UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE...

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS

JULIANA DE ALMEIDA FARIA

O CONSUMO DE FRUTOSE RESTRITO A FASE CLARA DO CICLO E SUAS IMPLICAÇÕES PARA A ATIVAÇÃO DA AMPK HIPOTALÂMICA, A

PRODUÇÃO DE MELATONINA E O METABOLISMO

LIGHT PHASE RESTRICTED FRUCTOSE CONSUMPTION AND ITS IMPLICATIONS ON HYPOTHALAMIC AMPK ACTIVATION, MELATONIN

PRODUCTION AND GLUCOSE METABOLISM

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS



PRODUÇÃO DE MELATONINA E O METABOLISMO GLICÍDICO



CAMPINAS

2016


GLICÍDICO




PRODUÇÃO DE MELATONINA E O METABOLISMO GLICÍDICO



Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Farmacologia.

Doctoral Thesis presented to the Faculty of Medical Sciences, State University of Campinas - UNICAMP to obtain the title of Doctor of Pharmacology.

Orientador: Professor Dr. Gabriel Forato Anhê Tutor: Professor Dr. Gabriel Forato Anhê ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA JULIANA DE ALMEIDA FARIA E ORIENTADA PELO PROF. DR. GABRIEL FORATO ANHÊ.

CAMPINAS

2016

Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): FAPESP, 2012/11409-4

Ficha catalográfica

Universidade Estadual de Campinas

Biblioteca da Faculdade de Ciências Médicas

Maristella Soares dos Santos - CRB 8/8402

Faria, Juliana de Almeida, 1986-

F225c FarO consumo de frutose restrito a fase clara do ciclo e suas implicações para

a ativação da AMPK hipotalâmica, a produção de melatonina e o metabolismo

glicídico / Juliana de Almeida Faria. – Campinas, SP : [s.n.], 2016.

FarOrientador: Gabriel Forato Anhê.

FarTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de

Ciências Médicas.

Far1. Frutose. 2. Ingestão fora de fase. 3. Hipotálamo. 4. Proteína quinase

ativada por AMP. 5. Corticosterona. 6. Melatonina. I. Anhê, Gabriel

Forato,1980-. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências

Médicas. III. Título.

Informações para Biblioteca Digital

Título em outro idioma: Light phase restricted fructose consumption and its implications on

hypothalamic AMPK activation, melatonin production and glucose metabolism

Palavras-chave em inglês:Fructose

Out-of-phase feeding

Hypothalamus

AMP-Activated protein kinase

Corticosterone

Melatonin

Área de concentração: Farmacologia

Titulação: Doutora em Farmacologia

Banca examinadora:Gabriel Forato Anhê [Orientador]

Andrea Maculano Esteves

Gabriela Freitas Pereira de Souza

Thomas Prates Ong

José Donato Júnior

Data de defesa: 29-07-2016

Programa de Pós-Graduação: Farmacologia

BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE DOUTORADO


ORIENTADOR: PROF. DR. GABRIEL FORATO ANHÊ

MEMBROS:

1. PROF. DR. GABRIEL FORATO ANHÊ

2. PROF. DRa. ANDREA MACULANO ESTEVES

3. PROF. DRa. GABRIELA FREITAS PEREIRA DE SOUZA

4. PROF. DR. THOMAS PRATES ONG

5. PROF. DR. JOSÉ DONATO JÚNIOR

Programa de Pós-Graduação em Farmacologia da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.

A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.

Data: 29/07/2016

"I do not know what I may appear to the world,

but to myself I seem to have been only like a boy

playing on the sea-shore, and diverting myself in now and

then finding a smoother pebble or a prettier shell than ordinary,

whilst the great ocean of truth lay all undiscovered before me."

Sir Isaac Newton

AGRADECIMENTOS

A Deus, minha “...humilde admiração do espírito superior e ilimitado que se revela nos menores

detalhes que podemos perceber em nossos espíritos frágeis e incertos... Essa convicção,

profundamente emocional na presença de um poder racionalmente superior, que se revela no

incompreensível universo...”.

Aos meus pais, Mauro e Marilza, pelo amor. Pela persistência e dedicação em me proporcionar

o que não tiveram. Pela educação e pelos valores transmitidos, baseados no exemplo e não

simplesmente em palavras vãs.

Ao meu irmão e aos meus avós, tios e primos pelo carinho, pela torcida e confiança no caminho

escolhido pra seguir.

Ao professor Gabriel Anhê, pela convivência diária, pela valiosa e consistente orientação, pela

inquestionável reverência e estima a ciência, pelas diversas oportunidades proporcionadas e pela

confiança em me integrar ao seu “time científico”. Agradeço pelo tempo dedicado a minha

formação profissional e intelectual. Serei eternamente grata.

Aos amigos, Letícia M. Ignácio de Souza e Thiago M. Ferreira de Araújo, presenças constantes

dentro e fora do laboratório. Pela sinceridade. Por desafiarem minhas convicções e permitirem o

questionamento e ampliação do meu limitado universo de ideias e teorias. Com vocês, entendi

que a amizade pode (e deve) ser catalisadora de transformações.

Ao Lucas pelo amor e companheirismo. Pela paciência. Por acreditar em mim mais do que eu

mesma. Por dividir (e somar) os planos e os sonhos dessa breve vida. Por achar graça dos meus

devaneios. Por trazer calma onde a ansiedade e a agitação predominam.

Ao querido Senhor Miguel pelo empenho no cuidado dos animais experimentais. Pelo seu

fantástico senso de humor.

Agradeço aos colegas e amigos do Laboratório de Farmacologia e Fisiopatologia do Diabetes

Mellitus e do Laboratório de Sinalização Celular pelas discussões sobre ciência e sobre a vida

(quantas vezes elas se confundem).

Pelo universo desconhecido que nos desafia constantemente. Pela curiosidade, alavanca das

descobertas e propulsora da inovação. Pelos que, acometidos pela doença, necessitam de

esperança em terapias mais eficientes.

Agradeço ainda a Thiago M. Ferreira de Araújo, Letícia M. Ignácio de Souza, Daniela Razolli,

Dailson Souza e ao professor Gabriel Anhê, os quais se dedicaram diretamente a realização deste

trabalho. Por questionarem sempre. Pelos experimentos diurnos e/ou noturnos (os ZT’s não serão

esquecidos). Pela paciência quando o meu cansaço já substituía o entusiasmo.

À Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri por minha formação básica.

Exemplo de que, mesmo diante de tantas limitações, é possível capacitar seus graduandos.

À Universidade Estadual de Campinas pela inspiração e orgulho. Nem nos planos mais otimistas,

me imaginei “filha” dessa grandiosa Instituição.

À Universidade de Cambridge, ao Instituto de Ciências Metabólicas e a professora Susan Ozanne

pela calorosa acolhida durante parte do meu Doutorado. Por permitir que as “janelas” do

conhecimento fossem ampliadas.

Aos animais experimentais, sem os quais seria impossível desenhar e desenvolver esse projeto.

Pela vida doada à ciência.

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, pelo auxílio financeiro. Pela

concessão da bolsa de estudo no país e da bolsa de estágio em pesquisa no exterior.

RESUMO

DE ALMEIDA FARIA, J. O consumo de frutose restrito a fase clara do ciclo e suas

implicações para a ativação da AMPK hipotalâmica, a produção de melatonina e o

metabolismo glicídico. 2016. 84 f. Tese (Doutorado) – Faculdade de Ciências Médicas,

Universidade Estadual de Campinas, São Paulo, 2016.

O consumo de dietas ricas em frutose exerce uma conhecida modulação a qual se caracteriza por

resistência periférica à ação da insulina, aumento de gliconeogênese e esteatose hepáticas sobre o

metabolismo glicêmico. Os mecanismos exatos pelos quais a frutose realiza estas ações estão em

contínua elucidação, no entanto já se sabe que tanto o aumento da gliconeogênese quanto o

estímulo à hiperfagia resultam da ativação da proteína AMPK no hipotálamo. Dentre as diversas

modulações endócrinas que a frutose exerce, foi recentemente descrita a redução na produção

noturna de melatonina. A melatonina, um hormônio produzido de maneira circadiana pela

glândula pineal, tem a capacidade de sincronizar o metabolismo energético aumentando a

sensibilidade à insulina e reduzindo a gliconeogênese. Assim como a produção de melatonina,

sabe-se que a atividade hipotalâmica da AMPK apresenta um ritmo circadiano com valores

aumentados no período noturno. Foi demonstrado recentemente que o aumento da atividade

hipotalâmica da AMPK com ativadores farmacológicos reduz a produção noturna de melatonina.

Interessantemente, a frutose ingerida exclusivamente durante a fase clara do ciclo claro/escuro

resulta em modificações metabólicas similares às descritas acima, enquanto que a frutose

ingerida durante a fase escura parece exercer efeitos metabólicos mais brandos. O presente

estudo traz os resultados oriundos da investigação das alterações metabólicas resultantes da

ingestão de frutose em diferentes fases do ciclo claro/escuro; e nesse contexto, avalia se tais

alterações mostram-se dependentes de modificações nos padrões de atividade da AMPK no

hipotálamo e da produção de corticosterona.

Palavras-chave: Frutose, Ingestão fora de fase, Hipotálamo, AMPK, Corticosterona,

Melatonina.

ABSTRACT

DE ALMEIDA FARIA, J. The light phase restricted fructose consumption and its

implications on hypothalamic AMPK activation, melatonin production and glucose

metabolism. 2016. 84 f. Thesis (Doctoral) – Faculty of Medical Sciences, University of

Campinas, Sao Paulo, 2016.

A high fructose diet exerts a known modulation which is characterized by peripheral resistance

to the insulin action, increased gluconeogenesis and hepatic steatosis on glucose metabolism.

The exact mechanisms by which fructose triggers such actions are in continuous elucidation

however it is known that the increased gluconeogenesis and the hyperphagia stimulation both

result from activation of hypothalamic AMPK protein. Among several endocrine modulations,

fructose promotes a reduction on nocturnal melatonin production. Melatonin, a hormone

produced by pineal gland in a circadian manner, has the ability to synchronize the energetic

metabolism by increasing insulin sensitivity and reducing gluconeogenesis. As melatonin

production, it is known that hypothalamic AMPK activity has a circadian rhythm with increased

values during the night phase. It has been shown recently that increased hypothalamic AMPK

activity through pharmacologic activators is able to reduce nocturnal melatonin production.

