UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

IZTAPALAPA c. 43 - S .

CARACTERIZACION DE MOLECULAS EXPRESADAS EN EL ESTOMAGO DE

MOSQUITOS HEMBRA DE Anopheles albimanus.

R E P O R T E

LICENCIADO EN BIOLOGIA EXPERIMENTAL P R E S E N T A:

R O C I O G O M E Z D E L G A D O

QUE PARA OBTENER EL TITULO DE:

MEXICO, D.F. 1996.

Casa abierta al tiempo

UNIVERSIDAD ALJTONONIA h’lETROPOLITANA DIVISION DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD DR. JOSE LUIS ARREDONDO FIGUEROA DIRECTOR

LIC. JULIO DE LARA ISShST C0011DINADOR DE SISTEh1,AS ESCOL-IRES Presente

Por este medio se hace constar que la alutnna Gónlez Delgado Rocío (86344930) de la Licenciatura en Biología Experinle~ltnl , concluyi, su Servicio Social, mismo que fue realizado en el Proyecto: “Caracterización de moléculas expresadas en el estómago de mosquitos hembra de Anoplzeles crlhinzmzus ” llevado a cabo en el Centro de

. Investigación y de Estudios Avanzados , bajo l a asescría de la M. en C. María de los Angeles Aguilar.

Se extiende l a presente para los fines que al interesado convengan, a los ocho días de Noviembre de mil novecientos noventa y seis.

ATENTAMENTE,

UNIDAD IZTAPALAPA

Av. Michoacán y la Purísima, Col. Vicentina, D.F. 09340 Tel. (5) 724 46 79, Fax (5)612 80 83

Casa abierta al tiempo

UNIVERSIDAD AIJTONOhIA ,1IETROPOLITANA DlVlSlON DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD DR. JOSE LUIS ARREDONDO FIGUEROA DIRECTOR

LIC. JULIO DE LARA ISSASI COORDIS.ADOII D E SISTEJ1;lS ESCOL,-lRES Presente

Por este medio se hace constar que la alumna Gómez Delgado Rocío (86344930) de la Licenciatura en Biología Exuperimelltal , concluyó su Servicio Social, mismo que fue realizado en el Proyecto: “C;~racterizaciÓn de moléculas expresadas en el estómago de

, mosquitos hembra de Anoplzeles nlhitnmrts ” llevado a cabo en el Centro de Investigación y de Estudios Avanzados , bajo la asesoría de la NI. en C. &faría de los Angeles “lguilar.

Se extiende l a presente para los fines que al interesado convengan, a los ocho días de Noviembre de mil novecientos noventa y seis.

ATENTAMENTE.

UNIDAD IZTAPALAPA

Av, Michoacán y la Purísima, Col. Vicentina, D.F. 09340 Tel. (5) 724 46 79, Fax (5)612 80 83

Casaatmadtlempo

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

México, D.F. a 21 de Noviembre de 1996

Dr. Fidel de la Cruz Hernández Hernández Jefe del Laboratorio de Entomologia Molecular Departamento de Patología Experimental CINVESTAV, IPN P R E S E N T E :

Por medio de la presente le manifiesto nuestro agradecimiento por su brillante co . -oración

como Asesor del Proyecto de Servicio Social titulado “Caracterización de moléculas expresadas

en el estómago de mosquitos hembras de Arzophelcs nlbimnr1us”de la alumna de la Licenciatura de

Biología Experimental Rocío Gómez Delgado. Sin su participación no habría sido posible la

realización de dicho trabajo que coadyuvó muy favorablemente para la formación profesional de la

alumna antes referida.

Espero que podamos seguir contando con su colaboración en un futuro cercano, y

reiterando mi agradecimiento quedo de Ud.

A T E N T A M E N T E TASA ABIERTA AL TIEMPO^^

“----

Depto. de Ciencias de la Salud CBS, UAM Iztapalapa

UNIDAD IZTAPALAPA Av. Michoacin y La Purísima, Col. Vicentina, 09340 MBxico, D.F. Tel.: 724-4600 TELEFAX: (5) 612 O885

Caracterización de moléculas expresadas en el estómago de mosquitos

hembra de Anopheles nlbimnnus.

A mis padres Ma. Trinidad y Galdino

Porque gracias a sus consejos y gran apoyo tanto económico corno moral he logrado cumplir satisfactoriamente uno de los objetivos que me habia trazado en la vida, por esta razón estaré eternamente agradecida.

A m i s hermanos Angeles, Galdino y Joel

Como una muestra de cariño.

Al Dr. Fidel de la C. Hernández Hdez.

Por la confianza y conocimientos, que me brindo en todo momento.

A mis asesoras

M. en C. Ma. de los Angeles Aguilar S. M. en C. Febe Elena Cazares Raga.

Por sus enseñanzas y consejos a lo largo de mi trayectoria como estudiante y en la elaboración de la tesis.

A mis amigos y compañeros en especial a Carlos

Gracias por su apoyo y amistad.

A la Universdad Autonoma Metropolitana

Por haberme dado la oportunidad de forjarme un futuro.

A mis compañeras del trabajo del laboratorio 10 del CINVESTAV

Gracias por su amistad y apoyo

Esta tesis file realizada en el departamento de Patología Experimental del CINVESTAV- IPN, bajo la dirección del Dr. Fidel de la Cruz Hemández H. El material biológico y la asesoria file proporcionada por el Dr. Mario H. Rodriguez L. del Centro de Investigaciones del Paludismo en Tapachula Chiapas y el CISEI- INSP. Además de la asesoria de la M. en C. Ma. de los Angeles Apilar S. de la Universidad Autonoma Metropolitana.

INDICE

Pagina

1 . RESUMEN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

1 . INTRODUCCION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

1.1 Generalidades . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

1.2 Ciclo de vida de Plmmodium ...................................................................... 2

1.2.1 Ciclo sexual ................................................................................... 3

1.2.2 Ciclo asexual .................................................................................. 4

1.3 Anatomía y ciclo de vida del mosquito Anopheles ......................................... 4

1.3.1 Huevo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

1.3.2 Larva . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

1.3.3 Pupa ................................................................................................ 5

1.3.4 Adulto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

1.4 Digestión y absorción ...................................................................................... 7

1.4.1 Tripsinas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

1.4.2 Matriz Peritrófica .............................................................................. 9

2 . ANTECEDENTES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

3 . JUSTIFICACION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

4 . OBJETIVOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

5 . ESTRATEGIA EXPERIMENTAL, ................................................................................ 15

6 . MATERIAL Y METODOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

7 . RESULTADOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

8 . DISCUSION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

9 . CONCLUSIONES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

10 . PERSPECTIVAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

11 . RECOMENDACIONES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

12 . FIGURAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

13 . APENDICE .................................................................................................................. 41

14 . BIBLIOGRAFIA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

" . . ~

INDICE DE FIGURAS

Pagina

Fig . 1 Ciclo de vida de Plasmodium ................................................................................. 29

Fig . 2 Representación esquemática de la formación de gametos

masculinos en Plasmodium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

Fig . 3 Caracteristicas distintivas de mosquitos anofelinos y culicidos .................................. 31

Fig . 4 Ciclo de vida de la hembra Anopheles ..................................................................... 32

Fig . 5 Canal alimentario de mosquito ................................................................................. 33

Fig . 6 Diagrama esquemático de cambios ultraestructurales en las

células secretoras de PM1 después de la alimentación con

sangre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

Fig . 7 Esquema del método para l a construcción de la biblioteca de

cDNA basado en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ................................. 35

Fig . 8 Vector de clonación pCRII . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

Fig . 9 Análisis de DNA de plásmido obtenido de E . coli ..................................................... 37

Fig . 1 O Analísis del DNA de plásmidos cortados con la enzima de restricción

Eco RI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

Fig . 11 Secuencia parcial de clona E6-3 ............................................................................... 39

Fig . 12 Comparación de una parte de la secuencia con un fragmento

del precursor de la proteína D2 regualda por CAMP ................................................. 40

1

RESUMEN

La malaria es una enfermedad que afecta aproximadamente a 200 millones de personas en 102

paises. El mosquito hembra del genero Anopheles es el causante de la transmisión de la malaria

provoca& por protozoarios parásitos del genero Plasmodium adquiridos por la alimentación con

sangre de humanos infectados. En el estómago es donde se lleva a cabo la parte sexual del ciclo de

vida de Plasmodium. En este órgano el parásito es vulnerable al medio ambiente por encontrarse

en forma extracelular (aún no invade células o tejidos del mosquito) y por pasar algunas horas en

este organ0 sin dividirse. Por otra parte, en la mayoría de los insectos hematófagos, después de la

alimentación con sangre se encienden varios genes en el estómago de los mismos, entre los cuales

se encuentran los que producen la matriz peritrófica y enzimas digestivas. Se sabe quc para el

control de la expresion genética existen elementos en el DNA que incluyen secuencias UTR hacia

ambos extremos j ' y 3' que regulan la expresión de las proteínas inducibles. Se ha observado que

las acciones de erradicación de la malaria han seleccionado mosquitos resistentes a insecticidas y

parásitos resistentes a drogas empleadas para su tratamiento. Por éstas razones, en nuestro equipo

se ha iniciado el estudio de los mecanismos de expresión y control de los genes en el estómago dc

mosquitos hembra de Anopheles albimanus, uno de los principales vectores de la malaria en

México.

