UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS FÍSICAS Y...

UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS FÍSICAS Y MATEMÁTICAS DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA Y BIOTECNOLOGÍA

ESTUDIO DE LA REDUCCIÓN DE AZUFRE ELEMENTAL Y PRODUCCIÓN DE SULFURO DE HIDRÓGENO EN BIOREACTORES ANAERÓBICOS

TESIS PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS DE LA INGENIERÍA MENCIÓN QUÍMICA

CLAUDIO MANUEL ESCOBAR ANTOINE

PROFESOR GUÍA: LEANDRO HERRERA ZEPPELIN

PROFESOR CO-GUÍA:

TOMÁS VARGAS VALERO

MIEMBROS DE LA COMISIÓN: JOSÉ HERNÁNDEZ PAVEZ

MARÍA ELENA LIENQUEO CONTRERAS GONZALO RUIZ FILIPPI

SANTIAGO DE CHILE

OCTUBRE 2009

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RESUMEN En el presente trabajo de tesis se estudió la reducción de azufre elemental y la producción de sulfuro de hidrógeno en dos diferentes tipos de bioreactores: reactor agitado mecánicamente y reactor gaslift. La importancia de este estudio radica en la comprensión de los distintos factores que se ven involucrados en este tipo de sistema bacteriano, con la finalidad de lograr un futuro desarrollo tecnológico de estos bioreactores para su aplicación industrial. Tanto el reactor agitado mecánicamente como el reactor gaslift, fueron inoculados con cultivos de Desulfovibrio desulfuricans. La temperatura de los reactores se controló automáticamente en 30ºC y el pH se mantuvo constante automáticamente a 7,0 ± 0,2, mediante inyección de CO2. Ambos reactores fueron operados en modalidad batch para las fases líquida y sólida, y en forma continua para la fase gas (H2, H2S(g), H2O(vap), CO2(g)). Como sustrato energético se utilizó H2 y como fuente carbono se utilizó CO2. Los resultados experimentales mostraron que la principal limitante de la velocidad de reacción es la disponibilidad de superficie activa de las partículas de azufre. Esta va disminuyendo a medida que se recubre con biofilm, compuesto tanto por bacterias como por sustancias poliméricas extracelulares. La presencia de bacterias adheridas a la superficie de las partículas de azufre pudo ser detectada mediante microfotografías tomadas con SEM. Por otra parte, utilizando la técnica XPS se determinó que las sustancias poliméricas extracelulares estaban constituidas aproximadamente por 73% de proteínas y 27% de polisacáridos. Se pudo comprobar que no hay limitación por transferencia de masa gas líquido del hidrógeno. Tampoco se evidenciaron problemas por inhibición por producto (ácido sulfhídrico). Sólo se presentaron problemas de desorción del ácido sulfhídrico para una velocidad de gas igual a 5,1·10-4 m3N·m-2·s-1, en el reactor agitado mecánicamente. En los experimentos realizados en el reactor gaslift se obtuvo una tasa promedio de formación de H2S(g) de 65,6 ± 7,0 mg H2S·(g S)

-1·d-1 (687 ± 71 mg H2S·(m2 S)-1·d-1), para un rango de v/v/m

comprendido entre 0,17 y 0,93. Mientras que en el reactor agitado se obtuvo una tasa promedio de formación de H2S(g) de 50,7 ± 2,7 mg H2S·(g S)

-1·d-1 (513 ± 38 mg H2S·(m2 S)-1·d-1), para un

rango de v/v/m comprendido entre 0,22 y 2,97. De esta manera es más conveniente el empleo del reactor gaslift que el reactor agitado mecánicamente, ya que se logra un patrón de mezclado aceptable, una buena suspensión de azufre y mayores velocidades de formación de producto para menores consumos de potencia. Mediante el estudio de intermediarios de la reacción, fue posible detectar tiosulfato y otro compuesto más, que podría corresponder a un polisulfuro del tipo [Sn-1

(0)S(2-)]2-. Mediante el desarrollo de un modelo fenomenológico que describió la bioreducción de azufre elemental, se determinaron los parámetros cinéticos de la reacción en el reactor agitado mecánicamente: µmax (velocidad máxima de crecimiento específico celular) = 5,1·10

-3 h-1; kS1(constante de afinidad al aceptor terminal de electrones) = 8,7·10-3 M; kA (constante cinética de adherencia) = 1·10

-1 h-1; kd (constante cinética de desorción) = 6,5·10-5 h-1; kS

(coeficiente cinético para la reacción en la superficie) = 6,5·10-1 m·h-1.

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AGRADECIMIENTOS Una vez finalizada esta etapa, quisiera agradecer sinceramente a las siguientes personas. A mis estimados profesores Leandro Herrera y José Hernández por guiarme de manera brillante en la realización de mis estudios de Doctorado. A mis profesores de comisión por mejorar este trabajo y por el tiempo dedicado: Tomás Vargas, María Elena Lienqueo y Gonzalo Ruiz. A Loreto Bravo, por su valiosa ayuda durante todo el trabajo experimental de esta Tesis. A Blanca Escobar, Jorge Castillo, Andrés Ibáñez y Boris Chornik, por toda la colaboración y el soporte brindado en la realización de diversos experimentos. A todos los integrantes del Laboratorio de Catálisis y del Laboratorio de Polímeros por toda la ayuda prestada y por su grata compañía: Paulo Araya, Francisco Gracia, Sergio Quinteros, Francisco Díaz, Gonzalo Águila, Patricio Baeza, Juan Benavides, Teresa Velilla y Lorena Guajardo. A don Manuel, don Juan y Juan Luis, por toda su colaboración y buena disposición. A todos los nuevos amigos que conocí en mi paso por el DIQBT: Gina Madariaga, Irene Román, Loreto Bravo, Érika Jorquera, Luis Cáceres, Carolina Urmeneta, Kimlin Fong, Patricia Contreras, María Luz Farah, Felipe Díaz y a todos los que se me quedaron en el tintero. A Gonzalo Rund por sus valiosos y desinteresados aportes al mejoramiento de esta obra. A toda mi familia por su constante apoyo y cariño, especialmente a mis padres Fernando Escobar e Ivonne Antoine y a mis hermanos Gonzalo y Andrés Escobar. Quiero brindar un especial agradecimiento al amor de mi vida, Carmen Saavedra, por su apoyo, por su amor y por inspirarme a ser cada día mejor. A su familia por todo el cariño que me han entregado A la radio Futuro y sus programas de Rock, por hacer más placenteras las jornadas nocturnas de trabajo en el laboratorio. Al CEIQBT por los pies de cueca y esquinazos diechiocheros. Finalmente deseo agradecer a CONICYT por el financiamiento de mis estudios de Doctorado.

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ÍNDICE DE CONTENIDOS

Contenido Página RESUMEN………………………………………………………………………………………...ii AGRADECIMIENTOS…………………………………………………………………………..iii NOMENCLATURA………………………………………………………………………………xi CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN………………………………………………………………...1 1.1 Microorganismos reductores de azufre............................................................................ 1

1.1.1 Cinética de las bacterias reductoras de azufre ......................................................... 2 1.2 Mecanismo de reacción ................................................................................................... 5 1.3 Adherencia bacteriana en las partículas de azufre........................................................... 7 1.4 Biodiversidad microbiana en bioreactores ...................................................................... 8 1.5 HIPÓTESIS ..................................................................................................................... 8 1.6 OBJETIVOS.................................................................................................................... 8

1.6.1 Objetivo General ..................................................................................................... 9 1.6.2 Objetivos Específicos .............................................................................................. 9

CAPÍTULO 2. ANTECEDENTES GENERALES………………………………………………10 2.1 Detección de Microorganismos..................................................................................... 10

2.1.1 Análisis de resultados de T-RFLP......................................................................... 10 2.1.1.1 Análisis de biodiversidad .................................................................................. 10 2.1.1.1.1 Diversidad alfa............................................................................................. 10 2.1.1.1.2 Diversidad beta ............................................................................................ 11

2.2 CRECIMIENTO BACTERIANO................................................................................. 13 2.3 AZUFRE ELEMENTAL............................................................................................... 15 2.4 EQUILIBRIOS QUÍMICOS ......................................................................................... 16

2.4.1 Equilibrios de ionización del Ácido sulfhídrico .................................................... 16 2.4.2 Equilibrio líquido-gas del Ácido sulfhídrico ......................................................... 17 2.4.3 Equilibrios de ionización del dióxido de carbono y bicarbonato .......................... 17 2.4.4 Equilibrio gas-líquido del dióxido de carbono ...................................................... 18 2.4.5 Equilibrio gas-líquido del Hidrógeno.................................................................... 18

2.5 TRANSFERENCIA DE MASA GAS-LÍQUIDO......................................................... 18 2.6 REACTOR GASLIFT ................................................................................................... 20

CAPÍTULO 3. MATERIALES Y MÉTODOS…………………………………………………..24 3.1 SISTEMAS EXPERIMENTALES ............................................................................... 24

3.1.1 Sistema experimental reactor agitado mecánicamente.......................................... 24 3.1.1.1 Análisis de muestras .......................................................................................... 25

3.1.2 Sistema experimental reactor gaslift ..................................................................... 26 3.1.2.1 Análisis de muestras .......................................................................................... 27

3.2 BACTERIAS Y MEDIO DE CULTIVO ...................................................................... 27 3.3 DETERMINACIÓN DE PROPIEDADES DE TRANSFERENCIA E HIDRODINÁMICAS DE LOS REACTORES......................................................................... 28 3.4 DETERMINACIONES ANALÍTICAS ........................................................................ 30

3.4.1 Determinación de la concentración de Sulfuro total ............................................. 30 3.4.2 Determinación de sulfato, tetrationato, sulfito, metabisulfito y tiosulfato ............ 30 3.4.3 Determinación de la concentración de células suspendidas .................................. 31 3.4.4 Determinación de la concentración de azufre suspendido..................................... 31

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3.4.5 Determinación potencial zeta de las partículas de azufre...................................... 31 3.4.6 Determinación distribución de tamaños de partículas de azufre ........................... 32 3.4.7 Determinación patrón de difracción de rayos X de las partículas de azufre ......... 33 3.4.8 Análisis de adherencia bacteriana.......................................................................... 34 3.4.9 Análisis superficial de las partículas de azufre...................................................... 34 3.4.10 Detección de microorganismos mediante análisis de T-RFLP.............................. 35

3.5 COMPONENTES DEL SISTEMA EXPERIMENTAL............................................... 36 3.5.1 Descripción de componentes ................................................................................. 36 3.5.2 Instrumentación y control...................................................................................... 39 3.5.3 Aparatos e Instrumentos ........................................................................................ 39 3.5.4 Conexiones sistemas experimentales..................................................................... 40

3.6 MODELACIÓN DINÁMICA....................................................................................... 40 CAPÍTULO 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN………………………………………………...41 4.1 PROPIEDADES DE TRANSFERENCIA DE MASA DEL REACTOR AGITADO MECÁNICAMENTE ................................................................................................................ 41 4.2 ESTUDIO CINÉTICO DE LA REDUCCIÓN DE AZUFRE MEDIADA POR BACTERIAS EN REACTOR AGITADO MECÁNICAMENTE............................................ 42 4.3 DISEÑO Y CONSTRUCCIÓN DE REACTOR GASLIFT. ........................................ 53 4.4 CARACTERIZACIÓN HIDRODINÁMICA Y DE TRANSFERENCIA DE MASA DEL REACTOR GASLIFT. ..................................................................................................... 54 4.5 ESTUDIO CINÉTICO DE LA REDUCCIÓN DE AZUFRE MEDIADA POR BACTERIAS EN REACTOR GASLIFT.................................................................................. 62 4.6 COMPARACIÓN DE REACTORES........................................................................... 65 4.7 ESTUDIO DE ADHERENCIA BACTERIANA Y ANÁLISIS SUPERFICIAL DE PARTÍCULAS DE AZUFRE.................................................................................................... 69 4.8 ESTUDIO DE BIODIVERSIDAD BACTERIANA..................................................... 83 4.9 ESTUDIO DE INTERMEDIARIOS DE LA REACCIÓN........................................... 89 4.10 MODELACIÓN MATEMÁTICA DEL REACTOR AGITADO ................................ 92

CAPÍTULO 5. CONCLUSIONES……………………………………………………………...102 CAPÍTULO 6. RECOMENDACIONES………………………………………………………..104 REFERENCIAS………………………………………………………………………………...105 APÉNDICES……………………………………………………………………………………113 APÉNDICE A. Determinación velocidad de agitación reactor agitado mecánicamente…...114 APÉNDICE B. Resazurina como indicador de anaerobiosis……………………………….115 APÉNDICE C. Procedimiento T–RFLP……………………………………………………116 APÉNDICE D. Fotografías del montaje experimental……………………………………..120 APÉNDICE E. Programa desarrollado para la integración de las ecuaciones del modelo y el ajuste de parámetros…………………………………………………………………………….122 APÉNDICE F. Publicaciones generadas durante esta investigación……………………….128

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ÍNDICE DE FIGURAS

Página

Figura 1. Variación de la energía libre de Gibbs con la temperatura para la reacción de reducción

de azufre elemental con hidrógeno en condiciones fisiológicas. ............................................ 5

Figura 2. Curva típica de crecimiento celular (Fuente: Doran, 1998)........................................... 14

Figura 3. Estructuras resonantes del anillo S8 ............................................................................... 15

Figura 4. Descripción reactor gaslift de flujo inverso y sus dimensiones. .................................... 20

Figura 5. Distribución detallada de equipos, conexiones y sistemas de control y adquisición de

datos del sistema experimental del reactor agitado mecánicamente. CV controlador de

válvula solenoide; CT controlador de temperatura; TT transmisor de temperatura; TpH

transmisor de pH; TEh transmisor de Eh; A/D convertidor análogo/digital de señales........ 24

Figura 6. Distribución detallada de equipos, conexiones y sistemas de control y adquisición de

datos del sistema experimental del reactor gaslift. La nomenclatura es la misma empleada en

la Figura anterior. .................................................................................................................. 26

Figura 7. Dimensiones del reactor gaslift. ..................................................................................... 37

Figura 8. a) Vista de la base del reactor. b) Corte transversal de la base del reactor ................... 38

Figura 9. Velocidad de formación de H2S(g) para UG = 2,1·10-3 m3N·m-2·s-1. La flecha 1 indica

que 18 g de azufre fueron agregados al reactor. .................................................................... 43

Figura 10. Velocidad de formación de H2S considerando el aporte de sulfuro total en el reactor.

UG = 2,1·10-3 m3N·m-2·s-1. ..................................................................................................... 44

Figura 11. Diámetro promedio estimado de partículas de azufre en el reactor agitado

mecánicamente. UG = 2,1·10-3 m3N·m-2·s-1. .......................................................................... 45

Figura 12. Velocidad de formación de H2S(g) para 5,1·10-4, 1,4·10-3 y 2,1·10-3 m3N·m-2·s-1. La

flecha 1 indica que se agregaron al reactor 400 mg de extracto de levadura. La flecha 2

indica que se agregaron al reactor 16 g de azufre.................................................................. 46

Figura 13. Concentración de sulfuro total en el reactor para 5,1·10-4, 1,4·10-3 y 2,1·10-3 m3N·m-2·s-

1. La flecha roja indica que se agregaron al reactor 16 g de azufre. ...................................... 47

Figura 14. Concentración de células suspendidas en el reactor. Las flechas 1, 3 y 4 indican que se

agregaron 100 mL de medio sin extracto de levadura al reactor. La flecha 5 indica que se

agregaron 400 mg de extracto de levadura al reactor. Las flechas 2 y 6 indican que se

agregaron al reactor 18 y 16 g de azufre, respectivamente. .................................................. 49

vii

Figura 15. Potencial de óxido reducción del reactor. La flecha 1 indica que se interrumpió el flujo

de hidrógeno y se cerró el reactor con 2 psig de este gas. La flecha 2 indica que se reinició el

flujo continuo de hidrógeno. Las flechas 3 y 5 indican que se agregaron al reactor 18 y 16 g

de azufre, respectivamente. La flecha 4 indica que se agregaron al reactor 400 mg de

extracto de levadura............................................................................................................... 50

Figura 16. Velocidad de formación de H2S(g) expresado por volumen de reacción para todo el

período de experimento en el reactor agitado mecánicamente.............................................. 51

Figura 17. Velocidad de formación de H2S(g) expresado por masa total de azufre para todo el

período de experimento en el reactor agitado mecánicamente.............................................. 51

Figura 18. Velocidad de formación de H2S(g) expresado por superficie total de azufre para todo

el período de experimento en el reactor agitado mecánicamente.......................................... 52

Figura 19. Variación de (kLa)H2 con UGR ...................................................................................... 55

Figura 20. Variación del Hold-up gaseoso local descendente con la profundidad del reactor, para

distintos valores de UGR......................................................................................................... 56

Figura 21. Variación del Hold-up gaseoso ascendente, descendente, global y la diferencia entre

hold-up ascendente y descendente, para distintos valores de UGR. ....................................... 57

Figura 22. Variación de la velocidad del líquido con UGR. Los valores corresponden al promedio

de 30 determinaciones. .......................................................................................................... 59

Figura 23. Tasa de formación de H2S(g) y concentración de azufre en función de la velocidad

superficial del gas en la zona ascendente. ............................................................................. 62

Figura 24. Velocidad de formación de H2S(g) en función de la masa y de la superficie total del

azufre suspendido en el reactor ............................................................................................. 64

Figura 25. Concentración de sulfuro total en función de la velocidad superficial del gas en la

zona ascendente. .................................................................................................................... 65

Figura 26. Velocidades de formación de H2S(g) por gramo de azufre suspendido (VHG) en

función de kLa........................................................................................................................ 66


función de v/v/m.................................................................................................................... 67


función de la potencia suministrada. ..................................................................................... 69

Figura 29. Adherencia bacteriana en partículas de azufre en el reactor agitado mecánicamente. La

foto fue tomada el día 8,5. Mag. = 6,50 KX.......................................................................... 70

viii

Figura 30. Microfotografía de una partícula de azufre en ausencia de bacterias. Mag. = 5,00 KX.

............................................................................................................................................... 71

Figura 31. Microfotografía de una partícula de azufre en el reactor agitado mecánicamente. La

foto fue tomada el día 8,5. Mag. = 15,00 KX........................................................................ 72

Figura 32. Difractograma de partículas de azufre. En azul: azufre antes de la reacción. En rojo:

azufre después de 25 días de reacción. .................................................................................. 73

Figura 33. Potencial zeta de las partículas de azufre para diferentes valores de pH. En rojo:

azufre antes de la reacción. En azul: azufre después de 25 días de reacción. Se indica el

punto isoeléctrico para ambas muestras. ............................................................................... 74

Figura 34. Potencial zeta de partículas de azufre provenientes del reactor gaslift para diferentes

valores de pH. En rojo: azufre en tiempo cero. En azul: azufre después de 6 días de reacción.

Se indica el punto isoeléctrico para ambas muestras............................................................. 75

Figura 35. Microfotografía de partículas de azufre en ausencia de bacterias. Mag. = 500 X. ...... 76

Figura 36. Microfotografía de partículas de azufre en ausencia de bacterias. Mag. = 1,00 KX. .. 76

Figura 37. Microfotografía de partículas de azufre después de 35 minutos del inicio del flujo de

H2. Mag. = 500 X................................................................................................................... 77


H2. Mag. = 5,00 KX............................................................................................................... 77


H2. Mag. = 5,00 KX............................................................................................................... 78

Figura 40. Microfotografía de partículas de azufre después de 2,1 días del inicio del flujo de H2.

Mag. = 5,00 KX..................................................................................................................... 78


Mag. = 5,00 KX..................................................................................................................... 79


Mag. = 5,00 KX..................................................................................................................... 79

Figura 43. Espectro XPS de partículas de azufre después de 7,5 días del inicio del flujo de H2. . 81

Figura 44. Espectro XPS del carbón 1s de la muestra de partículas de azufre después de 7,5 días

del inicio del flujo de H2........................................................................................................ 81

Figura 45. Espectro XPS del azufre 2p de la muestra de partículas de azufre después de 7,5 días

del inicio del flujo de H2........................................................................................................ 82

Figura 46. Electroferograma Muestra 1......................................................................................... 84


ix


Figura 49. Dendrograma obtenido con análisis de clusters para las tres muestras........................ 88

Figura 50. Gráfico de PCA para las muestras del reactor gaslift. ................................................. 89

Figura 51. Cromatograma muestra reactor gaslift. ........................................................................ 90

Figura 52. Resultado de la modelación y datos experimentales para la biomasa suspendida....... 99

Figura 53. Resultado de la modelación y datos experimentales para el radio promedio de las

partículas de azufre.............................................................................................................. 100

Figura 54. Resultado de la modelación de la evolución de la biomasa adherida. ....................... 101

Figura 55. Esquema propuesto de sistema experimental para estudiar reducción de azufre sin

contacto con bacterias.......................................................................................................... 104

Figura A 1. Formación de compuestos reducidos de la resazurina. ............................................ 115

Figura A 2. Etapas involucradas en el desarrollo de T-RFLP (Fuente: Morales G, 2006). ........ 116

x

ÍNDICE DE TABLAS

Página Tabla 1. Velocidades de formación de H2S(g) por gramo de azufre suspendido (VHG)................ 3

Tabla 2. Características principales de los alótropos cicloocta-S.................................................. 16

Tabla 3. Características geométricas del reactor gaslift. ............................................................... 37

Tabla 4. Coeficientes combinados de transferencia de masa para hidrógeno para distintas UG. .. 41

Tabla 5. Velocidades de formación de H2S(g) por gramo de azufre suspendido (VHG) obtenidas

en el reactor agitado mecánicamente..................................................................................... 52

Tabla 6. Resultados εεεεGTD y ajuste exponencial.............................................................................. 56

Tabla 7. Porcentaje de azufre suspendido desde el fondo del reactor gaslift para distintas UGR. 63

Tabla 8. Índices de biodiversidad para 3 muestras del reactor gaslift. .......................................... 87

Tabla 9. Coeficientes de similitud de Sørensen para las tres muestras del reactor gaslift. ........... 87

Tabla 10. Tiempos de retención de estándares y sus respectivos intervalos de confianza,

utilizados en estudio de intermediarios de la reacción. ......................................................... 90

Tabla 11. Parámetros óptimos del modelo matemático............................................................... 100

Tabla A 1. Concentraciones de los reactivos utilizados en PCR................................................. 118

Tabla A 2. Concentraciones de los reactivos utilizados en la digestión...................................... 119

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NOMENCLATURA

Símbolo Descripción AD Sección transversal de la zona descendente del reactor gaslift Ad Área de libre flujo de la zona ascendente del reactor gaslift aL Área interfacial por unidad de volumen de líquido. AR Sección transversal de la zona ascendente del reactor gaslift B Razón hB diámetro zona ascendente (B = hB/ DR)

20OLC

Concentración inicial de oxígeno en fase líquida

CL* Concentración de equilibrio en el líquido para un gas poco soluble

CLO2 Concentración de oxígeno en la fase líquida CLO2

* Concentración de saturación de oxígeno en la fase líquida D Coeficiente de dispersión axial d Longitud paleta de agitación (impeller) d0 Diámetro orificio difusor de gases db Diámetro de burbuja de gas DD Diámetro zona descendente reactor gaslift de Diámetro equivalente reactor di Diámetro de partícula Di Diámetro interno del reactor DL Coeficiente de difusión DP Diámetro promedio de partículas DR Diámetro zona ascendente reactor gaslift Fr Número de Froude (Fr = UGR/(g·DR)

0.5) Ga Número de Galileo (Ga = g·ρL

2·DR3/µL

2) h Altura dispersión gas-líquido h Constante de Planck (6,62·10-34 J s) hB Separación desde la base del reactor gaslift hasta la base del tubo deflector hbr Altura del nivel de líquido de un bioreactor hd Altura tubo deflector: HH2 Constante de Henry para el equilibrio gas – líquido de H2 HL Altura líquido hS Distancia entre el tope del tubo deflector y la altura de líquido I0 Intensidad de la luz incidida a la muestra Ii Intensidad de la luz transmitida a través de la muestra K Coeficiente óptico de la celda y de forma de partícula k11 Constante cinética de la reacción directa de la disociación de H2S(ac) k12 Constante cinética de la reacción inversa de la disociación de H2S(ac) k31 Constante cinética de la reacción directa de la hidratación-disociación de CO2(ac) k32 Constante cinética de la reacción inversa de la hidratación-disociación de CO2(ac) K5 Constante ajustada por Merchuk et al KB Coeficiente de pérdida friccional en el fondo del reactor gaslift ki Coeficiente de absorbancia de la partícula di

xii

Ki Constantes de afinidad respecto a diferentes sustratos Si

kL Coeficiente de transferencia de masa local de la fase líquida kLa Coeficiente combinado de transferencia de masa gas-líquido KS Constante de afinidad respecto al sustrato o constante de saturación KT Coeficiente de pérdida friccional superior del reactor gaslift n Número de orificios del distribuidor n Flujo de moles de gas a la entrada del reactor N Velocidad de agitación n4 Constante ajustada por Merchuk et al Ni Número de partículas di NP Número de potencia P Potencia P0 Potencia consumida sin aireación p1 Presión en la base del reactor p2 Presión de cabeza del reactor PG Potencia consumida con aireación pi Abundancia relativa de la especie i QG0 Caudal de gas por orificio del distribuidor R Resistencia al flujo en la zona descendente del reactor gaslift (R = Ad/ AR) Re0 Número de Reynolds en el orificio difusor de gases [S] Concentración sustrato limitante Sh Número de Sherwood (Sh = kLa·DR

2/DL) T Razón hS diámetro zona ascendente (T=(hS/DR)+1) tb Tiempo promedio de residencia de una burbuja dentro de un bioreactor tC Tiempo de circulación del líquido tD Tiempo del líquido en la zona descendente del reactor gaslift tR Tiempo del líquido en la zona ascendente del reactor gaslift TX Tasa de decaimiento celular UG Velocidad superficial de gas UGR Velocidad superficial de gas en la zona ascendente del reactor gaslift ULD Velocidad superficial del líquido en la zona descendente del reactor gaslift ULR Velocidad superficial del líquido en la zona ascendente en el reactor gaslift VG Flujo de gas VL Volumen de la fase líquida VLD Velocidad lineal del líquido en la zona descendente del reactor gaslift VLR Velocidad lineal del líquido en la zona ascendente del reactor gaslift vt Velocidad terminal de las burbujas de gas en la fase líquida X Concentración células suspendidas Xi Fracción relativa de partículas di Y Razón separador de gas (hS + DR)/Di

−24SX

Y Coeficiente de rendimiento celular respecto del tetrasulfuro

2HXY

Coeficiente de rendimiento celular respecto del hidrógeno

2COXY Coeficiente de rendimiento celular respecto del dióxido de carbono −

LV Velocidad de circulación del líquido

xiii

LETRAS GRIEGAS Símbolo Descripción Φ Función trabajo σ Tensión superficial del líquido ρG Densidad del gas εGD Hold-up gaseoso zona descendente del reactor gaslift εGLD Hold-up local descendente del reactor gaslift εGR Hold-up gaseoso zona ascendente del reactor gaslift εGTD Hold-up total descendente del reactor gaslift ρL Densidad del líquido ρS Densidad del sólido µeff Viscosidad efectiva de la suspensión µmax Velocidad de crecimiento específico celular máxima ν Frecuencia de la radiación νL Viscosidad cinemática del líquido

1

CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN Durante el siglo pasado, el flujo de azufre desde la corteza terrestre y su consecuente acumulación en la biosfera se incrementó notoriamente debido a actividades antropogénicas, principalmente la quema de combustibles fósiles y los procesos de fundición de minerales sulfurados. Una de las formas de minimizar este impacto ambiental de la minería es transformar el azufre emitido a formas de más fácil manejo y disposición, como el azufre elemental. La creciente demanda por productos de azufre más reactivo, es decir de menor estado de oxidación, hacen más interesante reducir el azufre elemental a su forma química más reducida, el sulfuro. El sulfuro de hidrógeno se utiliza en operaciones metalúrgicas para la recuperación y remoción de metales de las aguas de lixiviación (Jong y Parry, 2003). Se utiliza también en la remoción de metales y arsénico de aguas residuales de los drenajes ácidos de minas y de efluentes industriales (Luptakova y Kusnierova, 2005). Pero sin lugar a dudas, es en la minería nacional del cobre en donde tiene importantes proyecciones, ya que es precursor del sulfuro ácido de sodio (NaHS), reactivo utilizado como depresor de flotación de molibdenita. Dada la gran importancia que tiene la minería en nuestro país, es de suma relevancia el desarrollo de tecnologías que produzcan el sulfuro de hidrógeno a nivel nacional, ya que significaría una importante reducción de emisiones de azufre y de costos en su importación. Este compuesto puede ser producido in situ por reducción catalítica de azufre elemental a elevadas condiciones de presión y temperatura (Drum et al, 1982). Una opción menos peligrosa y menos costosa que la reducción catalítica para producir sulfuro de hidrógeno es su producción in situ mediante la reducción biológica de sulfato presente en aguas residuales y efluentes mineros. Sin embargo, el consumo del donador de electrones constituye una limitante económica (Herrera et al, 1997). Una alternativa a la reducción biológica de sulfato es la bioreducción de azufre elemental. Mediante esta vía, se reduce en un 75% el consumo de electrones con respecto a la bioreducción de sulfato. Como se trataría de una producción in situ de H2S y posteriormente de NaSH, se reducirían los riesgos de transporte asociados a este tipo de sustancias.

1.1 Microorganismos reductores de azufre

Muchos microorganismos son capaces de utilizar una variedad de compuestos orgánicos e inorgánicos como aceptores terminales de electrones en el proceso de respiración anaeróbica. Dentro de estos aceptores de electrones, los compuestos de azufre (sulfato, sulfito, tiosulfato, sulfóxidos orgánicos y azufre elemental) juegan un importante rol en el ciclo biogeoquímico del azufre. La bioreducción de estos compuestos de azufre genera ácido sulfhídrico como producto metabólico (Cypionka y Pfenning, 1986), el que es excretado fuera de las células debido a la naturaleza no asimilatoria del proceso. La habilidad de reducir azufre elemental de manera no asimilatoria usando H2 o sustratos orgánicos (lactato, acetato, piruvato, etanol) como dadores de electrones es común entre bacterias y arqueas. La mayoría de estos microorganismos son hipertermofílicos y pertenecen al dominio de las arqueas. Las reductoras de azufre mesofílicas y termofílicas, sobre todo del dominio bacteriano, se han aislado de sedimentos marinas anóxicos, de sedimentos de agua dulce, del rumen de los bovinos, y de afloramientos de aguas termales.

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Dentro de las arqueas y las bacterias reductoras de azufre, los miembros de los géneros Acidianus, Stygiolobus, Thermoproteus, Pyrobaculum, Igneococcus, Pyrodictium, Wolinella, Desulfuromonas, Ammonifex, y Desulfurobacterium pueden generar ATP mediante respiración litotrófica de azufre. En cambio, miembros de los géneros de arqueas Desulfurococcus, Staphylothermus, Hyperthermus, Thermococcus, y Pyrococcus y de los géneros bacterianos Thermotoga, Thermosipho, y Fervidobacterium sólo desproporcionan azufre. También se ha encontrado que algunas arqueas metanogénicas son capaces de producir H2S a partir de azufre elemental, especialmente termofílicas e hipertermofílicas de los géneros Methanopyrus, Methanobacterium, Methanothermus, y Methanococcus. Dentro de las bacterias reductoras de sulfato (BRS), los géneros que se ha encontrado que son capaces de reducir azufre elemental son Desulfovibrio, Desulfuromonas y Desulfurobacterium (Hedderich et al, 1999). Starkey (1937), reportó por primera vez la reducción bacteriana de azufre elemental con generación de ácido sulfhídrico. En 1976, Pfennig y Biebl publicaron la primera descripción genérica de bacterias reductoras de azufre con metabolismo no asimilatorio. En 1977, los mismos autores encontraron que ciertas bacterias reductoras de sulfato crecían con azufre como aceptor de electrones. En el mismo año, Wolfe y Pfenning describieron que la bacteria Sulfospirillum podía crecer mediante la oxidación anaeróbica de hidrógeno y la reducción de azufre elemental. Desde entonces, la bioreducción de azufre elemental ha sido intensamente estudiada. La mayor parte de estas investigaciones se han abocado al estudio de bacterias termofílicas e hipertermofílicos, probablemente debido a que esta forma de azufre se encuentra naturalmente relacionada a ambientes de altas temperaturas (volcanes, aguas hidrotermales, etc). Sólo en el último tiempo, se ha puesto énfasis en los microorganismos mesofílicos.

