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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE PROTOZOÁRIOS ENCONTRADOS EM FEZES E CÉREBRO DE CÃES E

DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO DE Neospora caninum NESTA ESPÉCIE ANIMAL

Doutorando (a): Vanessa Silvestre Ferreira de Oliveira Orientador (a): Profa. Dra. Andréa Caetano da Silva

GOIÂNIA 2011

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VANESSA SILVESTRE FERREIRA DE OLIVEIRA

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE PROTOZOÁRIOS

ENCONTRADOS EM FEZES E CÉREBRO DE CÃES E DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO DE Neospora caninum NESTA

ESPÉCIE ANIMAL

Tese apresentada para a obtenção do grau de Doutor em Ciência Animal junto à Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás

Área de Concentração: Sanidade Animal e Higiene e Tecnologia de alimentos

Orientador (a): Profa. Dra. Andréa Caetano da Silva - IPTSP/UFG Comitê de Orientação: Prof. Dr. Guido Fontgalland Coelho Linhares - EV/UFG Profa. Dra. Lígia Miranda Ferreira Borges - IPTSP/UFG

GOIÂNIA 2011

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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

GPT/BC/UFG

O482c

Oliveira, Vanessa Silvestre Ferreira de.

Caracterização molecular de protozoários encontrados em

fezes e cérebros de cães e diagnóstico de Neospora caninum nesta

espécie animal [manuscrito] / Vanessa Silvestre Ferreira de

Oliveira. - 2011.

78 f. : il.

Orientadora: Profª. Drª. Andréa Caetano da Silva.

Tese (Doutorado) – Universidade Federal de Goiás,

Escola de Veterinária e Zootecnia, 2011.

Bibliografia.

1. Protozoários – Diagnóstico. 2. Neospora caninum. I. Título.

CDU: 636.7:561.24

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AGRADECIMENTOS

Nestes quatro anos que se passaram, muitas pessoas contribuíram de alguma

maneira para a realização do meu doutorado, e espero conseguir transmitir o meu

eterno agradecimento a cada um.

Em primeiro lugar, agradeço a Deus por mais esse presente, pelas pessoas que

conheci nesta caminhada e por tudo que pude aprender.

À minha orientadora Andréa, por tudo que me ensinou na vida profissional e

pessoal, por ser uma amiga e até “mãe” em muitos momentos em que me

encontrei com dificuldades, sempre com disposição, bom humor e alegria.

Também pela oportunidade de viver em Madrid, aprender tantas coisas novas,

conhecer outra língua, outra cultura e pessoas que fizeram diferença na minha

vida.

A CAPES/MECD-Espanha, pela bolsa de doutorado-sanduíche que custeou todo

o meu aprendizado.

Aos meus queridos amigos Paula, Débora, Carla, Sabrina e Marcelo, por todo

apoio profissional, moral e espiritual. Por estarem do meu lado mesmo distante,

me dando força e me colocando para cima, sempre com palavras positivas e um

bom humor que contagia e que fez a diferença, tornando mais leves os problemas

do dia a dia.

Aos meninos do laboratório, Lorena, Hélio, Carol, Kennedy, Sara e Loreninha,

pelos bons e alegres momentos de tantas conversas, tantas risadas e tanto apoio.

À Cybelly, Aline, Jaires e Marcelo, pela imensa ajuda na colheita de material no

Centro de Zoonoses, sem vocês eu jamais teria conseguido.

Ao Luis Ortega-Mora, por me receber tão bem no grupo SALUVET da Universidad

Complutense de Madrid, foi uma honra conhecer e trabalhar com um profissional

tão dedicado.

Às queridas Gema e Susana, que me ensinaram tanto, com tanta paciência e

tanta disposição. Agradeço de coração tudo o que fizeram por mim, não as

esquecerei jamais.

À Esther pela idéia do projeto, por me acompanhar e orientar mesmo distante.

Aos meus amigos queridos Marta, Javi Moreno, Vanesa, Claudia e Carmen, pela

companhia e amizade, por fazerem da minha estadia em Madrid e do trabalho no

laboratório mais confortantes, como se eu realmente estivesse em casa.

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Aos companheiros de laboratório, Vero, Adri, Virgínia, Silvia, Lobo, Fran, Javier,

Alba e Elena, por tudo que me ensinaram e por me receberem tão bem, pela

companhia agradável e bem humorada, tornando o trabalho mais prazeroso.

Às minhas companheiras de apartamento, amigas eternas, Chris, Mari e Lorena.

Vocês foram minha família, minhas amigas, meu apoio. Tudo ficou tão mais fácil

perto de vocês, obrigada por tudo.

À Itsaso e Ceci, pela amizade linda que me proporcionaram, por tudo que me

ensinaram na língua espanhola e na vida. Vocês estão no meu coração para

sempre.

Aos meus pais, que me apoiaram tanto e me deram forças para agüentar a

saudade de estar longe de casa, por todo o amor a mim dedicado. Vocês são

muito importantes para mim.

Ao Ricardo, por me incentivar sempre, por estar ao meu lado em todas as

circunstâncias e por todo o amor que trouxe à minha vida. Obrigada por ser meu

amigo, amor e companheiro.

Às minhas amigas de sempre e para sempre Lili, Raquel, Clarissa, Flávia, Nicolle,

Liliana, Marina e Úrsula, que fazem parte de cada passo que dou, que torcem por

mim e que tornam minha vida mais leve e mais feliz.

Aos meus novos amigos e companheiros de trabalho no Labvet: Gabi, Rafael,

Marília e Tati, pelos bons e alegres momentos proporcionados no dia a dia.

Às minhas cadelas Sofia e Cristal, alegria dos meus dias, e, como não, a todos os

cães que participaram desse experimento, que suas vidas não tenham sido em

vão.

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“Que en la senda del vivir no ir adelante, es ir atrás; y el que a arar empieza, no ha de volver la cabeza, sino arar y proseguir.”

(Lope de Vega)

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RESUMO GERAL

Este trabalho teve como objetivos identificar os protozoários encontrados em fezes de cães, observar a ocorrência da infecção por Neospora caninum e Toxoplasma gondii em cães pela Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), desenvolver e validar técnicas de ELISA para o diagnóstico sorológico de N. caninum em cães, determinar a utilidade do Western Blot para esse diagnóstico e observar a ocorrência de DNA de N. caninum, T. gondii e Hammondia heydorni em tecido cerebral de cães. Para isso, foram colhidas amostras de cérebro e sangue de 251 cães, e fezes de 106 cães, provenientes do Centro de Zoonoses de Goiânia, Goiás. Foram utilizados oito soros de infecção experimental por N. caninum e quatro por T. gondii para comprovação dos resultados sorológicos. As amostras de fezes foram concentradas pelo método de Teleman seguido da flutuação com solução de Sheather, para visualização dos oocistos. Foi realizada a extração de DNA de todas as amostras, posteriormente analisadas por nested-PCR específicas para detecção de DNA de N. caninum, H. heydorni, T. gondii, Cryptosporidium spp. e Giardia spp. Uma nested-PCR foi ainda realizada nas amostras em que foram visualizados oocistos menores de 20 µm, para a detecção de DNA de coccídios e posterior seqüenciamento, para correta identificação dos mesmos. A técnica de RIFI foi realizada em todas as amostras de sangue, e técnicas de ELISA foram padronizadas, utilizando-se extrato solúvel de taquizoítos e as proteínas recombinantes rNcGRA7, rNcSAG4, rNcBSR4 e rNcSRS9 de N. caninum. Para a detecção de DNA dos parasitos nos cérebros, estes foram divididos em três partes, e de cada parte foi realizada a extração de DNA. Após a extração, foram realizadas nested-PCR específicas para cada parasito. Nas fezes dos cães, foram encontradas doze amostras contendo oocistos. Em seis, os oocistos eram maiores que 20 µm, e foram identificados como de Cystoisospora canis, e nas outras seis, oocistos menores que 20 µm foram visualizados e identificados como sendo quatro de H. heydorni, um de Cystoisospora spp. e uma amostra apresentava DNA tanto de H. heydorni quanto de Cystoisospora spp. DNA de C. canis foi identificado em quatro amostras, uma amostra foi identificada como G. duodenalis genótipo C e quatro como G. duodenalis genótipo D. Nenhuma amostra de fezes foi positiva para N. caninum e T. gondii, e quatro foram positivas para H. heydorni na PCR específica para este parasito. Nos cérebros analisados, foram encontradas seis amostras (2,4%) positivas a N. caninum e 23 amostras (9,1%) foram positivas a T. gondii. Nenhuma amostra foi positiva a H. heydorni. Anticorpos anti-N. caninum foram encontrados em 18,32% dos cães analisados, e 56,57% dos cães apresentaram sorologia positiva a T. gondii pela técnica de RIFI. Técnicas de ELISA foram padronizadas, utilizando-se extrato solúvel de taquizoítos e as proteínas recombinantes rNcGRA7, rNcSAG4, rNcBSR4 e rNcSRS9 de N. caninum. Foram encontrados valores de sensibilidade e especificidade menores que 84%, além do reconhecimento das proteínas recombinantes pelos dois parasitos, nos soros de infecções naturais e experimentais. Uma baixa concordância entre as técnicas foi observada, com valores de Kappa inferiores a 0,4. Os resultados encontrados indicam que N. caninum está menos presente em fezes de cães, enquanto H. heydorni é mais facilmente encontrada. As amostras que continham Cryptosporidium e Giardia foram identificadas como espécies-específicas. A

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pesquisa de DNA de parasitos em órgãos de cães pode ser utilizada como uma ferramenta para o diagnóstico post-mortem de infecções por protozoários, porém as técnicas de PCR podem apresentar baixa sensibilidade devido à pequena quantidade de tecido utilizado. Os resultados encontrados no WB indicam não haver um padrão de reconhecimento das proteínas imunodominantes, e que as técnicas sorológicas na neosporose canina têm limitações, devido aos baixos títulos encontrados e à reação cruzada com T. gondii, além da alta prevalência da infecção por T. gondii em cães, e presença de infecções mistas. PALAVRAS-CHAVE: Cryptosporidium canis, ELISA, Giardia duodenalis, Hammondia heydorni, Neospora caninum, PCR, RIFI, Toxoplasma gondii.

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SUMÁRIO

CAPÍTULO 1: Considerações gerais....................................................................

01 1.1 Protozoários intestinais de cães..................................................................... 01

1.2 Diagnóstico de N. caninum em cães.............................................................. 08

1.3 Objetivos........................................................................................................ 11

Referências.......................................................................................................... 11 CAPÍTULO 2: Identificação e caracterização molecular de protozoários intestinais em fezes de cães................................................................................ 20

Resumo................................................................................................................ 20

Abstract................................................................................................................ 21

Introdução............................................................................................................ 21

Material e métodos............................................................................................... 23

Resultados........................................................................................................... 27

Discussão............................................................................................................. 28

Conclusão............................................................................................................ 31

Referências.......................................................................................................... 31 CAPÍTULO 3: Utilização de Imunofluorescência Indireta, Ensaios imunoenzimáticos recombinantes, Western Blott e nested PCR no diagnóstico de Neospora caninum em cães............................................................................

38 Resumo................................................................................................................ 38 Abstract................................................................................................................ 38 Introdução............................................................................................................ 39 Material e métodos............................................................................................... 41 Resultados........................................................................................................... 47 Discussão............................................................................................................. 57 Conclusão............................................................................................................ 61 Referências.......................................................................................................... 62 CAPÍTULO 4: Considerações finais..................................................................... 67

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CAPÍTULO 1

CONSIDERAÇÕES GERAIS

1.1 Protozoários intestinais de cães

Os cães podem hospedar diferentes espécies de protozoários, como

Neospora caninum, Hammondia heydorni e Cystoisospora spp., capazes de

causar infecção nos próprios cães e em outros animais, e outros com potencial

zoonótico, como Cryptosporidium e Giardia.

Tanto a estrutura como o ciclo de vida de N. caninum são muito

similares aos do Toxoplasma gondii, com duas diferenças importantes: a

neosporose é uma enfermidade que acomete principalmente bovinos, enquanto a

toxoplasmose afeta principalmente humanos, ovinos e caprinos. Os cães e outros

canídeos são os hospedeiros definitivos de N. caninum (MCALLISTER et al.,

1998, GONDIM et al., 2004) e os felinos são os hospedeiros definitivos do T.

gondii (DUBEY et al., 2007a).

O ciclo biológico do N. caninum é caracterizado pela fase assexuada,

que se desenvolve tanto no hospedeiro definitivo como no hospedeiro

intermediário, e a fase sexuada, que ocorre nos hospedeiros definitivos. Na fase

assexuada, os taquizoítos, bradizoítos e cistos são intracelulares e localizam-se

em diferentes tecidos e órgãos, como cérebro, medula espinhal, nervos, músculos

cardíacos, músculos esqueléticos, fígado e músculos oculares (BARR et al., 1990;

DUBEY & LINDSAY, 1996, LINDSAY et al., 1996).

O ciclo intestinal do parasito ainda não foi descrito (GONDIM et al.,

2002), porém a fase sexuada provavelmente ocorre no intestino dos hospedeiros

definitivos, que se infectam ao consumir taquizoítos ou tecidos infectados com

cistos parasitários. Os cães, após ingerirem tecidos infectados, eliminam oocistos

não esporulados nas fezes (MCALLISTER et al., 1998).

A transmissão experimental em cães pode ocorrer após ingestão oral

de tecidos contendo cistos e por administração parenteral de taquizoítos. Os

resultados obtidos em cães são bastante diferentes dos obtidos em bovinos, nos

quais são observadas altas taxas de transmissão vertical, geralmente com títulos

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altos de anticorpos (DUBEY et al., 2007a). Cada população de cães pode ser

exposta a diferentes fatores de risco, tais como a ingestão de carne crua ou

placenta infectada, e também a ingestão de água ou alimentos contaminados com

oocistos esporulados (DIJKSTRA et al.,2002).

