UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE LA MIXTECA MAESTRÍA EN … · 2014. 8. 13. · Ferulic Acid exhibited...
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UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE LA MIXTECA
MAESTRÍA EN CIENCIAS PRODUCTOS
NATURALES Y ALIMENTOS
“ANÁLISIS TERMODINÁMICO DEL PROCESO DE
ENCAPSULAMIENTO DEL ÁCIDO FERÚLICO CON CICLODEXTRINAS,
Y LA ELUCIDACIÓN ESTRUCTURAL DE LOS COMPLEJOS ”
PROTOCOLO DE INVESTIGACIÓN
PRESENTA
I.A ARMANDO TORRALBA GONZÁLEZ
24 DE MAYO DEL 2013
DIRECTORA DE TESIS
DRA. EDITH GRACIELA GONZÁLEZ
MONDRAGÓN
CO-DIRECTOR DE TESIS
DR. RAFAEL ZUBILLAGA LUNA
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CONTENIDO 1. INTRODUCCIÓN
i. ÁCIDO FERÚLICO
ii. CICLODEXTRINAS
iii. ANÁLISIS TERMODINÁMICO Y ESTRUCTURAL DEL PROCESO
DE ACOMPLEJAMIENTO
iv. METODOS PARA DETERMINAR EL ACOMPLEJAMIENTO
(TERMODINÁMICO Y ESTRUCTURA)
2. JUSTIFICACIÓN
3. HIPÓTESIS
4. OBJETIVOS
5. METODOLOGÍA
6. RESULTADOS
7. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
2
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ÁCIDO FERÚLICO
• Polifenol
• Se encuentra en la pared celular de material vegetal
• Formando enlaces entre ligninas, taninos y glucósidos
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Urbaniak, A., & Szela, M. (2013). Theoretical investigation of stereochemistry and solvent influence on antioxidant activity of ferulic acid,
1012, 33–40. doi:10.1016/j.comptc.2013.02.018
INTRODUCCIÓN
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ÁCIDO FERÚLICO
Importancia
Efecto antioxidante frente a radicales
Lo proyecta como una molécula interesante con muchas aplicaciones industriales
Industria alimentaria (Precursor
de la vainillina y formulación de
alientos funcionales)
Limitantes
Sabor muy astringente y amargo
Sensible a la luz y el calor
Pobre biodisponibilidad debido principalmente a la baja solubilidad en agua
4
Munin, A. (2011). Encapsulation of Natural Polyphenolic Compounds; a Review (pp. 793–829). doi:10.3390/pharmaceutics3040793
Anselmi, C., Centini, M., Maggiore, M., Gaggelli, N., Andreassi, M., Buonocore, A., Beretta, G., et al. (2008). Non-covalent
inclusion of ferulic acid with ␣ -cyclodextrin improves photo-stability and delivery : NMR and modeling studies, 46, 645–652. doi:10.1016/j.jpba.2007.11.037
INTRODUCCIÓN
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ESTABILIZACIÓN DE MOLÉCULAS
• Encapsulación con ciclodextrinas (CD)
5 INTRODUCCIÓN
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CICLODEXTRINAS
• Oligosacáridos cíclicos
• De seis, siete, ocho o más unidades de glucopiranosa.
• Unidas por enlaces α-(1,4)
• α-ciclodextrina, β-ciclodextrina, γ-ciclodextrina
6 INTRODUCCIÓN
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PROPIEDADES DE LAS CICLODEXTRINAS
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Valle, E. M. M. Del. (2003). Cyclodextrins and their uses : a review. doi:10.1016/S0032-9592(03)00258-9
INTRODUCCIÓN
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8 INTRODUCCIÓN
Interacciones de van der Waals
Interacciones hidrófobicas
Puentes de hidrógeno
Reordenamiento de las moléculas
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MÉTODO DE ACOPLEJAMIENTO
Coprecipitación
Extrusión
Acomplejamiento por suspensión
Acomplejamiento por pegado
9 INTRODUCCIÓN
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ACOPLEJAMIENTO
10
F ormation of complexes
Cyclodextrins in aqueous
solutions welcome “guest
molecules”, other than water, in
their hydrophobic cavities (Szejtli,
1998). The interaction of a CD
and a guest molecule has usually a
molar ratio of 1:1, but other kinds
of interactions can be found, as
showed in figure 3 (Stella et al.
