiva do volume de líquido
extracelular em situações como vômitos, hemorragias, diarréias, depleção de sódio, etc,
causam o que chamamos de sede extracelular (ANTUNES-RODRIGUES, 2005;
THORNTON, 2010).
O cérebro pode influenciar o comportamento ingestivo de líquidos em vertebrados
através de pequenas estruturas neurais periventriculares específicas altamente vascularizadas e
desprovidas de barreira hematoencefálica, as quais respondem pela regulação da ingestão de
água e sódio. Estas estruturas são chamadas de órgãos circunventriculares (OCVs), os quais
18
são constituídos por duas estruturas sensíveis à ação dipsogênica, o Órgão Vasculoso da
Lâmina Terminal (OVLT) e o Órgão Subfornical (OSF), estas estruturas localizam-se ao
longo da parede ântero-ventral do terceiro ventrículo (AV3V) (FITZSIMONS, 1998;
MCKINLEY; JOHNSON, 2004).
O OSF, OVLT e AP são os principais centros dipsogênicos estimulados pela
angiotensina II (ANG II) circulante, entretanto existem estruturas intracerebrais que não
podem ser diretamente influenciadas por este peptídeo, pois estas estruturas estão localizadas
em áreas protegidas pela barreira hematoencefálica (BHE), como o núcleo pré-óptico
mediano (MnPO) localizado na lamina terminal entre os OCVs integrando a região AV3V.
(JOHNSON; THUNHORST, 1997).
2.1.2. Apetite por sódio
O sódio é o soluto iônico essencial para as mudanças na osmolalidade. Sua
concentração no fluido extracelular é determinante para o equilíbrio da água entre os
compartimentos intra e extracelulares (JOHNSON; GROSS, 1993). O volume total de fluido
extracelular depende amplamente da adição de sódio neste espaço promovendo o controle da
pressão osmótica de entrada e saída de água. Esta adaptação regulatória constitui a razão pela
qual o sódio deve ser excretado para reduzir volume, e também deve ser ingerido e retido para
incrementar o volume plasmático (GEERLING; LOEWY, 2008; MCKINLEY et al., 2006;
STELLAR; EPSTEIN, 1991).
Quando o individuo encontra-se em status deficiente de sódio, o organismo
desencadeia um comportamento de ingestão em quantidade não usual de sódio ao nível
encefálico, iniciado por grupos de neurônios específicos promotores do incremento na
necessidade e na busca pelo mineral. Uma vez encontrado, o aparato gustatório transmite um
sinal de detecção e por fim estes sinais são integrados a uma ou mais áreas cerebrais
motivando o comportamento ingestivo (GEERLING; LOEWY, 2008; GIESTAS; PALMA;
RAMOS, 2010).
O apetite ao sódio, assim como a sede, representa um comportamento inato que se
manifesta ao longo da vida sendo desencadeado independente do aprendizado. O incremento
19
na preferência ao sódio em humanos ocorre por subsequente perda do mineral. Dentre os
fatores mais conhecidos por influenciar este apetite, os hormônios desempenham papel
essencial na deficiência do sódio, como por exemplo a ANG II e a aldosterona. Outro fator
bem conhecido está relacionado às mudanças na concentração de sódio sanguíneo de certos
fatores, como o fluido cerebroespinhal (FCE), fluido intracelular (FIC) e extracelular (FEC).
Em adição, os hormônios ligados ao estresse (glicocorticóides), sistema nervoso simpático
(SNS), hormônios da gestação e lactação como estrógeno, progesterona, OT, prolactina
devem estar envolvidos em complexas interações reguladoras do apetite ou da saciedade ao
sódio (KAUFMAN; MACKAY, 1983; STELLAR; EPSTEIN, 1991).
A parede anterior do terceiro ventrículo da lâmina terminal possui regiões envolvidas
direta ou indiretamente com a mediação central do apetite por sódio que incluem neurônios
especializados e células gliais sensíveis a elevações na osmolalidade extracelular e
concentração de sódio (WATANABE et al., 2006). Estes neurônios específicos estão
concentrados sobretudo em dois OCVs sensoriais: o OSF e OVLT, promovendo o
comportamento de ingestão de fluidos estimulados por ANG II (KAUFMAN; MACKAY,
1983; MORRIS et al., 2002).
Quanto aos mediadores implicados na gênese e na inibição do apetite ao sódio, a
aldosterona pode estimular este apetite com alta seletividade relativa a outros hormônios,
como a ANG II que incrementa a ingestão não-seletiva de sal e água atuando como agonista,
enquanto que a OT no PVN e a serotonina no núcleo dorsal da rafe (NDR) devem estar
envolvidos na saciedade ou inibição do apetite ao sódio. Adicionado a este fato, o ANP possui
ação antagonista inibindo a sede e o apetite ao sódio quando o indivíduo é submetido a
privação hídrica, depleção de sódio ou quando induzido por injeção central de ANG II (REIS,
2007; STELLAR; EPSTEIN, 1991)
2.2. Regulação central do balanço hidroeletrolítico pelo Sistema Renina-Angiotensina
(SRA)
Atualmente, estudos tem destacado a atuação do sistema renina-angiotensina como
fator de atuação cerebral para o controle dos fluidos corporais, podendo resultar na regulação
da pressão sanguínea, da sede, do apetite por sódio, da secreção de vasopressina (VP) e da
secreção do hormônio adrenocorticotrópico (ACTH). Estudos mostram ainda, que o SRA
20
encefálico, é capaz de conduzir ações comportamentais de ingestão de água e resposta
pressórica sistêmica (FITZSIMONS, 1998; PARSONS; COFFMAN, 2007; PAUL; POYAN
MEHR; KREUTZ, 2006).
Além disso, o cérebro possui estruturas localizadas em torno do terceiro ventrículo,
que funcionam como verdadeiras janelas cerebrais, sendo responsáveis por detectar mudanças
de volume celular de origem central ou sistêmica, transmitindo informações que visam
modificar comportamentos, regular secreção hormonal e ativar o sistema nervoso simpático
objetivando restaurar o balanço dos fluidos corporais (BOURQUE; OLIET; RICHARD,
1994; OSBORN; COLLISTER; CARLSON, 2000).
2.2.1. O eixo ECA/ANGII/AT1 na regulação central da sede e apetite por sódio
O angiotensinogênio (AGT) constitui o principal substrato do SRA, é uma α-
glicoproteína produzida também no encéfalo, sobretudo nos astrócitos. Este componente pode
ser encontrado continuamente secretado no interstício cerebral constituindo uma das mais
abundantes proteínas encontradas no fluido cérebro-espinhal (MCKINLEY et al., 2003). No
cérebro, 95% do AGT relatado encontra-se no meio extracelular. A seqüência de eventos
envolvidos no sistema angiotensinérgico tem início com a clivagem do AGT por intermédio
de uma enzima intracelular cerebral chamada de renina (REN) em um decapeptídeo inativo
Angiotensina I (ANGI). A partir deste, a enzima conversora de angiotensina (ECA),
encontrada em altas concentrações nos OCVs, converte a ANG I cerebral em ANG II, a qual
exerce suas ações em receptores nestas regiões (SAAVEDRA, 1992; SHERROD et al., 2005)
A ANG II é considerada um peptídeo essencial do SRA, atuando em seus receptores
específicos subtipo 1 (AT1) e subtipo 2 (AT2) detectados em diversas áreas reguladoras da
homeostase cardiovascular e balanço de fluidos corporais (MCKINLEY et al., 2003). Dentre
os efeitos descritos na literatura para estes receptores, podemos destacar dentre outros, a sede
e o apetite por sódio como as respostas comportamentais mais significativas para injeções
centrais de ANGII. Os efeitos comportamentais acima citados são mediados pelos receptores
AT1, sendo descrito ainda que os receptores AT2 devem possivelmente exibir ações opostas
aos receptores anteriores no comportamento de sede (FITZSIMONS, 1998; MCKINLEY et
al., 2006; WRIGHT; HARDING, 1992).
21
A localização encefálica da ANG II foi descrita no corpo celular de neurônios em
várias regiões do sistema nervoso central (SNC) atuando como um neurotransmissor. As
regiões cerebrais contendo maior número de neurônios para angiotensina são: NPV (núcleo
paraventricular), NSO (núcleo supraóptico), OSF (órgão subfornical), NTS (núcleo do trato
solitário) e regiões periventriculares. Os receptores de ANG II central, AT1 e AT2, e seus
subtipos, estão localizados em regiões responsáveis por exercerem importante influência na
regulação de fluidos corporais e homeostase eletrolítica (SAAVEDRA, 1992). Estudos da
detecção de atividade neuronal por imunohistoquimica, utilizando antagonistas específicos
dos receptores citados, revelaram que ocorre alta predominância do subtipo AT1 em áreas
cerebrais importantes como NSO, NPV, NPB (núcleo parabraquial), NTS, dentre outras
(GILES et al., 1999; ROWE et al., 1990).
A localização central dos receptores de ANG II e a falta de acesso da ANG II
sistêmica através da barreira hematoencefálica (BHE) suportam a idéia de que ANG II seja
produzida em estruturas encefálicas dentro da BHE e não da circulação sistêmica. No entanto
os OCVs como o OSF, o OVLT, a EM (eminência mediana) e a AP (área postrema),
desprovidos de BHE, estão expostos a ANG II circulante, permitindo a mediação das ações da
ANG II em seus receptores (AT1), estes são expressos em altas concentrações nestes órgãos,
diferentemente de outras áreas encefálicas (BOURQUE; OLIET; RICHARD, 1994).
O padrão de distribuição dos receptores AT1 no cérebro sugere que a ANG II pode
atuar como um neuromodulador ou um neurotransmissor no SNC influenciando dentre outros
efeitos, a homeostase da água e eletrólitos, a liberação de hormônios pituitários e o controle
autonômico. De uma forma geral, a sede conta com requisitos importantes para ser
desencadeada, a diminuição do volume sistêmico resultante de perdas significativas como
hemorragia ou desidratação, estimula mecanismos que resultam no aumento da ANG II
circulante a qual deve interagir com os OCVs envolvendo mecanismos de regulação neural ou
humoral (GILES et al., 2001; JOHNSON; GROSS, 1993).
A conservação do sódio corporal está sob o controle permanente do SRA que atua na
deficiência do sódio, elevando os hormônios modulatórios deste sistema. Estes hormônios
atuam direta ou indiretamente no cérebro motivando o apetite por sódio. Ademais,
22
experimentos utilizando antagonistas dos receptores AT1 ou AT2, demonstraram a ocorrência
de inibição deste apetite especificamente em ratos e em babuínos (ROWE et al., 1990).
2.2.2. O eixo ECA2/ANG(1-7)/Mas e suas funções regulatórias
O SRA tem sido abordado como um sistema endócrino capaz de regular as várias
funções orgânicas por intermédio do seu principal hormônio efetor funcional, a ANG II. Com
o advento de novas técnicas moleculares, houve um melhor entendimento de seu
funcionamento e identificação dos diversos componentes reguladores da cascata enzimática.
Dentre eles, o primeiro componente descoberto foi o heptapeptídeo ANG(1-7) por Schiavone
e colaboradores em 1988, demonstraram que este peptídeo possuía ações equipotentes a
ANGII para liberação de vasopressina pela neurohipófise. Além disso, um estudo utilizando a
microinjeção em doses muito baixas (fentomoles) de ANG (1-7) dentro do bulbo ventrolateral
rostral (BVLR) resultou em diminuição da pressão arterial com bloqueio dos receptores AT1
e AT2 (CAMPAGNOLE-SANTOS et al., 1989).