Estudos a respeito da prevalência de anticorpos anti-N. caninum em

cães foram realizados em mais de 30 países em todo o mundo (DUBBEY et al.,

2007a), sendo que no Brasil, demonstraram que a enfermidade está presente,

tanto em cães de área rural, com taxa de soropositividade variando entre 21,7% a

58,9% (ANDREOTTI et al., 2004, HASEGAWA et al., 2004, FERNANDES et al.,

2004, ROMANELLI et al., 2007) quanto em cães de área urbana, com prevalência

variando entre 8,3% a 45% (CAÑON-FRANCO et al., 2003, GENNARI et al.,

2002, , FERNANDES et al., 2004, AZEVEDO et al., 2005, AGUIAR et al., 2006,

ANDREOTTI et al., 2006, TEIXEIRA et al., 2006, BOAVENTURA et al., 2008).

A prevalência em relação à idade sugere que a maioria dos cães é

infectada após o nascimento, uma vez que a maior prevalência tem sido

documentada em cães mais velhos quando comparado com cães jovens

(WOUDA et al., 1999, CAPELLI et al., 2004; MALMASI et al., 2006, ANDREOTTI

et al., 2006). Também se observa uma maior prevalência de cães soropositivos

provenientes de zonas rurais, pois é mais fácil o acesso a bovinos que possam

estar infectados (WOUDA et al., 1999).

N. caninum pode ser encontrado em órgãos como o cérebro, medula

espinhal, retina, músculos, timo, coração, fígado, rim, estômago, glândula adrenal

e pele onde pode formar cistos e persistir por um longo tempo, levando à infecção

crônica (PETERS et al., 2000). A maioria dos casos clínicos em cães ocorre em

filhotes infectados congenitamente (DUBEY et al., 1990), caracterizando-se por

uma paralisia ascendente, com os membros posteriores geralmente mais

afetados, podendo ter hiperextensão rígida ou flácida, provavelmente decorrente

da poliradiculoneurite e miosite causadas pela infecção (DUBEY et al., 1988a).

Podem ainda apresentar dificuldade de deglutição, paralisia da mandíbula,

cegueira, convulsões, incontinência urinária e fecal, flacidez e atrofia muscular e

falha cardíaca (LINDSEY et al., 1999).

Os cães geralmente nascem sem sintomas e começam a desenvolver

sinais clínicos três semanas ou mais após o nascimento, e nem todos os filhotes

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são afetados com o mesmo grau (DUBEY et al., 2007b). Em cães adultos a

apresentação é mais variada, e além do quadro neuromuscular, podem ocorrer

dermatite piogranulomatosa, miocardite fatal e pneumonia. Os cães podem

sobreviver durante meses com paralisia progressiva, meningoencefalite,

insuficiência cardíaca, complicações pulmonares e, muitas vezes, os animais

precisam ser eutanasiados (BARBER & TREES, 1998).

A toxoplasmose canina, por sua vez, é clinicamente similar à infecção

por N. caninum, que anteriormente era confundida com toxoplasmose (DUBEY et

al., 2009). Vários estudos demonstram que os cães apresentam uma alta

soroprevalência de T. gondii, geralmente mais alta que de N. caninum (MINEO et

al., 2001; CAÑON-FRANCO et al., 2004; ASLANTAS et al., 2005; AZEVEDO et

al., 2005; DUBEY et al 2007c). Os sintomas clínicos, porém, são raros, podendo

localizar-se nos sistemas respiratório, neuromuscular ou gastrintestinal, ou ainda,

se apresentar como uma infecção generalizada (DUBEY et al., 2009).

H. heydorni também é um coccídio morfológica e geneticamente

relacionado ao N. caninum, e que apresenta o cão e outros canídeos como

hospedeiros definitivos (REICHEL et al., 2007). Porém, pouco se sabe sobre este

parasito, que no passado era frequentemente confundido com N. caninum,

embora ambos hoje sejam reconhecidos como espécies independentes (DUBEY

et al., 2002) e possam ser distinguidos por meio da aplicação de técnicas

moleculares (SLAPETA et al., 2002). Similar a N. caninum, H. heydorni tem um

ciclo de vida cão-bovino, embora outros animais, como cervos, possam atuar

como hospedeiros intermediários (DUBEY et al., 2004). A transmissão

transplacentária de N. caninum é muito eficiente no gado, enquanto que H.

heydorni não teve demonstrada sua transmissibilidade pela placenta (DUBEY et

al., 2002) nesta espécie animal.

N. caninum e H. heydorni, possui oocistos pequenos (10-13 µm).

Oocistos de N. caninum esporulados variam de esféricos a subesféricos, e

medem 11.7 x 11.3 µm (DUBEY et al., 2002).

Vários autores afirmam que os oocistos de N. caninum e H. heydorni

são morfologicamente indistinguíveis, o que torna difícil o diagnóstico coprológico

em hospedeiros definitivos (SLAPETA et al., 2002, REICHEL et al., 2007, DUBEY

et al., 2009). Porém, SCHARES et al. (2005) demonstraram diferenças

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morfológicas entre oocistos de N. caninum e outras espécies, em que os oocistos

de N. caninum se apresentaram menores, e com uma relação comprimento-

largura menor que os oocistos de H. heydorni, T. gondii ou Hammondia

hammondi. Também, cães eliminando H. heydorni apresentaram mais oocistos

por grama de fezes em comparação a cães eliminando N. caninum, mas as

diferenças não foram estatisticamente importantes.

Cães são frequentemente infectados por coccídios do gênero

Cystoisospora spp., com pelo menos quatro espécies reconhecidas: C. canis, C.

ohioensis, C. burrowsi e C. neorivolta. O ciclo de vida de Cystoisospora ssp é

similar ao ciclo de vida básico do coccídio intestinal. Mediante ingestão pelos

hospedeiros definitivos, os oocistos se rompem na presença de bile e

esporozoítos livres invadem o intestino. Alguns esporozoítos penetram na parede

intestinal e entram nos nódulos linfáticos mesentéricos ou outros tecidos extra-

intestinas, onde formam cistos monozóicos que aumentam de tamanho. Os cistos

podem permanecer em tecidos extra-intestinas de hospedeiros intermediários

durante toda a vida do hospedeiro. A ingestão destes cistos pelo hospedeiro

definitivo leva a infecções intestinais no mesmo (DUBEY et al., 2009).

Os oocistos de Cystoisospora spp formam dois grupos: oocistos

grandes (25-35µm) pertencentes a C. canis, e oocistos intermediários (17-23 µm),

que pertencem ao grupo C. ohioensis. Os membros deste grupo são clinicamente

importantes por causarem diarréia em filhotes de cão (LINDSAY et al., 1997).

Os sinais clínicos são mais evidentes em cães recém-nascidos.

Diarréia com perda de peso e desidratação e, raramente, hemorragia, são os

principais sinais observados em cães. Anorexia, vômitos, depressão mental, e

finalmente a morte pode ser visto em animais severamente afetados. A

patogênese da coccidiose intestinal em cães não é bem compreendida, pois a

doença clínica não foi produzida em animais experimentalmente infectados, e os

sinais clínicos não estão correlacionados com o número de oocistos encontrados

nas fezes. Além disso, pouco se sabe sobre a virulência das diferentes cepas

destes parasitos (MITCHELL et al., 2007).

Outros protozoários, além dos descritos anteriormente, podem ser

encontrados nas fezes de cães, como Cryptosporidium e Giardia, parasitos

capazes de infectar uma grande variedade de vertebrados (CACCIÒ et al., 2005).

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O ciclo de vida do Cryptosporidium se completa em um único

hospedeiro, com estágios similares aos coccídios dos gêneros Eimeria e

Cystoisospora. Os oocistos contêm quatro esporozoítos infectantes e são

excretados nas fezes (XIAO & FAYER, 2008).

A transmissão se dá pela ingestão dos oocistos infectantes pelos

hospedeiros em água ou alimentos contaminados, e a infecção pode ocorrer

mesmo sem a apresentação de sinais clínicos que, quando ocorrem, cursam com

diarréia líquida, e a cura na maioria das vezes é espontânea. Infecções por

Cryptosporidium não são muito comuns em cães, e quando diagnosticadas,

geralmente estão associadas com fezes normais que contêm relativamente

poucos oocistos por grama (ABE et al., 2002).

Os dados de prevalência de Cryptosporidium no Brasil, em humanos,

variam de 1,1% a 17,4% (CARNEIRO et al., 1995; GENNARI et al., 1996,

NEWMAN et al., 1999, OSHIRO et al., 2000), e um estudo realizado em pacientes

HIV positivos na região do triângulo mineiro detectou a presença do parasito nas

fezes de 9,4% (34/359) dos pacientes (OLIVEIRA-SILVA, et al., 2007). Em cães,

observa-se uma prevalência mais baixa, de 1,85% a 2, 41% (FIGUEIREDO et al.,

2004, HUBER et al., 2005, MUNDIM et al., 2007).

Oocistos de Cryptosporidum podem ser detectados por uma variedade

de testes diagnósticos, como a utilização de métodos de concentração (flutuação

centrífuga em solução saturada de sacarose ou solução de Sheather) ou emprego

de métodos especiais de coloração, como por exemplo, Ziehl-Neelsen modificado,

além de técnicas como Imunofluorescência Direta ou ELISA (Ensaio

Imunoenzimático) (SCORZA & TANGTRONGSUP, 2010). Porém, nenhuma

destas técnicas é capaz de identificar qual a espécie de Cryptosporidium

envolvida na infecção. Técnicas moleculares, como a PCR e o seqüenciamento

de DNA, apresentam-se como alternativas ao diagnóstico convencional do

Cryptosporidium, e são capazes de identificar as espécies (XIAO & FAYER,

2008).

Em estudos de caracterização genética dos oocistos de

Cryptosporidium recuperados de amostras fecais de cães, gatos e humanos,

normalmente é observada uma infecção espécie-específica, ou seja, com

genótipos associados aos hospedeiros, por exemplo, cães são geralmente

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infectados com C. canis, gatos com C. felis, humanos com C. hominis e C.

parvum (ABE et al., 2002; HUBER et al., 2007; XIAO & FAYER, 2008). Porém,

espécies como o C. canis, C. felis e C. muris já foram identificados em humanos,

tanto em indivíduos imunocomprometidos quanto em imunocompetentes

(PEDRAZA-DIAZ et al., 2001; XIAO et al., 2001), sendo inclusive isolados de

pacientes HIV positivos, e associados a sintomas significativos (XIAO & FAYER,

2008). A freqüência dessas espécies em humanos, entretanto, é baixa, e

comumente ocorre em concomitância com outra doença, ou em condições que

aumentem a susceptibilidade à infecção por Cryptosporidium. CAMA et al. (2008)

demonstraram C. canis infectando crianças aparentemente normais em algumas

comunidades de baixa classe econômica, demonstrando o potencial zoonótico

desta espécie.

Giardia spp., outro protozoário que infecta cães, tem um ciclo de vida

simples e direto. Cistos excretados nas fezes podem permanecer infectantes por

meses em um ambiente úmido e fresco. Depois da ingestão dos cistos, os

trofozoítos surgem no duodeno e completam a divisão mitótica. A infecção em

novos hospedeiros se dá pela ingestão de cistos e repetidas divisões dos

trofozoítos, que se fixam à superfície das microvilosidades intestinais, abaixo da

camada de muco, por meio de um disco adesivo ventral. Os cistos se formam em

resposta às condições intestinais, passam pelo intestino e são disseminados

pelas fezes, contaminando água e alimentos (XIAO & FAYER, 2008).

Infecções por Giardia spp. são comuns em cães e gatos, geralmente

com prevalências altas (BOWMAN & LUCIO-FORSTER, 2009). No Brasil, a

prevalência de giardíase em humanos varia de 4 a 30% (CARDOSO et al., 1995;

GUIMARÃES & SOGAYAR, 1995), e geralmente apresenta-se com freqüência

acima de 30% em cães (HUBER et al., 2005, MUNDIM et al., 2007).

A nomenclatura para Giardia ainda é confusa. Com base na morfologia

dos trofozoítos existem seis espécies de Giardia: G. muris que infecta roedores,

G. agilis (anfíbios), G. psittaci e G. ardeae (pássaros), G. microti (ratos de

pradaria) e G. duodenalis que infecta mamíferos (SMITH et al., 2007).

Atualmente, existem sete genótipos bem definidos para G. duodenalis,

que são designados de A a G. Os genótipos A e B têm especificidade mais ampla,

sendo encontrados infectando humanos e vários outros mamíferos, como cães,

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gatos, bovinos e animais selvagens (CACCIÒ et al., 2005). Os genótipos C e D

podem ser encontrados infectando cães e coiotes, o genótipo E infecta alpacas,

bovinos, caprinos, suínos e ovinos, e os genótipos F e G infectam gatos e ratos,

respectivamente (SMITH et al., 2007).

A detecção de Giardia nas fezes é geralmente realizada por métodos

simples de flutuação em solução de sulfato de zinco, nos quais podem ser

visualizados cistos e trofozoítos, porém o diagnóstico é apenas morfológico, não

identificando que genótipo está presente (MUNDIM et al., 2007).

Em estudos de caracterização genética, apenas os genótipos A e B de

G. duodenalis foram associados a infecções humanas, e alguns estudos

demonstraram a presença destes genótipos também parasitando cães. Contudo,

em uma tentativa para maximizar a detecção de ocorrência de transmissão

cruzada e sua detecção, estes estudos foram realizados em comunidades onde

havia aglomeração de pessoas e cães domesticados ou de rua, baixas condições

socioeconômicas, baixos níveis de saneamento e de más práticas de higiene

(O’HANDLEY et al., 2000; APPELBEE et al., 2003; THOMPSON & MONIS, 2004,

XIAO & FAYER, 2008).

Não há dúvida de que existe um potencial de transmissão zoonótica,

mas a sua prevalência não é conhecida e há uma urgente necessidade de

estudos epidemiológicos moleculares em focos endêmicos, onde a freqüência de

transmissão zoonótica de Giardia possa ser determinada. Para isso, dados de

prevalência e de transmissão cruzada são necessários para cada genótipo

(MONIS et al., 2003).

