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ÉTUDE SUR L’ENDOCYTOSE DU RÉCEPTEUR DE L’INSULINE : RÔLE DU NŒUD DE SIGNALISATION ATIC / PTPLAD1.

Thèse

Martial Boutchueng Djidjou

Doctorat en biologie cellulaire et moléculaire Philosophiae doctor (Ph.D.)

Québec, Canada

© Martial Boutchueng Djidjou, 2016

ÉTUDE SUR L’ENDOCYTOSE DU RÉCEPTEUR DE L’INSULINE : RÔLE DU NŒUD DE SIGNALISATION ATIC / PTPLAD1.

Thèse

Martial Boutchueng Djidjou

Sous la direction de :

Robert Faure, directeur de recherche

iii

RÉSUMÉ

La cellule utilise des nœuds d’interactions protéiques relativement stables, conservés et souvent

constitués d’adaptateurs moléculaires pour gérer des signaux reçus (synthèse, sécrétion, traffic,

métabolisme, division), des problèmes de sécurité et de niveaux d’énergie. Nos résultats montrent que

la cellule utilise aussi des nœuds relativement petits et dynamiques où des informations propres

concernant des voies métaboliques apparemment indépendantes sont évaluées. Ces informations y sont

intégrées localement et une décision y est prise pour action immédiate. Cette idée est supportée par

notre étude sur le récepteur de l’insuline (RI). Ce récepteur transmembranaire à activité tyrosine kinase

reconnaît un signal externe (insuline circulante) et engage la signalisation de l’insuline, les réponses

métaboliques et le contrôle du glucose circulant. Le RI est aussi impliqué dans l’internalisation de

l’insuline et sa dégradation dans les endosomes (clairance). Il régule donc indirectement la sécrétion de

l’insuline par les cellules du pancréas endocrine. La signification pathophysiologique de l’endocytose

du RI ainsi que les bases moléculaires d’une telle coordination sont peu connues. Nous avons construit

un réseau d’interactions du RI (IRGEN) à partir d’un protéome de fractions Golgi-endosomales (G/E)

hépatiques. Nous démontrons une forte hétérogénéité fonctionnelle autour du RI avec la présence des

protéines ATIC, PTPLAD1, AMPKα et ANXA2. ANXA2 est une protéine impliquée dans la

biogénèse et le transport endosomal. Nos résultats identifient un site de SUMOylation régulé par

l’insuline dans sa région N-terminale. ATIC est une enzyme de la voie de synthèse des purines de novo

dont le substrat AICAR est un activateur de l’AMPKα. Des analyses biochimiques in vitro et in vivo

nous montrent que ATIC favorise la tyrosine phosphorylation du RI par opposition fonctionnelle à

PTPLAD1. Une délétion partielle d’ATIC stimule l’activation de l’AMPK dont la sous-unité AMPKα2

apparaît déterminante pour le trafic du RI. Nous démontrons que ATIC, PTPLAD1, AMPKα, AICAR

et ANXA2 contrôlent l’endocytose du RI à travers le cytosquelette d’actine et le réseau de

microtubules. Nous ressortons un nœud de signalisation (ATIC, PTPLAD1, AMPKα) capable de

détecter les niveaux d’activation du RI, d’énergie cellulaires (rapports AMP/ATP) et aussi d’agir sur la

signalisation et l’endocytose du RI. Cette proximité moléculaire expliquerait le débat sur le mécanisme

primaire du diabète de type 2 (DT2), notamment entre la sensibilité à l’insuline et sa clairance. Nous

avons calculé un enrichissement de 61% de variants communs du DT2 parmi les protéines

fonctionnellement proches du RI incluant RI, ATIC, AMPKα, KIF5A et GLUT2. Cet enrichissement

suggère que l’hétérogénéité génétique révélée par les consortiums sur études génomiques (GWAS)

converge vers des mécanismes peu étudiés de biologie cellulaire.