Em seguida, muitas pesquisas foram desencadeadas no intuito de encontrar uma via
enzimática específica para a formação da ANG(1-7). As pesquisas realizadas descreveram
uma enzima com propriedades catalíticas especifica para ANGII, a enzima conversora de
angiotensina tipo 2 (ECA2), uma isoforma da ECA (Enzima Conversora de angiotensina)
possuindo diferenças no que diz respeito a especificidade ao substrado e sua atividade
inalterada na presença de bloqueadores clássicos da ECA. (DOOBAY et al., 2007; ELASED
et al., 2006; SAKIMA et al., 2005).
A identificação da ECA2, proporcionou a descrição inicial de sua atividade na
hidrólise da ANGI gerando ANG (1-9), expressa predominantemente no endotélio vascular e
sendo altamente restrita ao rim, testículos e tecido cardíaco humano, exercendo sua influência
catalítica no SRA local do coração e do rim. Foi demonstrado ainda que a eficiência catalítica
da ECA2 para ANGII é 400 vezes maior que para ANGI (DONOGHUE et al., 2000;
VICKERS et al., 2002).
Ademais, muitas outras enzimas podem formar a ANG(1-7), tanto por ANGI quanto
por ANGII, incluindo a prolil-endopeptidase (PEP), endopeptidase neutra (NEP) e a prolil-
23
carboxipeptidase (PCP) (SANTOS; FERREIRA; SIMÕES E SILVA, 2008; VARAGIC et al.,
2008) (Fig. 1).
O interesse em estudar a ECA2 e receptores específicos para os fragmentos peptídicos
surgiu a medida que foram descritas propriedades contrarregulatórias do eixo clássico
(ECA/ANG II/AT1) sendo assim nomeado como um eixo depressor do SRA (HILLIARD et
al., 2013; KURDI; DE MELLO; BOOZ, 2005).
Neste cenário, diversos autores têm buscado o entendimento acerca das implicações
fisiológicas e mecanismos de ação deste eixo contrarregulatório do SRA. Este eixo pode ser
representado seqüencialmente pelos seus principais componente ECA2/ANG(1-7)/Mas.
Dentre os efeitos já reconhecidamente comprovados, estão a vasodilatação, efeitos
natriuréticos, diuréticos e antiproliferativos em contraste aos efeitos da ANG II como
vasoconstricção, retenção sódio e de água, além de afetar a função cardiovascular elevando a
pressão arterial (vide figura esquemática, Fig. 01). Estudos pioneiros de Santos (2008),
Ferrario (2007) e Donoghue (2000) permitiram observar este eixo como alvo em potencial
para a busca de fármacos com potencial terapêutico de doenças hipertensivas. (SANTOS;
FERREIRA; SIMÕES E SILVA, 2008; TRASK; FERRARIO, 2007).
Recentemente, estudos têm demonstrado que a ANG (1-7) é um membro
biologicamente ativo do SRA produzindo efeitos por vezes similares, e na maioria das vezes
opostos aos da ANG II. O produto da hidrólise do metabolismo de ANG I em homogenatos
do cérebro de cães, constituiu a primeira evidência da geração de ANG(1-7) encefálica, sendo
esta molécula o principal produto do metabolismo da ANG I e ANG II.(TRASK et al., 2007;
VARAGIC et al., 2008)
A ANG(1-7) tem sido detectada no corpo de células neuronais e fibras do núcleo
magnocelular em áreas encefálicas como hipotálamo, medula oblongata e amígdala no
cérebro de ratos normais, todas envolvidas com o controle do equilíbrio hidrossalino e
cardiovascular. Da mesma forma, o seu receptor Mas é encontrado em neurônios, microglia e
células endoteliais destas mesmas estruturas, revelando assim a importância deste receptor na
regulação da pressão sanguínea, balanço de fluidos e osmorregulação. Interessantemente, a
liberação de vasopressina (VP) induzida por ANG(1-7) é semelhante a observada quando da
microinjeção central da ANG II (SHI et al., 2010; XU; SRIRAMULA; LAZARTIGUES,
24
2011). As ações destas angiotensinas no encéfalo têm sido alvo de estudos com o intuito de
entender o envolvimento dos diferentes receptores, circuitos neurais e a integração de
complexos mecanismos cerebrais (DOOBAY et al., 2007; VARAGIC et al., 2008).
As ações relatadas até o momento são mediadas principalmente pelo receptor Mas, o
qual foi descrito por Santos e col.(2003) através da identificação da ANG(1-7) como o seu
principal fator de ligação estabelecendo o eixo ECA2/ANG(1-7)/MAS como uma descoberta
relevante para o SRA cerebral. O receptor Mas acoplado a proteína G, é expresso em vários
tecidos corporais em mamíferos. Dentre os mais importantes é altamente predominante no
encéfalo e testículos, e com moderada expressão no coração e rins (SANTOS et al., 2003).
Quanto a expressão deste receptor, diversos estudos demonstram sua ocorrência no
coração, rins, pulmões, fígado, baço, língua e músculo-esquelético. Porém, sua alta expressão
foi primeiramente detectada em células do endotélio vascular cerebral, sendo restrito ao
hipocampo, córtex e bulbo olfatório (ALENINA et al., 2008; SANTOS et al., 2003; YOUNG
et al., 1988).
AGT
REN
ANG I
ECA
ANG II ANG (1-7)
ANG (1-9)
ANG
(1-5)ECA
Bradicinin
a
ECA2
NEP,
PEP ECA,NEP
ECA2, PEP
RECEPTOR AT1
Vasoconstricção
Proliferação celular
Hipertrofia
Sede
Apetite por sódio
RECEPTOR AT2 Mas
Vasodilatação
Anti-proliferação
Anti-hipertrofia
Figura 1. Diagrama esquemático demonstrando cascata enzimática do Sistema Renina-Angiotensina (SRA) e
demais endopeptidases. (AGT) Angiotensinogênio; (REN) Renina; (ECA) Enzima conversora de angiotensina;
(ANGI) Angiotensina I; (ANGII) Angiotensina II; (AT1) Receptor de angiotensina tipo 1; (AT2) Receptor de
angiotensina tipo 2; (ECA2) Enzima conversora de angiotensina tipo 2; (ANG(1-9)) Angiotensina 1-9; (PEP)
Prolil-endopeptidase; (NEP) Endopeptidase neutra; (ANG(1-7) Angiotensina (1-7)); (ANG(1-5)) Angiotensina
1-5 e (Mas) Receptor de ANG(1-7) (Adaptado de SANTOS et al. 2008).
25
Algumas áreas relacionadas ao controle cardiovascular foram descritas a partir da alta
densidade dos receptores Mas imunorreativos no NTS, BVLR (Bulbo ventrolateral rostral),
BVLC (bulbo ventrolateral caudal), porções parvo- e magnocelulares do NPV, NSO e área
pré-óptica lateral como sítios de ação para a ANG(1-7) cerebral (BECKER et al., 2007).
Estudos utilizando bloqueadores destes receptores como o A779 e D-Pro-Ang(1-7)
demonstraram que o receptor Mas exerce uma função global no endotélio vascular regulando
a biodisponibilidade de óxido nítrico (NO) e na atividade da óxido nítrico sintaze (NOS).
Portanto, o receptor Mas constitui um componente altamente relevante para modulação da
vasodilatação induzida por agonistas dependentes ou não do SRA (PEIRÓ et al., 2013).
Recentemente, foram identificado dois novos componentes do SRA, o Alamandine
(Ala-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro) e o seu receptor MrgD. Este heptapeptídeo gerado da hidrólise
de Angiotensina A (Ala-AngII) pela ação da ECA2 humana, está presente na circulação
sanguínea humana produzindo vasodilatação, efeitos antihipertensivos em ratos
espontaneamente hipertensos e efeitos cardiovasculares central. Além disso, a semelhança
seqüencial entre o Alamandine e a ANG(1-7), levou a investigar se existia semelhança nas
ações biológicas deste peptídeos através do receptor Mas, não sendo observado efeito do
Alamandine para este receptor, mas a descoberta do receptor MrgD (LAUTNER et al., 2013).
2.3. Os hormônios gonadais e a sua influência na sede e no apetite por sódio
Em fêmeas, é sabido que os hormônios gonadais circulantes sofrem oscilações
constantes resultantes do ciclo estral e durante reposição hormonal. Com isso, evidencias
mostram que a ingestão de água e sódio nas diversas fases do ciclo, sofrem alterações
influenciadas pelo E2. A eliminação do E2 pela ovariectomia provoca mudanças
comportamentais não só na receptividade sexual, também na ingestão espontânea de fluidos
(KRAUSE et al., 2003; TARTTELIN; GORSKI, 1971).
O crescimento de pesquisas experimentais voltadas para o estudo dos efeitos não
reprodutivos do estrógeno (E2), ampliou o entendimento do mecanismo de ação deste
hormônio, a exemplo do equilíbrio de fluidos corporais, os comportamentos motivados pela
sede e pelo apetite por sódio são influenciados pelo E2. Evidências mostram a redução da
26
sede influenciada pela atuação do estrógeno em ratas estimuladas por isoproterenol (agonista
β-adrenérgico promotor de aumento de ANG II circulante) (CURTIS, 2009; KRAUSE et al.,
2003).
Os efeitos atribuídos ao estrógeno são classicamente genômicos e mediados por dois
subtipos de receptores, o REα, e o REβ. Assim, o E2 revela-se como um provável candidato a
desenvolver forte influência no controle central de fluidos corporais, isto devido a constatação
da presença de RE em áreas cerebrais envolvidas na regulação hidrossalina (GHAZI et al.,
1994; GRAVES et al., 2011; ROSAS-ARELLANO; SOLANO-FLORES; CIRIELLO, 1999).
A expressão de componentes e a resposta ao estimulo ou inibição do SRA sob
condições fisiológicas ou fisiopatológicas, representam diferenças significativas entre machos
e fêmeas. A ativação excessiva do SRA, implica na progressão de lesões a órgãos-alvo
provocando hipertrofia ventricular esquerda, insuficiência cardíaca congestiva, hipertrofia
vascular, doenças renais, dentre outras (HILLIARD et al., 2013). Segundo Oparil e Miller
(2005), o desenvolvimento e a progressão de doenças renais e cardiovasculares estão
relacionadas ao sexo, como por exemplo, mulheres em período de pré-menopausa apresentam
menor prevalência de hipertensão do que homens da mesma idade.
Os estrógenos possuem características altamente lipofílicas e podem acessar o SNC
facilmente. Desta forma, eles podem atuar nos receptores de estrógeno (RE) encefálicos,
sobretudo aqueles localizados em áreas envolvidas na regulação do balanço hidroeletrolítico.
Ademais, há evidências de que a administração de estradiol na área pré-optica medial, diminui
a sede induzida por ANG II em fêmeas, enquanto que em machos, tal efeito não foi observado
(GRAVES et al., 2011; KISLEY et al., 1999; KRAUSE et al., 2006).
É descrito ainda na literatura que o estrógeno regula todos os componentes do SRA,
seja incrementando a síntese de AGT ou diminuindo a síntese de REN e a ECA.
Adicionalmente, o estrógeno promove redução na expressão de receptores AT1 e elevação na
expressão de receptores AT2. Isto foi observado em rins de fêmeas ovariectomizadas que ao
receberem reposição estrogênica, expressaram maior quantidade de receptores AT2 quando
comparadas às fêmeas sem reposição (BAIARD et al., 2005; RECKELHOFF, 2008).