El objetivo de éste trabajo fue, caracterizar moléculas de estómagos de mosquitos hembra de

Anopheles albimanus después de seis horas postalimentación con sangre. Para este fin se

caracterizaron varios fragmentos de cDNA clonados en el vector pCRII. Una de las secuencias

analizadas, la clona E6-3 presentó en 10 aminoácidos homologia (71%) con un fragmento de

precursor de la proteina D2 regulada por CAMP.

Por otro lado, con ensayos de hibridización tipo Southern, se identificó una clona, la E6-1 con

un fragmento de - 400 ph, con secuencias 3'AUUUA repetidas, secuencias que pudieran estar

regulando la expresión a nivA transcripcional y/o a nivel de traducción a proteínas relacionadas

con éstres, que en éste caso pudieran estar relacionadas con la alimentación con sangre.

2

INTRODUCClON

1.1 GENERALIDADES

La malaria es la más importante de las enfermedades transmitidas por insectos debido

al gran número de personas afectadas y muertes que provoca, sobre todo en los países

subdesarrollados. A pesar de los esfuerzos de muchos años, la malaria es nuevamente un

grave problema de salud ya que afecta a 2000 millones de personas en 102 paises

(Crampton 4. 1994). Se sabe que la erradicación de la enfermedad no depende de

soluciones simples, como la aplicación de insecticidas a los cuales, los insectos vectores

han desarrollado resistencia, además del alto costo que implica desarrollar nuevos

componentes y el efecto que éstos causan en el ambiente. El tratamiento de casos clínicos

también se ha hecho dificil ya que no siempre son curables con las nuevas drogas

antipalúdicas, porque los parásitos cada vez son más resistentes a las drogas (Read, 198 1).

Los protozoarios del género Plasnzodiunt son los organismos causantes de la malaria.

Son tres las especies principales responsables de ésta enfermedad: Plasmodium v i v a , P.

falciparum y P. malarie. Una cuarta especie P. ovale, es un parásito humano más raro.

Los microorganismos son transmitidos al hombre por la picadura de mosquitos hembra del

género Anopheles que adquirieron el parásito al alimentarse con sangre de humanos

enfermos o acarreadores asintomáticos del parásito (Read, 1981).

1.2 CICLO DE VIDA DE PLASMODIUM

El ciclo de vida de Plasmodium es similar en ias especies especificas del hombre,

comprende una fase sexual (Esporogonia) con multiplicación en algunos mosquitos

Anopheles, y dos fases asexuales (Esquizogonia) con multiplicación en el huésped

vertebrado (fig. 1).

3

1.2.1 CICLO SEXUAL

~1 ciclo sexual se inicia cuando un mosquito hembra ingiere sangre de un huésped que

contiene las formas sexuales masculinas (microgametocitos) y femeninas

(macrogametocitos) del parásito. El núcleo del microgametocito, una vez en el estómago,

se divide endomitóticamente tres veces, formandose ocho núcleos ordenados

simétricamente alrededor de la antigua membrana nuclear. El centriolo también se replica y

cada producto de replicación se asocia con un núcleo, formando el cuerpo basal del

microgametocito, todo éste proceso se lleva de 8 a 12 minutos (fig. 2). El microgameto

del Plasmodiunt completamente desarrollado es en esencia un flagelo con las fibrillas

comunes 9 + 2, acompañadas de un núcleo (Read, 1981). El macrogametocito madura y

se forma un macrogameto. En el estómago del mosquito se lleva a cabo la fisión de los

dos tipos de gametos para formar el cigoto, el cual se desarrolla para formar células

alargadas y móviles llamadas oocinetos, que cruzan la matriz peritrófica y/o el epitelio del

estómago, un proceso posiblemente mediado por reconocimiento específico de un

receptor (proteínas de superficie) presente en el parásito, así como por mecanismos de

penetración, todo este proceso toma de 16-24 hr dependiendo de la especie. (Warburg y

Miller, 199 1; Ponnudurai, 1988).

Por medio de la microscopía electrónica se ha observado que el oocineto tiene una

película formada de dos membranas unidas, y debajo de éstas, una fila de fibrillas

longitudinales las cuales se piensa que cumplen hnciones locomotoras. El oocineto

penetra hasta la membrana basal del estómgo, donde se establece, formando un ooquiste,

estructura rodeada por una membrana elástica (Read, 198 1).

En el ooquiste ocurren muchas divisiones del parásito los cuales forman haces de

células en forma de huso (esporozoítos). De diez a doce días después de la ingestión de

. sangre infectada, 10s esporozoítos rompen la pared del ooquiste y salen hacia el

hemoceloma del mosquito, se dirigen hacia las glándulas salivales e invaden el lumen de

4

éstas glándulas. Los esporozoitos son inyectados con la saliva dentro del huésped

vertebrado durante la subsecuente alimentación con sangre (Warburg y Miller, 199 1) .

1.2.2 CICLO ASEXUAL

Una vez dentro del huésped vertebrado, el parásito pasa rápidamente de la sangre a las

células parenquimatosas del hígado. Una vez dentro de éstas células, los esporozoítos se

dividen para formar un esquizonte hepático (Exoeritrocítico) conteniendo numerosos

merozoítos, que en el caso de P. fnlcipnrunz, tarda 5 - 7 días (período latente) para formar

de 30 - 40,000 merozoítos. Después de este periodo, las células hepáticas afectadas se

rompen, liberando los merozoitos en el torrente sanguíneo. Estos merozoítos pueden

reinvadir las células hepáticas, produciendo esquizontes hepáticos secundarios, pero la

mayoría de ellos invaden los eritrocítos, donde se multiplican asexualmente de nuevo. En

los eritrocítos se forma un esquizonte eritrocítico maduro, que luego se rompe, liberando

nuevos merozoítos; ésta ruptura se acompaña de la liberación de sustancias pirógenas, que

ocasionan la rápida elevación de la temperatura corporal.

Las especies de Anopheles varían ampliamente en su capacidad para soportar el

desarrollo de una determinada especie de Plasmodium. Además con una especie de

mosquito. en particular hay variaciones en la susceptibilidad a una sóla línea de

Plasmodium.

1.3 ANATOMIA Y CICLO DE VIDA DEL MOSQUITO ANOPHELES

Los mosquitos anófeles causantes de la malaria son artrópodos, pertenecientes al

grupo de los dípteros, caracterizados por la presencia de dos alas y un par de halterios o

balancines, órganos especiales para regularizar el equilibrio durante el vuelo.

La morfología externa de los mosquitos anófeles es el principal criterio para la

identificación del género y la especie. Entre las características usadas para identificar a los

mosquitos del género Anopheles están: los palpos maxilares, casi tan largos como la

""-A". - - - - - - ""--..I "_ill

5

probóscide tanto en machos como en hembras. Los mosquitos adultos descansan con el

abdomen en ángulo sobre la superficie de reposo a diferencia de los culícidos que reposan

con el abdomen en posición paralela a la superficie. Los huevos de ésta especie son

depositados individualmente sobre la superficie del agua donde se mantienen gracias a la

presencia de flotadores. Las larvas son fácilmente reconocidas por su posición de

descanso, la cual es paralela a la superficie del agua (Little, 1963) (fig.3).

Los mosquitos del genero Anopheles son insectos de metamorfosis completa

(Holometabolos) y pasan por cuatro estadios de desarrollo perfectamente diferenciados

que son: huevo, larva, pupa y adulto o imago (fig. 4).

1.3.1 Huevo.- El huevo mide de 0.5 a 0.9 mm, tiene forma de huso o bote con uno

de los extremos romo y abultado, siendo ahí donde está la cabeza del embrión y el sitio

por donde sale la larva en el momento de la eclosión. La hembra pone alrededor de 1800 a

2400 huevos o más en varias ovoposiciones dependiendo de la especie.