Interestingly, fructose consumption only during the light phase of the light / dark cycle results in

metabolic changes similar to those described above, while fructose intake exclusively during the

dark phase appears to exert milder metabolic effects. This study presents the results arising from

the research of metabolic changes resulting from fructose intake at different phases of light / dark

cycle; and in this context, we have assessed whether such changes are dependent on

hypothalamic AMPK activity patterns and corticosterone production.

Key words: Fructose, Out-of-phase feeding, Hypothalamus, AMPK, Corticosterone, Melatonin.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AMP

AMPK

Adenosina monofosfato

Proteína quinase ativada por AMP

ANOVA

AUC

Análise de variância

Area under curve

ATP Trifosfato de adenosina

CRH Hormônio liberador de corticotrofina

DMSO Dimetilsulfóxido

DTT Ditiotreitol

EDTA Ácido etileno diamino tetracético

ELISA

EPM

FoxO1

G-6-Pase

Ensaio imunoenzimático

Erro padrão da média

Forkhead box protein O1

Glicose-6-fosfatase

GLUT4 Transportador de glicose tipo 4

GTT

HFCS

HPA

icv

Teste de tolerância à glicose

High fructose corn syrup

Hipotálamo-pituitária-adrenal

Intracerebrovenricular

ITT

NaCl

NES

Teste de tolerância à insulina

Cloreto de sódio

Night eating syndrome

PEPCK

PHG

PTT

Fosfoenolpiruvato carboxiquinase

Produção hepática de glicose

Teste de tolerância ao piruvato

SDS-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio

Tris

ZT

Tri(hidroximetil)-aminometano

Zeitgeber time

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO

14

OBJETIVOS 22

Objetivo Geral 22

Objetivos Específicos

METODOLOGIA

22

23

CAPÍTULO 1 – Artigo referente à tese 29

Abstract 30

Introduction 31

Methods 32

Results 36

Discussion 42

References 47

Figure Legends

Figures

DISCUSSÃO

CONCLUSÃO

53

56

60

65

CAPÍTULO 2 – Co-autoria/autoria de artigos publicados na área durante o período 66

REFERÊNCIAS 68

APÊNDICE 79

ANEXOS 84

14

INTRODUÇÃO

O açúcar e seu consumo através dos diferentes momentos históricos

Vários registros históricos demonstram que o consumo de açúcar, tal como

conhecemos, teve início apenas no último século. De forma breve, destaco aqui os

principais momentos históricos que permitiram o gradativo aumento do consumo de

açúcar até os padrões atuais.

Durante o período Paleolítico (conhecido ainda como Idade da Pedra Lascada),

as proteínas constituíam a base alimentar do Homem e eram oriundas de atividades

como pesca e caça. Os carboidratos eram obtidos exclusivamente de vegetais

encontrados casualmente e coletados da natureza, uma vez que a agricultura ainda não

havia sido desenvolvida. Nesse período, portanto, os açúcares, presentes naturalmente e

em quantidades modestas, eram consumidos de forma totalmente dependente da estação

do ano principalmente em países localizados em média e alta latitudes onde as estações

são marcadamente definidas.

No período Neolítico ou Idade da Pedra Polida, indivíduos, em diferentes

posições geográficas e de forma independente, perceberam que os grãos coletados

poderiam ser enterrados e, após algum tempo, dariam origem a novas plantas e,

consequentemente, a novos frutos. Nesse momento, entende-se que é possível cultivar

espécies vegetais e, portanto, controlar, pelo menos em parte, a disponibilidade de

alimentos.

Acredita-se que a escassez e a palatabilidade do açúcar foram responsáveis pelo

interesse recorrente de diversos povos em desenvolver técnicas que ampliassem a

obtenção de tal nutriente (Tappy & Lê, 2010).

15

Nessa linha cronológica, os próximos eventos históricos permitiram o contato de

países localizados na Europa com civilizações fixadas no Oriente Médio e em regiões

que hoje pertencem à Índia e à China. As Cruzadas e as Grandes Navegações levaram

ao estreitamento das relações comerciais entre o continente europeu e o asiático

viabilizando a substituição do mel, até então o principal agente edulcorante usado na

Europa, pelo açúcar extraído da cana e de outros vegetais. O açúcar oriundo de países

orientais foi incorporado rapidamente à cultura alimentar europeia e, mais tarde, seu

consumo, na forma de sacarose, foi difundido para os outros continentes.

Porém, a Revolução Industrial constituiu o período no qual aconteceram as mais

profundas transformações nos padrões alimentares. Durante esse período, o açúcar

passou a ser o principal componente da dieta ocidental (Licht, 2005). O

desenvolvimento e aperfeiçoamento de métodos de extração pela indústria alimentícia

permitiram maior eficiência na obtenção de frutose através do processo de isomerização

enzimática (Marshall, 1957). Com isso, na América do Norte, o xarope de milho rico

em frutose (originalmente nomeado como high fructose corn syrup ou simplesmente

compilado na sigla HFCS) passou a ser largamente produzido (White, 2008). O alto

poder edulcorante, a facilidade na extração e o baixo custo de produção foram fatores

que favoreceram a implementação e expansão do consumo da frutose à época e

explicam o interesse na manutenção desse monossacarídeo como um dos principais

componentes de produtos industrializados até os dias atuais (Tappy & Lê, 2010).

Efeitos metabólicos da frutose e a dependência do horário de ingestão

Dentre os diversos fatores ambientais reconhecidos como determinantes para o

ganho de peso e o estabelecimento de quadros que favorecem a resistência à insulina, a

composição da dieta é aquele que recebe maior atenção da comunidade científica.

16

Estudos realizados em humanos e em roedores mostram que, de maneira geral, a

ingestão de dietas ricas em açúcares e/ou em gorduras saturadas tem capacidade de

induzir resistência à insulina e aumento de adiposidade (Lê et al., 2009; Ragheb et al.,

2008; Rajasekar et al., 2007).

Antes de 1950, a frutose era encontrada em baixas quantidades na dieta humana,

a qual dispunha de alimentos que apresentavam naturalmente tal monossacarídeo, entre

os quais, cereais, vegetais e mel. O interesse em implementar e difundir o uso da frutose

residiu, em um primeiro momento, no fato de que esse nutriente apresenta poder

edulcorante maior que a glicose pura. Assim sendo, a frutose passou a ser

comercializada e ingerida na forma de sacarose (dissacarídeo frutose/glicose) ou ainda,

e principalmente, em sua forma pura, presente no xarope de milho rico em frutose; a

forma pura tem sido amplamente utilizada na dieta norte-americana até os dias atuais

conforme já mencionado anteriormente (Tappy & Lê, 2010). Porém, a rápida inserção e

difusão do consumo deste nutriente no ocidente e sua associação com o aumento no

número de casos de obesidade fizeram com que a frutose se tornasse alvo de vários

estudos buscando sua relação com o aumento de adiposidade corporal.

Foi demonstrado que a metabolização da frutose não depende da ação da

insulina. Além disso, após o consumo desse monossacarídeo, ocorrem flutuações

glicêmicas discretas, ao contrário do que ocorre após a ingestão de glicose. Por essas

razões, a frutose foi, em um primeiro momento, utilizada como alternativa à sacarose e

à glicose por pacientes diabéticos (Havel, 2005). No entanto, diversos estudos em

roedores mostraram uma consistente relação entre consumo crônico de frutose e

resistência à insulina em órgãos metabolicamente importantes, obesidade, Diabetes

Mellitus tipo II e hipertensão arterial (revisado por Tappy & Lê, 2010). Apesar de ainda

não determinados com exatidão, muitos mecanismos foram propostos para explicar o

17

possível efeito pró-resistência à insulina causada pela frutose. As primeiras abordagens

mostraram que o metabolismo da frutose pelo fígado leva a formação de fosfo-triose a

qual pode, à jusante da via, ser convertida à glicose. Desta maneira, mais de 50% da

frutose absorvida pelo trato gastrointestinal é convertida à glicose pelo fígado,

contribuindo para o aumento da glicemia de jejum (Bode et al., 1981).

Além disso, o próprio metabolismo hepático da frutose predispõe a síntese de

ácidos graxos e acúmulo de gordura em hepatócitos. Diversos relatos experimentais

descrevem um quadro de esteatose hepática em animais submetidos a dietas ricas em

frutose por um longo período de tempo (Mayes, 1993; Ragheb et al., 2008). Acredita-se

que o acúmulo de gordura no fígado leva um aumento da expressão de citocinas pró-

inflamatórias pelo hepatócito que, por sua vez, diminui a transmissão do sinal

intracelular da insulina. A resistência hepática a ação da insulina é marcada por um

drástico aumento da gliconeogênese e aumento da glicemia de jejum (Samuel, 2011).

Além dos eventos acima mencionados, a oxidação da frutose pela

cetohexocinase gera uma baixa quantidade de ATP e leva a uma diminuição da razão

ATP/AMP intracelular, facilitando deste modo a ativação da proteína kinase dependente

de AMP (AMPK). Recentemente, experimentos de nosso grupo mostraram que a

frutose pode aumentar a gliconeogênese em decorrência de ações extra-hepáticas.

Nossos estudos mostram que a frutose tem a capacidade de agir diretamente no

hipotálamo e estimular a ativação da AMPK. A ativação hipotalâmica da AMPK resulta

em disparo de uma resposta contra-reguladora da ação da insulina marcada por aumento

da produção de corticosterona, um clássico estimulador da gliconeogênese (Kinote et al,

2012). A ativação hipotalâmica da AMPK pela frutose também apresenta outras

relevâncias, entre as quais, a estimulação direta da ingestão alimentar (Cha et al., 2008).