27
Quanto aos esteróides masculinos, a influência da testosterona no controle da pressão
arterial tem sido amplamente documentada por estudos utilizando a remoção e reposição
hormonal em machos. Dentre outros trabalhos, ao promoverem a orquiectomia (remoção da
testosterona endógena) em ratos espontaneamente hipertensos, foi observada uma redução
significativa da pressão arterial, sendo esta restaurada após a reposição hormonal com
testosterona (CHEN; MENG, 1991; IAMS; WEXLER, 1977). Em outro estudo, foi
demonstrado que a infusão crônica de baixa dose de ANG II diminuiu a pressão arterial
especificamente em fêmeas, enquanto que em machos infundidos com a mesma dose houve
um incremento significativo, sugerindo ação oposta entre os receptores AT1 e os receptores
AT2 (JONES et al., 2008)
Para EPSTEIN (1992), a regulação da ingestão de sal em ratos caracteriza-se pela
presença de esteróides como a testosterona e peptídeos de origem cerebral (ANGII), estes
podem interagir diretamente regulando a via clássica do SRA com características
vasoconstrictoras através da regulação da expressão de AGT, da atividade da renina e a
expressão de receptores AT1. Além disso, altos níveis de renina plasmático são observados
em ratos intactos após a orquiectomia, estes níveis são diminuídos ou até mesmo restaurados
após reposição com testosterona, indicando que existe uma correlação entre a atividade de
renina plasmática e atividade da testosterona (RECKELHOFF, 2008).
Estudos têm identificado diferenças na expressão de componentes do SRA em machos
e fêmeas. Significativamente, os componentes do eixo ECA2/ANG(1-7)/Mas podem estar
altamente regulados em fêmeas, particularmente na presença de níveis elevados de ANGII
(OJEDA et al., 2007; SAFARI et al., 2012). Esta evidência mostra ainda que as fêmeas
comparadas aos machos apresentam mecanismo estrógeno-dependente na regulação dos
componentes do eixo citado.
Diante das evidências apontadas por diversas pesquisas em neurobiologia, constata-se
que existem fortes indícios de que os hormônios sexuais contribuem para mudanças
comportamentais na ingestão hidrossalina. Além disso, faltam dados concretos na literatura
que expliquem o dimorfismo sexual dos mecanismos de controle encefálico para os
comportamentos de ingestão de sal e água. Por esta razão, torna-se necessário estudar os
componentes do eixo ECA2/ANG(1-7)/Mas sob uma nova pespectiva, no intuito de ampliar o
conhecimento acerca dos efeitos neuromodulatórios da ingestão hidromineral em ratos e ratas.
28
29
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GERAL
Investigar a participação de hormônios gonadais na modulação das possíveis ações do
eixo ECA2/Ang(1-7)/Mas no controle das funções dipsogênica e natriorexigênica em ratos e
ratas.
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Investigar se o aumento na atividade da ECA2 encefálica em ratas sofre interferência
estrogênica no comportamento de ingestão de água e sódio induzidos.
Estudar o efeito da testosterona na ingestão de água e sódio através do aumento na
atividade da ECA2 encefálica em ratos.
Avaliar a participação do receptor Mas no comportamento de ingestão de água e sódio
induzidos em ratas ovariectomizadas com ou sem reposição estrogênica.
Determinar a interferência dos esteróides masculinos nos receptores Mas encefálicos
para o comportamento de ingestão de água e sódio em ratos.
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4. MATERIAL E METODOS
4.1. Animais utilizados
Foram utilizados ratos (Rattus norvegicus) Wistar, machos e fêmeas adultos pesando
inicialmente 250 a 300 g (12 animais por grupo), obtidos do Biotério Central da Universidade
Federal de Sergipe (UFS). Os animais foram alojados em gaiolas individuais de aço
inoxidável em ambiente controlado com temperatura de 23 ± 2 ºC e luminosidade controlada
com ciclo claro-escuro de 12 horas (luz das 6 às 18h). As gaiolas metabólicas individuais
eram equipadas com bebedouros graduados a cada 1ml com capacidade para 100ml tampados
com rolhas de borracha providas de bico de aço inoxidável e comedouros onde tiveram livre
acesso à água, solução hipertônica de NaCl 0,3 M e ração para roedores durante um período
de habituação de 7 a 10 dias (BADAUÊ-PASSOS et al., 2007; MECAWI et al., 2008) . Estes
animais foram mantidos em sala de manutenção e experimentação localizada no Laboratório
de Neuroendocrinologia Básica e Comportamental (LANBAC, DFS).
Todos os procedimentos, aos quais os animais utilizados neste estudo foram
submetidos estão de acordo com as normas e princípios éticos preconizados pela International
Guiding Principles for Biomedical Research Involving Animals e pelo Comitê de Ética em
Pesquisa com Animais (CEPA) da Universidade Federal de Sergipe, sendo aprovado por este
comitê conforme protocolo em anexo (Anexo A, protocolo # 029/2009).
4.2. Drogas Utilizadas
Para a indução da depleção de sódio, utilizamos o diurético inibidor do co-
transportador de Na+/K
+/Cl
- presente no ramo ascendente espesso da alça de Henle,
furosemida (Lasix™), na sua forma original. No experimento de manipulação central da
ECA2 utilizamos o Aceturato de Diminazeno em injeções intracerebroventriculares (i.c.v.)
como seu ativador; referida daqui em diante como DIZE. Para a manipulação central do
receptor de ANG (1-7), o receptor Mas, foi utilizada a droga D-Ala7 –ANG(1-7) referida
daqui em diante como A779 (AVENTIS pharma, EUA) gentilmente cedidas pelo Dr. Robson
Augusto Souza dos Santos, UFMG).
31
As drogas utilizadas para a manipulação farmacológica do SNC foram diluídas em
Líquido Cérebro-Espinhal-artificial (LCEa) (NaCl 140 mM, KCl 3,0 mM, CaCl 1,25 mM,
MgCl2 1,0 mM, Na2HPO4 1,2 mM, NaH2PO4 0,3 mM, glicose 3,0 mM). O volume de
administração foi de 2 μL através de seringa de Hamilton de 10μL (Microlab) acoplada a
bomba de infusão (BI-2008, AVS Projetos) através de tubo de silicone PE-10 durante três
minutos e oito segundos conforme configuração estabelecida pelo equipamento.
Para a reposição hormonal foi utilizado o Benzoato de Estradiol (Ric-BE,
TECNOPEC, São Paulo, Brasil) diluído em óleo de girassol e administrado continuamente até
o final do experimento em fêmeas castradas com reposição hormonal (OVXE). O óleo de
girassol foi utilizado como veículo.
Para os procedimentos cirúrgicos e a perfusão transcardíaca dos encéfalos, os animais
eram submetidos a anestesia sendo o tempo de procedimento cirúrgico menor que 20 min, por
esta razão utilizou-se a combinação anestésica entre quetamina (Cetamin, Syntecvet, Brasil) e
xylazina (Xilazin, Syntecvet, Brasil).
Para a profilaxia antibacteriana, utilizamos antibiótico de amplo espectro de ação
(Pentabiótico Veterinário, Fort Dodge Saúde Animal Ltda., Brasil). A analgesia pós-cirúrgica
foi produzida por meio da administração intramuscular de flunixim meglumine (Banamine
pet, MSD Saúde Animal, Brasil).
4.3. Procedimentos Cirúrgicos
4.3.1. Anestesia
Como procedimento anestésico para a realização dos procedimentos cirúrgicos, os
animais foram anestesiados através de injeção intraperitoneal da combinação anestésica entre
quetamina (60 mg/kg, ip) e xylazina (7,5 mg/kg, ip). A profilaxia antibacteriana, foi iniciada
imediatamente após a aplicação do anestésico, com a injeção intramuscular de antibiótico de
amplo espectro de ação, na dose de 240.000 UI/Kg das penicilinas (pentabiótico pequeno
porte-). A analgesia pós-cirúrgica foi produzida, em todos os animais operados, por meio da
administração intramuscular de flunixim meglumine (1mg/animal, uma vez ao dia, durante 3
dias).
32
4.3.2. Gonadectomia
As cirurgias de orquiectomia e ovariectomia foram realizadas 21 dias antes do início
dos experimentos. As fêmeas devidamente anestesiadas, tratadas profilaticamente, foram
posicionadas em decúbito lateral para possibilitar o acesso lateral da cavidade abdominal.
Através de uma incisão de pele de aproximadamente 1.0 a 1,5 centímetro de comprimento na
parede lateral lombar, os ovários foram acessados através de abertura lateral (por divulsão) da
musculatura abdominal onde foram localizados envoltos por uma massa de tecido adiposo, em
seguida foram devidamente ligados e removidos. Após suturadas, as fêmeas foram mantidas
em caixas individuais e acompanhadas até a completa recuperação pós-operatória (vide Fig.
2).
Figura 2. Cirurgia de ovariectomia em ratas. Posicionamento do animal em decúbito lateral e local para incisão
indicado pela seta na parede lateral do abdome (A); Divulsionamento da musculatura abdominal para acesso a
cavidade abdominal após incisão (B); Identificação da gordura periovariana e ligadura do ovário (C e D) e
retirada do ovário (E). Fonte: (RIGALLI; LORETO, 2010).
A ausência de atividade ovariana foi avaliada diariamente através da colpocitologia
vaginal nas ratas antes de ambos os grupos com ou sem reposição hormonal. A presença de
diestro persistente, fase em que se observa ausência de células nucleadas com predomínio de
leucócitos e muco, confirmaram o decréscimo da atividade ovariana (Fig. 3-Diestro). Nas
fêmeas com reposição hormonal foi avaliada a presença da fase estrogênica com a presença
de células corneificadas em sua maioria e ausência de leucócitos e células nucleadas (Fig. 3-
Estro). Ademais, ao final do estudo, as fêmeas foram eutanaziadas e os úteros foram
removidos e pesados para a determinação do índice uterino (peso do útero/peso corporal)
medido em mg/100g de peso corporal.
33
Figura 3. Microscopia demonstrando fases do ciclo estral. Proestro (ausência de leucócitos e grande numero de
células nucleadas); Estro (ausência de leucócitos e células nucleadas); Metaestro (grande infiltração de
leucócitos, células nucleadas e corneificadas) e Diestro (grande quantidade de leucócitos e ausência de celulas
nucleadas e corneificadas) (GOLDMAN; MURR; COOPER, 2007).
A orquiectomia dos machos foi realizada com os animais anestesiados e posicionados
em decúbito dorsal para evidenciação da bolsa escrotal (Fig. 4A). Em seguida, foi feita uma
incisão sagital mediana da bolsa escrotal entre os testículos até atingirmos a túnica vaginal,
este procedimento permitiu o acesso ao funículo espermático para hemostasia e remoção de
ambos os testículos dos animais do grupo ORQX (Fig. 4B-E). Em animais com cirurgia
34
fictícia (SHAM), os testículos foram evidenciados e em seguida recolocados na bolsa escrotal.
A bolsa foi suturada e os animais acompanhados até a sua completa recuperação pós-cirúrgica
(Fig. 4F).
Figura 4. Cirurgia de Orquiectomia em machos. Posicionamento do animal em decúbito dorsal (A); Incisão
sagital-mediana da bolsa escrotal (B); Exposição do testículo através da incisão (C); Evidenciação do funículo
espermático (D); Ligadura do plexo arteriovenoso consequente incisão (E) e Sutura da bolsa escrotal (F). Fonte:
Adaptado de material de autor desconhecido (Fonte não encontrada).
Para confirmação do efeito da desandrogenização, ao final dos experimentos, todos os
machos foram eutanaziados para remoção e pesagem da próstata e vesículas seminais com o
objetivo de estabelecer o índice prostático e de vesículas seminais (IPVS).