Assim sendo, o risco de infecção zoonótica por Cryptosporidium e

Giardia somente pode ser determinado com melhores informações a respeito da

prevalência da espécie envolvida em cada caso estudado.

A correta identificação dos oocistos presentes nas fezes de cães é

importante para determinar qual parasito está presente, uma vez que são

morfologicamente semelhantes. No entanto, são poucos os estudos que relatam a

excreção de oocistos (SLAPETA et al., 2002, SREEKUMAR et al., 2004,

SCHARES et al, 2005), não só de N. caninum, mas também de outros coccídios,

como H. heydorni, T. gondii e H. hammondi – estes dois últimos podendo ser

mecanicamente transmitidos por cães (SCHARES et al., 2005). Dessa maneira,

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técnicas moleculares com base na reação de PCR e no seqüenciamento de DNA,

podem ajudar a identificar as espécies presentes (SLAPETA et al., 2002).

1.2 Diagnóstico de N. caninum em cães

O diagnóstico da infecção por N. caninum em cães se baseia

principalmente em ensaios sorológicos e é utilizado como um instrumento

importante para a investigação clínica e soroepidemiológica. No entanto, o critério

utilizado nas amostras de soros para que sejam considerados positivos é variável,

dependendo tanto do investigador quanto das técnicas empregadas (LASRI et al.,

2004).

Para a detecção de anticorpos específicos para N. caninum, várias

técnicas foram realizadas, sendo as mais freqüentes a Reação de

Imunofluorescência Indireta (RIFI) e o ELISA. Esses testes mostram alto grau de

sensibilidade e especificidade em infecções naturais e experimentais, porém,

vários fatores, como a qualidade do antígeno ou conjugado utilizado nos

diferentes testes, podem resultar em uma pobre concordância ou em

discrepâncias, quando é realizada a comparação entre as técnicas (ROMAND et

al., 1998).

O ponto de corte de 1:50 na RIFI foi recomendado para o diagnóstico

sorológico em cães (BJORKMAN E UGGLA, 1999, AZEVEDO et al., 2005;

ANDREOTTI et al., 2006), porém distintos pontos de corte são considerados

positivos em diferentes provas, com títulos de RIFI variando de 1:16 a 1:100

(LASRI et al., 2004, PINHEIRO et al., 2005, CAPELLI et al., 2006, SILVA et al.,

2007) e os títulos de ELISA variando desde 1:50 a 1:100 (LASRI et al., 2004,

PINHEIRO et al., 2005, SILVA et al., 2007). A RIFI tem sido considerada a prova

mais específica, apesar de sua sensibilidade e especificidade mudarem de acordo

com os pontos de corte determinados, sendo bastante complicado fazer

comparações apropriadas de prevalência de anticorpos anti-N. caninum em cães

entre os diferentes estudos (BJORKMAN & UGGLA, 1999).

SILVA et al. (2007) também indicaram que o ponto de corte de 1:50 na

RIFI é o mais apropriado para a sorologia de N. caninum em cães. Entretanto,

sugerem que os antígenos de N. caninum imunodominantes, especialmente os de

9

17 e 29-32 kDa devem ser utilizados como marcadores selecionados com o fim

de desenvolver sistemas de diagnóstico sorológico da infecção por N. caninum

em cães. Além disso, a ampla variação nos pontos de cortes utilizados para a

RIFI nos diferentes estudos poderia influenciar o desempenho do ELISA, quando

comparadas as duas técnicas. Por isso, os resultados de ELISA devem ser

interpretados com cuidado, utilizando-se provas adicionais ou complementares,

como o Western Blot, a fim de esclarecer a discordância encontrada entre os

resultados de RIFI e ELISA. DUBEY & LINDSAY, (1996) ainda sugeriram a

utilização de proteínas específicas purificadas como antígeno para melhorar a

especificidade do ELISA.

Na neosporose canina, o primeiro ELISA desenvolvido foi um iscom

ELISA (BJORKMAN et al., 1994), com uma alta concordância com a RIFI como

prova de referência, apresentando 98% de sensibilidade e 96% de especificidade.

Desde então, vários ELISA utilizando antígenos solúveis de taquizoítos foram

desenvolvidos e provados para a sorologia de N. caninum em cães (LASRI et al.,

2004, PINHEIRO et al., 2005, CAPELLI et al., 2006; SILVA et al., 2007), porém,

nenhum desses protocolos apresentou boa sensibilidade e especificidade,

tampouco apresentaram boa concordância com a RIFI, e em alguns casos, não

foram indicados para estudos soroepidemiológicos (CAPELLI et al., 2006).

Até o momento, não há dados conclusivos que possam demonstrar que

títulos realmente deveriam ser considerados positivos para N. caninum entre as

diversas técnicas, principalmente porque os títulos encontrados em praticamente

todos os estudos de prevalência são geralmente baixos em cães, diferente dos

encontrados em bovinos. Além disso, títulos baixos de anticorpos anti-N. caninum

podem ser interpretados como uma reação cruzada entre parasitos relacionados,

particularmente T. gondii, que compartilham antígenos comuns de taquizoítos e

bradizoítos (BJERKAS et al., 1994, McALLISTER et al.,1996).

Semelhanças antigênicas entre N. caninum e T. gondii foram

demonstradas por DUBEY & LINDSAY (1996), e este risco de reação cruzada

pode complicar a interpretação das provas sorológicas de diagnóstico,

principalmente porque os cães apresentam alta soroprevalência de T. gondii,

geralmente mais elevada que de N. caninum (MINEO et al., 2001; CAÑON-

FRANCO et al., 2004; ASLANTAS et al., 2005; AZEVEDO et al., 2005; DUBEY et

10

al., 2007c). Já a presença de H. heydorni é difícil de ser verificada, devido à falta

de uma adequada técnica sorológica (REICHEL et al., 2007).

Na prova de RIFI, onde se detectam anticorpos contra antígenos de

superfície de taquizoítos, reações cruzadas entre N. caninum e T. gondii não

foram observadas (TREES et al, 1994; BUXTON et al., 1997). A reação cruzada

entre estes parasitos é mais evidente quando se usa extrato solúvel de

taquizoítos como antígeno, tal como o preparado para a técnica de ELISA

(DUBEY & LINDSAY, 1996), pois pode incluir antígenos somáticos liberados na

destruição do taquizoíto (PARÉ et al., 1995; DUBEY et al., 1996), os quais

parecem mais propensos a ocasionar uma reação cruzada.

LIAO et al. (2005) identificaram e caracterizaram anticorpos

monoclonais anti-N. caninum considerados também responsáveis por reação

cruzada entre os dois parasitos, que consistiam em proteínas situadas na sua

superficie (de massas moleculares de 28 a 76 kDa), nas organelas interiores

(massas moleculares de 35, 50 e 64 kDa) e apicais (massa molecular

desconhecida). Análises proteômicas na imunotransferência da eletroforese

bidimensional (2-DE), utilizando anti-soro de coelho contra N. caninum,

identificaram uma série de proteínas homólogas entre taquizoítos de N. caninum e

T.gondii, que vão de 41 a 76 kDa (LEE et al., 2005).

McALLISTER et al. (1996) demonstraram que um antígeno

recombinante específico de bradizoíto (BAG5) de T. gondii também apresentou

semelhanças antigênicas com bradizoítos de N. caninum. Entretanto, segundo

DUBEY & LINDSAY (1996), ainda que N. caninum e T. gondii possuam vários

antígenos em comum, eles não compartilham seus antígenos imunodominantes.

Em casos de infecções recentes ou crônicas com formação de cistos, a

sorologia pode ser negativa, mesmo quando o parasito está presente no

hospedeiro. Portanto, métodos de diagnóstico diretos podem ser utilizados, como

a imunoistoquímica ou a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) (DUBEY &

SCHARES, 2006), sendo esta última mais sensível que a primeira. Porém, alguns

estudos de imunoistoquímica também demonstraram existir certo grau de reação

cruzada entre cistos de T. gondii e N. caninum (DUBEY et al., 1990;

RUEHLMANN et al., 1995).

11

Cultivos celulares e inoculação em animais de laboratório também

podem ser usados para recuperar N. caninum de tecidos de animais (DUBEY et

al., 1988b). O sucesso do isolamento depende do número de organismos

presentes e o estágio de autólise do tecido.

1.3 Objetivos

Com base nas informações expostas, este trabalho teve como

objetivos principais: realizar a identificação dos protozoários encontrados em

fezes de cães, por técnicas morfológicas, de PCR e seqüenciamento, observar a

ocorrência de DNA de N. caninum, T. gondii e H. heydorni em cérebros de cães,

padronizar técnicas sorológicas de rotina para pesquisa de anticorpos de N.

caninum, avaliando a reação cruzada com T. gondii, e desenvolver novas técnicas

com a utilização de proteínas recombinantes para o diagnóstico sorológico de N.

caninum em cães.

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20

CAPÍTULO 2

Identificação e caracterização molecular de protozoários intestinais em

fezes de cães

Resumo

Este trabalho teve como objetivo identificar os protozoários encontrados em fezes

de cães. Para isso, foram colhidas amostras de fezes de 106 cães de rua

capturados pelo Centro de Zoonoses de Goiânia, Goiás. Foi realizada a

concentração da amostra pelo método de Teleman seguido da flutuação com

solução de Sheather, para detecção dos oocistos. Foi realizada a extração de

DNA de todas as amostras, posteriormente analisadas por nested-PCR

específicas para detecção de DNA de Neospora caninum, Hammondia heydorni,

Toxoplasma gondii, Cryptosporidium spp. e Giardia spp. Uma nested-PCR foi

ainda realizada nas amostras em que foram visualizados oocistos menores de 20

µm, para a detecção de DNA de coccídios e posterior seqüenciamento. Oocistos

foram visualizados em doze amostras, sendo que seis delas continham oocistos

maiores de 20 µm, identificados como Cystoisospora canis, e seis continham

oocistos menores de 20 µm, identificados como sendo quatro H. heydorni, um

Cystoisospora spp. e uma amostra apresentava DNA tanto de H. heydorni quanto

de Cystoisospora spp. DNA de C. canis foi identificado em quatro amostras, uma

amostra foi identificada como G. duodenalis genótipo C e quatro como G.

duodenalis genótipo D. Nenhuma amostra foi positiva para N. caninum e T. gondii,

e quatro foram positivas para H. heydorni na PCR específica para este parasito.

Os resultados encontrados indicam que N. caninum está menos presente em

fezes de cães, enquanto H. heydorni é mais facilmente encontrada. As amostras

que continham Cryptosporidium e Giardia foram identificadas como espécies-

específicas.

Palavras chave: Cryptosporidium, Giardia, Hammondia heydorni, Nested-PCR,

Oocisto, Sequenciamento.

21

Abstract

The aim of this work was to identify protozoa found in dog feces. For this purpose,

fecal samples were collected from 106 stray dogs captured by the Centro de

Zoonoses de Goiânia, Goiás. A sample concentration was conducted using the

Teleman method, followed by flotation with Sheather's Solution for oocyst

detection. A DNA extraction was performed in all samples, which were analyzed

by nested-PCR specific for detection of Neospora caninum, Hammondia heydorni,

Toxoplasma gondii, Cryptosporidium sp. and Giardia sp. A nested-PCR for

coccidia DNA was also carried out with the samples in which oocysts smaller than

20 µm have been observed, for coccidia DNA detection and later sequencing.

Oocysts were observed in twelve samples, with six of them containing oocysts

larger than 20 µm, identified as Cystoisospora canis, and six containing oocysts

smaller than 20 µm, identified as follow: four H. heydorni, one Cystoisospora spp.

and a sample which showed DNA of both H. heydorni and Cystoisospora spp. C.

canis DNA was identified in four samples, one sample was identified as G.

duodenalis genotype C and four as G. duodenalis genotype D. There was no

positive sample for N. caninum and T. gondii, and four were positive for H.

heydorni in the PCR specific for this parasite. These results indicate that N.

caninum is less present in dog feces, while H. heydorni is more easily found. The

samples that contained Cryptosporidium and Giardia have been identified as

species-specific.

Key words: Cryptosporidium, Giardia, Hammondia heydorni, Nested-PCR,

Oocyst, Sequencing.

Introdução

Os cães podem ser hospedeiros definitivos de diferentes espécies de

protozoários, capazes de causar infecção nos próprios cães, ou ainda, de

espécies zoonóticas, trazendo prejuízos também para a saúde humana.

22

Neospora caninum e Hammondia heydorni são coccídios morfológica e

geneticamente relacionados, tendo o cão e outros canídeos como hospedeiros

definitivos (MCALLISTER et al., 1998, DUBEY et al., 2002, GONDIM et al., 2004,

REICHEL et al., 2007). Cães são também frequentemente infectados por

coccídios do gênero Cystoisospora ssp, capazes de causar diarréias em filhotes

de cães, porém, os oocistos de Cystoisospora spp. são geralmente maiores que

os de N. caninum e H. heydorni, podendo ser assim, morfologicamente

distinguíveis (DUBEY et al., 2009).

São poucos os estudos que demonstram a ocorrência e a identificação

de oocistos semelhantes aos de N. caninum em fezes de cães (SLAPETA et al.,

2002, SREEKUMAR et al., 2004, SCHARES et al, 2005). Oocistos de coccídios

de felinos, como o Toxoplasma gondii e Hammondia hammondi, também podem

ser transmitidos por cães, pois alguns destes oocistos podem ser ingeridos e

passar pelo trato gastrointestinal dos cães (SCHARES et al., 2005) e dessa

maneira, podem estar presentes nas fezes. Assim, apenas a morfologia dos

oocistos encontrados nas fezes não é suficiente para a identificação das espécies

formadoras de cistos, e técnicas de biologia molecular são muito úteis para um

diagnóstico correto (SLAPETA et al., 2002).

