Two-State Reactivity in the Rebound Step of Alkane Hydroxylation by Cytochrome P-450: Origins of...

5
COMMUNICATIONS Angew. Chem. Int. Ed. 2000, 39, No. 11 WILEY-VCH VerlagGmbH, D-69451 Weinheim, 2000 0570-0833/00/3911-2003 $ 17.50+.50/0 2003 Two-State Reactivity in the Rebound Step of Alkane Hydroxylation by Cytochrome P-450: Origins of Free Radicals with Finite Lifetimes** Nathan Harris, Shimrit Cohen, Michael Filatov, François Ogliaro, and Sason Shaik* Alkane hydroxylation [1] by cytochrome P-450 poses tanta- lizing mechanistic questions. The consensus rebound mecha- nism, Scheme 1, [2] involves hydrogen abstraction from the Scheme 1. Schematic representation of the rebound mechanism. alkane (RH) in step (a), followed by hydroxyl rebound onto the radical to generate the ferric ± alcohol complex, in step (b). The rebound mechanism has gained support from findings of rearranged alcohol products, which indicate the presence of a free radical with a finite lifetime. [3] Further support has recently been provided by the kinetic isotope effect (KIE) measurements of Dinnocenzo, Jones et al. [4a] They found that for a few substituted alkanes, the KIEs of cytochrome P-450 hydroxylation are virtually identical to those of a corresponding hydrogen abstraction reaction by tert-butoxyl radical, thus implying isostructural transition states for the two processes. [4] In an apparent contrast, mechanistic studies by Newcomb and co-workers, [5] designed to probe the radical using alkane substrates that would yield ultrafast radical clocks, do not concur with a free-radical intermediacy ; apparent lifetimes are too fast to correspond to a real free-radical intermediate (for example, t 70 fs), [5b] and have no correlation with independently clocked rear- rangement lifetimes of the free radicals. [5a] Thus, while the evidence for incursion of radicals is strong, their presence is nevertheless controversial and merits elucidation. The origin of the radicals in the rebound process is the key issue addressed in this communication. Our approach to tackle this question, is to use density functional calculations to ascertain whether the hypothetical rebound process in step (b) of Scheme 1, involves a barrier which would endow the of the 1-NAc group allows them to occupy the A-1 and N loci (Figure 3b). In this case, the 3-OH group at A-1 is galactosy- lated, as is actually observed. On the contrary, 1-NAc derivatives of d-sugars can not adopt the supplementary interaction at the N or A-2 loci. Instead, d-xylose-1-NAc may adopt an alternative bonding at the A-2 and N loci where no reactive OH is placed at A-1 (Figure 3c). For d-glucose-1- NAc, which is reactive in the presence of a-LA, the exocyclic C-5 group may disturb this bonding (Figure 3 d). Moreover, judging from the higher reactivity of d-glucose than d-xylose (Figure 1 a), a peripheral binding interaction may exist around the C-5 group of d-glucose and contribute to the usual b-1,4- transfer reaction. In conclusion, we have proved that an anomeric NAc group changes unnatural l-glucose and l-xylose into acceptor substrates for bovine b-1,4-GalTase. The transfer reaction is regiospecific at the 3-OH position and so this is the first b-1,3- transfer reaction for this enzyme. This finding, together with our previous ones, have shown that variable unnatural glycosyl linkages can be produced enzymatically by a single enzyme. This fact may exceed the general concepts of ªone glycosyl enzyme for one glycosyl linkageº [13] and ªbiological homochiralityº [14] that express the high substrate and enan- tiospecificity of enzyme reactions in biosynthetic pathways. Received: September 24, 1999 [Z 14064] Revised: January 31, 2000 [1] a) C.-H. Wong, R. L. Halcomb, Y. Ichikawa, T. Kajimoto, Angew. Chem. 1995, 107 , 559 ; Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1995, 34, 521 ± 546 ; b) M. M. Palcic, O. Hindsgaul, Trends Glycosci. Glycotechnol. 1996, 8, 37 ± 49. [2] K.-Y. Do, S.-I. Do, R. D. Cummings, J. Biol. Chem. 1995, 270, 18 447 ± 18 451. [3] Y. Nishida, T. Wiemann, V. Sinnwell, J. Thiem, J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 2536 ± 2537. [4] a)Y. Nishida, T. Wiemann, J. Thiem, Tetrahedron Lett. 1992, 33, 8043 ± 8046; b) Y. Nishida, T. Wiemann, J. Thiem, Tetrahedron Lett. 1993, 34, 2905 ± 2906. [5] T. Wiemann, Y. Nishida, V. Sinnwell, J. Thiem, J. Org. Chem. 1994, 59, 6744 ± 6747. [6] L. M. Likhosherstov, O. S. Novikova, V. A. Derevitskaja, N. K. Kochetkov, Carbohydr. Res. 1986, 146, C1 ± C5. [7] D. K. Fitzgerald, B. Colvin, R. Marval, K. E. Ebner, Anal. Biochem. 1970, 36, 43 ± 61. [8] a) R. U.Lemieux, Chem. Soc. Rev. 1989, 18, 347 ± 374; b) M.-H. Du, U. Spohr, R. U. Lemieux, Glycoconjugate J . 1994, 11, 443 ± 461. [9] Y. Kajihara, H. Kodama, T. Endo, H. Hashimoto, Carbohydr. Res. 1998, 306, 361 ± 378. [10] a) K. Drickamer, Nature 1992, 360, 183 ± 186 ; b) K. Drickamer, J. Biol. Chem. 1988, 263, 9557 ± 9560. [11] L. J. Berliner, M. E. Davies, K. E. Ebner, T. A. Bayer, J. E. Bell, Mol. Cell. Biochem. 1984, 62, 37 ± 42. [12] J. A. Grobler, M. Wang, A. C. W. Pike, K. Brew, J. Biol. Chem. 1994, 269, 5106 ± 5114. [13] S. Natsuka, J. B. Lowe, Curr. Opin. Struct. Biol. 1994, 4, 683 ± 691. [14] a) V. V. Avetisov, V. I. Goldanskii, BioSystems 1991, 25, 141 ± 150 ; b) J. M. Bailey, FASEB J. 1998, 12, 503 ± 507. [15] H. Ohrui, Y. Nishida, H. Itoh, H. Hori, H. Meguro, J. Org. Chem. 1991, 56, 1726 ± 1731. [*] Prof. S. Shaik, Dr. N. Harris, S. Cohen, Dr. M. Filatov, Dr. F. Ogliaro Department of Organic Chemistry and The Lise Meitner-Minerva Center for Computational Quantum Chemistry Hebrew University, 91904 Jerusalem (Israel) Fax: ( 972) 2-658-5345 E-mail : [email protected] [**] This research was sponsored by the Israeli Science Foundation (ISF) and, in part, by the German Israeli Foundation (GIF), and the VW Stiftung. S.S. thanks the Humboldt Foundation for a Senior Research Award. F.O. thanks the EU for a Marie Curie Fellowship.

Transcript of Two-State Reactivity in the Rebound Step of Alkane Hydroxylation by Cytochrome P-450: Origins of...