4.3.3. Implantação de cânula intracerebroventricular (icv)
Doze a catorze dias após as gonadectomias procedeu-se às cirurgias para implante das
cânulas guia para administração de drogas no ventrículo lateral. Para isso, com o animal em
plano anestésico, realizamos a tricotomia da parte superior da cabeça. Em seguida, o animal
foi posicionado no aparelho estereotáxico (Grupo Insight Ltda, Brasil), e preso à barra
35
incisora no ponto zero (Fig. 5A). Depois de adequada assepsia do campo cirúrgico,
procedemos à aplicação de 0,1 ml de lidocaína com epinefrina a 2%, s.c., formando um botão
anestésico e em seguida era realizada incisão longitudinal da pele e tecido subcutâneo
isolando o periósteo por meio de retirada de camada muscular (Fig. 5B), em seguida a
abóbada craniana era trepanada com o auxílio de uma broca esférica no local adequado para a
introdução da cânula (Fig. 5C).
Após o alinhamento no plano horizontal dos pontos de bregma e lambda (Fig. 5D),
para a implantação da cânula guia (gauge 26 de 0,6 mm e medindo 10,0 mm de
comprimento), calculou-se o zero estereotaxico através da utilização das suturas craniais
como ponto de referencia. Foram considerados os seguintes parâmetros para o acesso
unilateral do ventrículo lateral: 1,08 mm posterior a bregma, deslocamento lateral de 2,0 mm
em relação ao plano sagital mediano, e 2,0 mm abaixo da superfície da calota craniana medida
em bregma de acordo com coordenadas do atlas estereotaxico (PAXINOS; WATSON, 2006)
conforme mostrado na figura 6. As cânulas injetoras utilizadas foram de espessuras de 30
gauge e 12,0 mm de comprimento.
Após a implantação, a cânula era estabilizada com acrílico autopolimerizável
sustentado por dois a três parafusos fixados à calota craniana. Em seguida, após a secagem do
acrílico, o animal era retirado do aparelho estereotáxico até a sua completa recuperação
anestésica. A localização adequada da cânula era confirmada ao final dos experimentos pela
análise histológica do tecido cerebral fixado com formol. Após a cirurgia estereotaxica, um
mandril era colocado na cânula guia e fixado permanecendo até o dia da microinjeção. Os
animais recebiam doses de anti-inflamatórios e antibióticos seguindo para recuperação em
caixas individuais por 7 dias.
36
Figura 5. Cirurgia de estereotaxia. Posicionamento do animal no Aparelho (A); Incisão e
retirada de camada muscular e fascias (B); Orifícios para colocação de parafusos e
cânula-guia (C) e Colocação da cânula-guia de acordo com coordenadas estereotaxicas
(D). Fonte: Adaptado de figura obtida em material de aulas práticas elaborado pelos Dr.
Celso Rodrigues Franci e Dra. Janete A. Anselmo Franci, docentes do curso de Pós-
Graduação em Fisiologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da USP.
Figura 6. Figura mostrando área de injeção ventricular no encéfalo de ratos (as). Fonte: Adaptado
de Paxinos & Watson, 2005.
D C
B A
37
4.4. Reposição hormonal
Nos experimentos utilizando-se fêmeas, as mesmas eram ovariectomizadas e
submetidas ao protocolo de reposição hormonal. A reposição estrogênica destas fêmeas era
realizada através da injeção diária de benzoato de estradiol (20 μg/animal, s.c.), iniciando a
reposição 24 horas após as cirurgias, até o dia do experimento (21 dias), administrado sempre
às 7h. O óleo de girassol foi utilizado como veículo e administrado no mesmo horário e
volume que o estrógeno (0,1ml por animal, sc) (FALK, 1965; MECAWI et al., 2008).
A presença característica de proliferação celular (células jovens e volumosas) em
esfregaços vaginais (Fig. 3-Estro) confirmaram a eficiência da reposição. Ademais, ao
término dos experimentos, os animais eram eutanaziados e seus úteros retirados e pesados
para a obtenção do índice uterino.
4.5. Indução da sede e do apetite por sódio e administração icv de drogas
Às 07 horas do dia anterior ao experimento, era iniciado o protocolo de depleção
hidrossalina conforme descrito por (JALOWIEC, 1974) e modificado por (BADAUÊ-
PASSOS et al., 2007). Neste, a administração de furosemida (20 mg/kg, sc) era associada a
dieta com restrição de sódio (água destilada e fubá de milho) por 24 horas.
Decorridas 24 horas do inicio da depleção, os bebedouros e comedouros foram
retirados e o mandril removido para posterior microinjeção da droga a ser utilizada. A
microinjeção foi realizada com uso de seringa de precisão (Hamilton, 10 µL), conectada a
tubo de polietileno (PE-10), e acoplada a bomba de infusão. Na extremidade do tubo PE 10
era conectada uma cânula injetora (12 mm) para injeção da droga diretamente no ventrículo
cerebral lateral direito. Trinta minutos após, os animais retornavam às gaiolas metabólicas
equipadas agora com água e NaCl 0,3 M. A partir de então era iniciada a coleta dos dados
relativos aos níveis de ingestão cumulativa de água e NaCl 0,3 M nos tempos zero, 15, 30, 60,
90, 120, 180, 240 min e 24 h após a reapresentação de fluidos. Ademais, foi avaliado o Índice
de Preferência ao Sódio (IPS), onde o volume ingerido NaCl 0,3 M, era dividido pelo volume
total de fluidos ingerido no mesmo tempo (i.e. volume ingerido de NaCl 0,3 M + volume
ingerido de água).
38
4.6. Perfusão para fixação do tecido cerebral
Ao final de cada procedimento experimental, todos os animais tiveram seus cérebros
perfundidos e fixados para posterior confirmação histológica do acerto das microinjeções.
Este procedimento iniciou-se com indução anestésica profunda dos animais que foram em
seguida perfundidos, por via transcardíaca, com aproximadamente 50 ml de salina isotônica
seguido da administração de 50 ml de paraformaldeído 4% em tampão fosfato 0,1 M (tampão
fosfato, pH 7,2).
4.7. Delineamento experimental
O experimento realizado teve como objetivo determinar a existência ou não de
influencia dos hormônios gonadais no aumento da atividade da ECA2 central no controle da
ingestão de sódio e água. Em outro bloco de experimentos, procedeu-se a microinjeção do
bloqueador do receptor Mas de ANG(1-7), o A779 afim de avaliar seu efeito sobre a resposta
dipsogênica e natriorexigênica sob a interferência ou não de hormônios gonadais.
No presente estudo, dois Blocos de Experimentos foram realizados e os animais foram
divididos em grupos experimentais conforme descrito abaixo:
Bloco de Experimento com a ativação da ECA2. Neste bloco, machos e fêmeas,
previamente submetidos aos respectivos protocolos de manipulação dos hormônios esteróides
gonadais, foram depletados de sódio e água e receberam, 30 min antes da reapresentação de
fluidos, a microinjeção icv do ativador direto da ECA2, DIZE (40 nmol/2μL/animal)
(adaptado de MECCA et al 2011). Estes animais estavam distribuídos nos seguintes
grupos(com „n‟ de 10-12 animais por grupo):
1) fêmeas ovariectomizadas tratadas com óleo s.c. + veículo i.c.v. (OVXV);
2) fêmeas ovariectomizadas tratadas com óleo s.c. + DIZE i.c.v. (OVXD);
3) fêmeas ovariectomizadas tratadas com estrógeno s.c. + veículo i.c.v. (OVXEV);
4) fêmeas ovariectomizadas tratadas com estrógeno s.c.+ DIZE i.c.v. (OVXED);
5) machos orquiectomizados + veículo i.c.v. (ORQXV);
6) machos orquiectomizados + DIZE i.c.v. (ORQXD);
7) machos SHAM + veículo i.c.v. (SHAMV); e,
8) machos SHAM + DIZE i.c.v. (SHAMD).
39
Bloco de Experimento com o A779:
Neste bloco, machos e fêmeas, previamente submetidos aos respectivos protocolos de
manipulação dos hormônios esteróides gonadais, foram depletados de sódio e água e
receberam, 30 min antes da reapresentação de fluidos, a microinjeção icv do bloqueador de
receptor Mas da ANG(1-7), A779 (10 nmol/2μL/animal) (adaptado de CANGUSSU et al.
2009). Estes animais foram distribuídos nos seguintes grupos (com „n‟ de 10-12 animais por
grupo):
1) fêmeas ovariectomizadas sem reposição hormonal+veículo (OVXV);
2) fêmeas ovariectomizadas sem reposição+A779 (OVXVA);
3) fêmeas ovariectomizadas com reposição+veículo (OVXEV);
4) fêmeas ovariectomizadas com reposição hormonal+A779 (OVXEA);
5) machos orquiectomizados+ veículo (ORQXV);
6) machos orquiectomizados+A779 (ORQXA);
7) machos SHAM+veículo (SHAMV);
8) machos SHAM+A779 (SHAMA).
4.8. Análise estatística
Os dados referentes ao índice uterino e IPVS, foram analisados por meio do teste t de
Student. Para análise da ingestão cumulativa de água e sódio, bem como para o IPS, os dados
foram normalizados pelo peso corporal de cada animal no dia do experimento. A análise
estatística destas variáveis foram realizadas por meio da Análise de Variância de duas vias
(ANOVA), seguido do pós-teste de Bonferroni. Foram considerados sempre dois fatores de
variação (condição hormonal versus manipulação farmacológica central). A significância de
cada um destes fatores, bem como a existência de interação entre eles foram avaliadas. O
nível crítico fixado foi de 5% para se admitir uma diferença de médias como estatisticamente
significante. Os resultados foram expressos em média ± erro padrão da média (EPM). Para
análise foi utilizado o Software GraphPad Prism, versão 5.01.
40
5. RESULTADOS
5.1. Efeito da gonadectomia em machos e fêmeas.
Nesse estudo foi observado que o índice uterino das ratas ovariectomizadas com
reposição de estrógeno (OVXE) foi significativamente maior que o de ratas ovariectomizadas
sem reposição de estrógeno (OVXV) (0,44 ± 0,04 versus 0,08 ± 0,01 mg/100g, p < 0,001)
(Fig. 7).
Além disso, o índice das glândulas reprodutivas (Índice da próstata e vesículas
seminais - IPVS) dos machos orquiectomizados (ORQX) foi menor em comparação aos
machos com cirurgia fictícia (SHAM) (0,65±0,03 versus 0,11 ± 0,01 mg/100g de peso
corporal, p< 0,001) (Fig. 8).
0.0
0.2
0.4
0.6
***
OVXE
OVXV
Ind
ice U
teri
no
(m
g/1
00g
)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
***
SHAM
ORQX
IPV
S (
mg
/10
0g
de
PC
)
Figura 7. Efeito da ovariectomia no índice uterino de ratas castradas sem (OVXV) e com (OVXE) reposição
estrogênica. OVXV: (veículo, 0,1ml/rata/dia, durante 21 dias), n=30; OVXE (Benzoato de Estradiol,
20µg/0,1ml/rata/dia, durante 21 dias) n=23. Análise estatística: Teste t de Student. (***) p < 0,001.
Figura 8. Efeito da orquiectomia no Índice prostático e vesículas seminais (IPVS) em ratos 21 dias após a
cirurgia fictícia (SHAM), n=26 ou 21 dias após orquiectomia (ORQX), n=24. Análise estatística: Teste t de
Student. (***) p < 0,001.