Outros protozoários, além dos descritos anteriormente, podem ser

encontrados nas fezes de cães, como Cryptosporidium e Giardia, parasitos

capazes de infectar uma grande variedade de vertebrados e que, provavelmente,

constituem a causa mais comum de diarréia em humanos por protozoários em

todo o mundo, e podem levar à mortalidade, tanto em países em desenvolvimento

como em países desenvolvidos (CACCIÒ et al., 2005).

A caracterização genética dos oocistos recuperados de amostras fecais

de cães, gatos e humanos, revela uma infecção espécie-específica, ou seja, com

genótipos associados aos hospedeiros, por exemplo, cães são geralmente

infectados com C. canis, gatos com C. felis, humanos com C. hominis e C.

parvum (ABE et al., 2002; HUBER et al., 2007; XIAO & FAYER, 2008). Porém,

espécies como o C. canis, C. felis e C. muris já foram identificados em humanos,

tanto em indivíduos imunocomprometidos quanto em imunocompetentes

(PEDRAZA-DIAZ et al., 2001; XIAO et al., 2001).

23

O mesmo ocorre quando se analisa estudos de caracterização genética

da Giardia duodenalis, nos quais foram observados os genótipos A e B infectando

principalmente humanos, e os genótipos C e D parasitando cães (SMITH et al.,

2007).

Porém, a ligação entre a infecção humana e animal é uma questão que

tem dominado grande parte do esforço de investigação sobre Giardia e

Cryptosporidium (FAYER, 2004; THOMPSON, 2004) e o papel que a infecção

animal pode desempenhar neste contexto permanece controverso.

A fim de melhor compreender o potencial zoonótico de infecções por

Giardia e Cryptosporidium em animais domésticos e selvagens, é importante

determinar se os seres humanos e outros animais são suscetíveis a infecção com

formas geneticamente idênticas de cada parasito (HUNTER & THOMPSON,

2005).

Baseado nas considerações acima, o objetivo do presente estudo foi

identificar e realizar a caracterização molecular dos protozoários encontrados em

fezes de cães do Centro de Controle de Zoonoses .

Material e métodos

Animais

Cento e seis cães de rua, capturados pelo Centro de Controle de

Zoonoses de Goiânia (Brasil) no período de março a junho de 2007, foram

examinados quanto a presença de protozoários intestinais. Foram registrados os

dados de idade, sendo nove cães com menos de um ano de idade e 97 adultos.

Todos os cães eram SRD (sem raça definida) e provenientes de zona urbana.

24

Procedimentos parasitológicos

Amostras de fezes foram colhidas diretamente do reto de todos os

animais e colocadas em recipientes rotulados com os dados de identificação. Foi

realizada primeiramente a concentração da amostra pelo método de Teleman, no

qual foram utilizados cinco gramas de fezes diluídas em 15 mL de ácido acético a

5%. As amostras foram filtradas em camada dupla de gaze, acrescentaram-se

cinco mL de éter etílico, seguida de agitação vigorosa. As amostras foram

centrifugadas a 1.500 g durante três minutos. O sobrenadante foi eliminado, e o

sedimento foi colocado em novo recipiente, identificado e colocado a 4 ºC até o

momento do exame.

Detecção de oocistos

Para a detecção de oocistos, foi realizada a técnica de flutuação com

solução saturada de sacarose (solução de Sheather) (LEVINE, 1973), utilizando a

amostra concentrada obtida pelo método de Teleman. Os oocistos foram medidos

com uma ocular micrométrica, em microscópio óptico de luz.

Extração de DNA dos oocistos presentes nas amostras fecais

A extração de DNA foi realizada em todas as amostras, pelo método de

Boom (BOOM et al., 1990), a partir da amostra concentrada, conforme descrito

por McLAUCHLIN et al. (1999). O procedimento é composto pela ruptura dos

oocistos com esferas de zircônia de 0.5mm e adição de álcool isoamílico, para

inibir a formação de espuma durante a agitação, seguida da purificação com sílica

ativada.

25

Identificação de DNA de oocistos por nested-PCR

Para as amostras em que foram visualizados oocistos menores de 20

µm pelo método de flutuação, foi desenvolvida uma nested-PCR, a fim de detectar

DNA de coccídios, usando primers externos universais da região SSU-rDNA,

comum aos apicomplexas, Forward A (5’-CCGAATCGTCGACAACCTG

GTTGATCCTGCCCAGT-3’) e Reverse B (5’-CCCGGGATCCAAGCTT

GATCCTTCTGCAGGTTCA CCTAC 3’). Para a segunda reação foram usados os

primers COC1 (5´-AAGTATAAGCTTTTATACGGCT-3´) e COC2 (5´-

CACTGCCACGGTAGTCCAATAC-3´) da região SSU-rRNA (HO et al., 1996).

Identificação de DNA de Neospora caninum, Toxoplasma gondii,

Cryptosporidium e Giardia por nested-PCR e Hammondia heydorni por PCR

Em todas as amostras, foram realizadas técnicas de PCR específicas

para N. caninum, H. heydorni, T. gondii, Cryptosporidium e Giardia.

Para a detecção de DNA de N. caninum, foi realizada nested-PCR,

utilizando-se os primers NN1 (5’-TCAACCTTTGAACCCAA-3’) - NN2 (5’-

CGAGCCAAGACATCCATT-3’) e NP1 (5’-TACTACTCCCTGTGAGTTG-3’) - NP2

(5’-TCTCTTCCCTCAAACGCT-3’) da região ITS-1 (Internal Transcribed Spacer),

conforme descrito por BUXTON et al. (1998). DNA de taquizoítos de N. caninum

(amostra Nc1) e água ultra-pura foram incluídos em cada reação,

respectivamente, como controles positivo e negativo.

Para a detecção de DNA de H. heydorni, foi utilizada uma PCR

baseada em seqüências disponíveis de rRNA descrita por SLAPETA et al (2002),

utilizando-se os primers JS4 (5´-CGAAATGGGAAGTTTTGTGAAC-3´) e JS5

(5´CAGCAGCTACATACGTAGA-3´).

Nested-PCR em único tubo foi utilizada para a detecção de DNA de

T.gondii, de um fragmento do gene 18S-5.8S rRNA, com os pares de primers

TgNN1 (5′-CCTTTGAATCCCAAGCAAAACATGAG-3′) TgNN2 (5′-

GCGAGCCAAGACATCCATTGCTGA-3′) e TgNP1 (5′ GTGATAGTATCGA

AAGGTAT-3′) - Tg-NP2 (5′ ACTCTCTCTCAAATGTTCCT-3′) de acordo com

26

HURTADO et al. (2001). Como controle positivo, foi utilizado DNA de taquizoítos

de T. gondii (amostra ME-49), água ultra-pura foi utilizada como controle negativo.

Para a detecção de DNA de Cryptosporidum spp., foi utilizada nested-PCR para

amplificação de um fragmento da região 18S rDNA, com os primers 18SX1F

(5´TTCTAGAGCTAATACATGCG-3´) 18SX1R (5´-CCCATTTCCTTCGAAACAG

GA-3´) e 18SX2F: (5´-GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG-3´) - 18SX2R: (5´

AAGGAGTAAGGAACAACCTCCA-3´) (XIAO et al., 1999, 2000) como descrito por

PEDRAZA-DÍAZ et al. (2009).

Para Giardia, um fragmento do gene β-giardin foi amplificado usando

uma nested-PCR. A primeira amplificação foi realizada a partir dos primers

forward G7 (5´-AAGCCCGACGACCTCACCCGCAGTGC-3´) e reverse G759 (5´-

GAGGCCGCCCTGGATCTTCGAGACGAC-3´) (CACCIÒ et al., 2002). Para a

segunda amplificação foram utilizados os primers bGiarF (5´-

GAACGAGATCGAGGTCCG-3´) e bGiarR (5´-CTCGACGAGCTTCGTTGTT-3´)

(LALLE et al, 2005).

Purificação e sequenciamento das amostras positivas

Nas amostras positivas por nested-PCR em que foram visualizados

oocistos, foi realizada a purificação do DNA e sequenciamento, bem como nas

amostras positivas por nested-PCR de Cryptosporidium e Giardia.

Foram examinados cinco mL do produto da PCR após eletroforese em

gel de agarose a 1,5% e brometo de etídio. As bandas de DNA correspondentes

foram extirpadas com uma lâmina de bisturi. Em seguida, foram purificadas,

utilizando-se kit comercial (GENECLEAN Turbo kit®, QBiogene) de acordo com as

instruções do fabricante e seqüenciadas em ambas as direções usando o Big Dye

Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Biosystems) no sequenciador 3730 DNA

Analizer (Applied Biosystems) na Unidade Genômica do Parque Científico de

Madrid.

Análise de similaridade

27

Todas as sequências obtidas foram submetidas ao BLAST (Basic Local

Alignment Search Tool Nucleotides) (ALTSCHUL et al., 1990) para avaliação de

similaridade com as sequências do GenBank.

Resultados

Identificação dos oocistos visualizados

Em doze amostras foram visualizados oocistos. Seis delas continham

oocistos medindo acima de 20 µm, identificados como Cystoisospora canis, e as

outras seis amostras continham oocistos menores de 20 µm. Com base na

análise de similaridade fornecida pelo algoritmo BLASTn, destas seis amostras,

quatro foram identificadas como H. heydorni, uma como Cystoisospora spp. e

uma amostra apresentava DNA tanto de H. heydorni quanto de Cystoisospora

spp.

Identificação por PCR, nested-PCR e seqüenciamento das amostras

positivas

Quatro amostras foram identificadas como C.canis, uma como G.

duodenalis C e quatro como G. duodenalis D. Nenhuma amostra foi positiva para

N. caninum e T. gondii, e quatro foram positivas para H. heydorni após a

realização da PCR específica para este parasito.

Todos os cães em que foram encontrados DNA de C. canis tinham

menos de um ano de idade. Associações de parasitos foram encontradas em três

amostras distintas: uma contendo DNA de H. heydorni e Cystoisospora spp., a

segunda contendo DNA de H. heydorni e C. canis e a última contendo DNA de C.

canis e G. duodenalis D.

28

Discussão

Neste estudo não foi encontrado nenhum cão excretando oocistos de

N. caninum no momento da colheita. A excreção destes por cães naturalmente

infectados é pouco observada, e geralmente a quantidade de oocistos excretada

é baixa, sendo descritos poucos casos no mundo (BASSO et al., 2001,

McGARRY et al., 2003; SCHARES et al., 2005; McINNES et al., 2006). Os fatores

que podem afetar esta excreção ainda são desconhecidos (DUBEY et al., 2007),

porém, sabe-se que cães excretam mais oocistos após a ingestão de tecido

bovino infectado do que após a ingestão de tecido de camundongos infectados

(GONDIM et al., 2002), e filhotes podem excretar oocistos em maior quantidade

do que cães mais velhos (GONDIM et al., 2005). Neste estudo, a maioria das

amostras pertencia a cães mais velhos, tornando mais difícil a detecção.

SLAPETA et al. (2002), ao analisarem fezes de cães da República

Checa, não encontraram cães excretando oocistos de N. caninum, mas

detectaram oocistos de H. heydorni, assim como no presente estudo.

Pesquisando cães da Alemanha, SCHARES et al (2005) também observaram

uma baixa prevalência tanto de oocistos de N. caninum (7/24.089) quanto de H.

heydorni (12/24.089).

A epizootiologia de H. heydorni ainda é desconhecida, tendo atraído

relativamente pouca atenção desde a sua descoberta (BLAGBURN et al., 1988), e

por isso são raros os estudos que identificaram oocistos de H. heydorni em fezes

de cães. Até recentemente, H. heydorni parecia não ter nenhum significado clínico

em cães, mas pode ser considerado como possível causa de diarréia (REICHEL

et al., 2007), embora no presente estudo nenhum dos cães positivos apresentava

diarréia no momento da coleta.

Cystoisospora spp. é encontrado comumente em cães, pois os oocistos

são capazes de sobreviver por longos períodos no ambiente (BUEHL et al., 2006),

facilitando a contaminação, especialmente em lugares onde existe aglomeração,

como é o caso dos centros de zoonoses. Neste trabalho foi encontrado um total

de 7,5% de Cystoisospora, como encontrado em outros estudos no Brasil, em que

29

foram observadas taxas de incidência de 6,2% a 8,49% de oocistos em fezes de

cães, nas regiões de São Paulo e Santa Catarina (OLIVEIRA-SEQUEIRA et al.,

2002, BLAZIUS et al., 2005). Em um estudo realizado em Goiânia por ALVES et

al. (2005), 10% dos cães de rua foram positivos para Cystoisospora spp.

Nenhum oocisto de T. gondii foi encontrado nas fezes dos cães

analisados, porém, já foram encontrados em fezes de cães em outros estudos,

como os de FRENKEL & PARKER (1996), LINDSAY et al. (1997), FRENKEL et

al. (2003), ETHEREDGE et al. (2004), SCHARES et al. (2005), sugerindo que os

cães poderiam representar um risco de transmissão de T. gondii para outras

espécies, incluindo os seres humanos, uma vez que podem servir como

transmissores mecânicos do parasito, por coprofagia. Entretanto, são encontrados

em número muito baixo, como mostra o estudo de SCHARES et al (2005) na

Alemanha, onde examinando mais de 24 mil cães, encontraram oocistos de T.

gondii nas fezes de apenas dois cães. Sendo assim, torna-se necessária a

identificação correta dos oocistos encontrados em fezes de cães, pela utilização

de técnicas de biologia molecular, como a PCR e o sequenciamento, uma vez que

os oocistos são indistinguíveis morfologicamente.

Em relação ao Cryptosporidium, apenas a espécie C. canis foi

encontrada nas amostras avaliadas neste trabalho. Este resultado está de acordo

com os estudos de THOMAZ et al. (2007) e HUBER et al. (2007), realizados no

Brasil, de YOSHIUCHI, et al. (2010) no Japão e de LUCIO-FORSTER et al.

(2010) nos EUA, demonstrando um baixo risco de transmissão zoonótica entre

cães e humanos.