Page 1: Two-State Reactivity in the Rebound Step of Alkane Hydroxylation by Cytochrome P-450: Origins of Free Radicals with Finite Lifetimes

�������������

������ ���� ��� � � ����� ��� ��� �� � ���� �� ����� ����� ������� ��������� !!! !�"!�!#$$%!!%$���� !!$ & �"��!'��!%! !!$

������� ��� � �� � �� ������ ��� ������ ��������� �� �� ��������� �� !�"#� $ �% �� &� �� ��% � �� & � � ' �� �%((��(��� �����)� *�����( ������ +�,���� -���(�.�-���/��) 0������� ��1 *�)�� *���23

4�2��� �51��65��(���7�8 �5 ,5(�,����� 9���! :�)�) (��(����;��� ��,����)(�, <=�)(���)� >�� ,��)��)=) ����=�1 ��,�����)�� *,���� ��7 8 ��.��.�) �51����� ��)(��,(��� ?��� (��

*,���� �� *,����(�, ��:��)��(�(��� �? (�� ����=�1 ��,����)��

��2��� @A�B �� )(�: @�B� ?����C�1 �5 �51��65� ����=�1 ��(�(�� ��1�,�� (� ������(� (�� ?����, D ��,���� ,��:��6� �� )(�:@�B� >�� ����=�1 ��,����)� ��) �����1 )=::��( ?���?��1���) �? ���������1 ��,���� :��1=,()� C��,� ��1�,�(� (��:��)��,� �? � ?��� ��1�,�� C�(� � ?���(� ��?�(����7$8 -=�(���)=::��( ��) ��,��(�5 ���� :��.�1�1 �5 (�� 2���(�, �)�(�:��??�,( @E�B ���)=�����() �? �����,��;�� F���) �( ���7��8

>��5 ?�=�1 (��( ?�� � ?�C )=�)(�(=(�1 ��2���)� (�� E�G) �?,5(�,����� 9���! �51��65��(��� ��� .��(=���5 �1��(�,�� (�(��)� �? � ,����):��1��� �51����� ��)(��,(��� ���,(��� �5������=(�65� ��1�,��� (�=) ��:�5��� �)�)(�=,(=��� (���)�(���)(�(�) ?�� (�� (C� :��,�))�)�7�8 �� �� �::����( ,��(��)(���,����)(�, )(=1��) �5 ��C,��� ��1 ,��C��2��)�7�8 1�)����1(� :���� (�� ��1�,�� =)��� ��2��� )=�)(��(�) (��( C�=�1 5���1=�(��?�)( ��1�,�� ,��,2)� 1� ��( ,��,=� C�(� � ?������1�,����(����1��,5H �::����( ��?�(���) ��� (�� ?�)( (� ,����):��1 (�� ���� ?������1�,�� ��(����1��(� @?�� �6��:��� �� "! ?)B�7��8

��1 ��.� �� ,������(��� C�(� ��1�:��1��(�5 ,��,2�1 �������������( ��?�(���) �? (�� ?��� ��1�,��)�7��8 >�=)� C���� (���.�1��,� ?�� ��,=�)��� �? ��1�,��) �) )(����� (���� :��)��,� �)��.��(����)) ,��(��.��)��� ��1 ����() ��=,�1�(����

>�� ������ �? (�� ��1�,��) �� (�� ����=�1 :��,�)) �) (�� 2�5�))=� �11��))�1 �� (��) ,���=��,�(���� 0=� �::���,� (�(�,2�� (��) <=�)(���� �) (� =)� 1��)�(5 ?=�,(����� ,��,=��(���) (��),��(��� C��(��� (�� �5:�(��(�,�� ����=�1 :��,�)) �� )(�:@�B �? *,���� �� ��.��.�) � ������� C��,� C�=�1 ��1�C (��

�? (�� ���4, ���=: ����C) (��� (� �,,=:5 (����) ��1 * ��,�@-��=�� $�B� �� (��) ,�)�� (�� $�0� ���=: �( ��) �) ����,(�)5���(�1� �) �) �,(=���5 ��)��.�1� 0� (�� ,��(���5� ���4,1���.�(�.�) �? ��)=���) ,�� ��( �1�:( (�� )=::�����(��5��(���,(��� �( (�� * �� ��� ��,�� ��)(��1� ��65��)�����4, ��5�1�:( �� ��(����(�.� ���1��� �( (�� ��� ��1 * ��,� C���� �����,(�.� 0� �) :��,�1 �( ��) @-��=�� $,B� -�� ����=,�)�����4,� C��,� �) ���,(�.� �� (�� :��)��,� �? ��4� (�� �6�,5,��,��� ���=: ��5 1�)(=�� (��) ���1��� @-��=�� $1B� +����.���I=1���� ?��� (�� ������ ���,(�.�(5 �? ����=,�)� (��� ��65��)�@-��=�� ��B� � :���:����� ���1��� ��(���,(��� ��5 �6�)( ���=�1(�� ��� ���=: �? ����=,�)� ��1 ,��(���=(� (� (�� =)=�� ������(���)?�� ���,(����

�� ,��,�=)���� C� ��.� :��.�1 (��( �� �������, �4, ���=:,�����) =���(=��� ����=,�)� ��1 ��65��)� ��(� �,,�:(��)=�)(��(�) ?�� ��.��� ���������>�)�� >�� (���)?�� ���,(��� �)�����):�,�?�, �( (�� $�0� :�)�(��� ��1 )� (��) �) (�� ?��)( ����$�(���)?�� ���,(��� ?�� (��) ��;5��� >��) ?��1���� (���(��� C�(��=� :��.��=) ���)� ��.� )��C� (��( .������� =���(=�����5,�)5� ���2���) ,�� �� :��1=,�1 ��;5��(�,���5 �5 � )�������;5��� >��) ?�,( ��5 �6,��1 (�� ������� ,��,�:() �? J�����5,�)5� ��;5�� ?�� ��� ��5,�)5� ���2���K7�$8 ��1 J�������,������,������(5K7��8 (��( �6:��)) (�� ���� )=�)(��(� ��1 �����(��):�,�?�,�(5 �? ��;5�� ���,(���) �� ���)5�(��(�, :�(�C�5)�

A�,��.�1L *�:(����� �� ���� 7M��!��8A�.�)�1L F��=��5 $�� !!!