1.3.2 Larva.- La hembra del anófeles deposita los huevos en el agua y quedan

flotando sobre la superficie, y de dos a cinco días después, aproximadamente, nacen las

larvas con un tamaño de 0.70 mm., y van creciendo hasta adquirir una longitud de ocho a

diez mm. La larva sufre cuatro mudas, las tres primeras necesitan seis días, y la cuarta

requiere de cuatro días. En el último estado larvario existen caracteres que se usan para su

identificación, tales como los pelos que presentan en los segmentos y el aparato

respiratorio que esta formado por un par de espiráculos abiertos en los anofelinos, a

diferencia de los culicidos que tienen un sifón. Las larvas de anófeles son carnívoras y

viven generalmente en aguas limpias con vegetación.

1.3.3 Pupa.- Después de haber pasado por sus cuatro estados larvarios, el insecto

sufre una nueva muda para convertirse en pupa. L a pupa está Constituida por el céfalo-

tórax, resultante de la hsión del tórax y la cabeza de la larva, que tiene en su parte

superior dos apéndices respiratorios en forma de pequeñas trompetas, y el abdomen

6

curvado. Este estado se caracteriza por su morfología especial, por su corta duración (dos

a tres días) y por no nutrirse en absoluto.

1.3.4 Adulto.- En la pupa ocurre la metamorfosis,, la cual origina al adulto, cuyo

cuerpo se encuentra dividido en tres partes: cabeza, tórax. y abdomen. Los machos adultos

se nutren de jugos vegetales, l a hembra es además hematófaga y su probóscisde tiene una

disposición especial para perforar la piel del hombre y de los animales. La proboscide tiene

un labio que termina en un par de labelas, un labio-epifaringe, una hipofaringe (con bomba

faríngea), dos pares de mandíbulas dentadas y el maxilar. Toda ésta estructura excepto el

labio penetra la piel del huésped del que se alimenta (Clements, 1992).

Los constituyentes y las fimciones de la saliva de los mosquitos no están

completamente caracterizados. Una de las razones por las que actualmente se estudia la

saliva es porque los parásitos de la malaria y muchos arbovirus usan éste vehiculo para la

transmisión a sus huéspedes vertebrados (Clements, 1992). La transmisión de los parásitos

se realiza al alimentarse con sangre,' hnción que es indispensable para la maduración de

los huevecillos (vitelogenesis).

El tórax de los mosquitos tiene un par de alas, un par de halterios y tres pares de patas.

En la parte anterior del tórax se encuentran las glándulas salivales (Z), cada una contiene

tres lóbulos, dos laterales largos y el central más corto, unidos por conductos que forman

el ducto saliva1 principal.

El abdomen tiene ocho segmentos, en el último de los cuales están los órganos

sexuales. En el macho, los dos testículos,. y en las hembras recién emergidas, los ovarios

ocupan una pequeña parte de la cavidad abdominal, mientras que en las hembras grávidas

los huevecillos ocupan una gran parte de ésta cavidad. De cada ovario sale un oviducto,

los cuales se unen en un oviducto común, cuya porción distal se expande para formar el

ntriunz, dentro del cual se abre el conducto espermático. Este conducto está unido a la

espermateca, lugar donde se guardan los espermatozoiides introducidos por el macho

7

durante la copulación, las glándulas accesorias del macho producen una secreción que

forma un tapón en la cámara genital de la hembra, evitando así posteriores copulaciones.

1.4 DIGESTION Y ABSORCION

El canal alimentario, consiste de tres partes principales: intestino anterior, intestino

medio (estómago) e intestino posterior (fig. 5). Cuando el mosquito se alimenta de sangre,

ésta pasa directamente a la porción expandida del estómago, encendiendose varios tipos

de genes entre ellos los que codifican para enzimas digestivas (Clements, 1992).

La digestión y la absorción de la sangre ocurren en el estómago. En los insectos existen

dos estrategias básicas de digestión, la digestión continua y la digestión en bloques, ésta

última es la que se lleva a cabo en los mosquitos. El bolo de sangre es digerido sobre la

superficie entera del estómago, y aparentemente las misrnas células están involucradas en

la síntesis y secreción de enzimas digestivas así como en la absorción de los productos de

digestión. El procesamiento de la sangre en insectos hematófagos involucran varios pasos:

(1) remover el exceso de agua de la sangre, (2) el rompijmiento de las células de la sangre

(hemólisis), (3) la digestión hidrolítica de las macromoltSculas en la sangre (digestión), y

(4) la absorción de pequeñas moléculas producidas por la digestión dentro de las células

epiteliales del estómago, y la subsecuente introducción all hemoceloma (Lehane, 1991).

La remoción de agua de la sangre se da por un gradiiente osmótico entre el lumen del

estómago, las células epiteliales del estómago, y la hemo1:infa. Este gradiente es producido

probablemente por transporte activo de iones como el potasio y el sodio, y facilitan la

difbsión pasiva del agua por el lumen del estómago. Por otro lado, el flujo de orina por los

tubulos de Malpigio incrementan significativamente éste proceso (Clements, 1992).

Las proteínas son el constituyente predominante cle la sangre aparte del agua. La

digestión de proteínas involucra dos tipos de enzimas, las proteinasas (endopeptidasas)

que rompen las proteínas en péptidos, y las peptidasas (exopeptidasas) que rompen los

péptidos en aminoácidos o dipéptidos de cada extremo del péptido (Clements, 1992).

2 2 7 5 2 8

8

Las exopeptidasas incluyen las aminopeptidasas, 1a.s cuales rompen péptidos en el

extremo amino terminal, y las carboxipeptidasas, las que rompen péptidos en el extremo

carboxilo terminal.

1.4.1 TRIPSINAS

Las tripsinas y quimiotripsinas son endopeptidasas, las primeras hidrolizan uniones

peptídicas en el grupo carboxilo de los aminoácidos básicos, la arginina o lisina. La

quimiotripsina hidrolisa uniones peptídicas en el grupo cam-boxilo de la tirosina, triptofano,

fenilalanina o residuos de leucina, se ha encontrado que la actividad de la quimiotripsina en

estómagos de mosquitos adultos es muy baja (Beaty y Marquardt 1996; Clements, 1992).

En mosquitos anófeles se han encontrado tripsinas que: van desde un peso molecular de

28.6 hasta 33.9 D a . Trabajos experimentales muestran que en Aedes negypti vector del

dengue, la síntesis de la tripsina se lleva a cabo en diferentes tiempos, las tripsinas de tipo

temprana y las tripsinas de tipo tardía, siendo éstas últimas las más prominentes (Clements,

1992).

La actividad enzimática es incrementada en las dos regiones del estómago, la anterior y

la posterior, después de la alimentación con sangre, pero mientras más tiempo haya

transcurrido después de la alimentación con sangre, miis del 90 % del total del la

actividad enzimática se lleva a cabo en el lumen del estómago posterior.

Los experimentos de Graf y Briegel(l989) indican que en Aedes aegypti la síntesis de

las tripsinas están reguladas a nivel transcripcional, ya que existe ur,a inducción inmediata

de tripsinas tempranas dada por un estimulo mecánico y/o estirnulación osmótica y una

respuesta tardía, que depende de la presencia de proteínas para la expresión de tripsinas

tardías.

En Aedes aegypti, se sugiere que la síntesis de las fases temprana y tardía de la tripsina

pueden estar inducidas por proteínas globulares solubles en la primera fase, y 10s

productos peptidicos de digestión inducen las segund,as. También sugieren que hay

9

hormonas como la 20-hidroxiecdisona que afectan la segunda fase de síntesis, como lo

muestran los experimentos de Briegel y Lea, (1979), en los cuales se observó que al

remover los ovarios de Aedes aegypti hembra, la secreción de proteínas declinó

substancialmente a las 18 y 24 hr, y solo se restablece corn la implantación de un ovario o

por inyección de la hormona 20-hidroxiecdisona, aunque no se sabe si el efecto que causa

en la síntesis de tripsinas es directa o indirecta (Briegel y Lea 1979).