1.1.1 Cinética de las bacterias reductoras de azufre

El crecimiento de las bacterias reductoras de azufre, clásicamente se ha modelado de acuerdo a una cinética tipo Monod de desarrollo celular. Utilizando microorganismos mesofílicos se han obtenido velocidades de reducción de azufre elemental más elevadas que aquellas obtenidas con microorganismos termófilos e hipertermofílicos. Por ejemplo, Segerer et al (1985), trabajando con Sulfolobus sp a 82ºC, reportaron una velocidad de formación de H2S de 4,5 mg H2S·(g S)

-1·d-1 y Takai et al (2003), trabajando con Balnearium lithotrophicum a 70ºC, obtuvieron una velocidad de formación de H2S de 1,08 mg H2S. Mientras que Azabou et al (2007), trabajando con Desulfomicrobium sp a 37ºC, reportaron una velocidad de formación de H2S de 42,5 mg H2S·(g S)

-1·d-1 y Böttcher et al (2001), trabajando con Desulfocapsa thiozymogenes a 28ºC, obtuvieron una velocidad de formación de H2S de 38,5 mg H2S·(g S)

-1·d-1. Estos auspiciosos resultados hacen muy atractivo el estudio cinético de bacterias mesofílicas reductoras de azufre como una alternativa para la producción de H2S. En la Tabla 1, se presentan velocidades de formación de H2S reportadas por distintos autores tanto para bacterias mesofílicas como termofílicas. Por tratarse de una reacción heterogénea en la que participa un sólido, la velocidad de formación de H2S(g) debería ser expresada también por área superficial. Sin embargo, los distintos autores han omitido el área superficial de las partículas de azufre.

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Tabla 1. Velocidades de formación de H2S(g) por gramo de azufre suspendido (VHG).

Autor VHG (mg H2S·(g S)-1·d-1) Temperatura (ºC) pH Fuente de

electrones Stetter & Gaag (1983) 32,5 65 6,5 H2 Belkin et al (1985) 23,8 77 7,5 acetato Takai et al (2005) 23,2 50 5,2 H2

Nakagawa et al (2005) 2,12 32 6,0 H2 Caccavo et al (1994) 29,1 35 N.I. acetato Takai et al (2003) 1,08 70 5,4 H2 Azabou et al (2007) 42,5 37 7,0 lactato

N.I.: no informado Los estudios cinéticos de bioreducción de azufre elemental reportados en la literatura, sólo informan velocidades instantáneas, y no expresiones cinéticas completas. Por otra parte hay insuficiente información acerca de las limitantes cinéticas y tampoco se ha abordado en profundidad el efecto de la superficie activa de las partículas de azufre sobre la cinética de la reacción. Las fuentes de energía más utilizadas por las bacterias reductoras de azufre incluyen hidrógeno, piruvato, lactato y acetato. Herrera et al (1997) encontraron que la utilización de hidrógeno como fuente de energía en el proceso de bioreducción de sulfato, era económicamente más conveniente que la utilización de lactato. Van Houten (1994 y 1997), logró reducir sulfato hasta ácido sulfhídrico empleando CO2 como fuente de carbono celular y H2 como fuente de energía. Estos antecedentes demuestran la factibilidad de utilizar bacterias reductoras autótrofas para la reducción de compuestos de azufre. Sáez (2001) obtuvo una velocidad de reducción de sulfato promedio de 3000 (ppm/d), utilizando Desulfovibrio desulfuricans (bacteria reportada como heterótrofa) en medio autotrófico enriquecido con extracto de levadura. Estos resultados demuestran que es factible utilizar esta bacteria en condiciones autotróficas. En el presente trabajo también se empleará esta bacteria, con hidrógeno como fuente de energía y bicarbonato como fuente de carbono celular (en equilibrio con el dióxido de carbono). Se utilizará azufre elemental como aceptor terminal de electrones. El hidrógeno puede producirse por diferentes vías: electrólisis, fotobioproducción, a partir de gas natural, por pirólisis de biomasa y por gasificación de carbón, entre otras. Díaz (2007) comparó diferentes alternativas y concluyó que la generación de hidrógeno mediante la gasificación de carbón es la opción más económica en la actualidad. Una planta modelo de reducción de azufre elemental debería contar con una unidad generadora de hidrógeno, de manera de contar con un suministro seguro de este gas. De esta manera se evita la construcción de grandes contenedores de H2. El hidrógeno se suministra en forma gaseosa al reactor. Debido a la baja solubilidad de este gas, la reacción podría estar limitada por transferencia de masa gas-líquido. Por otra parte, el producto de reacción, ácido sulfhídrico, es un inhibidor para las bacterias (Reis et al, 1992; Okabe et al, 1992 y 1995), de modo que la transferencia de este compuesto desde su forma acuosa a su forma

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gaseosa es un requisito de diseño del reactor. Por lo tanto se debe diseñar un reactor para obtener una tasa de transferencia de masa gas/líquido tan alta como para que la cinética no esté limitada por la disponibilidad del gas H2 disuelto en fase acuosa y que la remoción del ácido sulfhídrico sea tan eficaz como para mantenerlo bajo el umbral de inhibición. Dentro de este contexto, un reactor conocido de alta transferencia de masa es el reactor gaslift (Siegel y Merchuk, 1987; Bello et al, 1985a y 1985b). Por otra parte se ha encontrado que este reactor posee un buen grado de mezcla (Bello et al, 1984; Merchuk et al, 1998), bajos efectos de cizalle y un buen grado de contacto entre las fases. Estas características hacen muy atractivo el uso de este reactor para aplicaciones bioquímicas y biotecnológicas. Los reactores gas-líquido-sólido utilizados en la industria pueden ser divididos en dos grandes grupos: uno en donde los sólidos están fijos o empacados y otro en donde los sólidos están suspendidos. Generalmente, el primer tipo de reactores se utiliza para reacciones con catalizador o reacciones en las que una de las 3 fases es un inerte y el segundo tipo de reactores se utiliza para reacciones en las que las 3 fases reaccionan (Shah, 1979). Los reactores más comunes del segundo grupo son el reactor agitado gas-líquido- sólido suspendido, el reactor no agitado gas-líquido- sólido suspendido y el reactor no agitado de tres fases de lecho fluidizado con flujo ascendente en cocorriente. La cinética de reducción se estudiará en dos reactores de tres fases (gas, líquido y sólido suspendido): uno agitado mecánicamente y otro con agitación neumática y patrón hidrodinámico de tipo gaslift de tubos concéntricos. De aquí en adelante, al primer reactor se le denominará reactor agitado mecánicamente y al segundo se le denominará reactor gaslift. Ambos reactores operarán en modalidad batch para las fases líquida y sólida, y en continuo para la fase gas, salvo en una experiencia inicial en donde se operarán las tres fases en modalidad batch. La estequiometría de la reducción de azufre elemental para bacterias (X) que utilizan hidrógeno como fuente de energía, se expresa mediante la siguiente ecuación:

Ecuación 1: reacciónkJGacSHSacH X /2,46)()( 022 −=∆→+

Esta reacción es espontánea. La energía libre que se genera en condiciones fisiológicas (25 ppm de H2S y pH 7) y su evolución con la temperatura se muestra en Figura 1

5

-55.0

-50.0

-45.0

-40.0

-35.0

0 25 50 75 100 125 150 175 200

Temperatura (ºC)

∆∆ ∆∆G

(kJ

/rea

cció

n)

Figura 1. Variación de la energía libre de Gibbs con la temperatura para la reacción de reducción de azufre

elemental con hidrógeno en condiciones fisiológicas.

La energía libre requerida por bacterias anaeróbicas para sintetizar un mol de ATP a partir de ADP y fosfato en condiciones fisiológicas es 43,9 kJ/mol (Thauer et al, 1977). Estos requerimientos energéticos pueden ser satisfechos con la energía libre disponible a partir de la reacción de reducción de azufre elemental, tal como se aprecia en la Figura 1.

1.2 Mecanismo de reacción

En solución acuosa y en presencia de algún agente nucleófilo (CN-, SCN-, HS-, OH-, I-, C2H5S

-, entre otros), el azufre elemental experimenta ruptura del enlace S-S por ataque nucleofílico. Entre los nucléofilos, el ion HS- es uno de los que presenta mayor tiofilicidad, es decir mayor reactividad frente al enlace S-S (Pryor, 1962). La primera etapa del mecanismo de la reacción corresponde a la apertura del anillo S8 mediante un ataque nucleofilico del ion HS-. Esta etapa es la que demanda más energía ya que la estructura corona del anillo S8 está altamente estabilizada por resonancia. En esta reacción se forman un tipo de compuestos llamados polisulfuros (Bartlett et al, 1958; Hartler et al, 1967):

Ecuación 2: +−− +→+ HSSSnHS n2

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Los iones polisulfuros de largo n, (Sn

2-), pueden ser representados por la formula [Sn-1(0)S(2-)]2-, lo

que significa que de los n átomos, (n-1) son átomos de azufre-polisulfuros en estado de oxidación cero y un átomo es sulfuro-polisulfuro en estado de oxidación -II. El polisulfuro formado en el ataque nucleofílico da origen a polisulfuros más pequeños que a su vez atacan a anillos S8 que no han reaccionado (Hartler et al, 1967).

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Ecuación 3: −+

− →+ 288

2 SSSSS nn

La presencia de polisulfuros puede acelerar el rompimiento de las cadenas largas de azufre formadas inicialmente (Hartler et al, 1967):

Ecuación 4: −−−−+ +→+ 22228 SSSSSSSS pmqn

8++=+ qnpm Blumentals et al (1990), trabajando con Pyrococcus furiosus, encontraron que estos polisulfuros también se producen en la bioreducción de azufre elemental (no sólo en el proceso abiótico de reducción) y actúan como aceptores terminales de electrones en la cadena respiratoria de estos microorganismos. Dietrich y Klimmek (2002), trabajando con Wolinella succinogenes, también llegaron a la misma conclusión. Sin embargo, no se tiene información acerca de que polisulfuro en particular es utilizado como aceptor de electrones por las bacterias reductoras de azufre, ni de la distribución de estos compuestos en el medio de reacción. En su forma más general, los polisulfuros pueden ser representados por la fórmula X-Sn-X en donde n está entre 1 y 10 y X puede ser H, Cl, Br u otro grupo terminal orgánico o inorgánico. A este tipo de compuestos se les suele llamar también sulfanos cuando poseen hidrógeno como grupo terminal. A los polisulfuros con grupo terminal constituido por átomos de azufre y oxígeno se les denomina politionatos. Schippers et al (1996, 1999) detectaron diferentes politionatos (tetrationato, titrionato, entre otros) como intermediarios de la oxidación de sulfuro a azufre elemental, además de polisulfuros del tipo Sn

2-. Para la reacción de reducción de azufre elemental no se cuenta con información acerca de la existencia de politionatos como intermediarios. En ausencia de un dador de electrones, el azufre puede experimentar una reacción de desproporción que conduce a la formación de productos con estados de oxidación +VI y –II. La reacción es la siguiente:

Ecuación 5: )7(/2,105344 0'242

0 =+=∆++→+ +−− pHSmolkJGHHSSOOHS o

Esta reacción es espontánea cuando se remueve el HS-. Este puede ser oxidado por MnO2 o por FeOOH presentes en los sedimentos marinos, en donde se encuentran ciertas bacterias anaeróbicas capaces de desproporcionar azufre a temperatura ambiente (Böttcher et al, 2001 y 2005; Thamdrup et al, 1993; Frederiksen y Finster, 2003). Se ha encontrado que el sulfito es un intermediario esencial de la reacción de desproporción (Thamdrup et al, 1993; Frederiksen y Finster, 2003) y que la enzima sulfito reductasa jugaría un importante rol en este proceso (Frederiksen y Finster, 2003).

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1.3 Adherencia bacteriana en las partículas de azufre

Microorganismos de diversas especies son capaces de adherirse a superficies de distinta naturaleza, formando lo que se conoce como biofilm. La función y apariencia de biofilms en distintos ambientes puede ser diferente, sin embargo todos los biofilms se forman de acuerdo a una secuencia básica que incluye (i) la formación de un film acondicionador de compuestos macromoleculares adsorbidos; (ii) el transporte de microorganismos hacia la superficie; (iii) la atracción de los microorganismos hacia la superficie a través de fuerzas van der Waals generándose una adherencia reversible; (iv) la adherencia irreversible de los microorganismos a través de la producción de sustancias poliméricas extracelulares (extracellular polymeric substances, EPS); (v) desprendimiento de algunas células adheridas y acumulación de microorganismos en el biofilm. En la tercera etapa los microorganismos pueden ser removidos fácilmente de la superficie, mientras que en la cuarta etapa se genera un enlace permanente a la superficie. El empleo de soportes sólidos, en este caso el azufre, puede dar lugar a adherencia bacteriana. La posibilidad de que ocurra este fenómeno ofrece una excelente ventaja en reactores continuos (pues reduce la tasa de lavado de células). Para el diseño del reactor de este estudio puede tener dos efectos contrapuestos; es posible que crezca un gran número de bacterias asociadas directamente a las partículas de azufre, aumentando y facilitando su biodisponibilidad o, puede resultar que el biofilm termine por ocluir el azufre en sus sitios de reacción impidiendo la generación de azufre en fase acuosa, deteniendo así la reacción. La adherencia en partículas de azufre ha sido estudiaba con bacterias que utilizan el azufre elemental como fuente de electrones. Bryant et al (1984) demostraron que para diferentes especies de Thiobacillus, la adherencia en partículas de azufre elemental se generaba a través de la interacción entre glicocalix bacteriano y la superficie del azufre. Laishley et al (1986) demostraron que la tasa de oxidación de S0 por Thiobacillus albertis era función del área superficial y de la microestructura de los cristales de azufre. Shrihari et al (1993) demostraron que una vez que la bacteria Thiobacillus ferrooxidans se adhiere a las partículas de azufre, comienza a oxidarlo generando tiosulfato y sulfito, los que sirven como sustrato para las bacterias que permanecen suspendidas. Takakuwa et al. (Citado por Franz et al, 2007) encontraron que grupos tiol estaban probablemente involucrados en el proceso de adherencia de Acidithiobacillus thiooxidans en partículas de azufre elemental. En otros estudios, Ohmura et al (citado por Franz et al, 2007) y Ramírez et al (citado en Franz et al, 2007) encontraron evidencia de una proteína en la membrana externa de Acidithiobacillus ferrooxidans que está probablemente involucrada en la adherencia célula – azufre. Tal como puede apreciarse, se ha alcanzado un vasto conocimiento acerca de los mecanismos de adherencia en partículas de azufre elemental por parte de bacterias que oxidan azufre. Sin embargo, poco se sabe acerca de la adherencia de bacterias reductoras de azufre en partículas de este sustrato. En cuanto a las EPS, se puede mencionar que están involucradas en la adherencia de las células a superficies naturales o artificiales, en donde juegan un importante rol factores como fuerzas electrostáticas, cargas superficiales, hidrofobicidad de la superficie y disponibilidad de cationes.

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Las EPS están compuestas por polisacáridos, proteínas, lípidos, ácidos nucleicos, ácidos urónicos. Esta composición está influenciada por el sustrato a adherirse (Gehrke, 1998) y cada componente tiene propiedades adherentes diferentes. Por ejemplo, se ha reportado que los ácidos urónicos excretados por cepas de P. fuorescens tienen propiedades de activación de superficies, previniendo la adherencia de estas cepas en las superficies (Pringle et al, citado por Gómez-Suárez et al, 2002). Este efecto también fue reportado para ácidos urónicos excretados por P. aeruginosa (Gómez-Suárez et al, 2002). Por otra parte se ha reportado que los polisacáridos (Costerton et al; Azeredo et al.; Azeredo y Oliveira; citados por Gómez-Suárez et al, 2002) y las proteínas (Danielsson et al, citado por Gómez-Suárez et al, 2002; Dûfrene et al, 1996), favorecen la adherencia bacteriana. Hasta el momento, se han ignorado completamente los mecanismos y las propiedades de adherencia de bacterias reductoras de azufre en la literatura especializada. Es primordial contar con información precisa de este fenómeno para lograr su optimización, sea en términos de favorecerla o de impedirla según sea el caso.

1.4 Biodiversidad microbiana en bioreactores

Los bioreactores que procesan subproductos o desechos de otros procesos, no requieren trabajar en condiciones operacionales estériles. Bajo estas condiciones se favorece la formación de cultivos mixtos de bacterias, antes que cepas puras. En este contexto, es primordial indagar acerca de la existencia de especialización de algunas bacterias por adherirse a las partículas de azufre. También resulta de medular importancia saber si la biodiversidad bacteriana evoluciona frente a alguna variación del medio y si esta evolución toma un sentido tal que potencie o disminuya la reacción de bioreducción de azufre elemental, de tal manera que se asegure una operación acorde con los requisitos de diseño. Con el desarrollo de técnicas de biología molecular y análisis filogenéticos, se han desarrollado metodologías que dan la posibilidad de determinar la diversidad genética de microorganismos presentes en comunidades complejas. Dentro de estas metodologías destaca el procedimiento de T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Lenght Polymorphims).

1.5 HIPÓTESIS

En este trabajo de Tesis se pretende probar que es posible producir sulfuro de hidrógeno a partir de azufre elemental en bioreactores anaeróbicos autotróficas a 30ºC.

1.6 OBJETIVOS

Para probar la hipótesis se plantean los siguientes objetivos:

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1.6.1 Objetivo General

Estudiar la cinética de reducción de azufre elemental a 30ºC para producir sulfuro de hidrógeno en un bioreactor agitado mecánicamente y en un bioreactor gaslift, operados en condiciones anaeróbicas.

1.6.2 Objetivos Específicos

Establecer y cuantificar las variables operacionales críticas del sistema. Estudiar la adherencia bacteriana en las partículas de azufre y caracterizar estas partículas durante el transcurso de la reacción. Estudiar la biodiversidad bacteriana asociada al proceso de bioreducción de azufre elemental. Identificar posibles intermediarios de la reacción. Comparar los distintos tipos de bioreactores seleccionados. Determinar los parámetros cinéticos que describen la bioreducción de azufre elemental en el reactor agitado mecánicamente, mediante el desarrollo de un modelo dinámico fenomenológico.

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CAPÍTULO 2. ANTECEDENTES GENERALES

2.1 Detección de Microorganismos

Para detectar y monitorear microorganismos, se han desarrollado diversas técnicas basadas en la obtención del DNA. Dentro de éstas se encuentra el análisis de T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Lenght Polymorfism) en el cual el DNA es sometido a cortes con enzimas de restricción, generando patrones únicos dependiendo del organismo del cual proviene el DNA permitiendo de esta manera su identificación. La molécula 16S rDNA es parte estructural del ribosoma, está presente en todos los seres vivos y cumple un rol primordial en la formación de proteínas, específicamente sirve de lugar de unión del RNA mensajero. Las moléculas de rDNA bacteriano de gran tamaño (16S y 23S) contienen varias regiones que son secuencias muy bien conservadas, las que son útiles para determinar la cercanía genealógica entre dos organismos, pero al mismo tiempo presentan suficiente variabilidad como para ser excelentes cronómetros filogenéticos. Es por ello que las técnicas asociadas a las secuencias 16S rDNA, han sido ampliamente utilizadas en estudios de biodiversidad microbiana. Actualmente se ha logrado una alta caracterización de la secuencia 16S rDNA y se han establecido métodos estándar basados en dicha secuencia tanto para la identificación de filotipos (tipo bacteriano particular) como para análisis filogenéticos.

2.1.1 Análisis de resultados de T-RFLP

A partir de los perfiles de T-RFLP se puede analizar: i. La diversidad de filotipos en cada muestra, dado que cada una corresponde a una comunidad

biológica integrada por un determinado número de filotipos, y cada uno de estos filotipos tiene una cierta importancia.

ii. La dinámica de los filotipos durante la operación del sistema, mediante el análisis conjunto de todas las muestras y su respectiva diversidad de filotipos en función del tiempo.

2.1.1.1 Análisis de biodiversidad

El análisis de biodiversidad se puede realizar en tres niveles diferentes: dentro de comunidades (diversidad alfa), entre comunidades (diversidad beta), o para un conjunto de comunidades (diversidad gamma).

2.1.1.1.1 Diversidad alfa

La gran mayoría de los métodos propuestos para evaluar la diversidad de especies se refieren a la diversidad dentro de las comunidades. Para diferenciar los distintos métodos en función de las variables biológicas que miden, se dividen en dos grandes grupos (Moreno, 2001):

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i. Métodos basados en la cuantificación del número de especies presentes (riqueza específica) ii. Métodos basados en la estructura de la comunidad, es decir, la distribución proporcional del

valor de importancia de cada especie (abundancia relativa de los individuos, su biomasa, cobertura, productividad, etc)

La riqueza específica es la forma más sencilla de medir la biodiversidad, ya que se basa únicamente en el número de especies presentes, sin tomar en cuenta el valor de importancia de las mismas. Hay varios índices que miden la riqueza específica, siendo el más sencillo el índice de riqueza de especies (S). Este índice corresponde al número total de especies de la comunidad. Los métodos que describen la estructura pueden ser modelos paramétricos, modelos no paramétricos e índices de abundancia proporcional. Estos últimos pueden a su vez clasificarse según se basen en la dominancia o en la equidad de la comunidad. Los índices de dominancia toman en cuenta la representatividad de las especies con mayor valor de importancia sin evaluar la contribución del resto de las especies. Por el contrario, los índices de equidad toman en cuenta el valor de importancia de cada especie (Moreno, 2001). Los índices más reconocidos sobre diversidad se basan principalmente en el concepto de equidad. Uno de ellos es el índice de Shannon – Wiener (Ecuación 6), que expresa la uniformidad de los valores de importancia a través de todas las especies de la muestra. Adquiere valores entre cero, cuando hay una sola especie, y el logaritmo de S, cuando todas las especies están representadas por el mismo número de individuos

Ecuación 6: )ln( ii ppH ∑−=

Donde:

pi : abundancia relativa de la especie i Otro índice de equidad importante es el índice de Pielou (Ecuación 7). Mide la proporción de la diversidad observada con relación a la máxima diversidad esperada. Su valor va de 0 a 1, de forma que 1 corresponde a situaciones donde todas las especies son igualmente abundantes.

Ecuación 7: maxH

HJ =

Donde:

Hmax : ln(S)

2.1.1.1.2 Diversidad beta

La diversidad beta es el grado de reemplazo de especies o cambio biótico a través de gradientes ambientales. A diferencia de las diversidades alfa y gamma que pueden ser medidas fácilmente en función del número de especies, la medición de la diversidad beta es de una dimensión

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diferente porque está basada en proporciones o diferencias. Estas proporciones pueden evaluarse con base en índices o coeficientes de similitud, de disimilitud o de distancia entre las muestras a partir de datos cualitativos (presencia-ausencia de especies) o cuantitativos (abundancia proporcional de cada especie medida como número de individuos, biomasa, densidad, cobertura, etc.), o bien con índices de diversidad beta propiamente dichos. Los índices de similitud/disimilitud expresan el grado en el que dos muestras son semejantes por las especies presentes en ellas, por lo que son una medida inversa de la diversidad beta, que se refiere al cambio de especies entre dos muestras. Sin embargo, a partir de un valor de similitud (s) se puede calcular fácilmente la disimilitud (d) entre las muestras: d=1-s. Estos índices pueden obtenerse con base en datos cualitativos o cuantitativos directamente o a través de métodos de ordenación o clasificación de las comunidades. Dentro de los índices de similitud cualitativos destaca el coeficiente de similitud de Sørensen (Ecuación 8), que relaciona el número de especies en común con la media aritmética de las especies en ambas comunidades.

Ecuación 8: ba

cI S +

= ·2

Donde:

a : número de especies presentes en la muestra A b : número de especies presentes en la muestra B c : número de especies compartidas por ambas muestras

El intervalo de valores para este índice va de 0 cuando no hay especies compartidas entre ambos sitios, hasta 1 cuando los dos sitios tienen la misma composición de especies (Moreno, 2001). El análisis multivariado aprovecha las relaciones (proporciones o diferencias) entre las variables para buscar patrones o estructuras en los datos. Para realizarlo existen métodos como los de ordenamiento de objetos (donde se logra la reducción de dimensiones entre las variables o entre objetos a una o pocas dimensiones), y el análisis de agrupamiento donde los objetos se clasifican en categorías jerárquicas sobre la base de matrices de similitud de los mismos. El método de ordenamiento más frecuentemente utilizado para la medición de la diversidad beta es el análisis de componentes principales (PCA). Éste consiste en reducir las dimensiones de un conjunto numeroso de variables observadas sin perder información. Las nuevas variables obtenidas a partir de las variables originales reciben el nombre de factores o componentes. Éstos son una combinación lineal de variables y permiten identificar las dimensiones subyacentes a una matriz de correlaciones. Los objetos son representados en un espacio gráfico en el cual los ejes constituyen gradientes de combinaciones de variables. El PCA se efectúa para extraer la mayor varianza de las variables originales, considerando tanto lo que éstas comparten como lo específico en ellas, a fin de reproducir todos los aspectos observables en las variables. Se trata de reproducir con menos dimensiones la matriz de correlación entre variables (Vivanco, 1999).

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El análisis de agrupamiento (clusters) se utiliza para definir grupos homogéneos de objetos y estudiar la estructura natural de éstos. Tiene como objetivo formar grupos de muestras que sean similares entre sí y diferentes a los elementos de otros grupos. Para formar los grupos uno de los métodos más usados es el de agrupamiento jerárquico divisivo. Éste comienza con todos los elementos en un solo grupo y en sucesivas divisiones se van formando grupos cada vez más pequeños; estos pasos sucesivos se representan en un gráfico denominado dendrograma. Para realizarlo es necesario medir el grado de similitud entre las muestras, ya sea mediante los índices de asociación o las distancias. Los primeros se utilizan en general para datos cualitativos de ausencia-presencia, codificados con los estados 0 y 1, respectivamente. Las medidas de distancia miden el grado de disimilitud: cuanto más parecidas son dos muestras menor será su distancia. La medida más común es la distancia euclidiana (Moreno, 2001):

Ecuación 9: ( )∑ −= ikij XXED ..

Donde:

Xij : valor de la especie i para la muestra j Xik : valor de la especie i para la muestra k

2.2 CRECIMIENTO BACTERIANO

La base conceptual de la modelación del crecimiento bacteriano en sistemas biológicos fue propuesta por Jacques Monod (1942). Su modelo caracteriza a la cinética de un cultivo batch considerando que las funciones celulares son realizadas por unidades fisiológicamente estructuradas. Su postulado experimental considera que µ es una función hiperbólica de la concentración del sustrato limitante. Esta función llamada ecuación de Monod, es homóloga a la de Michaelis-Menten:

Ecuación 10: [ ]

[ ]SK

S

S +⋅= maxµµ

Donde:

µmax : velocidad de crecimiento específico celular máxima KS : constante de afinidad respecto al sustrato o constante de saturación [S] : concentración sustrato limitante

A concentraciones elevadas de sustrato, la velocidad de reacción se aproxima a un valor constante independiente de la concentración de sustrato, µmax. En este intervalo de concentración, la reacción es de orden cero con respecto al sustrato. Por otra parte, a concentraciones bajas de sustrato existe una dependencia aproximadamente lineal de la velocidad de reacción respecto del

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sustrato. En este intervalo de concentración, la reacción es esencialmente de primer orden con respecto al sustrato (Doran, 1998). En algunas ocasiones puede ocurrir que diferentes nutrientes pueden limitar el crecimiento. En este caso la expresión matemática es el producto de varias expresiones de tipo Monod:

Ecuación 11: [ ]

[ ]∏=

+=

n

i ii

i

SK

S

1maxµµ

Donde:

Ki : constantes de afinidad respecto a diferentes sustratos Si En un cultivo discontinuo se presentan varias fases de crecimiento celular. En la Figura 2 se muestra una curva típica de crecimiento.

Figura 2. Curva típica de crecimiento celular (Fuente: Doran, 1998)

Durante la fase de adaptación o latencia, la velocidad específica de crecimiento, µ, es cero o muy cercana a cero, ya que las células se están adaptando al nuevo ambiente. En la fase de aceleración comienza el crecimiento, alcanzando su máxima velocidad en la fase de crecimiento. Cuando los nutrientes en el medio de cultivo se han consumido o se acumulan los productos inhibidores, el crecimiento disminuye y las células comienzan la fase de desaceleración o deceleración. Después se alcanza la fase estacionaria, en la que no se produce crecimiento. Finalmente algunos cultivos presentan una fase de muerte cuando las células pierden viabilidad o son destruidas por rotura (Doran, 1998). La velocidad específica de crecimiento de las células durante las fases de crecimiento y desaceleración de un cultivo discontinuo, a menudo se ve primordialmente afectada por un único sustrato.

15

Otro parámetro cinético importante es el coeficiente de rendimiento celular respecto del sustrato (también conocido como yield). Este parámetro expresa la razón entre el crecimiento bacteriano y la disminución del sustrato consumido.

2.3 AZUFRE ELEMENTAL

El azufre en su estado de oxidación elemental tiene una configuración electrónica [Ne] 3s23p4. Es soluble en CS2 (35,5g / 100g a 25 ºC) y prácticamente insoluble en agua (5 µg/L a 25 ºC). Su primera energía de ionización es 999,6 kJ·mol-1, su afinidad electrónica es -200 kJ/mol y su electronegatividad (escala de Pauling) es 2,58. Tiene los mismos electrones de valencia que el oxígeno, por lo tanto las moléculas S2 y S3 tienen propiedades químicas y físicas análogas a las del oxígeno molecular y el ozono, respectivamente. Sin embargo, la forma más estable de azufre es S8 y no S2. Por ende, la química de ambos átomos (S y O) difiere en que el azufre tiene una pronunciada tendencia a concatenarse. Existen muchos alótropos del azufre presentes en las distintas fases. Estos pueden presentarse como anillos, cadenas o ambos (Meyer, 1976). Se ha demostrado mediante cálculos teóricos y consideraciones termodinámicas, que todas las moléculas Sn con 6 < n < 12 existen como anillos en todas las fases. Todos los anillos conocidos son de color amarillo y poseen un espectro de absorción comprendido entre 250 y 300 nm. Exceptuando al S3, los anillos son más estables que las cadenas, debido probablemente a los efectos de la resonancia. En la Figura 3 se muestran las estructuras resonantes del anillo S8. El azufre puede expandir su octeto, debido a su habilidad de utilizar orbitales d (Cilento, 1960).

Figura 3. Estructuras resonantes del anillo S8

En el estado sólido, existen los siguientes alótropos de azufre: S5, S6, S7, S8, S9, S10, S11, S12, S18 y S20. En condiciones estándar de temperatura y presión, la forma más estable de azufre es el α-azufre ortorrómbico, que consta de moléculas ciclooocta- S (S8). A 93,5 ºC este alótropo de azufre se convierte en β-azufre monoclínico (S8). Otro alótropo cicloocta- S importante es el γ-azufre triclínico. Tanto el β-azufre como el γ-azufre se revierten a la forma α-azufre a temperatura ambiente (Meyer, 1976). Los alótropos ciclooocta- S poseen una estructura corona. En la Tabla 2 se resumen las propiedades más relevantes de estos 3 alótropos.

16

Tabla 2. Características principales de los alótropos cicloocta-S

Molécula Nº moléculas en celda unitaria

a (ÅÅÅÅ) b (ÅÅÅÅ) c (ÅÅÅÅ) Densidad (g/mL)

Punto Fusión (ºC)

α-S8 16 10,4646 12,8660 24,4860 2,069 112,8 β-S8 6 10,778 10,844 10,924 1,94 133 γ-S8 4 8,442 13,025 9,356 2,19 20

Nota: a, b y c se refieren a las constantes de la celda unitaria También existen alótropos poliméricos de azufre, dentro de los que destacan el azufre plástico, azufre laminar, azufre fibroso y supersublimado. Estos alótropos están formados por largas hélices de azufre y son mezclas metaestables de alótropos cicloocta-S y otras formas. A temperatura ambiente este tipo de compuestos alotrópicos de azufre tienden a transformarse en la forma estable α-S8.

2.4 EQUILIBRIOS QUÍMICOS

En la presente sección se presentan los distintos equilibrios químicos en solución acuosa de las especies más relevantes involucradas en el sistema experimental. Si no se indica otra cosa, las constantes de equilibrio están referidas a 25ºC de temperatura, 1 atm de presión y a fuerza iónica nula.