7�8 �B ����� ����� A� � ���,���� �� �,��2�C�� >� E�I���(�� ���������� )++!� ���� ���H������ ���� ��� � � ����� )++!� ��� � � D ���H�B +� +� 9��,�,� 0� ���1)��=�� ���� � ��������� ������������� )++,� ��$" D ���

7 8 E���� ��� *���� ��� A� �� �=�����)� �� ����� ���� )++!� ��� �#��" D�#����

7$8 �� ��)��1�� >� �������� � *���C���� F� >����� �� �� ���� !���)++-� ��"� �$� D �$"�

7�8 �B �� ��)��1�� >� �������� F� >����� ����#�� ��� $���� )++�� ���#!�$ D #!��H �B �� ��)��1�� >� �������� F� >����� ����#�� ��� $����)++-� ��� �!� D �!��

7�8 >� �������� �� ��)��1�� � *���C���� F� >����� �� %��� ���� )++ � "���"�� D �"�"�

7�8 � +� �2��)���)(�.� 0� *� ��.�2�.�� � 4� ����.�()2�I�� �� E�E�,��(2�.� �#�&��� �� '��� )+.,� ��(� �� D���

7"8 �� E� -�(;�����1� N� ���.��� A� +��.��� E� � ����� ��#�� �������)+/�� �(� �$ D ���

7#8 �B A� O�����=6� ���� !��� '�)� )+.+� ��� $�" D $"�H �B +���� �=� O�*:���� A� O� ����=6� ��������*+�#�� �� )++ � ��� ��$ D ����

7�8 �� E�I������ �� E�1���� >� �1�� �� ��)����(�� �#�&��� �� '���)++.� ��(� $�� D $"#�

7�!8 �B E� ���,2�����,#�+�� )++�� �(�� �#$ D �#�H �B E� ���,2����� �� ��������� )+..� (�� ���" D ���!�

7��8 � F� N�������� +� � ��.��)� E� � ����� >� 4� N�5��� F� � N���� -�������� ������� )+. � ( � $" D � �

7� 8 F� 4� �������� +� ����� 4� �� �� 9�2�� E� N��C� �� ����� ���� )++ � (�� ��!� D �����

7�$8 *� ��()=2�� F� N� �C�� �+��� %.��� !��+��� ����� )++ � �� �#$ D ����7��8 �B � � 4.�(�)�.� � �� ���1��)2��� ���!����� )++)� "� ��� D ��!H

�B F� +� N����5� /�!�� �� )++.� � � �!$ D �!"�7��8 �� 0��=�� �� ��)��1�� �� �(��� �� ����� �� +��=��� �� %��� ���� )++)�

"(� �" � D �"$��

738 9��?� *� *���2� ��� �� �����)� *� ������ ��� +� -���(�.� ��� -� 0��������:��(���( �? 0�����, �����)(�5 ��1>�� �)� +��(����+����.� ���(�� ?�� ���:=(�(����� P=��(=������)(�5�����C O��.��)�(5� ���!� F��=)���� @�)����B-�6L @��" B ���#��$������� L )�)��Q5?��(�,���=I���,���

7338 >��) ��)���,� C�) ):��)���1 �5 (�� �)����� *,���,� -�=�1�(��� @�*-B��1� �� :��(� �5 (�� ������ �)����� -�=�1�(��� @��-B� ��1 (�� �*(�?(=��� *�*� (���2) (�� �=����1( -�=�1�(��� ?�� � *����� A�)���,�4C��1� -�0� (���2) (�� O ?�� � +���� �=��� -����C)��:�

Page 2: Two-State Reactivity in the Rebound Step of Alkane Hydroxylation by Cytochrome P-450: Origins of Free Radicals with Finite Lifetimes

�������������

���� � ���� �� ����� ����� ������� ��������� !!! !�"!�!#$$%!!%$���� !!� & �"��!'��!%! ������ ���� ��� � � ����� ��� ��� ��

��1�,�� C�(� � ?���(� ��?�(���� ��1 �? )� C��( �) (�� :��,�)���(=�� �? (�� ���� D :��:�5��� )(�(� (��( �������(�) (���������R >�=)� �=� )(=15 ?�,=)�) �� ��1����� �? (�� ����=�1:��,�)) �()��?� ��1 �) ��( ����( (� �� � )(=15 �? (�� ?=���51��65��(��� ��,����)� �? � :��(�,=��� ��2����

�� � :��.��=) :�:���7�8 C� )��C�1 �5 ����) �? 1��)�(5?=�,(����� ,��,=��(���)� (��( �� � 1����,(��, ��.�������( @)=,��) �� � )��.��( �� �� � :��(��� ,�.�(5B (�� ���� D �51��6���(����1��(� � �� *,���� � ��.��.�) �� -���� @1� ,��?��=��(���B��� ��1 � ,�(��� ��1�,�� )�(=�(�1 �� (�� :��:�5���� >�� ���=�1)(�(� �? (�� ���� D �51��6� ,��:��6 C�) ?�=�1 (� �� (�� (��:��()(�(� @!� �B C�(� )����� ���,(���) �,,=:5��� (�� 15;@�3B����(�� �? (�� ���� ��1 (�� � = (5:� ����(�� �? (�� :��:�5����C��,� �) 1���,���;�1 (�C��1 (�� )=�?=��7��8 4) )��C� �� :��( @�B�? *,���� � (��) ���� D �51��6� ,��:��6 C�(� (C� =�:����1

FeIII FeIII

OH

HS LS

OH

H

H

H

dx2-y2

dz2

dxy

dxz

a2u (a')

dyz

Por•+FeIIIO

φR

R•

δ

π*

σ*

..lpO

σOR

a)

••

3e–

a2u 'Hole'

R

2e–

Closed Shell

b)

PorFeIIIOR

S = 3/2 S = 1/2

dxy

dz2

dyz

dx2-y2a2u (a')

σOR

a2u (a')dx2-y2

dyzdxz

dz2

dxy

R•

PorFeIIIOR

SH SH

*,���� � �B 0���(�� 1������) )��C��� (�� ��C�):�� ��1 �����):�� ,�=�:���� ��1�) �? (�� (��:��( ���� D �51��6� ��1 ��25� ��1�,�� ):�,��) 1=����(�� ����=�1 )(�:� �B 4� ���,(����,�=�(��� 1������ ���=)(��(��� (�� ?������ �?(�� :��:�5��� J����K�

���,(���) �� � (��:��( )�(=�(��� @!� �B ,�� ,�=:�� C�(� (�� �11���,(��� �? (�� ��1�,�� @!� �S B �� ��C�):�� @*B ��1 �����):��@�*B ������)� ��)=�(��� �� 1�=���( @!� �S B ��1 <=��(�( @!�$S B )(�(�) �? (�� ?����, D ��,���� :��1=,()� ��):�,(�.��5� >��)�(C� :��,�))�) ��� )(=1��1 ���� ��1� �) C��� �� )��C�� (����1�,�� ��) � ?���(� ��?�(��� 1=� (� � ������� �� (�� �����):��

)=�?�,�� C���� (�� ��C�):�� ,�=:���� :��,��1) (� (�� ?����, D��,���� ,��:��6 C�(� �� )����?�,��( �������� >��) ��1 (�� ):���)(�(� ����,���� ��(��7"8 ��5 C��� �� (�� ���() �? (�� �::����(,��(��.��)5 �� (�� �6:������(�� 1�(��

�5���1 @���(��� D-�,2%�->B 1��)�(5 ?=�,(����� N$�9,��,=��(���)7#8 ��� :��?����1 C�(� (�� F4�O4A $��7�8 ��1�4O**�4��#7�!8 :�,2���)� ��1 =)�1 ?�� �����(�5 �:(���;��(��� �? (�� ):�,��) �� *,���� � C�(� ��$