iv

ABSTRACT

The normal cell deals efficiently with multiple signals, processes (synthesis, secretion, trafficking,

metabolism, and division), and energy and security problems. To achieve these goals, the cell uses

large and relatively stable proteins nodes (or hubs) often sustained by adapters. It appears that the cell

also uses small, dynamics nodes where informations about apparently unconnected major pathways are

evaluated. Not only these informations are locally integrated but also a decision is made for immediate

action. This is exemplified here by the insulin receptor (IR). This receptor-tyrosine kinase recognizes

signals from the outside (circulating insulin) and engages insulin signalling activity and the insulin

response. Quite simultaneously, the insulin receptor is involved in insulin internalization and its

subsequent degradation in endosomes (clearance of circulating insulin) and thus, it indirectly regulates

insulin secretion by the β-cells of the endocrine pancreas. The physiological significance of trafficking

and the molecular bases of such coordination have received little attention. We constructed hepatic

Golgi/endosomes (G/E) network of the internalized IR (IRGEN) and we found substantial

heterogeneity within the close environment of IR, with the presence of ATIC, a metabolic enzyme of

the de novo purine synthesis pathway, the putative tyrosine phosphatase PTPLAD1, the energy sensor

AMPK and ANXA2, a protein involved in endosomes biogenesis and endosomal transport. Our results

show that ANXA2 is SUMOylated on an insulin-dependent way at a non-concensus motif of its N-

terminal domain. It appears that following insulin stimulation, the proteins ATIC, PTPLAD1, AMPKα

associate within seconds with the activated IR and control its tyrosine kinase activity and traffic. We

found that PTPLAD1 and AMPKα are rapidly compartmentalised within the plasma membrane (PM)

and G/E fractions after insulin stimulation and that ATIC accumulates in the G/E fraction later. By

using an in vitro reconstitution system and siRNA–mediated partial knockdown of ATIC and

PTPLAD1 in HEK293 cells, we confirmed that ATIC, PTPLAD1 and AMPKα affect IR tyrosine

phosphorylation and endocytosis and treatment with AICAR, increased IR endocytosis in cultured

cells and in the liver. These results suggest the presence of a new signalling mechanism that senses in

the same time adenylate synthesis, cell energy (ATP) and IR activation states and that acts

consequently in regulating IR autophosphorylation and endocytosis. The IRGEN may explain the

perceived promiscuity that exists between insulin resistance and clearance, as this new signalling node

apparently controls both the IR activity and trafficking. The elevated number of common heritable

variants associated with type 2 diabetes (T2D) in the actual IRGEN (more than 61 %) favours the idea

that the confusing genetic heterogeneity converges however towards few biological mechanisms.

v

TABLE DES MATIÈRES

RÉSUMÉ ............................................................................................................................... iii ABSTRACT .......................................................................................................................... iv TABLE DES MATIÈRES ...................................................................................................... v LISTE DES TABLEAUX ................................................................................................... viii LISTE DES FIGURES .......................................................................................................... ix LISTE DES ABRÉVIATIONS ............................................................................................. xi DÉDICACES ....................................................................................................................... xvi REMERCIEMENTS .......................................................................................................... xvii AVANT-PROPOS ............................................................................................................... xix

1. CHAPITRE 1 : Introduction ........................................................................................ 1 1.1. Structure et synthèse de l’insuline ........................................................................ 1 1.2. Récepteur de l’insuline ......................................................................................... 2

1.2.1. Structure, synthèse et récepteurs hybrides de l’insuline ............................... 2 1.2.2. Architecture du récepteur de l’insuline ......................................................... 3 1.2.3. Activation du récepteur de l’insuline ............................................................ 9

1.3. Trafic membranaire ............................................................................................ 12 1.3.1. Protéome des fractions G/E et théorie des marqueurs ................................ 12

1.3.1.1. Ultrastructure ........................................................................................... 12 1.3.1.2. Théorie des marqueurs ............................................................................ 13

1.3.2. Voies d’endocytose des récepteurs tyrosine kinases (RTKs) ..................... 14 1.3.2.1. Endocytose par voie de clathrine ............................................................ 15 1.3.2.2. Endocytose par voie de cavéoline ........................................................... 18 1.3.2.3. Endocytose par voie de flotilline ............................................................. 19

1.3.3. Appareil endosomal .................................................................................... 21 1.3.4. Mécanismes de trafic endosomal : Rôle des petites GTPases Rabs ........... 22 1.3.5. Trafic membranaire et signalisation ............................................................ 29