2.4.1 Equilibrios de ionización del Ácido sulfhídrico

El H2S(ac) (producto metabólico) está en equilibrio con el ión HS-. A continuación se presentan los equilibrios de ionización del H2S(ac) y sus especies disueltas:

Ecuación 12: +− +→← HHSSH aK 12

[ ][ ][ ]

7

212

111 100,1 −

−+

⋅===SH

HSH

k

kK a

Ecuación 13: +−− + →← HSHS aK 22 [ ][ ]

[ ]13

2

2 10·2,1 −−

−+

==HS

SHK a

El pKa de la segunda disociación del ácido sulfhídrico es muy grande, por lo tanto a pH neutro existirán las especies H2S(ac) y HS

-.

17

2.4.2 Equilibrio líquido-gas del Ácido sulfhídrico

El H2S(ac) también está en equilibrio con su fase gaseosa. La constante de reparto entre ambas fases es la constante de Henry (HH2S).

Ecuación 14: )(2)(22

g

H

ac SHSH SH →← [ ][ ] )º30(/4404,0

)(2

)(2

2Cmolmol

SH

SHH acgas

ac

gSH ==

2.4.3 Equilibrios de ionización del dióxido de carbono y bicarbonato

El CO2(ac) proviene tanto de CO2(g) que se alimenta al reactor para control de pH, como del equilibrio de ionización del ión HCO3

- presente en el medio de cultivo como fuente de carbono. En ausencia del CO2(ac) proveniente del control de pH, el ión bicarbonato se comporta como un anfolito:

Ecuación 15: +−− + →← HCOHCO aK 233

2 [ ][ ]

[ ]11

3

23

2 10·6,5 −−

−+

==HCO

COHK a

Ecuación 16: −− + →←+ OHCOHOHHCO bK3223

2 [ ][ ]

[ ]11

3

322 1088,5 −

−

−

⋅==HCO

OHCOHK b

El ácido carbónico formado sufre la siguiente transformación:

Ecuación 17: OHCOCOH acK

2)(232 +→← [ ][ ] 385

32

)(2 ==COH

COK ac

El CO2(ac) proveniente del CO2(g) ingresado al reactor, se hidrata para generar ácido carbónico de acuerdo a la reacción inversa de la Ecuación 17, por lo tanto altera el equilibrio del bicarbonato existente en el reactor. El ácido carbónico se disocia de acuerdo a la siguiente ecuación:

Ecuación 18: +− +→← HHCOCOH aK332

1 [ ][ ]

[ ]4

32

31 107,1 −

+−

⋅==COH

HHCOK a

A su vez el bicarbonato se disocia de acuerdo a la Ecuación 15. Sin embargo, la constante de equilibrio es muy pequeña, por lo tanto en condiciones de neutralidad puede despreciarse la concentración del ión carbonato.

18

De acuerdo a la constante de equilibrio de la Ecuación 17, la concentración de ácido carbónico es muy pequeña comparada con la de anhídrido carbónico. Por esta razón suele escribirse la hidratación del CO2(ac) conjuntamente con la primera disociación del ácido carbónico:

Ecuación 19: +− +→←+ HHCOOHCO Kac 32)(2

[ ][ ][ ]

7

)(2

3

32

311 1044,4' −

−+

⋅===ac

a CO

HCOH

k

kK

En síntesis, la incorporación de CO2(ac) por una fuente externa al reactor provoca una alteración del equilibrio del bicarbonato.

2.4.4 Equilibrio gas-líquido del dióxido de carbono


ac

H

g COCO co →← [ ][ ] )º30(/7435,0

2

2

2Cmolmol

CO

COH gac

g

acCO ==

2.4.5 Equilibrio gas-líquido del Hidrógeno

El H2(ac) proviene del H2(g) que se alimenta al reactor como fuente de energía. El equilibrio entre ambas fases se presenta a continuación:


ac

H

g HH H →← [ ][ ] )º30(/0190,0

2

2

2Cmolmol

H

HH gac

g

acH ==

2.5 TRANSFERENCIA DE MASA GAS-LÍQUIDO

La transferencia de masa del dador de electrones (H2) desde la fase gaseosa hasta los sitios de reacción celular ocurre en varias etapas con diversas resistencias al transporte. Lo mismo ocurre con la transferencia del producto del metabolismo celular (H2S(ac)) desde los sitios de reacción celular hasta la fase gaseosa. Las distintas resistencias al transporte dependen de las propiedades reológicas del medio de cultivo, el tamaño de las burbujas de gas, coalescencia, dispersión, potencia de mezclado, tamaño celular, entre otros. Tal como se mencionó existen varias resistencias para la transferencia de masa. Sin embargo, en las condiciones de operación típica de los bioreactores, la resistencia al transporte está dada por la película de líquido que rodea a las burbujas.

19

La velocidad de transferencia de masa se expresa de la siguiente forma:

Ecuación 22: ( )LLLLL CCak

dt

dC−⋅⋅= ∗

Donde:

CL* : concentración de equilibrio en el líquido para un gas poco soluble

kL : coeficiente de transferencia de masa local de la fase líquida aL : área interfacial por unidad de volumen de líquido.

Parte fundamental del diseño de bioreactores es conocer adecuadamente el producto kL·aL o kLa (coeficiente combinado de transferencia de masa gas líquido). Este coeficiente es influenciado por la geometría y tipo de bioreactor, las propiedades de los fluidos y las condiciones de operación (temperatura, presión). La fuerza motriz (CL

* - CL) puede incrementarse aumentando la concentración de saturación de la fase gas en el líquido (CL

*). La determinación experimental clásica del coeficiente kLa se basa en la integración de la Ecuación 22 y se determina para el oxígeno empleando electrodos específicos. Para otros gases se relacionan los coeficientes combinados con las difusividades de los gases, tal como se verá más adelante (Sección 3.3). En forma teórica se deben estimar por separado kL y aL. El coeficiente de transferencia de masa local puede estimarse mediante la siguiente relación (Bailley, 1986):

Ecuación 23: L

bL

D

dkSh

⋅=

Donde:

Sh : número de Sherwood db : diámetro de burbuja DL : coeficiente de difusión

El área interfacial por unidad de volumen puede estimarse para el caso de burbujas de volumen constante mediante la siguiente relación (Treybal, 1980):

Ecuación 24:

⋅⋅⋅⋅

=bL

bGOL dV

tQna

6

Donde:

VL : volumen de la fase líquida n : número de orificios del distribuidor

20

QG0 : caudal de gas por orificio del distribuidor tb : tiempo promedio de residencia de una burbuja dentro del bioreactor (tb= hbr/vt) hbr : altura del nivel de líquido del bioreactor vt : velocidad terminal de las burbujas de gas en la fase líquida

2.6 REACTOR GASLIFT

El gaslift es un reactor de al menos dos fases, con una gran diferencia de densidad entre ellas como gas-líquido o gas-suspensión, donde la potencia de agitación proviene del mismo gas (agitación neumática). Este tipo de reactor posee un deflector que lo divide en dos zonas conectadas hidráulicamente en el fondo y en la parte superior. Sólo en una de estas zonas se suministra gas, denominándose a ésta zona de ascenso. Al volumen de gas capturado en un volumen particular dentro del reactor se le denomina Hold-up gaseoso, expresado como porcentaje (o fracción) del volumen total. El mayor Hold-up gaseoso de la zona con suministro de gas (ascendente) respecto de aquella sin suministro (descendente) provoca una diferencia de la densidad media del fluido entre ambas zonas, induciéndose de esta manera una circulación del líquido con un patrón cíclico definido, con dirección hacia arriba en la zona de ascenso (menor densidad media: mayor Hold-up) y hacia abajo en la zona de descenso (Chisti et al, 1988). El rector gaslift puede contar con dos cilindros concéntricos, que permiten dos posibles arreglos para el flujo, según sea la forma de suministro de gas (Figura 4). En uno el gas suministrado ingresa por la región cilíndrica interior. En el otro, el gas suministrado ingresa por la región anular, produciéndose un flujo inverso al anterior. El primero de estos arreglos se conoce como gaslift de flujo normal y el segundo como gaslift de flujo inverso.

GAS

hS

hB

GASGAS

hShS

hBhB

Figura 4. Descripción reactor gaslift de flujo inverso y sus dimensiones.

21

La separación desde la base del reactor hasta la base del tubo deflector (hB), la separación de la altura del líquido en el reactor hasta el tope del tubo deflector (hS), la relación de áreas de ascenso (AR) y descenso (AD) y la relación altura diámetro, constituyen los parámetros geométricos más importantes para el diseño del reactor gaslift. Estos parámetros afectan notablemente las propiedades hidrodinámicas y de transferencia de los reactores gaslift (Bello et al, 1984; Bello et al, 1985a; Bello et al, 1985b; Chisti et al, 1988; Merchuk et al, 1994; Gavrilescu y Tudose, 1996 y 1998; Gouveia et al, 2003). Mediante un balance de energía y asumiendo continuidad del flujo del líquido entre la zona descendente y ascendente, Chisti et al (1988) obtuvieron la siguiente expresión para la velocidad superficial del líquido ascendente (ULR) en el reactor gaslift:

Ecuación 25: ( )

( ) ( )

5.0

2

2

2 1

1··

1

···2

−

+

−

−=

GDD

RB

GR

T

GDGRLR

A

AK

K

hgU

εε

εε

Donde:

h : altura dispersión gas-líquido εGR : Hold-up gaseoso zona ascendente εGD : Hold-up gaseoso zona descendente KT : coeficiente de pérdida friccional superior del reactor gaslift KB : coeficiente de pérdida friccional en el fondo del reactor gaslift

Gavrilescu y Tudose (1998) determinaron las siguientes correlaciones entre los parámetros geométricos y las propiedades de transferencia de masa e hidrodinámicas de un reactor gaslift de tubos concéntricos:

Ecuación 26: Sh = 1,204·106 Ga0,01 Fr0,90 B-0,1 T-0,18 Y-1,70 R-0,18

Ecuación 27: ULR = 1,57 Fr0,42 B0,84 Y0,33 R0,63 (νL / DR)

0,01

Ecuación 28: εGR = 8·10-3 Ga0,21 Fr0,82 B-0,19 Y-0,43 T-0,10 R-0,17

Ecuación 29: εGD = 2,35·10-3 Ga0,20 Fr0,74 B0,41 Y-1,14 T-0,54 R-0,24

Donde:

Ad : área de libre flujo de la zona ascendente B : razón hB diámetro zona ascendente (B = hB/ DR) Di : diámetro interno del reactor

22

DR : diámetro zona ascendente Fr : número de Froude (Fr = UGR/(g·DR)

0.5) Ga : número de Galileo (Ga = g·ρL

2·DR3/µL

2) R : resistencia al flujo en la zona descendente (R = Ad/ AR) Sh : número de Sherwood (Sh = kLa·DR

2/DL) T : razón hS diámetro zona ascendente (T=(hS/DR)+1) νL : viscosidad cinemática del líquido Y : razón separador de gas (hS + DR)/Di

El rango donde se obtuvieron estas correlaciones fue 0,5 < B < 3,8; 1 < T < 3,8; 9·106 < Ga < 3·109; 5·10-3 < Fr < 110·10-3; AD/AR ≥ 1; 0,333 < Y < 1,267; 0,1< R < 0,9; UGR ≤ 1,1·10-1 m/s. Gouveia et al (2003), a su vez determinaron las siguientes correlaciones:

Ecuación 30: Sh = 7,16·106 Fr1,121 B0,201 T0,410

Ecuación 31: ULR = 0,178 Fr0,297 B-0,004 T0,095

El rango de estas correlaciones es 0,25 < B < 0,45; 1 < T < 1,4; AD/AR = 0,63; 1,6·10

-2 < UGR < 4,0·10-2 m/s. Cabe señalar que Merchuk et al (1994), encontraron correlaciones del mismo tipo para el número de Sherwood y para el hold up en la zona ascendente y descendente. Un aspecto importante que se debe considerar para el diseño de un reactor gaslift, es el difusor de gases. Para una amplia variedad de gases y líquidos el diámetro de burbuja (dB) se puede determinar según la siguiente expresión (Treybal, 1980):

Ecuación 32: 4,0

0

5/1

2 )(

72G

GL

LB Q

gd ⋅

−⋅⋅⋅

=ρρπ

ρ

Donde:

ρG : densidad del gas ρL : densidad del líquido

En donde tiene que cumplirse lo siguiente:

Ecuación 33: ( )

( )

6/1

32

50

0

20

⋅∆⋅⋅⋅

>L

Gg

dQ

ρρσ

23

Ecuación 34: Re0 < 2100

Donde:

d0 : diámetro orificio difusor de gases σ : tensión superficial del líquido Re0 : número de Reynolds en el orificio difusor de gases

El número de orificios del difusor de gases se determina utilizando la Ecuación 32 y sabiendo que los orificios deben estar separadas al menos 3·dB (Treybal, 1980). Esto último se recomienda para que las burbujas de orificios adyacentes no interfieran entre sí.

24

CAPÍTULO 3. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1 SISTEMAS EXPERIMENTALES

Inicialmente se trabajó en un reactor agitado mecánicamente. El primer experimento se llevó a cabo operando el reactor en modalidad batch para las tres fases del sistema. Los restantes experimentos del reactor agitado mecánicamente se llevaron a cabo operándolo en forma continua para la fase gas y en modalidad batch para las fases líquida y sólida. Posteriormente se estudió la cinética de reducción en un reactor gaslift. Este reactor fue operado en forma continua para la fase gas y en modalidad batch para las fases líquida y sólida.

3.1.1 Sistema experimental reactor agitado mecánicamente

La distribución detallada de los componentes del sistema experimental, conexiones, instrumentación y control, se muestra en la Figura 5.

Figura 5. Distribución detallada de equipos, conexiones y sistemas de control y adquisición de datos del sistema experimental del reactor agitado mecánicamente. CV controlador de válvula solenoide; CT

controlador de temperatura; TT transmisor de temperatura; TpH transmisor de pH; TEh transmisor de Eh; A/D convertidor análogo/digital de señales.

El sistema estaba compuesto por un bioreactor no estéril, con difusor de gases, agitado mecánicamente. El volumen de la fase líquida estuvo comprendido en un rango entre 1 y 1,15

25

litros. La temperatura del reactor se controló automáticamente en 30ºC, temperatura que Okabe y Characklis (1992) recomiendan para un cultivo de Desulfovibrio desulfuricans. El reactor fue operado en modalidad batch para las fases líquida y sólida, y en forma continua para la fase gas (H2, H2S(g), H2O(vap)). El potencial de óxido-reducción (Eh) fue registrado con un electrodo de Eh conectado a un medidor de voltaje. El pH óptimo para el crecimiento de Desulfovibrio desulfuricans es 7,0 (Reis et al, 1992), pero el pH del reactor aumenta a medida que se reduce azufre elemental. Por lo tanto el pH se mantuvo constante automáticamente a 7,0 ± 0,2, mediante inyección de CO2. Para inocular el reactor, previamente se incubó un cultivo bacteriano resuspendido a partir de pellets de bacterias mantenidos en frío. Esta incubación se llevó a cabo a 30ºC durante 15 días. El reactor, con 1 litro de medio, fue inoculado con 100 mL de cultivo bacteriano. Luego se le agregó al reactor azufre elemental en la forma de azufre flor cristalino (diámetro promedio de partículas de 30,7 µm, determinado experimentalmente de acuerdo a sección 3.4.6) y fue cerrado a una presión de 2 psig de hidrógeno. Después de 2 días, el reactor fue operado con flujo continuo de hidrógeno, manteniéndose a una presión igual a 1,5 psig. Este procedimiento se realizó tanto para la experiencia con concentración inicial de azufre de 5% (p/v) como para la experiencia con 4% (p/v). El dador de electrones se suministró en fase gaseosa como H2. Tanto el flujo de este gas como el de CO2 se monitorearon con rotámetros, previamente calibrados con un flujómetro de película ascendente. Estos gases fueron burbujeados al reactor a través del difusor de gases, transfiriéndose al seno del líquido según las propiedades de transferencia del reactor y de las solubilidades de los gases. La cinética de reducción de azufre elemental se estudió en condiciones de flujo continuo de H2. Para ver el transcurso de la reacción se determinó la velocidad de formación de sulfuro de hidrógeno, capturando el H2S generado en el reactor, durante 15 minutos, en trampas de 1 litro de solución de NaOH 0,1 N. En cada determinación de velocidad de formación de sulfuro de hidrógeno se emplearon soluciones frescas de NaOH 0,1. En los períodos de tiempo en que no se realizó esta determinación, el H2S se atrapó en trampas de 1 litro de solución de NaOH 0,5 N. Una trampa de CuSO4 fue usada como indicador de la saturación de estas últimas trampas. Considerando el H2S atrapado en los dos tipos de trampas de NaOH y el sulfuro total presente en el reactor, se calculó el consumo de azufre elemental. Se empleó una agitación de 250 RPM, suficiente para lograr la suspensión completa de las partículas de azufre. El procedimiento para determinar este valor se detalla en el APÉNDICE A.

3.1.1.1 Análisis de muestras

Se tomaron muestras del reactor periódicamente para la determinación de la concentración de sulfuro y recuento directo de bacterias. También se tomaron muestras del reactor para realizar los siguientes análisis a las partículas de azufre: determinación del potencial zeta, determinación del patrón de difracción de rayos X y estudio de adherencia bacteriana.

26

De cada trampa de NaOH 0,1 N empleada en la determinación cinética, se tomó una muestra para la determinación de la concentración de sulfuro.

3.1.2 Sistema experimental reactor gaslift

La distribución detallada de los componentes del sistema experimental, conexiones, instrumentación y control, se muestra en la Figura 6.

Figura 6. Distribución detallada de equipos, conexiones y sistemas de control y adquisición de datos del sistema experimental del reactor gaslift. La nomenclatura es la misma empleada en la Figura anterior.

Este sistema experimental es similar al del reactor agitado mecánicamente, sólo que en este caso se utilizó un reactor gaslift y la agitación fue de tipo neumática. El pH se registró en la zona comprendida entre el tubo deflector y el nivel del líquido. El volumen de la fase líquida fue de 5,7 litros. El cultivo bacteriano utilizado en este reactor provino del reactor agitado utilizado anteriormente. Una vez que se concluyeron los experimentos con ese reactor, se centrifugó su contenido a 300 RPM durante 5 minutos para separar las partículas de azufre. El sobrenadante fue sometido a

27

centrifugación a 8000 RPM durante 15 minutos, obteniéndose de esta manera un pellet de bacterias. Para inocular el reactor gaslift se resuspendió el pellet con medio de cultivo fresco. Al reactor gaslift, con 5,55 litros de medio de cultivo, se le agregó azufre elemental en la forma de azufre flor cristalino (diámetro promedio de partículas de 30,7 µm). Después de 1 día, se inoculó el reactor con 150 mL de cultivo bacteriano y fue cerrado a una presión de 2 psig de hidrógeno. Después de 10 días, fue operado con flujo continuo de hidrógeno para distintas UGR, manteniéndose la presión en aproximadamente 1 psig. Se agregaron 228 gramos al reactor, pero la cantidad de azufre suspendido dependió de cada UGR empleada. De esta manera, aumentó la concentración de azufre suspendido cada vez que se aumentó la UGR. Las partículas de azufre que no lograban ser suspendidas, permanecían en el fondo del reactor. La fuente de electrones se suministró en fase gas como H2. Tanto el flujo de este gas como el de CO2 se monitorearon con rotámetros, previamente calibrados con un flujómetro de película ascendente. Estos gases fueron burbujeados al reactor a través del difusor de gases, transfiriéndose al seno del líquido según las propiedades de transferencia del reactor y de las solubilidades de los gases Las determinaciones cinéticas se realizaron de modo similar a como se realizaron en el reactor agitado mecánicamente. Las trampas fueron de las mismas concentraciones, pero con volúmenes de 850 mL.

3.1.2.1 Análisis de muestras

Se tomaron muestras del reactor periódicamente para la determinación de la concentración de sulfuro, azufre suspendido y recuento directo de bacterias. Con la finalidad de determinar intermediarios de la reacción se tomaron muestras puntuales para análisis de sulfato (SO4

2-), tetrationato (S4O6

2-), sulfito (SO32-), metabisulfito (S2O5

2-) y tiosulfato (S2O32-).

También se tomaron muestras del reactor para realizar los siguientes análisis a las partículas de azufre: determinación del potencial zeta, determinación de la distribución de tamaños, análisis de adherencia bacteriana y análisis superficial de las partículas de azufre. De cada trampa de NaOH 0,1 N empleada en la determinación cinética, se tomó una muestra para la determinación de la concentración de sulfuro. Por último, se tomaron muestras del reactor para estudiar la diversidad bacteriana presente en el sistema.

3.2 BACTERIAS Y MEDIO DE CULTIVO

Para el desarrollo de los experimentos se usó un cultivo autóctono formado a partir de una cepa original de Desulfovibrio desulfuricans en medio autotrófico enriquecido con extracto de levadura. Se usó hidrógeno y azufre elemental como fuente de energía y aceptor de electrones, respectivamente.

28

Se utilizó un medio de cultivo constituido por (por litro de agua destilada): 0,2 g KH2PO4; 0,3 g NH4Cl; 3,0 g MgCl2·6H2O; 0,5 g KCl; 0,15 g CaCl2·2H2O; 1·10

-3 g Resazurina; 1,0 g extracto de levadura; 2,5 g NaHCO3 (fuente de carbono en equilibrio con CO2); 1 mL de solución de oligoelementos (Widdel et al, 1983); 10 mL de solución de vitamina de Wolfe (Atlas, 1997) y 1mL de una solución que contiene 3 mg de Na2SeO3·5H2O en un litro de NaOH 0,01M. La anaerobiosis en ambos reactores fue alcanzada mediante la desgasificación del oxígeno presente en el medio de cultivo, empleando hidrógeno gaseoso. Como indicador de anaerobiosis se utilizó el reactivo Resazurina (7-hidroxi-3H-fenoxazina-3-ona-10-óxido) además del electrodo de Eh. En el APÉNDICE B se detalla el papel de la resazurina como indicador de anaerobiosis.

3.3 DETERMINACIÓN DE PROPIEDADES DE TRANSFERENCIA E HIDRODINÁMICAS DE LOS REACTORES

La determinación del coeficiente combinado de transferencia de masa gas-líquido (kLa) para ambos tipos de reactores, se realizó empleando el método dinámico (Dunn y Einsele, 1975). Se midió la concentración del oxígeno disuelto en experiencias de absorción y desorción en fase acuosa, mediante el empleo de un electrodo polarográfico y un sistema de adquisición de datos. Se utilizó aire como fuente de oxígeno y nitrógeno gaseoso como desorbedor de aquel. Un balance de masa de O2 disuelto en el sistema conduce a la siguiente relación:

Ecuación 35: ( ) ( )222

2 ·OO

O

LLOL

LCCak

dt

dC−= ∗

Donde:

CLO2 : concentración de oxígeno en la fase líquida CLO2

* : concentración de saturación de oxígeno en la fase líquida (kLa)O2 : coeficiente combinado de transferencia de masa gas-líquido para oxígeno

De la respuesta transiente de absorción y de la integración de la Ecuación 35, es posible determinar kLa a partir de la siguiente expresión:

Ecuación 36: ( )takLLLL

L

OOOOeCCCC ·

0 )(2222

−∗∗ −+=

Donde:

20OLC : concentración inicial de oxígeno en fase líquida

Los valores de kLa para hidrógeno y sulfuro de hidrógeno se calcularon usando los coeficientes de difusión y el valor de (kLa)O2 determinado experimentalmente. De acuerdo a la teoría de renovación y a la teoría de penetración (Miller, 1983; Moo-Young y Blanch, 1981), existe una relación entre kLa para dos gases a las mismas condiciones del reactor. Esta relación está dada por la siguiente expresión:

29

Ecuación 37: ( ) ( )2

2

22

O

H

OLHL D

Dakak =

Esta determinación se llevó a cabo en un sistema de dos fases (medio y aire) y tres fases (medio, aire y azufre flor). No hubo bacterias presentes en el reactor. El Hold-up gaseoso global, ascendente (εGR) y descendente (εGD) en el reactor gaslift, fueron determinados utilizando el método de expansión de volumen, sin bacterias ni partículas de azufre. Se midió el Hold-up local descendente (εGLD) a diferentes profundidades del reactor, para obtener una relación entre ambas variables para cada valor de UGR. Una vez conocida esta función, se calculó el Hold-up total descendente (εGTD) mediante la siguiente expresión:

Ecuación 38: ∫−=

2

112

)(1 h

h

GLDGTD dhhhh

εε

El tiempo de circulación (tC) fue medido utilizando una esfera de polietileno de alta densidad (densidad = 1 g·mL-1) inmersa en el líquido, sin bacterias ni partículas de azufre. Similarmente, el tiempo que la esfera demora en la zona de ascenso (tR) y el tiempo que tarda en la zona descendente (tD), fueron determinados mediante este método.

La velocidad de circulación del líquido (−

LV ) fue calculada de acuerdo a la Ecuación 39 (Gouveia et al, 2003):

Ecuación 39: C

SBdL t

hhhV

++=

− 2

Donde:

hd : altura del tubo deflector Las velocidades lineales del líquido ascendente (VLR) y descendente (VLD), se calcularon de acuerdo a las siguientes expresiones (Lu y Hwang, 1995):

Ecuación 40: R

dLR t

hV =

Ecuación 41: D

dLD t

hV =

Las velocidades superficiales del líquido de ascenso (ULR) y de descenso (ULD) se calcularon según las siguientes expresiones:

Ecuación 42: ULR = VLR (1 - εGR)

30

Ecuación 43: ULD = VLD (1 - εGD)

3.4 DETERMINACIONES ANALÍTICAS

3.4.1 Determinación de la concentración de Sulfuro total

La determinación de la concentración de sulfuro total (expresado como mg·L-1 de S) se llevó a cabo mediante el método estándar del azul de metileno (Clesceri et al, 1998a) en un espectrofotómetro Hatch. Este método se basa en la reacción de las distintas especies de sulfuro en solución acuosa (H2S(ac), HS

- y S2-) con N,N-dimetil p-fenilenediamina y dicromato de potasio en medio ácido para formar azul de metileno. El sulfuro total involucra la suma de las distintas especies de sulfuro y se expresa en mg·L-1 de S. Procedimiento: � Ajustar el método Nº 690 en el espectrofotómetro. � Diluir la muestra en matraz aforado de 50 mL o 100 mL. � Agregar 25 mL de la muestra diluida a una celda de vidrio. Utilizar otra celda “blanco” con

25 mL de agua destilada. � Agregar a cada celda 1 mL del reactivo sulfide 1® y 1 mL de reactivo sulfide 2®. Agitar. � Colocar la celda con el blanco en el espectrofotómetro, ajustar en cero y luego colocar la

celda con la muestra diluida. Multiplicar el resultado leído por la dilución realizada. El método Nº 690 trae incorporado una curva de calibración, en consecuencia los valores de absorbancia son convertidos automáticamente por el espectrofotómetro, a valores de concentración de sulfuro. El límite de linealidad de este método es 0,600 ppm. La precisión del método fue determinada por el fabricante utilizando soluciones estándar de 0,250 ppm de concentración de sulfuro y reactivos sulfide 1® y sulfide 2®. La desviación estándar obtenida fue de ± 0,003 ppm (± 1,2%). Conocido el pH de la muestra y las constantes de acidez, se puede determinar la concentración de las distintas especies de sulfuro presentes (H2S(ac), HS

- y S2-). En el caso de los bioreactores, el pH del medio era 7,0, por lo tanto el 50% del sulfuro estaba como H2S(ac) y el otro 50% estaba como HS-.

3.4.2 Determinación de sulfato, tetrationato, sulfito, metabisulfito y tiosulfato

Todos estos analitos se determinaron por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) empleando columna de intercambio iónico. Se utilizó un cromatógrafo con detector de lámpara de arreglo de diodos a una longitud de onda de 215 nm.

31

Los tiempos de retención se determinaron utilizando soluciones estándares de cada compuesto. Se empleó una fase móvil constituida por una mezcla de NaHCO3 4 mM y Na2CO3 1,5 mM (pH = 9,5), a un flujo de 1,2 mL/min. Procedimiento: � Los tubos centrífuga, la jeringa de toma de muestra y el matraz de aforo se purgan con N2

para evitar contaminación con O2. � Se centrifuga la muestra a 8000 RPM durante 20 minutos para separar la bacterias y las

partículas de azufre. � Del sobrenadante se toma una alícuota de 300 – 500 µL y se diluye a 10 mL con fase móvil

en matraz de aforo de ese volumen. � Se inyecta en el cromatógrafo un volumen de 20 µL de la solución anterior. Preparación fase móvil: � Se calienta H2O desionizada a 40ºC durante 30 minutos. � Se pesan las cantidades necesarias de bicarbonato y carbonato y se disuelven en el H2O

desionizada. � Se desgasifica esta solución mediante bombeo al vacío. � Se nitrogena la solución anterior durante 20 minutos.

3.4.3 Determinación de la concentración de células suspendidas

La concentración de células suspendidas se determinó por recuento directo, empleando una cámara de recuento y un microscopio óptico convencional. Sólo se contabilizaron aquellas bacterias que se encontraban suspendidas en la muestra y no aquellas que se encontraban adheridas a las partículas de azufre.

3.4.4 Determinación de la concentración de azufre suspendido

La determinación de la concentración de azufre suspendido se llevó a cabo filtrando una muestra de 20 mL a través de un filtro de microfibra de vidrio de 1,5 µm y secando el sólido a 105 ºC hasta obtener peso constante, de acuerdo a método estándar de sólidos suspendidos (Clesceri et al, 1998b). Se asumió que los sólidos suspendidos del reactor son esencialmente partículas de azufre.

3.4.5 Determinación potencial zeta de las partículas de azufre

El potencial zeta de las partículas de azufre fue determinado a diferentes valores de pH, mediante migración electroforética en un medidor de potencial zeta. Se utilizó un microscopio óptico convencional con aumento 6x para observar las partículas dentro de la celda electroforética.

32

La interfase entre la capa difusa y la capa de Stern, en el modelo de la doble capa, corresponde al potencial zeta. Este potencial puede ser medido de una manera muy simple, mientras que la carga de la superficie y su potencial no pueden medirse (Hiemenz y Rajagopalan, 1997). Para efectos prácticos la medida de potencial zeta es una buena aproximación del potencial superficial. En presencia de un campo eléctrico, las partículas cargadas migran hacia el electrodo de carga contraria. La velocidad con la que se desplazan las partículas depende de la magnitud de la carga que posean y el sentido del desplazamiento depende de la polaridad que posean. Dependiendo del pH y de las características superficiales de las partículas, éstas tendrán un valor determinado de potencial zeta, ya sea negativo o positivo. Se denomina punto isoeléctrico al valor de pH en donde las partículas tienen un valor de potencial zeta igual a cero. Procedimiento: � Se filtra la muestra a través de un filtro de nitrato de celulosa de 0,45 µm. � Se seca el sólido a 40ºC durante 48 horas. � Se agregan 30 mg de sólidos secos a un vaso de precipitado con 300 mL de una solución de

KCl 1·10-3 M. � Se agita esta mezcla mediante placa agitadora hasta obtener una suspensión uniforme. � Se bombea la suspensión hacia la celda electroforética y se mantiene en recirculación por un

tiempo. � Se detiene el bombeo y una vez que las partículas de azufre están detenidas se les somete a

una diferencia de potencial de 300 V. � Se mide directamente el potencial zeta cada vez que las partículas pasan por una cuadrícula

visible con el microscopio. Se mide el potencial zeta a diferentes valores de pH, acidificando el medio con HCl o alcalinizándolo con KOH. Para cada valor de pH se realizan tres determinaciones con diferentes partículas.

� Con los resultados se construye una curva potencial zeta – pH. Se ajusta una curva sigmoidea y se determina el punto isoeléctrico.

� Se repite 2 veces más el procedimiento desde el punto 3 en adelante, de tal manera de asegurar la reproducibilidad.

