UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRIDUNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRIDFACULTAD DE FARMACIAFACULTAD DE FARMACIADEPARTAMENTO DE FARMACOLOGÍADEPARTAMENTO DE FARMACOLOGÍA

BASES MOLECULARES DEL ACOPLAMIENTO INTERCELULAR EN EL SINCITIO PANGLIAL

TRABAJO DE INVESTIGACIÓN TUTELADO

Autor: Ilaria FascianiAutor: Ilaria Fasciani Directores: Dr. Luis C.Barrio y Dr. Daniel González NietoDirectores: Dr. Luis C.Barrio y Dr. Daniel González Nieto Tutor: Dra. Marisol Fernández-AlfonsoTutor: Dra. Marisol Fernández-Alfonso Lugar de realización: Unidad de Neurología experimental. Lugar de realización: Unidad de Neurología experimental.

Departamento de investigación. Departamento de investigación.

Hospital Ramón y CajalHospital Ramón y Cajal

Junio 2009Junio 2009

COMUNICACIÓN INTERCELULAR A TRAVÉS DE CANALES

M1M2 M3 M4

E1 E2

NTCTCL

Conexina (Cx)Conexón

(hemicanal)Canal

Intercelular

6 Cx’s 2 hemicanales

ASTROCITOS OLIGODENDROCITOS

Cx30

Cx26

Cx43

Cx46.6 Cx32

Cx31.3

ENFERMEDAD DE PELIZAEUS-MERZBACHER

SINCITIO PANGLIAL

PMLD (Cx46.6) WT

ARN 5’ AUG ACC AAC AUG AGC TGG AGC TTC ..TGA 3’1 2 3 4 STOP

Met MetThr Asn TrpSer Ser Phe

NT de Cx26

OBJETIVOS

1. Caracterización de los canales de la Cx-46.6 humana: Identificación del sitio de iniciación de la traducción del mRNA Estudio de las propiedades de regulación por voltaje y por pH

2. Determinación de las propiedades de los canales implicados en el acoplamiento astrocito-oligodendrocito.

METODOLOGÍA

3) ENSAYO EN EL SISTEMA DE EXPRESIÓN DE LOS OOCITOS DE XENOPUS

Canales intercelulares

1) CLONAJE Y MUTAGENESIS

2) TRANSCRIPCIÓN IN VITRO

4) INMUNODETECCIÓN

pBSXG

PCR Stu1

5) CONDUCTANCIA INTERCELULAR Gj (DOBLE FIJACIÓN DE VOLTAJE)

“LIGACIÓN”

6) pHi

580 nm

630 nm

pHi

7.23 pH i 5.73

ROI-2

ROI-1

ROI-1

ROI-2

PROTEÍNA TOTAL

PROTEÍNA SUPERFICIE

C-SNARF

STOPATG

HCX46.6 GENÓMICO

+Met4

Met1&4Met1&4

Met4

( g/ l)[RNA]

Co

nd

uct

anci

a In

terc

elu

lar

(S

) (2

4 h.

a.p)

05

1015202530354045505560

2.01.00.50.10.050.0250.005

N=3n=8

N=4n=21

N=10n=48

N=4n=13

N=3n=16

N=3n=13

N=3n=14

N=4n=13

N=5n=13

Met4Met1&4

1) IDENTIFICACIÓN DEL SITIO DE INICIACIÓN de la Cx46.6.

ARN Met1&4 5’ AUG ACC AAC AUG. . . . . . .TGA 3’ 440aa1 2 3 4 STOP

Met MetThr Asn

ARN Met4 5’ .........................AUG. . . . . . .TGA 3’ 437aa

0.0e+02.5e+55.0e+57.5e+51.0e+60

10

20

30

40

50

60

C

on

du

tan

cia

Inte

rcel

ula

r

(S

)(4

8 h

. a. i.

, 24

h. a

. p)

0.025

0.05

0.5

0.1

Met1&4Met4

Cx46.6 EN SUPERFICIE (UA; 48 h.a.i.)