� �) � ��1�� ��1�,����1 �*� �) �� �6��� �����1� -����C��� (�� :��.��=) )(=157�8 � C�=)� (�� �) 4����) �??�,(�.� ,��� :�(��(��� ,�=:��1 C�(� (��1�=��� ;�(� 4� 9 ��)�) )�(7��8 ?�� ����� ��1 �� �������,(�����$�� ��)�) )�( ?�� (�� ��)( �? (�� �(��)� +���,=��� �����(���)�? ��� ):�,��) ��� ?=��5 �:(���;�1 C�(��=( ��5 )5���(�5,��)(����()�

-�� (�� ?����, D��(����� ,��:��6 - @A�+� �� *,���� �B�(�� ���=�1 )(�(� �) ?�=�1 (� �� (�� 1�=���( )(�(� @!� �S B C�(�(�� <=��(�( )(�(� @!� $S B �5��� "�� 2,������� �������7� 8 �����(���)���( ��,���� ,��:��6�) ��.� ��( �) 5�( ���� 1�(�,(�1 �� ���,����)(�, )(=15 �? (�� �51��65��(��� :��,�))� ?����, D ��,����� ,��:��6�) �? ,5(�,����� 9���! ��� ��.��(����)) 2��C��0=� ,��:=(�(����� ��)=�( �) �� �,,��1 C�(� (�� �6:������(���))������( �? (�� ���51��65,��:��� ,��:��6 @� ?����, D ���,���� ,��:��6B �? ,5(�,����� 9���!,�� �) � 1�=���(�):��,��:��6 @!� �S B�7�$8 >�� )(���� ���1���� ��1�,�(�1 �5 (�� )���(-��0 ���1 �� (�� ,��:=(�1 ?����, D��(����� ,��:��6 @)��-��=�� �B� )=���)() (��( �� ��,���� (���)���( �) ���)�������

Fe Fe Fe

Fe Fe

TS

rFeN(av) = 2.017

Cabs Creb

Alcohol Complex

S = 3/2 S = 3/2 S = 3/2

S = 3/2 S = 1/2

1.811

2.503

152.21.826

2.456

2.251

156.21.858

2.594

1.4562.462

2.491

2.108

2.278

1.465

rFeN(av) = 2.017 rFeN(av) = 2.018

rFeN(av) = 2.018 rFeN(av) = 2.018

OH

CH3

165.12.335

0.986

SH

OH

H3C 3.422

OH

H3C

SH

SH

OHH3C

OHH3C

SH

SH

-��=�� �� *(�(�����5 ):�,��) ?�� (�� ����=�1 :��,�))�

C���� (�� ��(����(�.� 1���,( 0� (���)?�� (� (�� ��25� ��1�,�� (�?��� � ?��� ��,���� ��5 �� ������(�,���5 ���� 1����1����7��8

-��� (��) :���( ��� (�� (��� ��C ):�� @*B C��� 1���(� (��1�=���( )(�(� C���� (�� (��� ���� ):�� @�*B C��� 1���(� (��<=��(�( )(�(��7� �8 >�� �* ����=�1 )(�: ��.��.�) � ,�=)(�� (��(:��,�1�) � (���)�(��� )(�(� @>*B �� ��=(� (� (�� �* ?����, D��(����� ,��:��6� >��)� )(�(�����5 ):�,��) ��� 1�:�,(�1

Page 3: Two-State Reactivity in the Rebound Step of Alkane Hydroxylation by Cytochrome P-450: Origins of Free Radicals with Finite Lifetimes

�������������

������ ���� ��� � � ����� ��� ��� �� � ���� �� ����� ����� ������� ��������� !!! !�"!�!#$$%!!%$���� !!� & �"��!'��!%! !!�

),����(�,���5 �� -��=�� � C��,� )��C) ���5 2�5 �����(��,:�����(��)� >�� ,�=)(�� ���) �) )��� (� ,����):��1 (� (��:��1=,( �? (�� �51��������)(��,(��� )(�:� A�(�(��� �? (����(�5� ���=: (� (�� �(��� )�1� �? (�� �65��� �,,=�) �( (���6:��)� �? � )���� �����5 ��,���)� @ �� 2,�������B ��1������(�) � )�,��1 ,�=)(��� ����� C��,� �) ��( � (�=� �����=��=( �) � ):�,��) �� ��=(� (� (�� ����=�1� �� ,��(��)(� (�� ���5)(�(�����5 :���( ?�=�1 �� (�� * ����=�1 �) (�� * ?����, D��(����� :��1=,(�

�,�(��� �? (�� (���)�(��� )(�(�) �� (�� �* ��1 * )=�?�,�)C�) �,���.�1 �� (C� )(�:)� -��)(� (�� �����=� �����5 �* ��1* :�(�) C��� ),����1 ����� (�� ��TTT0 ,���1���(� @�::���,� �?(�� ��$ ��1�,�� (� (�� �65��� �? (�� ���� D �51��6� ,��:��6BC�(� �) )5���(�5 ,��)(����()� -��=�� )��C) (�� �����5

-��=�� � 9�(��(��� �����5 ,=�.�) �? (�� �����):�� @�*B ��1 ��C�):�� @*B����=�1 :��,�))�) ����� (�� ��$ TTT 0 ,���1���(� @��TTT0B�

:��?���) ��(����1 ��1 �( �) �::����( (��(� C����(�� * :��?��� 1�),��1) )���(��57��8 (�C��1 (��* ?����, D��(����� ,��:��6� (�� �* )=�?�,��6����() � ������� ���� ��TTT0� � U� >�� (�=�(���)�(��� )(�(� @>*B �� (�� �* )=�?�,� @)��C�C�(� � ?����1 (������� �� -��=�� B C�) (�����,�(�1 �5 )�11���:���( �:(���;�(��� �? ��������(��, .�������) C�(� �� )5���(�5 ,���)(����()� >��) C�) ?����C�1 �5 � ,��:��(� .�����(����� ����5)�) C��,� ��.����1 (��( (���� �) ���5��� ��1� C�(� �� ��������5 ?��<=��,5 �?���"�� ,��� C��,� ,����):��1) (� (�� �6:�,(�1��1� ����� (�� ��TTT0 ���,(��� ,���1���(� (��(,����,() ���,(��() (� :��1=,()�

>���� � 1�):��5) 2�5 ?��(=��) �? (�� )(�(�����5)(�=,(=��) ����� (�� :�(�� >�� ������� ����(�.� (�(�� )�:���(�1 ?������() �) ��! 2,�������� ��1����(�.� (� (�� ���,(��( ,�=)(�� �( �) "�� 2,�����������)�1����� (�� 2��C� (��1��,5 �? 1��)�(5?=�,(�����) (� =�1���)(���(� �������)�7��8 (�� �*������� ?��(=�� ?�=�1 �� (��) C�5 �) ��( ��2��5 (��� �� ��(�?�,(� >�� �����5 )(�����;�(��� �? (�� *)=�?�,� �� (�� ������ �? (�� �* (���)�(��� )(�(�@�::��6���(��5 �" 2,������� ����(�.� (� (����)�( �( $ UB �) )����?�,��(�5 ������ (��� (���6:�,(�1 N$�9 ������7��18 >�=)� �.�� �? N$�9

�.���)(���(�) (�� * )(�(� )���C��(� � )����?�,��( ������� �))(��� =���2��5 �� (�� * )=�?�,�� �� ,����( ��C�.��� �=�� �=( �(��5 ������� �( � �=,� J�������K :�)�(��� ����� (�� ��TTT0,���1���(��

-=�(��� ��):�,(��� �? >���� � ��.���) (��( (�� �* >*:�))�))�) �����(��, :�����(��) ��(C��� (��)� �? (�� ?���5� D�51��6� ���,(��( ,��:��6� 79����-����0�8� ��1 (��)� �? (���* ?����, D��(����� ,��:��6� 79��-����@��$0�B8� >�� ):��1��)�(5 1�(� �� >���� � ?=�(��� )��C (��( (�� .�,���(5 �? (�� >*�) ,����,(���;�1 �5 �� �6(��)�.� ���,(����, ��������;�(���� ��)���� ��C ����5;� (��) ���,(����, ��������;�(���� ��1 (�����5)��C (��( (���� �) � )��:�� ���)�� ?�� (�� �* ������� ��1 (����,2 �? �� * ��������

>���� � )��C) (��( (�� �((�,2��� ��$� ��1�,�� ��1 (��

:��:�5��� ���� ��)� (���� ���(��� ):��) �� ��(� (�� �* ��1 *����=�1)� ���( ��2�) (�� 1�??����,� �) (�� ):�� 1��)�(5 �? (������� C��,� ��)�) )(��:�5 �� (�� �* :�(� @!�#� D �� B� �=(������) �))��(����5 ,��)(��( @!�#� D !�#�B ����� (�� * :�(��>�� ����(�� 1������)� :��( @�B �? *,���� � )��C (�� ������) �?(��) ��������;�(���� >�=)� ���(����5 �� (�� ?���5� D �51��6����,(��( ,��:��6 (�� � =@��B :��:�5��� ����(��7��8 �) )����5�,,=:��1� ��1 )� �) (�� ����(�� �? (�� ��25� ���=: @�:0 �) ���65��� �����:��� ����(��B� �=���� (�� ����=�1� (�� � =@��B����(�� �) ?����1 �5 �� ���,(��� ?������5 :��.�1�1 �5 (�� ��25���1�,�� A � C��,� ��C :��(�,�:�(�) �� (�� ��C�5 ?����1 �0A

����(��� ��C�.��� C���� �� (�� * :��,�)) (��) �) (�� :�����5,������ 1=���� (�� �* :��,�)) (�� ?������ �? (�� :��:�5��� )�����=)( �� �((��1�1 �5 �6,�(�(��� �? �� ���,(��� ?��� (�� 16;

����(�� (� (�� ������ �����5 @�3 (5:�B 1; ����(��� >�=)�C�����) �� (�� ���� D �51��6� ,��:��6%��$

� ,�=)(�� ��� (��=�:����1 ���,(���) ��)�1� �� ����(�.��5 ��C��5��� ����(��)� ��

>���� �� *���,(�1 �����(��, :�����(��) � 7U8� ):�� 1��)�(��) �� ��1 ����(�.� �������) ����

72,�������8 �? (�� ,��(�,�� ):�,��) ����� (�� ����=�1 :�(�C�5�

:�����(�� 79����-����0�8%��$� 79����-����0�8%��$

� >* 79��-����@��$0�B8���,(��() �* ,�=)(��7�8 �* �* *

��TTT0 � $� �# � �� ����� �����7�8

�-��0 ��# � ��#�� ��#�# ��� ��!#7,8

@��# �B718

�-��* ���! ��!$ ���� ���� � "#@ ���#B718

�-���@�.B7�8 �!�" �!�" �!�# �!�# �!�#@ �!�"B718

�-������ � !�!� � !�!� � !�!# � !��� � !�!�

���� ! � �� � ��!7?8 � ��� � �#�"� �"��7�8

���$!��� !��� !��� D !�$$ 7�8 !�!!$ !�!!!

����� !��" !�� !��� D !��$7�8 !��# !�!$ �-� !�#� !�#� ��!� D � �7�8 �� !�#�

7�8 >�� ���) ,�=)(�� )��C� �� -��=�� �� 7�8 ��0 1�)(��,�� 7,8 -� TT T 0 1�)(��,�� 718 ��(� ��:����(��)�) ��� ?�� (�� �) )(�=,(=��7�8 C��,� �) !�## 2,������� ������ (��� (�� �� )(�=,(=��@1�(� ��( �� :����(��)�)B� 7�8 >�� �.����� ���)=�����() �? ?�=� -��� 1�)(��,�)� 7?8 >��������� ����(�.� (� (�� �:(���;�1 ���,(��( �( �� )5���(�5� 7�8 ����5 �? (�� ,����):��1��� *)(�=,(=�� �( � U� 7�8 A���� �? ):�� 1��)�(5 �( ��TTT0� � D �!� U�

Page 4: Two-State Reactivity in the Rebound Step of Alkane Hydroxylation by Cytochrome P-450: Origins of Free Radicals with Finite Lifetimes

�������������

���� � ���� �� ����� ����� ������� ��������� !!! !�"!�!#$$%!!%$���� !!� & �"��!'��!%! ������ ���� ��� � � ����� ��� ��� ��

(�� �* >* ��1 �� (�� ,����):��1��� �* ?����, D ��,����,��:��6� ��� ���,(��� �) �6,�(�1 (� � ������ ��.�� �3@1; B����(�� �� ��1�� (� ,��)��.� (�� (�(�� <=��(�( ):��� >��)�11�(����� �6,�(�(��� �) �,,��:����1 �5 (�� �?������(����1��,���)� �? (�� ):�� 1��)�(5 �� (�� ����� �) C��� �) �5 �,��)�1������ ������(��� �? (�� -��0 ��1 -��* ���1 ����(�)�� (�� >* ����(�.� (� (�� ���� D �51��6� ,��:��6� ��1 (�� ��))�? ���1��� �) ����?�)(�1 �) � ������� ?�� (�� �* ����=�1:��,�))� >�=)� (�� ������� �� (�� �* :�(� ��) � )(�����(?��C��1���,(����, �������

*��,� (�� * :�(� �) ��������?���� �� .��5 ?��(� �( ,����( ��1�C� ��1�,�� ��(����1��(� C�(� � )����?�,��( ��?�(���� �? �( ���� �(?����C) (��( * �51��65��(��� C��� :��,��1 �� �� �??�,(�.��5,��,��(�1 �������7��� "� �"8 �.�� �? (�� (��I�,(��5 �? �::���,� �?(�� ?���5� D �6��� ):�,��) (� (�� A�� ��2��� C��� ��)����� ��51����� ��)(��,(��� :��,�))� 4���� (�� )��� (��I�,(��5� ����25� ��1�,�� C��� �� :��1=,�1 �� (�� �* :�(� ��1 C��� ?�,� �����=�1 �������� >�=)� �))=���� (��( (�� ��(� �? (�� ����=�1)(�: ���5) (�� 4������=) �<=�(��� C�(� (�� )��� :���6:�����(��� ?�,(�� ?�� (�� �* ��1 * :�(�C�5)� (�� :�(��(���������� �? � (� " 2,������� �� (�� �* :��?��� C��� )��C 1�C�(�� �* ����=�1 �5 ?�=� (� )�6 ��1��) �? �����(=1�� ��1 C���(�����5 ��1�C (�� ��1�,�� C�(� � )����?�,��( ��?�(���� 1=����C��,� ��1�,�� ������������( ,�� �,,=�� �� (��) 1=�� :�(�C�5),������� C���� ���������1 ��,���� �) :��1=,�1 (���=�� ���5��� )(�(� @�*B� C���� =����������1 ��,���� �) :��1=,�1 ?���(C� )(�(�) @* ��1 �*B� �::����( ��?�(���)V,��,=��(�1 ?���:��,��(���) �? ������������(V��5 �,,�)������5 �::���=������)(�,���5 )���( ��1 C��� ���� �� ,������(��� (� ,��,2�1��?�(���) �? (�� ?��� ��1�,��)� �) ��)��.�1 �5 ��C,��� �( ���7�8