3.4.6 Determinación distribución de tamaños de partículas de azufre

La distribución de tamaños de partículas de azufre se determinó mediante el método de transmisión óptica. En este método se combina la ecuación de sedimentación de Stokes con la relación entre la absorbancia y la concentración de partículas. El método consiste en la medición del grado de sedimentación de las partículas a través de la medición de la luz transmitida. La velocidad de sedimentación dependerá del tamaño de las partículas. Una fuente de luz se sitúa en un plano de medición y la intensidad de la luz transmitida es medida por un detector localizado en el lado opuesto. La relación entre absorbancia y tamaño y número de partículas está dada por la siguiente expresión:

Ecuación 44: ∑=

=n

iiii

i

dNkKI

I

1

20 ···log

33

Donde:

I0 : intensidad de la luz incidida a la muestra Ii : intensidad de la luz transmitida a través de la muestra K : coeficiente óptico de la celda y de forma de partícula ki : coeficiente de absorbancia de la partícula di Ni : número de partículas di di : diámetro de partícula

La muestra es dispersada en una solución soporte en la que no sea soluble, no forme aglomerados, no altere sus propiedades físico-químicas y cuyo índice de refracción debe ser diferente al del sólido problema. En el presente estudio se seleccionó como medio dispersante al etilenglicol. Procedimiento: � Se filtra la muestra a través de un filtro de nitrato de celulosa de 0,45 µm. � Se seca el sólido a 40ºC durante 48 horas. � Las partículas secas se dispersan en etilenglicol � La dispersión resultante se sonica durante 20 minutos para evitar aglomeración de partículas. � Se dejan sedimentar las partículas de la dispersión de etilenglicol dentro del analizador. � Se registra automáticamente la luz transmitida en el plano de medición, durante la

sedimentación. Una vez conocida la distribución de tamaños se calculó el tamaño promedio de partículas de acuerdo a la siguiente expresión (Leva, 1960):

Ecuación 45:

∑=

=n

i i

iP

d

XD

1

1

Donde:

DP : diámetro promedio de partículas Xi : fracción relativa de partículas di

3.4.7 Determinación patrón de difracción de rayos X de las partículas de azufre

El patrón de difracción de rayos X se determinó mediante incidencia de rayos X provenientes de la radiación Cu Kα (1,5406 Å), en un difractómetro de rayos X. Este análisis se encargó al Laboratorio de Cristalografía de la Facultad de Ciencias Físicas y Matemáticas de la Universidad de Chile. La difracción de rayos X es una técnica no destructiva de análisis que proporciona información acerca de las fases cristalinas presentes en la muestra analizada. Procedimiento:

34

� Se filtra la muestra a través de un filtro de nitrato de celulosa de 0,45 µm. � Se seca el sólido a 40ºC durante 48 horas � Se envía muestra seca al Laboratorio de Cristalografía. � Se llena el portamuestra del difractómetro con muestra sólida � Se inciden rayos X sobre la muestra sólida y se obtiene el difractograma respectivo.

3.4.8 Análisis de adherencia bacteriana

El análisis de adherencia bacteriana fue llevado a cado mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) y fue encargado al Laboratorio de Física Experimental de la Facultad de Física de la Pontificia Universidad Católica de Chile. Conjuntamente con la técnica SEM se determinó la composición química elemental de la superficie de las partículas de azufre mediante microanálisis por energía dispersiva (EDS). Las etapas previas al SEM, es decir la deshidratación con alcohol, el secado de punto crítico y el sombreado de las muestras, se encargaron al Laboratorio de Reproducción y Desarrollo de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Pontificia Universidad Católica de Chile. El secado de punto crítico se llevó a cabo utilizando CO2, de acuerdo al procedimiento descrito por Porter et al (1982). El sombreado se realizó con oro y paladio. Procedimiento: � Se descarta el medio líquido de la muestra. � Se lava el sólido con agua destilada 10 veces para eliminar las bacterias mas bien depositadas

que adheridas. � Las bacterias adheridas se preservan con glutaraldehido al 6 %. � Se envía la muestra preservada al Laboratorio de Reproducción y Desarrollo, en donde se

deshidratan con alcohol y posteriormente son secadas con CO2 en su punto crítico. � Se sombrean las muestras con oro y paladio. � Se analizan las muestras mediante SEM en el Laboratorio de Física Experimental.

3.4.9 Análisis superficial de las partículas de azufre

El análisis superficial de las partículas de azufre se llevó a cabo mediante espectroscopía fotoeléctrica de rayos X (XPS), utilizando rayos X provenientes de la radiación Al Kα (1486,6 eV). Este análisis se encargó al Laboratorio de Superficies de la Facultad de Ciencias Físicas y Matemáticas de la Universidad de Chile. XPS es una técnica espectroscópica que se basa en el efecto fotoeléctrico. La energía incidente utilizada corresponde a rayos X monocromáticos. Esta energía es absorbida por los átomos constituyentes de la muestra, produciéndose ionización de éstos y la emisión de electrones de capas internas de su configuración electrónica. La energía cinética y el número de los electrones fotoemitidos son detectados en un analizador de energía de electrones. La diferencia de energía entre los átomos ionizados y neutros, corresponde a la energía de enlace del electrón. Esta energía se toma como una medida directa de la energía requerida para remover

35

el electrón desde su nivel inicial hasta el nivel de vacío. En sólidos, esta energía se mide con respecto al nivel Fermi del sólido en vez del nivel de vacío. Los átomos de mayor estado de oxidación exhiben mayores energías de enlace, debido a interacciones electrostáticas entre el electrón fotoemitido y el ion. La energía de enlace exacta de un electrón depende también del ambiente químico y físico. En consecuencia mediante XPS se puede discriminar entre diferentes estados de oxidación y ambientes químicos. La energía de enlace se determina de acuerdo a la siguiente expresión:

Ecuación 46: Φ−−=CINÉTICAENLACE EhE ν

Donde:

h : constante de Planck (6,62·10-34 J s) ν : frecuencia de la radiación Φ : función trabajo

Esta técnica espectroscópica es superficial, ya que se emiten electrones ubicados a una profundidad de 1 a 10 nm de la superficie del material a analizar. Se requieren condiciones de ultra alto vacío para permitir analizar los electrones fotoemitidos sin la interferencia de las colisiones de la fase gas. Procedimiento: � Se filtra la muestra a través de un filtro de nitrato de celulosa de 0,45 µm. � Se seca el sólido a 40ºC durante 48 horas � Se envía muestra seca al Laboratorio de Superficies. � Se llena el portamuestra con muestra sólida � Se somete la cámara a condiciones de ultra alto vacío (~10-9 torr) � Se inciden rayos X sobre la muestra sólida y se obtiene el espectro respectivo

3.4.10 Detección de microorganismos mediante análisis de T-RFLP

Este análisis fue desarrollado por la profesora Blanca Escobar en el laboratorio de Biohidrometalurgia del Departamento de Ingeniería Química y Biotecnología, de la Facultad de Ciencias Físicas y Matemáticas de la Universidad de Chile. El procedimiento consiste, a grandes rasgos, en extraer el DNA de la muestra, amplificarlo utilizando un partidor marcado con fluorescencia para el gen 16S rDNA y posteriormente digerir el ADN amplificado con una enzima de restricción específica. El procedimiento detallado se puede ver en el APÉNDICE A.

36

3.5 COMPONENTES DEL SISTEMA EXPERIMENTAL

3.5.1 Descripción de componentes

1. Reactor agitado mecánicamente: este reactor era un recipiente cilíndrico de acrílico de

9,8·10-2 m de diámetro y 1,9·10-1 m de altura, con una capacidad aproximada de 1,3 litros. El sello lo proporcionaba una tapa de acrílico y una empaquetadura de goma fijadas al reactor mediante 12 pernos y 24 golillas. La tapa de acrílico, con 7 perforaciones, permitía la utilización de éstas como puertos de conexión para la toma de muestra, para la entrada y salida de gas y para los diversos instrumentos utilizados en el control y monitoreo del reactor (termocupla, calefactor, electrodos de pH y Eh), tal como se muestra en la Figura B 3, apéndice B.

2. Reactor gaslift: consistió en dos tubos concéntricos de acrílico, con ascenso del gas por su

espacio anular. Fue construido de acuerdo a los criterios y requisitos de diseño expuestos en los resultados. Las características geométricas de este reactor se presentan en la Figura 7 y en la Tabla 3.

37

50.50cm

1.00cm

17.90cm22.07cm

38.15cm

9.93cm

11.13cm

16.86cm

34.99cm

16.80cm

7.02cm

7.62cm

1.00cm1.00cm

1.00cm

4.00cm

Figura 7. Dimensiones del reactor gaslift.

Tabla 3. Características geométricas del reactor gaslift.

Parámetros Geométricos Dimensiones Altura Reactor: Htot (cm) 92,5

Altura tubo deflector: hd (cm) 53,5 AR (cm

2) 38,7 AD (cm

2) 38,7 hB (cm) 3,8 hS (cm) 13

38

3. Sistema de agitación mecánica reactor agitado mecánicamente: estaba constituido por una barra magnética de 60 mm de largo y 9,4 mm de diámetro y una placa agitadora Variomag, Electronicrüber, Compact HP1, con control manual de velocidad.

4. Distribuidor de gases reactor agitado mecánicamente: consistió en difusor de gases de

piedra porosa localizado inmediatamente sobre la barra agitadora magnética. 5. Distribuidor de gases reactor gaslift: el gas se distribuyó a través de 10 perforaciones

circulares (determinadas de acuerdo a los criterios expuestos en los resultados) de 0,7 mm de diámetro ubicadas equidistantes entre sí. El gas se alimentó a través de un canal de sección cuadrada de 0,4 cm ubicado en la base del reactor, según se muestra en la Figura 8.

Figura 8. a) Vista de la base del reactor. b) Corte transversal de la base del reactor

6. Sistema de trampas de retención de H2S(g): Las trampas de NaOH y de CuSO4 estaban

constituidas por botellas de vidrio templado Schott Duran con tapa de plástico de alta resistencia, sello a presión y dos tubos conectores de vidrio.

39

7. Sistema de agitación de trampas: se empleó agitación mecánica utilizando barras magnéticas como las utilizadas en la agitación del bioreactor agitado mecánicamente, con una placa agitadora Nuova II Stir Sybron Termolyne.

3.5.2 Instrumentación y control

La instrumentación y control de los dos sistemas experimentales se realizó utilizando los siguientes equipos: 1. Las señales de la variable pH se capturaron en un sistema de adquisición de datos consistente

en un convertidor analógico digital, marca Measuring Computing Co, modelo PMD 120 8LS, el que operó con el software InstaCal y Tracer DAQ. El sistema de control de pH se basó en un controlador micro PLC marca Array Electronic Co, modelo AF-20MR-D, operado con software Quick II.

2. Sistema Autoparamétrico de Control de temperatura, marca Self Tune Plus. 3. Termocupla de Fe-Constantan tipo J, marca Veto, con blindaje de acero inoxidable. 4. Electrodo de combinación de pH, marca Hanna Instruments, modelo ML 1030 5. Electrodo de potencial de óxido reducción, marca Hanna Instruments, modelo HI 3230. 6. Registrador de pH, marca Cole Palmer, Chemcadet 7. Registrador de Eh, marca Cole Palmer, Chemcadet 8. Manómetro Bourdon, marca Veto de 8 psi. 9. Válvula solenoide, marca Nacom Industries Co, modelo M442C2AFR-HT. 10. Calefactor resistivo de Acuario de 100 W de potencia, con vaina de vidrio, de 13 cm de largo

y 1 cm de diámetro. 11. Flujómetro de película ascendente, modelo Optiflow 730, marca Humonics.

3.5.3 Aparatos e Instrumentos

1. Espectrofotómetro UV visible, marca Hach modelo DR/2000. 2. Celdas de vidrio de 2 cm de paso óptico. 3. Microscopio óptico Galen III, Cambridge Instrument, con binocular 10x y lentes 4x, 10x, 40x

y 100 x. 4. Cámara de recuento, marca Brand, modelo Neubauer Improved.

40

5. Balanza analítica, marca Metler H33-AR 6. Medidor potencial zeta, Zeta Meter, modelo 3.0 7. Analizador automático de distribución de tamaño de partículas, marca Horiba, modelo capa

300 8. Cromatógrafo para HPLC, marca Hitachi, con detector de arreglo de diodos marca Hitachi

modelo L-3000 y bomba Hitachi modelo L-6200. 9. Columna de intercambio iónico, marca Transgenomic, modelo ICSep – ANSC de 4,6 mm x

250 mm. 10. Filtros de microfibra de vidrio de 1,5 µm, marca Whatman 934 AH 11. Filtros de nitrato de celulosa de 0,45 µm, marca Sartorius AG 12. Tubos centrífuga 13. Rotámetro Gilmont Instruments, modelo F1200 con esfera de acero inoxidable. 14. Rotámetro Cole Palmer modelo FM 082-03 con esfera de acero inoxidable.

3.5.4 Conexiones sistemas experimentales

Las conexiones se realizaron utilizando mangueras Masterflex, tipos Tygon y C-flex números 13, 16 y 17; resistentes a medios ácidos y no permeables a los gases empleados. En el Apéndice B se muestran 3 fotografías correspondientes al sistema experimental y al montaje general del sistema, junto con los principales componentes así como también con el sistema de control e instrumentación utilizados en este trabajo experimental.

3.6 MODELACIÓN DINÁMICA

La optimización de parámetros se realizó utilizando métodos de Gauss – Newton, considerando como función objetivo a la suma de las diferencias cuadráticas entre los datos experimentales y aquellos determinados en la integración del sistema de ecuaciones que describieron adecuadamente el sistema reaccionante del reactor agitado mecánicamente (Sección 4.10). La resolución simultánea de las ecuaciones diferenciales consideradas en el modelo se llevó a cabo utilizando la función ODE del programa orientado a matemáticas Matlab® . La bondad de ajuste de los resultados entregados por el modelo se determinó mediante prueba estadística de Chi cuadrado (χ2).

41

CAPÍTULO 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN En el presente capítulo se estudia la cinética de reducción de azufre mediada por bacterias en un reactor agitado mecánicamente y en un reactor gaslift. Con estos resultados se comparan ambos reactores, con la finalidad de encontrar el mejor diseño. Tal como se estableció anteriormente, existen parámetros geométricos que afectan notablemente las propiedades hidrodinámicas y de transferencia de los reactores gaslift. Por lo tanto, se diseña el reactor de acuerdo a criterios de diseño considerando estos parámetros geométricos. Previo a realizar los experimentos de determinación de cinéticas, es necesario conocer las propiedades de transferencia de masa de ambas reactores y las propiedades hidrodinámicas del reactor gaslift.

4.1 PROPIEDADES DE TRANSFERENCIA DE MASA DEL REACTOR AGITADO MECÁNICAMENTE

Antes de realizar los experimentos de cinética de producción de H2S(g), es necesario conocer las propiedades de transferencia de masa del reactor agitado mecánicamente, representadas por el coeficiente combinado de transferencia de masa, kLa. Esta determinación se realizó empleando oxígeno y nitrógeno para distintas velocidades superficiales de gas (UG), tal como se detalla en la sección 3.3. La Ug será expresada en todo el presente trabajo en m3N·m-2·s-1, en donde la letra N significa condiciones normales de temperatura y presión (0ºC, 1 atm). Los resultados de las mediciones de (kLa)H2 para sistemas de dos fases (gas, líquido) y tres fases (gas, líquido, sólido) se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4. Coeficientes combinados de transferencia de masa para hidrógeno para distintas UG.

UG (m3N·m-2·s-1) kLa (sistema de dos fases) (s-1) kLa (sistema de tres fases) (s-1)

5,1·10-4 5,6·10-3 N.D. 8,5·10-4 6,7·10-3 7,0·10-3 2,1·10-3 9,3·10-3 8,2·10-3 3,7·10-3 1,6·10-2 1,7·10-2 6,8·10-3 2,9·10-2 N.D.

N.D.: no determinado A partir de la tabla anterior, se observa un progresivo aumento de kLa en función de UG, tanto para el sistema de dos fases como para el de tres fases. La relación obtenida experimentalmente es concordante con la teoría, en el sentido que al aumentar UG aumenta la cantidad de gas entrante y con ello la cantidad de burbujas transfiriendo reactante gaseoso al medio, por lo que si bien el coeficiente de transferencia de masa local (kL) no cambia, el cambio de área de burbujas produce el aumento del coeficiente combinado, kLa. Naturalmente, se trabajó en el régimen de burbujas, en donde el aumento de UG no llegó a cambiar el régimen de burbujas.

42

También es posible constatar que no hay diferencias significativas entre los valores de (kLa)H2 para el sistema de dos fases y tres fases. Se sabe que la incorporación de partículas sólidas a la fase líquida conduce a un incremento de µeff, lo que trae consigo una disminución del área interfacial, por lo que sería esperable una disminución de kLa al pasar a un sistema de tres fases. Sin embargo, Joosten et al (1977) encontraron en un reactor agitado mecánicamente de tres fases que las partículas de tamaño ≤ 250 µm no afectan significativamente el kLa, cuando la viscosidad aparente de la suspensión no es mayor a cuatro veces la del líquido. En este caso las partículas de azufre son bastante menores que 250 µm, por lo que es razonable que no haya mayores diferencias entre ambos sistemas estudiados. La determinación de kLa fue llevada a cabo sin la presencia de bacterias, pese a que autores como Galaction et al, (2004) encontraron que la concentración celular aumenta la viscosidad del medio. Esto provoca dos efectos sobre el coeficiente de transferencia de masa: la reducción de la turbulencia y la perturbación del equilibrio dispersión - coalescencia de las burbujas. Estos efectos fueron observados para un rango de concentraciones de biomasa comprendidos entre 30,5 y 120,5 g·L-1 en base seca. En el presente estudio la concentración máxima celular alcanzada fue de 2,68·108 cel·mL-1 (ver sección 4.5). Este valor corresponde a 5,4·10-2 g·L-1 en base seca, asumiendo que un gramo de biomasa contiene 1012 células y que una célula tiene un 80% de humedad (Bailey y Ollis, 1986). Esta concentración es considerablemente menor que aquellas empleadas por Galaction et al, por lo tanto en este trabajo se asume que la determinación de kLa no es afectada por la bacterias. Por otra parte, según Bailey y Ollis (1986), el efecto de la biomasa es despreciable sobre la viscosidad del medio para concentraciones celulares menores a 1·109 cel·mL-1.

4.2 ESTUDIO CINÉTICO DE LA REDUCCIÓN DE AZUFRE MEDIADA POR BACTERIAS EN REACTOR AGITADO MECÁNICAMENTE.

Para ratificar la estequiometría de la reacción y para evaluar el efecto del burbujeo del hidrógeno, se realizaron 2 experiencias en condiciones batch para las 3 fases (gas, líquido y sólido) en el reactor agitado mecánicamente. Estos experimentos sólo duraron 5 horas, para evitar problemas inhibitorios asociados a la acumulación de ácido sulfhídrico. Se midió la presión inicial y final de H2, y la concentración inicial y final de sulfuro total (H2S (ac) + HS

-, expresados como S) en el reactor. Se obtuvieron velocidades de formación de sulfuro de hidrógeno (medidos en fase acuosa) de 183 y 154 mg H2S·L

-1·d-1. A partir de la diferencia de presión se determinó el consumo de H2, siendo igual a 1,17·10

-3 moles de H2 en ambos casos. Los moles de ácido sulfhídrico formados fueron 1,21·10-3 y 1,08·10-3, para el primer y segundo experimento, con lo que se obtuvieron cuocientes H2/H2S iguales a 0,97 y 1,08, respectivamente. De esta forma se ratificó la estequiometría planteada en la Ecuación 1. Los siguientes experimentos realizados en el reactor agitado mecánicamente se llevaron a cabo en forma continua para la fase gas y en modalidad batch para las fases líquida y sólida. Se realizaron 3 experimentos de corta duración (24 horas) con la finalidad de optimizar las condiciones de operación del reactor, en lo que a flujo de hidrógeno se refiere. La concentración de azufre inicial fue de 5% (p/v). La reacción fue estudiada para tres velocidades superficiales de gas (2,1·10-3, 3,7·10-3 y 6,8·10-3 m3N·m-2·s-1), en tres diferentes experimentos. En los tres casos se obtuvo una velocidad de formación de sulfuro de hidrógeno de 2,3 g H2S·L

-1·d-1. Para la menor UG se obtuvo

43

esta velocidad de formación al cabo de 14 horas, mientras que para las otras UG se obtuvo luego de 2 horas de reacción. En los tres experimentos el Eh permaneció constante con un valor en torno a los -300 mV vs Ag/AgCl. Las velocidades de formación de sulfuro de hidrógeno obtenidas en condiciones de flujo de H2 son notoriamente superiores a aquellas obtenidas sin flujo de este gas. En este último caso el área de transferencia de masa gas líquido está dada sólo por la sección transversal del reactor, mientras que en condiciones de flujo el área de transferencia es mayor, ya que está dado por las burbujas de gas. Considerando los resultados anteriores, se estimó que una velocidad superficial de gas (UG) de 2,1·10-3 m3N·m-2·s-1 era una velocidad adecuada para realizar un experimento de mayor duración. Posteriormente se realizó un experimento de mayor duración (21 días), con una concentración inicial de azufre de 4% (p/v). Los resultados de los primeros 10 días de experimento se muestran en la Figura 9. Por tiempo cero se considera al comienzo del flujo continuo de hidrógeno.

0

500

1000

1500

2000

2500

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Tiempo (días)

Vel

ocid

ad d

e fo

rmac

ión

H2S

(g)

(m

g·L

-1·d

-1)

1

Figura 9. Velocidad de formación de H2S(g) para UG = 2,1·10

-3 m3N·m-2·s-1. La flecha 1 indica que 18 g de azufre fueron agregados al reactor.

Se observa un aumento gradual de la tasa de formación de H2S(g) con el transcurso del tiempo, hasta alcanzar un valor máximo de 1,8 g H2S·L

-1·d-1 en el día 2,5. Este valor se mantuvo hasta el día 4,5. Después de transcurridos 5,4 días, disminuyó a 1,5 g H2S·L

-1·d-1. Entre los días 7,5 y 9,13, la tasa de formación de H2S(g) disminuyó progresivamente. En ese último día, se agregaron 18 gramos de azufre al reactor (Figura 9, flecha 1), alcanzándose una concentración de azufre de 4,7% (p/v). Al cabo de 3 horas, se recuperó la velocidad de formación de H2S(g) alcanzando un valor de 2,1 g H2S·L

-1·d-1. Estos resultados sugieren que existe una limitación por la edad de las

44

partículas de azufre, es decir que la reacción estaría limitada por la propia disponibilidad del azufre. Entre los días 2,5 y 4,5, la concentración de sulfuro total en el reactor fue de 4,73 ± 0,12 mg·L-1 S. Después fue disminuyendo progresivamente hasta alcanzar un mínimo de 2,24 mg·L-1 S. Después del día 9,13 cuando se agregó más azufre al reactor, la concentración de sulfuro total aumentó a 7,15 mg·L-1 S; evidenciándose una tendencia similar a aquella obtenida para la velocidad de formación de H2S(g). Si se considera el aporte del sulfuro total en el reactor a la cinética de formación de H2S, este representa un incremento muy marginal frente al H2S(g) atrapado en las trampas, tal como puede visualizarse en la Figura 10. De esta manera queda en evidencia que el H2S atrapado en las trampas es una muy buena medida de la cinética de formación de producto, siempre que haya una buena desorción de ácido sulfhídrico.

0

500

1000

1500

2000

2500

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Tiempo (días)

Vel

ocid

ad d

e fo

rmac

ión

H2S

(m

g·L-1

·d-1

)

H2S (g)

H2S (ac) + HS- + H2S(g)

Figura 10. Velocidad de formación de H2S considerando el aporte de sulfuro total en el reactor. UG =

2,1·10-3 m3N·m-2·s-1.

Realizando balances de masa del azufre remanente en el reactor y considerando el tamaño promedio inicial de partículas (30,7 µm), se calculó la variación en el tiempo del diámetro promedio de las partículas de azufre en el reactor (asumiendo que todas las partículas disminuyen uniformemente su tamaño). En la Figura 11 se presentan los resultados para los primeros días del experimento, antes de la adición de 18 gramos de azufre. Tal como puede apreciarse, desde el comienzo del experimento se observa una disminución progresiva del diámetro promedio de partículas en función del tiempo. Esta tasa se ve incrementada al cumplirse el primer día de experimento. La tasa de disminución permanece prácticamente constante hasta el día 7. Desde ese día hasta los 7 días y medio, la tasa es prácticamente nula. Luego, a partir del día 8, se

45

observa que el diámetro de partículas disminuye levemente, para finalmente permanecer constante. Hartler et al. (1967) encontraron que la reacción de disolución de azufre por reacción con polisulfuros y el ion HS- es una reacción no catalítica con disminución de tamaño de partículas. De acuerdo con Levenspiel (2002), este tipo de reacciones debería conducir a una disminución del tamaño de partículas hasta su desaparición total. Sin embargo, en el experimento realizado en esta oportunidad no se presentó dicha situación, ya que al cabo de los primeros nueve días de experimento, la velocidad de formación de H2S(g) disminuyó drásticamente, mientras que el tamaño promedio de las partículas sólo alcanzó a disminuir en un 9,8% (27,7 µm) con respecto al tamaño inicial. Además cabe señalar que a contar del día 8, el diámetro promedio de partículas permaneció constante, en cambio la velocidad de formación de H2S(g) continuó descendiendo. De esta manera el descenso en la velocidad de formación de H2S(g) indicado en la Figura 9, no parece deberse a la caída intrínseca de las partículas de azufre inherente a su agotamiento. En la reducción de azufre en presencia de bacterias existe algún otro tipo de mecanismo distinto a aquellos descritos para la reducción abiótica de azufre.

25.0

26.0

27.0

28.0

29.0

30.0

31.0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Tiempo (días)

Diá

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rom

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de

part

ícul

as

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róm

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s)

Figura 11. Diámetro promedio estimado de partículas de azufre en el reactor agitado mecánicamente. UG

= 2,1·10-3 m3N·m-2·s-1.

La evolución de la velocidad de formación de H2S(g) de los restantes días del experimento se muestra en la Figura 12. En esta etapa del experimento se hicieron sucesivos cambios de UG. Por otra parte, en la Figura 13 se presenta la evolución de la concentración de sulfuro total en el reactor para el mismo período de tiempo.

46

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21400

600

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1000

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1400

1600

1800

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2200

2400

Tiempo (días)

Vel

ocid

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de

H2S

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(m

g/L/

d)

4.0x10-4

6.0x10-4

8.0x10-4

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1.2x10-3

1.4x10-3

1.6x10-3

1.8x10-3

2.0x10-3

2.2x10-3

21

UG(m

3 N·m

-2·s

-1)

Figura 12. Velocidad de formación de H2S(g) para 5,1·10

-4, 1,4·10-3 y 2,1·10-3 m3N·m-2·s-1. La flecha 1 indica que se agregaron al reactor 400 mg de extracto de levadura. La flecha 2 indica que se agregaron al

reactor 16 g de azufre.

Después de 12,2 días de operación, se disminuyó la velocidad superficial de gas a 1,4·10-3 m3N·m-2·s-1. Sin embargo, no se observaron cambios en la velocidad de formación de H2S(g) y la concentración de sulfuro total permaneció constante en 7,64 ± 0,42 mg·L-1 S (ver Figura 13). En el día 14, la UG fue disminuida a 5,1·10-4 m3N·m-2·s-1. Entre ese día y el día 15,3, la tasa de formación de H2S(g) disminuyó de 2,04 a 1,42 g H2S·L

-1·d-1 y la concentración de sulfuro total aumentó de 9,93 a 20,85 mg·L-1 S (ver Figura 13), por lo que una posible inhibición por producto de H2S(ac) podría haber ocurrido. Dado que el reactor estaba a pH = 7, las concentraciones recién mencionadas equivalen a 5,27 y 11,07 mg·L-1 de H2S(ac), respectivamente. Se dejan expresadas como concentración de ácido sulfhídrico, H2S(ac), ya que ésta es la especie reportada como inhibitoria. Sin embargo, las concentraciones detectadas de ácido sulfhídrico en el reactor son muy inferiores a las reportadas como inhibitorias en la literatura. Okabe et al (1992), trabajando a pH = 7 reportaron que la inhibición comienza a una concentración de sulfuro total de 150 mg·L-1 S (equivalente a 80 mg·L-1 de H2S(ac)) y a una concentración de sulfuro total de 500 mg·L-1 S (equivalente a 266 mg·L-1 de H2S(ac)) se produce un 50% de inhibición de utilización de lactato (utilizado en ese estudio como fuente de carbono y energía). Reis et al (1992), trabajando a pH 6,6 y 6,2, reportaron inhibición total de reducción de sulfato para una concentración de 547 mg·L-

1 de H2S(ac). Okabe et al (1995), trabajando a pH = 7, encontraron que el rendimiento celular decae a la mitad para una concentración de sulfuro total de 250 mg·L-1 S, lo que equivale a una concentración de 133 mg·L-1 de H2S(ac). En consecuencia, se descarta que la disminución de la velocidad de formación de H2S(g) sea debido a inhibición bacteriana por ácido sulfhídrico. Lo que sí queda en evidencia, es una mala transferencia del H2S de la fase acuosa a la fase gaseosa para una UG de 1·10

-4 m3N·m-2·s-1.

47

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

2.0

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6.0

8.0

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14.0

16.0

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22.0

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26.0

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Tiempo (días)

Con

cent

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L-1 S

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2.2x10-3

UG(m

3 N·m

-2·s

-1)

Figura 13. Concentración de sulfuro total en el reactor para 5,1·10-4, 1,4·10-3 y 2,1·10-3 m3N·m-2·s-1. La

flecha roja indica que se agregaron al reactor 16 g de azufre.

A partir del día 15,3, tanto la concentración total de sulfuro como la velocidad de formación de H2S(g) comenzaron a disminuir progresivamente. En el día 17,2 la UG fue aumentada a 1,4·10-3 m3N·m-2·s-1. Sin embargo, ambos parámetros continuaron disminuyendo. En el día 18, se agregaron 400 mg de extracto de levadura al reactor (Figura 12, flecha 1), produciéndose un ligero aumento en la velocidad de formación de H2S(g), pero no así en la concentración de células suspendidas. Sin embargo, este efecto fue breve, ya que la velocidad de formación de H2S(g) disminuyó nuevamente hasta alcanzar un mínimo el día 19,3. En ese momento se agregaron 16 gramos de azufre al reactor (Figura 12, flecha 2), obteniéndose una concentración de azufre de 4,7% (p/v). La velocidad de formación de H2S(g) alcanzó nuevamente un valor de 2,1 g H2S·L

-1·d-1 pasadas 7,5 horas después de que se agregara esta nueva cantidad de azufre. Conocido el valor de (kLa)H2 y asumiendo que la saturación de hidrógeno en el seno de la solución es de un 70%, se puede calcular la tasa de transferencia de hidrógeno. Para UG = 2,1·10

-3

m3N·m-2·s-1, ésta corresponde a 0,17 mol H2·L-1·d-1, por lo que sería esperable una máxima

velocidad de formación de H2S(g) de 5,8 g H2S·L-1·d-1. Sin embargo, sólo se obtiene una máxima

velocidad de formación de H2S(g) de 2,1 g H2S·L-1·d-1. Esto indica que no hay limitación por

transferencia de masa gas líquido de hidrógeno para UG mayores que 5,1·10-4 m3N·m-2·s-1. De esta manera queda en evidencia que la edad de las partículas de azufre es la limitante más importante de la velocidad de reacción para el rango de UG comprendido entre 1,4·10-3 y 6,8·10-3

m3N·m-2·s-1. Al agregar extracto de levadura al reactor, se obtuvo un aumento en la velocidad de formación de H2S(g). Un amino ácido común que está presente en el extracto de levadura es la cisteína. Blumentals et al (1990) encontraron que este amino ácido es un nucleófilo que abre el anillo de

48

azufre, aumentando así la tasa de disolución del azufre. Belkin et al (1985) encontraron que la presencia de extracto de levadura aumentaba la tasa de formación de sulfuros, con una concentración óptima de extracto de levadura de 1 g·L-1. Estos resultados sugieren que el reactor necesita un suministro permanente de extracto de levadura que asegure la mejor dispersión del azufre. Para descartar que el aumento en la velocidad de formación de H2S(g), no haya sido debido sólo a la incorporación de azufre contenido tanto en la cisteína como en la metionina (también presente en el extracto de levadura), se determinó el aporte de azufre. Por cada 100 gramos de extracto de levadura hay 2 gramos de azufre, por lo que al agregar 400 mg de extracto de levadura se incorporaron 8 mg de azufre al reactor que sólo explicarían una producción de 8,5 mg de H2S durante las 6 horas que se detectó el aumento de la velocidad de formación de H2S(g), en circunstancias que durante ese tiempo se produjeron 70 mg de H2S. Estos resultados reafirman el postulado de un ataque nucleofílico por parte del azufre de la cisteína al azufre elemental presente en el reactor. En la Figura 14 se observa la evolución de la concentración de células suspendidas en el reactor a lo largo de todo el experimento. En los días 3,0, 5,3 y 7,0, se agregaron 100 mL de medio de cultivo sin extracto de levadura al reactor. No se observaron cambios en la velocidad de formación de H2S(g) ni en la concentración celular, en los días 3,0 y 5,3. 10 horas después de que se agregaran los últimos 100 mL de medio, la concentración celular aumentó de 7,70·106 a 1,1·107 cel/mL. En los días 13,5 y 16,4, se agregaron 100 mL de medio sin extracto de levadura al reactor. La velocidad de formación de H2S(g) no sufrió cambios, mientras que la concentración celular aumentó de 2,0·106 a 4,0·106 cel/mL después de 10 horas de la primera adición de medio, y aumentó de 4,7·106 a 6,5·106 cel/mL 5 horas después de la última adición. Considerando estos resultados, se concluye que las bacterias necesitan una renovación del medio de cultivo del orden de dos días y medio, después de que se han aclimatado a las condiciones del reactor.