0.0e+0 5.0e+5 1.0e+6 1.5e+60.0e+0

2.5e+5

5.0e+5

7.5e+5

1.0e+6

Cx4

6.6

EN

SU

PE

RF

ICIE

(U

A)

Met40.05

Met1-41.0

Met1-40.5

Met40.025

TOTAL DE Cx46.6 (UA)

Met

1&4

(0.1

)

100kDa

cont

rol

Met

4 (0

.1)

52kDaBC

500

Met1-4HCx46.6

Met4HCx46.6

CONTROL0

100200300400

52 k

Da

52kDa 52 k

Da

0100200300400500

Met1-4HCx46.6

Met4CONTROL

Vj

Ij

100mV

+120

-120

1 s

50nA

100

Vj

Ij

100mV

+120

-120

1 snA

-120 -80 -40 0 40 80 120

0.00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.01.11.2

Vj

Gj

-120 -80 -40 0 40 80 120

0.00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.01.11.2

Vj

Gj

Met1&4 Met4 Met1&4/Met4

Vj

Ij

100mV

+120

-120

1 s

100nA

-120 -80 -40 0 40 80 120

0.00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.01.11.21.31.4

Gj

V j

amp

litu

de

0 5000

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0 -120 mV

amp

litu

de

0 5000

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0 +120 mV

1+2

21

21

1+2

ms ms 0 5000

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0 5000

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0 -120 mV

am

pli

tud

e

msa

mp

litu

de

+120 mV

1 1

1 1

ms

am

pli

tud

e

0 5000

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0 -120 mV

t1+t2

t1

t2

ms

am

pli

tud

e

0 5000

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0 +120 mV

t1

t2

t1+t2

ms

2. PROPIEDADES DE LOS CANALES DE LA Cx46.6 2.1. REGULACIÓN POR VOLTAJE

CANALES OLIGODENDROCITARIOS, ASTROCITARIOS Y OLIGODENDROCITARIOS-ASTROCITARIOS

CANALES ASTROCITO-OLIGODENDROCITO

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Co

nd

uc

tan

cia

In

terc

elu

lar

(S

)(2

4 h

.a.p

)

NC NC NC NC NC NC

N=7n=27

N=4n=18

N=6n=30

N=5n=28

N=4n=18

N=4n=15

N=4n=18

N=4n=14

N=3n=16

N=3n=15

Met1&4/hCx43 Met4/hCx43 hCx43

Vj

Ij

1 s

40nA

100mV

+120

-120

-120 -80 -40 0 40 80 120

0.00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.01.11.2

Vj

Gj

jV

jI

+120

100mV

-120

1 snA100

-120 -80 -40 0 40 80 120

0.00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.01.11.21.31.4

Vj

Gj

-120 -80 -40 0 40 80 120

0.00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.01.11.21.31.4

Vj

Gj

LOS CANALES ASTROCITARIOS y ASTROCITARIOS-OLIGODENDROCITARIOS

am

pli

tud

e

0 5000

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0 -120 mV

1

2

+2

msa

mp

litu

de

0 5000

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0 +120 mV

1 2

+2

ms

am

pli

tud

e

0 5000

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0 +120 mV

12

+2

ms

am

pli

tud

e

0 5000

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0 -120 mV

1

ms

am

pli

tud

e

0 5000

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0 -120 mV

1+2

21

ms

am

pli

tud

e

0 5000

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0 +120 mV

21

1+2

ms

100mV

jV

+120

50nA

Ij

1 s

-120

CONCLUSIONES

1) Los estudios realizados para identificar cuál es la metionina iniciadora en la Cx46.6 indican que el mRNA se transduce a partir del primer triplete AUG presente en el extremo 5’ de su secuencia. Como consecuencia de ello, el número de residuos aminoacídicos de la Cx46.6 es de 440.

2) El triplete de aminoácidos Met-Thr-Asn presente en el extremo 5’ del dominio amino-terminal de la Cx46.6 es un importante determinante molecular de las caracteristicas funcionales del canal y de las propiedades de regulación por voltaje y por pH.

3) La Cx46.6 oligodendrocitaria es capaz de formar canales con la Cx43 astrocitaria, formando unas uniones de tipo rectificador en función del voltaje. Esta rectificación se origina como consecuencia de la diferencia de permeabilidad entre los hemicanales que constituyen los canales de Cx46.6-Cx43 e implica unidireccionalidad para la difusión de iones y moléculas.