41
5.2. Estudo da participação da ECA2 encefálica na ingestão induzida de água e de NaCl
0,3M em ratas.
Após análise dos dados obtidos, em ratas, nenhuma diferença foi observada na
ingestão de água em nenhum dos tempos e para nenhum dos fatores de variação estudados,
não havendo interação significativa deles (i.e. fator hormonal ou fator manipulação
farmacológica central; Fig. 9).
Quando da análise dos dados de ingestão de NaCl 0,3M, nenhuma diferença foi
observada em nenhum dos tempos e para nenhum dos fatores de variação estudados,
tampouco houve interação (Fig. 10).
Da mesma forma que as variáveis anteriores, o índice de preferência ao sódio não
diferiu em nenhum dos tempos e para nenhum dos fatores de variação estudados, não havendo
também interação (Fig. 11).
42
LCEa DIZE0
1
2
3
4
5
OVXE
OVXV
Ing
estã
o d
e á
gu
a (
ml/100g
)
LCEa DIZE0
1
2
3
4
5
Ing
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gu
a (
ml/100g
)
LCEa DIZE0
1
2
3
4
5
Ing
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ml/100g
)
LCEa DIZE0
1
2
3
4
5
Ing
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ml/100g
)
LCEa DIZE0
1
2
3
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ml/100g
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LCEa DIZE0
1
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LCEa DIZE0
1
2
3
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5
Ing
estã
o d
e á
gu
a (
ml/100g
)
LCEa DIZE0
5
10
15
20
25
Ing
estã
o d
e á
gu
a (
ml/100g
)
BA
C D
E F
G H
Figura 9. Efeito do DIZE (40 nmol/2μL.) na ingestão cumulativa de água em fêmeas sem (OVXV) e com
(OVXE) reposição hormonal. Volumes de ingestão cumulativa em 15 (Painel A), 30 (Painel B), 60 (Painel C),
90 (Painel D), 120 (Painel E), 180 (Painel F), 240 (Painel G) minutos e 24 horas (Painel H) após a
reapresentação de fluidos. Os valores estão normalizados pelo peso corporal (mL/100g de PC). OVXE + LCEa,
n = 11; OVXE + DIZE, n = 12; OVXV + LCEa, n = 14; OVXV + DIZE, n = 16. Análise estatística: ANOVA de
duas vias, seguido do pós-teste de Bonferroni. DIZE: dimanizine aceturato; LCEa: liquido cérebro-espinhal
artificial.
43
LCEa DIZE0
2
4
6
8
OVXV
OVXE
Ing
estã
o d
e N
aC
l 0,3
M (
ml/100g
)
LCEa DIZE0
2
4
6
8
Ing
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aC
l 0,3
M (
ml/100g
)
LCEa DIZE0
2
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6
8
Ing
estã
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l 0,3
M (
ml/100g
)
LCEa DIZE0
2
4
6
8
Ing
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l 0,3
M (
ml/100g
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LCEa DIZE0
2
4
6
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M (
ml/100g
)
LCEa DIZE0
2
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l 0,3
M (
ml/100g
)
LCEa DIZE0
2
4
6
8
Ing
estã
o d
e N
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l 0,3
M (
ml/100g
)
LCEa DIZE0
5
10
15
20
Ing
estã
o d
e N
aC
l 0,3
M (
ml/100g
)
BA
C D
E F
G H
Figura 10. Efeito do DIZE (40nmol/2μL.) na ingestão cumulativa de NaCl 0,3M em fêmeas sem (OVXV) e com
(OVXE) reposição hormonal. Volumes de ingestão cumulativa em 15 (Painel A), 30 (Painel B), 60 (Painel C),
90 (Painel D), 120 (Painel E), 180 (Painel F), 240 (Painel G) minutos e 24 horas (Painel H) após a
reapresentação de fluidos. Os valores estão normalizados pelo peso corporal (mL/100g de PC) OVXE + LCEa, n
= 11; OVXE + DIZE, n = 12; OVXV + LCEa, n = 14; OVXV + DIZE, n = 16. Análise estatística: ANOVA de
duas vias, seguido do pós-teste de Bonferroni. DIZE: dimanizine aceturato; LCEa: liquido cérebro-espinhal
artificial.
44
LCEa DIZE0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
OVXV
OVXEIP
S
LCEa DIZE0.0
0.5
1.0
1.5
IPS
LCEa DIZE0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
IPS
LCEa DIZE0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
IPS
LCEa DIZE0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
IPS
LCEa DIZE0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
IPS
LCEa DIZE0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
IPS
LCEa DIZE0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
IPS
BA
C D
E F
G H
Figura 11. Efeito do DIZE (40 nmol/2μL) no índice de preferência ao sódio (IPS) em fêmeas ovariectomizadas
com (OVXE) e sem (OVXV) reposição hormonal após ingestão induzida. Volumes de ingestão cumulativa em
15 (Painel A), 30 (Painel B), 60 (Painel C), 90 (Painel D), 120 (Painel E), 180 (Painel F), 240 (Painel G) minutos
e 24 horas (Painel H) após a reapresentação de fluidos. Os valores estão normalizados pelo peso corporal
(mL/100g de PC) OVXE + LCEa, n = 11; OVXE + DIZE, n = 12; OVXV + LCEa, n = 14; OVXV + DIZE, n =
16. Análise estatística: ANOVA de duas vias, seguido do pós-teste de Bonferroni. DIZE: dimanizine aceturato;
LCEa: liquido cérebro-espinhal artificial.
45
5.3. Estudo da participação do receptor Mas encefálico na ingestão induzida de água e
de NaCl 0,3M em ratas:
Na figura 12, os resultados mostraram que 30 min após a reapresentação de fluidos
(Painel B), ocorre uma forte tendência para a significância do fator hormonal sobre a ingestão
de água [F (1,33) = 3,74, p=0,062], com provável redução na ingestão de água nas ratas
OVXV em comparação com as ratas OVXE. No entanto, nos tempos 60 (Painel C), 90 (Painel
D), 120 (Painel E), 180 (Painel F), 240 min (Painel G), e 24 h (Painel H), já se observou
diferença significativa para o fator hormonal [F(1,33) = 6,43, p=0,016; F(1,33) = 5,64,
p<0,05; F(1,33) = 4,83, p<0,05; F(1,33) = 4,40, p<0,05 e F(1,33)= 26,50, p<0,001
respectivamente], com menor ingestão de água nos animais OVXV em comparação com os
animais OVXE. Nas ratas tratadas com A779, nestes mesmos tempos, o pós-teste de
Bonferroni, foi capaz de identificar menor ingestão de água em fêmeas OVXV + A779 que
nas OVXE + A779 (p < 0,05).
Para a ingestão cumulativa de água, 24h após a reapresentação de fluidos, o mesmo
pós-teste revelou uma menor média em ratas OVXV que em ratas OVXE, independente da
administração central das drogas (p < 0,01 e p < 0,001, respectivamente tratadas com LCEa
ou A779, Fig. 15 H).
Na figura 13, painel H, após a análise de variância de duas vias, observou-se que a
ingestão cumulativa de NaCl 0,3M em fêmeas, 24h após a reapresentação de fluidos, sofre
influência da interação dos fatores estudados (i.e. fator hormonal versus fator manipulação
farmacológica central) [F(1,33)= 6,57, p=0,015]. Após a aplicação do pós-teste de Bonferroni,
verificou-se que a ingestão de NaCl 0,3 M foi maior nos animais OVXV + A779 que nos
animais OVXE + A779 (p < 0,05), e também maior quando comparado aos animais OVXV +
LCEa (p < 0,05).
D
46
LCEa A7790
1
2
3
4
5
OVXV
OVXE
Ing
estã
o d
e á
gu
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ml/100g
)
LCEa A7790
1
2
3
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5
Ing
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gu
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ml/100g
)
LCEa A7790
1
2
3
4
5
*
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gu
a (
ml/100g
)
LCEa A7790
1
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3
4
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gu
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ml/100g
)
LCEa A7790
1
2
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5
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ml/100g
)
LCEa A7790
1
2
3
4
5
*
Ing
estã
o d
e á
gu
a (
ml/100g
)
LCEa A7790
1
2
3
4
5
*
Ing
estã
o d
e á
gu
a (
ml/100g
)
LCEa A7790
5
10
15
20
25 *****
Ing
estã
o d
e á
gu
a (
ml/100g
)
A B
C D
E F
G H
Figura 12. Efeito do A779 (10 nmol/2μL.) na ingestão cumulativa de água em fêmeas sem (OVXV) e com
(OVXE) reposição hormonal. Volumes de ingestão cumulativa em 15 (Painel A), 30 (Painel B), 60 (Painel C),
90 (Painel D), 120 (Painel E), 180 (Painel F), 240 (Painel G) minutos e 24 horas (Painel H) após a
reapresentação de fluidos. Os valores estão normalizados pelo peso corporal (ml/100g de PC) OVXE + LCEa, n
= 10; OVXE + A779, n = 11; OVXV + LCEa, n = 7; OVXV + A779, n = 9. Análise estatística: ANOVA de duas
vias, seguido do pós-teste de Bonferroni. A779: D-Ala7-Ang (1-7); LCEa: liquido cérebro-espinhal artificial. (*)
p < 0,05; (**) p < 0,01; (***) p < 0,001.
47
LCEa A7790
2
4
6OVXE
OVXVIn
gestã
o d
e N
aC
l 0,3
M (
ml/100g
)
LCEa A7790
2
4
6
Ing
estã
o d
e N
aC
l 0,3
M (
ml/100g
)
LCEa A7790
2
4
6
Ing
estã
o d
e N
aC
l 0,3
M (
ml/100g
)
LCEa A7790
2
4
6
Ing
estã
o d
e N
aC
l 0,3
M (
ml/100g
)
LCEa A7790
2
4
6
Ing
estã
o d
e N
aC
l 0,3
M (
ml/100g
)
LCEa A7790
2
4
6
Ing
estã
o d
e N
aC
l 0,3
M (
ml/100g
)
LCEa A7790
2
4
6
Ing
estã
o d
e N
aC
l 0,3
M (
ml/100g
)
LCEa A7790
5
10
15 **
Ing
estã
o d
e N
aC
l 0,3
M (
ml/100g
)
A B
C D
E F
G H
Figura 13. Efeito do A779 (10 nmol/2μL.) na ingestão cumulativa de sódio em fêmeas sem (OVXV) e com
(OVXE) reposição hormonal. Volumes de ingestão cumulativa em 15 (Painel A), 30 (Painel B), 60 (Painel C),
90 (Painel D), 120 (Painel E), 180 (Painel F), 240 (Painel G) minutos e 24 horas (Painel H) após a
reapresentação de fluidos. Os valores estão normalizados pelo peso corporal (mL/100g de PC) OVXE + LCEa, n
= 10; OVXE + A779, n = 11; OVXV + LCEa, n = 7; OVXV + A779, n = 9. Análise estatítica: ANOVA de duas
vias, seguido do pós-teste de Bonferroni. A779: D-Ala7-Ang (1-7); LCEa: liquido cérebro-espinhal artificial. (*)
p < 0,05.