Entretanto, existem estudos que apontam o C. canis infectando

crianças aparentemente normais em comunidades de baixa condição econômica,

com higiene precária e que compartilhavam o mesmo ambiente com os animais

(CAMA et al., 2008). Além disso, C. canis e C. felis foram isolados de pacientes

HIV positivos, e associados com sintomatologia clínica. A freqüência dessas

infecções, entretanto, é baixa, e comumente ocorre em concomitância com outra

doença, ou em condições que aumentem a susceptibilidade à infecção por

Cryptosporidium (XIAO & FAYER, 2008).

Vários trabalhos recentes demonstraram que cães podem albergar

infecções com genótipos de Giardia consideradas espécie-específicas (C e D)

30

(BERRILLI et al., 2004, SZENASI et al., 2007, SOUZA et al., 2007, LEBBAD et al.,

2010) ou zoonóticas (A e B) (LALLE et al., 2005; LEONHARD et al., 2007;

CLAEREBOUT et al., 2009). Entretanto, encontrar esses genótipos em humanos

não fornece uma forte evidência que associe a infecção com uma possível rota

zoonótica, uma vez que geralmente este tipo de infecção, quando comprovada

por técnicas moleculares, está relacionado a fatores sócio-culturais e condições

higiênico-sanitárias precárias (TRAUB et al., 2004; LALLE et al., 2005; VOLOTÃO

et al., 2007).

Os estudos citados acima mencionam uma alta porcentagem do

genótipo A em cães domiciliados, enquanto cães que vivem em canis ou abrigos

apresentam uma alta porcentagem dos genótipos C e D, como nos presentes

resultados, em que só foram encontradas Giardia C e D nos cães. UPJOHN et al.

(2010), explicam que a transmissão de isolados específicos de cães pode ser

favorecida pelo contato intenso entre um grande número de cães compartilhando

o mesmo ambiente. Em cães domésticos, a frequência de transmissão de cão

para cão será menor e, portanto, as infecções adquiridas com genótipos A em

cães tendem a persistir.

Segundo ELIGIO-GARCIA et al. (2005), quando são encontrados

genótipos A ou B em cães, a transmissão zoonótica pode estar ocorrendo,

indicando um problema de saúde pública. Entretanto, se os resultados mostram

cães com genótipos C ou D, não se espera infecção humana, uma vez que estas

são espécie-específicas.

No Brasil, apenas recentemente tem sido utilizada a caracterização

molecular no diagnóstico desses parasitos (GONÇALVES et al., 2006, BUSHEN

et al., 2007, HUBER et al., 2007, THOMAZ et al., 2007, SOUZA et al., 2007), e os

resultados encontrados revelam que as infecções por Cryptosporidium spp. e

Giardia spp. são, na sua maioria, espécie-específicas. A maioria dos estudos,

porém, se baseia apenas no diagnóstico morfológico dos cistos de Giardia e

oocistos de Cryptosporidium, não permitindo assim a identificação da espécie ou

genótipo envolvido.

31

Conclusão

Oocistos de N. caninum não foram encontrados nas amostras

analisadas, mas oocistos de H. heydorni estavam presentes. As amostras de

fezes dos cães de rua analisadas neste trabalho demonstraram que todas as

espécies de Cryptosporidium e Giardia encontradas eram espécie-específicas.

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37

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38

CAPÍTULO 3

Utilização de Imunofluorescência Indireta, Ensaios imunoenzimáticos

recombinantes, Western Blott e nested PCR no diagnóstico de Neospora

caninum em cães

Resumo

Este trabalho teve como objetivos observar a prevalência da infecção por Neospora caninum e Toxoplasma gondii em cães pelas técnicas de RIFI e PCR, desenvolver e validar técnicas de ELISA para o diagnóstico sorológico da neosporose canina e determinar a utilidade do Western Blot para esse diagnóstico. Para isso, foram colhidas amostras de cérebro e sangue de 251 cães provenientes do Centro de Zoonoses de Goiânia, Goiás. Foram utilizados oito soros de infecção experimental por N. caninum e quatro por T. gondii para comprovação dos resultados. Dos cérebros analisados, seis (2,4%) foram positivos pela técnica de Nested-PCR para N. caninum e vinte e três (9,1%) foram positivos para T. gondii. Anticorpos anti-N. caninum foram encontrados em 18,32% dos cães analisados, e 56,57% dos cães apresentaram sorologia positiva a T. gondii. Foi realizada também a PCR para H. heydorni, mas todos os cães foram negativos. Técnicas de ELISA foram padronizadas, utilizando-se extrato cru de taquizoítos e as proteínas recombinantes rNcGRA7, rNcSAG4, rNcBSR4 e rNcSRS9 de N. caninum. Foram encontrados valores de sensibilidade e especificidade menores que 84%, além do reconhecimento das proteínas recombinantes pelos dois parasitos, nos soros de infecções naturais e experimentais. Uma baixa concordância entre as técnicas foi observada, com valores de Kappa inferiores a 0,4. Os resultados encontrados no WB indicam não haver um padrão de reconhecimento das proteínas imunodominantes, e que as técnicas sorológicas na neosporose canina têm limitações, devido aos baixos títulos encontrados e à reação cruzada com T. gondii, além da alta prevalência da infecção por T. gondii em cães, e presença de infecções mistas.

Palavras-chave: proteína recombinante, rNcGRA7, rNcSAG4, rNcBSR4,

rNcSRS9, reação cruzada, Toxoplasma gondii.

Abstract

The aim of this work was to observe the prevalence of infection by Neospora

caninum and Toxoplasma gondii in dogs by the RIFI and PCR assays, develop

39

and validat ELISA assays for diagnosis of canine neosporosis, and determine the

usefulness of WB for this diagnosis. For that, blood and brain tissue samples were

collected from 251 dogs in the Centro de Zoonoses de Goiânia, Goiás. Eight

experimental infection sera for N. caninum and four for T. gondii were used to

verify the results. Among the analyzed brains, six (2.4%) were positive for N.

caninum by the Nested-PCR assay and twenty- three (9.1%) were positive for T.

gondii. Anti-N. caninum antibodies were found in 18.32% of the examined dogs

and 56,.57% of the dogs showed positive sorology for T. gondii. A PCR assay for

H. heydorni was also performed, but all dogs were negative. ELISA assays were

standardized, using tachyzoite raw extract and N. caninum's rNcGRA7, rNcSAG4,

rNcBSR4 and rNcSRS9 recombinant proteins. The values found for specificity and

sensitivity were below 84%, and it was also observed the recognition of

recombinant proteins by both parasites in both natural and experimental infection

sera. A low agreement between the assays was observed, with Kappa values

below 0.4. The results found in the WB indicate that there is no standard for

recognizing the immune dominant proteins, and the serological assays for canine

neosporosis have limitations due to the low titres found and the cross-reaction with

T. gondii, besides the high prevalence of T. gondii infection in dogs and the

presence of mixed infections.

Keywords: Recombinant protein, rNcGRA7, rNcSAG4, rNcBSR4, rNcSRS9,

Cross reaction, Toxoplasma gondii.

Introdução

Neospora caninum, Hammondia heydorni e Toxoplasma gondii são

coccídios formadores de cistos, pertencentes ao filo Apicomplexa, família

Sarcocystidae, que apresentam uma ampla variedade de hospedeiros. Tanto a

estrutura como os ciclos de vida são muito similares, no entanto os canídeos são

os hospedeiros definitivos de N. caninum e H. heydorni, e felinos são os

hospedeiros definitivos do T. gondii (DUBEY et al., 2007a).

40

Comparações filogenéticas entre esses protozoários demonstraram

que existe uma maior relação entre N. caninum e H. heydorni do que entre N.

caninum e T. gondii (MUGRIDGE et al. 1999).

Apesar de vários estudos já terem sido realizados com N. caninum em

diferentes espécies, não se sabe se H. heydorni induz reação cruzada em ensaios

sorológicos com N. caninum, como se observa entre T. gondii e H. hammondi

(RIAHI et al. 1998) e entre T. gondii e N. caninum (DUBEY E LINDSAY,1996).

Estudos epidemiológicos envolvendo H. heydorni são poucos, pois ainda não se

conseguiu manter o parasito em culturas celulares, e tampouco foram

desenvolvidos testes sorológicos para tal (MUGRIDGE et al. 1999; SCHARES et

al. 2003).

A soroprevalência de N. caninum em cães clinicamente saudáveis

geralmente encontra-se abaixo de 20%, mas ainda assim é maior que a

prevalência da doença clínica, sugerindo que as infecções são, na maioria dos

casos, assintomáticas (DUBEY et al., 2009). Entretanto, os cães apresentam uma

alta soroprevalência de T. gondii, geralmente mais alta que de N. caninum

(MINEO et al., 2001; CAÑON-FRANCO et al., 2004; ASLANTAS et al., 2005;

AZEVEDO et al., 2005; DUBEY et al 2007b), provavelmente porque cães e gatos

de rua convivam em ambiente comum com maior possibilidade de infecção.

O diagnóstico da infecção por N. caninum se baseia principalmente em

ensaios sorológicos e é utilizado como um instrumento importante para a

investigação clínica e soroepidemiológica. No entanto, o critério utilizado nas

amostras de soros para que sejam consideradas positivas são variáveis,

dependendo tanto do investigador quanto das técnicas empregadas (LASRI et al.,

2004). Além disso, semelhanças antigênicas entre N. caninum e T. gondii foram

demonstradas por DUBEY E LINDSAY (1996), podendo complicar a interpretação

das provas sorológicas de diagnóstico.

O ponto de corte de 1:50 na Reação de Imunofluorescência Indireta

(RIFI) foi recomendado e é usado normalmente para o diagnóstico sorológico em

cães (BJORKMAN & UGGLA, 1999, AZEVEDO et al., 2005; ANDREOTTI et al.,

2006), mas distintos pontos de corte são considerados em diferentes provas,

variando desde 1:16 a 1:100 em RIFI (LASRI et al., 2004, PINHEIRO et al., 2005,

CAPELLI et al., 2006, SILVA et al., 2007) e desde 1:50 a 1:100 no Ensaio

41

Imunoenzimático (ELISA) (LASRI et al., 2004, PINHEIRO et al., 2005, SILVA et

al., 2007). Por este fato, torna-se complicado fazer comparações apropriadas de

prevalência de anticorpos anti-N. caninum em cães entre os diferentes estudos,

pois existem desacordos entre a sensibilidade e especificidade das provas e entre

os diferentes pontos de corte utilizados (SILVA et al., 2007).

Os resultados dos testes sorológicos podem ser negativos quando a

infecção é recente, ou crônica, com formação de cistos. Portanto, métodos de

diagnóstico direto, como a PCR, podem ser úteis para detectar a presença do

parasito em órgãos dos cães (GHALMI et al., 2008).

Sendo assim, o objetivo desse trabalho foi observar a frequência da

infecção por N. caninum e T. gondii em cães pelas técnicas de RIFI e PCR,

desenvolver e validar técnicas de ELISA para o diagnóstico da neosporose e

toxoplasmose canina e determinar a utilidade do WB para este diagnóstico.

Material e métodos

Colheita de amostras

Foram colhidas amostras de cérebro e sangue de 251 cães

provenientes do Centro de Controle de Zoonoses da cidade de Goiânia – Goiás

no período de março a junho de 2007.

Os cérebros foram divididos em três partes: anterior, mediana e

posterior e cerebelo. As amostras foram maceradas e concentradas com 1 mL de

PBS estéril para cada grama de tecido, centrifugadas a 1.350g por 15 minutos, e

os sedimentos foram transferidos para tubos eppendorff, devidamente

identificados e acondicionados a -20ºC até o momento da extração de DNA.

O sangue colhido foi centrifugado a 1.350g por 15 minutos, o soro foi

colocado em eppendorffs identificados de acordo com o número de cada animal,

correspondendo também ao número de cada cérebro e acondicionados a -20ºC

até o momento do exame.

42

Soros provenientes de infecção experimental para o estudo de reações

cruzadas entre N. caninum e T. gondii

A presença de reações cruzadas com T. gondii foi investigada

utilizando-se oito soros de cães infectados experimentalmente com N. caninum

(GONDIM et al., 2005) e quatro soros de cães infectados experimentalmente com

T. gondii (SILVA et al., 2002). Os soros positivos a Neospora foram colhidos

durante as primeiras fases da infecção (fase aguda), enquanto que os de

Toxoplasma correspondem a fase crônica da infecção.

Extração de DNA

O DNA genômico foi obtido a partir de 20 mg de amostra macerada de

tecido de cada uma das três partes do cérebro, usando-se um kit de extração

(Real Pure Extracción DNA Genómico, Durviz) de acordo com as instruções do

fabricante. A concentração de DNA foi medida por espectrofotômetro a A260/280

e todas as amostras de DNA foram diluídas a uma concentração final de 60

ng/mL e armazenadas a -20°C até análise por PCR.

Nested-PCR específicas para a detecção de DNA de N. caninum e T. gondii

em tecido cerebral

Para a detecção de DNA de N. caninum, uma nested-PCR foi

realizada, utilizando-se os primers NN1 (5’-TCAACCTTTGAACCCAA-3’) - NN2

(5’-CGAGCCAAGACATCCATT-3’) e NP1 (5’-TACTACTCCCTGTGAGTTG-3’) -

NP2 (5’-TCTCTTCCCTCAAACGCT-3’) da região ITS-1, conforme descrito por

BUXTON et al. (1998). DNA de taquizoítos de N. caninum (amostra Nc1) e água

ultra-pura foram incluídos em cada reação de nested-PCR, respectivamente,

como controles positivo e negativo.