18

Um estudo recente mostra que também o horário da ingestão de frutose parece

determinar a intensidade de seus efeitos metabólicos descritos acima. Ratos expostos à

frutose durante a fase clara do ciclo claro/escuro apresentaram um aumento de

adiposidade e resistência à insulina ao passo que estas adaptações metabólicas não

foram observadas em animais expostos à frutose durante a fase escura do ciclo

claro/escuro (Morris et al., 2012). Apesar deste estudo não descrever o mecanismo que

explica o efeito horário-dependente da frutose, pode se levar em conta uma possível

interferência no ritmo circadiano da atividade hipotalâmica da AMPK. Neste sentido, já

está relativamente bem estabelecido que as flutuações nas atividades da AMPK no

hipotálamo apresentam valores máximos durante a noite e mínimos durante o dia em

roedores (Um et al., 2011).

Dependendo de sua intensidade e frequência, a ingestão de alimentos fora de

fase por seres humanos pode ser classificada como a night eating syndrome (NES)

(Stunkard et al., 1955), traduzida livremente como síndrome da alimentação noturna. A

prevalência de NES é relativamente baixa na população em geral, mas varia entre 8,9 e

27% em subgrupos obesos (Rand et al., 1957). Os estudos de coorte mostraram que a

NES está positivamente correlacionada ao diagnóstico de síndrome metabólica,

aumento de triglicerídios e da circunferência da cintura (Gallant et al., 2014). Entre as

várias adaptações, o perfil endócrino circadiano dos pacientes com NES é caracterizado

por níveis de melatonina reduzidos durante a noite e aumento das concentrações de

cortisol pela manhã (Birketvedt et al., 1999).

Inter-relações entre frutose, melatonina e adaptações metabólicas

A exposição à frutose tem como resultado, além das alterações metabólicas

descritas acima, uma complexa modulação em várias secreções endócrinas. Por

19

exemplo, em humanos a exposição à frutose resulta em diminuição nas concentrações

dos hormônios leptina e grelina (Teff et al., 2004). Em ratos, a frutose promove uma

redução do pico noturno da produção de melatonina pela glândula pineal (Leibowitz et

al., 2008) e aumento da produção de corticosterona (Kinote et al., 2012). A redução da

secreção de melatonina, por sua vez, parece não ser uma simples coincidência posto que

a reposição da melatonina em animais que recebem frutose resulta numa reversão de

alguns distúrbios metabólicos causados por este monossacarídeo (Kitagawa et al.,

2012).

A descrição das ações reguladoras do metabolismo desencadeadas pela

melatonina data, porém, do início da década de 90. Em trabalho publicado em 1994

(Lima et al., 1994), foram relatados os primeiros resultados de experimentos com

adipócitos isolados e incubados na presença de melatonina. Este trabalho mostrou que a

incubação de adipócitos com melatonina, aumenta a captação de glicose estimulada pela

insulina. Em continuidade, outros estudos do mesmo grupo demonstraram que a

remoção da glândula pineal (pinealectomia) gera um quadro de intolerância à glicose e

resistência à insulina (Lima et al, 1998).

Em seguida, foi demonstrado que ratos submetidos a uma remoção da glândula

produtora de melatonina (pineal) apresentavam resistência à insulina e diminuição da

expressão do GLUT4 no tecido adiposo e na musculatura esquelética (Zanquetta et al.,

2003). É importante ressaltar que, ao contrário de outros parâmetros metabólicos, a

captação de glicose por adipócitos em animais sem a glândula pineal está reduzida em

diferentes momentos da fase do ciclo claro/escuro (Alonso-Vale et al., 2004). Mais

interessante, foi a constatação de que a incubação intermitente in vitro de adipócitos

com melatonina (12h de presença e 12h de ausência de melatonina in vitro) é um

potencializador da insulina mais eficiente que a exposição continua à melatonina (24h)

20

(Alonso-Vale et al., 2006). Após estes achados, verificou-se que a melatonina leva ao

aumento também da captação de glicose em células musculares in vitro em paralelo a

um aumento da sinalização da insulina (Ha et al., 2006) e que a administração de

melatonina in vivo para animais obesos atenua a resistência à insulina (Sartori et al.,

2009).

De maneira geral, todos estes achados sugerem que a ritmicidade de produção da

melatonina favorece a sensibilidade à insulina de maneira sincronizada com a

capacidade secretora do pâncreas endócrino, de modo a evitar uma intolerância à

glicose. A insulina secretada, em situações fisiológicas, exerce uma potente ação sobre

o fígado que resulta na supressão da produção hepática de glicose (PHG). O mecanismo

proposto para esta ação envolve a inibição do fator de transcrição FoxO1 (Forkhead

box-Other 1), proteína que quando ativa, estimula a expressão das enzimas

Fosfoenolpiruvato-Carboxicinase (PEPCK) e glicose-6-fosfatase (G-6-Pase) (Zhang et

al., 2006). O mecanismo pelo qual a insulina inibe a atividade transcricional do FoxO1

envolve sua fosforilação em resíduos de serina e treonina pela AKT (Brunet et al.,

1999). Nosso grupo publicou recentemente que animais sem a glândula pineal

apresentam, no final do período noturno, aumento da expressão do fator de transcrição

FoxO1 e da proteína PEPCK no território hepático; classicamente, a PEPCK é descrita

como uma enzima chave da gliconeogênese por converter oxalacetato em

fosfoenolpiruvato (Nogueira et al., 2011).

No que diz respeito ao mecanismo pelo qual a ritmicidade da produção de

melatonina leva a melhora da homeostasia glicêmica, a literatura atual aponta duas

tendências não excludentes. A melatonina diretamente pode ativar a via de sinalização

da insulina em diversos tecidos (Anhê et al., 2004; Ha et al., 2006) e assim estimular,

por exemplo, a captação de glicose por adipócitos e fibras musculares (Alonso-Vale et

21

al., 2004; Ha et al., 2006). Outro possível mecanismo pelo qual a melatonina facilitaria

a ação da insulina seria secundário à supressão da secreção de cortisol ou corticosterona.

Uma série de estudos já demonstrou que a melatonina consegue agir através de

receptores específicos na adrenal de primatas e de roedores resultando na supressão da

produção de glicocorticóides (Torres-Farfan et al., 2004; Torres-Farfan et al., 2011).

22

OBJETIVOS

Objetivo geral

Investigar o papel do consumo de frutose em diferentes fases do ciclo claro/escuro sobre

a modulação do metabolismo energético.

Objetivos específicos

• Investigar o efeito do consumo de frutose sobre a ingestão alimentar e ganho de

peso para os diferentes grupos experimentais.

• Investigar possíveis alterações na sensibilidade sistêmica à insulina, tolerância à

glicose e gliconeogênese.

• Investigar possíveis alterações na ativação da proteína AMPK no tecido

hipotalâmico resultantes do consumo de frutose em diferentes fases do ciclo

claro/escuro.

• Avaliar se a inibição farmacológica da proteína AMPK no sistema nervoso

central pode interferir nas ações metabólicas da frutose oferecida durante a fase clara do

ciclo claro/escuro.

• Avaliar a produção de melatonina em animais expostos à frutose durante a fase

clara do ciclo claro/escuro.

• Avaliar se a reposição de melatonina exclusivamente durante a fase escura

suprime os prejuízos metabólicos da frutose ingerida exclusivamente durante a fase

clara do ciclo claro/escuro.

23

METODOLOGIA

Animais e tratamentos

Os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética em

Experimentação Animal da Universidade Estadual de Campinas (protocolo n ° 2798-1)

e foram conduzidos de acordo com as orientações do Colégio Brasileiro de

Experimentação Animal (COBEA).

Ratos machos da linhagem Sprague-Dawley apresentando três semanas de idade

foram fornecidos pelo Centro de Melhoramento Animal da Universidade Estadual de

Campinas (CEMIB, Campinas, São Paulo, Brasil) e foram mantidos sob temperatura

(22 ± 2 ° C) e fotoperíodo de 12 horas. Os animais tiveram livre acesso a ração padrão e

água durante 5 semanas. Na oitava semana de vida, os animais foram atribuídos aos

respectivos grupos experimentais e tratados durante as próximas 8 semanas com frutose

e/ou melatonina. As medidas de ingestão alimentar e de massa corporal foram feitas

duas e uma vez, por semana, respectivamente, durante todo o período de tratamento.

Quando especificado na seção de resultados (Capítulo 1), duas estratégias experimentais

foram combinadas ao tratamento com frutose durante a fase clara do ciclo: (i) a

disponibilidade de ração padrão foi restrita à fase escura (grupo Chow-R) durante as 8

semanas de tratamento, ou (ii) O Composto C foi administrado durante a última semana

de tratamento através de uma cânula implantada no ventrículo lateral.

A frutose foi dissolvida em água potável para produzir uma solução estoque

70% (m/v). A solução estoque de frutose foi posteriormente diluída a 10% (m/v)

novamente com água potável imediatamente antes do tratamento. A frutose foi

disponibilizada aos animais exclusivamente durante a fase clara ou durante a fase escura

24

(representados pelas siglas LPF e DPF, respectivamente). Garrafas contendo água foram

oferecidas aos ratos apenas quando frutose estava ausente.

A melatonina (Cat. A9525, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) foi

inicialmente diluída em etanol absoluto para produzir uma solução estoque de

concentração 100 mg/ml a qual foi mantida ao abrigo da luz em freezer -20 ° C durante,

no máximo, os próximos 7 dias. A solução estoque de melatonina foi posteriormente

diluída (1:50) com água destilada a cada 3 dias para gerar uma solução de concentração

2 mg/ml. Volumes variáveis (levando em consideração a massa corporal do respectivo

animal) desta última solução de melatonina foram adicionados à garrafa de água

potável, para se obter uma solução a 0,5 mg de melatonina/kg de animal. A garrafa

contendo solução de melatonina foi colocada na respectiva gaiola 30 minutos antes do

apagar das luzes e removida 30 minutos após a o acender. Os cálculos individuais para

os volumes necessários de solução de melatonina foram baseados na massa corporal

(avaliada semanalmente) e na ingestão noturna de água (avaliada diariamente). Tais

cálculos foram ajustados diariamente.