En trabajos realizados por Barillas-Mury y Wells (1 993), se obtuvo un gen de una sola

copia para la tripsina tardía, representado en una clona genómica de 4.1 Kb en Aedes

aegypti así como una subclona de 1.6 Kb de las cuales l. 1 Kb correspondian a una región

reguladora corriente arriba y 0.5 Kb de región codificadora. También se obtuvo una

secuencia repetida (5' TGACTC 3') cinco veces, hom6loga a la GCN4 de levaduras;

GCN4 es una proteína que se une al DNA para activar la transcripción de varias enzimas

involucradas en biosíntesis de aminoácidos (Amdt y Fink, 1986). Esta proteína semejante

a la GCN4 puede estar unida a regiones reguladoras consenso e interactuar con otros

factores transcripcionales para activar la transcripción de:l mensajero de la tripsina tardía

en los mosquitos.

Por otro lado se sabe que para el control de la expresilón genética existen elementos en

el DNA que incluyen secuencias de regiones no traducidas (UTR) hacia ambos extremos

5' y 3' que regulan la expresión de las proteínas inducibles, como en el caso de las

secuencias repetidas de AUUUA en el extremo 3' no tralducidas de mRNA, y que se han

conservado a través de la evolución. Estas secuencias codifican para proteínas altamente

inducibles, incluyendo factores de crecimiento hematopoyeticos, interleucinas, adhesión

molecular y protooncogenes (Asson-Batres y col., 1994).

1.4.2 MATRIZ PERITROFICA

El epitelio del estómago secreta la matriz peritrófica (PM) alrededor del bolo de

sangre. La matriz peritrófica es una matriz extracelular que contiene quitina, bordeando el

10

epitelio del estómago en la mayoría de los insectos. Se puede considerar que es una

estructura que funciona estrictamente en el estómago, sin embargo, en raras excepciones

tiene otras fbnciones como el caso de algunos escarabajos que usan la PM para formar

capullos.

Existen dos tipos de PM, la tipo PM1 que es produci'da por áreas secretoras difusas a

todo lo largo del estómago, y la tipo PM2 que es formada por un área localizada por la

unión del estómago y el intestino anterior (Miller y Lehane, 1993).

La PM1 y PM2 tienen propiedades diferentes. Cada especie de insecto y cada estado

de desarrollo produce su PM1 o PM2, pero no ambas. Los mosquitos adultos producen

PMl, cuyo espesor es de un rango de 2 a 20 pm. La secreción de la PM1 correlacióna con

la distención del epitelio del estómago durante la ingestión de sangre, por ejemplo una

alimentación parcial de sangre en Anopheles y Sintulium no provocan la secreción de

PM, pero en Aedes negypti parece existir una correlación entre el volumen de la sangre

ingerida y el espesor de la PM1 formada (Freyvogel y Jaquet, 1965; Reid y Lehane, 1984).

Estos resultados sugieren que la composición química del alimento no es el Único factor

que provoca la secreción de la PM, el volumen de sangre ingerido es determinante en la

secreción de la PM1. El mecanismo por el cual se induce la PM1 no es totalmente

conocido,.las células del estómago que secretan la PM1 presentan cambios marcados en su

morfología después de la ingestión de sangre. El epitelio con células en columnas de tipo

cuboidal que recubren el tubo digestivo se ensanchan hasta aplanarse cuando se encuentra

alimento con sangre (fig. 6). Debido a los cambios de forma en la célula es posible que

ciertos componentes citoesqueléticos puedan estar implicados (Beaty y Marquardt, 1996).

La PMl es inicialmente suave, frágil y gradualmente: se va solidificando y espesando

durante la maduración. Entre las posibles hnciones de la matriz peritrófica, están la de una

estructura que previene la acción abrasiva de partículas alimenticias sobre las células

epiteliales, interviene en la permeabilidad durante los procesos digestivos y en la

interacción con parásitos presentes en la sangre ingerida (:Beaty y Marquardt 1996).

11

La PM está compuesta principalmente por varias proteínas de complejidad y tamaños

varizdos, quitina y otros carbohidratos; en experimentos realizados con la mosca negra

Simulium vitiatum, vector de la estomatitis vesicular en caballos (Ramos gt al 1994), se

encontraron dos proteínas especificas de la PM1, con peso molecular de 66 y 61 D a . Los

trabajos de Huber al (1991) sugirieron que P. gallinaceum secreta una quitinasa para

penetrar la PM1 de AR aegypti. Huber gt 4 reportaron que una quitinasa es suficiente

para que el parásito atraviese la PM1. Subsecuentemente, Shahabuddin et 4. (1993)

demostraron que la inhibición de la actividad de la quitinasa por la alosamidina bloquea

completamente la transmisión del parásito. Otros autoraes demostraron que la quitinasa

secretada por los parásitos es activada por la tripsina slecretada en los mosquitos. Esto

revela los sofisticados mecanismos de adaptación del parásito a la PM1 y la secreción de

las enzimas digestivas del huésped (Beaty y Marquardt, 1996).

12

ANTECEDENTES

En estudios realizados en estómagos de Anopheles albimaus, se ha encontrado que

la mayoría de las proteínas inducidas por alimentación con sangre, son del tipo serín

proteasas, y que existe una inducción diferencial de proteasas en mosquitos machos y

hembras, ésta especie de mosquito transmisora de P. vitwx es de las más importanes en

México y América Latina, por ello la importancia de su estudio (Sánchez 1993). Entre los

experimentos realizados para estudiar mecanismos de control que regulan la expresión de

genes, se encuentran entre otros, los estudios en erizo de ]mar de Asson-Batres & al, 1994,

éstos estudios revelaron la presencia de secuencias repetitiivas AUUUA en el estremo 3’ de

RNAm de celomocitos estresados, tales secuencias de:sestabilizan al RNAm, y están

relacionadas con el control de expresión de proteínas inducibles por estrés, tanto en

mamíferos como en invertebrados, lo que indica que son secuencias conservadas a través

de la evolución, y podría ser que éste tipo de secuencias, se encuentren también en

mosquitos, por el estrés que implica la ingestión de sangre y/o la invasión de parásitos.

Para estudiar los genes expresados específicamente en el estómago de hembras de An,

aflbinzanus después de la alimentación con sangre, y la posible presencia de secuencias

repetitivas de AUUUA, Cázares & al construyeron un banco de expresión en el

Laboratorio de Entomologia Molecular en el departamento de Patología Experimental del

CINVESTAV-IPN. Este banco se hizo con la estrategia dle cDNA amplificado por PCR a

pitrtir de RNA total (fig 7) (Gun et al, 1991 ; Gurr y McPherson, 1992; Belyavsky gt 4,

1989). Para éste trabajo una población de cDNA de - 600 pb amp]ificado por PCR; se

donó en el plásmido pCRII, vector que contiene un solo cleoxi-timidilato en cada extremo

3’ para una ligación directa de productos de PCR (fig. 8). El plásmido se introdujo por

transformación en células Escherichia coli competentes de la cepa DH5-a. De este banco

parcial de cDNA se tomaron tres placas al azar para su caracterización.

13

JUSTIFICACION

Algunas de las causas para el aumento en la incidencia de la malaria son el desarrollo

de resistencia a insecticidas en los mosquitos vectores y la aparición de resistencia a

drogas en los parásitos. Unidos a éstos factores se encuentran los cambios climáticos y

migración de un número creciente de personas de áreas no endémicas a regiones donde la

malaria es prevalente o viceversa.

Una estrategia alternativa que puede reducir el impacto de las enfermedades

provocadas por artrópodos es la manipulación del genoma del mosquito para reducir su

capacidad vectorial. No obstante, tienen que desarrollarse las técnicas para una

manipulación consistente y predecible del genoma del rrtosquito. Las técnicas requeridas

incluyen métodos eficientes de expresión de secuencias que impac:ten adversamente sobre

la replicación del patógeno en células de mosquito o mosquitos completos. Para éste fin es

necesario conocer los mecanismos de control genético que operan en el estómago del

mosquito, durante la alimentación con sangre, ya que les en el estómago del mosquito

donde la forma sexuada del parásito es más vulnerable, por encontrarse en forma

extracelular (aún no invade células o tejido del mosquito:) y porque no se ha reproducido,

además de que pasa algunas horas en el tracto digestivo.

L a idea de que es posible "construir" mosquitos refractarios parte de la observación de

que existen mosquitos que de manera natural son inmunes a cierto tipo de parásitos por

incompatibilidad fisiológica. En estos casos, aunque el parásito invade al vector y se

instala normalmente, no completa su ciclo (Collins @ al 1986 y Miller 4 1993).

En éste proyecto se estudiaron mosquitos hembra de Anopheles afbimanus, por ser

una de las especies transmisoras de P. v i v u más importante en Mkxico y América Latina.

14

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL.