Nested-PCR em único tubo foi utilizada para a detecção de DNA de T.

gondii, baseado na amplificação da região ITS1 (Internal Transcribed Spacer) do

43

gene 18S rRNA, com os pares de primers TgNN1 (5′-CCTTTG AATCCCAAGCA

AAACATGAG-3′) -TgNN2 (5′-GCGAGCCAAGACATCCATTGCTGA-3′) e

TgNP1 (5′ GTGATAGTATCGAAAGGTAT-3′) - Tg-NP2 (5′ ACT

CTCTCTCAAATGTTCCT-3′) de acordo com HURTADO et al. (2001). Como

controle positivo, foi utilizado DNA de taquizoítos de T. gondii (amostra ME49), e

água ultra-pura foi utilizada como controle negativo.

Padronização de nested-PCR para detecção de H. heydorni em tecido

cerebral

Foi padronizada uma nested-PCR para a análise do DNA de H.

heydorni dos cérebros obtidos dos cães, com uso dos primers externos NN1 (5’-

TCAACCTTTGAACCCAA-3’) - NN2 (5’-CGAGCCAAGACATCCATT-3’) da região

ITS-1 (BUXTON et al., 1998), e internos HYD1 (5´-CTGCTGATATCCGGG

AGTGG-3’) - HYD2 (5’- CATCTTTGTTTCGTAAATAATCTGGCAT-3’). Os pares

de primers internos HYD1 E HYD2 são específicos para H. heydorni, amplificando

um fragmento de DNA de aproximadamente 200 pares de base (pb) (BARRATT

et al., 2008).

Uma quantidade de 300 ng de DNA extraído das amostras de tecido foi

usada como modelo em cada reação. A amplificação do DNA foi executada em

um volume total de 25 μL contendo água ultrapura esterilizada ajustada ao

volume final, 2,5 μL de tampão buffer 1x (Ecogen®), 1,0 μL de cloreto de

magnésio (MgCl2) a 2 mM (Ecogen®), 0,5 μL de dNTPs a 200 µM (Sigma®), 2,5 μL

de cada primer (Sigma®) a 1,5 µM (NN1 e NN2) ou a 10 µM (HYD1 e HYD2) e

0,125 µl de Ecotaq (Ecogen®), usando o termociclador Mastercycler (Eppendorf).

Os parâmetros do ciclo da primeira amplificação consistiram em um ciclo à 95ºC

por 5 min., 35 ciclos de desnaturação (95 ºC, 1 min.), anelamento (55 ºC, 1 min.)

e extensão (72 ºC, 1 min.), com uma extensão final a 72ºC por 5 min. Depois da

amplificação primária, o segundo par de primers foi acrescentado a 5 μl do

primeiro produto de PCR ao mix da reação de amplificação secundária e o

amplicons foram assim submetidos a 30 ciclos de 94 ºC por 1 min., 62 ºC por 1

min. e 72 ºC por 1 min., com uma extensão final de 72 ºC por 5 min. Como

44

controle positivo, foi utilizado DNA extraído de oocistos excretados por cão,

reconhecidos como de H. heydorni por sequenciamento (dados não publicados).

Reação de Imunofluorescência Indireta

Primeiramente, foi utilizada a reação de Imunofluorescência Indireta

(RIFI) como a técnica de referência, em todos os soros.

A RIFI foi usada para detectar anticorpos específicos anti-N. caninum e

anti-T. gondii, em infecções naturais, nos 251 soros provindos dos cães do centro

de zoonoses e nos 12 soros provindos de cães infectados experimentalmente. Os

antígenos foram preparados a partir da multiplicação de taquizoítos de N.

caninum (amostra Nc-1) e T. gondii (amostra ME-49) em cultivos de células Marc-

145. A reação e a preparação do antígeno foram realizadas de acordo com

ALVAREZ-GARCIA et al. (2002), e o ponto de corte utilizado foi de 1:50.

Padronização e otimização de uma técnica de ELISA indireto baseado no

antígeno solúvel obtido de taquizoítos de N. caninum e de T. gondii

Em um primeiro momento foram estabelecidas as condições mais

adequadas, selecionando a quantidade de antígeno por poço (0,1g/poço),

diluição do soro (1:100), tipo de conjugado (proteína A conjugada com

peroxidase), diluição do conjugado (1:160000) e substrato (TMB - 3,3',5,5' –

tetramethybezidine, Sigma®). Para estas provas foram empregadas amostras de

soros de cães soronegativos e soropositivos por RIFI, infectados naturalmente.

Uma análise TG-ROC (two-graph receiver operating characteristic),

usando um modelo do Microsoft-EXCEL foi aplicada para seleção de valores de

pontos de corte e desempenhos de testes diagnósticos. A concordância entre a

RIFI e ELISA foi expressa pelo cálculo do Kappa (k), tomando como prova de

referência os resultados de RIFI.

Em placas de ELISA foram acrescentados 0,1 µg/poço de antígeno

solúvel de N. caninum ou T. gondii, preparados de acordo com ALVAREZ-

45

GARCIA et al.(2002), diluídos em 100µl de Tampão Carbonato Bicarbonato (pH

9,6) e deixadas durante toda a noite a 4ºC. As placas foram lavadas três vezes

com PBS tween a 0,05% durante cinco minutos e bloqueadas com 300 µl/poço de

PBS tween 0,05% BSA 1%, durante uma hora em temperatura ambiente. Em

seguida, foram adicionados 100 µl/poço do soro diluído a 1:100 em PBS tween

BSA 1% e incubados a 37ºC durante 30 minutos. Foi utilizada como conjugado a

Proteína A conjugada na diluição 1:160.000 em PBS tween BSA. Após cada

passo, foram epetidas as lavagens das placas.

O substrato utilizado foi o TMB (100 µl/poço) por 10 minutos em

temperatura ambiente, e a reação bloqueada com Ácido Sulfúrico (100 µl/poço).

As amostras de soro foram analisadas em duplicata, os valores de

densidade ótica (DO) convertidos em índice relativo x 100 (IRPC), e a

interpretação dos resultados calculada pela seguinte fórmula: IRPC = (DO450

amostra _ DO450 controle negativo)/(DO450 controle positivo _ DO450 controle

negativo) x 100. A reação colorimétrica em cada poço foi medida utilizando-se um

leitor de ELISA (Multiskan RC 6.0, Labsystems) a um comprimento de onda de

450 nm.

Padronização e otimização de técnicas de ELISA indireto baseados na

utilização das proteínas recombinantes rNcGRA7, rNcSAG4, rNcBSR4 e

rNcSRS9 de N. caninum

Foram padronizadas técnicas de ELISA utilizando-se como antígeno as

proteínas recombinantes rNcGRA7 (proteína específica da fase de taquizoíto,

marcador de fase aguda), rNcSAG4, rNcBSR4 e rNcSRS9 (proteínas da fase de

bradizoítos, marcadoras de fase crônica), preparadas de acordo com ÁLVAREZ-

GARCÍA et al. (2007), FERNÁNDEZ-GARCÍA et al. (2006), RISCO-CASTILLO et

al. (2007) e RISCO-CASTILLO (dados não publicados), respectivamente.

Para a padronização das provas de ELISA recombinantes se utilizaram

as mesmas condições que para o ELISA baseado na proteína solúvel do parasito,

exceto a diluição da proteína A conjugada, que foi 1:80000 para os ELISA

rNcGRA7 e rNcSAG4 e 1:40000 para os ELISA rNcBSR4 e rNcSRS9. Para o

46

cálculo dos pontos de corte, foi analisado um total de 207 soros de cães

infectados naturalmente (46 positivos e 161 negativos para N. caninum). Nas

doze amostras de soros de cães infectados experimentalmente também foram

realizadas as técnicas de ELISA descritas. Em todos os ELISA foram empregados

os mesmos soros para os controles positivo e negativo.

Identificação dos antígenos imunodominantes (IDAs) dos taquizoítos de

Neospora caninum reconhecidos por soros caninos pela técnica de

Western-Blot (WB).

As técnicas de eletroforese em uma dimensão em condições

desnaturalizantes e de WB foram otimizadas, utilizando-se como antígeno extrato

total de taquizoítos de N. caninum obtidos em cultivo celular. Dois tipos de

anticorpos, um anti-IgG de cão e a proteína A, foram comparados em diferentes

diluições, ambos conjugados com peroxidase. Para isso, foi utilizado um painel de

soros de cães infectados naturalmente, positivos e negativos a N. caninum e a T.

gondii pela RIFI.

Os melhores resultados se observaram com a proteína A diluída a

1:50000. A diluição do soro foi 1:20. Após a transferência úmida das proteínas de

N. caninum à membranas de nitrocelulose, estas foram lavadas com TBS-Tween

20 a 0,05% (dois lavados de 5 minutos cada um) e foram bloqueadas com

solução de TBS-Tween 20 com 5% de leite desnatado, a 4ºC por toda a noite.

Após dois lavados de 10 minutos cada em TBS-Tween 20 a 0,05%, as

membranas foram incubadas com os soros problemas, diluídos a 1:20 na solução

de bloqueio, a 37ºC durante uma hora. Decorrida essa primeira incubação,

novamente três lavados de 10 minutos cada um, com TBS-Tween 20 a 0,05%

foram realizados, e as membranas foram novamente incubadas a 37ºC durante

uma hora com a proteína A conjugada, diluída também em TBS-Tween 20 a

0,05%. Finalmente, as membranas foram lavadas duas vezes com TBS-Tween 20

a 0,05% e uma última vez com TBS, e imediatamente foram incubadas com o

substrato, 4 cloro-1naftol (Bio-Rad®), em ausência de luz e em temperatura

47

ambiente durante alguns minutos, até a visualização de bandas imunorreativas. A

reação foi parada mediante a adição de água destilada.

Da mesma maneira que para N. caninum, foi padronizado o WB com

extrato total de taquizoítos de T. gondii obtidos em cultivo celular, com o fim de

identificar posteriormente possíveis reações cruzadas. Utilizaram-se as mesmas

condições que na técnica para N. caninum.

Uma vez padronizada a técnica de WB para Neospora e Toxoplasma,

foi determinada a utilidade deste no diagnóstico sorológico de N.caninum em

cães. Dessa maneira, foi estabelecido o padrão de IDAs e identificados antígenos

que possam ser responsáveis por reações cruzadas. Para isso, foram analisados

104 soros de cães infectados naturalmente examinados pela RIFI, dos quais 15

eram positivos para N. caninum, 31 para N. caninum e T. gondii, 21 somente para

T. gondii, além de 14 soros que foram considerados duvidosos (fluorescência

apical) e 23 soros negativos aos dois parasitos. Também foram analisados os

soros de cães infectados experimentalmente.

Para a análise dos resultados, as membranas foram escaneadas,

utilizando-se o Scanner GS-800 (Bio-Rad®) e os pesos moleculares das proteínas

reconhecidas pelos soros foram analisados com o programa informático Quantity

One (Bio-Rad®). A freqüência de aparição de cada IDA foi calculada como a

porcentagem relativa de soros em que aparece o reconhecimento do antígeno

(dividindo o número de soros em que aparece pelo total de soros positivos e

multiplicando por cem). Uma vez que se analisaram os resultados, os IDAs foram

estabelecidos em função da freqüência de reconhecimento.

Resultados

Nested-PCR para N. caninum, T. gondii e H. heydorni em tecido cerebral

Dos 251 cérebros de cães analisados, apenas seis (2,4%) foram

positivos pela nested-PCR para N. caninum. Destes seis, quatro foram positivos

também pela técnica sorológica de RIFI.

48

Vinte e três cérebros (9,1%) foram positivos pela nested-PCR para T.

gondii. Dentre esses, 22 cães eram soropositivos (RIFI). Nenhum cérebro foi

positivo para H. heydorni.

Reação de Imunofluorescência Indireta

Anticorpos anti-N. caninum foram encontrados em 18,32% dos cães

analisados (46/251), enquanto 56,57% (142/251) dos animais apresentaram

sorologia positiva a T. gondii. Os títulos observados nos soros positivos a N.

caninum variaram de 1:50 a 1:800, sendo que mais de 80% dos cães positivos

apresentaram títulos < 1:100. O oposto ocorreu com os cães positivos a T. gondii,

em que mais de 80% dos cães apresentaram títulos > 1:100, variando desde 1:50

até 1:12800, conforme visto na Tabela 1. Dos 46 cães positivos a N. caninum, 30

(65,21%) eram também positivos a T. gondii.

TABELA 1: Títulos de anticorpos anti-Neospora caninum e anti-Toxoplasma gondii analisados por RIFI de 251 cães provenientes do Centro de Zoonoses de Goiânia.

Título RIFI Cães positivos a N. caninum Cães positivos a T. gondii

N % N %

1:50 21 45,6

17 36,9

04 8,6

03 6,5

01 2,1

- -

- -

- -

- -

24 16,9

1:100 47 33,0

1:200 14 9,8

1:400 25 17,6

1:800 12 8,4

1:1.600 09 6,3

1:3.200 06 4,2

1:6.400 03 2,1

1:12.800 02 1,4

Total 46 18,3 142 56,5

49

ELISA indireto baseado no antígeno solúvel obtido de taquizoítos de N.

caninum e T. gondii

Foram calculados os valores de sensibilidade e especificidade para o

ELISA indireto baseado no antígeno solúvel obtido de taquizoítos de N. caninum

(Figura 1). Na Figura 1(A) soros com títulos acima de 1:50 pela RIFI foram

considerados positivos, obtendo-se um ponto de corte de IRPC=29, para um valor

de sensibilidade e especificidade de 73% e 60%, respectivamente. Na Figura

1(B), foram considerados positivos os soros com títulos acima de 1:100 na RIFI,

obtendo-se um ponto de corte de IRPC= 24, com valores de sensibilidade e

especificidade de 84% e 72%, respectivamente.

Também foram calculados os valores de sensibilidade e especificidade

para o ELISA indireto baseado no antígeno solúvel de T. gondii, obtendo-se um

ponto de corte de IRPC= 21, com valores de sensibilidade e especificidade de

68% e 71%, respectivamente (Figura 2).

FIGURA 1. Valores de sensibilidade (Se), especificidade (Sp) e ponto de corte (IRPC) obtidos para o ELISA baseado no antígeno solúvel de N. caninum, com títulos acima de 1:50 (A) e acima de 1:100 na RIFI (B).