49

0.0E+00

2.0E+06

4.0E+06

6.0E+06

8.0E+06

1.0E+07

1.2E+07

1.4E+07

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

Tiempo (días)

Con

cent

raci

ón d

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dida

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L)

2

3

4 5

6

1

Figura 14. Concentración de células suspendidas en el reactor. Las flechas 1, 3 y 4 indican que se

agregaron 100 mL de medio sin extracto de levadura al reactor. La flecha 5 indica que se agregaron 400 mg de extracto de levadura al reactor. Las flechas 2 y 6 indican que se agregaron al reactor 18 y 16 g de

azufre, respectivamente.

En la Figura 15 se muestra la evolución del potencial de óxido reducción (Eh) del reactor a lo largo de todo el experimento. En el día 7,55 (Flecha 1, Figura 15) se detuvo el flujo de hidrógeno al reactor, con el objetivo de estudiar su efecto. Las condiciones reductoras empeoraron rápidamente, reflejadas en un aumento del Eh desde -500 a -366 mV vs Ag/AgCl. Esta alteración no tuvo mayor efecto en la tasa de reducción de azufre, ya que se encontraba disminuyendo antes de este cambio y después continuó con la misma tendencia. Las bacterias suspendidas si se vieron afectadas, ya que disminuyeron drásticamente su concentración desde 1,20·107 a 4,90·106 cel/mL (Figura 14). Esto demuestra la sensibilidad de las bacterias reductoras de azufre frente a cambios que pueda experimentar el potencial de óxido reducción. Una vez que se reinició el flujo de hidrógeno, el Eh se recuperó rápidamente (flecha 2, Figura 15), indicando con ello que el hidrógeno es fundamental en la mantención de las condiciones reductoras. Fitz y Cypionka (1989), estudiando la reacción de tiosulfato a sulfito y sulfuro mediada por Desulfovibrio desulfuricans, encontraron que el Eh disminuyó desde -240 a -420 mV en condiciones de baja concentración de hidrógeno hasta condiciones de saturación de éste. En el presente estudio puede haber sucedido algo semejante, ya que el Eh del reactor disminuye progresivamente en función del tiempo de exposición al H2(g). En torno a los días 17 y 18 se obtiene un mínimo de Eh igual a -515 mV vs Ag/AgCl, valor que se mantiene hasta el momento de la incorporación de extracto de levadura, en donde inevitablemente ingresa oxígeno al sistema (flecha 4, Figura 15). Este valor de Eh podría indicar condiciones de saturación de hidrógeno.

50

Cuando se agregó azufre elemental al reactor (flechas 3 y 5, Figura 15) se produjo un aumento indeseado del Eh, debido a la inevitable incorporación de oxígeno al medio. Sin embargo, esta alteración fue de carácter leve, sin que se presentaran problemas tanto en la concentración de células suspendidas como en la velocidad de formación de H2S (g).

-550

-525

-500

-475

-450

-425

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-350

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0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26

Tiempo (días)

Eh

(mV

vs

Ag/

AgC

l)

1

3

2

4

5

Figura 15. Potencial de óxido reducción del reactor. La flecha 1 indica que se interrumpió el flujo de

hidrógeno y se cerró el reactor con 2 psig de este gas. La flecha 2 indica que se reinició el flujo continuo de hidrógeno. Las flechas 3 y 5 indican que se agregaron al reactor 18 y 16 g de azufre, respectivamente.

La flecha 4 indica que se agregaron al reactor 400 mg de extracto de levadura.

Durante los primeros 10 días de experimento, el Eh disminuyó desde -350 a -500 mV vs Ag/AgCl y la concentración celular alcanzó un máximo de 1,2·107 cel/mL. Estos resultados indican que se alcanzaron condiciones reductoras favorables para la respiración y crecimiento celulares, de esta manera la velocidad de la reacción no estaría limitada por estas variables. Los resultados experimentales muestran que la principal limitante de la velocidad de bioreducción del azufre está dada por la propia disponibilidad de éste. Este hecho fue evidente en los días 9,13 y 19,3, cuando se agregó azufre al reactor e inmediatamente aumentó la velocidad de formación de H2S(g). Un aumento de la concentración inicial de azufre provocó un aumento proporcional de la velocidad de formación de H2S(g). Para UG mayores que 5,1·10-4 m3N·m-2·s-1, la velocidad de hidrógeno no tuvo efecto en la velocidad de formación de H2S(g). Para un rango de concentración de azufre de 4 a 5% (p/v), y para un rango de UG de 1,4·10

-3 a 6,8·10-3 m3N·m-2·s-1, se encontró que la velocidad de reacción (expresada en función del volumen de reacción) es de primer orden con respecto al azufre (r = 0,995). Se obtuvo una velocidad de formación de H2S(g) máxima de 2,1 g H2S·L

-1·d-1durante un período significativo de tiempo, para UG de 2,1·10

-3 Nm3·m-2·s-1 y concentración inicial de azufre de 4,7% (p/v). Por tratarse de una reacción heterogénea, es necesario conocer también la evolución de la

51

velocidad de formación de H2S(g) expresada en función de la masa y superficie de azufre. Estas se presentan en las siguientes figuras, junto a la velocidad de formación de H2S(g) expresada en función del volumen de reacción para todo el período de experimentación.

0

500

1000

1500

2000

2500

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Tiempo (días)

Vel

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(g)

(m

g L

-1 d

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Figura 16. Velocidad de formación de H2S(g) expresado por volumen de reacción para todo el período de

experimento en el reactor agitado mecánicamente.

0

10

20

30

40

50

60

70

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Tiempo (días)

Vel

ocid

ad d

e fo

rmac

ión

H2S

(g)

(m

g g

-1 d

-1)

Figura 17. Velocidad de formación de H2S(g) expresado por masa total de azufre para todo el período de

experimento en el reactor agitado mecánicamente.

52

0

100

200

300

400

500

600

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Tiempo (días)

Vel

ocid

ad d

e fo

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ión

H2S

(g)

(m

g m

-2 d

-1)

Figura 18. Velocidad de formación de H2S(g) expresado por superficie total de azufre para todo el período

de experimento en el reactor agitado mecánicamente.

Al observar las últimas 3 figuras, se puede afirmar que la evolución de la velocidad de formación de H2S(g) no tiene mayor diferencia si es expresada por volumen de reacción, masa o superficie total de azufre. La única diferencia entre la Figura 16 por una parte, y la Figura 17 y Figura 18 por otra parte, se presenta después de que se son agregados 18 gramos de azufre al reactor (día 9,13). Cuando la cinética de formación de producto es expresada por masa y superficie de azufre, el valor máximo obtenido después de esta incorporación de azufre es similar al obtenido entre el día 3 y 5, mientras que para el caso de cinética expresada por volumen de reacción se obtiene un valor mayor que el obtenido entre el día 3 y 5. Esto se debe a que al expresarlo en volumen, no se corrige la variación en concentración que se produce al incorporar los 18 gramos de azufre. Los resultados de las velocidades de formación de H2S(g) expresados en mg H2S·(g S)

-1·d-1 con sus respectivos intervalos de confianza se presentan en la Tabla 5. Al comparar estos resultados con aquellos encontrados en la literatura (ver Tabla 1), queda de manifiesto que las tasas de reducción de azufre obtenidas en este estudio son notablemente superiores a todas las reportadas, con la excepción de las obtenidas por Azabou et al (2007), la que se encuentra dentro del orden de las aquí reportadas.

Tabla 5. Velocidades de formación de H2S(g) por gramo de azufre suspendido (VHG) obtenidas en el reactor agitado mecánicamente

UG (m3N·m-2·s-1) VHG (mg H2S·(g S)

-1·d-1) 5,1·10-4 45,4 ± 4,0 1,4·10-3 53,0 ± 3,6 2,1·10-3 51,2 ± 1,7 3,7·10-3 52,0 ± 3,8 6,8·10-3 52,0 ± 4,1

53

4.3 DISEÑO Y CONSTRUCCIÓN DE REACTOR GASLIFT.

Como base de comparación entre el reactor agitado y el reactor gaslift en construcción, se consideró la velocidad superficial de gas utilizada en el reactor agitado de 2,1·10-3 m3N·m-2·s-1 (la que se utilizó la mayor parte del tiempo), equivalente a 0,94 v/v/m (volumen de gas por volumen de reactor por minuto). Considerando esta última relación para el reactor gaslift, se obtiene un flujo gaseoso de 9,5·10-5 m3/s, equivalente a una velocidad superficial de gas de la zona ascendente (UGR) de 2,5·10

-2 m3N·m-2·s-1, para un diámetro interno de tubo deflector de 7,02 cm (tubo deflector seleccionado para la construcción del reactor gaslift). Se planteó como requisito de diseño, un valor de kLa(H2) del mismo orden que el obtenido en el reactor agitado para la misma v/v/m. De acuerdo a los resultados experimentales con valores de kLa(H2) de ese orden no habría limitación por transferencia de masa gas líquido. La velocidad de circulación del líquido debe ser lo suficientemente elevada para asegurar un buen grado de mezcla (Bello et al, 1984; Chisti et al, 1988) y la suspensión de las bacterias. Vera (1995) encontró que operando un reactor gaslift a una velocidad de circulación del líquido de 1,2·10-1 m/s, logró la suspensión de bacterias reductoras de sulfato. De acuerdo a la Ecuación 25, para satisfacer este requisito de diseño se debe maximizar la diferencia (εGR - εGD) y minimizar el cuociente AR/AD. Por otra parte, Bello et al (1985a y 1985b) encontraron que el kLa aumenta con este cuociente, por lo tanto se requiere un cuociente AR/AD que optimice kLa y la velocidad de circulación del líquido. De acuerdo a la literatura disponible, se optó como criterio de diseño una relación AR/AD igual a 1 (Bello et al, 1984; Bello et al 1985a y 1985b; Chisti et al, 1988) y por una relación altura diámetro tubo externo igual a 7. Los parámetros geométricos del reactor determinados utilizando las correlaciones encontradas en la literatura fueron hB, hS, hd y el número de orificios del difusor de gas. Los resultados se resumen en la Tabla 3, y se estimaron de acuerdo a los criterios expuestos a continuación: Según la Ecuación 25, ULR aumenta al disminuir los coeficientes de pérdida friccional tanto en el fondo como en la parte superior del reactor. Estos coeficientes se minimizan al aumentar hB y hS, ya que de esa manera hay menos resistencia al paso del líquido. Sin embargo, existen efectos contrapuestos de hB sobre kLa en las correlaciones descritas por la Ecuación 26 y por la Ecuación 30, por lo que se tomó un valor intermedio de B igual a 0,5, para satisfacer los requisitos de kLa de diseño. Con este valor de B no se menoscaba la velocidad superficial del líquido, ya que su efecto según la ecuación 27 es positivo, mientras que según la Ecuación 31 es negativo, pero despreciable. Según la Ecuación 28 y la Ecuación 29, un valor bajo de B mantendrá una alta diferencia de Hold-up, lo que permitirá una alta velocidad del líquido, y el límite inferior a la que fueron obtenidas estas correlaciones es 0,5. Por lo tanto se diseñó el reactor con B = 0,5, lo que significó un valor de hB igual a 3,8 cm. Según la Ecuación 28 y la Ecuación 29, un alto valor de T genera una gran diferencia de Hold-up entre la zona ascendente y descendente, efecto deseable para obtener una buena circulación del líquido. También genera efectos positivos sobre kLa y ULR, según la Ecuación 30 y la Ecuación 31, respectivamente. Sin embargo, no genera efectos positivos sobre kLa, según la Ecuación 26, por lo que un valor de T intermedio igual a 2,8 satisface los requerimientos. Se obtuvo así un valor de hS igual a 13 cm.

54

Las burbujas pasan a través de orificios de diámetro 0,7 mm, distribuidos en un anillo ubicado en el punto medio entre la pared interior del reactor y la pared externa del tubo deflector, que conforma un espacio de 0,2827 metros (ver Figura 8). Tomando como referencia este último valor y utilizando la Ecuación 32, la Ecuación 33 y el requisito 3·dB, se calculó la cantidad de orificios mediante iteración, obteniéndose un total de 10 orificios. Se obtuvo un valor de Re0 de 350 y uno de QG0 igual a 9,5·10

-6 m3/s, valores que satisfacen las condiciones impuestas en la Ecuación 33 y en la Ecuación 34, para validar el empleo de la Ecuación 32.

4.4 CARACTERIZACIÓN HIDRODINÁMICA Y DE TRANSFERENCIA DE MASA DEL REACTOR GASLIFT.

Dado que el diseño se basó en correlaciones empíricas y modelos, es necesario realizar una caracterización del reactor para ratificar que se cumplen los requisitos de diseño y conocer las características hidrodinámicas del sistema. Los resultados de las mediciones de (kLa)H2 en función de la velocidad superficial de gas ascendente (UGR) para el reactor gaslift en un sistema de dos fases, se muestran en la Figura 19. Los resultados expuestos en la figura corresponden a aquellos medidos en la zona superior del reactor. También se determinó kLa en la base y en el punto medio del tubo deflector, siempre en la zona ascendente del reactor. Sin embargo la variación obtenida con respeto a la medición hecha en la zona superior del reactor es poco significativa en ambos casos (-0,4 % para la base y -1,1% para la medición realizada en el punto medio del tubo deflector). Por lo tanto se toma como valor representativo de kLa del reactor a aquel medido en la zona superior del reactor. No se midió kLa en la zona descendente, porque en esta zona el hold-up del gas y el grado de mezcla son menores que en el resto del reactor (Hwang y Lu, 1997). La determinación de kLa usando la Ecuación 36, requiere que el sistema esté perfectamente agitado. Esta condición se cumple si (kLa·tC)

-1 es mayor que 1 (Merchuk, 2003). En el presente estudio se cumple para todos los casos determinados. Para reactores altos con mayores tC, no se cumple esta condición y es necesario utilizar modelos más complejos para calcular kLa a partir de los datos experimentales. Dentro de estos modelos destacan los propuestos por Merchuk et al (1992) y Hwang y Lu (1997).

55

0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

0,025

0,030

0,035

0,040

0,000 0,010 0,020 0,030 0,040

UGR (m3N·m-2·s-1)

k La

(s-1

)

Figura 19. Variación de (kLa)H2 con UGR

El kLa aumenta con UGR, tal como en el caso del reactor agitado mecánicamente, por las mismas razones expuestas anteriormente. Los resultados experimentales concuerdan en orden de magnitud con muchos trabajos reportados en la literatura para reactores Gaslift (Gavrilescu y Tudose, 1998; Tobajas et al, 1999; Freitas y Teixeira, 2001). Los resultados experimentales obtenidos (en un rango de UGR comprendidos entre 6,0·10-3 y 3,6·10-2 m3N·m-2·s-1) se correlacionan según kLa = a UGR

b por:

Ecuación 47: kLa = 1,05 · UGR 1,02 R2 = 0,991

La Figura 20 muestra la relación del Hold-up gaseoso local descendente con la profundidad del reactor. Se observa un descenso del Hold-up con la profundidad, más rápido del que se esperaría por simple compresión hidrostática del gas, debido probablemente a que no todas las burbujas que ingresan al tubo deflector, la abandonan. También es posible observar que el hold-up aumenta con UGR para todas las profundidades estudiadas, ya que al aumentar UGR aumenta la cantidad de gas entrante y con ello la cantidad de burbujas.

56

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

15 25 35 45 55 65 75 85

Profundidad reactor (cm)

Hol

d-up

(fra

cció

n)Ug r= 0 ,011 m/s

Ug r= 0 ,016 m/s

Ugr = 0 ,020 m/s

Ugr = 0 ,024 m/s

Ugr = 0 ,032 m/s

Ugr = 0 ,036 m/s

Figura 20. Variación del Hold-up gaseoso local descendente con la profundidad del reactor, para distintos

valores de UGR.

El descenso de Hold-up observado en la Figura 20, corresponde a un decaimiento exponencial, para todas las UGR estudiadas, salvo para la velocidad menor. Este comportamiento concuerda plenamente con otros trabajos encontrados en la literatura (Herrera, 1982; Couvert et al, 1999). Conocida esta función, se calculó el Hold-up total descendente, utilizando la Ecuación 38 . En la Tabla 6 se resumen los parámetros del ajuste exponencial, el coeficiente R2 y el εGTD para cada valor de UGR estudiado. Los parámetros están referidos a una ecuación del tipo Ae-Bh, en donde h es la profundidad y e es la función exponencial. En el caso de la menor UGR se utilizó un valor promedio para estimar el εGTD, ya que no se obtuvo una significativa relación en este caso. No fue posible medir hold-up a profundidades menores a 20 cm, debido a la turbulencia imperante en esa zona.

Tabla 6. Resultados εGTD y ajuste exponencial.

UGR (m3N·m-2·s-1) A B (cm-1) R2 εεεεGTD (fracción)

1,1·10-2 --------- -------- ------- 0,009 1,6·10-2 0,080 0,029 0,896 0,028 2,0·10-2 0,114 0,029 0,962 0,036 2,4·10-2 0,117 0,028 0,835 0,042 3,2·10-2 0,121 0,021 0,993 0,056 3,6·10-2 0,106 0,015 0,995 0,061

57

El εGTD corresponde entonces al Hold-up característico de la zona de descenso, expresado simplemente como εGD. Los resultados experimentales obtenidos (en un rango de UGR

comprendidos entre 1,6·10-2 y 3,6·10-2 m3N·m-2·s-1) se correlacionan según εGD = a UGRb por:

Ecuación 48: εGD = 1,46 · UGR0,99 R2 = 0,929

Los resultados obtenidos son muy similares a los encontrados por Couvert et al (1999), quienes obtuvieron valores de 1,4 y 1 para los coeficientes a y b, respectivamente, para un rango de UGR entre 5,0·10-3 y 5,7·10-2 m3N·m-2·s-1. En la Figura 21 se muestran los resultados de la variación del Hold-up ascendente, descendente y global con UGR. También se muestra la variación que experimenta la diferencia entre hold-up ascendente y descendente con UGR.

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

0.08

0.09

0.000 0.010 0.020 0.030 0.040

UGR (m3N·m-2·s-1)

Hol

d-up

(fr

acci

ón)

Hold -up ascendente

Ho ld -up descendente

Diferencia Hold -up

Figura 21. Variación del Hold-up gaseoso ascendente, descendente, global y la diferencia entre hold-up ascendente y descendente, para distintos valores de UGR.

El Hold-up gaseoso ascendente puede correlacionarse con una expresión similar a la descrita para el descendente. En este caso es válida para valores de UGR comprendidos entre 1,1·10-2 y 3,6·10-2 m3N·m-2·s-1, y corresponde a la siguiente función:

Ecuación 49: εGR = 1,37 · UGR0,86 R2 = 0,992

Nuevamente se encontró una buena concordancia con los resultados de Couvert et al (1999), quienes encontraron una expresión similar con valores de 1,37 y 0,92 para los coeficientes a y b, respectivamente. Korpijarvi et al (1999) encontraron la misma función, con valores de 0,55 y 0,65 para los coeficientes a y b, respectivamente.

58

Se encontró la siguiente función entre εGD y εGR:

Ecuación 50: εGD = 1,019 εGR – 0,016 R2 = 0,991

La relación encontrada es diferente a aquella encontrada por Bello et al. para gaslift de tubos concéntricos (1985b), y ampliamente utilizada en trabajos posteriores: εGD = 0,89 εGR. Sin embargo, esta última relación fue obtenida para reactores gaslift con cuocientes AD/AR entre 0,11 y 0,69, en circunstancias que en el presente trabajo se utilizó un reactor con cuociente AD/AR igual 1. El Hold-up global se correlaciona con una expresión similar a las descritas para Hold-up ascendente y descendente. La correlación encontrada es la siguiente:

Ecuación 51: εG = 3,70 · UGR1,25 R2 = 0,991

Couvert et al (1999), encontraron una expresión similar con valores de 1,81 y 1,03 para los coeficientes a y b, respectivamente. Es interesante destacar la similitud encontrada entre el trabajo de Couvert et al y el realizado en esta oportunidad, a pesar del hecho de haber trabajado con gaslift de distinta geometría, ya que esa publicación se basó en un Airlift rectangular. Gavrilescu y Tudose (1998), encontraron valores de 1,89 y 1,20 para los coeficientes a y b, respectivamente. La diferencia de hold up ascendente y descendente (εGR - εGD) permaneció prácticamente constante en torno a 0,014, para valores de UGR superiores a 1,0·10

-2 m3N·m-2·s-1, pero con una leve tendencia a aumentar para UGR superiores a 3,1·10

-2 m3N·m-2·s-1. Para UGR ≥ 1,6·10-2 m3N·m-2·s-1, se observó que algunas burbujas de gas quedaban atrapadas en la zona descendente.

La Figura 22 muestra la variación de la velocidad de circulación del líquido (−

LV ), de ascenso (VLR) y descenso (VLD), al variar la velocidad superficial del gas. Se observa un aumento inicial de las 3 velocidades hasta UGR ≈ 1,6·10

-2 m3N·m-2·s-1, para luego alcanzar un plateau entre 1,6·10-2 y 2,1·10-2 m3N·m-2·s-1 de UGR.

59

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,000 0,005 0,010 0,015 0,020 0,025

UGR (Nm3·m-2· s-1)

VL

(m·s

-1)

Velocidad ascenso

Velocidad de circulación

Velocidad de descenso

Figura 22. Variación de la velocidad del líquido con UGR. Los valores corresponden al promedio de 30

determinaciones.

Este comportamiento es concordante con los resultados mostrados en la Figura 21, ya que la diferencia (εGR - εGD) es la fuerza motriz que permite la circulación del líquido, y si ésta permanece constante, también permanecerá constante la velocidad del líquido, hecho que sucede a partir de UGR mayor a 1,6·10-2 m3N·m-2·s-1. Estos hechos son también concordantes con la observación de algunas burbujas que entran en el tubo deflector, y que permanecen retenidas allí. Tanto VL como VLR, se ajustan adecuadamente al siguiente modelo:

Ecuación 52: GR

GR

L

L

Uk

U

V

V

+=

max

Para −

LV , se obtuvo VL max = 0,22 m/s y k = 1,9·10-3 m/s (R2 = 0,997). Para VLR, se obtuvo VLR max = 0,24 m/s y k = 2,8·10-3 m/s (R2 = 0,999) Couvert et al (1999), encontraron una tendencia similar a la reportada en este trabajo, con VL max = 0,25 m/s y k = 2,0·10-3 m/s. Benthum et al (1999) y Heijnen et al (1997) también reportaron similar tendencia, con valores de VL cercanos a los encontrados en esta ocasión. La evolución de la velocidad del líquido y del hold-up gaseoso observada en este trabajo, es similar a la descrita para los regímenes I y II de los regímenes de recirculación de burbujas en reactores gaslift (van Benthum et al, 1999; Heijnen et al 1997). En el régimen I, para velocidades de gas muy bajas, no hay burbujas de gas presentes en la zona de descenso, ya que la velocidad del líquido en esa zona es menor que la velocidad de deslizamiento promedio de las burbujas de gas en el líquido. El hold-up gaseoso en la zona de ascenso aumenta, mientras que en la zona descendente permanece con un valor igual a cero, por lo tanto la fuerza motriz para la

60

circulación, (εGR - εGD), aumenta y VLD aumenta con UGR. En el régimen II, VLD es igual a la velocidad de deslizamiento de las burbujas de gas, lo que conduce a que burbujas de gas permanezcan estacionarias en la zona descendente: la velocidad de las burbujas relativa al reactor es cero. La diferencia (εGR - εGD) es mayor a cero, pero permanece constante, ya que εGR y εGD aumentan a la misma tasa con el aumento de UGR. Por lo tanto, VLD permanece constante cuando UGR es aumentado. En el régimen III, VLD aumenta con UGR y luego toma valores más altos que la velocidad de deslizamiento. Las burbujas de gas recirculan junto con el líquido desde la zona descendente hacia la zona ascendente. εGR aumenta más rápido que εGD. Merchuk et al (1998), distingue entre un régimen de flujo homogéneo o régimen de flujo uniforme de burbuja, un régimen de flujo de transición y un régimen de flujo heterogéneo. El régimen homogéneo es equivalente a los regímenes I y II, y los regímenes de transición y heterogéneo son en su conjunto equivalentes al régimen III. La observación de burbujas atrapadas en la zona descendente, la diferencia de hold-up gaseoso y la velocidad del líquido constante para UGR > 1,6·10

-2 m3N·m-2·s-1, confirma la existencia de un régimen de flujo II en el reactor gaslift para UGR mayores a este valor. Sin embargo, para valores de UGR > 3,1·10

-2 m3N·m-2·s-1, podría el reactor estar entrando a régimen III, de acuerdo a los resultados de la diferencia de hold-up. La presencia de sólidos conduce a un aumento significativo de la viscosidad efectiva de la suspensión (µeff), y una mayor µeff aumenta la fricción de las paredes, por ende, se disminuye la velocidad del líquido. Por otra parte, los sólidos suspendidos disminuyen la fuerza motriz para la circulación del líquido, al cambiar las densidades medias en las zonas ascendente y descendente del reactor gaslift (Heijnen et al, 1997). Sin embargo, diferentes autores (Miyahara y Kawate, 1992; Lu y Hwang, 1995; Schlötelburg et al, 1999) encontraron que el aumento de la concentración de sólidos, para un rango de concentraciones de sólidos semejante a la utilizada en el presente trabajo, no conduce a cambios significativos de la velocidad del líquido. Schlötelburg et al (1999), encontraron una relación que correlaciona VL con UGR, con la viscosidad aparente y con el hold-up sólido. Los exponentes de la viscosidad aparente y el hold-up sólido, indican que su influencia sobre VL es más bien moderada. Por estas razones es que se llevaron a cabo las determinaciones del hold-up gaseoso y de la velocidad del líquido sin la presencia de bacterias y de partículas de azufre. El rompimiento de las burbujas de gas causado por la fase sólida, podría conducir a un aumento del hold-up gaseoso. Sin embargo, para las partículas de azufre utilizadas en el presente estudio de bioreducción (tamaño promedio de partículas de 30,7 µm) este fenómeno es poco probable, ya que Henriksen y Ostergaard (1974) encontraron un diámetro de partícula mínimo para el rompimiento de las burbujas de gas en agua igual a 8,5·10-3 m. Por otra parte, para partículas pequeñas, la coalescencia de burbujas puede conducir a una menor área interfacial gas-líquido y una subsiguiente reducción del hold-up gaseoso. Sin embargo, esta influencia ha sido detectada para una concentración de sólidos mayor que la empleada en el presente estudio (Miyahara y Kawate, 1992; Schlötelburg et al, 1999). Además en el presente estudio, no se detectaron diferencias significativas entre (kLa)H2 para sistemas de dos fases y tres fases, lo que indica que las partículas de azufre utilizadas no provocarían coalescencia de burbujas. De acuerdo a lo expuesto recientemente, la caracterización hidrodinámica y de transferencia de masa gas-líquido del reactor gaslift realizada para un sistema de dos fases es también satisfactoria

61

para un sistema de tres fases. Además, ya se ratificó este comportamiento para el reactor agitado mecánicamente. Para determinar el grado de mezcla del reactor fue necesario determinar el coeficiente de dispersión axial y el módulo de dispersión. Merchuk et al (1998), trabajando con un reactor gaslift de tubos concéntricos, encontraron una correlación para determinar el coeficiente de dispersión axial (D) en este tipo de reactores:

Ecuación 53:

4

··5

n

G

GRe

UdKD

=

ε

Donde:

K5 : constante ajustada por Merchuk et al de : diámetro equivalente n4 : constante ajustada por Merchuk et al

Las constantes K5 y n4 tienen un valor de 0,89 y 1,18, respectivamente (Merchuk et al, 1998), y corresponden a valores promedios de distintos tipos de difusores de gas empleados por los autores. Se encontró una baja variabilidad de los valores encontrados para K5 y n4 para los distintos tipos de difusores, por lo que el empleo de valores promedio es una buena estimación. El diámetro equivalente (de) viene dado por la siguiente expresión:

Ecuación 54: 2

DRe

DDd

+=

El reactor utilizado por Merchuk et al tenía un de igual a 0,060 m y un cuociente AR/AD igual a 1,01, mientras que el reactor gaslift del presente estudio tenía un de igual a 0,0702 m y un cuociente AR/AD igual a 1. Las similitudes entre ambos reactores, avalan el empleo de la Ecuación 53. Para UGR entre 1,6·10

-2 y 2,1·10-2 m3N·m-2·s-1, el coeficiente de dispersión axial fue de 4,1·10-2 m2·s-1. Este valor corresponde a un módulo de dispersión de 0,17, lo que representa una gran dispersión (Levenspiel, 2002). Esto implica que el patrón de mezclado de este reactor se asemeja más a un reactor perfectamente agitado que a uno de tipo pistón. Mediante los fundamentos y criterios de diseño del reactor gaslift, es posible diseñar los parámetros geométricos de este reactor, de tal manera de maximizar la velocidad de circulación del líquido. Pese a que Merchuk et al (1998) estudiaron el patrón de mezcla en un reactor gaslift de dos fases, la expresión que encontraron puede ser utilizada en el presente reactor, ya que la presencia de partículas de azufre no altera significativamente la hidrodinámica de un reactor de dos fases. Para el mismo rango de UGR, se calculó el número de Reynold (Re) considerando la velocidad de circulación del líquido. Se obtuvieron valores comprendidos entre 1,4·104 y 1,8·104, lo que indica condiciones de turbulencia. Estos resultados reafirman el buen grado de mezcla logrado en el reactor gaslift.

62

4.5 ESTUDIO CINÉTICO DE LA REDUCCIÓN DE AZUFRE MEDIADA POR BACTERIAS EN REACTOR GASLIFT

La cinética de bioreducción del azufre elemental fue estudiada durante 7 días y medio en el reactor gaslift. Se trabajó por menos tiempo que en el reactor agitado, para evitar problemas de disminución de la velocidad de reacción como los detectados en ese reactor. Durante estos 7 días y medio se trabajó con 6 velocidades superficiales de gas diferentes, partiendo con 4,2·10-3 y terminando con 2,3·10-2 m3N·m-2·s-1. Se utilizó azufre elemental en polvo igual al utilizado en el experimento del reactor agitado mecánicamente, es decir azufre ortorrómbico α-S8 de tamaño promedio de partículas de 30,7 µm. En la Figura 23 se presentan los valores promedios y los respectivos intervalos de confianza de la tasa de formación de H2S(g) y de la concentración de azufre suspendido para cada una de las UGR empleadas.

0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

UGR

(m3N·m-2·s-1)

Tas

a de

form

ació

n de

H2S

(m

g·L-1

·d-1)

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

Con

cent

raci

ón d

e az

ufre

(g·

L-1)

Figura 23. Tasa de formación de H2S(g) y concentración de azufre en función de la velocidad superficial

del gas en la zona ascendente.