Procedimento cirúrgico e tratamento intracerebroventricular

Sete semanas após o início do tratamento com frutose, os ratos foram

anestesiados através da administração de uma mistura de diazepam e cetamina (2 e 50

mg/kg, respectivamente) e posicionados em aparelho estereotáxico para inserir uma

cânula de aço inoxidável no ventrículo lateral do hipotálamo. As coordenadas

estereotáxicas foram de 0,8 mm (anteroposterior), 1,5 mm (lateral), e 4,0 mm

(profundidade) (Lin et al, 2013). A localização da cânula foi testada avaliando-se a

resposta dipsogênica individual após a injeção intracerebroventricular (icv) de

25

angiotensina II (5 ng/uL de solução salina; Sigma, St Louis, MO, EUA) uma semana

após o procedimento cirúrgico (7 semanas de tratamento com frutose). Apenas os

animais que apresentaram uma resposta positiva neste teste foram utilizados nos

próximos experimentos. Para a injeção icv foi utilizada seringa Hamilton (50 µL)

acoplada, por meio de uma cânula plástica a uma agulha 30G, de modo que esta

ultrapasse o comprimento da cânula metálica (0,1 – 0,2 mm) garantindo a entrada do

líquido no ventrículo lateral.

O Composto C (catálogo n ° 171260; EMD4 Biosciences, Gibbstown, NJ, EUA)

foi diluído em 5% de dimetilsulfóxido (DMSO) a uma concentração final de 200 mM e

foi injetado diariamente através da cânula, durante os cinco dias finais da última semana

de tratamento com frutose. As injeções (2 ul) foram realizadas uma hora após o

acendimento das luzes (ZT 1) do biotério e volumes iguais de veículo foram injetados

nos animais do grupo controle. Os experimentos foram realizados duas horas antes de

as luzes serem apagadas no quinto dia de injeção icv utilizando composto C.

Previamente às análises, os animais foram submetidos ao jejum (imediatamente após a

última injeção icv). As amostras foram coletadas duas horas antes do apagar das luzes

(ZT 10) do quinto dia de injeção icv de composto C.

Produção de glicose após desafio intraperitoneal com piruvato

O teste de tolerância intraperitoneal ao piruvato (PTT) foi realizado com a

finalidade de estimar a taxa de gliconeogênese em cada animal submetido a um

diferente tratamento (Yao & Nyomba, 2008). Os ratos receberam uma injeção

intraperitoneal de piruvato (2 g/kg) dissolvido em uma solução de NaCl 0,9% (m/v). A

glicemia foi medida anteriormente a injeção de piruvato e, após a mesma, nos tempos

26

15, 30, 60, 90 e 120 minutos a partir do sangue total colhido de uma pequena incisão na

cauda do animal.

Teste de tolerância à glicose

Para se avaliar a tolerância à glicose, os animais foram submetidos ao teste de

tolerância à glicose (GTT). Neste teste os animais receberam uma injeção

intraperitoneal de glicose (2g/kg) e a glicemia foi medida antes e 5, 10, 15, 30, 60 e 120

minutos após a injeção. A área sob a curva (glicemia vs. tempo) foi calculada como

parâmetro de tolerância à glicose.

Teste de tolerância à insulina

Os animais foram submetidos ao teste de tolerância à insulina (ITT) para se

avaliar a sensibilidade sistêmica à insulina. Neste teste os animais receberam uma

injeção intraperitoneal de insulina (2 UI/kg) e a glicemia foi aferida antes e 5, 10, 15,

20, 25 e 30 minutos após a injeção. Os valores da glicemia foram convertidos para

escala logarítimica na base e. Em seguida a inclinação da reta (resultante do logarítimo

da glicemia vs. tempo) foi calculada. Assumiu-se este valor em módulo multiplicado

por 100 como a constante de decaimento de glicose após o ITT (KITT).

Extração de proteínas e immunoblotting

Os animais anestesiados foram decapitados e o hipotálamo foi removido. O

hipotálamo foi em seguida homogeneizado com um Polytron (Kinematica. Suíça) em

0.8 mL de tampão de extração (SDS 1%, Tris (pH 7,4) 100mM, pirofosfato de sódio

100mM, fluoreto de sódio 100mM, EDTA 10mM, ortovanadato de sódio 100mM) e

incubadas à 96ºC por 10 min. Em seguida, as amostras foram centrifugadas para a

27

remoção do material insolúvel. Após centrifugação, parte do sobrenadante das amostras

foi utilizado para determinação do conteúdo protéico por espectrofotometria com

reagente Bradford (Biorad, CA, USA) e o restante foi acrescido de tampão Laemmli 5X

com DTT e incubado à 96ºC em banho-maria por 10 min. A mesma quantidade de

proteínas totais de cada amostra tratada com Laemmli foi fracionada em SDS-PAGE em

aparelho para mini-gel (Mini-Protean, Bio-Rad). Após separação eletroforética, as

proteínas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose (Bio-Rad, CA, USA).

As extrações ocorreram duas horas antes do desligamento das lâmpadas do

biotério. Os anticorpos primários utilizados foram: anti-pAMPK alfa (T172) ( Cell

Signaling Technology, Cat #2531S, Danvers, MA, EUA) e anti-GAPDH ( Cell

Signaling, Cat #2118S, Danvers, MA, EUA). Os anticorpos secundários conjugados

com peroxidase (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA) foram utilizados, seguidos

de detecção quimioluminescente das bandas sobre filmes de raios-X. A densitometria

óptica dos filmes foi realizada utilizando o software de análise Scion Image (Scion

Corp., Frederick, MD, EUA).

Dosagens hormonais (direta e indireta)

Sangue do tronco foi colhido duas horas antes do desligamento das luzes (ZT

10) e o plasma foi extraído com heparina e armazenado a -80 ° C para determinação dos

níveis de corticosterona utilizando kit comercial de ELISA (Cat # 402810;. Neogen,

Lexington, KY, EUA). Para colher a urina, os ratos foram colocados numa gaiola

metabólica durante a fase escura do ciclo. A urina foi coletada em tubo de vidro

posicionado sob as gaiolas após seu acúmulo durante todo o período da noite. As

amostras de urina foram usadas para dosagem da 6-sulfatoxi-melatonina (6-S-Mel)

28

utilizando um kit de ELISA comercialmente disponível (Cat # RE54031; IBL

Internacional, Hamburgo, Alemanha).

Análise estatística

Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (EPM) e

analisados estatisticamente por análise de variância (ANOVA de uma via com pós-teste

de Tukey-Kramer). Em todos os resultados adotou-se 5% como limite de significância

estatística (p < 0,05).

29

CAPÍTULO 1

______________________________________________________________________Regular Manuscript Metabolic impact of light phase-restricted fructose consumption is linked to

changes in hypothalamic AMPK phosphorylation and melatonin production

Juliana de Almeida Faria1, Thiago Matos F. de Araújo1, Letícia Martins I. de Souza2,

Silvana Bordin3, Gabriel Forato Anhê1*

Author affiliation: 1-Department of Pharmacology, Faculty of Medical Sciences, State

University of Campinas, Campinas, Brazil; 2-Faculty of Nutrition, Federal University of

Mato Grosso, Cuiabá, Brazil; 3-Department of Physiology and Biophysics, Institute of

Biomedical Sciences, University of Sao Paulo, Sao Paulo, Brazil

Running title: Fructose intake and melatonin production

Key words: Fructose, out-of-phase feeding, AMPK, corticosterone, melatonin

*Corresponding author: Please address correspondence to Dr. Gabriel Forato Anhê,

Department of Pharmacology, Faculty of Medical Sciences, State University of

Campinas, #105 Alexander Fleming St., Campinas, SP, Brazil. Zip Code: 13084-971.

Phone: 55-19-35219527. Fax: 55-19-32892968. E-mail: [email protected]

30

Abstract

Excessive fructose consumption can facilitate the development of glucose intolerance in

rodents and in humans. Recent studies have revealed that the metabolic outcomes

caused by fructose in mice are dependent on the phase of its consumption along with the

light/dark cycle. It is still unclear, however, if this time-of-the-day dependence is linked

to perturbations in parameters that display circadian rhythmicity. In the present study,

we investigated the effects of fructose consumption either during the light (LPF) or the

dark (DPF) phases of the light dark cycle over 8 weeks. We also investigated how these

changes were dependent on modulations of feeding behavior, hypothalamic AMPK

phosphorylation and melatonin and corticosterone production. LPF rats exhibited

increased AMPK phosphorylation in the hypothalamus and more pronounced glucose

intolerance and whole-body conversion of pyruvate into glucose when compared with

DPF rats. LPF rats, but not DPF rats, exhibited increased chow ingestion during the

light phase that was blunted by pharmacological inhibition of AMPK in the central

nervous system. LPF rats subjected to dark phase-restricted feeding still exhibited

increased hypothalamic AMPK phosphorylation but failed to develop the endocrine and

metabolic outcomes. Moreover, melatonin administration to LPF rats reduced

corticosterone levels and prevented glucose intolerance. Altogether, the present data

suggests that consumption of fructose during the light phase, rather than during the dark

phase, results in out-of-phase feeding due to increased hypothalamic AMPK

phosphorylation. This shift in spontaneous chow ingestion is responsible for the

reduction of melatonin production and the deleterious metabolic outcomes in LPF rats.

31

Introduction

It is well recognized that excessive fructose consumption can facilitate the development

of glucose intolerance in rodents and in humans. Sprague-Dawley rats fed a fructose-

enriched diet develop glucose intolerance and whole body insulin resistance [1]. In

mice, fructose-enriched diets were found to cause glucose intolerance with concomitant

hepatic triglyceride accumulation and insulin resistance [2]. Interventional experiments

with humans have also demonstrated that overweight subjects display glucose

intolerance after a 10 week interval of consumption of fructose sweetened beverages

[3]. Among the myriad of endocrine changes that putatively underlie these metabolic

effects, the consumption of a fructose-enriched diet was shown to reduce nocturnal

melatonin production in rats [4].

The relationship between melatonin and the control of energy metabolism has

been supported by several studies using distinct experimental approaches. Surgical

ablation of the pineal gland was reported to result in glucose intolerance and insulin

resistance with increased nocturnal levels of glycemia and gluconeogenesis [5,6,7].