A B

50

FIGURA 2. Valores de sensibilidade (Se), especificidade (Sp) e ponto de corte (IRPC) obtidos para o ELISA baseado no antígeno solúvel de T. gondii, com títulos acima de 1:50 na RIFI.

ELISA baseado no emprego dos antígenos recombinantes rNcGRA7,

rNcSAG4, rNcBSR4 e rNcSRS9

Após a padronização da técnica, foi calculado o ponto de corte,

obtendo-se um valor de IRPC=20, com valores de sensibilidade e especificidade

de 63% e 57% respectivamente, para o ELISA rNcGRA7 (Figura 3 A). Para o

ELISA rNcSAG4 encontrou-se um ponto de corte de IRPC=45 com uma

sensibilidade e especificidade de 65% e 52%, respectivamente (Figura 3 B).

FIGURA 3. Valores de sensibilidade (Se), especificidade (Sp) e ponto de corte (IRPC) obtidos para o ELISA rNcGRA7 (A) e ELISA rNcSAG4 (B).

A B

51

Obteve-se para o ELISA rNcBSR4 o ponto de corte de IRPC=47 com

um valor de sensibilidade e especificidade de 71% e 61%, respectivamente

(Figura 4 A), e para o ELISA rNcSRS9 foi encontrado o ponto de corte de

IRPC=48, com valores de sensibilidade e especificidade de 67% e 60%,

respectivamente (Figura 4 B).

FIGURA 4. Valores de sensibilidade (Se), especificidade (Sp) e ponto de corte (IRPC) obtidos para o ELISA rNcBSR4. (A) e ELISA rNcSRS9 (B).

Caracterização da imunogenicidade dos antígenos recombinantes rNcGRA7,

rNcSAG4, rNcBSR4 e rNcSRS9

Foi observada uma resposta frente às proteínas recombinantes

rNcGRA7, rNcSAG4, rNcBSR4 e rNcSRS9, em soros de cães infectados tanto de

forma natural (Figura 5) como experimental por N. caninum.

A B

52

FIGURA 5. Reconhecimento das proteínas (A) rNcGRA7 (33kDa), (B) rNcSAG4 (19kDa) e (C) rNcBSR4 (51kDa) e rNcSRS9 (37kDa) de Neospora caninum por soros de cães infectados naturalmente por Neospora caninum.

Os resultados no WB demonstraram também a existência de um

reconhecimento dos soros positivos a Toxoplasma frente as proteínas rNcSAG4,

NcBSR4 e NcSRS9, sendo de menor grau frente a rNcGRA7.

Quando esses soros foram analisados por ELISA, e segundo se mostra

na Figura 6 (A), os soros de cães infectados experimentalmente com Neospora e

utilizando-se o ELISA rNcGRA7 (proteína específica da fase de taquizoíto e

marcador de fase aguda), mostraram maiores valores de IRPC que ao utilizar as

provas de ELISA baseadas em extrato solúvel e nas proteínas específicas do

estádio de bradizoíto do parasito (SAG4, BSR4 e SRS9).

Quando se compararam os ELISA recombinantes com a prova de

ELISA baseada em extrato solúvel, pode-se observar que tanto os soros de cães

positivos a N. caninum como para T. gondii tiveram maior reconhecimento nos

ELISA recombinantes, apresentando também maior grau de reação cruzada entre

os dois parasitos.

Da mesma maneira, quando foram analisados soros de cães

naturalmente infectados com Neospora e/ou Toxoplasma (Figura 6 B),

BSR4

SRS9

53

observaram-se tanto nos soros positivos a Neospora quanto a Toxoplasma

valores superiores com as provas de ELISA baseadas em proteínas de bradizoíto.

Porém, o reconhecimento frente a proteína rNcGRA7 foi baixo.

FIGURA 6. Valores de IRPC obtidos nas diferentes provas de ELISA com soros de cães infectados experimentalmente (A) e de forma natural (B) por Neospora caninum.

Identificação dos antígenos imunodominantes (IDAs) dos taquizoítos de N.

caninum reconhecidos por soros caninos pela técnica de Western-Blot (WB)

e reação cruzada com T. gondii

Os antígenos de N. caninum com maior reconhecimento por soros

positivos a N. caninum pela RIFI foram os de 33-35 KDa, com 53%, e de 60-62

kDa com 40%, e de reconhecimento médio os de 17-18, 41-42 e 67 kDa. Os

antígenos de 77, 53 e 45 kDa mostraram uma baixa ou nula imunogenicidade

(Quadro 1).

A

B

54

Com o objetivo de identificar antígenos que poderiam ser responsáveis

por reações cruzadas, foram analisados também soros de cães positivos por RIFI

a T. gondii, e a ambos os parasitos. Nos soros positivos a ambos, foi observado

um maior reconhecimento das proteínas de 67, 55-57, 51, 37 e 30, 33-35, 41-42

kDa. Da mesma maneira, soros positivos a T. gondii reconheceram também

diversas proteínas de N. caninum, destacando os antígenos de 54 e 30 KDa.

Entre os IDAs identificados para Neospora, os soros positivos a Toxoplasma não

mostraram nenhum reconhecimento frente a banda de 33-35 KDa, porém

reconheceram debilmente os antígenos de 67, 60-62, 41-42 e 17-18 KDa.

QUADRO 1. Reconhecimento de antígenos imunodominantes de Neospora caninum, por WB, frente a soros positivos para Neospora caninum, Neospora caninum e Toxoplasma gondii, Toxoplasma gondii e negativos aos dois parasitos pela técnica de RIFI.

Peso molecular (kDa)

Positivos N. caninum (%)

Positivos N.caninum e T. gondii (%)

Positivos T. gondii (%)

Negativos (%)

77 - - - -

67 26,6 44,4 14,2 6,60

60-62 40,0 14,8 14,2 -

55-57 6,60 37,0 3,50 -

54 - - 32,0 -

53 6,60 - - -

51 13,3 44,4 3,50 13,3

47 20,0 14,8 10,7 -

45 6,60 7,40 14,2 -

41 26,6 40,7 21,4 -

37 13,3 51,8 21,4 6,60

35-33 53,3 33,3 - 6,60

30 6,60 33,3 25,0 -

28 13,3 14,8 14,2 -

21 - 7,40 17,8 6,60

24 13,3 18,51 17,8 13,3

17-18 26,6 40,7 7,00 -

55

Os resultados obtidos indicam um reconhecimento variável dos

antígenos, tanto em soros positivos apenas a N. caninum, positivos a N. caninum

e T. gondii quanto positivos apenas a T. gondii (Figura 7).

FIGURA 7. Reconhecimento dos antígenos de Neospora caninum por soros de cães naturalmente infectados, positivos a Neospora caninum (Iinhas 1-6) com títulos de anticorpos ≤ 1:100; positivos aos dois parasitos (linhas 7-13) com títulos de Neospora caninum e Toxoplasma gondii de 1:200/1:200, 1:800/1:100, 1:100/1:400, 1:200/1:1.600, 1:100/1:200, 1:400/1:6.400, e 1:400/1:3200, respectivamente,. e positivos a Toxoplasma gondii (linhas 14-18) com títulos de anticorpos de 1:100, 1:50, 1:1.600 e 1:200, respectivamente.

O grau de reação cruzada entre os antígenos de N. caninum e T. gondii

foi avaliado analisando o reconhecimento dos soros analisados frente as

proteínas de T. gondii, utilizando também a técnica de WB (Quadro 2). Neste

contexto, 50% dos soros positivos a Toxoplasma reconheceram o antígeno de 30

KDa e 44,8%, o de 34 KDa. Além disso, se observou um reconhecimento médio

(20-38%) frente aos antígenos de 67, 62, 49, 42-43, 38-41, 26, 22-24, 20 e 18

kDa.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

150

100

75

50

37

25

15

10

250

kDa

20

56

Nos soros positivos aos dois parasitos e somente a Neospora, se

observou um aumento do reconhecimento frente as proteínas de 75, 55, 51, 32 e

26 kDa. Os soros positivos a Neospora não reconheceram antígenos de 67, 62,

53, 18 e <14 kDa, entretanto mostraram diferente grau de reconhecimento frente

a diversas proteínas de Toxoplasma.

Por outro lado, os soros controles negativos mostraram uma débil ou

nenhuma reação frente aos antígenos menores de ambos parasitos, a exceção do

antígeno de 30 KDa de Toxoplasma que foi reconhecido por 38,4% dos soros

negativos.

QUADRO 2. Reconhecimento de antígenos imunodominantes de Toxoplasma gondii, por WB, frente a soros positivos para Toxoplasma gondii, Toxoplasma gondii e Neospora caninum, Neospora caninum e negativos aos dois parasitos pela técnica de RIFI.

Peso molecular (kDa)

Positivos T. gondii (%)

Positivos T. gondii e N. caninum (%)

Positivos N. caninum (%)

Negativos (%)

75 - 14,8 37,5 -

73 - - - -

67 20,6 - - 7,70

62 34,4 - - -

55 6,90 66,6 31,5 -

53 6,90 - - 7,70

51 10,3 29,6 12,5 -

49 38,0 3,70 6,25 7,70

46 17,2 40,7 12,5 -

42-43 31,0 11,1 12,5 15,4

38-41 31,0 11,1 12,5 -

34 44,8 37,0 6,25 -

32 10,3 33,3 31,5 7,70

30 55,0 37,0 12,5 38,4

26 31,0 55,5 37,5 7,70

22-24 20,6 44,4 12,5 -

20 20,6 40,7 25,0 7,70

18 24,0 37,0 - -

<14 13,7 14,8 - -

57

Concordância entre as diferentes técnicas sorológicas

Ao comparar a prova de RIFI e as diferentes provas de ELISA, foram

obtidas baixas concordâncias (Tabela 2). A maior parte dos resultados

discordantes foi observada nos soros negativos por RIFI, já que muitos destes

foram positivos por ELISA.

TABELA 2: Valores de Kappa para as provas de ELISA in house Neospora caninum (com pontos de corte 1:50 e 1:100), ELISA in house Toxoplasma gondii e ELISA das proteínas recombinantes rNcGRA7, rNcSAG4, rNcBSR4 e rNcSRS9,

utilizando-se a RIFI como prova de referência.

ELISA Valores Kappa

ELISA in house N. caninum 1:50 0,06

ELISA in house N. caninum 1:100 0,30

ELISA in house T. gondii 0,40

ELISA rNcGRA7 0,03

ELISA rNcSAG4 0,10

ELISA rNcBSR4 0,21

ELISA rNcSRS9 0,20

No WB, antígenos de 33-35 e 60-62 kDa aparecem com maior

freqüência nos soros que concordaram positivamente, tanto na RIFI quanto no

ELISA de extrato solúvel e ELISA recombinantes. Nos soros que apresentaram

alguma discordância entre estas técnicas, antígenos de 37 e 55-57 kDa foram

mais freqüentes, principalmente nos soros que eram positivos tanto a N. caninum

quanto a T. gondii.

Discussão

Neste estudo não foi observada boa concordância entre RIFI e PCR, e

somente em seis cães foram detectados DNA de N. caninum no cérebro. Dois

cães foram positivos na PCR e negativos na RIFI, provavelmente porque, na

infecção crônica, os parasitos nas formas de cistos nos órgãos estimulam pouco o

sistema imune.

58

Estudos envolvendo o diagnóstico por PCR em órgãos de cães são

raros. GHALMI et al. (2008) pesquisaram, por Real Time PCR, DNA de N.

caninum em baço e fígado de 87 cães, e ao comparar o resultado com RIFI, não

encontraram boa concordância, sendo a PCR menos sensível. Os autores

atribuem essa menor sensibilidade tanto à pequena quantidade de tecido utilizado

para a pesquisa de DNA, quanto pela escolha dos órgãos, pois sabe-se que N.

caninum é mais fácilmente encontrado em órgãos do SNC. Porém, no presente

estudo, mesmo utilizando os cérebros de cães, pode ser observado que a

frequência em cães sem sintomatologia clínica é baixa, e provavelmente a carga

parasitária também, sendo difícil a detecção do parasito nesses animais.

Novamente, GHALMI et al. (2009a) ao analisarem sangue de cães por

Real Time PCR, não obtiveram boa concordância entre a RIFI e a PCR, e

afirmaram que estes dois testes medem diferentes aspectos da relação

hospedeiro-parasito, pois a sorologia é uma forma indireta de estudo da

exposição de cães frente a N. caninum. Ainda assim, a PCR pode ser utilizada em

cães que morreram ou que foram eutanasiados, para a confirmação do

diagnóstico de neosporose (BARBER & TREES, 1996).

Não há na literatura informações a respeito de H. heydorni em órgãos

de cães, e nosso estudo demonstrou que o SNC talvez não seja ideal para a

pesquisa do parasito, uma vez que não foi encontrado DNA nos cérebros

analisados.

Neste estudo, T. gondii foi encontrado no cérebro de 23 cães,

demonstrando que este parasito, assim como N. caninum, também tem tropismo

por tecidos nervosos, e os cães apresentaram positividade à sorologia a T. gondii

muito maior do que a N. caninum, inclusive com títulos de anticorpos muito mais

altos.

Em relação à sorologia, não foi observada reação cruzada na prova de

RIFI entre N. caninum e T. gondii, tanto nos soros de infecção natural quanto nos

soros de infecção experimental, como observado por outros autores (TREES et al,

1994; BUXTON et al., 1997). A RIFI detecta antígenos de superficie do taquizoíto,

e provavelmente estes antígenos são menos propensos a ocasionar reações

cruzadas, ao contrário dos antígenos de extrato solúvel utilizados na prova de

59

ELISA, que possivelmente são mais propensos a ocasionar tais reações (PARÉ et

al, 1995; DUBEY et al., 1996).