48
Os dados referentes ao IPS em fêmeas (Fig. 14), revelam que há interferência
significativa do fator hormonal nos tempos 60 (Painel C), 90 (Painel D), 120 (Painel E) e 180
(Painel F) minutos, sendo F(1,33)= 4,37, p<0,05; F(1,33)= 7,26; p=0,011; F (1,33)= 5,63,
p<0,05 e F(1,33)= 7,76, p<0,01, respectivamente, com maior preferência por sódio nos
animais OVXV, em comparação com os animais OVXE. Nestes tempos, o pós-teste de
Bonferroni foi capaz de detectar diferença apenas nos animais OVXV + A779 em
comparação com os animais OVXE + A779. Após 24h da reapresentação de fluidos (Painel
H), foi observada significância para o efeito do fator condição hormonal (F(1,33) = 6,02, p<
0,05), bem como para a interação de ambos os fatores [F(1,33) = 8,81, p<0,01 (0,66 ± 0,12
versus 0,24 ± 0,03, p<0,001)]. Após a aplicação do pós-teste de Bonferroni, verificou-se que o
IPS foi maior nos animais OVXV + A779 que nos animais OVXE + A779 (p < 0,001), e
também maior quando comparado aos animais OVXV + LCEa (p < 0,01).
49
LCEa A7790.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0OVXV
OVXE
IPS
LCEa A7790.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
IPS
LCEa A7790.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
IPS
LCEa A7790.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0 *
IPS
LCEa A7790.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0 *
IPS
LCEa A7790.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
IPS
LCEa A7790.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
*****
IPS
LCEa A7790.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0 *
IPS
A B
C D
E F
G H
Figura 14. . Efeito do A779 (10 nmol/2μL.) no índice de preferência ao sódio (IPS) em fêmeas sem (OVXV) e
com (OVXE) reposição hormonal. Volumes de ingestão cumulativa em 15 (Painel A), 30 (Painel B), 60 (Painel
C), 90 (Painel D), 120 (Painel E), 180 (Painel F), 240 (Painel G) minutos e 24 horas (Painel H)após a
reapresentação de fluidos. Os valores estão normalizados pelo peso corporal (mL/100g de PC) OVXE + LCEa, n
= 10; OVXE + A779, n = 11; OVXV + LCEa, n = 7; OVXV + A779, n = 9. Análise estatítica: ANOVA de duas
vias, seguido do pós-teste de Bonferroni. A779: D-Ala7-Ang (1-7); LCEa: liquido cérebro-espinhal artificial.
(**) p < 0,01; (***) p < 0,001.
D G H
50
5.4. Estudo da participação da ECA2 encefálica na ingestão induzida de água e de
NaCl 0,3M em ratos.
Em machos tratados intracerebroventricularmente com DIZE ou seu veículo (Fig. 15),
observa-se que após 15 (Painel A) e 30 (Painel B) min, a ingestão induzida de água sofreu
interferência da interação dos fatores estudados (fator hormonal e fator manipulação
farmacológica central) [F(1,29)=6,62, p=0,015 e F(1,28)=5,91, p<0,05 respectivamente]. Aos
15 min (Fig. 12 A) os animais ORQX + LCEa ingeriram mais água que os SHAM + LCEa (p
< 0,05), o que não se observou nos animais tratados com DIZE. Ademais, até o tempo 30 min
(Fig. 15 B), os animais SHAM + DIZE ingeriram mais água que os animais SHAM + LCEa
(p < 0,01).
Também observou-se significância estatística para o fator hormonal no tempo 240 min
(Fig. 15 G) [F(1,28)=4,19, p<0,05], com menor ingestão de água nos animais ORQX, em
comparação com os animais SHAM, independentemente da manipulação farmacológica
central.
É digno de nota que, na análise da ingestão cumulativa de água em 24 h (Painel H), foi
observada tendência para significância do fator hormonal [F(1, 1,28) =3,15, p=0,087], com
possibilidade de reduzida ingestão nos animais ORQX em comparação com os SHAM.
Para a ingestão de NaCl 0,3M em machos (Fig. 16), a análise estatística revelou haver
significância somente na ingestão cumulativa até o tempo de 15 min (Painel A), onde foi
observada diferença para o fator hormonal [F(1,33)=4,29, p<0,05], com menor ingestão
cumulativa de NaCl 0,3 M nos animais ORQX em comparação com os animais SHAM. Nos
demais tempos estudados não foi observada diferença estatística para nenhum dos fatores.
O índice de preferência ao sódio (IPS) em machos submetidos a ingestão induzida de
sódio e água pelo protocolo utilizado neste trabalho não diferiu entre os grupos em nenhum
dos tempos propostos no estudo, e tampouco sofreu influência da interação ou, isoladamente,
dos fatores de variação aqui investigados (Fig. 17).
51
LCEa DIZE0
1
2
3
SHAM
ORQX
*
Ing
estã
o d
e á
gu
a (
ml/100g
)
LCEa DIZE0
1
2
3
**
Ing
estã
o d
e á
gu
a (
ml/100g
)
LCEa DIZE0
1
2
3
Ing
estã
o d
e á
gu
a (
ml/100g
)
LCEa DIZE0
1
2
3
Ing
estã
o d
e á
gu
a (
ml/100g
)
LCEa DIZE0
1
2
3
Ing
estã
o d
e á
gu
a (
ml/100g
)
LCEa DIZE0
1
2
3
Ing
estã
o d
e á
gu
a (
ml/100g
)
LCEa DIZE0
1
2
3
Ing
estã
o d
e á
gu
a (
ml/100g
)
LCEa DIZE0
5
10
15
20
25
Ing
estã
o d
e á
gu
a (
ml/100g
)
BA
C D
E F
G H
Figura 15. Efeito do DIZE (40 nmol/2μL) na ingestão cumulativa de água em machos com cirurgia fictícia
(SHAM) e orquiectomizados (ORQX). Volumes de ingestão cumulativa em 15 (Painel A), 30 (Painel B), 60
(Painel C), 90 (Painel D), 120 (Painel E), 180 (Painel F), 240 (Painel G) minutos e 24 horas (Painel H) após a
reapresentação de fluidos. Os valores estão normalizados pelo peso corporal (mL/100g de PC) SHAM + LCEa, n
= 10; SHAM + DIZE, n = 10; ORQX + LCEa, n = 9; ORQX + DIZE, n = 10. Análise estatística: ANOVA de
duas vias, seguido do pós-teste de Bonferroni. DIZE: dimanizine aceturato; LCEa: liquido cérebro-espinhal
artificial. (*) p < 0,05; (**) p < 0,01.
52
LCEa DIZE0
2
4
6
8SHAM
ORQX
Ing
estã
o d
e N
aC
l 0,3
M (
ml/100g
)
LCEa DIZE0
2
4
6
8
Ing
estã
o d
e N
aC
l 0,3
M (
ml/100g
)
LCEa DIZE0
2
4
6
8
Ing
estã
o d
e N
aC
l 0,3
M (
ml/100g
)
LCEa DIZE0
2
4
6
8
Ing
estã
o d
e N
aC
l 0,3
M (
ml/100g
)
LCEa DIZE0
2
4
6
8
Ing
estã
o d
e N
aC
l 0,3
M (
ml/100g
)
LCEa DIZE0
2
4
6
8
Ing
estã
o d
e N
aC
l 0,3
M (
ml/100g
)
LCEa DIZE0
2
4
6
8
Ing
estã
o d
e N
aC
l 0,3
M (
ml/100g
)
LCEa DIZE0
5
10
15
20
Ing
estã
o d
e N
aC
l 0,3
M (
ml/100g
)
A B
C D
E F
G H
Figura 16. Efeito do DIZE (40 nmol/2μL) na ingestão cumulativa de NaCl 0,3M em machos com cirurgia
fictícia (SHAM) e orquiectomizados (ORQX). Volumes de ingestão cumulativa em 15 (Painel A), 30 (Painel B),
60 (Painel C), 90 (Painel D), 120 (Painel E), 180 (Painel F), 240 (Painel G) minutos e 24 horas (Painel H)após a
reapresentação de fluidos. Os valores estão normalizados pelo peso corporal (mL/100g de PC). SHAM + LCEa,
n = 10; SHAM + DIZE, n = 10; ORQX + LCEa, n = 9; ORQX + DIZE, n = 10. Análise estatística: ANOVA de
duas vias, seguido do pós-teste de Bonferroni. DIZE: dimanizine aceturato; LCEa: líquido cérebro-espinhal
artificial
53
LCEa DIZE0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
SHAM
ORQX
IPS
LCEa DIZE0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
IPS
LCEa DIZE0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
IPS
LCEa DIZE0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
IPS
LCEa DIZE0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
IPS
LCEa DIZE0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
IPS
LCEa DIZE0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
IPS
LCEa DIZE0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
IPS
A B
C D
E F
G H
Figura 17. Efeito do DIZE (40 nmol/2μL) no índice de preferência ao sódio (IPS) em machos com cirurgia
fictícia (SHAM) e orquiectomizados (ORQX). Volumes de ingestão cumulativa em 15 (Painel A), 30 (Painel B),
60 (Painel C), 90 (Painel D), 120 (Painel E), 180 (Painel F), 240 (Painel G) minutos e 24 horas (Painel H) após a
reapresentação de fluidos. Os valores estão normalizados pelo peso corporal (mL/100g de PC) SHAM + LCEa, n
= 10; SHAM + DIZE, n = 10; ORQX + LCEa, n = 9; ORQX + DIZE, n = 10. Análise estatística: ANOVA de
duas vias, seguido do pós-teste de Bonferroni. DIZE: dimanizine aceturato; LCEa: liquido cérebro-espinhal
artificial.
54
5.5. Estudo da participação do receptor Mas encefálico na ingestão induzida de água e
de NaCl 0,3M em ratos.
No estudo seguinte, os resultados demonstram não haver diferença estatística para
nenhum dos fatores e em nenhum dos tempos estudados para ingestão de água em machos
(Fig. 18).
Para ingestão de sódio em machos (Fig. 19), evidenciou-se que nos tempos 30 (Painel
B), 60 (Painel C), 90 (Painel D), 120 (Painel E), 180 (Painel F) e 240 minutos (Painel G) há
interação dos fatores estudados (fator manipulação farmacológica central versus fator
hormonal), sendo, F (1,16)= 7,31, p<0,05 para 30 minutos; F (1,16)= 6,15, p<0,05 para 60
minutos; F (1,16)= 6,14, p<0,05 para 90 minutos; F (1,16)= 5,64, p<0,05 para 120 minutos; F
(1,16)= 5,33, p<0,05 para 180 minutos; e F (1,16)= 6,22, p<0,05 para 240 minutos. Após a
aplicação do pós-teste de Bonferroni, verificou-se que a ingestão de NaCl 0,3 M foi menor
nos animais ORQX + A779 que nos animais ORQX + LCEa (p < 0,05) (Painéis C, D, E, F e
G). Nos demais tempos estudados não foi observada nenhuma diferença estatística (Fig. 19).
O índice de preferência ao sódio (IPS) em machos (Fig. 20) não sofreu influência da
interação dos fatores de variação utilizados neste estudo. Isoladamente, estes fatores também
não afetaram estatisticamente o IPS em nenhum dos tempos estudados.
D
E F
G H
A B
55
LCEa A7790.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5 SHAM
ORQXIn
gestã
o d
e á
gu
a (
ml/100g
)
LCEa A7790.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Ing
estã
o d
e á
gu
a (
ml/100g
)
LCEa A7790.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Ing
estã
o d
e á
gu
a (
ml/100g
)
LCEa A7790.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Ing
estã
o d
e á
gu
a (
ml/100g
)
LCEa A7790.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Ing
estã
o d
e á
gu
a (
ml/100g
)
LCEa A7790.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Ing
estã
o d
e á
gu
a (
ml/100g
)
LCEa A7790.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Ing
estã
o d
e á
gu
a (
ml/100g
)
LCEa A7790
5
10
15
20
25
Ing
estã
o d
e á
gu
a (
ml/100g
)
A B
C D
E F
G H
Figura 18. . Efeito do A779 (10 nmol/2μL) na ingestão cumulativa de água em machos com cirurgia fictícia
(SHAM) e orquiectomizados. Volumes de ingestão cumulativa em 15 (Painel A), 30 (Painel B), 60 (Painel C),
90 (Painel D), 120 (Painel E), 180 (Painel F), 240 (Painel G) minutos e 24 horas (Painel H) após a
reapresentação de fluidos. Os valores estão normalizados pelo peso corporal (mL/100g de PC) SHAM + LCEa, n
= 5; SHAM + A779, n = 5; ORQX + LCEa, n = 5; ORQX + A779, n = 5. Análise estatítica: ANOVA de duas
vias, seguido do pós-teste de Bonferroni. DIZE: dimanizine aceturato; LCEa: liquido cérebro-espinhal artificial.