Caracterizar moléculas que se expresan en los estómagos del mosquito

Anopheles albinzanus hembra, después de seis horas de alimentación con sangre.

OBJETIVOS PARTICULARES.

1. Identificar plásmidos con insertos de cDNA de un mini banco de expresión

obtenido de estómagos de hembras de Anopheles albimanus 6 h

postalimentación con sangre.

2. Analizar los insertos de interés por secuenciacibn.

3. Comparar las secuencias con secuencias almacenadas en bancos de información.

4. Identificar secuencias AUUUA (AURE) en los insertos de interés por

hibridización tipo Southern.

15

ESTRATEGIA EXPERIMENTAL

Para cumplir con los objetivos antes mencionados se planteó la siguiente estrategia

experimental:

AISLAMIENTO Y PURIFICACION DE PLASMIDOS

l. Crecimiento de bacterias transformadas conteniendo los plásmidos de interés,

en medio LB liquido con ampicilina.

2. Aislamiento y purificación del DNA de plásmido.

3. Determinación de la concentración del DNA de plásmidos.

LIBERACION DE INSERTOS.

1. Liberación de insertos de los plásmidos, cortando con la enzima de restricción

EcoRI.

2. Medición del tamaño de los insertos liberados, utilizando marcadores estándar

de peso molecular.

CARACTERIZACION DE LAS CLONAS DE INTERES.

l. Caracterización por secuenciación parcial del inserto.

2. Comparación de la secuencia obtenida, por medio de programas de

computación, con las secuencias almacenadas en los bancos de informacirjr ...

IDENTIFICACION DE SECUENCIAS AUUUA.

Identificación de secuencias AUUUA en el inserto de interés por hibridización

tipo Southern.

16

MATERIAL Y METODOS

Reactivos

Los rectivos utilizados para la realización de éste trabajo, heron de las firmas

siguientes: GIBCO BRL, SIGMA CO., PROMEGA., BOEHRINGER y MERCK, el

medio de cultivo y el antibiótico empleados heron de la marca SIGMA.

En éste proyecto se trabajó con el vector pCRII (Invitrogen) y bacterias receptoras

E.coZi DHS-a .

Crecimiento de bacterias.

Las bacterias E. coli que contienen el plasmid0 pCRII, se crecieron en medio LB-

ampicilina (50 pg/ ml), por 14 a 16 horas a 37°C en agitación constante (Sambrook & al

1989).

Aislamiento y purificación de DNA de Plásmidos.

Para la purificación de plásmidos se inocularon 250 m 1 de medio LB-ampicilina (para

cada muestra) con la bacteria y se incubaron por 16 a 18 hrs a 37" C en agitación

constante. Estos cultivos se utilizaron para el aislamiento y purificación de los plásmidos.

El aislamiento y purificación de plasmidos se realizó, utilizando el Kit "Plasmid SELECT-

250" (5prime + 3prime), basado en la purificación de plásmidos por columna

cromatográfica, y eliminación del RNA por el procedimiento de lisis alcalina modificada

(Birnboim y Doly, 1979).

Concentración de DNA

La concentración de DNA se calculó utilizando la fluorescencia emitida por el bromuro

de etidio intercalado dentro de las moléculas de DNA, comparando la fluorescencia de las

17

muestras con estándares de DNA de lambda, por goteo en un minigel de agarosa

(Sambrook gt al 1989).

Liberación del inserto de cDNA contenido en el plásrnlido pCRII.

El DNA de los plásmidos se cortaró con enzimas de restricción de acuerdo a metodos

reportados (Sambrook al, 1989). Se utilizaron 10 pg de plásmido de cada muestra para

digerirlo por 1 hr con 10 U de la enzima EcoRI y buffer apropiado para la enzima (2~1) ,

llevando la reacción a un volumen final de 20 pl con agua estéril (12 pl), a una

temperatura de 37°C.

Electroforesis en geles de agarosa.

Los geles de agarosa se prepararon a una concentración de 1% para analisis de

plásmidos completos y al 2% para analizar la liberación! de insertos, en buffer TBE 1X

(Tris boratos 4 m M , EDTA 1 mM pH 8.0) en presencia de bromuro de etidio O.Spg/ml.

Los geles se corrieron a 7-10 V/cm a temperatura ambie:nte, las moléculas se observaron

bajo luz ultravioleta (UV) y se les tomaron fotografias con cámara Polaroid tipo DS34

(Con capucha DSH-6) y pelicula tipo 667 I S 0 3000 (Sarnbrook gt al 1989). Los tamaños

moleculares aparentes del plásmido y los insertos se calcularon comparando su movilidad

electroforética con el marcador de peso molecular pGEh4, preparado por la digestión de

DNA pGEM-3 con Hinf I, Rsa I y Sin I, obteniendo fragmentos de 2.6, 1.6, l . 1, 0.67,

0.51, 0.46, 3.39 y 0.35 Kb.

Secuenciación de !a clona genómica aislada.

Para la secuenciación de la clona genómica se utili26 el metodo de "T7 Sequencing

Kit" (Pharmacia) basado en el método de terminación de cadena por

dideoxinucleosidotrifosfatos (ddNTP) (Sanger gt al 197'7), la cual consiste en preparar

cuatro reacciones diferentes, todas conteniendo DNA molde, iniciador y los cuatro

deoxinucleótidos, pero cada una conteniendo un ddNTP como terminador de la síntesis de

cadena de dideoxinucleótido y 0.8 pl (1pCi) de [ c x - ~ ~ S I dATP (Dupont) (Sambrook

1989). Para su detectar los fragmentos generados, estos se separaron por electroforésis

(Camara de secuenciación OWL, modelo S2S)en un gel de poliacrilamida-urea aí 6%. Las

condiciones de corrida heron las siguientes: 2000 Volts, 200 Miliamperios y 50 Watts.

Comparación de secuencias por programas de computación.

La secuencia de nucleótidos del fragmento, se comparó con las secuencias de genes

registrados en el Gene Bank. El programa utilizado para éste fin h e el BLAST network

service, version 1.4 application programs (Basic Blast cojmparado con la base de datos de

NIH).

Ensayos de Southern blot.

El DNA de Anopheles albimanus fue digerido con emimas de restricción, separado en

geles de agarosa al 2% y transferido a membranas de nylon por capilaridad (Southern

1975; Church y Gilbert 1984), (Sambrook gt al, 1989).

Transferencia de DNA digerido a membranas de nylon.

Para hacer la transferencia del DNA del gel a memblranas de nylon (Nytron S y S),

primero se depurinizó el ácido nucleic0 con HCI 0.25M dos veces por 15 min, después se

desnaturalizó con NaCl 1.5M, NaOH 0.5M, das veces por 15 min, y por último se

neutralizó con Acetato de Sódio 3M a pH 5.5 por espacio de 30 min. La tranferencia se

realizó por capilaridad a membrana de nylon en un secador de geles (EC355) (Sambrook

" et al 1989) utilizando buffer SSC 20X, dado que el tamaño de los insertos es < 500 pb. El

DNA unido a la membrana se fijó con luz ultravioleta usando un aparato que emite

radiaciones UV (Stratagene) a 1200 p joules, por dos minutos.

19

Prehibridización.

La prehibridización de DNA se realizó cubriendo la m.embrana a razón de lml/cm2 con

buffer de prehibridización (SSC 6X, Denhardts lox, SDS 1% y 50 &m1 de DNA de bajo

peso molecular) e incubando por 1 hr a 42" C en un horno de hibridación (autoblot, Bellco

Glass, INC),

Hibridización

Para la hibridación de las moléculas adheridas a la membrana a la sonda especifica se

eliminó la solución prehibridizadora y se adicionó la solución SSC 6X, Formamida 50%,

SDS 1% y 50 &m1 cDNA de estómago de mosquito de 6 horas postalimentación con

sangre, desnaturalizado a razón de O. 1 mVcm2 dle membrana (sonda marcada

radiactivamente), se incubó en el autoblot con agitación suave y continua toda la noche a

42°C.

Lavados.

La membrana de nylon se lavó después de la hibridización de la siguiente manera: 15

min a temperatura ambiente y 15 min a 37°C en: SSC 5 X, SDS 1% , y dos veces por 15

min a 37°C en cada uno de los siguientes soluciones: 1. SSC 3 X , SDS 1%; 2. SSC 2.5 X,

SDS 1% y 3. SSC 2 X, SDS 1%. Después de los lavados, la membrana se expuso a una

placa radiográfica a -70°C con placa intensificadora por un tiempo de 6 a 8 días

aproximadamente.

