Understanding the mechanisms by whichB cells escape self tolerance

The role of CD35 and CD21 in the pathogenesis ofcollagen-induced arthritis

David Fernando Plaza

Degree project in biology, Master of science (2 years), 2010Examensarbete i biologi 45 hp till masterexamen, 2010Biology Education Centre and Department of Cell and Molecular Biology, Uppsala UniversitySupervisor: Sandra Kleinau

1  

Contents 

 Abbreviations Abstract  

1. Introduction 1.1. Pathogenesis of rheumatoid arthritis 1.2. Collagen induced arthritis 1.3. The complement system 

1.3.1. Complement receptors 1.3.2. Complement receptors in autoimmunity 

1.4.  Marginal zone B cells  2. Materials and Methods 

2.1. Hybridoma cell culture 2.2. Mice 2.3. Induction of CIA 2.4. In vivo CR1 blocking experiment 2.5. Anti‐BCII ELISA 2.6. Magnetic cell separation (MACS) of spleen B cells 2.7. B cell transfer into cr2+/+ and cr2‐/‐ mice  2.8. FACS 2.9. Statistics 

3. Results 3.1. Increased CD19 expression in cr2‐/‐ mice on DBA/1 background. 3.2. CIA incidence after anti‐CR1 treatment.  3.3. CIA incidence in DBA/1 mice transferred with cr2‐/‐ B cells 3.4. Homing of cr2‐/‐ B cell in transferred DBA/1 mice 3.5. CIA incidence in cr2‐/‐ mice transferred with cr2+/+ B cells 

4. Discussion 5. Acknowledgements 6. References 

      

         

2  

Abbreviations 

 Ab    Antibody BCII    Bovine collagen type II BSA    Bovine serum albumin CIA     Collagen induced arthritis CFA    Complete Freund´s Adjuvant CR1    Complement receptor 1 CR2    Complement receptor 2 EDTA    Ethylenediaminetetraacetic acid ELISA    Enzyme linked immunosorbent assay FACS    Fluorescence activated cell sorting FCS    Fetal calf serum FDC    Follicular dendritic cells FITC    Fluorescein isothiocyanate i.d.    Intradermal Ig    Immunoglobulin IL    Interleukin i.v.    Intravenously mAb    Monoclonal antibody  MACS    Magnetic activated cell sorting MHC    Major histocompatibility complex MZ    Marginal zone  OD405    Optical density measured at 405 nm Ova    Ovalbumin PBS    Phosphate buffer saline PE    Phycoerythrin  RA    Rheumatoid arthritis RCA    Regulators of complement activation SD    Standard deviation SLE    Systemic lupus erythematous Th17    T helper 17 TNF‐α    Tumor necrosis factor α WT    Wild type 

            

3  

Abstract  The  immune response evoked  in collagen  induced arthritis (CIA)  is dependent on the production of auto antibodies by B  cells; however  some other  roles have been attributed  to  this  cell population such as antigen presentation  to T  cells, cytokine  secretion, expression of co  stimulatory molecules and  production  of  neolymphogenic  compounds.  To  indirectly  evaluate  the  effect  of  CD35/CD21 absence on B cell receptor signaling threshold, the expression level of CD19 was evaluated in DBA/1 mice deficient  in CD35/CD21  (cr2‐/‐)  and  cr2+/+ DBA/1 mice. We  found  that  leukocytes deficient  in CD35/CD21 show increased expression of CD19 (10‐30% increase) in the DBA/1 genetic background. Adoptive  transfer  experiments were  carried  out  to monitor  the  effect  on  CIA  incidence  and  anti‐bovine collagen type (BCII) antibody production derived from transferring cr2‐/‐ and cr2+/+ B cells into cr2+/+  and  cr2‐/‐ mice,  respectively. The  transfer of  cr2‐/‐ B  cells  augments  the  risk of CIA  in DBA/1 female  mice.  The  relative  amount  of  anti‐BCII  IgG  is  higher  in  these  animals  69  days  post immunization. On the other hand, the transfer of cr2+/+ B cells reduces the risk of CIA in cr2‐/‐ female mice. The production of anti‐BCII  IgM  is  lower  in the animals transferred with cr2+/+ B cells 31 days post immunization. This experimental evidence suggests a strong association between the lacking of CD35 and CD21 and an  increased risk of CIA,  implying an  important role of CD35/CD21  in tolerance breakage preceding CIA onset.                                  

 

4  

1. Introduction  

1.1.  Pathogenesis of rheumatoid arthritis   

Rheumatoid  arthritis  (RA)  is  a  chronic  disease  primarily  affecting  the  joints,  causing  synovium inflammation,  as well  as  cartilage  and  bone  degradation mainly by  the  effector  activity  of matrix metallophylic macrophages  (1).  It  is a complex autoimmune disease and  its prognostic depends on many already established factors, such as genetic predisposition (2), gender bias and age (3).   The  reported  incidence  and  prevalence  of  this  inflammatory  disease  vary  according  to  genetic background  and  age  distribution  of  the  population,  as well  as  to  diagnosis  accuracy  (4).  Reliable incidence measurements are only available for Europe and North America, with 29 and 38 cases per 100,000 population, respectively (5).     Different cytokines and lymphocyte populations have been shown to be involved in RA pathogenesis (6). Thus, the neutrophil recruiting role of T helper 17 (Th17) cells, a T cell subpopulation specialized on producing  IL‐17, has been  recently highlighted  in RA pathophysiology  (7,8). Th17 cells promote angiogenesis by  inducing  the production of proinflammatory  cytokines,  such as  IL‐1 and TNF‐α, as well as it stimulates bone resorption, metalloproteinases activity and matrix catabolism (9,10).  B cells have been seen to be involved in the pathogenesis of RA. Auto‐antibodies against citrullinated peptides  or  to  the  IgG  Fc  region  (rheumatoid  factor)  are  produced  in  RA  patients  (11),  however, rheumatoid  factor  is also detected  in the serum of 5% of the healthy population although at much lower  titers. Rituximab, a B cell depleting  therapy based on  the  specific  recognition of  the  surface marker CD20, has been shown to significantly reduce the symptoms  in RA patients (12). Apart from the established role on auto‐antibody production, B cells may perform various functions contributing to RA immune responses, such as cytokine production (both regulatory and activatory cytokines) and T cell activation, via antigen presentation and expression of co stimulatory molecules (12).              