Para el rango de UGR comprendido entre 4,2·10-3 y 1,3·10-2 m3N·m-2·s-1, la velocidad de formación de H2S(g) no experimentó ningún cambio significativo. La concentración de azufre suspendido aumentó con la velocidad superficial del gas hasta 7,1·10-3 m3N·m-2·s-1. Para UGR entre 7,1·10-3 y 1,3·10-2 m3N·m-2·s-1, la concentración de azufre permaneció constante. Para UGR ≥ 1,7·10-2 m3N·m-2·s-1, aumentó tanto la tasa de formación de H2S(g), como la concentración de azufre. El comportamiento que experimenta la concentración de azufre al aumentarse la UGR para los 4 primeros valores, es similar a aquel obtenido para la velocidad de circulación del líquido en función de UGR: un aumento inicial para luego alcanzar un plateau. Sin embargo, a partir de una UGR igual a 1,7·10

-2 m3N·m-2·s-1 comienza a aumentar la concentración de azufre suspendido. No

63

se cuenta con información acerca de la evolución de la velocidad de circulación del líquido para UGR mayores que 2,1·10-2 m3N·m-2·s-1, pero sí se sabe que la diferencia de hold-up entre la zona ascendente y descendente deja de ser constante y presenta un leve aumento para UGR mayores que 3,1·10-2 m3N·m-2·s-1, lo que estaría indicando un aumento de la velocidad de circulación del líquido. Esto trae como consecuencia un aumento del azufre suspendido, ya que la velocidad de circulación del líquido es la fuerza impulsora que mantiene a las partículas en suspensión. El líquido que circula por el loop formado dentro del reactor va suspendiendo partículas de azufre que se encuentran en el fondo del reactor.

En la Tabla 7, se presenta el porcentaje de azufre que se logra suspender desde el fondo del reactor gaslift para las concentraciones de azufre determinadas. Tal como se mencionó anteriormente la máxima velocidad de circulación que se logró medir fue de 2,0·10-1 m/s, valor insuficiente para suspender todo el azufre. Después del cuarto punto se registra un aumento del porcentaje de azufre suspendido hasta alcanzar un 54,5%, debido probablemente a un aumento de la velocidad de circulación del líquido. Sin embargo, no se pudo alcanzar mayor suspensión de azufre, debido a que se estaba trabajando a caudales muy altos de hidrógeno lo que hacía muy inestable e insegura la operación del reactor.

Tabla 7. Porcentaje de azufre suspendido desde el fondo del reactor gaslift para distintas UGR.

UGR (m3N·m-2·s-1) Concentración azufre (g/L) % Azufre suspendido

0,004 4,18 10,6 0,007 7,44 19,0 0,010 7,49 19,3 0,013 7,98 20,7 0,017 15,72 41,3 0,023 20,38 54,5

Tal como se vio en la Figura 23, un aumento de la concentración de azufre trae como consecuencia un incremento de la velocidad de formación de H2S(g) expresada en función del volumen de reacción. Para corregir esto y visualizar la evolución efectiva de la velocidad de formación de H2S(g), es necesario expresarla en función de la masa o superficie disponible de azufre. Realizando balances de masa del azufre remanente en el reactor y considerando el tamaño promedio inicial de partículas (30,7 µm), se calculó la variación en el tiempo del diámetro promedio de las partículas de azufre en el reactor (asumiendo que todas las partículas disminuyen uniformemente su tamaño). Con este valor y conociendo la masa de azufre suspendido, se calculó la superficie disponible de las partículas de azufre suspendidas. En la siguiente figura, se puede ver la velocidad de formación de H2S(g) en función de la masa y de la superficie total del azufre suspendido en el reactor.

64

0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.0250

10

20

30

40

50

60

70

80

90

UGR

(m3N·m-2·s-1)

Vel

ocid

ad d

e fo

rmac

ión

de H

2S (

mg·

g-1·d

-1)

300

400

500

600

700

800

900

1000

1100

Vel

ocid

ad d

e fo

rmac

ión

de H

2S (

mg·

m-2·d

-1)

Figura 24. Velocidad de formación de H2S(g) en función de la masa y de la superficie total del azufre

suspendido en el reactor

Al observar la figura, se aprecia que los primeros cinco puntos están en un rango acotado de valores, mientras que el último punto se escapa claramente. Este último punto se obtuvo en condiciones de alta inestabilidad del reactor en que no se pudieron tomar muchas muestras (N = 3), haciendo muy incierta esta medida. Para el rango de UGR comprendido entre 4,2·10-3 y 2,3·10-2 m3N·m-2·s-1, se encontró que la tasa de formación de H2S(g) expresada en volumen de reacción, aumentó linealmente con la concentración de azufre suspendido (r = 0,964), de manera similar a lo obtenido en el reactor agitado mecánicamente. Para este mismo rango de UGR, se encontró la siguiente expresión cinética general: ([S0] se refiere a la concentración de azufre activo expresado en mol·L-1)

Ecuación 55: [ ] 93.00121087,52

Sdr SH ⋅⋅= −−

La reacción fue de primer orden con respecto al azufre, con un coeficiente de correlación de pearson (r) de 0,927. El término de concentración de hidrógeno aparece implícito en la constante cinética, ya que se asume que está en exceso. En la Figura 25 se presentan los valores promedios y los intervalos de confianza de la concentración de sulfuro total en el reactor para cada una de las UGR empleadas. Su comportamiento es similar al obtenido para la concentración de azufre y para la tasa de formación de H2S(g), ya que permanece constante para un rango de UGR comprendido entre 4,2·10-3 y 1,0·10-2 m3N·m-2·s-1, y aumenta para UGR > 1,3·10

-2 m3N·m-2·s-1.

65

0.00

2.00

4.00

6.00

8.00

10.00

12.00

14.00

0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025

UGR (m3N·m-2·s-1)

Con

cent

raci

ón d

e su

lfuro

tota

l (m

g·L-1

S)

Figura 25. Concentración de sulfuro total en función de la velocidad superficial del gas en la zona

ascendente.

Las concentraciones de sulfuro detectadas en este reactor son bastante más bajas que aquellas reportadas como inhibitorias para bacterias reductoras (Okabe et al, 1992 y 1995; Reis et al, 1992), de acuerdo a lo discutido en la sección 4.2. Por lo tanto, hay una adecuada desorción del H2S(ac) con las velocidades superficiales de gas empleadas. Durante los 7,5 días de experimento, la concentración celular aumentó de 1,98·108 cel·mL-1 a 2,68·108 cel·mL-1. Conocido el valor de (kLa)H2 y asumiendo que la saturación de hidrógeno en el seno de la solución es de un 70%, se puede calcular la tasa de transferencia de hidrógeno. Para UGR = 2,3·10-2 m3N·m-2·s-1, ésta corresponde a 0,46 mol H2·L

-1·d-1, por lo que sería esperable una máxima velocidad de formación de H2S(g) de 15,5 g H2S·L

-1·d-1. Sin embargo, sólo se obtiene una velocidad de formación de H2S(g) de 1,6 g H2S·L

-1·d-1. Esto indica que no hay limitación por transferencia de masa de hidrógeno. En los experimentos realizados en el reactor gaslift se obtuvo una tasa promedio de formación de H2S(g) de 65,6 ± 7,0 mg H2S·(g S)

-1·d-1 (687 ± 71 mg H2S·(m2 S)-1·d-1), para un rango de UGR

comprendido entre 4,2·10-3 y 2,3·10-2 m3N·m-2·s-1.

4.6 COMPARACIÓN DE REACTORES

En la Figura 26 se comparan los resultados de las velocidades de formación de H2S(g) por gramo de azufre suspendido (VHG) en función del kLa, con sus respectivos intervalos de confianza, para los dos reactores utilizados en este estudio. El rango de kLa utilizado en ambos casos es similar,

66

salvo el primer punto del reactor gaslift, por lo que no se considera este punto en este gráfico ni en los siguientes. Las VHG obtenidas en el reactor agitado mecánicamente son prácticamente independientes del kLa, para valores mayores a 5,6·10-3 s-1. En el reactor gaslift también se obtiene una independencia de kLa hasta un valor de 2,2·10

-2 s-1. A partir de este valor, se obtiene un considerable aumento de VHG, pero atribuido a aspectos hidrodinámicos relacionados con la velocidad de circulación del líquido más que a transferencia de masa, de acuerdo a lo explicado anteriormente. Tal como se evidenció durante el trabajo experimental en ambos reactores, no hay limitación por transferencia de masa gas líquido.

0.0

20.0

40.0

60.0

80.0

100.0

120.0

0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 0.035

kLa (s-1)

VH

G (

mg

H2S

·(g·

S)-1

·d-1

) Reactor Gaslift

Reactor Agitado M ecánicamente

Figura 26. Velocidades de formación de H2S(g) por gramo de azufre suspendido (VHG) en función de kLa.

Para comparar reactores de diferentes dimensiones se suele emplear la expresión v/v/m o volumen de gas por volumen de reactor por minuto. Mediante esta expresión se corrige el caudal de entrada de gas con el volumen del reactor. En la siguiente figura se comparan las VHG obtenidas por cada reactor en función de v/v/m. El comportamiento observado es muy similar al de la figura anterior. En ambas figuras, se aprecia que los primeros puntos en ambos reactores están en un rango acotado de valores, mientras que el último punto del reactor gaslift se escapa claramente. Tal como se discutió previamente, este último punto se obtuvo en condiciones de alta inestabilidad del reactor en que no se pudieron tomar muchas muestras (N = 3), haciendo muy incierta esta medida.

67

0.0

20.0

40.0

60.0

80.0

100.0

120.0

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5

v/v/m

VH

G (

mg

H2S

·(g·

S)-1

·d-1

)

Reactor Gaslift

Reactor Agitado M ecánicamente

Figura 27. Velocidades de formación de H2S(g) por gramo de azufre suspendido (VHG) en función de

v/v/m.

Una característica importante de los reactores que permite compararlos es la potencia de agitación. La potencia suministrada al reactor gaslift se calculó asumiendo una expansión isotérmica del gas de entrada (hidrógeno), tal como se resume en la siguiente expresión:

Ecuación 56:

=

2

1·ln··p

pTRnP

Donde: P : potencia n : flujo de moles de gas a la entrada del reactor p1 : presión en la base del reactor p2 : presión de cabeza del reactor

Para el reactor agitado mecánicamente se calculó el cuociente entre la potencia consumida con aireación y aquella consumida sin aireación, de acuerdo a la Ecuación 57 (Hughmark, 1980):

Ecuación 57:

20,0

3/2

4225,0

0 ··

··

··1,0

−−

=

LLL

GG

VHg

dN

VN

V

P

P

Donde:

PG : potencia consumida con aireación P0 : potencia consumida sin aireación VG : flujo de gas VL : volumen fase líquida

68

N : velocidad de agitación d : longitud paleta de agitación (impeller) HL : altura líquido

Una vez calculado el cuociente anterior, se calculó P0 utilizando el diagrama de Martin (Nagata, 1975). Este diagrama presenta diversas curvas de correlación entre el número de potencia (NP) y el número de Reynolds (Re). Cada una de estas curvas representa un distinto tipo de impeller. Conocida la velocidad de agitación, se determinó el número de Reynols, de acuerdo a la siguiente expresión:

Ecuación 58: µ

ρ··Re

2 Nd=

Donde:

ρ : densidad del líquido µ : viscosidad dinámica del líquido N : velocidad de agitación d : longitud paleta de agitación (impeller)

Considerando que la velocidad de agitación en el reactor de agitación fue de 250 RPM y que la longitud de la barra magnética utilizada como impeller era de 6 cm, el Re alcanzado bajo las condiciones experimentales fue de 1,8·104; siendo del mismo orden de magnitud que el obtenido para el reactor agitado mecánicamente. Con este valor se interpoló el valor de NP utilizando la curva correspondiente al impeller más parecido a la barra magnética en el diagrama de Martin. El valor de NP fue de 4·10

-5. P0 se determinó de acuerdo a la siguiente ecuación:

Ecuación 59: 53

0

·· dN

PN P ρ

=

Con el valor interpolado de NP se obtuvo un valor de P0 igual a 0,072 W, equivalente a una potencia por unidad de volumen de 65 W/m3. En la Figura 28 se comparan los resultados de las velocidades de formación de H2S(g) por gramo de azufre suspendido (VHG) en función de la potencia suministrada, con sus respectivos intervalos de confianza, para los dos reactores utilizados en este estudio. Se observa claramente que la potencia suministrada al reactor gaslift es notoriamente menor que aquella suministrada al reactor agitado mecánicamente. Por lo tanto desde un punto de vista de potencia suministrada, es claramente conveniente el empleo del reactor gaslift, ya que se logra un patrón de mezclado aceptable, una buena suspensión de azufre y mayores VHG con menores consumos de potencia.

69

0.0

20.0

40.0

60.0

80.0

100.0

120.0

0 50 100 150 200 250Potencia suministrada (W/m 3)

VH

G (

mg

H2S

·(g·

S)-1

·d-1

)

Reactor GasliftReactor Agitado M ecánicamente

Figura 28. Velocidades de formación de H2S(g) por gramo de azufre suspendido (VHG) en función de la

potencia suministrada.

En los experimentos realizados en el reactor gaslift se obtuvo una tasa promedio de formación de H2S(g) de 65,6 ± 7,0 mg H2S·(g S)

-1·d-1 (687 ± 71 mg H2S·(m2 S)-1·d-1), para un rango de v/v/m

comprendido entre 0,17 y 0,93. Mientras que en el reactor agitado se obtuvo una tasa promedio de formación de H2S(g) de 50,7 ± 2,7 mg H2S·(g S)

-1·d-1 (513 ± 38 mg H2S·(m2 S)-1·d-1), para un

rango de v/v/m comprendido entre 0,22 y 2,97. La velocidad promedio de formación de H2S(g) obtenida con el reactor gaslift es un 30% superior a aquella obtenida con el reactor agitado. Esta diferencia puede deberse a que en la zona de ascenso del reactor gaslift, las burbujas de gas podrían flotar preferentemente las partículas de tamaño más pequeño dentro de la distribución de tamaños de las partículas de azufre presente en el reactor.

4.7 ESTUDIO DE ADHERENCIA BACTERIANA Y ANÁLISIS SUPERFICIAL DE PARTÍCULAS DE AZUFRE

Con el propósito de indagar con mayor profundidad las causas de la disminución de la velocidad de formación de H2S(g) detectada en el reactor agitado, se tomaron y analizaron microfotografías de partículas de azufre. En el día 8,5, cuando ya era evidente la disminución de la velocidad de formación de H2S(g) se tomó una muestra para realizar un análisis microscópico mediante la técnica SEM. Mediante las microfotografías obtenidas, se constató la existencia de adherencia bacteriana en la superficie de las partículas de azufre. Las bacterias adheridas pueden ser apreciadas en la Figura 29. Al comparar esta microfotografía con otra tomada a partículas de azufre sometidas a las mismas condiciones experimentales, pero sin la presencia de bacterias (Figura 30), se deduce que la formación de biofilm sólo tiene lugar en presencia de bacterias. Además queda de manifiesto que la superficie inicial de las partículas de azufre es prácticamente lisa y libre de imperfecciones. Un análisis de EDS realizado con la microfotografía mostrada en la Figura 30 indica que sólo había azufre.

70

Se ha encontrado que cultivos puros y mixtos de bacterias reductoras de sulfato cultivadas en laboratorio a menudo se adhieren a superficies (Nielsen, 1987). También se ha encontrado que pueden formar biofilms en materiales inertes de transporte bajo condiciones de flujo turbulento (van Houten el al, 1994; Hulshoff, 2004; Visser at al, 1993). Por otra parte, Espejo y Romero (1987) estudiaron crecimiento de Thiobacillus ferrooxidans en partículas de azufre elemental. Sin embargo, en el presente trabajo se reporta adherencia bacteriana en azufre elemental por parte de otro grupo diferente de bacterias: bacterias reductoras de azufre. El fenómeno descrito puede tener dos efectos contrapuestos en el diseño del reactor de este estudio; es posible que crezca un gran número de bacterias asociadas directamente a las partículas de azufre, aumentando y facilitando su biodisponibilidad o, puede resultar que se termine por ocluir el azufre en sus sitios de reacción, impidiendo la generación de azufre en fase acuosa, deteniendo así la reacción. La sostenida disminución de la velocidad de formación de H2S(g) obtenida a partir del día 4,5 de experimentación, indica que se está frente a la segunda alternativa.

Figura 29. Adherencia bacteriana en partículas de azufre en el reactor agitado mecánicamente. La foto fue

tomada el día 8,5. Mag. = 6,50 KX.

71

Figura 30. Microfotografía de una partícula de azufre en ausencia de bacterias. Mag. = 5,00 KX.

En la Figura 31 se muestra otra microfotografía de partículas de azufre del día 8,5. Se observa claramente que además de bacterias existen sustancias adheridas al azufre, las que ocupan la mayor cantidad de la superficie. Se realizó un análisis de EDS con la imagen mostrada en esta figura. Los elementos más abundantes en la superficie analizada fueron carbono, oxígeno y azufre, con abundancias atómicas de 58,3%, 28,5% y 3,11%, respectivamente. La razón de abundancias atómicas entre carbono y oxígeno es mayor a 2, lo que indica que las sustancias adheridas a las partículas de azufre son de origen orgánico ya que las sustancias inorgánicas poseen una razón de abundancias entre carbono y oxígeno menor a 1. Estas sustancias orgánicas detectadas pueden corresponder al film acondicionador de compuestos macromoleculares adsorbidos de un biofilm bacteriano.

72

Figura 31. Microfotografía de una partícula de azufre en el reactor agitado mecánicamente. La foto fue

tomada el día 8,5. Mag. = 15,00 KX.

De acuerdo a las microfotografías tomadas, no se detectó formación de biofilm compuesto de multicapas, sino más bien una monocapa. De haberse formado un biofilm compuesto de multicapas, las bacterias adheridas a las partículas de azufre podrían haber generado limitaciones de tipo difusionales tanto al acceso al azufre por parte de las bacterias de las capas superiores, como al acceso al hidrógeno por parte de las bacterias en las capas inferiores. Por otra parte, cuando se agregaron nuevas partículas de azufre, quedó disponible más área superficial para adherencia, lo que hubiese provocado una disminución de las bacterias suspendidas, lo que claramente no ocurrió (Figura 14, flechas 2 y 6). Esto significa que la adherencia no es un requisito necesario para llevar a cabo la bioreducción del azufre, ya que un aumento de la tasa de formación de H2S(g) se produjo inmediatamente después de que nueva superficie de azufre fuera agregada al reactor. Por lo tanto, limitaciones difusionales de esta naturaleza no parecen ser los fenómenos que expliquen la limitación por disponibilidad de azufre detectada anteriormente. Paralelamente a los análisis de microscopía electrónica, se hizo un análisis de rayos-X a una muestra de azufre sin reaccionar y a otra muestra de azufre reaccionado. Esta última muestra fue tomada 25 días después de la última adición de azufre al reactor (Flecha 2 en la Figura 12). Los resultados se muestran en la Figura 32.

73

Figura 32. Difractograma de partículas de azufre. En azul: azufre antes de la reacción. En rojo: azufre

después de 25 días de reacción.

Tal como puede apreciarse, no se obtuvieron diferencias entre los patrones de difracción de rayos-X para ambas muestras. En ambos casos estos patrones corresponden al azufre ortorrómbico α-S8 con densidad igual a 2,070 g/cm

3 y con celda unitaria: a = 10,45, b = 12,84 y c = 24,46. De manera complementaria a los análisis anteriores, se determinó el punto isoeléctrico para las mismas dos muestras de azufre. Esta determinación se hizo a través de mediciones de potencial zeta para diferentes valores de pH. Los resultados se muestran en la Figura 33. Se observa que hay diferencias significativas entre ambas muestras, ya que el punto isoeléctrico de las partículas de azufre sin reaccionar fue de 3,92, mientras que el de las partículas de azufre reaccionado fue de 4,70. Esto significa que se registran alteraciones de la carga superficial de las partículas de azufre después de 25 días de reacción. Esto puede deberse al aumento de la coordinación de las partículas de azufre durante el transcurso de la reacción o a la adsorción de compuestos con distinta carga superficial. Esta segunda opción estaría en concordancia con la formación de biofilm detectada mediante SEM, lo que significa que la limitación de disponibilidad de azufre detectada se debe a fenómenos superficiales de las partículas de azufre. Costa et al (2002), encontraron que el aumento del punto isoeléctrico de partículas de pigmentos con aditivos en comparación con partículas de pigmentos sin aditivos, era proporcional al porcentaje de cubrimiento de aditivo adsorbido en dichas partículas. En el presente estudio puede haber sucedido algo similar con las partículas de azufre y la formación de biofilm. De esta manera la medición de potencial zeta podría ser un indicador de la formación de biofilm.

74

2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0-35

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

5

10

15

20

25

3.92

4.70

Pot

enci

al Z

eta

(mV

)

pH

Figura 33. Potencial zeta de las partículas de azufre para diferentes valores de pH. En rojo: azufre antes de la reacción. En azul: azufre después de 25 días de reacción. Se indica el punto isoeléctrico para ambas

muestras.

Con la finalidad de estudiar la evolución de las características superficiales de las partículas de azufre, se realizaron determinaciones de potencial zeta de partículas tomadas del reactor gaslift. Se analizaron partículas de azufre al comienzo del experimento (El inicio del flujo de H2 fue considerado como tiempo cero) y después de 6 días de experimentación (6 días). Los resultados se muestran en la Figura 34. Se observa que hay diferencias significativas entre ambas muestras, ya que el punto isoeléctrico de las partículas de azufre en tiempo cero fue de 3,96, mientras que el de las partículas de azufre de 6 días fue de 4,77. Este comportamiento es similar al encontrado en el reactor agitado mecánicamente. Es importante señalar que se tomaron varias muestras durante el transcurso de la reacción en el reactor gaslift, pero al compararlas con las partículas antes de reacción sólo algunas muestras presentaban cambios significativos del punto isoeléctrico.

75

2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0-30

-20

-10

0

10

20

30

3,96

4,77

Pot

enci

al Z

eta

(mV

)

pH

Figura 34. Potencial zeta de partículas de azufre provenientes del reactor gaslift para diferentes valores de

pH. En rojo: azufre en tiempo cero. En azul: azufre después de 6 días de reacción. Se indica el punto isoeléctrico para ambas muestras.

Durante el transcurso del experimento en el reactor gaslift, se tomó una serie de microfotografías a las bacterias adheridas en las partículas de azufre, con el objetivo de captar la evolución del fenómeno de adherencia. En la Figura 35 y en la Figura 36 se muestran dos vistas de las partículas de azufre en ausencia de bacterias. En la Figura 37 se muestra una microfotografía de las partículas de azufre correspondiente a 35 minutos después del inicio del flujo de H2. Esta microfotografía fue tomada con el mismo aumento que la microfotografía de la Figura 35. Al comparar ambas microfotografías, se aprecia que sobre algunas partículas de azufre de la muestra de 35 minutos (círculos rojos), hay algún tipo de sustancia. En la Figura 38 y en la Figura 39, se presentan microfotografías con mayor aumento de la misma muestra, en donde se aprecia claramente la adherencia de bacterias. En la Figura 42 ya no se aprecian bacterias adheridas, sino más bien un entramado adherido a las partículas de azufre. Visualmente, este entramado presenta características típicas de las EPS. Esto significa que se está frente a una adherencia irreversible. Los resultados obtenidos por EDS para la última microfotografía son C = 68,32% O = 6,42% S = 25,26%. La razón C/O es mucho mayor a la esperada para compuestos de carbono inorgánico, por lo que es razonable esperar que se trate de compuestos orgánicos.

76

Figura 35. Microfotografía de partículas de azufre en ausencia de bacterias. Mag. = 500 X.

Figura 36. Microfotografía de partículas de azufre en ausencia de bacterias. Mag. = 1,00 KX.

77

Figura 37. Microfotografía de partículas de azufre después de 35 minutos del inicio del flujo de H2. Mag. =

500 X


5,00 KX

78


5,00 KX

Figura 40. Microfotografía de partículas de azufre después de 2,1 días del inicio del flujo de H2. Mag. =

5,00 KX

79


5,00 KX


5,00 KX

80

Según se discutió anteriormente, la formación de biofilm en las partículas suspendidas de azufre sería la causa de la disminución de la velocidad de formación de H2S (g) en el reactor agitado mecánicamente. En las partículas de azufre suspendidas en el reactor gaslift también se detectó la formación de biofilm, pero no así disminución de la velocidad de la reacción. Esta diferencia puede deberse a una menor cantidad de partículas de azufre con formación de biofilm en el reactor gaslift en comparación con las partículas de azufre presentes en el reactor agitado. Esto se puede corroborar analizando la Figura 37, en donde se observa claramente que sólo una pequeña cantidad de partículas presenta formación de biofilm. Los resultados obtenidos para las mediciones de potencial zeta de las partículas de azufre del reactor gaslift también estarían indicando que no todas las partículas tendrían desarrollo de biofilm. La formación de biofilm sólo en una pequeña fracción de las partículas de azufre del reactor gaslift, puede deberse a una menor cantidad de tiempo de reacción en comparación con el reactor agitado mecánicamente y al hecho de que no todas las partículas estaban suspendidas a la vez, existiendo la posibilidad de una renovación de partículas desde el fondo del reactor. La adherencia a sustratos hidrofóbicos como el azufre, es más lenta que en sustratos hidrofílicos. Esto permite tener un margen mayor de tiempo para observar los fenómenos asociados a la adherencia bacteriana. Por esta razón se tomaron microfotografías de partículas de azufre de muestras obtenidas durante todo el transcurso del experimento en el reactor gaslift. A la muestra del día 7,5 se le realizó un análisis de XPS, con el objetivo de indagar acerca de la naturaleza del biofilm, en particular de la composición de las EPS generadas por las bacterias. Las energías de enlace de los elementos detectados fueron determinadas usando la posición del carbono 1s a 284,8 eV (grafito) como referencia. El espectro obtenido se muestra en la Figura 43. Los elementos detectados fueron carbono, nitrógeno, oxígeno y azufre. Cada uno de los espectros de estos elementos está constituido de diferentes curvas gaussianas que representan distintos grupos funcionales. Para lograr el mejor ajuste de combinaciones lineales de curvas gaussianas se utilizó el criterio de χ2. La señal del C1s puede ser descompuesta en dos espectros con picos en 285,9 eV y 288,5 eV (χ2 = 0,63), con áreas relativas de 76,86% y 23,14%, respectivamente. Chan et al (2002), estudiando EPS producidos por bacterias reductoras de sulfato en acero dulce, detectaron el pico de 285,9 eV y lo atribuyeron a un carbono enlazado a oxígeno o nitrógeno, C-(O, N) (enlace simple). Gómez-Suárez et al (2002), estudiando EPS producidos por Pseudomonas aeruginosa en vidrio, también detectaron el mismo pico y también lo atribuyeron a un carbono enlazado a oxígeno o nitrógeno. Por otra parte, el segundo pico de carbono detectado, fue atribuido a un enlace doble de carbono-oxígeno (C=O) o a un carbono con enlaces simples a dos átomos de oxígeno (O-C-O), tanto por Chan et al (2002) como por Gómez-Suárez et al (2002). En la Figura 44 se muestra el espectro XPS del C1s.

81

Figura 43. Espectro XPS de partículas de azufre después de 7,5 días del inicio del flujo de H2.

Figura 44. Espectro XPS del carbón 1s de la muestra de partículas de azufre después de 7,5 días del inicio

del flujo de H2.

82

El azufre 2p presenta dos líneas espectrales: 2p3/2 y 2p1/2. De acuerdo a la expresión 2·n+1, la primera tiene una multiplicidad de espín igual a 4 y la segunda igual a 2. Esto significa que las señales 2p3/2 deben estar en una proporción 2:1 con respecto a las señales 2p1/2. Por esta razón se prefiere determinar los compuestos de azufre con las señales de 2p3/2. Los picos de las señales de las dos posibles configuraciones siempre se encuentran separadas a 1,18 eV. El espectro de alta resolución del azufre de la muestra de partículas de azufre se muestra en la Figura 45. Se observa que la señal del azufre pudo ser descompuesta en 6 curvas, de las cuales 3 corresponden a señales 2p3/2: 161,5 eV, 162,7 eV y 164,1 eV (χ2 = 0,94), con áreas relativas de 28,46%, 25,57% y 12,64%, respectivamente. Las otras 3 curvas corresponde a las señales 2p1/2 respectivas: 162,7 eV, 163,9 eV y 165,3 eV, con áreas relativas de 14,23%, 12,78% y 6,32%, respectivamente. Moulder et al (citado por Chan et al, 2002), atribuyeron el pico de azufre 2p3/2 de 162,7 eV al aminoácido metionina. Mientras que Kelemen et al (1990) atribuyeron el mismo pico al aminoácido cisteína. Ambos aminoácidos son constituyentes de las proteínas. El pico de 164,1 eV fue atribuido al azufre elemental por Brion (1980). El bajo porcentaje de azufre elemental es concordante con lo observado en la Figura 42, en donde se aprecia que gran parte de la superficie de azufre está cubierta con EPS.

Figura 45. Espectro XPS del azufre 2p de la muestra de partículas de azufre después de 7,5 días del inicio

del flujo de H2.

El nitrógeno presentó un pico para una energía de enlace de 399,5 eV. Chan et al (2002) también detectaron este pico y fue atribuido a aminas o amidas desprotonadas. Chan et al (2002), detectaron además un pico de carbono 1s para una energía de enlace 284,2 eV, correspondiente a un carbono enlazado a carbono o hidrógeno (C-(C, H)). Gómez-Suárez et al (2002), detectaron los 3 picos de carbono 1s detectados por Chan et al (2002), además de un pico

83

situado a una energía de enlace de 289,1 eV. Este pico fue atribuido por los autores a un carbono del grupo carboxilo, O=C-OH. Chan et al (2002), consideraron que las EPS estaban constituidas primordialmente por proteínas (Pr), polisacáridos (PS) y compuestos análogos a hidrocarburos (HC); mientras que Gómez-Suárez et al (2002), consideraron que estaban constituidas por estos componentes y por ácidos urónicos (UA). La presencia de ácidos urónicos se detecta a través del pico del carbono del grupo carboxilo (Gómez-Suárez et al, 2002). Por otra parte, la presencia de los HC es detectada exclusivamente a través del pico de carbono enlazado a carbono o hidrógeno (Chan et al, 2002). En la presente Tesis, no se detectaron los picos de carbono correspondientes a carbono enlazado a carbono o hidrógeno (C-(C,H) y carbono del grupo carboxilo (O=C-OH). Por lo tanto, sólo fue posible detectar proteínas y polisacáridos. La fracción de proteínas se determina a partir de la razón N/C y asumiendo que las proteínas tienen un contenido de nitrógeno de 28% (Gómez-Suárez et al, 2002). De esta forma, las EPS detectadas están constituidas aproximadamente por 73% de proteínas y 27% de polisacáridos. Gómez-Suárez et al (2002), encontraron que las EPS estaban constituidas por 2,7% de ácidos urónicos, 1,2% de compuestos análogos a hidrocarburos, 67,7% de proteínas y 28,4% de polisacáridos. Por otra parte, Chan et al (2002), encontraron que las EPS estaban constituidas por 60% de proteínas, 37% de polisacáridos y 3% de compuestos análogos a hidrocarburos. El alto contenido de proteínas detectado también se evidencia mediante la detección de aminoácidos como la cisteína y/o metionina detectados con la señal del azufre 2p3/2 y mediante la detección de la señal de aminas y amidas en la señal de nitrógeno. Al comparar la fracción de proteínas de las EPS detectadas por los autores antes mencionados y la encontrada en la presente Tesis, se puede concluir que mientras más hidrofóbica es la superficie del sustrato, mayor es el porcentaje de proteínas. En este caso sucede algo similar a lo enunciado por Gehrke (1998), en cuanto a que la composición de las EPS está influenciada por el sustrato a adherirse, ya que la hidrofobicidad del azufre estimula la producción de EPS más hidrofóbicas. Esta característica de las EPS se las confiere una mayor proporción de proteínas. En la adherencia bacteriana reportada en esta oportunidad, la componente hidrofóbica de la energía libre de Gibbs de adherencia parece ser la más relevante. Por otra parte, Dûfrene et al. (1996), encontraron que la adherencia de Azospirillum brasilense a sustratos hidrofílicos e hidrofóbicos ocurría sólo después de la producción de EPS y lo correlacionaron con un incremento del contenido de proteínas de las EPS en el transcurso del tiempo. DeFlaun et al. (1990), reportaron un aumento similar en la adherencia de Pseudomonas fluorescens asociado con altos contenidos de proteínas de las EPS.

4.8 ESTUDIO DE BIODIVERSIDAD BACTERIANA

Para llevar a cabo este estudio, se realizó un análisis de T-RFLP a una muestra tomada al comienzo del experimento de bioreducción de azufre elemental (tiempo cero) y otra al final (después de 7,5 días), en el reactor gaslift. A estas muestras se les denominó Muestra 1 y Muestra 2, respectivamente. De la Muestra 2 se separó el azufre mediante centrifugación, para realizar un ensayo de T-RFLP (Muestra 3) y así obtener el perfil de T-RFLP de las bacterias adheridas.