Accordingly, the aging-related reduction of melatonin levels was shown to mediate the

increase of adiposity in middle-aged rats [8]. In turn, exogenous melatonin

administration is able to improve metabolic control in rodents rendered glucose

intolerant either by high-fat diets or fructose administration [9,10,11].

Recent studies have revealed that the metabolic outcomes caused by fructose

and high-fat diet intake are influenced by their out-of-phase consumption. Mice allowed

to consume a high-fat diet exclusively during the dark-phase fail to develop abrupt body

weight gain and glucose intolerance compared with those subjected to ad libitum or

light phase-restricted consumption [12,13]. In addition, fructose consumption by mice

32

exclusively during the light phase, but not during the dark phase, resulted in increased

body weight, adiposity and insulin levels [14].

Depending on its intensity and frequency, out-of-phase food intake by humans

can be classified as the night eating syndrome (NES) [15]. The prevalence of NES is

relatively low in the general population but ranges between 8.9 and 27% in obese

subgroups [16]. Cohort studies have shown that NES positively correlates with the

diagnosis of metabolic syndrome, increased triglycerides and waist circumference [17].

Among several adaptations, the circadian endocrine profile of NES patients is

characterized by reduced melatonin levels during the night and increased morning

cortisol concentrations [18].

Given the above mentioned observations, the present study was conducted to

investigate whether the metabolic impact resulting from fructose consumption during

different phases of the light/dark cycle is dependent on changes in the circadian pattern

of food intake in rats. We also collected results showing that disruption of melatonin

production is a key event in the mechanism linking the light phase-restricted fructose

consumption and its metabolic outcomes.

Materials and Methods

Animals, Surgical Procedure and Treatments

The experimental procedures were approved by the State University of Campinas

Committee for Ethics in Animal Experimentation (protocol n° 2798-1) and were

conducted in accordance with the guidelines of the Brazilian College for Animal

Experimentation.

Three-week-old male Sprague-Dawley rats were obtained from the Animal

Breeding Center at the University of Campinas (CEMIB, Campinas, Sao Paulo, Brazil)

33

and were housed at 22±2°C under a 12:12 h light:dark cycle (lights on at 7:00 a.m.)

with free access to food and water for 5 weeks. At 8 weeks of age, rats were assigned to

the experimental groups for an additional 8 weeks of treatment with fructose and/or

melatonin. Measurements of chow consumption and body mass were made twice and

once a week during the period of treatment, respectively. When specified in the results

section, two experimental strategies were combined to the fructose treatment: (i) chow

availability was restricted to the dark phase (Chow-R rats) during the 8 weeks of

treatment, or (ii) Compound C was administered during the last week of treatment

through a cannula placed in the lateral ventricle.

Fructose was dissolved in regular water to produce a 70% stock solution (w/v).

The fructose stock solution was further diluted to 10% (w/v) with regular water

immediately before treatment. Fructose was made available exclusively during the light

or the dark phases (respectively LPF and DPF rats). Bottles containing just water were

offered to the rats only when fructose was absent.

Melatonin (Cat. A9525; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) was initially

diluted in 100% ethanol to generate a 100 mg/ml stock solution that was kept protected

from the light in -20°C for no longer than 7 days. The melatonin stock solution was

further diluted (1:50) with distilled water every 3 days of treatment to generate a 2

mg/ml solution. Variable volumes of this solution were added to the drinking water

bottle to yield a 0.5 mg/kg ingestion of melatonin. Bottles with melatonin were placed

on the cages 30 minutes before "lights off" and removed 30 min after "lights on". The

individual calculations of the required volumes of melatonin solution were based on the

body weight (weekly assessed) and nocturnal water intake (daily assessed) and were

adjusted daily.

34

Surgical Procedure and icv treatment

Six weeks after the beginning of fructose treatment, rats were anesthetized with

diazepam and ketamine (2 and 50 mg/kg, respectively) and placed in a stereotaxic

apparatus to insert a stainless-steel cannula into the lateral ventricle. Stereotaxic

coordinates were 0.8 mm (anteroposterior), 1.5 mm (lateral), and 4.0 mm (depth) [19].

The localization of the cannula was tested by evaluating the dipsogenic response to an

intracerebroventricular (icv) angiotensin II injection (15 ng/3 µl saline; Sigma, St Louis,

MO, USA) 1 week after the surgical procedure (7th week of fructose treatment). Only

animals that presented a positive response in these tests were used for further

experimentation.

Compound C (catalog no. 171260; EMD4 Biosciences, Gibbstown, NJ, USA)

was diluted in 5% dimethylsulfoxide (DMSO) to a final concentration of 200 mM and

was injected daily through the cannula for five days during the last week of fructose

treatment. Injections (2 µl) were performed 1 hour after "lights on" and equal volumes

of vehicle were injected in the controls. Experiments with these rats were carried out

two hours before "lights off" on the day of the last icv injection. Fasting prior to the

analyses and sample collection started immediately after the last injection.

Intraperitoneal pyruvate tolerance test (PTT)

Rats were fasted for 10 h, and a sodium pyruvate solution (250 mg/ml) was injected i.p.

at a dosage of 2 g/kg. Pyruvate injections were made two hours before "lights off".

Glucose concentration was determined in blood extracted from the tail before (0 min)

and 15, 30, 60, 90, and 120 min after pyruvate injection. The area under the curve

(AUC) of glycemia vs. time was calculated using each individual baseline (basal

glycemia) to estimate glucose clearance after pyruvate injection.

35

Intraperitoneal glucose tolerance test (GTT)

Rats were fasted for 10 h prior to i.p. glucose injection (2 g/kg of a 25% solution of D-

glucose) two hours before "lights off". The blood samples were collected from the tail at

0, 10, 15, 30, 60 and 120 min to determine the blood glucose concentration. The area

under the curve (AUC) of glycemia vs. time was calculated from each individual

baseline (basal glycemia) to estimate glucose tolerance.

Intraperitoneal insulin tolerance test (ITT)

Rats were fasted for 10 h prior to i.p. insulin injection (2 IU/kg) two hours before "lights

off". Blood glucose was measured before and 5, 10, 15, 20, 25 and 30 min after insulin

injection to determine the sensitivity of insulin-responsive tissues. Blood glucose values

were converted to a logarithmic scale, and the slope of the curve was calculated. This

value multiplied by 100 was assumed to be the glucose decay constant (KITT).

Protein extraction and immunoblotting

Anesthetized rats were decapitated, and the hypothalamus was removed and processed

for Western blotting as previously described [20]. The extractions occurred two hours

before "lights off". The primary antibodies used were as follows: anti-pAMPK alpha

(T172) from Cell Signaling Technology (Cat #2531S, Danvers, MA, USA) and anti-

GAPDH from Cell Signaling (Cat #2118S, Danvers, MA, USA). Secondary antibodies

conjugated with horseradish peroxidase (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)

were used, followed by chemiluminescent detection of the bands on x-ray-sensitive

films. Optical densitometry of the films was performed using the Scion Image analysis

software (Scion Corp., Frederick, MD, USA).

36

Hormone measurements

Trunk blood was collected two hours before "lights off", and plasma was extracted with

heparin and stored at -80°C for corticosterone determination with a commercially

available ELISA kit (Cat. #402810; Neogen, Lexington, KY, USA). For urine

collection, rats were placed in a metabolic cage during the dark phase. Urine was

allowed to accumulate overnight in a glass tube placed under the cages. Urine samples

were used for 6-sulfatoxi-melatonin (6-S-Mel) determination using a commercially

available ELISA kit (Cat. #RE54031; IBL International, Hamburg, Germany).

Statistical analysis

The results are presented as the means ± SE. Comparisons were performed using one-

way ANOVA, followed by Tukey-Kramer post hoc testing (INStat; GraphPad Software,

Inc., San Diego, CA, USA). Values of P˂0.05 indicate a significant difference.

Results

Metabolic and endocrine changes in rats exposed to fructose consumption during the

light or the dark phases

Body weights of CTL, LPF and DPF rats were similar at baseline, prior to the beginning

of treatments. Body weight gains after the 8 week treatments did not differ among the

groups so that final body weights were similar among rats assigned to the CTL, LPF

and DPF groups (Fig. 1A). Food intake was also assessed at the eighth week after the

beginning of treatments. The rats exhibited an expected nocturnal eating pattern so that,

for every group, food intake during the dark phase was higher than that during the light

phase (P<0.001). Consumption of chow during the light phase, however, was increased

in LPF rats (58% higher than CTL values; P<0.001), but reduced in DPF rats (44%

37

lower than CTL values; P<0.01). Chow consumption during the dark phase was

similarly reduced in LPF and DPF rats (23 and 31% lower than CTL, respectively;

P<0.01) (Fig. 1B). Glucose intolerance was found in LFP rats, but not in DFP rats, as

evidenced by increased AUC values obtained from the GTTs (120% higher than CTL;

P<0.05) (Fig. 1C). Conversely, the AUC values obtained from the curve glycemia vs.

time after a pyruvate load were increased in both LPF and DPF rats (respectively 114

and 42% higher than CTL; P<0.05). The values of DPF were, however, 44% lower than

those of LFP (P<0.001) (Fig. 1E). Apart from these changes in glucose tolerance, our

data revealed that neither LPF nor DPF rats exhibited insulin resistance as shown by

similar KITT values (Fig. 1G). Endocrine changes in LPF rats were hallmarked by

increased levels of corticosterone (91% higher than CTL; P<0.05) and reduced urinary

levels of 6-S-Mel (63% lower than CTL; P<0.05) (Figs. 1D and 1F, respectively). These

changes were not observed in DPF rats. The levels of hypothalamic AMPK

phosphorylation were increased in LPF rats but not in DPF rats (102% higher than CTL;

P<0.05) (Fig. 1H).

Increased food intake during the light phase is involved in the glucose intolerance

observed in LPF rats

To investigate if the increase in food intake during the light phase was involved in the

metabolic and endocrine changes observed in LPF animals, we designed an

experimental protocol in which the animals were assigned to four different groups: CTL

(rats that consumed chow ad libitum and did not receive fructose), LPF (rats that

consumed chow ad libitum and received fructose during the light phase), Chow-R (rats

that consumed chow exclusively during the dark phase and did not receive fructose) and

38

LPF/Chow-R (rats that consumed chow exclusively during the dark phase and received

fructose during the light phase).