 1.2.  Collagen‐induced arthritis 

 The collagen‐induced arthritis  (CIA)  (13) model  is  induced by a single  intradermal  (i.d.)  injection of collagen  type  II  (CII)  in  complete  Freund’s  adjuvant  (CFA)  in  the  susceptible mouse  strain  DBA/1 (carrying the H‐2q MHC haplotype) (14). When using a dose of 50 µg CII per mouse a 90% and a 65% incidence of arthritis is observed in male and female DBA/1 mice respectively (15), however, using a lower CII dose of 20 µg  reduces de  incidence, particularly  in  female DBA/1 mice,  in which only 20‐30% will develop a mild disease (16). The strong MHC haplotype correlation in mice and humans with arthritis  indicates  that  the  immune  response  in  CIA  and  RA  is  highly  dependent  on  T  cell costimulation (17). The triggered immune response against CII evokes the production of IgM and IgG anti‐CII antibodies and promotes the development of polyarthritis (figure 1), with synovial infiltration and cartilage and bone destruction.    

5

  Figure 1. CIA model. DBA/1 female mice were  injected  i.d. with 20 µg of BCII  in CFA and were monitored for scoring of joint inflammation from day 21 after immunization and onwards. Front and back unilateral swelling of limbs are shown.   

1.3. The complement system  

The complement system was discovered more than 100 years ago by Jules Bordet as a complement to the opsonizing and bactericidal activity of the immunoglobulins (18). This system comprises more than 30 serum proteins and receptors (19,20) that can be  involved  in a variety of functions, such as activation,  regulation, antigen opsonization, assembly of pore  forming  complexes and  chemotaxis. The system is divided into three different activation pathways: Classical, alternative and lectin; all of them leading to the proteolytic cleavage and activation of the central components C3 and C5 (figure 2).   

  Figure 2. The complement system. Classical, lectin and alternative complement pathways. As a consequence of complement system activation, C3 degradation products are formed, able to bind to complement receptors on immune cells. Adapted from (21). 

 The classical pathway was  the  first activation  route  to be discovered. This  is based on  the  immune complex  recognition by C1q. C1q  is  a homohexamer  composed by  filamentous  subunits, having  a globular domain and a collagen like region at each of the ends. The binding of C1q to the Fc part of the  antibody  in  an  immune  complex  leads  to  the  activation  of  the  serine  protease  heterodimer C1r/C1s. C1r/C1s cleaves C4 and C2, forming together the classical pathway C3 convertase (22).  

6  

Some sugars on pathogen surfaces are  recognized by  two different  lectins, mannose binding  lectin (23)  and  ficolin.  These  two  lectins have  a  structure  resembling C1q  and  form  a  complex with  the C1r/C1s‐like serine proteases MASP1 and MASP2. Once the whole complex is activated, it cleaves C4 and C2, assembling the same C3 convertase that is used by the classical activation pathway (24).    The  alternative  pathway  is mainly  considered  an  amplification  route  for  the  other  two  activation pathways. The pathway  is  triggered by  the spontaneous cleavage of  the C3 molecule  into C3b and C3a in a process called C3 tickover. Afterwards, more C3 molecules are proteolytically cleaved by the alternative pathway C3 convertase (C3bBb) and the reaction is amplified (25).  C3b  stays  attached  to  the  antigen  surface  and  binds  to  the  already  formed  alternative  or classical/lectin pathways C3  convertases  (C3Bb or C4b2b)  to generate  the C5  convertase. This will cleave  C5  into  C5b  and  C5a,  where  C5b  acts  as  a  binding  substrate  for  the  components  of  the membrane attack complex, C6, C7, C8 and C9. The membrane attack complex forms a pore shaped structure that osmotically  lyses a reduced group of thin wall gram‐negative bacteria such as species of the genus Neisseria (26,27).  The small fragments produced from the C3 and C5 cleavage, C3a and C5a, work as chemoattractants able to recruit a variety of  immune cells. The accumulation of  immune complexes  in  joints  leads to excessive  proteolysis  of  C3  and  C5  that  promotes  the  anaphylatoxins  C3a  and  C5a, which  recruit neutrophils and macrophages into the joint synovium (23).      1.3.1. Complement receptors 

 There are  several complement  receptors  (28) and  two of  them, CR1  (CD35) and CR2  (CD21), have shown to be important in the regulation of the adaptive immune response. In mouse, these receptors are  produced  by  alternative  splicing  from  the  cr2  gene  primary  transcript,  giving  rise  to  the expression of a  short product  (CR2) and a  long one  (CR1). The basic structure of both  receptors  is highly similar  (figure 3),  including short consensus  repeats composed of 60 amino acids  (29). CD35 and CD21 are widely expressed on a variety of immune cells subpopulations in human, such as T cells, B cells, macrophages, FDC and erythrocytes. On the other hand, the expression of these receptors is restricted to B cells and FDC in mice (30).  CD35 mediates phagocytosis of immune complexes bound to C3 degradation fragments, while CD21 binds  simultaneously with  BCR  to  immune  complexes  containing  iC3b  and  C3d,  promoting  B  cell activation and proliferation.          

  

7  

Figure 3. Mouse complement receptors 1 (CD35) and 2 (CD21). CD35 and CD21 are alternative splice products from the gene cr2. The different C3 proteolysis products acting as ligands are shown, as well as the binding sites for two commonly used monoclonal antibodies employed for the characterization of these receptors, 8C12 and 7E9. Adapted from (29). 

 Recently,  it has been  shown  that CR1 molecules expressed on  the surface of MZ B cells,  transport immune complex from the marginal zone to the spleen follicles, transferring high molecular weight antigens  to  the  resident  FDC.  The  same  CR1‐mediated  transport  is  responsible  of  transporting immune complexes  involving high molecular weight antigens to the lymph node follicles (31). Inside the lymph nodes, naive B cells are responsible of transporting the C3‐coated immune complexes into the  follicles  (32,33).  Studies  in  CD35/CD21  deficient  mice,  generated  on  a  C57Bl/6  genetic background, have shown that these mice have increased CD19 expression (34), reduced amounts of CD5+ B1 cells (35) and decreased  IgM and IgG titers towards sheep red blood cells (36).   1.3.2. Complement receptors in autoimmunity  Contradictory results have been published regarding the role of CD35/CD21 in CIA. Recently, Kristine Kuhn and colleagues used male cr2‐/‐ DBA/1j mice and 400 µg of BCII  in CFA to establish CIA. Their results demonstrated that deficiency  in CD35/CD21 significantly reduces the CIA severity compared to wild type (WT) DBA/1 males and that the production of anti‐cyclic citrullinated peptide antibodies is  reduced,  as well  as  the  level  of  anti‐BCII  and  anti‐murine  CII  IgG  and  IgG2a  antibodies  (37).  In contrast, our group  recently  reported  increased CIA  incidence  in cr2‐/‐  female DBA/1 mice  injected with  low BCII dose (20 µg/dose)  in CFA compared to WT  female DBA/1 mice  (16). The cr2‐/‐  female DBA/1 mice  demonstrated  also  increased  complement  levels  and  sustained  IgM  anti‐CII  response compared to WT females.    It has been shown that the expression of CD35 and CD21 is significantly reduced on peripheral B cells of patients with systemic lupus erythematosus (SLE) (38,39). Or group has shown that the percentage of  peripheral  B  cells  expressing  CD35  and  CD21,  as  well  as  the  expression  level  of  these  two receptors, are significantly reduced in RA patients (data not published). Issak and collaborators have shown  that CD35 expression  is profoundly  reduced on memory B  cells derived  from  SLE patients; however,  this  reduction  can  be  a  consequence  of  a  negative  feedback  loop  in  the  SLE  immune response rather that a factor predisposing the individual to SLE development (40).          Previous studies have shown that the presence of C3b (CD35 ligand) inhibits the proliferation of tonsil derived  human  B  cells  activated  with  anti‐IgM,  IL‐2  and  IL‐15  in  vitro,  remarking  the  inhibitory function of CD35 in human B cell activation (41).       1.4.  Marginal zone B cells  