2008). This complex formation
can then increase the solubility of
some drug molecules (Stella et al.
2008 and Loftsson et al. 1996).
Throughout the formation of
complexes between cyclodextrins
and drug molecules, no breakages
of covalent bonds are noticed, but
what leads to the formation of
such complexes is the release of
water molecules from the cavity
of the cyclodextrins,
hydrophobic interactions,
hydrogen bonding, among others (Loftsson 2004). Complexes formed by HP-0.6-β-CD and β-CD
with some bile salts: glycocholate (GC), glycodeoxycholate (GDC) and glycochenodeoxycholate
(GCDC) are the most relevant complexes for this report.
2.2. Bile Salts
Figure 4 : Cholesterol conversion to 7-hydroxy-Cholesterol (Stamp & Jenkins, 2008)
This section will explain the basic and important aspects of BS while also distinguishing the
difference between what is known as BS and bile acid (BA).
Figure 3: Formation of complexes
(http://www.nature.com/nrd/journal/v3/n12/images/nrd1576-f3.jpg)
Paulon H., Paula Melo R., Thomas A. Mackevica, A. (2009). Cyclodextrin and Bile Salt Interactions Using Isothermal Titration
Calorimetry Bachelor Project.
INTRODUCCIÓN
No sigue un
patrón común
Tamaño relativo
cavidad
Tamaño
molécula huésped
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METODOS DE RECUPERACIÓN
DEL COMPLEJO
Centrifugación
Separación con papel filtro con un tamaño de poro de
0.45 mm
El complejo se recupera en estado sólido
11 INTRODUCCIÓN
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ANÁLISIS DE LOS COMPLEJOS DE
INCLUSIÓN CON CD
• Termodinámico
• Calorimetría de titulación isotérmica (ITC)
• Espectroscopía de fluorescencia
• Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC)
• Estructura
• Resonancia Magnética Nuclear (NMR)
• Difractometría de Rayos X
• Espectrocopía infrarroja y Raman
• Microscopía electrónica de barrido
• Espectrofotometría UV-Vis
12 INTRODUCCIÓN
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ANÁLISIS TERMODINÁMICO DEL PROCESO
DE ACOMPLEJAMIENTO
• La variación de energía libre (ΔG)
• Describe si el proceso es espontaneo o no
• El cambio de entalpía estándar (ΔH) • Describe si el sistema absorbió o liberó energía
• El cambio de entropía estándar (ΔS) • Describe lo irreversible de los sistemas termodinámicos
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Mediante esta ecuación se puede determinar si
el proceso de acomplejamiento entálpicamente
o entrópicamente favorable.
INTRODUCCIÓN
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CALORIMETRÍA DE TITULACIÓN
ISOTÉRMICA (ITC)
Equipo de ITC
14 ITC
Paulon Hansen, Paula Melo Rayner, Thomas Allan Mackevica, A. (2009). Cyclodextrin and Bile Salt Interactions Using Isothermal Titration
Calorimetry Bachelor Project.
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CURVA DE TITULACIÓN
15 ITC
Paulon Hansen, Paula Melo Rayner, Thomas Allan Mackevica, A. (2009). Cyclodextrin and Bile Salt Interactions Using Isothermal Titration
Calorimetry Bachelor Project.