The body weights of the animals assigned to the four groups were similar at the

beginning of the treatments. The four groups of animals exhibited a similar increase in

body weight so that absolute body weights at the end of the treatments were also similar

among the groups (Fig. 2A). The increase in food intake during the light phase exhibited

by LPF rats was replicated in this set of experiments (40% higher than food intake of

CTL during the light phase; P<0.05). The food intake during the dark phase was

increased in Chow-R compared with CTL rats (26% higher; P<0.05). Apart from that,

consumption of fructose during the light phase resulted in reduced food intake during

the dark phase irrespective of food restriction to this phase. Thus, food intake during the

dark phase was reduced in LPF/Chow-R (14% lower than in Chow-R; P<0.05) and in

LPF (12% lower than in CTL; P<0.05) (Fig. 2B).

LPF animals exhibited consistent glucose intolerance as evidenced by the AUC

values obtained from the GTT (98% higher than CTL; P<0.05). The tolerance to

exogenous glucose was not modulated in Chow-R compared with CTL animals.

Interestingly, glucose intolerance observed in LPF rats was not replicated in LPF/Chow-

R rats (Fig. 2C). With regard to the endocrine profile, Chow-R exhibited corticosterone

and urinary 6-S-Mel concentrations similar to those of CTL rats. The increase in

circulating corticosterone levels (77%; P<0.05) and the reduction in the urinary

concentration of 6-S-Mel (74%; P<0.05) observed in LPF rats when compared with

CTL rats were not detected in LPF/Chow-R (respectively, Figs. 2D and 2E). The

hypothalamic AMPK phosphorylation levels observed in CTL and in LPF rats were not

affected by restricting food availability to the dark phase. Thus, the amounts of

39

phosphorylated AMPK were increased in LPF compared with CTL rats (72%; P<0.05)

and in LPF/Chow-R compared with Chow-R rats (41%; P<0.05) (Fig. 2F).

Increased hypothalamic AMPK phosphorylation in LPF phase advances food intake

resulting in metabolic and endocrine changes

The previous data indicated that the increase of chow ingestion during the light phase

in LPF rats, although indispensable for the endocrine/metabolic changes, was not

causing the increase in hypothalamic AMPK phosphorylation. We assessed the

relevance of this increase in hypothalamic AMPK phosphorylation for LPF rats in a set

of experiments in which they received icv injections with Compound C, a

pharmacological AMPK inhibitor. The rats were assigned to four different groups in

these experiments, as follows: CTL (rats that did not receive fructose and were treated

with vehicle icv), LPF (rats that received fructose during the light phase and were

treated with vehicle icv), CC (rats that did not receive fructose and were treated with

Compound C icv) and LPF/CC (rats that received fructose during the light phase and

were treated with Compound C icv). Icv treatments lasted for 5 days during the eighth

week of fructose treatment.

Icv treatments did not interfere with the final body weight so that similar values

were obtained among the groups at the end of the eighth week of treatment. For the four

groups, the final body weight reached values higher than in the beginning of treatments

(P<0.05) (Fig. 3A). Before the beginning of icv treatments, food intake during the light

phase was increased in animals assigned to both LPF and LPF/CC groups (139 and

119% higher than CTL, respectively; P<0.05). Thus, surgical implantation of the

cannula in the lateral ventricle alone did not affect the response to light phase fructose

described in the previous experiments. After icv treatments, the LPF animals treated

40

with vehicle, but not those treated with Compound C, maintained increased values of

food intake during the light phase (200% higher than CTL after treatment with vehicle;

P<0.05) (Fig. 3B).

Food intake during the dark phase was similarly not affected by cannula

implantation per se so that before icv treatments, the amount of chow ingested by LPF

and LPF/CC groups during the period of "lights off" was lower than that ingested by

rats assigned to the CTL group (25 and 28% lower than CTL before icv treatment;

P<0,05). After icv treatments, food intake during the dark phase remained reduced in

both LPF and LPF/CC groups (32 and 34% lower than CTL after icv treatment with

vehicle; P<0.05) (Fig. 3C).

Glucose tolerance tests performed after icv treatments showed that icv injections

with vehicle did not interfere with the metabolic effect of fructose consumption during

the light phase. In these experiments, as in those described above, LPF animals treated

with vehicle became glucose intolerant as evidenced by the AUC values of the GTTs

(114% higher than in CTL after icv treatment with vehicle; P<0.05). When compared

with CTL rats, neither the CC nor the LPF/CC rats exhibited glucose intolerance after

icv treatments (Fig. 3D).

Corticosterone levels were increased in LPF rats treated with vehicle via icv

(150% higher than in CTL treated with vehicle; P<0.05). Corticosterone levels of

LPF/CC and CC rats remained similar to those of CTL rats after icv treatments (Fig.

3E). The urinary 6-S-Mel concentrations in LPF rats, but not in LPF/CC and CC rats,

were reduced after icv treatments (65% lower than CTL after icv treatment with vehicle;

P<0.05) (Fig. 3F). The phosphorylation levels of hypothalamic AMPK were increased

in LPF rats after treatment with vehicle (460% higher than in CTL treated with vehicle;

41

P<0.05). Treatment with Compound C icv blunted this response so that hypothalamic

AMPK phosphorylation in LPF/CC rats was similar to that of CTL rats (Fig. 3G).

Reduced melatonin production in LPF rats leads to increased corticosterone levels and

glucose intolerance

To determine the metabolic relevance for reduced melatonin production in LPF rats, we

designed an experimental protocol in which the animals were assigned to the following

four different groups: CTL (rats that did not receive either fructose or melatonin), LPF

(rats that received fructose during the light phase), Mel (rats that received melatonin

exclusively during the dark phase) and LPF/Mel (rats that received fructose during the

light phase and melatonin exclusively during the dark phase).

When compared to their initial body weights, the rats belonging to the four

experimental groups exhibited increased body weight at the end of the treatment

(P<0.05). Treatment with melatonin did not affect the changes in body weights

throughout the experimental period so that final body weights of the rats belonging to

the CTL, LPF, Mel and LPF/Mel groups were similar (Fig. 4A). The changes in the

food intake profile observed in LPF animals, hallmarked by increased values during the

light phase and reduced values during the dark phase, were not altered by melatonin

treatment. Additionally, melatonin treatment per se did not affect food intake. Thus,

food intake by both LPF and LPF/Mel rats was increased during the light phase

(approximately 50% higher than CTL; P<0.05) and reduced during the dark phase

(approximately 17% lower than CTL; P<0.05) (Fig. 4B).

Treatment with melatonin was able to reduce glucose intolerance induced by

fructose consumption during the light phase. The AUC values obtained from the GTT

were increased in LPF (138% higher than CTL; P<0.05) but not in LPF/Mel rats. In

42

turn, treatment with melatonin in fructose-naive rats did not alter glucose tolerance (Fig.

4C). As example of what was observed for glucose intolerance, corticosterone levels

were increased in LPF (249% higher than CTL; P<0.05) but not in LPF/Mel animals.

Melatonin treatment alone did not alter corticosterone concentrations (Fig. 4D).

In this set of experiments, we also found that LPF rats had reduced urinary 6-S-

Mel concentrations (80% lower than CTL; P<0.05). Fructose consumption during the

light phase, however, failed to reduce urinary 6-S-Mel concentrations in rats consuming

melatonin (urinary 6-S-Mel concentration are similar between Mel and LPF/Mel

groups). The urinary 6-S-Mel concentration was found to be similarly increased in both

Mel and LPF/Mel groups (187 and 254% higher than CTL, respectively; P<0.05) (Fig.

4E).

Melatonin treatment alone did not interfere with hypothalamic AMPK

phosphorylation so that the levels in rats belonging to the Mel group were similar to

those of the CTL group. Melatonin treatment was also unable to modulate the increase

in hypothalamic AMPK phosphorylation induced by the consumption of fructose during

the light phase (LPF and LPF/Mel were, respectively, 302 and 325% higher than CTL;

P<0.05) (Fig. 4F).

Discussion

The data presented herein show that rats receiving fructose during the light phase

exhibited glucose intolerance and increased whole-body conversion of pyruvate to

glucose simultaneously with increased chow ingestion during the light phase.

Importantly, these combined changes were not observed in rats receiving fructose

exclusively during the dark phase. Our data supports the conclusion that this shift in

food intake is of pivotal relevance for metabolic outcomes because fructose ingestion

43

during the light phase with simultaneous chow restriction to the dark phase fails to

induce glucose intolerance. This finding is in accordance with recent publications

showing that rats that increase their food intake during the light phase (either by forced

activity protocols during the light phase or by simple restriction of food availability)

become glucose intolerant [21]. Out-of-phase feeding seems also to be relevant for

human metabolism as subgroups of diabetic patients who display night eating behavior

also have impaired glycemic control based on increased glycated hemoglobin levels

[22].

The present data also allow us to conclude hypothalamic 5’-AMP-activated

protein kinase (AMPK) activation is a key event induced by fructose ingestion during

the light phase that increases out-of-phase feeding. In turn, out-of-phase feeding is

likely to be ultimately responsible for glucose intolerance. This sequential cause/effect

relationship is supported by our data showing: 1-fructose consumption during the light

phase is still able to induce hypothalamic AMPK phosphorylation in rats for which food

availability has been restricted to the dark phase; and 2-pharmacological inhibition of

AMPK with Compound C abrogates the shift in food intake and glucose intolerance

induced by fructose consumption during the light phase. Accordingly, previous studies

have already shown that fructose metabolism in the hypothalamus results in an increase

in the AMP/ATP ratio that activates AMPK and stimulates food intake [23].