2 2 7 5 2 8 Obtención de sonda por RT-PCR

La sonda específica de A W A para la hibridización tipo Southern se preparó por

transcripción reversa y reacción en cadena de la polimerasa (RT- PCR)( Gurr, gt d. 1991).

La primera cadena de cDNA se sintetizó a partir de RN.A total (3 pl) de estómago de

mosquito de 6 h postalimentación con sangre, mezclados con lpl de Oligo dT (0.5 pg) y

8p1 de agua, la mezcla se calentó a 70°C por 10 min, se pasó a hielo y se centrifugó. A la

20

mezcla se le adicionaron 4 pI de 5X del primer buffer estandar, 2 pl DTT O. IM, 1 pl de

dNTPs (pH 7.0) se mezcló por 2 min a 42OC, se agregó 11.11 de la enzima retrotranscriptasa

Super Script I1 (BRL) y se incubo a 42°C por 50 min, por último se calentó a 70°C por

15min y se mantuvo a 4°C. La segunda cadena de cDNA se sintetizó por PCR en

presencia de iniciadores específicos para AUUUA. Se preparáron reacciones de 100 p1

utilizando Mg 25 nih4 (24 pl), dNTPs sin dCTP (50 pl), iniciador 1 (2 pl), iniciador 2 (2

pl), Taq DNA polimerasa (1 PI), primera cadena de cD:NA de estomagos de mosquitos

después de 6 horas de alimentación (2 pl), [ u ~ ~ P I ~ C T P (15 pl), agua (34 pl). Los ciclos

empleados para la PCR heron, un ciclo de 95°C por 5 min, 40 ciclos de 94°C por 2 min,

32°C por 3 min y 72°C por 3 min, y una extensión a 72°C por 10 min (Asson-Batress,

- al, 1994; Cázares-Raga, 1996).

Obtención de oligonucledtidos sintéticos

Para obtener oligonucleótidos sintéticos con las seculencias requeridas para el ensayo

de hibridación se construyeron iniciadores oligo dT conteniendo un sitio de restricción

Xba I en el extremo 5‘ ( 5‘- GCTCTAGAT16- 3 ’ ) y al otro iniciador una secuencia

específica rica en AUUUA corriente arriba con un sitio de restricción Sal I en el extremo

5 ’ ( 5 ’- CTCGTCGACTATTTATTTATTTAT-3 ’) (Asson-Batres, 1994;Cázare~-Raga,

1996).

21

RESULTADOS

Este trabajo comprendió la identificación y la caracterización parcial de moléculas que

se expresan en el estómago del mosquito Anopheles alhimanus hembra, a partir de un

banco genómico de cDNA clonado en el vector pCIUI, construido con mRNA de

mosquitos seis horas después de una alimentación con sangre.

AISLAMIENTO DE DNA DE PLASMIDOS

Para la caracterización de moléculas expresadas en los estómagos de los mosquitos se

eligieron al azar tres clonas de cDNA(E6-1, E6-3 y E6-4) insertos en el vector pCRII.

Para dicho análisis se hizo la extracción del DNA de los plásmido; y se analizaron por

electroforésis en gel de agarosa al 1%. En el DNA de las muestras, se observaron varias

bandas correspondientes a las formas estructurales del plásmido (fig 9): lineal,

superenrollado y circular relajado.

LIBERACION DEL INSERTO

Para comparar el tamaño de los fragmentos de cDNA presentes en las clonas, los

plásmidos de las clonas seleccionadas se sometieron a restricción con la enzima EcoRI, ya

que la secuencia que reconoce ésta enzima se encuentra a ambos lados del inserto. Los

plásmidos cortados se, separaron en un gel de agarosa al 1.5%, y se visualizaron por

fluorescencia, utilizando Bromuro de Etidio. Los insertos liberados fueron de tamaños

moleculares de 500 pb en E6-1, 450 pb para E6-3 y 400 pb en el caso de E6-4. (fig 10).

De éstas cepas se seleccionó la muestra E6-3 para el análisis de secuencia.

22

SECUENCIACION PARCIAL DE LA CLONA GIENOMICA.

Se realizó la secuenciación parcial de la clona E6-3 (fig. lo). La secuencia obtenida se

tradujo a una secuencia de aminoácidos y se hizo la comparación con las secuencias de

genes registrados en el Gene Bank. Para la secuenciaci6nY las reacciones de síntesis se

llevaron a cabo utilizando el "iniciador universal" (CTGGCCGTCATTTTAC), clonado en el

plásmido pCRII a poca distancia del inserto (- 84 pb).

Se lograron leer 173 pb de la clona E6-3, obteniendos'e una cadena de doce "C" lo que

indicó el inicio del inserto clonado, ya que en la estrategia de clonación de los insertos se

coloco esta secuencia hacia el extremo 5' (Fig. 7). Al analizar la secuencia por programas

de computación ( Blast ) se obtuvieron tres marcos de lectura abiertos, de los cuales, se

tomó el segundo para el análisis de comparación, por ser éste el segmento más largo con

60 pb (fig. 11).

Los resultados de la comparación, muestran que 30 plb de la secuencia son homólogas

en un 71% con un fragmento del precursor de la proteína :D2 regulada por CAMP (fig. 12),

lo cual puede ser importante debido a que el CAMP es un segundo mensajero regulador en

la expresión de varios genes, entre los cuales se encuentran los del operan Lac y genes

tempranos de Dictiostelium discoideum.

HIBRIDIZACION SOUTHERN BLOT

Para la identificación de secuencias AURE en las clonas E6-1, E6-3 y E6-4 se extrajo

el DNA de los plásmidos por el método de lisis alcalina, se cortó con la enzima de

restricción EcoRI, se separó por electroforésis en geles de: agarosa al 2%, se visualizó por

luz ultravioleta, se transfirió a membrana de nylon, se fijó por luz ultravioleta y se hibridó

23

con la sonda para localizar las secuencias AURE. El inserto que hibridó con la sonda

radioactiva fue el correspondiente a la clona E6-1 lo que indicó la presencia de estas

secuencias en ésta clona.

24

DISCUSION

El estudio de la biología molecular de los estómagos de los mosquitos Anopheles

albimanus hembra después de la alimentación con sangre, permitirá desarrollar técnicas

para una manipulación consistente y predecible del genonla del mosquito.

En nuestro grupo de investigación nos interesa #estudiar al mosquito Anopheles

albinlnnus porque es uno de los principales vectores de l a malaria en México.

Para éste trabajo se utilizó, un banco de cDNA construido con fragmentos de

aproximadamente 400 - 1000 pb que corresponde a men,sajeros que pueden codificar para

péptidos entre - 15-36 Kda lo que corresponde a proteínas que se ha observado que se

inducen por alimentación con sangre según se observa al analizar las proteínas de

9 estómagos alimentados con sangre en geles de poliacrilamida-SDS, incluyendo las

tripsinas. (Cazares, 1996), (Sanchez, 1996). Los fragmentos de cDNA heron obtenidos

por RT-PCR, a partir de cantidades muy pequeñas de RNA total de estómagos de

mosquito de 6 horas de postalimentación con sangre. La razón por la que se realizó la RT-

PCR fue para lograr suficiente cantidad de fragmentos para ser donados en el vector

pCRII. Este vector se usa para la donación directa de fragmentos obtenidos por PCR

debido a que tiene en sus extremos 3’un solo deoxi-tirnidilato, los cuales se uniran al

residuo deoxiadenilato que la Taq DNA polimerasa adiciona a cada extremo de la cadena

amplificada.

Se trabajaron tres clonas al azar, llamadas E6-1, E6-3 y E6-4. Los insertos de ]as tres

clonas se liberaron cortando con la enzima de restricción EcoRI, que reconoce 10s

25

extremos donde se encuentra el inserto y de esta manera se verificó que el inserto de

cDNA de mosquito se encuentra en el plásmido. Los insertos de las donas presentaron un

peso molecular de alrededor de 500 pb para E6-1, 450 pb para E6-3 y 400 pb para E6-4.

Estos datos sugirieron que efectivamente son insertos dle cDNA de estómagos, ya que

están en el rango de los fragmentos que heron clonados.

En este trabajo se analizó con mayor detalle la clona E6-3 de cDNA corespondiente a

un mensajero expresado en el estómago de los mosquitcls a las 6h postalimentación con

sangre. La clona E6-3 tiene un inserto de 450 pb que a la fecha ha sido parcialmente

secuenciada. La secuencia lograda se analizó mediante el programa Basic Blast

comparando con una base de datos con secuencias de DNA de muchos organismos la cual

es accesible vía internet y es mantenida por los Institutos Nacionales de Salud de E.U.