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OBTENCIÓN DE PARAMETROS
TERMODINÁMICOS
16
Para obtener la energía libre
de gibbs y a la entropía se
utilizan modelos matemáticos
ITC
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LUZ ENERGÍA ENERGÍA
ENERGÍA
ESPECTROFLUORÓMETRO
ver. 1.0 JT/HH
1
1. Introduction
Rice has been cultivated in large part of Japan for human nutrition and as one of the export
resources. In recent years, there are increasing studies focusing on the bioactive components of
rice and rice bran. Oryza Oil & Fat Chemical Co., Ltd has been involved in the research and
development on the functional benefits of bioactive components of rice bran and rice germ. Rice
derived -oryzanol, tocotrienols, sterol, squalane and ceramide are now widely used as active
ingredient in health food, food additives, pharmaceutical and cosmeceutical products. In this
instance, we have successfully developed ferulic acid, 100% extracted and purified from rice
germ and rice bran with our technology.
2. What is Ferulic Acid?
Ferulic acid is a derivative of cinnamic acid with molecular formula C10H10O4. In 1886,
Hlasiwetz Barth, an Austrian, isolated 3-methoxy-4-hydroxycinnamic acid from the genus
Ferula foetida for structure determination. Ferulic acid together with dihydroferulic acid, is a
component of lignocelluloses, conferring cell wall rigidity by cross linking lignin and
polysaccharides. It is commonly found in seeds of plant such as rice, wheat and oats. Besides,
Ferulic Acid exhibited biochemical role in the inhibition of seed germination, inhibition of
indole-acetic acid and enzyme, inhibition of decarboxylation activity & other protective effect
on micro-organisms and pets.
The syntheis of Ferulic acid was established by Dutt in 1935 when ferulic acid was used as a
precursor in the manufacturing of vanillin and malonic acid. There are vast numbers of studies
documented on the bio-medical properties of ferulic acid such as antioxidant activity,
UV-absorbing capacity & its effect of lignin as precursor in plants metabolic pathway. Ferulic
acid, being highly abundant, is indeed difficult to synthesize, Oryza Oil & Fat Chemical has
successfully developed an efficient method to extract ferulic acid from rice bran and suitable for
applications in the health and beauty arena.
Food & Cosmetic Material
FERULIC ACID
C
OH
OCH3
CH
COOH
H
Fig 1. Ferulic acid
FLUORESCENCIA
ÁCIDO FERÚLICO
Titulación con
ciclodextrinas y monitoreo
de los cambios en la
intensidad de fluorescencia
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ESPECTRO
EMISIÓN
LONGITUD DE ONDA
INT
EN
SID
AD
DE
FL
UO
RE
SC
EN
CIA
ESPECTRO
ABSORCIÓN
310 nm excitación
330 nm emisión
FLUORESCENCIA
FLUORESCENCIA
Obtener la longitud de onda máxima de
excitación, para obtener la mayor señal de
intensidad de emisión de fluorescencia
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OBTENCIÓN DEL VALOR DE KU
19
Ecuación modificada de Benesi–Hildebrand
FLUORESCENCIA
① Curva de titulación Fluorometríca ② Ajustar mediante un modelo
matemático la curva de titulación
③ Obtener Ku ④ Posteriormente calcular ΔGu
o
Zhang, M., Li, J., Jia, W., Chao, J., & Zhang, L. (2010). Theoretical and experimental study of the inclusion complexes of ferulic acid with
cyclodextrins. inclusiondoi:10.1080/10610270802596403
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INCREMENTO EN LA INTENSIDAD DE
FLUORESCENCIA
20 FLUORESCENCIA
Zhang, M., Li, J., Jia, W., Chao, J., & Zhang, L. (2010). Theoretical and experimental study of the inclusion complexes of ferulic acid with
cyclodextrins. inclusiondoi:10.1080/10610270802596403
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ESTUDIO DE RMN
21
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ESTUDIO DE RMN
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Estudio COSY Se observan los protones que están
relacionados entre si mediante acoplamientos
La relajación de los núcleos varíe como función
de dos tiempos de espera diferentes
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JUSTIFICACIÓN
Es relevante acomplejar al ácido ferúlico con ciclodextrinas ya
que le brindará mayor solubilidad en soluciones acuosas y mayor
estabilidad en el transcurso de su almacenamiento.