4( (�� )��� (���� (�� ���)=��1 E� C��� ��?��,( � J�51�������)(��,(��� (��I�,(��5K @,����� (� (�� (C� )(�(�)B� �)1�1=,�1 �� (�� )(=15 �5 �����,��;�� F���) �( ���7�8 >�=)� (��:��:�)�1 (C��)(�(� ),������ :��.�1�) � ���)������ ��,��,�����(��� �? (�� �::����( ,��(��1�,(��� �� (�� (C� )�() �? 1�(��

>�� :��,��(��� �? ������������( C��� 1�:��1 �� (�� ���(���,��,��(��(��� �? (�� ��1�,��� �) 1�(������1 �5 (�� ����,������(�� �? (�� ���,(��� ,��:��6�) ��(C��� (�� �* ��1 *:��,�))�)�7"8 �) C��� �) �� (�� �* ����=�1 ��(�� C��,� �) )�;�1�5 (�� �* �������� >C� ?�,(��) C��� ��?�=��,� (�� �����( �? (��������� �� (�� �* ����=�1� ��1 ,�� �� 1�1=,�1 ?���*,���� � >�� ?��)( ?�,(�� �) �))�,��(�1 C�(� (�� ���,(����6,�(�(��� ?��� (�� ��C�� ��.�� 16; ����(�� (� (�� ������ �����51; @�3B ����(�� C��,� �) ��(����1��� �,��)) (�� �6��� 0�-��*�6�)� >�� )(������ (�� *����1��� �����(5 �? (�� (�����(� �����1�(�� ������ (�� 1; @�3B ����(�� �)� ��1 � ������ �* ����=�1������� �) (�� ��)=�(� *��,� �� (�� ��(=��� ��;5�� (�� (�����(������1 �) � )�1� ���=: �? (�� ��,�:)=��(��� :��(���� (�� :��(����) �6:�,(�1 (� �??�,( (�� ���1��� �����(5 �? (�� (�����(� (���=��.����(��� �� (�� :�����(5 ��1 �,�1�(5 �? �() :�,2�( �) C��� �)(���=�� )(���, ,��)(����() ?�� -��* ���1����

>�� )�,��1 ?�,(�� �? (�� ����=�1 ������� �) �))�,��(�1 C�(�(�� :��:��(��) �? (�� �((�,2��� ��1�,�� ��1 ,�� �� 1�1=,�1?��� :��( @�B �? *,���� � 4 )��:�� ���,(��� ,�=�( ��.���)(��(� ���(����5� (�� A�0 ���2��� ��.��.�) (���� ���,(���) ��1(�� :��:�5��� ��) � J����K�7��8 ��1 ��(�� (�� A�0 ���2�����,���) � (C�����,(��� A�0 ���1 ��1 (�� :��:�5��� �((���)� ,��)�1 )����� >�=)� (�� ���,(��� (��( ?���) (�� :��:�5���J����K �������(�) �� (�� �6(�� ���,(��� �? (�� A�0 ���2��� ��1

�) ?������5 (���)?����1 ?��� (�� ���,(��:�)�(�.� ��25� ��1�,������)�<=��(�5� (�� �* ����=�1 :��,�)) ��.��.�) ,��,���(��(��5 �� A�0 ���1 ?����(��� ��1 �� ���,(��� )��?( @?��� A � (�9����B� �( ?����C) (����?��� (��( (�� :��,��(��� �? ��1�,��������������( C��� 1�:��1 �� (�� �6�1�(��� :�(��(��� �? (����1�,��� 4�� �(��� ?�,(��) ����� �<=��� (�� ��C�� (�� �6�1�(���:�(��(���� (�� )���(�� (�� (�=� ��?�(��� �? (�� ��1�,�� �� (�� �*)=�?�,� ��1 (�� ��)) ���������1 ��,���� ,�� �� �6:�,(�1� >��)(���1 �) �� ��������( C�(� ��,��( ��)��.�(���) �5 ��C,����( ��� � C�� ?�=�1 (��( �) (�� ��25� ��1�,�� ����(5 �? (��)=�)(��(�) @ ���5��,5,��:��:5� ��2���)B ��,���) � ��((�����,(��� 1����� (�� ���=�( �? ���������1 ��,���� 1�,���)�)?��� �W @?�� � .��-$ ��5� )=�)(�(=��(B 1�C� (� ��)) (��� �W?�� (�� ��)( 1���� )�(=�(��� @?�� �:���5��,5,��:��:5� �)��:��:���B�7�,8 ��.��(����))� (�� �6:������(�� ��)=�() ��� ����,��:��,�(�1 1=� (� ������������( �? ,�(����, ��(����1��(�)��1 (�� :��)��,� �? ���� (��� ��� �6�1�;��� ):�,��)�7�8

A�,��.�1L *�:(����� �� ���� 7M�$��#8A�.�)�1L ��.����� � ����

7�8 +� *���� +� 9� A��,�� � �� ��=�(��� F� �� ��C)��� ���� '�)� )++,��(� #���

7 8 �B F� >� ���.�)� �� ���� � +�� )+.!� ( � � #H �B F� >� ���.�)� �� 4�+,��=)25� �� �� ���� !��� )+/,� ��� #���

7$8 �B F� >� ���.�)� ���M� ���� �� ��������� 0�"�1 !��+��+��� -���#2���� #� ������������ �1 �1� @1�L 9� A� 0�(�; 1� +��(������B�9���=�� ��C ���2� )++!� ,��:� �H �B N� +�=����� ���� '�)� )++�� � �����H ,B �� �� ������� ��.� �+��� ���� )++,� ���� �!�

7�8 �B F� �� +��,��)(��� F� 9� �����,��;�� � 4� ������)� F� 9� F���)� �� ������ !��� )++/� ���� �!��H �B >�� 1���(�5� ������� )=�)(��(�) ����?� 7��8 C��� )=���)(�1 ��(�� (� =�1���� �� ���(��� ���,(��� (���)?�� �5(�� ?���5� D �6��� ):�,��) �? ���)���1�)� :���6�1�)� ��1 �5 � )5�(��(�,?���5� D �6��� ��1�� @�� ��(�� �� ��(������ *� -=2=;=��� F� 9� F���)�F� 9� �����,��;�� �� �� ���� !��� )++.� � �� �!"� B� >��) ,��,�=)���1��) ��(� ��C�.��� :��(��� (� (�� (��=���� .265����� ��1 ���;5� ��,����):�,��) �� ��?� 7��8� -=�(�������� ��� (�� ��1�� ?���5� D �6��� )5)(��)�=)�1 �� (�� )(=15� ��� ��((�� ���,(��� �,,�:(��) (��� (�� ,5(�,�����9���! ?���5� D �6��� ,��:��6 )� (��( (�� ��)=�() ��5 ��( :��(��� �( ���(� �6�1�(��� �5 ,5(�,����� 9���!�

7�8 �B +� ��C,���� +���� � >�1�,� �� 4� 9=((� 9� -� ����������� �� ������ !��� )++!� ���� $$� H �B +� ��C,���� +���� � >�1�,�N��1�((�� �� � ���)(��5� � *� A����()� 9� -� ����������� �� ������ !��� )++!� ���� � !#�H ,B 9� �� >�5� +� ��C,���� 9� -������������ �� �� ���� !��� )++.� � �� ""���

7�8 �B +� -���(�.� �� �����)� *� *���2� ������ ���� )+++� ���� $"$!H������ ���� ��� � � )+++� ��� $�� � >�� :�:�� )��C) (��( �� (�� ��):��)� (�� ���,(������, ?���)� 79��-�� 0�8 @!� �B ��1 79����-����0�8@!� �B ��� ����)( 1�������(�� �=( � 1����,(��, ��.�������( ��2�)79����-����0�8 @!� �B (�� ���=�1 )(�(�� >��) �) �� �,,��1 C�(����,(��,����,�� ��)=�() ��L F� >� ���.�)� M� ���))� +� E� *(���� ��������� )++ � ��� �!��� �B >�� ):�� 1��)�(5 �) �"W �� (�� :��:�5��� ��1$!W �� (�� (�����(� �����1 ?�� (�� ��1�� (�����(� =)�1 ����� >��)��1�� �) ,��)�� (� (�� ?=�� ,5)(����(� �����1 (���� ?�� �6��:��� (����$*� ��1���

7"8 *� *���2� +� -���(�.� �� *,���1��� �� *,�C��;� ���� �+�� �� )++.� ����$�

7#8 9� F� *(�.��)� -� F� ��.���� �� -� ������C)2�� +� F� -��),�� �� 0���� ����)++ � ��� ��� $�

7�8 F4�O4A $��� *,���1������ ��,�� 9��(���1� 0A� )++.� >�� :��������:��5) (�� ��)(��,(�1 �:���)���� N$�9 ��(��1�

7�!8 �4O**�4��#� ��=))���� ��,�� 9�(()�=���� 94� )++.�7��8 F� 9� ��5� �� A� ��1(� �� ���� 0���� )+.!� � � ���7� 8 �B >�� )(�(� C�(� ��6��=� ):�� @!� �S B 1�1 ��( ,��.���� �� �=�

,��,=��(���)� ��C�.��� �( �=)( �� 2�:( �� ���1 (��( C��(��� (�����=�1 )(�(� �? (�� :��1=,( ?����, D ��,���� ,��:��6 �) !� �S �� !� �S 1��) ��( ��.� ������� �� (�� ,��,�=)���) �? (��) )(=15� �) )=�����;�1

Page 5: Two-State Reactivity in the Rebound Step of Alkane Hydroxylation by Cytochrome P-450: Origins of Free Radicals with Finite Lifetimes

�������������

������ ���� ��� � � ����� ��� ��� �� � ���� �� ����� ����� ������� ��������� !!! !�"!�!#$$%!!%$���� !!" & �"��!'��!%! !!"

�� ��� �$ ������� 0���% �� �������1������ �� ���%�� ������ % �� � 2���%����� � 2������3�((�����=) +�,�2���)� C� *2�;5:,;�2�F��2=�� ��1F��� �� 9��(�)��C�,;3

���,�.����(� �((��,(�.� ��(���,(���) ��� �6(�����5 ��:���(��( ?��,�) (��( ,�� ��?�=��,� ����,=���� )��=(���� ��1 )���1�)(�(� :��:��(��)� -�� �6��:��� �51����� ���1��� �) =����=����5 (�� ��)( ��:��(��( 1���,(��� ��(������,=��� ?��,� ��1

)(�=,(=�� ������(��� ��(�? �� ���5 ,����,�� ��1 �������,��)5)(��)� +=,� ��)) �::��,��(�1 @��1 =(���;�1B ��� (�� ����(�1?��,�) (��( �6�)( ��(C��� ���.��� �(��)� 4 ,��)) �? )=,��((��,(�.� ��(���,(���) ��.� �?(�� ���� (����1 )�,��1��5���1)�7�8 �2� �51����� ���1)� (��)� ���1) ��.� )(�������,(��)(�(�, ,��:����() ��1 )��C 1���,(����� :��?����,�)�7 8

-��� (�� )�������(5 (� �51����� ���1)� �( ��) ��)� ����)=���)(�1 (��( )�,��1��5 ���1) ����( ��.� :�(��(��� ?�� (����(����� 1�)��� �? )=:������,=��� )(�=,(=��)�7$8

*�,��1��5 ���1)� :��(�,=����5 � TT T 0 ���1)� ��� � :��.�)�.�?��(=�� �? )(�=,(=��� ��������1���@���B ,����)(�5�7�8 A�,��(�5�)=,� )�,��1��5 ���1 ��(���,(���) ��.� ���� �6:���(�1 (���(��1=,� ,����� ��.�������() ���=( ��1���@���B ,��(��) ?������(��)���,(�.� �6�1�(��� ���,(���)�7�8 �� �(��� ,�)�)� )�,���1��5 ���1) ,�� �� ,�=�(��:��1=,(�.�� �� ��1�)5����;���@9��0B�� � T T T 0 ���1) 1�����(� (�� )(�=,(=�� (� )=,� ���6(��( (��( (��) �6(�����5 :�(��( ��1 ��:��(��( ������( �)�))��(����5 ��)��=��� �� ��� ������,(�.� ��1���7�8 ����(����))�(��) .���(���� J�65��� �(�� C�����=)�K ��) ?�=�1 C�1��):���1 =)� �� ,�(��5(�, �65����(��� ���,(���) �?(�� (��1�),�.����) �? �() �??�,�,5 �) � )�=�,� �? �65��� �(��) ?���6�1�(���) ,�(��5;�1 �5 ,5(�,����� 9���!7"8 ��1 �5 1�),��(�(���)�(��� ��(�� ,��:��6�)�7#8