(NIH). Al traducir la secuencia obtenida, 10 aminoácidos de la secuencia tuvieron

hornologia del 71% con un fiagmento del precursor de la proteína D2 de Dictiostelium

discoideum, la cual esta regulada por CAMP. Esta hornologia puede ser importante por la

razón de que el CAMP es un segundo mensajero regu1ado:r en la expresión de varios genes

inducibles, entre los cuales se encuentran los del operón Lac y los genes tempranas de

desarrollo de Dictiostelium discoideum.

En el caso de que la region de regulación por CAMP realmente esté presente en la

proteína que analizamos de los estómagos de los mosquitos, esta podría estar relacionada

con la activación de genes durante la alimetación ccln sangre, fenómeno que esti

acompañado por la inducción de genes especificos tales como los de la Matriz Peritrofica

y enzimas digestivas.

26

Se sabe que en la región 3 ' UTR de varias proteílnas inducibles por estrés, está la

secuencia AUUUA (AURE), la cual puede hncionar como posible regulador en la

expresión genética. Por este motivo las clonas E6-1, E,6-3 y E6-4, se sometieron a un

análisis por medio de hibridación tipo southern con una sonda específica la cual contenia

las secuencias AURE. La sonda se obtuvo por RT-PCR ]marcando con [ C X ~ ~ P I ~ C T P .

Los resultados de la hibridización sugirieron en la clona E6-1 la presencia de

secuencias repetidas de AUUUA en el inserto separa'do por restricción del plásmido

pCRII, lo que podría indicarnos que éstas secuencias, all igual que en los mamíferos y en

el erizo de mar, podrían estar regulando la expresión de genes inducibles por estrés,

aunque en éste trabajo faltaría por verificar si las secuencias repetitivas AUUUA, son

inducibles por alimentación con sangre.

27

CONCLUSIONES

Las clonas E6-1, E6-3 y E6-4 contenían insertos de cDNA de estómagos de

mosquito hembra de Anopheles albimanus de seis horas postalimentación con sangre con

tamaños de 500,450 y 400 pb respectivamente.

El inserto de 450 pb correspondiente a la clona E6-3, mostró que diez pares de

bases de la secuencia presenta homología del 71% con un fragmento del precursor de la

proteína D2, regulada por C A M P .

El inserto de 500 pb que corresponde a la clona E6-1 hibridó con la sonda de

secuencias AURE, lo que probablemente indica que la secuencia esta implicada en la

regulacion de la expresión de genes inducibles por estrés.

PERSPECTIVAS

Verificar por medio de experimentos tipo Nothern la inducibilidad de las clonas E6-1,

E6-3 y E6-4.

Utilizar la clona E6-3 que presenta homología al precursor de la proteína D2 regulada

pcir CAMP, para realizar un tamizaje en un banco de DNA genómico para tratar de

identificar el gen completo correspondiente.

Una vez aislado el gen correspondiente a la clona E6-3, realizar su secuencia para

conocer su identidad y la regulación de su expresión.

28

RECOMENDACIONE!S

Para utilizar radioactividad, es necesario tomar todas las medidas de seguridad

necesarias. En primer lugar el uso de un detector de raldioactividad (geiger), durante y

después de la utilización de la radioactividad. Tambiénse debe usar el equipo de protección

como guantes, plastico de lucíta (o Plexiglas para el caso de [32Pl) y una area de trabajo y

el material utilizado, así como el uso de guantes, plastico de lucíta y una area restringida

para éste fin. Asi mismo los desechos deben descartarse en los recipientes adecuados y

colocando metiquetas que indiquen el isopo, la actividad utilizada y la fecha.

En el caso del manejo de luz ultravioleta, es necesario utilizar careta protectora o lentes

especiales.

29

Fig 1 Ciclo de vida de Plrrsmtotlium.

Fase 1. Fertilización: Inicia cuando una hembra de Anopheles se alimenta con sangre de una persona infectada. Los gametocitos (escapan de los eritrocitos para convirtirse en gametos libres, de machos y hembras. Los gametos machos producen 8 o más flagelos, durante la exflagelación (1). Este rompimiento libera a los flagelos y cada uno queda con un núcleo adherido. Si se encuentra con un gameto hembra se produce la feritilización (2) y se forma un cigoto (3). Este se desarrolla y forma un oocineto invasivo (4), que atraviesa la pared del estómago y se convierte en un oocisto.

Fase 2. Esporogonia: Desarrollo asexual en el mosquito. El oocisto crece (l), se divide y produce miles de esporozoitos invasivos (2). El oocisto maduro se rompe (3) y los esporozoitos libres migran a través del cuerpo del Irnosquito e invaden las glándulas salivales de éste.

Fase 3. Esquizogonia hepática: Desarrollo asexual en el hígado. Cuando el mosquito se alimenta de nuevo los esporozoitos son inyectados a la circulación sanguínea e invaden las células del hígado (I), convirtiéndose entonces en trofozoítos hepáticos (2), que crecen y se dividen para producir mile:s de merozoítos invasivos (3). Las células del hígado infectadas se rompen, liberando los merozoítos a la circulación sanguínea (4). Algunos esporozoitos se convierten en hipnozoitos (en el caso de P. vivax, los cuales permanecen como formas durmientes en las células del hígado, para desarrollarse meses o años después y causar la enfermedad al liberarse.

Fase 4. Esquizogonia eritrocítica: Desarrollo asexual en la sangre . Los merozoítos invaden a los eritrocitos (1) y se convierten en trofozoítos eritrocíticos (2). Estos crecen, y se dividen en 8 a 16 nuevos meroz'oítos (3). Cuando los merozoítos maduran, el eritrocito se rompe, y los merozoítos son liberados (4), iniciando nuevamente el ciclo (5). Conforme avanza la enfermedad algunlos merozoítos se desarrollan a gametocitos machos o hembras (6,7). Estos permanecen en la circulación pero se desarrollan posteriormente cuando son ingeridos por un mosquito.

Oocisto madurando sobre la pared del estómago

2 ESPOROGONIA

1 FERTILIZACION

Codigo de color

* Forma asexual invasiva

3 Fonna sexual invasiva

j <:re:imiento trofico, forma principal para la ma1t:plicación asexual

3 1

ANOPHELINOS

Anopheles

CULICINOS

Aedes Culex

Fig. 3 Caracteristicas distintivas en mosquitos anofelinos y culicinos. a.f..

flotadores de aire; a.g., barba anal; ab, abdomen; an, antena; br, cepillo de la boca; e, ojo;

h.h, pelos curvados; pa, palpos maxilares; p.h, pelos flotadores; pr, proboscis; 1 seg,

primer segmento abdominal; 8 seg, octavo segmento abdominal; si, sifon; sp, spiraculo; th,

toráx; tr, trompetas respiratorias; w.s, superficie del agua (Tomado de Little, 1963).

2 2 ’ 9 5 2 8

30

C.

Fig. 2 Representación esquematica de la formación de los gametos masculinos en

Plasmodium. (A) Microgametocito con un solo núcleo y un centriolo. (B) Endomitosis y

replicación del centriolo. (C) Formación de las fibrillas. (D) Asociación de núcleos y

mitocondrias cerca del punto de emergencia de los complejos de fibrillas. (E) Liberación

de microgametos, Abreviaturas: c., centriolo; r.e., retículo endoplásmico; f. f., fibrillas

flagelares; m., mitocondria; n., núcleo del microgametocito; n.g., núcleo del microgameto

(Tomado de Read, 198 1).

32

Fig. 4 Ciclo de vida de la hembra Alnopheles

Noche 1 : Alimentación. La hembra se alimenta con sangre.

Día 2: Descanso. Durante el día la hembra descansa en sitios fríos, sombreados y húmedos. Comienza el proceso de digestión de la sangre ingerida e inicia el desarrollo de SUS huevecillos.

Noche 2: Descanso y semigravidez. La digestión de la sangre y la producción de los huevecillos continua. El mosquito puede dejar la casa o cambiar su sitio de descanso.

Día 3 : Descanso y gravidez completa. Permaneciendo en un sitio húmedo sombreado y frío; la producción de huevecillos se completa.

Día 3 : Por la tarde. La hembra grávida vuela hacia un cuerpo de agua disponible y deposita de 50 a 150 huevecillos.