Los parámetros termodinámicos obtenidos por las técnicas de
ITC y de espectroscopía de fluorescencia permitirán establecerán
las fuerzas intermoleculares que gobiernan el proceso de
inclusión del ácido ferúlico dentro de las ciclodextrinas.
Por otro lado el tener la estructura del acomplejamiento
proporcionará información acerca de cómo esta unido
estructuralmente el ácido ferúlico en las ciclodextrinas.
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HIPÓTESIS
El método de ITC, fluorescencia y RMN permitirán obtener
información de la termodinámica y de la estructura del proceso de
acomplejamiento del ácido ferúlico con las ciclodextrinas
(alfa,beta y gama).
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OBJETIVOS
• Objetivo General
Evaluar los parámetros termodinámicos del proceso de
encapsulamiento del ácido ferúlico con ciclodextrinas, y la
elucidación estructural de los complejos.
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• Meta 1
Determinar los parámetros termodinámicos propios de l proceso de
acomplejamiento del ácido ferúlico con las ciclodextrinas ( )
mediante calorimetría de titulación isotérmica (ITC).
• Objetivos
1. Realizar el análisis termodinámico del proceso de acomplejamiento
entre la ciclodextrina y el ácido ferúlico utilizando la técnica de calorimetría
de titulación isotérmica
2. Obtener los parámetros termodinámicos mediante el ajuste de la
curva de titulación: la constante de unión (Ku), la entalpía (ΔHuo) y la
estequiometría de unión (n).
3. Calcular la energía libre de Gibbs (ΔGuo) y la entropía (ΔSuo) a
partir de los parámetros anteriores.
26 OBJETIVOS
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• Meta 2
Determinar la contante de unión (Ku) mediante una
titulación fluorimétrica para contar con una medición alternativa.
• Objetivo
Investigar la posibilidad de determinar la constante de
unión (Ku) del ácido ferúlico acomplejado con las CD,
empleando una técnica de fluorescencia
27 OBJETIVOS
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• Meta 3
Obtener la estructura de los complejos del ácido ferúlico
con las diferentes ciclodextrinas.
Objetivo
Elucidar la estructura la estructura de los complejos del
ácido ferúlico con las diferentes ciclodextrinas, mediante
resonancia magnética nuclear (RMN) unidimensional y
bidimensional homonuclear.
28 OBJETIVOS
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METODOLOGÍA
Realizar el análisis
termodinámico del proceso de acomplejamiento
utilizando la técnica de calorimetría de titulación
isotérmica
Obtener los parámetros termodinámicos mediante
el ajuste de la curva de titulación: constante de
unión (Ku), entalpía (ΔHuo) y la estequiometría de
unión (n)
Calcular la energía libre de Gibbs (ΔGuo) y la entropía (ΔSuo)
mediante las relaciones
termodinámicas estándar
Determinar la constante de unión
(Ku) del ácido acomplejado
ferúlico con las CD, empleando una
técnica de fluorescencia
Elucidación estructural de los complejos ácido ferúlico-CD por
espectroscopía de RMN
Redacción del
documento del reporte
final
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ΔGuo = -RT ln Ku
ΔSuo = (ΔHuo
- ΔGuo)/ T
Establecer condiciones de concentración y tipo de disolvente así como la
técnica de recuperación de los complejos
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CONDICIONES DE LA
EXPERIMENTACIÓN CON ITC
Ácido ferúlico 1X10-3 M
Ciclodextrinas (α-CD, β-CD, γ-CD) 1X10-2 M
Las condiciones de los experimentos serán:
20 inyecciones de 1.5 μl de solución de ciclodextrina en la celda de
muestra que contiene la solución de ácido ferúlico.
El intervalo de tiempo entre las inyecciones será de 300 segundos.