84

En la Figura 46, en la Figura 47 y en la Figura 48 se muestran los electroferogramas obtenidos con la enzima de restricción HAE III para las Muestras 1, 2 y 3, respectivamente. Sólo se consideraron los fragmentos de pares de bases con una abundancia relativa mayor a 1%, considerándose como ruido a aquellos fragmentos con abundancias menores a este porcentaje.

40 80 120 160 200 240 280 320 360 400 4400,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

247

229

17752

Abu

ndan

cia

rela

tiva

(%)

Tamaño fragmentos (pb)

Figura 46. Electroferograma Muestra 1.

85

40 80 120 160 200 240 280 320 360 400 4400,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

366

306

261

193

150

120

Abu

ndan

cia

rela

tiva

(%)



40 80 120 160 200 240 280 320 360 400 4400,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

296

193

156120

Abu

ndan

cia

rela

tiva

(%)



86

En las 3 figuras se observa gran cantidad de diferentes tamaños de fragmentos, lo que demuestra la existencia de un cultivo mixto en el reactor de reducción biológica de azufre. Originalmente en el laboratorio se contaba con una cepa pura de Desulfovibrio desulfuricans. Esta se ha utilizado en diversos bioreactores anaeróbicos a lo largo del tiempo, por lo que es esperable que junto a esta cepa se hayan desarrollado otras especies de bacterias adaptadas a condiciones anaeróbicas. La riqueza específica es 46, 35 y 32, para las muestras 1, 2 y 3, respectivamente. Con respecto a los perfiles de T-RFLP, se encontró que al comienzo del experimento los filotipos más abundantes (abundancia relativa > 3,0%) correspondieron a los fragmentos de 52 pb, 177 pb, 229 pb y 247 pb. Al final del experimento (muestra 2) no se detectaron los filotipos correspondientes a los fragmentos de 52 pb, 177 pb y 229 pb (abundancia relativa < 1,0%), mientras que el fragmento de 247 disminuyó su abundancia relativa de 3,0% a 1,9%. En esta muestra los filotipos más abundantes correspondieron a los fragmentos de 120 pb, 150 pb, 193 pb, 261 pb, 296 pb, 306 pb y 366 pb (abundancia relativa > 3%). Los fragmentos de 120 pb, 193 pb, 296 pb y 366 pb no se detectaron en la muestra 1, mientras que los fragmentos de 150 pb, 261 pb y 306 pb estaban presentes en la muestra 1 con abundancias relativas de 2,9%, 1,3% y 1,4%, respectivamente. Los filotipos más abundantes de la muestra 3 (abundancia relativa > 3%) correspondieron a los fragmentos de 120 pb, 124 pb, 156 pb, 193 pb, y 296 pb. Los fragmentos de 124 pb y 156 pb no se detectaron en la muestra 2. De los filotipos más abundantes de la muestra 2, aquellos correspondientes a los fragmentos de 50 pb y 306 pb, no fueron detectados en la muestra 3. Considerando los resultados obtenidos, queda en evidencia que se produjeron cambios en la distribución de los fragmentos durante el transcurso de la reacción. Estos cambios pueden producirse como consecuencia de variaciones que hayan experimentado variables fisicoquímicas del medio, tales como el potencial de óxido-reducción y la fuerza iónica. Anteriormente, en el reactor agitado mecánicamente, se detectó una sostenida disminución de esta variable durante el transcurso de la reacción (Sección 4.2), por lo que algunos filotipos pueden verse favorecidos en desmedro de otros, bajo estas nuevas condiciones. Debido a la poca precisión, propia de las bases de datos filogenéticas consultadas en la asignación de filotipos, no es posible utilizar la técnica de T-RFLP como una técnica de identificación, sino más bien permite detectar cambios en la composición y distribución de filotipos en las muestras analizadas. Para determinar con precisión los filotipos bacterianos es necesario clonar y secuenciar el gen 16S rDNA. De esta manera se obtienen genotecas que se comparan con los fragmentos obtenidos. No obstante lo anterior al comparar con la base de datos, se encontró que el fragmento 229 podría corresponder a Desulfotomaculum alkaliphilum, el 193 a alguna especie de Clostridium y el 199 a Desulfovibrio desulfuricans, todas especies reconocidas como reductoras de azufre. Al utilizar la enzima de restricción Msp1 para las mismas muestras, también fue posible encontrar posibles filotipos de Desulfovibrio desulfuricans y algunas especies de Clostridium, Desulfotomaculum y Thermotoga. Las especies del género Thermotoga desproporcionan azufre, pero no lo utilizan como aceptor terminal de electrones en su respiración. El fragmento correspondiente a este filotipo sólo se detectó en la Muestra 1. Al comienzo del experimento las condiciones eran menos reductoras que al final, lo que podría explicar la presencia de especies fermentativas especializadas en desarrollarse en ambientes carentes de dadores de electrones.

87

Los resultados obtenidos con ambas enzimas de restricción, muestran una alta coincidencia en la detección de los filotipos reductores de azufre. Sin embargo, los resultados son sólo una estimación, debido a las razones anteriormente señaladas. Los fragmentos menos abundantes pueden corresponder a filotipos que no tengan relación con la bioreducción de azufre elemental y que se encuentren en estado de latencia en el medio. La diversidad alfa también fue estimada mediante el índice de Shannon. Este índice se determinó a partir de los electroferogramas obtenidos con la enzima de restricción HAE III para las 3 muestras. También se determinó la biodiversidad máxima y el índice de Pielou. Estos resultados se resumen en la Tabla 8. Los altos valores del índice de Pielou obtenidos indican que las 3 muestras analizadas presentan una alta biodiversidad.

Tabla 8. Índices de biodiversidad para 3 muestras del reactor gaslift.

Muestra 1 (M1) Muestra 2 (M2) Muestra 3 (M3) Índice de Shannon 3,21 2,92 3,17 Diversidad máxima 3,83 3,56 3,69 Índice de Pielou 0,84 0,82 0,86

El Índice de Pielou no presentó diferencias significativas entre las muestras. Mientras que el Índice de Shannon presentó diferencias significativas entre las muestras 1 y 2 (t = 2,135; p = 0,018) y no presentó diferencias significativas entre las muestras 2 y 3. Las diferencias encontradas entre las muestras 1 y 2 mediante el Índice de Shannon, corroboran las observaciones planteadas anteriormente, referentes a cambios en la distribución de los fragmentos de los pares de bases de los perfiles de T-RFLP. La diversidad beta se determinó mediante el coeficiente de similitud de Sørensen, a partir de una matriz de ausencia/presencia de los fragmentos encontrados con el método T-RFLP. Los resultados se muestran en la Tabla 9.

Tabla 9. Coeficientes de similitud de Sørensen para las tres muestras del reactor gaslift.

IS M1 - M3 IS M1 – M2 IS M2 - M3 0,385 0,395 0,507

De acuerdo a los resultados presentados en la Tabla anterior, se deduce que la similitud entre las muestras 1 y 3 es comparable a aquella encontrada para las muestras 1 y 2, y que la similitud entre las muestras 2 y 3 es significativamente mayor que las otras dos. Entre las muestras 1 y 2 comparten 16 fragmentos, entre las muestras 2 y 3 comparten 17 y entre las muestras 1 y 3 comparten 15. Los fragmentos con una abundancia superior al 1%, presentes en las tres muestras son 7. La mayor similitud encontrada entre las muestras 2 y 3, corrobora los resultados encontrados con el índice de Shannon, en donde se encontró que la biodiversidad entre ambas muestras no presentó diferencias estadísticamente significativas. La mayor similitud también es concordante con el hecho de que ambas muestras provienen de la misma matriz. A partir de estos resultados se

88

puede afirmar que no existe una diferenciación estadísticamente significativa entre las bacterias adheridas y aquellas que permanecen suspendidas. La diversidad beta también fue determinada mediante dos pruebas estadísticas de análisis multivariado: un análisis de componentes principales (PCA) y un análisis jerárquico aglomerativo (clusters). En ambos casos se utilizó como variables la abundancia relativa de los fragmentos de pares de bases. En la Figura 49 se muestra el dendograma obtenido con el análisis de clusters para las tres muestras analizadas.

Distancia

0

0.4

0.8

1.2

1.6

2

2.4

Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3

Figura 49. Dendrograma obtenido con análisis de clusters para las tres muestras.

Los resultados presentados en el dendrograma indican un agrupamiento similar al encontrado con el coeficiente de similitud: una mayor similitud entre las muestras 2 y 3. Sin embargo, el grado de similitud entre estas dos muestras expresado en distancia euclidiana, es relativamente bajo. En la Figura 50 se muestra el gráfico del análisis de componentes principales para las muestras 1, 2 y 3.

89

Componente 1

Com

ponente 2

Muestra 1

Muestra 2

Muestra 3

-0.7 -0.5 -0.3 -0.1 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9-0.9

-0.6

-0.3

0

0.3

0.6

0.9

Figura 50. Gráfico de PCA para las muestras del reactor gaslift.

Los resultados presentados en la Figura 50 indican que la muestra 1 aparece claramente distanciada de las muestras 2 y 3. Estas a su vez, se encuentran más agrupadas, pero a una distancia considerable, lo que confirma los resultados obtenidos por los análisis anteriores. Los dos primeros componentes explican el 80,5% de la varianza total (componente 1: 52,6% de la varianza; componente 2: 27,9% de la varianza). Los fragmentos 75 pb, 114 pb, 120 pb, 145 pb, 177 pb, 193 pb, 229 pb, 292 pb, 353 pb y 366 pb estaban altamente relacionados con el componente 1. Mientras que los fragmentos 124 pb, 156 pb, 296 pb y 306 pb estaban altamente relacionados con el componente 2. Resultados similares a los encontrados con la enzima de restricción HAE III, fueron obtenidos al utilizar la enzima de restricción Msp1. A la luz de los resultados obtenidos empleando la técnica de T-RFLP, se puede afirmar que en el reactor gaslift de bioreducción de azufre elemental existe un cultivo mixto de bacterias que experimenta cambios en la distribución de sus poblaciones, favoreciéndose las de mayor adaptabilidad a las condiciones imperantes en el reactor. Estos cambios poblacionales pueden deberse a variaciones de las propiedades fisicoquímicas del medio, como el potencial de óxido reducción o la fuerza iónica. No existe una diferenciación estadísticamente significativa entre las bacterias adheridas y aquellas que permanecen suspendidas.

4.9 ESTUDIO DE INTERMEDIARIOS DE LA REACCIÓN

Se estudió la presencia de posibles intermediarios de la reacción, mediante la determinación de las especies sulfato, tetrationato, sulfito, metabisulfito y tiosulfato en el reactor gaslift. Con el objetivo de descartar posibles interferencias de la matriz, se analizó también sulfuro, cloruro y bicarbonato.

90

Se utilizó un rango de concentraciones comprendido entre 25 y 200 ppm para todos los analitos estudiados. El límite de detección instrumental determinado según procedimiento descrito por Skoog y Leary (1994), fue de 2 ppm. Los tiempos de retención para cada compuesto se presentan en la Tabla 10. No se registraron señales para cloruro y bicarbonato, pese a que ambos presentan absorción en la región UV.

Tabla 10. Tiempos de retención de estándares y sus respectivos intervalos de confianza, utilizados en estudio de intermediarios de la reacción.

S4O62- SO3

2- SO42- S2O3

2- S2O52- HS-

Tiempo (min) 15,68 ± 0,08

6,06 ± 0,04 6,07 ± 0,09 14,71 ± 0,42

6,63 ± 0,11 2,46 ± 0,01

Nota: se presenta la especie más abundante bajo las condiciones de pH de la fase móvil (pH = 9,5) En la Figura 51 se muestra el cromatograma correspondiente a una muestra tomada del reactor gaslift. Se realizó otra determinación de intermediarios con resultados similares. La señal del primer compuesto eluido fue mucho más intensa, pero para fines comparativos sólo se muestra una parte de su señal.

Figura 51. Cromatograma muestra reactor gaslift.

91

En el cromatograma anterior se observan 3 picos nítidos en 2,45, en 5,73 y en 14,47 minutos, con áreas de 11865379, 163274 y 734197, respectivamente. Al comparar con los tiempos de retención de los estándares (Tabla 10), se deduce que el primero de los compuestos en eluir corresponde al sulfuro. Este se encuentra en una proporción notablemente mayor que los otros dos compuestos detectados, lo que es concordante con el hecho de que el sulfuro es el producto final de la reacción estudiada. El compuesto que eluye a los 14,47 minutos se encuentra dentro del intervalo de confianza del tiempo de retención del tiosulfato, por lo que se trataría de este compuesto. El tiosulfato puede provenir de la oxidación de polisulfuros en presencia de Fe(III) (Schippers y Sand, 1999):

Ecuación 60: +++ ++

−+→++ HFeSn

OSHOHFeSH n 66·8

236 2

832223

2

Sin embargo, en el medio de cultivo (en la solución de oligoelementos) sólo hay presente Fe(II) y no Fe(III), por lo que parece poco plausible la reacción anterior. El tiosulfato también podría provenir de la reacción entre el ión HS- y el tetrationato (Klimmek et al, 1991):

Ecuación 61: ( ) +−+

−−− +++→++ HnSOSnHSnOSn n )·1(·2·1· 21

232

264

El tetrationato no fue detectado en este estudio, pero debido a la presencia de tiosulfato se infiere que podría producirse este politionato y reaccionar muy rápido, o permanecer en condiciones muy bajas, indetectables con el método empleado en esta oportunidad. El tiempo de retención del otro compuesto detectado (5,73 minutos) no coincide con ninguno de los estándares. Se encuentra cerca del intervalo de confianza del tiempo de retención del sulfato, sin embargo la señal del estándar del sulfato siempre se presentó con un pico hacia abajo de la línea base. En consecuencia se trataría de un compuesto diferente a los analizados. En el presente estudio no se detectó sulfato, lo que indicaría que no tiene lugar una reacción de desproporción de azufre paralelamente a la reacción de reducción del mismo. Esto es concordante con el hecho de que no se detectaron filotipos asociados a la desproporción de azufre al final del experimento. También existe la posibilidad de que se hubiese formado sulfato, pero que éste se haya reducido rápidamente a sulfuro, o bien que haya precipitado ante la presencia de calcio del medio de cultivo. Sin embargo, las condiciones reductoras imperantes en el reactor hacen muy improbable la formación de sulfato. Durante el transcurso de la reacción, en los dos tipos de reactores empleados, siempre se detectó un alza de pH, la que se contrarrestaba automáticamente mediante inyección de CO2. Esta alza es similar a la que se produce al utilizar sulfato como aceptor terminal de electrones. Se ha establecido que el transporte activo de sulfato es el causante de la alcalinización del medio, ya que este transporte se lleva a cabo en simporte con dos protones (Cypionka, 1989; Warthmann y Cypionka, 1990). El hecho de que también suceda esta alcalinización al utilizar azufre elemental,

92

hace suponer que existiría un mecanismo similar de transporte con alguna especie aniónica de azufre, por ejemplo un polisulfuro. El compuesto detectado en el tiempo de retención de 5,73 minutos podría corresponder a un polisulfuro del tipo [Sn-1

(0)S(2-)]2-, ya que estos compuestos también presentan absorción en esta zona de la región UV (Giggenbach, 1972). Sin embargo, los espectros individuales de los diferentes polisulfuros no han podido obtenerse. Teder (1969) modeló numéricamente los espectros, asumiendo la coexistencia de combinaciones de diferentes polisulfuros con cadenas de átomos de azufre entre 2 y 5. Schwarzenbach y Fischer (1960) también dedujeron una distribución completa de polisulfuros. Giggenbach (1972) estudió la evolución de las bandas de absorción en el espectro electrónico en un amplio rango de pH alcalino y concluyó que el polisulfuro más grande era el pentasulfuro. Para extraer las constantes termodinámicas, él asumió que sólo el tetra y el pentasulfuro eran importantes en un amplio intervalo de condiciones experimentales. Debido a la rápida reacción de desproporción de los polisulfuros (Ecuación 62), a su alta reactividad, a su inestabilidad termodinámica y a la carencia de estándares de los mismos, ha sido muy difícil desarrollar un método de cuantificación de polisulfuros individuales.

Ecuación 62: −+

−−

− +↔ 21

21

22 nnn SSS

Sólo recientemente, Kamyshny et al (2006) lograron desarrollar un método para la determinación de miembros individuales de familias de polisulfuros inorgánicos en muestras reales. Este método consiste en la detección de dimetilpolisulfuros en HPLC-UV, generados a partir de la reacción entre metil trifluorometanosulfonato y los polisulfuros inorgánicos.

4.10 MODELACIÓN MATEMÁTICA DEL REACTOR AGITADO

Una vez finalizado el estudio experimental, se recolectó toda la información necesaria para plantear el conjunto de ecuaciones que describen la reducción anaeróbica y autotrófica de azufre elemental mediada por bacterias. Con esta información se desarrolló el correspondiente modelo matemático dinámico. Para llevar a cabo el modelamiento, se consideró un bioreactor CSTR de mezcla perfecta, operando en las mismas condiciones del reactor agitado mecánicamente descrito en las secciones anteriores. El desarrollo del modelo consistió en el planteamiento de los balances de masas para todos los componentes presentes en la fase líquida y fase gas del sistema, además del crecimiento celular. Para este último caso se consideró una cinética de crecimiento celular clásica de tipo Monod. La optimización de parámetros se llevó a cabo considerando los resultados experimentales de los primeros 8 días de experimento del reactor agitado mecánicamente, ya que posterior a ese tiempo se agregó nuevas partículas de azufre.

93

Hipótesis del modelo: El modelo fue desarrollado considerando las siguientes hipótesis: • El bioreactor agitado mecánicamente es de mezcla perfecta y opera a temperatura constante

(30°C) y pH = 7. • Existe una relación bien definida entre los rendimientos celulares de la fuente de carbono, el

producto metabólico y el aceptor y el donador de electrones (Sáez, 2001). Además se asume que estos rendimientos celulares son constantes.

• La desorción de H2S es lo suficientemente eficiente como para no considerar la inhibición por este producto.

• El consumo de sustrato para mantenimiento está incorporado en el coeficiente de rendimiento celular.

• La resistencia a la transferencia a través de la película de líquido en torno a las burbujas de gas es la resistencia más importante. Esta resistencia se describe adecuadamente por el coeficiente combinado de transferencia de masa gas líquido, kLa.

• Se puede despreciar la concentración de H2S(g) en el reactor considerando que es atrapado en su totalidad en las trampas de NaOH.

• Las concentraciones de CO2(g) y H2(g) se consideran constantes, ya que para el período considerado no se cambió el flujo de gas.

• La fuerza iónica del sistema estudiado es pequeña, por lo que no afecta los equilibrios de ionización. De esta manera no es necesario corregir las constantes cinéticas reportadas en la literatura a fuerza iónica nula

• Existen dos grandes grupos de bacterias; aquellas que están suspendidas y las que están adheridas.

• La velocidad máxima de crecimiento específico celular y el rendimiento no se ven afectados por la adherencia.

• El mecanismo de adherencia es de tipo Langmuir: a) la velocidad de adherencia es proporcional a la superficie desocupada y a la concentración de bacterias suspendidas; b) la velocidad de desorción es proporcional a la concentración de bacterias adheridas (Fehrmann, 1989)

• En una primera etapa de formación de biofilm, la acumulación de microorganismos en la superficie corresponde a la suma de los procesos de adherencia (Ra), crecimiento y desorción (Rd). Se considera que la adherencia es reversible y que las bacterias adheridas replican hacia la superficie (Fehrmann, 1989)

• Una vez que el biofilm alcanza saturación, se considera que está en estado estacionario y las bacterias irreversiblemente adheridas replican hacia la solución.

Balances de masa: Crecimiento celular: Se considera que el crecimiento celular, tanto de las bacterias adheridas como de las suspendidas, procede de acuerdo a una relación tipo Monod con un sustrato limitante (Bailley, 1986). Según los antecedentes de la literatura (Schauder y Kröger, 1993), un aceptor de electrones probable es el tetrasulfuro (S4

2-):

94

Ecuación 63: [ ]

[ ]−

−

+⋅=

241

24

SK

S

SMAXµµ

Donde:

KS1 : constante de afinidad respecto de tetrasulfuro (M) Los paréntesis cuadrados indican concentraciones molares. Velocidad de adherencia (Ra): las bacterias se adhieren en la superficie disponible hasta alcanzar saturación:

Ecuación 64: [ ] [ ]( )( )σ⋅−+⋅= ASATSAa XXXkR

Donde:

kA : constante cinética de adherencia (h-1) [XS] : concentración de bacterias suspendidas (células/L) XSAT : número máximo de sitios de adherencia (células/m2) [XA] : concentración de bacterias adheridas (células/m2) σ : cuociente superficie disponible/volumen líquido del reactor (m2/L)

Velocidad de remoción (Rd): paralelamente al proceso de adherencia se produce desorción de bacterias:

Ecuación 65: [ ] σ⋅⋅= Add XkR

Donde:

kd : constante cinética de desorción (h-1) Cuociente superficie disponible/volumen (σ): depende del radio de las partículas de azufre (r):

Ecuación 66: reactorvolumen

partículasdeNúmeror ⋅⋅⋅=24 πσ

Radio partículas de azufre: la variación del radio de una partícula de azufre se estimó considerando que la cantidad de sustancia reactante es proporcional a la superficie disponible del núcleo sin reaccionar (Levenspiel, 2002).

Ecuación 67: [ ]

B

SkHSb

dt

dr

ρ⋅⋅

−=−

Donde:

95

kS : coeficiente cinético para la reacción en la superficie (m·h-1) ρB : densidad molar azufre (64,7 mol·L-1) b : coeficiente estequiométrico del azufre en la Ecuación 2

Bacterias suspendidas: se encuentran suspendidas en la fase acuosa del reactor. La siguiente ecuación representa el balance de masa respectivo:

Ecuación 68: [ ] [ ] ( )daS

S RRXdt

Xd−−⋅= µ

Bacterias adheridas: se adhieren a la superficie de las partículas de azufre. La siguiente ecuación representa el balance de masa respectivo:

Ecuación 69: [ ] ( ) [ ]A

daA XRR

dt

Xd⋅+

−= µ

σ

Tetrasulfuro: se considera que este ion es el aceptor terminal de electrones. La siguiente ecuación representa el balance de masa respectivo:

Ecuación 70: [ ] [ ] [ ]( ) [ ] 1000

24

24 ⋅⋅⋅+

⋅+−= −

−

−

σσµ

S

SX

AS kHSY

XX

dt

Sd

Donde:

−24SX

Y : Coeficiente de rendimiento celular respecto del tetrasulfuro (células/mol S42-).

Hidrógeno disuelto: el hidrógeno disuelto proviene de la fase gas, desde donde se transfiere mediante el difusor de gases. La siguiente ecuación representa el balance de masa respectivo:

Ecuación 71: [ ] ( ) [ ] [ ]( ) [ ] [ ]( )

2

22 222

HX

ASacHgHL

ac

Y

XXHHHak

dt

Hd σµ ⋅+−−⋅⋅=

Donde:

2HXY = 1/3· −24SX

Y

(kLa)H2 : coeficiente combinado de transferencia de masa gas líquido para H2 (h-1)

HH2 : constante de Henry para el equilibrio gas – líquido de H2 (molac/molgas)

96

Ion sulfuro ácido: este ion proviene de su equilibrio de ionización con el ácido sulfhídrico. La siguiente ecuación representa el balance de masa respectivo:

Ecuación 72: [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] 100012211 ⋅⋅⋅−⋅⋅−⋅= −+−

−

σSkHSHHSkSHkdt

HSd

Donde:

k11 : constante cinética de la reacción directa de la disociación del ácido sulfhídrico (29,88·106 h-1).

k12 : constante cinética de la reacción inversa de la disociación del ácido sulfhídrico (2,7·1014 M-1 h-1).

Ácido sulfhídrico: el ácido sulfhídrico corresponde al producto metabólico de las bacterias. La producción de este compuesto está relacionada directamente con el rendimiento celular respecto del tetrasulfuro. La siguiente ecuación representa el balance de masa respectivo:

Ecuación 73:

[ ] [ ] [ ] [ ] ( ) [ ] [ ] [ ] [ ]( )−

⋅+⋅+

−⋅−⋅−⋅⋅= +−

24

2

2

42

2211122

SX

AS

SH

g

acSHLac

Y

XX

H

SHSHakSHkHHSk

dt

SHd σµ

Donde:

(kLa)H2S : coeficiente combinado de transferencia de masa gas líquido para H2S (h-1)

HH2S : constante de Henry para el equilibrio gas – líquido de H2S (molgas/molac) Dióxido de carbono acuoso: proviene de la fase gas desde donde se transfiere mediante el difusor de gases en el control de pH. Además, está en equilibrio con el bicarbonato presente en el medio de cultivo. Considerando constante el rendimiento de biomasa formada por mol de dióxido de carbono consumido, se obtiene el siguiente balance de masa:

Ecuación 74:

[ ] [ ] [ ] [ ] ( ) [ ] [ ]( ) [ ] [ ]( )

2

22 222313322

COX

ASacgCOCOLac

ac

Y

XXCOCOHakCOkHHCOk

dt

COd σµ ⋅+−−⋅⋅+⋅−⋅⋅= +−

Donde: (kLa)CO2 : coeficiente combinado de transferencia de masa gas líquido para CO2 (h

-1)

2COXY = 10,78· −24SX

Y

HH2S : constante de Henry para el equilibrio gas – líquido de CO2 (molac/molgas) k31 : constante cinética de la reacción directa de la disociación del dióxido de

carbono (30,6 h-1).

97

k32 : constante cinética de la reacción inversa de la disociación del dióxido de carbono (72·106 M-1 h-1).

Ion Bicarbonato: este ion está presente en el medio de cultivo y está en equilibrio con el dióxido de carbono. Para el pH de operación, la concentración de carbonato es despreciable, por lo que no se considera como especie en equilibrio del ion bicarbonato. La siguiente ecuación representa el balance de masa respectivo:

Ecuación 75: [ ] [ ] [ ] [ ]+−

−

⋅⋅−⋅= HHCOkCOkdt

HCOdac

ac332231

3

Protones: se consumen durante la reducción del azufre elemental y están en equilibrio con el ácido sulfhídrico y con el ion sulfuro ácido. La siguiente ecuación representa el balance de masa respectivo:

Ecuación 76:

[ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ]( ) [ ] 100023133212211 ⋅⋅⋅+⋅+

−⋅+⋅⋅−⋅⋅−⋅= −+−+−+

+

σσ

µ S

HX

ASac kHS

Y

XXCOkHHCOkHHSkSHk

dt

Hd

Donde:

+HXY : Coeficiente de rendimiento celular respecto de los protones (cél/mol H+).

Transferencia de masa gas-líquido y condiciones iniciales Los coeficientes combinados de transferencia de masa de las especies involucradas se determinaron de acuerdo a la Ecuación 37, y utilizando el valor obtenido experimentalmente para oxígeno como referencia. En este contexto, se utilizaron valores de kLa para hidrógeno, ácido sulfhídrico y anhídrido de carbono de 33,48 h-1, 9,84 h-1 y 12,06 h-1, respectivamente. Los valores utilizados de la constante de Henry (a 30ºC) para H2, CO2 y H2S fueron 0,019 (molac/molgas), 0,7435 (molac/molgas) y 0,4404 (molgas/molac), respectivamente. El bioreactor se operó a 30°C, pH neutro y una presión de 1,5 psig durante 8 días. El H2 fue alimentado continuamente a una velocidad superficial de gas (UG) de 2,1·10

-3 m3N·m-2·s-1. El control de pH fue mediante inyección de CO2, en una relación 1:10 con respecto a la inyección de H2. La inyección de CO2 no fue continua, ya que dependía del alza de pH. Si se corrige esta alimentación por el intervalo de inyección de CO2 para obtener una alimentación continua de ambos gases, se obtiene una mezcla de H2 y CO2 en una relación volumétrica de 97% v/v y 3% v/v, respectivamente. Considerando la presión de vapor del agua para las condiciones de operación (0,042 atm), se calcularon las concentraciones de los gases involucrados en el sistema. La concentración de H2(g) fue de 0,0414 M y la de CO2(g) fue de 0,0013 M. De acuerdo a las hipótesis del modelo se consideró que la concentración de H2S(g) fue cero.

98

Para establecer las condiciones iniciales del modelo se utilizaron las observaciones experimentales para la biomasa suspendida, ión sulfuro ácido, ácido sulfhídrico, bicarbonato y radio promedio de las partículas de azufre. Para las restantes especies químicas se consideraron condiciones de equilibrio. La concentración inicial de biomasa suspendida fue de 4,0·109 cel/L, la concentración inicial de bicarbonato fue de 2,98·10-2 M, la del ácido sulfhídrico y la del ion sulfuro ácido fue de 5,88·10-5 M (calculada a partir de la medición de sulfuro total). La concentración inicial de CO2(ac) se estimó considerando equilibrio con el HCO3

-, en 6,70·10-3 M. Se consideró que la concentración inicial de bacterias adheridas era cero. La concentración inicial de H2(ac) se estimó a partir de su concentración en fase gas para las condiciones de operación y considerando una saturación del 70% (Sáez, 2001), resultando 5,51·10-4 M. La concentración inicial de tetrasulfuro se estimó en 5,0·10-7 M. El radio promedio inicial de las partículas de azufre fue de 15,35 µm y el número inicial de partículas fue de 1,28·109. De acuerdo a las dimensiones de una bacteria se calculó que 592 bacterias cubrirían completamente toda la superficie de una partícula de azufre. Sin embargo, tal como se apreció en las microfotografías, sólo una parte de la superficie se cubre de bacterias (aproximadamente el 32% del total de la superficie), ya que hay una gran cantidad de superficie ocupada por EPS. De este modo se consideró un número máximo de 192 bacterias por partícula, por lo que XSAT se estimó en 6,5·1010 cel/m2. A partir de los datos experimentales se determinó que el coeficiente de rendimiento celular respecto de azufre elemental fue de 1,58·1012 cel·(mol S0)-1. Dado que no se determinó tetrasulfuro, el coeficiente de rendimiento de esta especie se estimó considerando su relación estequiométrica con el azufre elemental. De este modo el coeficiente de rendimiento celular respecto del tetrasulfuro fue de 4,74·1012 cel·(mol S4

2-)-1. Estimación de parámetros: Los parámetros a optimizar en el modelo son:

1. Velocidad máxima de crecimiento específico celular, µmax. 2. Constante de afinidad al aceptor terminal de electrones, kS1. 3. Constante cinética de adherencia, kA. 4. Constante cinética de desorción, kd. 5. Coeficiente cinético para la reacción en la superficie, kS

Resultados: Se pudo ajustar adecuadamente el modelo para la concentración de bacterias suspendidas y para el radio promedio de partículas de azufre. No fue posible lograr lo mismo para la concentración del ion sulfuro ácido. El ajuste de parámetros arrojó un valor mínimo de la función objetivo de 0,729, considerando sólo las dos primeras variables mencionadas. En la siguiente figura se muestran los resultados del modelo contrastados con los datos experimentales para bacterias suspendidas. La bondad de ajuste del modelo se determinó mediante test de χ2. La discrepancia entre los valores experimentales y simulados fue

99

estadísticamente poco significativa, ya que se obtuvo un valor de χ2 de 1,42·10-5 (p = 0,997; gl = 9). Esto significa que el modelo desarrollado verificó adecuadamente un buen ajuste para una función de velocidad específica de crecimiento celular de tipo Monod con un sustrato limitante.

0.0E+00

2.0E+09

4.0E+09

6.0E+09

8.0E+09

1.0E+10

1.2E+10

1.4E+10

0 25 50 75 100 125 150 175 200 225

Tiempo (horas)

Con

cent

raci

ón d

e cé

lula

s su

spen

dida

s (c

el/L

)

Modelo

Datos experimentales

Figura 52. Resultado de la modelación y datos experimentales para la biomasa suspendida

En la siguiente figura se muestran los resultados del modelo contrastados con los datos experimentales para bacterias suspendidas y radio promedio de partículas de azufre. La bondad de ajuste del modelo se determinó mediante test de χ2. La discrepancia entre los valores experimentales y simulados fue estadísticamente poco significativa, ya que se obtuvo un valor de χ2 de 49,59 (p = 1,00; gl = 121).