 The  spleen  is  a  complex  secondary  lymphoid organ  responsible  for  the  capture  and processing of blood born antigens and  the  triggering of  the  immune  response against  them.  It also  removes  the senescence erythrocytes  from  the circulation  that are phagocytosed by  the  resident macrophages. The whole erythrocyte turn over process is carried out in the red pulp. The spleen  is  irrigated by an afferent  artery  branching  into  the  white  pulp  and  delivering  its  content  into  the marginal  zone dividing  the  red  pulp  (erythrocyte  turn  over  structure)  from  the white  pulp  (lymphoid  structure) (figure 4) (42).   

8  

  

Figure 4. General architecture of the spleen. Two regions are clearly distinguishable: The red pulp constituted of cords and venous sinuses and the white pulp formed by lymphoid tissue. The lymphoid white pulp includes regions of antigen  capture and processing; a T  cell  zone where  the antigen  is presented and B  cell  follicles where the B cells are activated and the affinity maturation takes place. Image adapted from (42).  

 The  white  pulp,  following  the  common  pattern  shown  by  most  secondary  lymphoid  organs,  is composed by professional antigen presenting cells, macrophages, T cells and B cells, the latter either forming follicles or surrounding the whole structure in the form of marginal zone (MZ) B cells. Those MZ B cells are characterized by the expression of IgMhi, IgDlo, CD23‐, CD21hi and CD1dhi and produce high amounts of  low affinity  IgM and  IgG (43). These cells have been shown to be  important  in the immune  response  against encapsulated bacteria  and T  independent multivalent antigens. Another important function of the MZ B cell population lies on the transport of immune complexes from the MZ to the B cell follicles as a constant antigen supplier to the stroma derived follicular dendritic ells (FDC), acting basically as an antigen “shuttle” (44).  Aim  The aim of this project is to evaluate the role of CD35 and CD21 on B cells in the pathogenesis of CIA, bearing in mind the reported importance of B cells in the immunopathogenesis of RA. To accomplish this, female cr2‐deficient DBA/1 mice (cr2‐/‐) and female WT DBA/1 mice were used  in different CIA experiments,  including  in vivo blockage of CR1 and  the adoptive  transfer of cr2‐/‐ and cr2+/+ B cells into DBA/1 and cr2‐/‐ female mice.                      

9  

2. Materials and Methods  

2.1 Hybridoma cell culture  The  B  cell  hybridoma  cell  line,  8C12,  a  rat  IgG2a  monoclonal  antibody  to  mouse  CD35,  was maintained in culture and constantly expanded in DMEM (SVA, Uppsala, Sweden) supplemented with 5% fetal calf serum (FCS), 10 mM HEPES, 2 mM L‐glutamine, 50 µM β‐mercaptoethanol and 1 µg/ml streptomycin/penicillin. Nine liters of culture supernatant were collected and filtered through a 0.45 µm  pore  diameter  nitrocellulose  membrane.  A  previously  equilibrated  25  ml  GammaBind  Plus Sepharose  column  (Pharmacia Biotech, Uppsala,  Sweden) was employed  to purify  the monoclonal antibodies produced. The column was washed with 125 ml NaH2PO4 * H2O and the bound antibodies were detached using a 100 mM glycine‐HCl solution (pH 2.7), collecting 16 x 2 ml fractions per liter of culture supernatant. The fractions were directly neutralized with 300 µl/fraction of 1 M Tris‐HCl (pH 8.5).  The  OD280  was  measured  to  establish  the  fractions  containing  monoclonal  antibodies.  The fractions with an antibody concentration above 100 µg/ml were pooled and concentrated to 3 mg/ml utilizing Amicon Ultra‐15 Centrifugal Filter Units with Ultracel‐50 membrane (Millipore, Cork, Ireland) according  to  the  manufacturer  instructions.  The  concentration  was  calculated  according  to  the formula: Concentration (mg/ml) = (OD280/1.5).         2.2 Mice  DBA/1 and cr2‐deficient DBA/1 (cr2‐/‐) mice were used. The mice were used at 4‐6 weeks of age. The animals were kept at Uppsala Biomedical Centre Animal Facility and feed ad  libitum with water and dry  pellets.  All  experiments  were  approved  by  the  local  ethics  committee  (Uppsala  tingsrätt, Sweden).     

 2.3 Induction of CIA  Two mg/ml  bovine  CII  (BCII)  stock  solution was  prepared  in  10 mM  ascetic  acid.  The  BCII  stock solution was additionally diluted with PBS to 800 µg/ml and a 1:1 emulsion with complete Freund´s adjuvant (CFA) was prepared. The animals were anesthetized with isofluran (Baxter Healthcare, Kista, Sweden) and injected intradermally with 50 µl of the emulsion at the base of the tail giving 20 µg of BCII per mouse. After day 20 post  immunization, arthritic scores were assessed every other day  to establish CIA  incidence,  severity  and onset day.  The  arthritic  score was  assigned  according  to  the following observations: One point was given for each swelling finger, five points per swelling mid paw and five points per wrist or ankle, giving a maximum score of 15 per limb (60 per animal).   

 2.4  In vivo CR1 blocking experiment  In order  to evaluate  the effect of CD35 blocking on CIA  incidence, 300 µg of  rat  IgG2a anti‐mouse CD35  (clone  8C12)  were  intravenously  (i.v.)  injected  into  9  DBA/1  female  mice  two  days  prior immunization with 20 µg BCII in CFA. As controls, 9 animals were injected with 300 µg of IgG2a anti‐OVA  (clone O3G64) before  collagen  immunization, whereas  6  additional  animals were  immunized with the same collagen concentration without any previous treatment. The mice were bled on days 5, 11, 20 and 41 post  immunization  to perform  IgM and  IgG anti‐BCII ELISAs. Arthritic scores were assessed every other day,  starting 20 days after  immunization,  to establish CIA  incidence,  severity and onset day.         