La velocidad de agitación será de 310 rpm
La temperatura de la celda será de 25 ºC
30 METODOLOGÍA
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CRONOGRAMA TRIMESTRAL DE ACTIVIDADES
31
-
GRACIAS POR SU
ATENCIÓN
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• Clasificación de los polifenoles
• La subdivisión de polifenoles en taninos, ligninas y flavonoides
deriva de la variedad de unidades simples polifenoles derivadas
de los metabolitos secundarios de las plantas de la ruta del ácido
shikímico.
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IMPORTANCIA DE POLIFENOLES • Los polifenoles naturales son valiosos compuestos que
poseen propiedades antiradicalarías y de acomplejación con proteínas.
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Formulaciones
• Alimentos
• Farmacéuticos
Urbaniak, A., & Szela, M. (2013). Theoretical investigation of stereochemistry and solvent influence on antioxidant activity of ferulic acid,
1012, 33–40. doi:10.1016/j.comptc.2013.02.018
Controlan enfermedades como:
-Cáncer
-Trastornos cardiovasculares
-Aterosclerosis
-Asma
-Artritis
-Trastornos neurodegenerativos (enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y demencia)
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CICLODEXTRINAS
Capacidad para formar
complejos de inclusión
Se rompen y se forman enlaces no covalentes
durante la formación del
complejo.
La principal fuerza impulsora de la formación de complejos
es por la liberación de moléculas de agua de la
cavidad de ciclodextrinas.
Disminuye la tensión del anillo de ciclodextrina
ganando estabilidad por el descenso a un nivel inferior
de energía.
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Valle, E. M. M. Del. (2003). Cyclodextrins and their uses : a review. doi:10.1016/S0032-9592(03)00258-9
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Industrias
• Alimentos
• Productos farmacéuticos
• Cosméticos
• Protección del medio ambiente
• Bioconversión
• Industria textil
Moleculas huésped
• Alifáticos de cadena lineal o ramificada
• Aldehídos
• Cetonas
• Alcoholes
• Ácidos orgánicos, ácidos grasos
• Compuestos aromáticos
• Compuestos polares tales como halógenos y aminas
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USOS DE LAS
CICLODEXTRINAS
Valle, E. M. M. Del. (2003). Cyclodextrins and their uses : a review. doi:10.1016/S0032-9592(03)00258-9
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FACTORES QUE INTERVIENE EN EL
ACOMPLEJAMIENTO
Factor estérico
• Depende del tamaño relativo de la cavidad de la ciclodextrina y del tamaño de la molécula huésped.
Factor en las interacciones termodinámicas
• Interacciones termodinámicas entre los diferentes componentes del sistema (ciclodextrina, huésped y disolvente).
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INTERACCIONES CD-HUESPED
• Interacciones energéticamente favorables que ayudan a la formación del complejo de inclusión:
• • El desplazamiento de las moléculas de agua desde la cavidad de la ciclodextrina.
• • El aumento del número de puentes de hidrógeno formados conforme el agua se desplazada hacia afuera de la ciclodextrina.
• • Una reducción de las interacciones repulsivas entre la molécula huésped hidrófoba y el entorno acuoso.
• • Un aumento de las interacciones hidrofóbicas entre la molécula huésped y la cavidad de la ciclodextrina.
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CALORIMETRÍA DE TITULACIÓN
ISOTÉRMICA (ITC)
Es una técnica altamente sensible que es capaz de determinar la interacción de la reacción de las especies en solución.
Hasta ahora se ha utilizado con gran éxito en el estudio de la interacción entre biomoléculas en soluciones acuosas diluidas brindando información termodinámica y cinética.
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Krishnakumari, V., & Nagaraj, R. (2012). Biochimica et Biophysica Acta Binding of peptides corresponding to the carboxy-terminal
region of human-β-defensins-1 – 3 with model membranes investigated by isothermal titration calorimetry, 1818, 1386–1394.
doi:10.1016/j.bbamem.2012.02.016
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MICROCALORIMETRÍA DE TITULACIÓN
ISOTÉRMICA (ITC)
La sensibilidad analítica de valoraciones termométricas está linealmente relacionada con la concentración.