100

1.20E-05

1.25E-05

1.30E-05

1.35E-05

1.40E-05

1.45E-05

1.50E-05

1.55E-05

1.60E-05

0 25 50 75 100 125 150 175 200

Tiempo (horas)

Rad

io p

rom

edio

de

partí

cula

s (m

)

Modelo

Datos experimentales

Figura 53. Resultado de la modelación y datos experimentales para el radio promedio de las partículas de

azufre.

En la siguiente tabla se presentan los resultados de la optimización:

Tabla 11. Parámetros óptimos del modelo matemático.

µmax (h-1) kS1 (M) kA (h

-1) kd (h-1) kS (m·h-1)

5,1·10-3 8,7·10-3 1·10-1 6.5·10-5 6,5·10-1 El valor de µmax obtenido en el presente trabajo es comparable con µmax obtenido por Zavarzina et al (2000), pese a que esos autores trabajaron con bacterias heterótrofas termofílicas. En la siguiente figura se presentan los resultados de la simulación de la concentración de bacterias adheridas. La curva obtenida corresponde a una isoterma de tipo Langmuir, tal como era de esperarse. De acuerdo a la figura, al cabo de unas 25 horas se alcanzan valores cercanos a XSAT, siendo muy rápida la adherencia en las primeras horas. En este estudio no se midió la concentración de bacterias adheridas. Sin embargo, se puede comparar esta simulación con resultados experimentales obtenidos por otros autores. Por ejemplo, Solari et al (1992) encontraron curvas similares trabajando con Thiobacillus ferrooxidans en pirita y calcopirita, minerales con puntos isoeléctricos parecidos a los de las partículas de azufre. Es evidente que la adherencia depende del pH, de la agitación, de la hidrofobicidad y la carga superficial tanto de las bacterias como del sustrato de adherencia, por lo que la comparación es sólo para establecer el orden de magnitud.

101

0.0E+00

1.0E+10

2.0E+10

3.0E+10

4.0E+10

5.0E+10

6.0E+10

7.0E+10

8.0E+10

0 25 50 75 100 125 150 175 200 225

Tiempo (horas)

Bac

teria

s ad

herid

as (

cel/m

2 )

Figura 54. Resultado de la modelación de la evolución de la biomasa adherida.

El hecho de que se alcancen valores en torno a XSAT, no significa que esté toda la superficie cubierta, ya que además de las propias bacterias habría formación posterior de EPS o compuestos orgánicos, tal como se pudo apreciar en las microfotografías. De acuerdo a la hipótesis desarrollada en secciones anteriores, el desarrollo del biofilm en su conjunto, esto es bacterias y EPS más un posible aumento de coordinación de las partículas de azufre serían los causantes de la disminución de la velocidad de la reacción. El modelo desarrollado no contempla la formación de EPS, por lo que sería importante desarrollar como trabajo futuro un modelo fenomenológico que incorpore la formación de sustancias poliméricas extracelulares en las partículas de azufre.

102

CAPÍTULO 5. CONCLUSIONES Los resultados obtenidos demuestran la factibilidad de llevar a cabo la reducción de azufre elemental en un reactor agitado mecánicamente y en un reactor gaslift utilizando bacterias mesofílicas reductoras de azufre. Mediante el control adecuado de las variables pH, temperatura y Eh se propiciaron las condiciones ideales para el desarrollo de las bacterias reductoras de azufre utilizadas en la presente Tesis. Los resultados experimentales mostraron que la principal limitante de la velocidad de reacción es la disponibilidad de superficie activa de las partículas de azufre. Esta se va disminuyendo a medida que se recubre con biofilm, compuesto tanto por bacterias como por sustancias poliméricas extracelulares. La presencia de bacterias adheridas a la superficie de las partículas de azufre pudo ser detectada mediante microfotografías tomadas con SEM. Por otra parte, utilizando la técnica XPS, fue posible determinar la composición química de las sustancias poliméricas extracelulares. Para los dos reactores estudiados se encontró que la reacción es de primer orden con respecto al azufre y el hidrógeno no tiene mayor efecto sobre ésta. En el caso del reactor agitado mecánicamente esto es válido para el rango de velocidad supercial de gas comprendido entre 1,4·10-3 y 6,8·10-3 m3N·m-2·s-1. Para el reactor gaslift esto es válido para un rango de UGR comprendido entre 4,2·10-3 y 2,3·10-2 m3N·m-2·s-1. Se pudo comprobar que no hay limitación por transferencia de masa gas líquido del hidrógeno. Tampoco se evidenciaron problemas por inhibición por producto (ácido sulfhídrico). Sólo se presentaron problemas de desorción del ácido sulfhídrico para una velocidad de gas igual a 5,1·10-4 m3N·m-2·s-1, en el reactor agitado mecánicamente. Se pudo constatar que una de las variables críticas del reactor gaslift es la velocidad de circulación del líquido, ya que de ella depende el grado de mezcla y la adecuada suspensión de las partículas de azufre. Mediante los fundamentos y criterios de diseño del reactor gaslift, es posible diseñar los parámetros geométricos de este reactor, de tal manera de maximizar la velocidad de circulación del líquido. A la luz de los resultados obtenidos empleando la técnica de T-RFLP, se puede afirmar que en el reactor gaslift de bioreducción de azufre elemental existe un cultivo mixto de bacterias que experimenta cambios en la distribución de sus poblaciones, favoreciéndose las de mayor adaptabilidad a las condiciones imperantes en el reactor. Estos cambios poblacionales pueden deberse a variaciones de las propiedades fisicoquímicas del medio, como el potencial de óxido reducción o la fuerza iónica. No existe una diferenciación estadísticamente significativa entre las bacterias adheridas y aquellas que permanecen suspendidas. Mediante el estudio de intermediarios de la reacción, fue posible detectar tiosulfato. Este compuesto podría provenir de la reacción entre el ión HS- y el tetrationato. También fue posible detectar otro compuesto más, cuyo tiempo de retención no coincidió con ninguno de los

103

estándares empleados. Este compuesto podría corresponder a un polisulfuro del tipo [Sn-1(0)S(2-)]2-,

ya que estos compuestos también presentan absorción en esta zona de la región UV. Se constató que para llevar a cabo el proceso de bioreducción de azufre elemental es más conveniente el empleo del reactor gaslift que el reactor agitado mecánicamente, ya que se logra un patrón de mezclado aceptable, una buena suspensión de azufre y mayores velocidades de formación de producto para menores consumos de potencia. Mediante el desarrollo de un modelo fenomenológico que describió la bioreducción de azufre elemental, se determinaron los parámetros cinéticos de la reacción en el reactor agitado mecánicamente. Se pudo ajustar adecuadamente el modelo para la concentración de bacterias suspendidas y para el radio promedio de partículas de azufre. No fue posible lograr lo mismo para la concentración del ion sulfuro ácido. Una vez realizadas todas las actividades propuestas, es posible concluir que el objetivo general propuesto fue cumplido, ya que fue posible llevar a cabo la bioreducción de azufre elemental en un reactor agitado mecánicamente y en un reactor gaslift. Los objetivos específicos propuestos fueron logrados satisfactoriamente, ya que se lograron identificar las variables críticas del sistema y las etapas limitantes de la velocidad de la reacción, se logró estudiar la adherencia bacteriana, se pudieron identificar posibles intermediarios de la reacción y fue posible determinar parámetros cinéticos mediante el desarrollo de un modelo fenomenológico. La hipótesis postulada fue probada satisfactoriamente, gracias a los resultados obtenidos. En resumen se ha conseguido avanzar en el estado del arte de la investigación de la bioreducción de azufre elemental.

104

CAPÍTULO 6. RECOMENDACIONES Como trabajo futuro queda propuesto investigar el mecanismo de la disolución de azufre elemental y la formación de polisulfuros del tipo [Sn-1

(0)S(2-)]2-, en presencia del ión sulfuro ácido, mediante el empleo de métodos de reciente desarrollo como el propuesto por Kamyshny et al (2006). Una vez estudiado esto, se podría dilucidar cuál polisulfuro es el aceptor terminal de electrones en la bioreducción de azufre elemental. Este estudio también daría pie para investigar el transporte activo del aceptor de electrones a través de las células bacterianas y su rol en la alcalinización del medio durante la reacción de reducción de azufre.

También se propone estudiar la cinética de la reacción en un sistema compuesto por dos reactores conectados en serie con recirculación interna, pero sin contacto bacteria-sólido. Este sistema debería tener un reactor agitado con el azufre suspendido y un bioreactor con las bacterias suspendidas, ambos con medio de cultivo. Las conexiones hidráulicas entre ambos reactores deben estar provistas de filtros, para que no se contacten las bacterias con las partículas de azufre. Así se evitaría la adherencia bacteriana y el consiguiente agotamiento prematuro de superficie reactiva de las partículas de azufre. Tanto el aceptor de electrones (pj el ion tetrasulfuro) como el agente nucleofílico (HS-), podrían traspasar sin problemas los filtros. De esta manera se asegura la respiración celular y la reacción de rompimiento de anillos S8. En la siguiente figura se presenta el esquema propuesto:

Figura 55. Esquema propuesto de sistema experimental para estudiar reducción de azufre sin contacto con

bacterias.

Por último se propone incorporar el desarrollo de un modelo fenomenológico que incorpore la formación de sustancias poliméricas extracelulares en las partículas de azufre.

105

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113

APÉNDICES

114

APÉNDICE A. Determinación velocidad de agitación reactor agitado mecánicamente

La velocidad de agitación crítica (Nf) para suspender las partículas de azufre se determinó de acuerdo a la siguiente expresión (Nagata, 1975):

Ecuación A 1

7.0'9/13/2

3/13/2 ·····

−=

−−

p

p

LL

Lspif V

VdDKN

ρµ

ρρρ

Donde:

K : constante de proporcionalidad dp : diámetro de partícula (mm) µ : viscosidad (cp) ρL : densidad del líquido (g/mL) ρS : densidad del sólido (g/mL) Vp : volumen verdadero de las partículas Vp

` : volumen bulk de las partículas Considerando una constante K igual a 160 (Nagata, 1975), se determinó que Nf tenía un valor igual a 254 RPM. Sin embargo, este valor se corrigió para la cantidad de azufre presente según procedimiento descrito por Nagata (1975), resultando un valor de 219 RPM. Para asegurar la suspensión completa se agitó el reactor a una velocidad igual a 250 RPM.

115

APÉNDICE B. Resazurina como indicador de anaerobiosis. La resazurina es una oxazona de color azul en soluciones acuosas oxigenadas. Sometido a condiciones reductoras, la resazurina cambia de color desde azul a rosado y después a incoloro, cuando el oxígeno es limitante en el medio (Twigg, 1945). La primera etapa de reducción se debe a la pérdida de un átomo de oxígeno débilmente enlazado al nitrógeno del núcleo de la fenoxazina. Esta etapa de reducción es irreversible y el compuesto formado corresponde a la resorufina (7-hidroxi-3H-fenoxazina-3-ona). La segunda etapa de reducción es reversible, y en ella tiene lugar la transformación de resorufina a dihidro-resorufina (10H-fenoxazina-3,7-diol), compuesto incoloro que por oxidación puede pasar de nuevo a resorufina (Figura A 1). La reducción de la resorufina (color rosado) a dihidro-resorufina (incoloro) tiene lugar cuando el Eh adquiere un valor menor o igual a -100 mV (Twigg, 1945). Es esta última reacción la que se utiliza como indicador de anaerobiosis, por lo que la ausencia de color del indicador indica un resultado positivo de anaerobiosis.

O

N+

O OH

O-

O

N

O OH

OH

N

O OH

H

-[O] 2H+ 2e-

Resazurina (azul) Resorufina (rosado)

Dihidro - resorufina (incoloro)

Figura A 1. Formación de compuestos reducidos de la resazurina.

116

APÉNDICE C. Procedimiento T–RFLP En la Figura A 2 se muestran las diferentes etapas de la técnica T-RFLP. En primer lugar se extrae el DNA, para luego realizar un PCR con Primers no marcados simple usando distintos volúmenes de DNA con el objeto de determinar la cantidad óptima a usar en los PCR con Primers marcado. Después se hace el PCR marcado por triplicado y se mezcla el producto obtenido, para tener una cantidad adecuada de DNA para las etapas siguientes y minimizar errores. Se purifican los productos de PCR, para eliminar primers marcados y otro tipo de material que pueda interferir posteriormente. Luego se cuantifica la concentración de DNA, para digerir los productos de PCR con las respectivas enzimas de restricción y finalmente se realiza la electroforesis. Las distintas electroforesis mostradas permiten verificar el correcto funcionamiento de cada etapa.

Figura A 2. Etapas involucradas en el desarrollo de T-RFLP (Fuente: Morales G, 2006).

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Extracción de DNA Para la extracción de DNA de las muestras 1 y 2, se utilizó el Kit de extracción UltraClean Soil DNA Isolation Kit de MoBIO Labs. Para la extracción de DNA de la muestra de azufre se utilizó el Kit de extracción de DNA Kit PowerMaxSoil DNA Isolation Kit de MoBio Labs. Ambos Kit constan de las soluciones S1, S2, S3, S4, S5, PowerBead e IRS (Inhibitor Removal Solution). Traen también filtros spin. El protocolo de extracción es el siguiente: 1. A los tubos con 2 mL de solución PowerBead se le agrega la cantidad de muestra necesaria que contenga entre 0,25 y 1 gramo de biomasa. 2. Revolver suavemente 3. Revisar la solución S1. Si esta solución ha precipitado, calentarla hasta 60ºC hasta que se disuelva, antes de ocuparla. 4. Agregar 60 µL de solución S1 y agitar (Vortex 3 a 4 segundos). 5. Agregar 200 µL de solución IRS. Se requiere sólo si el DNA se utilizará para PCR. (Vortex 3 a 4 segundos). 6. Asegurar los tubos en Vortex. Calentar a 70ºC por 5 minutos y después agitarlos en el Vortex por 3 a 5 segundos. Repetir una vez. 7. Asegurarse que los tubos de 2 mL roten libremente en la centrífuga sin restregarse. Centrifugar los tubos a 13000 RPM por 30 segundos. 8. Transferir el sobrenadante a un tubo microcentrífugo limpio. 9. Agregar 250 µL de solución S2 y agitar en Vortex por 5 segundos. Incubar a 4ºC por 5 minutos. 10. Centrifugar los tubos por 1 minuto a 13000 RPM. 11. Transferir el volumen completo de sobrenadante a un tubo microcentrífugo limpio, evitando transferir el pellet. 12. Agregar 1 mL de solución S3 al sobrenadante y agitar en vortex por 5 segundos. 13. Cargar aproximadamente 700 µL a un filtro spin y centrifugar a 10000 x g por un minuto. Descartar el filtrado, y agregar el resto del sobrenadante al filtro spin y centrifugar a 10000 x g

118

por un minuto. Repetir hasta que todo el sobrenadante haya pasado por el filtro. NOTA: un total de 3 cargas para cada muestra procesada es requerida. 14. Agregar 300 µL de solución S4 y centrifugar a 30 segundos por 10000 x g. 15. Descartar el filtrado. 16. Centrifugar de nuevo por 1 minuto. 17. Colocar cuidadosamente el filtro spin en un nuevo tubo limpio. Evitar salpicar la solución S4 en el filtro spin. 18. Agregar 50 µL de solución S5 al centro de la membrana blanca del filtro. 19. Centrifugar por 30 segundos. 20. Descartar el filtro spin. El DNA en el tubo está listo para ser aplicado. Se recomienda guardar el DNA congelado (-20ºC). La solución S5 no contiene EDTA. Amplificación del 16S rDNA mediante PCR Las condiciones que se usan para la realización del PCR con primers marcados o no marcados son las mismas y se entregan a continuación. Las concentraciones de los reactivos se muestran en la Tabla A 1. El volumen final de la reacción es 25 µL.

Tabla A 1. Concentraciones de los reactivos utilizados en PCR.

Reactivo Concentración final Partidor forward 0,5 µM Partidor reverse 0,5 µM Nucleótidos 200 µM Buffer Taq 1 X MgCl2 2 mM

Taq Polimerasa 2,5 U La cantidad de DNA genómico a utilizar para el PCR marcado se determina realizando tres reacciones simultáneas de PCR con distintas diluciones de DNA en el volumen final de reacción. Purificación y cuantificación de DNA La purificación de los productos de la reacción de PCR con primers marcados se lleva a cabo mediante el kit comercial QIAquick Gel Extraction Kit Protocol, de Qiagen, siguiendo el protocolo descrito por el fabricante. La cuantificación se realiza mediante espectrofotometría con luz ultravioleta a una longitud de onda de 260 nm.

119

Digestión de productos de PCR y electroforesis capilar La digestión se realiza en un volumen final de reacción de 20 µL. Las concentraciones de los reactivos se detallan en la Tabla A 2. En esta etapa se utilizan dos enzimas de restricción (MspI y Hae III), en dos digestiones separadas.

Tabla A 2. Concentraciones de los reactivos utilizados en la digestión.

Reactivo Concentración final Producto PCR purificado 18 ng/µL MspI (Hpa II) / Hae III 15 U

Buffer MspI (Hpa II) / Buffer Hae III 1 X Para asegurar una reacción completa, la digestión se realiza a 37ºC durante 3 horas. La electroforesis capilar es realizada por la empresa Genética y Tecnología limitada. La concentración mínima de DNA a enviar es de 10 ng/µL y el volumen mínimo es 5 µL. Procesamiento de resultados de electroforesis capilar Los pasos a realizar en esta etapa son los siguientes: 1. Redondear largos de TRF: se redondea a un número entero los largos entregados por la electroforesis capilar. 2. Se eliminan los largos extremos: se considera el rango de largos entre 35 y 490 pb, por la capacidad de resolución que posee el estándar de tamaño molecular que se usa en la corrida electroforética (GeneScan-500 Size Standard). 3. Revisión de largos: si al redondear se obtienen dos picos con largos iguales, se transforman en 1, con intensidad igual a la suma de las intensidades de ambos picos. 4. Cálculo porcentaje de presencia de cada pico (altura relativa): se realiza el cálculo para cada uno de los picos que se encuentran en la muestra, mediante la siguiente ecuación:

Ecuación A 2 %100⋅=∑n

i

ii

picoAltura

picoAlturapicorelativaAltura

5. Estimación de la diversidad bacteriana: se comparan los largos obtenidos experimentalmente con los obtenidos a partir de un T-RFLP virtual (usando la misma combinación primer-enzima que en el T-RFLP real), y se asigna la bacteria correspondiente al largo encontrado.

120

APÉNDICE D. Fotografías del montaje experimental

Figura B 1. Montaje experimental

121



122

APÉNDICE E. Programa desarrollado para la integración de las ecuaciones del modelo y el ajuste de parámetros

Archivo modelo2.m: function [dx]=modelo2(t,x) umax=0.0051; %(1/h) ks1=0.0087; % M kA= 0.1; % (1/h) kd= 0.000065; % (1/h) kS= 0.65; % (m/h) yxs4=4.74e12; %bacterias/mol % ctes cineticas de equilibrios de ionizacion k32=72e6;%(1/(h*M)) constante cinetica inversa CO2 (ac) k31=30.6;%(1/h) constante cinetica directa CO2 (ac) k11=29.88e6; %(1/h) constante cinetica directa H2S k12=2.7e14; %(1/(h*M)) constante cinetica inversa H2S %coeficiente combinado (1/h) klaco2 = 12.06; klah2 = 33.48; klah2s = 9.84; % cte Henry Hco2 = 0.7435; %cte Henry CO2 (conc. sat, molar fase ac/ conc. molar fase gas) Hh2 = 0.019; %cte Henry H2 (conc. sat, molar fase ac/ conc. molar fase gas) Hh2s = 0.4404; %cte Henry H2S (conc. sat, molar fase gas/ conc. molar fase ac) %Gases en el sistema (M) h2g = 0.0414; co2g = 0.0013; h2sg = 0; %Otras constantes rho= 64.7; % densidad molar azufre (mol/L) N= 1.28e9; % numero inicial de particulas de azufre Xsat= 6.5e10; % (bacterias/m2) t0=0; tf=200.7; ux=umax*x(7)/(ks1+x(7)); sigma= 4*pi*(x(3)^2)*N/1.075; Ra=kA*(x(1)+(Xsat-x(5))*sigma); Rd=kd*x(5)*sigma; dx(1)= x(1)*ux+Rd; %biomasa suspendida dx(2)= -k12*x(2)*1e-7-x(2)*kS*sigma*1000 +k11*x(6); %HS- dx(3)= -3*x(2)*kS/rho; %radio particulas azufre dx(4)= klah2*(Hh2*h2g-x(4))-3*ux*(x(1)+x(5)*sigma)/yxs4; %hidrogeno acuoso dx(5)= ux*x(5)+(Ra-Rd)/sigma; %biomasa adherida dx(6)= k12*x(2)*1e-7-k11*x(6)-klah2s*(x(6)-h2sg/Hh2s)+4*ux*(x(1)+x(5)*sigma)/yxs4; %H2S dx(7)= -ux*(x(1)+x(5)*sigma)/yxs4 +x(2)*kS*sigma*1000; %tetrasulfuro dx(8)= k31*x(9)-k32*x(8)*1e-7;%HCO3-

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dx(9)= klaco2*(Hco2*co2g-x(9))+k32*x(8)*1e-7-k31*x(9)-ux*(x(1)+x(5)*sigma)/(10.78*yxs4); %CO2 dx=[dx(1) dx(2) dx(3) dx(4) dx(5) dx(6) dx(7) dx(8) dx(9)]'; Archivo Programa2.m: clc clear x0=[4.0e9 5.88e-5 15.35e-6 5.51e-4 0 5.88e-5 5e-7 2.98e-2 6.70e-3]; load 'Datos_exp.txt'; z=Datos_exp(:,:); nptos=size(z,1); md3=max(Datos_exp(:,3)); md2=max(Datos_exp(:,2)); md4=max(Datos_exp(:,4)); tpo=z(:,1); bio=z(:,2); sul=z(:,3); azu=z(:,4); %calculo de los valores teoricos (integrados) para cada tiempo experimental y=x0; %valores iniciales x=(xo,so) teo(1,:)=y; for i=2:nptos delta=(tpo(i)-tpo(i-1))/2; for p=1:2 iniciar=tpo(i-1)+(p-1)*delta; finalizar=tpo(i-1)+p*delta; [t,x]=ode23tb('modelo2',[iniciar finalizar],y); tam=size(x); ifin=tam(1); y=x(ifin,:); end tr(i,1)=tpo(i); tr(i,2)=x(ifin,4); tr(i,3)=x(ifin,5);tr(i,4)=x(ifin,6);tr(i,5)=x(ifin,7);tr(i,6)=x(ifin,8);tr(i,7)=x(ifin,9); tr(1,2)=x0(4);tr(1,3)=x0(5);tr(1,4)=x0(6);tr(1,5)=x0(7);tr(1,6)=x0(8);tr(1,7)=x0(9); if bio(i)~=-1 teo(i,1)=x(ifin,1); end if sul(i)~=-1 teo(i,2)=x(ifin,2); end if azu(i)~=-1 teo(i,3)=x(ifin,3); end y=x(ifin,:); end % "teo" es una matriz teo(x,s) que guarda el valor teorico de x y s para % cada tiempo experimental %Determinacion de los residuos ib=1; is=1; ia=1; bteo=teo(:,1);steo=teo(:,2);ateo=teo(:,3); conta=1; for i=1:nptos, if bio(i)==-1 sdq(i)=((sul(i)-steo(i))/md3).^2; sd(is)=sul(i);st(is)=steo(i);ts(is)=tpo(i);is=is+1;

124

else if sul(i)==-1 sdq(i)=((bio(i)-bteo(i))/md2).^2; bd(ib)=bio(i);bt(ib)=bteo(i);tb(ib)=tpo(i);ib=ib+1; else sdq(i)=((azu(i)-ateo(i))/md4).^2; ad(ia)=azu(i);at(ia)=ateo(i);ta(ia)=tpo(i);ia=ia+1; sdq(nptos+conta)=((sul(i)-steo(i))/md3).^2;conta=conta+1; sd(is)=sul(i);st(is)=steo(i);ts(is)=tpo(i);is=is+1; sdq(nptos+conta)=((bio(i)-bteo(i))/md2).^2;conta=conta+1; bd(ib)=bio(i);bt(ib)=bteo(i);tb(ib)=tpo(i);ib=ib+1; end end end minimo=0; final=nptos+conta-1; for i=1:final, minimo=minimo+sdq(i); end minimo it=1; for i=1:nptos, if sul(i)~=-1 sdd(it)=sul(i);stt(it)=steo(i);tss(it)=tpo(i);it=it+1; end end %grafica de resultados clf; subplot(3,3,1); plot (tb, bt,'r*-', tb, bd, 'bo'); xlabel('Tiempo(hr)');ylabel('biomasa (cel/L)'); subplot(3,3,2); plot (tss, stt, 'r*-', tss, sdd,'bo'); xlabel('Tiempo(hr)');ylabel('HS- (mol/L)'); subplot(3,3,3); plot (tpo, ateo, 'r*-', tpo, azu,'bo'); xlabel('Tiempo(hr)');ylabel('tamaño azufre (m)'); subplot(3,3,4); plot (tr(1:nptos,1), tr(1:nptos,2),'r*-'); xlabel('Tiempo(hr)');ylabel('Conc de H2 (mol/L)'); subplot(3,3,5); plot (tr(1:nptos,1), tr(1:nptos,3),'r*-'); xlabel('Tiempo(hr)');ylabel('biomasa adherida (cel/m2)'); subplot(3,3,6); plot (tr(1:nptos,1), tr(1:nptos,4),'r*-'); xlabel('Tiempo(hr)');ylabel('Conc H2S (mol/L)'); subplot(3,3,7); plot (tr(1:nptos,1), tr(1:nptos,5),'r*-'); xlabel('Tiempo(hr)');ylabel('Conc de S4-2 (mol/L)'); subplot(3,3,8); plot (tr(1:nptos,1), tr(1:nptos,6),'r*-'); xlabel('Tiempo(hr)');ylabel('Conc de HCO3- (mol/L)'); subplot(3,3,9); plot (tr(1:nptos,1), tr(1:nptos,7),'r*-');

125

xlabel('Tiempo(hr)');ylabel('Conc de CO2 (mol/L)'); Archivo Datos_exp.txt:

Tiempo (horas) bacterias (cel/L) HS- (M) radio partículas (m)

0 4.00E+09 5.88E-05 1.54E-05

0.35 -1 -1 1.53E-05

1.1 -1 -1 1.53E-05

1.35 -1 -1 1.53E-05

2.1 -1 -1 1.53E-05

2.35 -1 6.07E-05 1.53E-05

2.8 -1 -1 1.53E-05

3.1 -1 -1 1.53E-05

3.35 -1 6.58E-05 1.53E-05

4.1 -1 -1 1.53E-05

4.35 -1 8.67E-05 1.53E-05

7.68 -1 -1 1.53E-05

7.93 -1 6.37E-05 1.53E-05

8.1 -1 -1 1.53E-05

10.18 -1 -1 1.53E-05

10.43 -1 8.05E-05 1.53E-05

10.6 -1 -1 1.53E-05

13.18 -1 -1 1.53E-05

13.43 -1 8.16E-05 1.53E-05

23.37 -1 -1 1.53E-05

23.62 4.40E+09 9.14E-05 1.53E-05

24.43 -1 -1 1.52E-05

24.48 -1 -1 1.52E-05

24.73 -1 9.92E-05 1.52E-05

25.7 -1 -1 1.52E-05

25.95 -1 9.41E-05 1.52E-05

26.7 -1 -1 1.52E-05

26.95 -1 8.95E-05 1.52E-05

27.27 -1 -1 1.52E-05

27.7 -1 -1 1.52E-05

27.95 -1 1.09E-04 1.52E-05

29.73 -1 -1 1.52E-05

29.98 -1 9.77E-05 1.52E-05

30.1 -1 -1 1.52E-05

31.73 -1 -1 1.52E-05

31.98 -1 1.17E-04 1.52E-05

32.27 -1 -1 1.52E-05

35.43 -1 -1 1.52E-05

35.47 -1 -1 1.52E-05

35.72 -1 1.04E-04 1.52E-05

37.38 -1 -1 1.52E-05

37.63 -1 8.28E-05 1.52E-05

37.78 -1 -1 1.51E-05

47.18 -1 -1 1.51E-05

47.27 -1 -1 1.51E-05

47.52 4.60E+09 6.76E-05 1.51E-05

48.32 -1 -1 1.51E-05

48.57 -1 7.73E-05 1.51E-05

126

49.85 -1 -1 1.50E-05

51.02 -1 -1 1.50E-05

51.27 -1 1.07E-04 1.50E-05

52.5 -1 -1 1.50E-05

53.5 -1 -1 1.50E-05

53.75 -1 1.18E-04 1.50E-05

55.37 -1 -1 1.50E-05

59.05 -1 -1 1.50E-05

59.75 -1 -1 1.50E-05

60 5.70E+09 7.42E-05 1.50E-05

61.18 -1 -1 1.49E-05

69.3 -1 -1 1.49E-05

69.55 5.15E+09 -1 1.49E-05

70.77 -1 -1 1.48E-05

71.52 -1 -1 1.48E-05

72.85 -1 -1 1.48E-05

72.9 -1 -1 1.48E-05

73.87 -1 -1 1.48E-05

74.12 -1 7.72E-05 1.48E-05

75.6 -1 -1 1.48E-05

77.68 -1 -1 1.48E-05

77.77 -1 -1 1.48E-05

78.02 -1 -1 1.48E-05

80.32 -1 -1 1.48E-05

82.73 -1 -1 1.47E-05

84.12 -1 -1 1.47E-05

84.37 -1 6.77E-05 1.47E-05

84.97 -1 -1 1.47E-05

95.35 -1 -1 1.46E-05

95.88 -1 -1 1.46E-05

96.13 -1 -1 1.46E-05

97.1 -1 -1 1.46E-05

97.77 -1 -1 1.46E-05

98.65 -1 -1 1.46E-05

98.9 5.14E+09 7.67E-05 1.46E-05

99.6 -1 -1 1.46E-05

102.1 -1 -1 1.45E-05

104.1 -1 -1 1.45E-05

107.08 -1 -1 1.45E-05

107.33 -1 -1 1.45E-05

126.85 -1 -1 1.45E-05

127.3 -1 -1 1.44E-05

128.83 -1 -1 1.44E-05

129.08 -1 -1 1.44E-05

129.6 -1 -1 1.44E-05

131.6 -1 -1 1.44E-05

131.85 4.70E+09 5.78E-05 1.44E-05

132.77 -1 -1 1.43E-05

147.07 -1 -1 1.42E-05

147.18 -1 -1 1.42E-05

147.43 7.70E+09 5.94E-05 1.42E-05

150.45 -1 -1 1.42E-05

150.7 -1 -1 1.42E-05

127

150.88 -1 -1 1.42E-05

153.17 -1 -1 1.42E-05

168.1 -1 -1 1.40E-05

168.27 -1 -1 1.40E-05

168.52 -1 6.13E-05 1.40E-05

169.53 -1 -1 1.40E-05

171.5 -1 -1 1.40E-05

171.75 -1 -1 1.40E-05

174.33 -1 -1 1.40E-05

174.58 -1 -1 1.40E-05

178 -1 -1 1.40E-05

178.02 -1 -1 1.39E-05

178.05 -1 -1 1.39E-05

178.3 -1 -1 1.39E-05

179.2 -1 -1 1.39E-05

179.45 -1 -1 1.39E-05

180.2 -1 -1 1.39E-05

180.45 1.10E+10 6.25E-05 1.39E-05

181.27 -1 -1 1.39E-05

200.4 -1 -1 1.39E-05

200.65 1.20E+10 -1 1.39E-05

128

APÉNDICE F. Publicaciones generadas durante esta investigación. Artículos en Revistas Escobar C, Bravo L, Hernández J, Herrera L. 2007. Hydrogen sulfide production from elemental sulfur by Desulfovibrio desulfuricans in an anaerobic bioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 98(3): 569 – 577. Presentaciones en Congresos Escobar C, Bravo L, Hernández J, Herrera L. Modelo hidrodinámico para la predicción de la velocidad del líquido y del hold-up gaseoso en un reactor airlift de cilindros concéntricos. XVI Congreso Chileno de Ingeniería Química. 2005. Escobar C, Bravo L, Hernández J, Herrera L. Diseño y caracterización hidrodinámica de un reactor airlift. XXI Congreso Interamericano de Ingeniería Química y VIII Congreso Peruano de Ingeniería Química. 2005.

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