10  

2.5 Anti‐BCII ELISA    

For IgM measurement, 96 well plates were coated with 10 µg/well BCII in PBS, and incubated for 72 h at  4°C  in  a  humid  chamber.  Thereafter,  the  plates  were  washed  using  0.05%  Tween‐20  in  PBS (washing  buffer)  and  the  remaining  unspecific  binding  sites  were  blocked  with  1%  BSA  in  PBS (blocking  buffer).  The  sera  were  diluted  1:20,  1:40,  1:80  and  1:160  and  added  in  the  wells  by duplicate. Some  independent wells were coated with blocking buffer to determine  the background optical density and the plates were  incubated overnight at room temperature  in a humid chamber. The plates were  then  rinsed employing washing buffer and 1:500 polyclonal alkaline phosphatase‐conjugated rat anti‐mouse IgM (Sigma‐Aldrich, Steinheim, Germany) was added and incubated for 2 h  at  room  temperature.  After  the  plates  were  profusely  washed,  50  µl  of  1  mg/ml  P‐nitrophenylphosphate  in  1 M  diethanolamine  /  1 mM MgCl2  buffer were  added.  After  90 min  of incubation at room temperature the OD405 was measured  in a Versamax tunable microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).   IgG anti‐BCII ELISA was performed as for IgM, but adapting a few steps. The plates were coated with 5 µg/well BCII and  incubated overnight at 4°C  in a humid chamber. Sera were diluted 1:100, 1:1000 and  1:10000  in  duplicate  and  incubated  for  2  h  at  room  temperature.  Polyclonal  alkaline phosphatase‐conjugated  sheep  anti‐mouse  IgG  (1:7000  F(ab´)2  fragments)  were  used  for  IgG detection. The OD405 was measured after 40 min incubation at room temperature in the presence of alkaline phosphatase substrate. 

 2.6  Magnetic activated cell sorting (MACS) of B cells  Wild  type  and  cr2‐/‐  mice  were  killed  by  CO2  and  the  spleens  were  surgically  removed.  A homogeneous cell suspension was prepared by disaggregating the spleen on a sterile alum mesh over a petri dish with PBS. The cell suspensions were centrifuged at 300 x g for 7 min and the cells were suspended in 5 ml ACK lysing buffer (150 mM NH4Cl, 9 mM KHCO3 and 10 µM EDTA.Na2∙2H2O) for 5 min  to  lyse  the  erythrocytes.  Thereafter,  5  ml  of  PBS  (137  mM  NaCl,  2.68  mM  KCl,  8.09  mM Na2HPO4*2H2O  and  1.47 mM  KH2PO4) were  added  to  stop  the  lysis  reaction.  The  suspended  cells were counted in a Bürker chamber and adjusted to 1.11 x 108 cells/ml in degassed 0.5 % BSA (Merck, Darmstadt, Germany) in PBS (MACS buffer). The cell suspension was stained with 250 ng/1 x 106 cells of biotin‐conjugated anti‐mouse CD43 (clone eBioR2/60, eBioscience, San Diego, CA) and  incubated for 25 min at 4°C. Subsequently, the cells were spinned down and suspended in the same volume of MACS buffer used earlier  to adjust  the  cell density up  to 1.11  x 108  cells/ml. One µl/2  x 106  cells streptavidin‐conjugated magnetic beads (MiltenyiBiotec, San Diego, CA) was added and incubated for 25 min at 4°C. Finally, the cells were washed, resuspended in 500 µl MACS buffer and sorted through pre chilled LS columns (Miltenyi, Bergisch Galdbach, Germany). The CD43 negative fraction (B cells) was  collected, washed  and  suspended  in  sterile  PBS.  The  cells were  counted  and  the  cell  density adjusted to 3.3 x 106 cells/ml.      

 2.7  B cell transfer into cr2+/+ and cr2‐/‐ mice   Four to six weeks old cr2+/+ and cr2‐/‐ female DBA/1 mice were randomly distributed into 4 different groups; two groups of cr2+/+ mice and two groups of cr2‐/‐ mice. The two groups of each strain were then injected i.v. with 1‐1.5 million cr2‐/‐ B cells or cr2+/+ B cells suspended in 300 µl PBS. In addition, two control groups, each consisting of 12 cr2+/+ and 4 cr2‐/‐ female mice, were treated with PBS only (300  µl/mouse).  The  mice  were  bled  on  days  11,  31  and  69  post  immunization  for  measuring antibody levels to BCII.     

11  

2.8  FACS 

To evaluate the purity of the B cells injected into the recipients, as well as to establish the homing of the  transferred B  cells  and  to measure CD19  expression  in  cr2‐/‐ DBA/1 mice we performed  FACS analyses.   Mice  that  had  been  injected with  B  cells were  killed  at  the  end  of  the  experiment  (day  69  post immunization), the spleens were removed and splenocyte suspensions prepared. Samples of MACS separated B cells (to be transferred) and splenocytes from B cell transferred mice were suspended in 0.5% BSA  in  PBS  (FACS  buffer),  counted  and  adjusted  to  2  x  106  cells/ml. One  hundred µl  of  cell suspension were added per FACS tube. To establish the purity of B cells, 5 x 105 cells from the MACS sorting  were  stained  with  Phycoerythrin  (PE)‐conjugated  anti‐mouse  B220  (clone  RA3‐6B2;  BD Pharmingen, San Diego, CA) and Fluorescein isothiocyanate (FITC)‐conjugated anti‐mouse CD3 (clone DaA3; EuroBioSciences, Friesoythe, Germany).   In order  to examine  the homing of  the  transferred B cells  into  the  recipient mice,  the splenocytes were stained with FITC‐conjugated anti‐mouse B220 (clone RA3‐6B2; BD Pharmingen, San Diego, CA) and biotin‐conjugated anti‐mouse CD35  (clone 8C12; BD Pharmingen, San Diego, CA)  for 20 min at 4°C. Thereafter, the cells were washed and stained with PE‐conjugated streptavidin for 20 min at 4°C.   Additional  FACS  tubes  with  cells  were  incubated  with  FITC  and  PE‐conjugated  rat  IgG2a  (BD Pharmingen, San Diego, CA) and used as  isotype controls. After staining, the cells were washed and suspended in 500 µl of 1% paraformaldehyde in PBS.   To  compare  the  expression  of  CD19  on  leukocytes  (B  cells)  isolated  from  DBA/1  and  cr2‐/‐ mice, spleen and lymph nodes were extracted from 3 females and 3 males of each strain. Cells suspensions were prepared as described above from spleen and pooled lymph nodes from individual mouse and the cell concentration adjusted to 2 x 106 cells/ml. Two hundred thousand cells were stained with rat anti‐mouse PE‐conjugated CD19 (clone 1D3; BD Pharmingen, San Diego, CA) for 20 min at 4°C in the dark. As  a  control  of  unspecific  antibody  binding,  similar  number  of  cells was  incubated with  PE‐conjugated rat IgG2a for 20 min at 4°C in the dark. The unbound antibody was removed by washing and the cells were fixed using 500 µl of 1% paraformaldehyde in PBS.   The samples were acquired on a FACScan (BD Biosciences, San Diego, CA) equipped with a 480 nm argon laser and analyzed using CellQuest software (BD Biosciences, San Diego, CA). 