Previous publications have also shown that hypothalamic AMPK activation with

pharmacological approaches triggers a counter-regulatory response hallmarked by

increased Endogenous Glucose Production (EGP). The mechanisms for this response

are not completely understood. However, it was demonstrated that hypothalamic AMPK

activation is able to spread peripheral signals that lead to the secretion of

glucocorticoids, glucagon and catecholamines [24,25,26]. These hormones are

44

classically known to act in the liver by increasing gluconeogenesis and glycogenolysis,

therefore stimulating EGP. In this context, we have previously demonstrated that intra-

cerebro ventricular injections with fructose during the light phase lead to an acute

activation of hypothalamic AMPK in the central nervous system and consequently

increases corticosterone levels that raise whole-body gluconeogenesis [20]. Increased

corticosterone levels as an acute response to an oral fructose load have been formerly

demonstrated by other groups [27,28].

The present data add further information to this field by revealing that chronic

fructose consumption can also increase both hypothalamic AMPK phosphorylation and

corticosterone levels when it occurs exclusively during the resting light phase. As

example of glucose intolerance, increased corticosterone levels were also prevented in

LPF rats by restricting chow availability to the night or by pharmacologically inhibiting

AMPK in the central nervous system. Based on our interpretation, the ability of chronic

fructose consumption during the light phase to increase corticosterone levels relies on

the chronically light phase-shifted chow ingestion induced by hypothalamic AMPK

activation.

Having established that hypothalamic AMPK activation and increased food

intake during the light phase are important for the increase in corticosterone levels

observed in LPF rats, we next explored how changes in the central nervous system

result in peripheral endocrine modulations. It was previously demonstrated that

exposing Sprague-Dawley rats to a 60% fructose-enriched diet ad libitum resulted in a

reduction of the levels of urinary 6-sulfatoxy melatonin [4]. The day-time consumption

of carbohydrates by rodents, however, seems to be particularly relevant to yield

reductions in nocturnal melatonin production. Selmaoui et al. have demonstrated that

the reduced amplitude of nocturnal melatonin levels is caused by offering a combination

45

of a carbohydrate-enriched diet and standard chow during the light-resting phase.

Similar protocols with standard chow alone failed to modulate melatonin production

[29]. Accordingly, the present data reveals that the consumption of fructose during the

light phase needs to co-exist with increased chow ingestion during this period of the

light/dark cycle to result in reduced 6-S-Mel production and increased corticosterone

levels. This was concluded because restriction of chow availability to the dark phase

prevented the reduction in 6-S-Mel observed in LPF rats. Our data from the experiments

with Compound C further corroborates this hypothesis because the pharmacological

inhibition of AMPK in the central nervous system abrogated both the shift in food

intake to the light phase observed in LPF rats and the reduction in 6-S-Mel.

To date, the negative modulation of melatonin secretion secondary to

hypothalamic AMPK activation has already been shown in other species. Menassol et

al. demonstrated that acute icv injection with AICAR (a pharmacological AMPK

activator) in ewes can actually reduce the amplitude of the nocturnal melatonin surge.

This modulation occurred irrespective of changes in the rhythm of melatonin production

[30]. As our data suggest, the ability of hypothalamic AMPK activation induced by

fructose ingestion during the light phase to reduce melatonin production relies on

changes in the rhythm of feeding behavior of the rat. Whether this applies to different

species remains to be determined.

The causal relationship between the reduced melatonin and increased

corticosterone was further examined in our experiments in which LPF rats were treated

with melatonin. We collected evidence to support the proposition that reduced

melatonin in rats consuming fructose during the light phase is a key event for the

increase in corticosterone levels and glucose intolerance as these adaptations were not

observed in LPF rats receiving melatonin. Accordingly, melatonin has already been

46

demonstrated to blunt insulin resistance induced by ad libitum consumption of a 60%

fructose enriched diet in Wistar rats [10].

The increased corticosterone levels observed in experimental conditions

characterized by reduced melatonin production can be explained by the suppressive

action that the pineal hormone exert on the Hypothalamus-Pituitary-Adrenal (HPA)

axis. It has already been shown that melatonin acts through MT1 receptors to suppress

ACTH-induced cortisol production in cultured adrenal glands isolated from primates

[31]. A similar response was found in cultured adrenal glands from rats [32]. It is

important to note that the suppressive action of melatonin over the HPA axis might not

be restricted to direct action on the adrenal glands because rats treated with melatonin

were also shown to have reduced CRH and ACTH levels after a stress stimulus [33].

In summary, the present study demonstrates that fructose consumption during

the light phase, but not the dark phase, results in glucose intolerance and increased

corticosterone levels. The effects of day-time consumption of fructose are secondary to

hypothalamic AMPK activation and to upregulation of food intake during the light

phase. We also show that the reduction of melatonin production due to hypothalamic

AMPK activation is a key event that mediates the increase in corticosterone and glucose

intolerance induced by the consumption of fructose during the light phase.

Acknowledgements

The authors would like to thank Mr. Miguel Borges da Silva, Mr. Antonio Vilson dos

Santo and Mr. Agnaldo Fernando de Azevedo for their technical assistance (State

University of Campinas). This study was supported by the Research Foundation of the

State of Sao Paulo (FAPESP) and the National Council of Research (CNPq).

47

Author Contributions

Juliana de Almeida Faria designed and performed the experiments, acquired the data,

contributed to data analysis/interpretation, prepared and approved the manuscript.

Thiago Matos F. de Araújo performed the experiments and approved the article. Letícia

Martins I. de Souza performed the experiments and approved the manuscript. Silvana

Bordin prepared and approved the manuscript. Gabriel Forato Anhê designed the

experiments, contributed to the data analysis/interpretation, prepared and approved the

manuscript.

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53

Figure Legends

Figure 1: Metabolic and endocrine changes in rats exposed to fructose

consumption during the light or the dark phases. Rats assigned to the groups CTL

(no fructose), LPF (fructose during the light phase) and DPF (fructose during the dark

phase) had their body weights assessed before and after (8 weeks) treatments (A). Food

intake during the light and the dark phases were also assessed at the end of the

treatments (B). After these measurements, the rats were subjected to glucose tolerance

tests (C), pyruvate tolerance tests (D) and insulin tolerance tests (E). Tests were

performed two hours before "lights off". Euthanasia was performed two hours before

"lights off" and the hypothalamus and plasma were collected. Plasma samples were

used for the determination of corticosterone levels (F). Urine was collected overnight

before euthanasia for determination of 6-S-Mel concentration (G). Hypothalamus

samples were used for Western blot detection of pAMPK and normalization GAPDH

(H). The results are presented as the means ± SE. *P<0.05 vs. same group before

treatment; **P<0.05 vs. CTL at the same phase of the light/dark cycle; #P<0.05 vs. LPF

at the same phase of the light/dark cycle.

Figure 2: Night-restricted feeding in LPF rats. Rats were assigned to the groups CTL

(rats that consumed chow ad libitum and did not receive fructose), LPF (rats that

consumed chow ad libitum and received fructose during the light phase), Chow-R (rats

that consumed chow exclusively during the dark phase and did not receive fructose) and

LPF/Chow-R (rats that consumed chow exclusively during the dark phase and received

fructose during the light phase). Body weights were assessed before and after (8 weeks)

treatments (A). Food intake during the light and the dark phases were also assessed at

the end of the treatments (B). After these measurements, the rats were subjected to

54

glucose tolerance tests (C). Tests were performed two hours before "lights off".

Euthanasia was performed two hours before "lights off" and the hypothalamus and

plasma were collected. Plasma samples were used for the determination of

corticosterone levels (D). Urine was collected overnight before euthanasia for

determination of the 6-S-Mel concentration (E). Hypothalamus samples were used for

Western blot detection of pAMPK and normalization GAPDH (F). The results are

presented as the means ± SE.*P<0.05 vs. same group before treatment; **P<0.05 vs.

CTL at the same phase of the light/dark cycle; #P<0.05 vs. Chow-R at the same phase

of the light/dark cycle.

Figure 3: Pharmacological inhibition of AMPK in the central nervous system of

LPF rats. Rats were assigned to the groups CTL (rats that did not receive fructose and

were treated with vehicle icv), LPF (rats that received fructose during the light phase

and were treated with vehicle icv), CC (rats that did not receive fructose were treated

with Compound C icv) and LPF/CC (rats that received fructose during the light phase

and were treated with Compound C icv). Cannula implantation and icv treatments (5

days) occurred during the sixth and eighth weeks of fructose treatment, respectively.

Body weights were assessed before and after (8 weeks) fructose treatment (A). Food

intake was assessed before and after icv injections during the last week of fructose

treatment. Data were acquired separately during the light (B) and the dark (C) phases.

After these measurements, the rats were subjected to glucose tolerance tests (D). Tests

were performed two hours before "lights off". Euthanasia was performed two hours

before lights off, and the hypothalamus and plasma were collected. Plasma samples

were used for corticosterone determinations (E). Urine was collected overnight before

euthanasia for determination of 6-S-Mel concentration (F). Hypothalamus samples were

55

used for Western blot detection of pAMPK and normalization GAPDH (G). The results

are presented as the means ± SE.*P<0.05 vs. same group before fructose treatment;

**P<0.05 vs. CTL at the same moment of icv treatment.

Figure 4: Nocturnal melatonin administration in LPF rats. Rats were assigned to the

groups CTL (rats that did not receive either fructose or melatonin), LPF (rats that

received fructose during the light phase), Mel (rats that received melatonin exclusively

during the dark phase) and LPF/Mel (rats that received fructose during the light phase

and melatonin exclusively during the dark phase). Body weights were assessed before

and after (8 weeks) treatments (A). Food intake during the light and the dark phases

were also assessed at the end of the treatments (B). After these measurements, the rats

were subjected to glucose tolerance tests (C). Tests were performed two hours before

"lights off". Euthanasia was performed two hours before "lights off" and the

hypothalamus and plasma were collected. Plasma samples were used for the

determination of corticosterone levels (D). Urine was collected overnight before

euthanasia for determination of 6-S-Mel concentration (E). Hypothalamus samples were

used for Western blot detection of pAMPK and normalization GAPDH (F). The results

are presented as the means ± SE.*P<0.05 vs. same group before treatment; **P<0.05 vs.

CTL at the same phase of the light/dark cycle.