El calor es liberado o absorbido en proporción directa a la cantidad de unión que se produce.
Cuando el anfitrión en la célula huésped se satura con agregado, la señal de calor disminuye hasta que el calor de fondo de dilución se observa.
40
Castronuovo, G., & Niccoli, M. (2013). Ac ce pt cr t. Thermochimica Acta. doi:10.1016/j.tca.2013.01.037
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Termodinámica
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La termodinámica es la rama de la física que describe los estados de
equilibrio a nivel macroscópico.
Entalpía es una magnitud termodinámica, simbolizada con la letra H
mayúscula, cuya variación expresa una medida de la cantidad de energía
absorbida o cedida por un sistema termodinámico, es decir, la cantidad de
energía que un sistema puede intercambiar con su entorno.
La entropía es una magnitud física que, mediante cálculo, permite
determinar la parte de la energía que no puede utilizarse para producir
trabajo. Es una función de estado de carácter extensivo y su valor, en un
sistema aislado, crece en el transcurso de un proceso que se dé de forma
natural. La energía libre de Gibbs es un potencial termodinámico, es decir, una
función de estado extensiva con unidades de energía, que da la condición
de equilibrio y de espontaneidad para una reacción química (a presión y
temperatura constantes).
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• La fluorescencia es un tipo particular de luminiscencia, que caracteriza a las sustancias que son capaces de absorber energía en forma de radiaciones electromagnéticas y luego emitir parte de esa energía en forma de radiación electromagnética de longitud de onda diferente.
• La energía total emitida en forma de luz es siempre menor a la energía total absorbida y la diferencia entre ambas es disipada en forma de calor. En la mayoría de los casos la longitud de onda emitida es mayor -y por lo tanto de menor energía- que la absorbida, sin embargo, si la radiación de excitación es intensa, es posible para un electrón absorber dos fotones; en esta absorción bifotónica, la longitud de onda emitida es más corta que la absorbida, sin embargo en ambos casos la energía total emitida es menor que la energía total absorbida.
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FLUORESCENCIA tecnica
Realizar un escaneo y obtener los espectros de excitación y de
emisión del ácido ferúlico
Obtener la longitud de onda máxima de excitación, para obtener
la mayor señal de intensidad de emisión de fluorescencia
Realizar la titulación con ciclodextrinas y monitorear los cambios
en la intensidad de fluorescencia
Generar la curva de titulación fluorometríca (intensidad de
fluorescencia VS concentración de CD)
Ajustar mediante un modelo matemático la curva de titulación y
obtener el parametro de Ku y energía libre de Gibbs
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RMN
• Tal y como se indicó en la introducción en un aparato de RMN tenemos más de un emisor de frecuencias con lo cual podemos irradiar con varias frecuencias diferentes si fuese necesario, pero también podemos hacer lo que se denominan secuencias de pulsos es decir irradiamos la muestra dejamos un cierto tiempo para que se relaje parcialmente y volvemos a irradiarla con frecuencias o campos diferentes antes de que acabe de relajarse. También cabe la posibilidad de considerar experiencias en las que la relajación de los núcleos varíe como función de dos tiempos de espera diferentes que van a dar lugar a unos espectros cuya representación debería ser tridimensional y que como convenio o convención representamos mediante curvas de nivel semejantes a los mapas topográficos y que conocemos como RMN bidimensionales. Dependiendo de las secuencias de pulsos usadas y de dichos tiempos de espera entre los pulsos se obtienen diferentes espectros siendo los dos mas usados el espectro COSY homonuclear y la correlación heteronuclear (HETCOR, HMQC). En el primero de ellos se observan los protones que estan relacionados entre si mediante acoplamientos y en el segundo nos indica que protones se relaciona con que carbono y viceversa
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