2.9 Statistics  Statistical significance on  IgM and  IgG anti‐BCII  levels among different groups was calculated using two tailed student T‐test. Student T‐test was also used to verify differences on CD19 expression level. Fisher exact test was utilized to evaluate the statistical significance on CIA‐incidence.   

           

12  

3. Results  3.1.  Increased CD19 expression in cr2‐/‐ mice on DBA/1 background.  It has previously been reported that CD19 expression is enhanced in cr2‐/‐ C57BI/6 mice (34). To verify that this is also the case when cr2 knock‐outs are on a DBA/1 background we analyzed CD19 in cr2‐/‐ DBA/1 mice  in comparison with WT DBA/1 mice. We  found  that CD19 expression was  significantly increased in male lymph nodes (p = 0.003, figure 5) and female spleens (data not shown, p = 0.0004). A tendency towards higher expression of this B cell marker was also observed in the spleen of males (figure 5). 

  

Figure  5.  Expression  of  CD19  in  cr2‐/‐ DBA/1 mice. A.  The  average  +  standard  deviation  (SD)  of  the mean fluorescence intensity (MFI) of CD19 on splenocytes and lymph node cells from 3 DBA/1 male mice and 3 cr2‐deficient DBA/1 male mice are shown. B. Two representative overlaid histograms corresponding to splenocytes and lymph node cells from a DBA/1 and a cr2‐/‐ mouse. * = p < 0.05      

  3.2. CIA incidence following anti‐CR1 treatment.   In  order  to  evaluate  the  role  of  CR1  in  CIA  pathogenesis  in  DBA/1 mice, we  blocked  the  amino terminal region of CR1 using the monoclonal antibody 8C12 in vivo. Control DBA/1 mice were treated i.v. with  300  µg  anti‐Ova  (O3G64)  in  PBS  or  left  untreated.  The mice were  treated  24  h  before immunization with BCII. We assessed the arthritic scores every second day beginning on day 21 post immunization to determine disease severity, time of onset and CIA incidence. No conspicuous effect on the incidence of the anti‐CR1 treated animals compared to the incidence of the anti‐Ova injected animals  was  found  (figure  6),  although,  anti‐CR1  treated mice  showed  a  tendency  of  increased arthritis  incidence  compared  to  the  anti‐Ova  treated mice.  Notably,  both  anti‐CR1  and  anti‐Ova treatments seemed to induce higher CIA incidence in mice than in untreated individuals.                       

13  

 Figure 6. CIA  incidence  in DBA/1 mice  treated with anti‐mouse CR1. A  trend  is observed  towards a higher incidence of CIA in anti‐CR1 injected group (n = 9) compared to the anti‐Ova (n = 9) and non‐injected groups (n = 6).  

 Regarding IgM anti‐BCII antibodies in the animals, we found that all groups produced similar levels of IgM at different time points after immunization (figure 7). The highest anti‐BCII levels were observed at  day  20  post  immunization,  with  animals  treated  with  anti‐CR1  or  anti‐Ova  having  somewhat stronger IgM response to BCII than untreated mice.   

 Figure 7. Relative concentration of IgM anti‐BCII in mice treated with anti‐CR1 antibodies. Similar amounts of IgM  anti‐BCII were  observed  in  BCII‐immunized  animals  treated with  anti‐mouse  CR1 monoclonal  antibody (mAb)  (clone 8C12)  (n = 10), anti‐Ova mAb  (clone O3G64)  (n = 9) or  left untreated  (n = 6) at all  time points evaluated. The values shown represent the mean + SD OD405 of sera. As positive controls, two sera from earlier BCII‐immunized animals were used. Serum from naïve DBA/1 was used as negative control. 

 3.3.  CIA incidence in DBA/1 mice transferred with cr2‐/‐ B cells  To  elucidate  the  role  of  CD35  and  CD21  in  the  regulation  of  B  cells  in  CIA,  DBA/1  mice  were transferred i.v. with cr2+/+ B cells or cr2‐/‐ B cells. A separate control group was injected i.v. with PBS only. Three days after cell transfer or PBS the animals were  immunized with BCII. An outstandingly high CIA incidence (63%) was observed from day 53 in animals receiving cr2‐/‐ B cells compared to the groups that were injected with cr2+/+ (33%) or PBS (25%) (figure 8). No significant differences on the mean day of onset were observed between the groups (cr2‐/‐ B cells: 42.71 ± 7.16; cr2+/+ B cells: 50.67 

14  

± 11.50; PBS: 50.80 ± 20.17). No difference in CIA severity was observed among the different groups of mice.   

 

 Figure 8. CIA incidence in DBA/1 mice transferred with cr2‐/‐ B cells. Female DBA/1 mice were injected i.v. with either cr2‐/‐ B cells (n = 12 mice), cr2+/+ B cells (n = 9 mice). No statistically significant differences between the treatments  were  found,  but  a  clear  trend  is  observed  towards  higher  CIA  incidence  in  the  cr2‐/‐  B  cell transferred group compared to the cr2+/+ B cell transferred or PBS injected groups.  

IgM and IgG production against BCII was measured at different time points after immunization in the DBA/1 mice transferred with cr2+/+ or cr2‐/‐ B cells, or injected with PBS. No differences were found in the IgM production between the groups on days 11 and 31 after immunization. However, sixty nine days post  immunization,  the production of  IgG was  significantly higher  in DBA/1 mice  transferred with cr2‐/‐ B cells than in DBA/1 animals transferred with cr2+/+ (figure 9).       