56
LCEa A7790
2
4
6
8SHAM
ORQXIn
gestã
o d
e N
aC
l 0,3
M (
ml/100g
)
LCEa A7790
2
4
6
8
Ing
estã
o d
e N
aC
l 0,3
M (
ml/100g
)
LCEa A7790
2
4
6
8
*
Ing
estã
o d
e N
aC
l 0,3
M (
ml/100g
)
LCEa A7790
2
4
6
8
*
Ing
estã
o d
e N
aC
l 0,3
M (
ml/100g
)
LCEa A7790
2
4
6
8
*
Ing
estã
o d
e N
aC
l 0,3
M (
ml/100g
)
LCEa A7790
2
4
6
8
*
Ing
estã
o d
e N
aC
l 0,3
M (
ml/100g
)
LCEa A7790
2
4
6
8
*
Ing
estã
o d
e N
aC
l 0,3
M (
ml/100g
)
LCEa A7790
2
4
6
8
Ing
estã
o d
e N
aC
l 0,3
M (
ml/100g
)
A B
C D
E F
G H
Figura 19. Efeito do A779 (10 nmol/2μL) na ingestão cumulativa de sódio em machos com cirurgia fictícia
(SHAM) e orquiectomizados (ORQX). Volumes de ingestão cumulativa em 15 (Painel A), 30 (Painel B), 60
(Painel C), 90 (Painel D), 120 (Painel E), 180 (Painel F), 240 (Painel G) minutos e 24 horas (Painel H) após a
reapresentação de fluidos. Os valores estão normalizados pelo peso corporal (mL/100g de PC) SHAM + LCEa, n
= 5; SHAM + A779, n = 5; ORQX + LCEa, n = 5; ORQX + A779, n = 5. Análise estatítica: ANOVA de duas
vias, seguido do pós-teste de Bonferroni. DIZE: dimanizine aceturato; LCEa: liquido cérebro-espinhal artificial.
(*) p < 0,05.
57
LCEa A7790.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
SHAM
ORQXIP
S
LCEa A7790.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
IPS
LCEa A7790.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
IPS
LCEa A7790.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
IPS
LCEa A7790.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
IPS
LCEa A7790.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
IPS
LCEa A7790.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
IPS
LCEa A7790.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
IPS
A B
C D
E F
G H
Figura 20. Índice de Preferência ao Sódio em machos com cirurgia fictícia (SHAM) e orquiectomizados
(ORQX) microinjetados com A779 ou LCEa. Volumes de ingestão cumulativa em 15 (Painel A), 30 (Painel B),
60 (Painel C), 90 (Painel D), 120 (Painel E), 180 (Painel F), 240 (Painel G) minutos e 24 horas (Painel H) após a
reapresentação de fluidos. Os valores estão normalizados pelo peso corporal (mL/100g de PC) SHAM + LCEa, n
= 5; SHAM + A779, n = 5; ORQX + LCEa, n = 5; ORQX + A779, n = 5. Análise estatítica: ANOVA de duas
vias, seguido do pós-teste de Bonferroni. D-Ala7-Ang (1-7)(A779); LCEa: liquido cérebro-espinhal artificial.
58
6. DISCUSSÃO
Os resultados obtidos no presente trabalho mostram, pela primeira vez, a atuação dos
hormônios gonadais masculinos e femininos no eixo ECA2/ANG-(1-7)/Mas cerebral,
regulando os comportamentos ingestivos de sódio e água em ratos e ratas, bem como a ação
deste eixo, per si, sobre o apetite por sódio.
A participação de hormônios gonadais masculinos e femininos nestes comportamentos
já tem sido amplamente demonstrada (CURTIS, 2009; EPSTEIN, 1992). No entanto, os
mecanismos neuroendócrinos reguladores das mudanças no comportamento ingestivo de água
e sódio em ambos os sexos permanecem ainda obscuros e contraditórios.
Um dos possíveis mecanismos que constituiu o foco deste estudo foi a provável
influência dos hormônios gonadais em paralelo ao eixo ECA2/ANG-(1-7)/Mas, supostamente
contrarregulatório ao eixo ECA/ANGII/AT1 que reconhecidamente promovem dentre outros
efeitos, a sede e apetite ao sódio.
A distribuição de ECA2 no encéfalo de ratos foi identificada em áreas envolvidas na
regulação central da função cardiovascular e do controle do balanço hidroeletrolítico, tais
como o OVLT, o OSF, o NPV, o NTS, núcleo ambíguo, BVLR e AP (DOOBAY et al.,
2007). Assim, sugerimos que a ECA2 deve, potencialmente, participar não apenas da
regulação da função cardiovascular, bem como da homeostase dos líquidos corporais. Como
por exemplo, sobre aqueles que modulam ou determinam os comportamentos de ingestão de
sódio e água. Paralelamente, estes mecanismos poderiam sofrer interferência dos hormônios
gonadais.
Inicialmente, verificamos que os modelos utilizados de manipulação hormonal foram
eficazes em abolir ou reestabelecer as ações mais conhecidas dos hormônios de interesse. Isto
foi observado pela significativa redução nos índices prostático e da vesícula seminal de ratos
orquiectomizados, quando comparados aos animais submetidos a cirurgia fictícia. Em ratas
ovariectomizadas, a administração diária de estrógeno por 21 dias, elevou o índice uterino a
valores encontrados por Mecawi e colaboradores (2008) em ratas adultas submetidas a um
protocolo de reposição semelhante ao utilizado neste experimento. Já é bem conhecido que
59
ratas submetidas à ovariectomia bilateral apresentam diminuição nas concentrações
plasmáticas de 17β-estradiol, sendo detectados valores muito baixos deste hormônio já ao
final do 7º dia após o procedimento cirúrgico (HERNÁNDEZ et al., 2000). Além disso, o
protocolo utilizado é amplamente adotado por diversos grupos de pesquisa que investigam a
função dos mesmos hormônios gonadais (JONES; CURTIS, 2009; KRAUSE et al., 2003;
MECAWI et al., 2007).
Utilizando os modelos experimentais anteriormente citados, buscamos avaliar a
resposta comportamental de ingestão de sódio e água após a ativação da ECA2, com DIZE
administrado icv, em machos e fêmeas submetidos a protocolos distintos de manipulação de
seus hormônios gonadais.
O efeito ativador da ECA2 pelo DIZE administrado centralmente foi descrito por
MECCA e colaboradores (2011) em protocolo distinto do nosso, já que os autores
administraram cronicamente, enquanto que em nosso estudo o tratamento foi agudo e em dose
única. Segundo os autores, os efeitos obtidos de diminuição do tamanho do infarto cerebral e
do déficit neurológico mensurado 72 horas após o infarto, foram mediados pela ativação dos
receptores Mas por meio da conversão elevada da ANGII em ANG(1-7) através da ação da
ECA2. Isto se opõe aos efeitos da ANGII ligadas ao seu receptor AT1.
Nas fêmeas ovariectomizadas com ou sem a reposição de estrógeno e que receberam
DIZE ou seu veículo, os comportamentos de ingestão hídrica, de NaCl 0,3 M, bem como o
índice de preferência por sódio, induzidos pelo protocolo de depleção de sódio, não sofreram
qualquer interferência de nenhum dos fatores estudados [i.e.: efeito da administração do DIZE
(fator manipulação farmacológica central), ou do estrógeno (fator hormonal)] em nenhum dos
tempos estudados. Num estudo prévio, no qual os autores utilizaram um vetor viral para a
transfecção do gene da ECA2 humana, foi demonstrado que a expressão elevada desta enzima
influencia a regulação central da função cardiovascular e da homeostase dos fluidos corporais
(FENG et al., 2008). Segundo os autores, a elevação da expressão desta enzima resulta em
redução da expressão de receptores AT1 responsáveis pelos efeitos mediados por ANGII.
Portanto, assumindo o possível efeito contrarregulatório da ECA2, nossa hipótese era a de que
a ativação desta enzima com o DIZE fosse capaz de inibir a ingestão de água, mas sobretudo
de NaCl 0,3M e a preferência por sódio, o que não foi observado. Deve-se ressaltar aqui que o
60
protocolo de depleção de sódio utilizado evoca uma ingestão mais expressiva de sódio do que
propriamente de água.
Da mesma forma, o tratamento hormonal crônico com estrógeno nas ratas tratadas
com DIZE ou seu veículo não afetou nenhuma das variáveis estudadas, induzidas pelo
protocolo de depleção de sódio associado a oferta de dieta pobre em sódio. Assim, podemos
especular que o eixo ECA2/ANG(1-7)/Mas dos substratos neurobiológicos da gênese da sede
e do apetite por sódio induzidos por este protocolo, parecem permanecer estáveis e em
equilíbrio com o eixo ECA/ANGII/AT1. Além disso, diante do achado de que a ativação da
ECA2 com o DIZE não afetou o comportamento de ingestão de água, aventamos a
possibilidade da não participação do eixo ECA2/ANG(1-7)/Mas na ingestão induzida de água
e sódio pelo protocolo de depleção de sódio utilizado neste estudo.
Deve-se destacar aqui que a busca por fármacos com eficiência na ativação da ECA2
está em fase inicial e muito sigilo e restrição de acesso gira em torno da disponibilização
destas promissoras drogas para o tratamento de doenças cardiovasculares. Neste sentido, o
DIZE, droga gentilmente cedida pelo Prof. Robson Santos (UFMG), tem eficiência e DE50
ainda pouco definidas, sobretudo para administração intracerebroventricular
Em relação aos efeitos inibitórios do E2 no comportamento ingestivo de água e sódio,
recentemente Dalmasso e colaboradores (2011), utilizaram o modelo experimental de ratas
ovariectomizadas e ratas ciclando normalmente. Os autores promoveram indução do apetite
por sódio pelo uso de furosemida e dieta pobre em sódio, as fêmeas com reposição hormonal
e fêmeas no estro exibiram um significante decréscimo na ingestão de sódio induzida,
comparável a ratas em diestro ou somente ovariectomizadas. Entretanto, estes achados não
foram reproduzidos em nossos animais.
Ademais, deve-se apontar aqui estudo prévio que mostra que a reposição estrogênica
em ratas ovariectomizadas induz a redução de 20 a 30% nos níveis de RNAm (RNA
mensageiro) que decodifica o receptor AT1 na glândula pituitária (KISLEY; SAKAI;
FLUHARTY, 1999). Adicionalmente, foi relatado por outros autores que a presença de
receptores estrogênicos em neurônios do OSF, atuam reduzindo a ligação da ANGII ao
receptor AT1, bem como diminuindo o número de neurônios que expressam este receptor,
resultando na regulação da resposta dipsogênica em ratas (MECAWI et al., 2007; TANAKA
61
et al., 2003). Neste contexto, outras estruturas encefálicas foram descritas como sendo
influenciadas pela ação do E2, desenvolvendo respostas neuroendócrinas de controle da
ingestão hídrica, tais como o i) MnPO, o qual recebe projeções do OSF; ii) o NPV envolvido
na gênese da sede; iii) o NTS; iv) BVL e; v) o NPB são exemplos de que o E2 deve modular a
ativação de vias encefálicas para respostas a estímulos osmóticos(CURTIS, 2009; ROSAS-
ARELLANO; SOLANO-FLORES; CIRIELLO, 1999; TANAKA; NOMURA, 1993).