Vários ELISA utilizando antígenos solúveis de taquizoítos foram

desenvolvidos e testados para a sorologia de N. caninum em cães (LASRI et al.,

2004, PINHEIRO et al., 2005, CAPELLI et al., 2006; SILVA et al., 2007), mas

nenhum destes apresentou boa sensibilidade e especificidade, tampouco

apresentaram boa concordância com a RIFI, e em alguns casos, não foram

indicados para estudos soroepidemiológicos (CAPELLI et al., 2006), e inclusive

demonstraram reação cruzada entre antígenos de N. caninum e T. gondii (SILVA

et al., 2007), assim como no presente estudo.

Em relação a esse ponto, uma maior concordância entre as técnicas foi

observada quando se estabeleceu como ponto de corte para a RIFI a diluição de

1:100. Esta observação está de acordo com GHALMI et al. (2009b), que também

encontraram melhor concordância entre as duas provas quando os títulos na RIFI

eram maiores. Porém, ao se utilizar um ponto de corte mais alto, a probabilidade

de se encontrar cães positivos diminuiria, uma vez que a maioria dos cães

apresenta títulos baixos.

Ao analisar os resultados de WB, observou-se que há um

reconhecimento dos IDAs já identificados em soros de bovinos (ÁLVAREZ-

GARCÍA et al., 2002), ainda que em menor porcentagem e maior variabilidade.

Em diversos estudos foram analisados soros de cães positivos a N.

caninum por WB, e proteínas de 14, 33, 42 e 55 kDa foram identificadas

(BJORKMAN et al., 1994; HEMPHILL et al., 1999; MINEO et al., 2001; SCHARES

et al., 2001), e assim como neste estudo, a frequência de reconhecimento foi

variável.

SILVA et al. (2007) sugerem que os antígenos de N. caninum

imunodominantes, especialmente os de 17 e 29-32 kDa devem ser utilizados

como marcadores selecionados com o fim de desenvolver sistemas de

diagnóstico sorológico da infecção por N. caninum em cães. Por outro lado,

JESUS et al. (2007) evidenciaram o reconhecimento de antígenos de 14, 30, 40,

43, 55, 60, 77, 84 e 170 kDa em soros de cães que tiveram resultados

discordantes (negativos a RIFI e positivos no ELISA). No presente estudo, os

antígenos de N. caninum com maior reconhecimento por soros positivos a N.

60

caninum pela RIFI foram os de 33-35 e de 60-62 kDa, contudo não foi observado

um padrão de reconhecimento pelos soros positivos por RIFI, nem mesmo pelos

soros de infecção experimental por N. caninum, evidenciando que o WB pode não

ser uma boa técnica de diagnóstico para a neosporose canina.

PINHEIRO et al. (2005) relataram que a banda de 37 kDa de N.

caninum foi reconhecida por soros positivos e negativos, o que indica que outros

antígenos não específicos podem estar presentes em ambos os grupos de cães.

Neste estudo, a banda de 37 kDa foi mais reconhecida por soros que tiveram

resultados discordantes entre RIFI e ELISA, que eram, em sua maioria, soros de

infecção mista (positivos a N. caninum e T. gondii).

Outras provas de ELISA utilizando-se proteínas recombinantes já foram

criadas. Recentemente, GHALMI et al. (2009b) avaliaram um ELISA.SRS2

sandwich comercial, tanto em soros de bovinos como de cães, e encontraram

valores de sensibilidade e especificidade bons quando comparados à RIFI,

porém, não estudaram a reação cruzada com T. gondii. No presente estudo, foi

observado um alto reconhecimento das proteínas recombinantes rNcSAG4,

rNcGRA7, rNcBSR4 e rNcSRS9, quando testadas frente à soros provindos de

cães com infecção experimental por T. gondii.

Em relação às provas de ELISA baseadas em proteínas recombinantes

de N. caninum aqui desenvolvidas, se pretendia resolver alguns dos principais

problemas que apresentam as provas diagnósticas sorológicas convencionais.

Neste sentido, a utilização de duas provas de ELISA baseadas no emprego dos

antígenos recombinantes rNcSAG4 e rNcGRA7 ofereceria alternativas para

distinguir as diferentes fases da infecção por N. caninum no hospedeiro definitivo

(neosporose aguda e crônica). Na neosporose bovina, a prova ELISA rNcGRA7 é

mais sensível que a prova ELISA convencional para detectar uma primo infecção.

Já a prova de ELISA rNcSAG4 permite detectar a infecção em animais

soronegativos que apresentam flutuações de anticorpos durante uma infecção

crônica (AGUADO-MARTÍNEZ et al., 2008).

Neste estudo, foram detectados alguns casos de animais

soronegativos mediante a prova ELISA convencional que apresentaram elevado

reconhecimento frente a ambas as proteínas recombinantes. Tal condição poderia

ser indicativa de uma possível reativação de uma infecção crônica

61

(recrudescência). Em relação a esta última, foi comprovado que o emprego

conjunto das provas de ELISA recombinantes desenvolvidas permitem diferenciar

uma primo infecção (reconhecimento de rNcGRA7) de uma infecção crônica

(reconhecimento de rNcSAG4), de forma similar ao que permite a prova ELISA de

avidez. Além disso, o emprego dessas provas permitiria diferenciar uma infecção

crônica de uma recrudescência (reconhecimento tanto de rNcGRA7 como de

rNcSAG4).

Por outra parte, foi investigada a utilidade diagnóstica na neosporose

canina de outros dois genes de N. caninum específicos da fase de bradizoíto,

rNcBSR4 e rNcSRS9. Os resultados obtidos em relação a aplicação dos ELISA

recombinantes na neosporose canina indicaram uma utilidade diagnóstica

limitada, já que mostraram algum grau de reação cruzada com T. gondii,

principalmente com as proteínas específicas da fase de bradizoíto (rNcSAG4,

rNcBSR4 e rNcSRS9). Porém, nos soros dos cães infectados experimentalmente

com N. caninum, colhidos durante a fase aguda e utilizando o ELISA rNcGRA7

(proteína específica da fase de taquizoíto e marcador de fase aguda), se

observaram maiores valores de IRPC que ao se utilizar as provas de ELISA

baseadas em extrato solúvel e das proteínas específicas da fase de bradizoíto do

parasito (SAG4, BSR4 e SRS9), o que confirmaria que a prova ELISA rNcGRA7 é

mais sensível para a detecção de uma primo infecção.

Quando foram analisados soros de cães naturalmente infectados com

Neospora, foram observados valores de IRPC superiores com as provas de

ELISA baseadas em proteínas de bradizoíto. Por outro lado, o reconhecimento

frente a proteína GRA7 foi baixo, o que indicaria a existência de uma infecção

crônica.

Conclusão

Na técnica de RIFI não foi observada reação cruzada entre N. caninum

e T. gondii. As proteínas recombinantes mostraram reação cruzada com T. gondii,

porém mostraram-se capazes de diferenciar as fases aguda e crônica da

infecção. O WB não demonstrou ser uma boa técnica de diagnóstico para N.

62

caninum em cães, pois não foi observado padrão de reconhecimento de proteínas

imunodominantes. As proteínas recombinantes de fase de bradizoíto são

promissoras para o diagnóstico da infecção natural por N. caninum em cães, a

partir de técnicas de ELISA que minimizem os efeitos da reação cruzada com T.

gondii. A pesquisa de DNA de parasitos em órgãos de cães pode ser utilizada

como uma ferramenta para o diagnóstico post-mortem de infecções por

protozoários.

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67

CAPÍTULO 4

CONSIDERAÇÕES FINAIS

Ao se aplicar a biologia molecular para a identificação genética dos

protozoários encontrados nas fezes dos cães, pode-se observar que as espécies

identificadas das amostras de Cryptosporidium e Giardia foram espécie-

específica. Estes resultados são importantes do ponto de vista epidemiológico,

pois, ao contrário do que se pensava, não parece ser comum a ocorrência de um

ciclo de transmissão zoonótica entre cães e seres humanos. Poucos trabalhos

neste sentido já foram realizados no Brasil, porém, para que se possa entender

melhor o papel do cão na infecção humana por estes dois agentes, e assim,

compreender a epidemiologia de ambos, é essencial o uso de técnicas

moleculares que permitam a identificação de cada espécie envolvida, inclusive

com estudos filogenéticos que permitirão agregar informações que servirão para

pesquisas futuras.

Observou-se ainda, que a excreção de oocistos semelhantes a N.

caninum pelos cães é rara, e quando ocorre, não é possível identificá-los apenas

pela morfologia. Assim sendo, o uso das técnicas moleculares faz-se novamente

necessário para a identificação correta dos oocistos presentes, pois muitas vezes,

mesmo cães que estão excretando oocistos podem apresentar sorologia negativa,

e a detecção destes nas fezes é uma ferramenta a mais para o diagnóstico de N.

caninum em cães.

Além disso, por meio destas técnicas moleculares, pode-se realizar a

identificação dos oocistos de H. heydorni também, que se mostrou estar mais

presente nas fezes dos cães do que N. caninum. O reconhecimento correto de

oocistos em fezes de cães se torna ainda mais importante, ao considerar a

possibilidade do isolamento de H. heydorni pelo crescimento de taquizoítos em

cultivos celulares, e a posterior padronização de um teste diagnóstico, tal como foi

e é comumente feito para N. caninum, para, entre outras finalidades, estudar a

reação cruzada com este parasito.

68

As técnicas de PCR utilizadas para a pesquisa do parasito em órgãos

dos animais demonstraram uma sensibilidade baixa em relação à sorologia,

provavelmente associada à pequena quantidade de tecido utilizada. Além disso, a

técnica não pode ser utilizada em cães vivos, porém pode ser útil como

ferramenta para auxiliar no diagnóstico post-mortem.

Assim sendo, o diagnóstico da neosporose canina é feito

principalmente por meio de provas sorológicas, porém, os critérios utilizados nas

amostras de soros para considerá-los positivos são variáveis, e dependem das

técnicas empregadas e dos pontos de corte utilizados.

Em conjunto, os resultados apresentados no quarto capítulo indicam

que a prova de ELISA deve ser utilizada de maneira crítica, devido a possível

reação cruzada com T. gondii. Em relação às provas de ELISA baseadas em

proteínas recombinantes de N. caninum aqui desenvolvidas, se pretendia resolver

alguns dos principais problemas que apresentam as provas diagnósticas

sorológicas convencionais. Neste sentido, o emprego das provas de ELISA

utilizando-se antígenos recombinantes ofereceria alternativas para distinguir as

diferentes fases da infecção por N. caninum no hospedeiro definitivo (aguda e

crônica).

Os resultados obtidos em relação a aplicação dos ELISA

recombinantes na neosporose canina indicaram uma utilidade diagnóstica

limitada, já que mostraram algum grau de reação cruzada com T. gondii. Porém,

em cães naturalmente infectados, pode-se perceber uma predominância de

infecção crônica, pelo maior reconhecimento das proteínas recombinantes de fase

de bradizoítos. Este resultado poderia sugerir que os ELISA recombinantes são

mais sensíveis na detecção de animais com uma infecção crônica e com baixo ou

nenhum reconhecimento nas provas convencionais (RIFI ou ELISA baseado em

extrato solúvel).

Tais resultados são promissores e indicariam que estas proteínas

poderiam ser de grande utilidade no diagnóstico da neosporose canina, mas é

necessário o desenvolvimento de outras técnicas de ELISA (ELISA de competição

com anticorpos monoclonais frente as proteínas ou ELISA de inibição) com o fim

de reduzir a reação cruzada com T. gondii.

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Vale ressaltar ainda, que os baixos títulos encontrados em cães

soropositivos a N. caninum, tanto neste quanto em outros estudos, dificultam a

viabilidade da prova de ELISA, pois podem ser interpretados como resultados de

reações cruzadas. Ao se observar os valores de IRPC do ELISA em comparação

com os títulos de RIFI, percebemos que em cães com títulos baixos, os valores de

IRPC foram muito próximos aos valores de IRPC dos cães soronegativos.

Por outro lado, não foi observada reação cruzada na RIFI, onde são

detectados somente anticorpos frente a antígenos de superfície de taquizoítos,

entre T. gondii e N. caninum, mas não se sabe se há algum tipo de reação

cruzada com H. heydorni, uma vez que não existem testes sorológicos

disponíveis para este parasito. Ainda assim, a RIFI poderia ser considerada como

a técnica sorológica mais sensível para o diagnóstico de N.caninum em cães.

O WB, por sua vez, não deve ser considerado uma boa técnica de

referência para o diagnóstico em cães, pois, diferente do observado em bovinos,

não há um padrão de reconhecimento de anticorpos imunodominantes,

apresentando uma alta variabilidade tanto em soros positivos quanto em

negativos. Além disso, foram observadas a existência de reações cruzadas com

antígenos de T. gondii, e baixa sensibilidade.

Os resultados mais significativos encontrados neste trabalho indicam

que a sorologia para N. caninum em cães tem importantes limitações, devido

principalmente às seguintes razões: os títulos frente a N. caninum são geralmente

baixos, indicando uma infecção subclínica; à reação cruzada com T. gondii e

provavelmente outros parasitos relacionados; à alta prevalência da infecção por T.

gondii em cães e à alta incidência de infecções mistas (N. caninum e T. gondii).

Estas limitações dão lugar a uma baixa concordância entre as técnicas e a

dificuldade na interpretação dos resultados.

Sugere-se que a RIFI seja utilizada como prova de referência para o

diagnóstico da neosporose canina e que, além de T. gondii, H. heydorni pode ter

um papel fundamental para o diagnóstico sorológico correto da neosporose

canina, já que provavelmente compartilham muitos antígenos semelhantes. A

criação de uma técnica sorológica específica para este parasito e a detecção dos

anticorpos imunodominantes torna-se necessária para que se conheça o grau de

reação cruzada entre os dois parasitos e para que se possam entender melhor os

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diferentes resultados encontrados entre as diferentes técnicas sorológicas

utilizadas. Além disso, é interessante que se aprofundem os estudos a respeito

das proteínas recombinantes de fase de bradizoíto, uma vez que, pelos

resultados observados, a infecção crônica parece ser predominante em cães

infectados naturalmente.