 Figure 9. Antibody production against BCII in DBA/1 mice transferred with cr2‐/‐ B cells. The production of (A) IgM and (B) IgG anti‐BCII in serum of BCII‐immunized female DBA/1 mice injected i.v. with either cr2‐/‐ B cells (n = 12 mice), cr2+/+ B cells (n = 9 mice) or PBS (n = 12 mice). Significantly higher production of IgG was observed in animals  transferred  with  cr2

‐/‐  B  cells  compared  to  those  transferred  with  cr2

+/+  B  cells  at  day  69  post 

immunization. The values shown  represent  the mean OD405 + SD  for  sera. As positive control,  serum  from a previously BCII immunized animal was used. Serum from naïve DBA/1 was used as negative control. * = p < 0.05 

15  

 3.4.  Homing of cr2‐/‐ B cells in transferred DBA/1 mice 

To evaluate the homing of cr2‐/‐ B cells  in the spleen of recipient mice, we extracted and processed the spleens at the end of the adoptive transfer experiment. The expression of CR1 (CD35) and B220 of the splenocytes was investigated by FACS.  

 

Table 1.  cr2‐/‐ B  cell homing  in  the  spleen of DBA/1 mice  transferred 73 days earlier. The  table  shows  the development (Y) or not (N) of CIA in the individual DBA/1 mice (n = 5) injected i.v. with cr2‐/‐ B cells. The data demonstrates the amount of CD35 positive and CD35 negative B220+ B cells respectively  in the spleen of the mice.  Three  out  of  five mice  demonstrate  cr2‐/‐  B  cells  in  the  spleen.  There  is  no  correlation  between  the homing of CD35 negative cells in the host spleens and the development of CIA at day 69 post immunization.           

Sixty percent of  the  studied mice  showed percentages of CD35‐ B  cell higher  than 25%  in  spleen, while 40% of them had a percentage of CD35‐ B cells higher than 95 % (table 1). Despite these high rates of  long  term CD35‐/B220+ cell homing  in  transferred DBA/1  female mice, we  found no direct correlation between the percentage of CD35‐/B220+ cells  in the spleen at day 69 post  immunization and the development of CIA (table 1).       

3.5. CIA incidence in cr2‐/‐ DBA/1 mice transferred with cr2+/+ B cells  To  evaluate whether  the  acquisition of B  cells  expressing CD35  and CD21  is  able  to protect  cr2‐/‐ female DBA/1 mice from CIA development, cr2‐/‐ mice were transferred with cr2+/+ B cells, cr2‐/‐ B cells or injected with PBS only. Three days later, the mice were immunized with BCII in CFA. A prominent delay  in  the CIA onset was observed  in  the  group  transferred with  cr2+/+ B  cells  compared  to  the control groups  receiving cr2‐/‐ B cells or PBS  (figure 10). Thus,  the CIA  incidence  in  the cr2+/+ B cell injected group was conspicuously lower (20%) than the incidences shown by the group injected with PBS  (75%)  and  the  group  transferred with  cr2‐/‐  B  cells  (60%)  at  the  end  of  the  experiment. No statistically significant differences in CIA onset day and severity were observed.        

16  

 Figure 10. CIA  incidence  in cr2‐/‐ DBA/1 mice transferred with cr2+/+ B cells. Female cr2‐/‐ mice were  injected i.v. with either cr2+/+ B cells (n = 5 mice), cr2‐/‐ B cells (n = 5 mice) or PBS (n = 4 mice). No statistically significant differences between the treatments were found, but a clear trend is observed towards a lower CIA incidence in the cr2+/+ B cell transferred group compared to the cr2‐/‐ B cell transferred or PBS injected groups.  

 IgM and IgG production against BCII was measured at different time points after immunization in the cr2‐/‐ DBA/1 mice transferred with cr2+/+ or cr2‐/‐ B cells, or injected with PBS. The animals that were subjected to cr2+/+ B cell transfer showed a significantly lower production of IgM than those animals that were transferred with cr2‐/‐ B cells at day 31 post immunization (figure 11).   

 Figure  11.    Antibody  production  against  BCII  in  cr2‐/‐  DBA/1  mice  transferred  with  cr2+/+  B  cells.  The production of  (A)  IgM and  (B)  IgG anti‐BCII  in  serum of BCII‐immunized  cr2‐/‐  female mice  injected  i.v. with either cr2+/+ B cells (n = 5 mice), cr2‐/‐ B cells (n = 5 mice) or PBS (n = 4 mice) was evaluated. Significantly lower production  of  IgM  was  observed  in  animals  that  were  transferred  with  cr2+/+  B  cells  compared  to  those transferred with cr2‐/‐ B cells at day 31 post immunization. The values shown represent the mean OD405 + SD. As positive control, serum from a previously BCII‐immunized animal was used. Serum from naïve DBA/1 mice was used as negative control. * = p < 0.05       

17  

4. Discussion  It  is widely  accepted  that  CR2  function  lies  on  decreasing  the  activation  thresholds  of  the  B  cell towards  low concentration of  immune complexes opsonized with C3d. By definition, this makes this complement receptor an activating  input for the B cell. Bearing  in mind that CR1 and CR2 share the carboxy‐terminal  region  responsible  of  triggering  intracellular  signal  transduction  pathways,  one could predict that CR1 should present a similar stimulatory  function; however, experiments carried out in our lab have shown that female cr2‐/‐ DBA/1 mice are around 70% more susceptible to CIA than WT DBA/1 animals (16). Furthermore, our previous study of CR1 and CR2 expression on CD19+ B cells in humans, demonstrated  that  the expression of  these  receptors  is down  regulated on peripheral blood B cells from RA patients (non published data), suggesting that CR1 and CR2 play a role  in the autoimmune phenotype of those individuals.   CD19, CD81, CD21 and CD35 are different BCR complex coreceptors (45). Mice lacking CR1/2 tend to overexpress  CD19,  and  this  phenomenon  can  be  considered  a  compensatory  measurement  to maintain  the B cell activation  threshold near  to WT  levels and  to promote B cell survival, which  is directly dependant on the strength of the signal via BCR at different stages of B cell maturation and activation  (28). We  found  an  increased  expression  of  CD19  (10%‐30%)  on  splenocytes  and  lymph node  derived  cells  obtained  from  cr2‐/‐  DBA/1  females  and males  compared  to  their WT  DBA/1 counterparts.  This  increased  expression  can  lead  to  augmented  proliferative  activity  towards transmembrane signals in B cells (46,47).      