. El mosquito hembra puede entonces alimentarse nuevamlente con sangre e iniciar el ciclo nuevamente.

Larva. Los huevos se incuban 2 a 3 días. Las larvas se alimentan filtrando algas y otros materiales del agua. En condiciones favorables las larvas crecen rápidamente . Sufriendo tres procesos de muda.

Pupa. Depués de la tercer muda la larva se alimenta y crece nuevamente, entonces se convierte en una pupa móvil. En este estado no se alimenta. La pupa respira a través de dos estructuras llamadas trompetas, mientras el desarrollo del adulto procede internamente.

Emergencia del mosquito adulto. Después de dos a tres días el adulto emerge. La pupa se abre liberando a un adulto, que necesita secarse durante un tiempo para endurecer sus estructuras y posteriormente poder volar.

Fertilización. El apareamiento es la primera actividad de los adultos que recién han emergido. Después de la copulación, en el conducto genital de la hembra se forma un tapón, de una secreción depositada por el macho al final de la copulación.

/* r\ Fertilización

Día 3 (por la tarde) depósito de huevecillos en el agua

* Ciclo de vida de la hembra Anopheles.

3 Ciclo gonotrófico

33

Ca

Fig. 5 Canal alimentario de mosquito. , 41, intestino posterior; AM, intestino

anterior; Ca, cardia; CP, bomba cibarial; DD,diverticuloN dorsal; Es, esófago; MT túbulo

de Malpigio; PM, intestino medio (estómago); PP, bomba faringe; PR, proboscis; Re,

recto; SG, glandula salival; VD, diverticulo ventral (buche) (Tomado de Beaty, 1996).

34

(A) Antes de la alimentación con sangre

,

Vesículas secretoras Microvellocidad apical Células de unión

Núcleo

I 1 I I Laberinto basal

(B) Después de la alimentación con sangre.

Fig. 6 Diagrama esquemático de cambios ulltraestructurales en las células

secretoras de PM1 depués de la alimentación con. sangre. Las microvellosidades

apicales y los laberintos basales de las células epiteliares, desaparecen al alargarse y

aplanarse éstas células, originando la distención del estómago, después de la alimentación

con sangre. La formación de la PMl implica la desaparición de la vesiculas secretoras y la

distensión del RER. Todos estos cambios ocurren en todos los insectos (Tomado de Beaty

1996).

35

Estómago de mosquito

-1 c Aislamiento de RNA total

5' AAAAA" (aproximadamente 2% de poli A)

-1 c Oligo dT primer TITIT

-1 c Primera sintesis de cDNA 5' A A A A A 3 '

3' TTTTT 5'

-1

-1

C FLemover primer p o r precipitación con CTAB

C Adición de Oligo -dG

5' AAAAAGGGGG J'CCCCC TTTTTs.

-1 e Hidrolisis de RNA s'ccccc T T T T ~ '

-1

-1 C Primer ciclo de PCR generando I EcoRI-CCCCC I AAAAA" cDNA de doble cadena 3' GCGGG TTTTTs,

-1 c Amplificación por PCR

''1 EcoRI-CCCCC] AAAAA-NotI-A'' 3, A-EcoRI-GGGGG

Construcción de biblioteca en el vector pCRII

Fig. 7 Esquema del métodc para la construccih de la genoteca de cDNA de

estómagos de mosquitos hembra, er el vector pCRII, basado en la reacción en cadena de

la polimerasa (PCR) (Modificado de Gurr, gt al, 1991).

36

/ P m d u c t o i f T T T T T T ) 4 A 3’ 3‘A (CCCCCk

Nsi I Hind111 Kpn I Sac I BamH I

BstX I EcoR I EcoR V BstX I Not I Ava I PaeR7 I Xma 111 xho I Nsi I Xba I &a I T7 A

SPe I

Fig. 8 Vector de clonación pCR I I . Vector que contiene un solo deoxi-timidilato en

cada extremo 3’ para una ligación directa de productos de PCR. Los productos de PCR

poseen una sola deoxiadenosina en el extremo 3’ del DNA de doble cadena, ya que la

polimerasa termofila adiciona ésta base al final de la cadena. Estos extremos 3’ con

terminación A y T son usados para insertar el producto cle PCk dentro del vector pCRII

por una ligación directa.

37

Fig. 9 Análisis de DNA de plásmidos obtenidos de E. coli. El análisis se realizó por

electroforesis en gel de agarosa al 1%, visualizando el DNA de plásmido por

fluorescencia, utilizando bromuro de etidio.

Carriles: 1. Blanco; 2. E6-1; 3 . Blanco; 4. E6-2; 5. Blanco; 6. E6-3; 7 . Blanco; 8. E6-4

21,60C 4,268

1,904

38

Fig. 10 Análisis del DNA de plásmidos cortado con la enzima de restricción

EcoRI. Los plásmidos fieron cortados con la enzima de restricción EcoRI, separados en

un gel de agarosa al 1.5%, y visualizado por fluorescencia, utilizando Bromuro de Etidio.

Los insertos liberados heron de tamaños moleculares de 500 pb en E6-1, 450 pb para E6-

3 y 400 pb en el caso de E6-4.

Carriles: l . Marcador de peso molecular PGEM.; 2. blanco; 3 . E6-1 sin cortar; 4. E6-1

cortado; 5. E6-3 sin cortar; 6. E6-3 cotado; 7. E6-4 sin cortar; 8. E6-4 cortado; 9. blanco

2,615- 1,605-

517-

39

G TAA TGG ATA TCT GCA GAA TTC GGC TTA AGG AAT T[ cc ccc ccc ccc CCC~TAA CGG

A A T T C T G T G C A G T A C G A G A G G A A C C A C A G G T A C G T A T C G C T G G C T C A A T A C T A G

TTC GAC CGG ACT TTG GTA TAA CGC TAC GTA CGT T'CG CCG GAT TAT GCC TGA ACC

G C C T C T A A G G T C G T A G C C G A A C C G A G C C G A C A G T G G C C G A G T T C A T A G G T G T T C

GGTGATTAGATGGCACTACAAACTGTAAAGAGTC:TATTGCCATTACCTAACGCA

GTCGTCTTATCTGCTCTAGCGAGCACACCGGCGTACACTAGATCGGACACGACA

TGCACCTCGATCATAGGCATT

Fig. 11 Secuencia parcial de E6-3. La secuencia sub:rayada es el marco de lectura que

se utilizo para la comparación en el banco genomico, las bases en negritas indican el inicio

de la lectura. La secuencia de bases en el recuadro, nos indica que a partir de ésta

secuencia se trata del inserto en el plásmido de clonación, ya que ésta cadena de citocinas

se adicionó durante la construcción del banco de cDNA de estómagos de mosquito

después de 6h de alimentación con sangre.

40

Inserto M I E V H V V S D L V Y A G V L A R D K T T A L G N G N R L F T V C S A I

Fragmento Precursor de de la 248 E:] F ¿ i A D F A u 3 26 I

proteína D2

Fig. 12 Comparación de una parte de la secuencia con un fragmento del precursor de la proteína D2 regulada por C A M P , con una homología entre éstos dos fragmentos de 71%.

41

Buffer SSC 2OX

APENDICE

2 2 7 5 2 8

Disolver 173.3 g de NaCl y 88.2 g de citrato de

sodio en 800 m1 de agua. Ajustar el pH a 7.0 con

unas gotas de una solución de NaOH.

Ajustar el volumen a un litro con agua. Esterilizar

por autoclave.

Solución de Denhardt lOOX 10 g de Ficoll (type 400, Pharmacia), 10 g de

polivinilpirrolidona, 10 g de albumina serica de

bovino (Fraccion V; Sigma), y agua a 500 ml.

Esterilizar por filtración y mantener a -20°C.

Sodio dodecil sulfato (SDS) 10% Disolver lOOg de SDS grado electroforesis en

(tambien llamado sodio lauril sulfato) 90 m1 de agua. Calentar a 68" C para disolver.

Ajustar el pH a 7.:2 adicionando gotas de HCl

concentrado. Ajustar el volumen a un litro con

agua.

Solución para la prehibridización Preparar 32 m1 de la siguiente solución (partiendo

de los stocks): SSC 6X, Denkrdt lox, SDS 1% y

DNA de bajo peso molecular (genómico) 50 pg/ml,

ajustar con agua.

Solución para la hibridización Preparar 20 m1 de la siguiente solución: SSC 6X,

Formamida 50%, SIIS 1% y DNA 50 pg/ml

(sonda marcada radiactivamente), ajustar con agua.

42

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