60

DISCUSSÃO

Os dados aqui apresentados mostram que os animais que receberam frutose

durante a fase clara do ciclo claro/escuro exibiram intolerância à glucose e aumento da

conversão sistêmica de piruvato em glicose simultaneamente ao aumento da ingestão

alimentar durante o mesmo o período do ciclo. É importante ressaltar que as alterações

citadas não foram observadas em ratos que receberam frutose exclusivamente durante a

fase escura do ciclo. Nossos dados permitem afirmar que o aumento da ingestão total de

calorias durante a fase clara do ciclo é de relevância fundamental para os resultados

metabólicos observados, uma vez que a ingestão de frutose durante a fase clara

associada simultaneamente à restrição de ração nessa mesma fase (a ração, nesse caso, é

oferecida exclusivamente durante a fase escura) falha em induzir intolerância à glicose.

Este resultado está de acordo com as publicações recentes que demonstram que os ratos

que aumentam sua ingestão de alimentos durante a fase clara (ou por protocolos de

atividade forçada durante essa fase ou pela simples restrição da disponibilidade de

alimentos durante a fase escura) tornam-se intolerantes à glicose (Salgado-Delgado,

2013). A ingestão alimentar fora de fase (em geral, relacionada ao período de menor

atividade da espécie em questão) também parece ser relevante no que tange o

metabolismo humano como já descrito para subgrupos de pacientes diabéticos os quais

apresentam controle glicêmico prejudicado (com base no aumento dos níveis de

hemoglobina glicada) quando ocorre aumento no comportamento alimentar noturno

desses indivíduos (Hood, 2014).

Os presentes dados também permitem afirmar que a ativação hipotalâmica da

proteína quinase 5'-AMP (AMPK), induzida pela ingestão de frutose durante a fase

clara, constitui um evento chave levando, por sua vez, ao aumento da alimentação fora

de fase. Em última análise, a alimentação fora de fase é responsável pela intolerância à

61

glicose. A proposição da existência desta relação de causa/efeito sequencial é suportada

pelo nosso conjunto de dados mostrando: 1- O consumo de frutose durante a fase clara é

capaz de induzir a fosforilação da AMPK hipotalâmica em ratos mesmo quando a

disponibilidade de alimentos é restrita à fase escura do ciclo; 2- A inibição

farmacológica da AMPK com Composto C atenua o aumento da ingestão calórica fora

de fase e a intolerância à glicose induzidos pelo consumo de frutose exclusivamente

durante a fase clara do ciclo. Em consonância com os dados apresentados, estudos

anteriores já demonstraram que o metabolismo da frutose gera no hipotálamo uma

resposta caracterizada pelo aumento da razão AMP/ATP a qual estimula a ativação da

proteína AMPK e, em consequência, o aumento da ingestão de alimentos (Cha, 2008).

Publicações anteriores também demonstraram que a ativação da AMPK

hipotalâmica através do uso de agentes farmacológicos desencadeia uma resposta contra

regulatória caracterizada pelo aumento da produção endógena de glicose. Os

mecanismos para esta resposta não foram completamente elucidados. No entanto, foi

demonstrado que a ativação da AMPK hipotalâmica é capaz de desencadear sinais

periféricos que levam à secreção de glicocorticóides, glucagon e catecolaminas

(McCrimmom, 2008; Han, 2005; Alquier, 2007). Esses hormônios são classicamente

conhecidos por atuar no fígado ocasionando aumentados níveis de gliconeogênese e

glicogenólise e, portanto, estimulando a produção endógena de glicose. Neste contexto,

demonstramos previamente que as injeções intracerebroventriculares com frutose

durante a fase clara levam a ativação aguda da AMPK hipotalâmica e,

consequentemente, aumentos dos níveis de corticosterona que elevam a gliconeogênese

sistêmica (Kinote, 2012). O aumento dos níveis de corticosterona como uma resposta

aguda a uma carga de frutose por via oral foi anteriormente demonstrado por outros

grupos (Brindley, 1981; Brindley, 1985). Os dados aqui apresentados adicionam mais

62

informações a este campo ao revelar que o consumo crônico de frutose também reflete

em aumentados níveis de fosforilação da AMPK hipotalâmica e de corticosterona

quando ocorre o consumo desse nutriente exclusivamente durante a fase de menor

atividade do roedor, ou seja, a fase clara do ciclo. No que diz respeito à intolerância à

glicose, o aumento do nível de corticosterona foi prevenido quando o grupo LPF teve a

disponibilidade de alimento restrita ao período escuro do ciclo ou ainda quando a

proteína AMPK foi farmacologicamente inibida no sistema nervoso central. Com base

em nossa interpretação, a habilidade de o consumo crônico de frutose durante a fase

clara levar ao aumento dos níveis de corticosterona, baseia-se no deslocamento parcial

da ingestão alimentar (ingestão fora de fase) induzida pela ativação da AMPK

hipotalâmica.

Tendo estabelecido que a ativação da AMPK hipotalâmica com consequente

aumento da ingestão calórica durante a fase clara representa o gatilho metabólico para o

aumento dos níveis de corticosterona, o próximo objetivo foi explorar o papel das

modificações no sistema nervoso central sobre possíveis modulações endócrinas

periféricas. Interessantemente, foi demonstrado que a exposição de ratos Sprague-

Dawley machos a uma dieta rica em frutose (60% m/m) ad libitum resultou numa

redução considerável dos níveis urinários de 6-sulfatoxi-melatonina (Leibowitz, 2008),

principal produto do metabolismo hepático da melatonina. O consumo de carboidratos

durante a fase clara do ciclo por roedores, no entanto, parece ser particularmente

relevante para produzir reduções na produção de melatonina noturna. Selmaoui e

colaboradores demonstraram que a associação de uma dieta rica em carboidrato e uma

dieta balanceada durante a fase de menor atividade mostrou-se capaz de reduzir a

amplitude dos níveis noturnos de produção da melatonina. Protocolos semelhantes, com

uso exclusivo de dieta padrão, falharam em modular a produção de melatonina

63

(Selmaoui, 2001). Por conseguinte, os presentes dados revelam que o consumo de

frutose durante a fase clara precisa coexistir com o aumento da ingestão alimentar

durante o mesmo período para resultar na redução da produção de 6-S-Mel e aumento

dos níveis de corticosterona. Este desfecho foi confirmado uma vez que a restrição da

ingestão alimentar ao período escuro do ciclo preveniu a redução da 6-S-Mel observada

em animais do grupo LPF. Adicionalmente, os dados experimentais obtidos com a

administração do inibidor Composto C corroboram esta hipótese já que a inibição

farmacológica da AMPK no sistema nervoso central revoga tanto o aumento da ingestão

fora de fase quanto a citada redução da 6-S-Mel em animais do grupo LPF.

A modulação negativa da secreção de melatonina secundária à ativação da

AMPK hipotalâmica já foi demonstrada em outras espécies experimentadas. Menassol e

colaboradores demonstraram que a injeção icv aguda com AICAR (um clássico ativador

farmacológico da proteína AMPK) em ovelhas leva a efetiva redução na amplitude do

pico noturno de produção da melatonina. Esta modulação ocorreu independentemente

de mudanças no ritmo da produção de melatonina (Menassol, 2011). Como os dados

aqui mostrados sugerem, a capacidade da ativação da AMPK hipotalâmica induzida

pela ingestão diurna da frutose em reduzir a produção noturna de melatonina, depende

de alterações no comportamento alimentar. Ainda não foi completamente esclarecido se

tal fato aplica-se a diferentes espécies.

A relação causal entre a redução nos níveis de melatonina e aumento da

corticosterona foi ainda investigada em nossos experimentos onde o grupo que recebeu

frutose exclusivamente durante a fase clara foi tratado com melatonina (suplementada

em água potável durante a fase escura). Verificou-se que os animais que ingeriram

frutose durante a fase clara e concomitantemente melatonina durante a fase escura do

ciclo tiveram níveis aumentados de corticosterona e intolerância à glicose, prevenidos.

64

Por conseguinte, demonstrou-se previamente que a melatonina atenua a resistência à

insulina induzida pelo consumo de uma dieta composta por 60% de frutose ad libitum

em ratos Wistar (Kitagawa, 2012).

O aumento dos níveis de corticosterona observado em condições experimentais,

caracterizado por produção reduzida de melatonina, pode ser explicado pela ação

supressora que o hormônio produzido pela pineal exerce sobre o eixo hipotálamo-

pituitária-adrenal (HPA). Já foi demonstrado que a melatonina atua através de

receptores MT1 para suprimir a produção de cortisol induzida pelo hormônio ACTH em

glândulas supra-renais em cultura isoladas de primatas (Torres-Farfan, 2003). Uma

resposta similar foi encontrada nas glândulas supra-renais em cultura de ratos (Richter,

2008). É importante destacar que a ação supressora da melatonina ao longo do eixo

HPA não pode ser restrita a ação direta sobre as glândulas supra-renais uma vez que

demonstrou-se também que os ratos tratados com melatonina apresentaram reduzidos

níveis de CRH e ACTH depois de um estímulo de stress (Konakchieva, 1997).

65

CONCLUSÃO

Em resumo, a presente tese demonstra que o consumo de frutose durante a fase

clara, mas não durante a fase escura do ciclo claro/escuro, resulta em intolerância à

glucose e aumento dos níveis de corticosterona. Os prejuízos associados ao consumo de

frutose restrito à fase clara são secundários à ativação da AMPK hipotalâmica e à

regulação positiva da ingestão alimentar durante a mesma fase. Também demonstramos

que a redução da produção de melatonina devido à ativação da AMPK hipotalâmica

constitui um evento chave que medeia o aumento da corticosterona e a intolerância à

glucose induzidos pelo consumo de frutose exclusivamente durante o período claro do

ciclo claro/escuro.

66

CAPÍTULO 2

____________________________________________________________________________

Co-autoria/autoria de artigos publicados durante o período

1. De Almeida Faria, J., De Araújo, T.M.F., Isler Mancuso, R., Meulman, J.,

Ferreira, D.S., Batista, T.M., Vetorazzi, J., Silva, P.M.R., Rodrigues, S.C.,

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APÊNDICE

84

ANEXO

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE...

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