A marked increase on CIA incidence was evidenced after in vivo CR1 blockage. On the other hand, a similar  enhanced  incidence was observed  in  the  group of  animals  that was  treated with  anti‐Ova monoclonal antibodies. At least, two arguments could explain this ambiguous response. The first one accounts for a potential bacterial contamination in the antibody batches used. Thus, different toll like receptor  ligands of bacteria  can activate a variety of antigen presenting  cells  including B  cells and enhance antigen presentation, promote class switch recombination, expansion, and immunoglobulin secretion (48). The second argument  lies on the potential triggering of an  immune response against anti‐CR1 and anti‐Ova antibodies able  to boost  the  reaction against BCII by activating  the  classical pathway of complement on the first days post BCII immunization.  The  increased CIA  incidence observed  in DBA/1  female mice transferred with cr2‐/‐ B cells supports the importance of CD35 as a regulatory receptor of B cell activation. Thus, lack of CD35 may lead to reduced regulation of the transferred B cells,  increasing the risk of self tolerance breakage. On the other  hand,  the  delayed  CIA  onset  and  astonishing  low  CIA  incidence  observed  on  cr2‐/‐  mice subjected to cr2+/+ B cell transfer, showed that these CD35/CD21 deficient mice were almost resistant to CIA development,  suggesting  that  the expression of CD35 and CD21 on  the  injected B cells can protect mice from breaking tolerance against CII. Stronger evidence on the function of CD35/CD21 on B cells in the development of CIA will be obtained from new experiments including a higher number of animals per group. 

The  in vivo experiments performed during this project did not  lead to statistically significant results giving  clues  about  the  role  of  CR1  and  CR2  in  CIA  immunopathogenesis.  Different  regulatory mechanisms can be responsible of masking the potential effect of transferring either cr2‐/‐ or cr2+/+ B cells  into cr2+/+ or cr2‐/‐ animals, respectively. A main aspect to be considered  is the potential fading of  anti‐BCII  produced  by  few  poorly‐expanded  B  cell  clones  in  the  spleen  when  measured  in peripheral blood. Our group has  found  that  the number of BCII‐specific  IgM positive B cells  in  the spleen  is  low  after  the  mice  were  immunized  with  BCII  (data  not  published).  Auto  antibodies produced by these few B cells would be hardly detectable  in the sera at day 11 post  immunization. The role of B cells in CIA involves not only the production of antibodies against self antigens, but also the secretion of cytokines, the expression of co stimulatory molecules and antigen presentation to T 

18  

cells; as  it  is shown  that  the symptoms  recovery  in RA patients given B cell depleting  therapy  that does not eliminate plasmablasts (12). 

An  immune response against CD35 and CD21  is possibly evoked  in cr2‐/‐ mice  injected with cr2+/+ B cells. This anti‐CD35/CD21  immune response may be responsible of the depletion of the  injected B cells, as well as of elimination of  the protective effect of  these  cells  to CIA  some weeks after  cell transfer and explaining perhaps the development of CIA in 25% of the cr2‐/‐ mice treated with cr2+/+ B cells  at  the  end  of  the  experiment.  Additional  experiments  aimed  to  detect  anti‐CD35/CD21 antibodies in cr2‐/‐ mice transferred with cr2+/+ B cells would confirm this hypothesis.   The autoimmune prone phenotype observed in cr2‐/‐ mice, may also be explained by a defect of the more  controlled  and  regulated  B  cell  activation  environment  in  the  follicle  compared  to extrafollicular  niches.  The  lacking  of  CR1  and  CR2  promotes  the  accumulation  of  high molecular weight antigen at extrafollicular sites, leading to potential B cell activation in the absence of follicle‐specific cytokine and cellular milieu. Previous studies have shown that B cell activation and somatic hypermutation can take place at the T zone–red pulp border in the spleen of AM14 Id+ MRL/lpr mice. This genetically modified  strain was designed  to express a  recombinant  rheumatoid  factor‐specific immunoglobulin gene (49). Outside the follicle, B cell activation and somatic hypermutation is driven by CD11c+ dendritic cells providing distinctive survival and differentiation signals to plasmablasts and B cells in a T cell independent fashion (13).   A variety of experiments can be carried out to verify this hyphotesis. To begin with, the accumulation of  BCII  at  the  T  zone‐red  pulp  boarder  may  be  detected  by  histologic  immunostaining  using fluorochrome‐coupled polyclonal BCII. Additional histologic analyses can be made in BCII immunized cr2‐/‐ mice in order to evaluate the formation of extrafollicular clusters of plasmablasts at the bridging channel/red pulp boarder (50,51). Additionally, and to discard a potential regulatory signaling effect from CR1, anti‐CXCL13 can be used  to block  this chemokine on cr2+/+ B cells, preventing MZB cell‐dependent transport of high molecular weight antigens into the follicle (52).             

5. Acknowledgements  I am grateful  to Professor Sandra Kleinau  for her wise guidance along  the project. The continuous support  from  my  friends  and  lab  partners  Mike,  Alex,  Anja,  Marius  and  Marlen  are  highly acknowledged. I thank my parents and brother for being constantly close to me even in the distance, their  enthusiasm  and  love  reached me  despite  the  thousands  of  kilometers  that  lie  between  us. Adriana,  to  know  that  I  have  a  friend  like  you  always  open  to  hear  my  trivial  problems  and frustrations was  as  important  for  the  outcome  of  this  project  as  knowing  all  the  conceptual  and technical issues behind it.                   

19  

6. References 

1.  Firestein, G. S. (2005) J Clin Rheumatol 11(3 Suppl), S39‐44 2.  Barton, A., and Worthington, J. (2009) Arthritis and rheumatism 61(10), 1441‐1446 3.  Symmons, D. P., Barrett, E. M., Bankhead, C. R., Scott, D. G., and Silman, A. J. (1994) British 

journal of rheumatology 33(8), 735‐739 4.  Alamanos, Y., Voulgari, P. V., and Drosos, A. A. (2006) Seminars in arthritis and rheumatism 

36(3), 182‐188 5.  Tobon, G. J., Youinou, P., and Saraux, A. (2010) Journal of autoimmunity  6.  McInnes, I. B., and Schett, G. (2007) Nature reviews 7(6), 429‐442 7.  Jacobs, J. P., Wu, H. J., Benoist, C., and Mathis, D. (2009) Proceedings of the National 

Academy of Sciences of the United States of America 106(51), 21789‐21794 8.  Pernis, A. B. (2009) Journal of internal medicine 265(6), 644‐652 9.  Koenders, M. I., Joosten, L. A., and van den Berg, W. B. (2006) Annals of the rheumatic 

diseases 65 Suppl 3, iii29‐33 10.  Stamp, L. K., James, M. J., and Cleland, L. G. (2004) Immunology and cell biology 82(1), 1‐9 11.  Wegner, N., Lundberg, K., Kinloch, A., Fisher, B., Malmstrom, V., Feldmann, M., and Venables, 

P. J. Immunological reviews 233(1), 34‐54 12.  Silverman, G. J., and Boyle, D. L. (2008) Immunological reviews 223, 175‐185 13.  Garcia De Vinuesa, C., Gulbranson‐Judge, A., Khan, M., O'Leary, P., Cascalho, M., Wabl, M., 