>��=�� 2��C� ?�� �.�� �!! 5���)�7�8

)(�=,(=��� 1�(���) ?�� ��1�)5����;���V�� ��5 ������) �? (��) ,��)) �? ��(������)V��� )(��� ����(�1� ����=) ):�,(���),�:�, )(=1��) ��.� )=���)(�1 (��( ���1�)5����;��� �1�:() (�� ?��� �? � ;���;�� :��5��� @*,���� �B�7�!8 C�����5��������, =��() �? 9��0 ��� ���2�1�5 ��(������,=��� � TT T0 )�,��1��5���1)� ��(��� 9��0 �������)� ��0 )����� ���1) @ �!� UB��1 � ����0 ���1 ����� ���� �!� ��.� ���� 1�1=,�1 ?����6(��1�1 X���5 ��)��:(��� ?����)(�=,(=�� @X4-*B ����5�)�)�7�!�8 >�� (���(� )���1�)(�(� �������(��� �? (�� 9��0 ��������) �) =�1�=�(�1�5 ,�=)�1 �5 (�� )(���� ���,(��)(�(�,�((��,(���) ��(C��� (�� �::�)�(��5 ,�����1 ��1��� ��1 �65����(��) @����( ��)����,� )(�=,(=��� *,���� �B� 9��5����,��1�)5����;��� �) ��)� ��2��5 (� �� (������(�1 �5 �11�(��� �?C�(�� ��1 (�=) ��1�)5����;��� ,�� �� ?=�(��� ?���=��(�1 �)�0@9��0B���7��8 �� ��.� ��,��(�5 1�),�.���1 (��( )��=���1���.�(�.�) �? @(�)5��������1�B���;��� ��1 ��1�)5����;������ �����;�1 �? )(���� ��(����� 1�:���) ,�:���� �? ��(��1=,�������#����+�#� � T T T 0 )�,��1��5 ���1)� ?�� (�� :=�:�)� �?��:��,��� ���������+�#� � TT T � ��1 � TT T0 )�,��1��5 ���1)���� ��,��:���(�1 ��(� (��)� ��(�����)�7� 8 ��1��1� � )������,�5)(�� X���5 )(�=,(=�� ����5)�) �? (�� @(�)5���������1�B���;��� 1���.�(�.� )��C�1 (�� :��)��,� �? )����?�,��(��(������,=��� � TT T 0 )�,��1��5 ���1��� ��1 (�=) ,��?����1�=� �6:�,(�(���)� �� ��C ��.� )=,,��1�1 �� ��(������ )�����,�5)(��) )=�(���� ?�� X���5 1�??��,(��� )(=1��) �? (�� ,�����):��1��� )��=��� ��1�)5����;��� ��1 ������ ��:��( (�� ?��)(,�5)(�� )(�=,(=�� �? �� ��1�)5����;��� 1���.�(�.� 4��0 @)H4�� ��N=*0 ����B� -=�(�������� (�� ,�5)(�� )(�=,(=�� �?(�� ,����):��1��� ��15����;��� 4��0 @�B ��) ��)� ������(����1� ���:���)��) ��(C��� (��)� (C� )(�=,(=��) ��.�����(���)(��� �):�,() �? (�� ��(=�� �? ��1�)5� ��1 ��1�65���1)�

�� -��=�� � ���( ��((��) �) (�� ����.��� �? )(�(�) ��(����1 �5 (�� (C�):�� ,�=:���� ��1�) �� *,���� � �B ���)�(5 ?=�,(����� ,��,=��(���)�? ,����):��1��� ?����, DC�(�� ,��:��6�) ��.� !� �S ���=�1 )(�(� ��1� ������ �����5 !� �S )(�(�� *��L +� -���(�.� �� �����)� *� *���2� ������ !��� 0��3�� ��#��� )+++� $��H +� >� ������ �� �� ���� !���)++.� � �� �!"" � >��) �) )=::��(�1 �5 �6:������(�� �))������(� *��L�� >������� +� N�����1�� �� ���1?���� 9� +� �� E����,2� � O���,���� �� ���� !��� )++!� ���� # �$� ��C�.��� � ��,��( �6:������(����.�)(���(��� �? � ��1�� ,��:�=�1 C�(� � ):�(����5 ?�6�1 (���:����65�����1 )��C) �� !� �S ���=�1 )(�(� ��1 ��1�,�(�) (�� ���� �? (��:��(��� �� )(�����;��� (�� !� �S ���=�1 )(�(�� �) :��1�,(�1 ���(����5 �5�����) ��1 ��C� *��L �� 4�))��=�� A� N�,������ 4� *,�C������ ����� ������� ������ ���� )++.� ���� $���H ������ ���� ��� � �)++.� ��� ��#H �� �����)� �� �� ��C� �� �� ���� !��� )++-� ��"�#""��

7�$8 �� �� *� ����)���=�=� � +� ��.���� F� �� ���2���� >� � 9�=��)� ���� ���� !��� )++!� ���� � �"�

7��8 4 1���,( 0� (���)?�� ��,����)� C�=�1 ��(��� ):���)(�(� ,��))��� (�(�� !� �S )(�(� �? (�� ?�.��,���1���(� ?����, ,��:��6 @?�� �6��:��� )��L��?� 7�8B�

7��8 4�� �* 1�(� ��� ��(����1 C�(� N$�9 =)��� F4�O4A $�� @��?� 7�8B�>�� * :��?��� �) ,��,=��(�1 C�(� (�� =���)(��,(�1 N$�9 ��(��1 ���4O**�4� �# @��?� 7�!8B� -�� ,��.�����,�� (�� ;��� �? (�� �����5),��� �� -��=�� �) ,����� (� (�� * ��1 �* ,=�.�)�

7��8 �B +� -���(�.� �� >����� ���� 0���� $���� )++.� �"� ��"H �B �� N�),��*� ��;� �� 0���� ���� � )++/� ���� ����H ,B *� *2�2�.� A� 4� ������������ 0���� $���� )++/� ��� ��H 1B >�� �.����� =�1���)(���(�������� �? N$�9 @�� ��?� 7��� D ,8B ?�� ����(�1 ���,(���) ��.��.�����1�,��) �)�� 2,�������� C���� ?�� ����(�1 ���,(���) ��.��.��� 0� ��1��$ ���=:)� (�� ����� �) !�� 2,��������7��,8 -�� ���,(���) ��.��.��� -��0� ��1 � �(��)� (�� =�1���)(���(��� ����� �? (�� N$�9 ������� �)�::��6���(��5 � 2,������� ����(�.� (� �6:������(�� 1�(� ��1 ��� 2,������� ����(�.� (� (�� �4*9> ��)=�( C��,� )���) (� �.���)(���(� (����������7�"8

7�"8 +� -���(�.� *� *���2� �� 0���� ���� � )++.� �� � $#$��

738 9��?� F� �� 9��(�)��C�,;� �� +�,�2���)��:��(���( �? �����)(�5��)� ��)(��� A�)��.� O��.��)�(5�!�!! =,��1 4.��=����.����1� 0� ���!��"!"# @O*4B-�6L @��B ���$�#�$!!������ L I1:�Q:��,C�=��1=

��� � *2�;5:,;�2�F��2=���:��(���( �? �����)(�5O��.��)�(5 �? >���1�>���1�� 0� �$�!��$$�! @O*4B

7338 >��) C��2 C�) )=::��(�1 �5 (�� 1����) �? >�� 9�(����=� A�)���,�-=�1� �1����)(���1 �5 (�� 4����,�� �����,�� *�,��(5� ��1 �5 (��0��� N���1 �? A����() @?�� ?����,��� )=::��( �? (�� 0��� ��5)(��������:��, ���)��(�=�B�

*,���� �� M��;��)(�=,(=�� �? ��1�)5�����;����