Ji et al (2008) implicaram as mudanças nos níveis de estradiol como principal fator
responsável pela regulação da atividade da ECA2. Em seu estudo, os autores observaram que
a ovariectomia resultou em uma redução substancial na atividade da ECA2 renal, sendo esta
revertida pela reposição hormonal no modelo de hipertensão renal. Outro estudo concluiu que
fêmeas cronicamente tratadas com E2 respondem às mudanças na osmolalidade plasmática e
a concentração de ANGII estimulando a ingestão de água e/ou liberação de VP, ao contrario
de fêmeas ovariectomizadas que apresentam resposta reduzida para este fator. (AKAISHI;
HOMMA, 1996). No entanto, apesar destas evidências, em nosso estudo nenhum efeito foi
observados nos comportamentos de ingestão estudados nas ratas com ou sem reposição
hormonal, tampouco com ou sem a ativação da ECA2.
Em ratas, a análise de variância revelou que a ausência do estrógeno reduz a ingestão
cumulativa induzida de água em todos os tempos estudados, exceto nos tempos mais precoces
de 15 e 30 min. Ademais, a administração do antagonista de receptores Mas não afetou este
comportamento, em nenhum dos tempos estudados.
Distintamente, a ingestão cumulativa de sódio não sofreu influência do fator hormonal
e tampouco da administração de A779 em nenhum dos tempos estudados, exceto na ingestão
cumulativa em 24h após a administração de fluidos. Apenas neste tempo, observou-se que o
bloqueio do receptor Mas foi capaz de elevar a ingestão de sódio em ratas OVXV, quando
comparadas a ratas OVXV tratadas com LCEa ou comparadas a ratas OVXE que também
receberam A779. Este achado sugere que a longo prazo, provavelmente por meio de ação
genômica, os receptores Mas são determinantes da redução da ingestão induzida de sódio em
ratas castradas. Porém, na presença do estrógeno, este receptor não parece exercer papel
relevante no controle deste mesmo comportamento, ao menos quando induzido pelo protocolo
utilizado neste estudo.
62
Quando a preferência ao sódio foi investigada pelo IPS, uma significativa elevação da
preferência foi observada em ratas OVXV em comparação com as OVXE, independente da
administração icv do A779 ou do seu veículo. Este achado, tomado em conjunto com os
discutidos anteriormente, sugere que, apesar da não observância da influência do fator
hormonal no comportamento de ingestão de sódio, a constatação da redução da sede em ratas
OVXV foi responsável pela elevação do IPS nas ratas deste grupo.
Quando o IPS foi analisado 24h após a reapresentação de fluidos, observou-se que, na
mesma linha dos achados de ingestão de sódio nestes mesmos animais, o bloqueio do receptor
Mas foi capaz de elevar a preferência ao sódio em ratas OVXV, quando comparadas a ratas
OVXV tratadas com LCEa ou comparadas a ratas OVXE que também receberam A779. Este
achado reforça que, a longo prazo, os receptores Mas são determinantes da redução da
ingestão induzida de sódio em ratas castradas. Contudo, na presença do estrógeno, este
receptor não deve, de fato, exercer papel relevante no controle deste mesmo comportamento,
ao menos quando induzido pelo protocolo aqui utilizado.
Nos machos, observamos que os ratos submetidos à orquiectomia fictícia (SHAM),
apresentaram maior ingestão cumulativa de água aos 240 min após a reapresentação de fluido,
quando comparados aos animais orquiectomizados (ORQX) nos tempos iniciais aos 15 e 30
min. Porém, neste tempo, a administração icv de DIZE não alterou o padrão de ingestão de
água de ratos ORQX ou SHAM. Este achado sugere que os hormônios testiculares exercem
um papel potencializador da sede induzida pelo protocolo de depleção de sódio utilizado neste
estudo.
De modo interessante, a ingestão precoce de água nestes mesmos animais teve um
comportamento paradoxal. Enquanto a castração reduziu a ingestão cumulativa tardia de água
aos 240 min, a ingestão cumulativa em 15 min mostrou a ocorrência de uma maior e mais
precoce avidez por água em animais ORQX, quando comparados aos animais SHAM. Porém,
quando tratados com DIZE, este efeito foi revertido. Este achado sugere que a ativação da
ECA2, apenas em ratos ORQX, é capaz de reverter o efeito dipsogênico precoce da castração.
Considerando que a análise de variância revelou a presença de interação dos fatores de
variação estudados, aos 15 min, pode-se sugerir ainda que apenas em ratos ORQX o eixo
ECA2/ANG-(1-7)/Mas encefálico parece participar da regulação da sede precoce induzida por
este protocolo.
63
De modo ainda mais intrigante, a ingestão cumulativa de água, aos 30 min, agora
adota outro comportamento. Os achados deste tempo mostram que apenas animais não
castrados, quando tratados com DIZE, apresentam sede mais intensa, enquanto nenhum efeito
é observado quando DIZE é administrado em animais ORQX. Nos tempos seguintes este
efeito desaparece. Tomados em conjunto, pode-se especular que o efeito dipsogênico mais
tardio (i.e. observado aos 30 min) do DIZE pode ser dependente de provável ação genômica
da ativação da ECA2, dependente da presença dos hormônios testiculares, que logo
desaparece, como por exemplo a redução da expressão de receptores AT1, como observado
por FENG e colaboradores (2008). Por outro lado, o efeito precoce e inverso observado aos
15 min pode ser decorrente de ação não genômica. Escassos são os dados da literatura que
ostentem outras possibilidades.
Nossos achados, mostraram que a ingestão induzida de NaCl 0,3M em machos
orquiectomizados foi menor em comparação aos ratos SHAM, independente da ativação da
ECA2 encefálica com DIZE. Portanto, nestes animais, a ECA2 parece não influenciar a
ingestão cumulativa de sódio, induzida pelo protocolo utilizado neste estudo. É bem descrito
na literatura que os andrógenos, como a testosterona, exercem um importante papel no
dimorfismo sexual da regulação da pressão arterial. Dentre os estudos descritos, Reckelhoff e
colaboradores (1999) encontraram menor desenvolvimento de hipertensão em ratos SHR com
3 a 5 semanas de idade após a orquiectomia. Ademais, os autores descrevem o bloqueio
crônico do receptor de andrógenos reduz a pressão arterial em machos a valores comparáveis
aos encontrados em fêmeas SHR (RECKELHOFF, 2001).
Os efeitos produzidos pela testosterona foram descritos por Chow e colaboradores
(1992), neste estudo os autores observaram que a castração neonatal de ratos machos resultou
em um comportamento ingestivo ao NaCl a 3% semelhante às fêmeas continuando até a fase
adulta. A androgenização de ratas submetidas a castração neonatal com Propionato de
Testosterona, revelou que a necessidade ao sódio era semelhante aos machos. O tratamento
com Dehidrotestosterona em fêmeas no mesmo modelo anterior, sugere que o dimorfismo
sexual da ingestão de sódio é resultante da aromatização da testosterona para o estrógeno.
No que diz respeito ao índice de preferência ao sódio em machos ORQX ou SHAM,
tratados com DIZE ou seu veículo, foi observado que nenhum dos fatores de variação
64
afetaram esta variável. Contudo, dados da literatura indicam a testosterona como uma das
prováveis causas do dimorfismo sexual da ingestão de sódio em ratos. Neste estudo os autores
encontraram que machos castrados logo após o nascimento, manifestam menor apetite por
sódio, semelhante a fêmeas adultas. No mesmo estudo os autores demonstraram também que
fêmeas tratadas com testosterona no período de amamentação ingerem NaCl na mesma
proporção que machos adultos (EPSTEIN, 1992).
Quando investigamos a participação do receptor Mas encefálico nos comportamentos
ingestivos de água e NaCl 0,3 M, através da sua manipulação farmacológica com o A779, um
antagonista específico, observamos a manutenção do paradoxo que norteia a participação do
eixo ECA2/ANG-(1-7)/Mas no controle destes comportamentos em ratos e ratas submetidos
aos protocolos de manipulação hormonal deste estudo.
O estudo da participação do receptor Mas no comportamento ingestivo de água em
machos castrados ou submetidos a castração fictícia, revelou a ausência da influência dos
fatores estudados, em todos os tempos em que esta análise foi realizada.
Porém, quando a ingestão cumulativa de sódio foi analisada nestes mesmos animais,
observou-se uma significativa interação dos fatores investigados neste estudo. Para esta
variável, o pós-teste revelou que a administração de A779 a ratos ORQX reduziu a ingestão
de sódio destes animais, o que não ocorreu com os animais contendo hormônios gonadais
circulantes. Assim, estes achados sugerem que o receptor Mas exerce papel excitatório sobre a
ingestão de sódio em machos sem hormônios testiculares. Porém, na presença destes
hormônios, os receptores Mas parecem não ter papel relevante no controle da ingestão
induzida de sódio, ao menos no protocolo de indução utilizado neste estudo. Por sua vez, o
IPS não diferiu entre os grupos.
Até o presente momento, não há dados na literatura que descrevam a atuação dos
hormônios gonadais masculinos e femininos na ingestão de água e sódio resultantes da
ativação da ECA2 ou do bloqueio do receptor Mas encefálicos. Esta constatação torna este
estudo inédito e demonstra pela primeira vez os aspectos paradoxais que envolvem a
participação da ECA2 e do receptor Mas de ANG-(1-7) em machos e fêmeas submetidos a
manipulação de seus hormônios gonadais no controle destes importantes comportamentos de
regulação do balanço dos fluidos corporais.
65
66
7. CONCLUSÃO
Face ao exposto neste estudo e considerando as evidências relatadas por outros
autores, podemos concluir que:
1. A administração icv de DIZE não afeta a sede e o apetite por sódio induzidos por
depleção de sódio em ratas ovariectomizadas ou ovariectomizadas com reposição
de estrógeno;
2. A ovariectomia com ou sem reposição de estrógeno não interfere na ingestão
induzida de sódio e água;
3. A ausência do estrógeno é capaz de reduzir a ingestão induzida de água
independente do eixo ECA2/ANG(1-7)/Mas;
4. O receptor Mas participa a longo prazo, inibindo a ingestão de sódio e o índice de
preferência ao sódio, apenas na ausência de estrógeno;
5. Os hormônios gonadais masculinos atuam independentemente da atividade da
ECA2 promovendo elevação da ingestão de água e NaCl;
6. Os níveis fisiológicos de testosterona parecem suprimir os efeitos do receptor Mas
no protocolo de indução hidrossalina;
7. Os receptores Mas apresentam efeitos natriorexigênicos na ausência de hormônios
gonadais masculinos;
Desta forma concluímos que o estrógeno atua inibindo a ingestão de NaCl
independentemente do eixo ECA2/ANG(1-7)/Mas. Já os hormônios gonadais masculinos
interferem elevando a ingestão hidrossalina sem a interferência do eixo citado. Assim, este
eixo evidencia a necessidade de ampliar as pesquisas a respeito dos distúrbios
comportamentais de ingestão hidrossalina que repercutem diretamente na fisiopatologia das
doenças cardiovasculares.
67
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ANEXO A