Klaus, G. G., Owen, M. J., and MacLennan, I. C. (1999) European journal of immunology 29(11), 3712‐3721 

14.  Wooley, P. H., Luthra, H. S., Stuart, J. M., and David, C. S. (1981) The Journal of experimental medicine 154(3), 688‐700 

15.  Hietala, M. A., Jonsson, I. M., Tarkowski, A., Kleinau, S., and Pekna, M. (2002) J Immunol 169(1), 454‐459 

16.  Nilsson, K. E., Andren, M., Diaz de Stahl, T., and Kleinau, S. (2009) Faseb J 23(8), 2450‐2458 17.  Rossen, R. D., Brewer, E. J., Sharp, R. M., Ott, J., and Templeton, J. W. (1980) The Journal of 

clinical investigation 65(3), 629‐642 18.  Zipfel, P. F., and Skerka, C. (2009) Nature reviews 9(10), 729‐740 19.  Carroll, M. C. (2004) Nature immunology 5(10), 981‐986 20.  Reid, K. B., and Porter, R. R. (1981) Annual review of biochemistry 50, 433‐464 21.  Roozendaal, R., and Carroll, M. C. (2007) Immunological reviews 219, 157‐166 22.  Gal, P., Dobo, J., Zavodszky, P., and Sim, R. B. (2009) Molecular immunology 46(14), 2745‐

2752 23.  Grant, E. P., Picarella, D., Burwell, T., Delaney, T., Croci, A., Avitahl, N., Humbles, A. A., 

Gutierrez‐Ramos, J. C., Briskin, M., Gerard, C., and Coyle, A. J. (2002) The Journal of experimental medicine 196(11), 1461‐1471 

24.  Endo, Y., Takahashi, M., and Fujita, T. (2006) Immunobiology 211(4), 283‐293 25.  Torreira, E., Tortajada, A., Montes, T., Rodriguez de Cordoba, S., and Llorca, O. (2009) 

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106(3), 882‐887 

26.  Bhakdi, S., and Tranum‐Jensen, J. (1978) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 75(11), 5655‐5659 

27.  Schneider, M. C., Exley, R. M., Ram, S., Sim, R. B., and Tang, C. M. (2007) Trends in microbiology 15(5), 233‐240 

28.  Ahearn, J. M., Fischer, M. B., Croix, D., Goerg, S., Ma, M., Xia, J., Zhou, X., Howard, R. G., Rothstein, T. L., and Carroll, M. C. (1996) Immunity 4(3), 251‐262 

29.  Carroll, M. C. (2008) Vaccine 26 Suppl 8, I28‐33 30.  Erdei, A., Isaak, A., Torok, K., Sandor, N., Kremlitzka, M., Prechl, J., and Bajtay, Z. (2009) 

Molecular immunology 46(14), 2767‐2773 

20  

31.  Barrington, R. A., Schneider, T. J., Pitcher, L. A., Mempel, T. R., Ma, M., Barteneva, N. S., and Carroll, M. C. (2009) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106(34), 14490‐14495 

32.  Phan, T. G., Grigorova, I., Okada, T., and Cyster, J. G. (2007) Nature immunology 8(9), 992‐1000 

33.  Roozendaal, R., Mempel, T. R., Pitcher, L. A., Gonzalez, S. F., Verschoor, A., Mebius, R. E., von Andrian, U. H., and Carroll, M. C. (2009) Immunity 30(2), 264‐276 

34.  Hasegawa, M., Fujimoto, M., Poe, J. C., Steeber, D. A., and Tedder, T. F. (2001) J Immunol 167(6), 3190‐3200 

35.  Reid, R. R., Woodcock, S., Shimabukuro‐Vornhagen, A., Austen, W. G., Jr., Kobzik, L., Zhang, M., Hechtman, H. B., Moore, F. D., Jr., and Carroll, M. C. (2002) J Immunol 169(10), 5433‐5440 

36.  Molina, H., Holers, V. M., Li, B., Fung, Y., Mariathasan, S., Goellner, J., Strauss‐Schoenberger, J., Karr, R. W., and Chaplin, D. D. (1996) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93(8), 3357‐3361 

37.  Kuhn, K. A., Cozine, C. L., Tomooka, B., Robinson, W. H., and Holers, V. M. (2008) Molecular immunology 45(10), 2808‐2819 

38.  Marquart, H. V., Svendsen, A., Rasmussen, J. M., Nielsen, C. H., Junker, P., Svehag, S. E., and Leslie, R. G. (1995) Clinical and experimental immunology 101(1), 60‐65 

39.  Wilson, J. G., Ratnoff, W. D., Schur, P. H., and Fearon, D. T. (1986) Arthritis and rheumatism 29(6), 739‐747 

40.  Isaak, A., Gergely, P., Jr., Szekeres, Z., Prechl, J., Poor, G., Erdei, A., and Gergely, J. (2008) International immunology 20(2), 185‐192 

41.  Jozsi, M., Prechl, J., Bajtay, Z., and Erdei, A. (2002) J Immunol 168(6), 2782‐2788 42.  Mebius, R. E., and Kraal, G. (2005) Nature reviews 5(8), 606‐616 43.  Pillai, S., Cariappa, A., and Moran, S. T. (2005) Annual review of immunology 23, 161‐196 44.  Wang, J. H., Li, J., Wu, Q., Yang, P., Pawar, R. D., Xie, S., Timares, L., Raman, C., Chaplin, D. D., 

Lu, L., Mountz, J. D., and Hsu, H. C. J Immunol 184(1), 442‐451 45.  Rickert, R. C. (2005) Current opinion in immunology 17(3), 237‐243 46.  Engel, P., Zhou, L. J., Ord, D. C., Sato, S., Koller, B., and Tedder, T. F. (1995) Immunity 3(1), 39‐

50 47.  Zhou, L. J., Smith, H. M., Waldschmidt, T. J., Schwarting, R., Daley, J., and Tedder, T. F. (1994) 

Molecular and cellular biology 14(6), 3884‐3894 48.  Bekeredjian‐Ding, I., and Jego, G. (2009) Immunology 128(3), 311‐323 49.  William, J., Euler, C., Christensen, S., and Shlomchik, M. J. (2002) Science (New York, N.Y 

297(5589), 2066‐2070 50.  Herlands, R. A., William, J., Hershberg, U., and Shlomchik, M. J. (2007) European journal of 

immunology 37(12), 3339‐3351 51.  Weisel, F., Wellmann, U., and Winkler, T. H. (2007) European journal of immunology 37(12), 

3330‐3333 52.  Reif, K., Ekland, E. H., Ohl, L., Nakano, H., Lipp, M., Forster, R., and Cyster, J. G. (2002) Nature 

416(6876), 94‐99