1.4. Cytosquelette et transport bidirectionnel des vésicules endosomales ................ 33 1.5. Réseaux d’interactions protéines-protéines ........................................................ 37

1.5.1. Topologies des réseaux d’interactions protéiques dans la cellule .............. 37 1.5.2. Réseaux d’interactions moléculaires et maladies complexes ..................... 40 1.5.3. Réseaux cellulaires et gènes candidats pour maladies complexes .............. 43 1.5.4. Concept de « diseasome » ........................................................................... 46

vi

1.6. Diabète : Résistance à l’insuline et génétique .................................................... 46 1.6.1. Histoire : Du diabète à la découverte de l’insuline ..................................... 46 1.6.2. Diabète : Présentation générale ................................................................... 47 1.6.3. Mécanismes moléculaires associés au diabète de type II ........................... 49 1.6.4. Génétique du diabète de type II .................................................................. 50

OBJECTIFS ET HYPOTHÈSES ......................................................................................... 52 2. CHAPITRE 2 : La dernière enzyme de la voie de novo de biosynthèse des purines (ATIC) joue un rôle central dans la signalisation de l’insuline et le réseau golgi-endosomal ......................................................................................................................... 54

2.1. Résumé en Français ............................................................................................ 54 2.2. Avant-propos du chapitre 2 ................................................................................ 55

The last enzyme of the de novo purine synthesis pathway ATIC plays a central role in insulin signalling and the Golgi/endosomes protein network. ............................................. 56

2.3. Abstract .............................................................................................................. 57 2.4. Introduction ........................................................................................................ 58 2.5. Experimental procedures .................................................................................... 60 2.6. Results ................................................................................................................ 63 2.7. Discussion .......................................................................................................... 69 2.8. Supplemental data .............................................................................................. 71 2.9. Acknowledgments .............................................................................................. 71 2.10. Références .......................................................................................................... 73 2.11. Tables ................................................................................................................. 77 2.12. Figures and legends ............................................................................................ 79

3. CHAPITRE 3 : Annexine A2 est SUMOylé à son domaine N-terminal : Régulation par l’insuline ..................................................................................................................... 94

3.1. Résumé en Français ............................................................................................ 94 3.2. Avant-propos du chapitre 3 ................................................................................ 95

Annexin A2 is SUMOylated on its N-terminal domain: Regulation by insulin. .................. 96 3.3. Abstract .............................................................................................................. 97 3.4. Introduction ........................................................................................................ 98 3.5. Materials and methods ....................................................................................... 98 3.6. Results .............................................................................................................. 101 3.7. Discussion ........................................................................................................ 103 3.8. Acknowledgments ............................................................................................ 105 3.9. References ........................................................................................................ 105

vii

3.10. Figures and legends .......................................................................................... 109 4. CHAPITRE 4 : Conclusions générales et perspectives ........................................... 114

4.1. Protéome des fractions G/E et théorie des marqueurs ...................................... 114 4.2. Analyse systématique des fractions G/E à partir du récepteur de l’insuline .... 115 4.3. Le récepteur de l’insuline contrôle son trafic en régulant la SUMOylation de l’annexine A2 .............................................................................................................. 118 4.4. Importance pathophysiologique du réseau Golgi-endosomal du récepteur de l’insuline ...................................................................................................................... 118 4.5. Perspectives ...................................................................................................... 120

4.5.1. La flotilline est-elle une voie d’endocytose pour le récepteur de l’insuline...…………………………………………………………………………120 4.5.2. ATIC rentre – t- elle dans la catégorie des morphéines? .......................... 120 4.5.3. Mécanismes moléculaires de trafic du récepteur de l’insuline in vivo chez la souris………………………………………………………………………………122

5. Bibliographie ........................................................................................................... 123

viii

LISTE DES TABLEAUX

Chapitre 2

Table 1 : Mass spectrometry analysis of internalised IR complexes in the liver……………………...77 Supplemental table.1: Peptides and MRM Transitions used for relative quantification……………..78

ix

LISTE DES FIGURES

Chapitre 1

Figure 1: Séquence en acides aminés de l’insuline humaine, porcine, bovine ou de mouton………….1 Figure 2: Architecture modulaire du RI………………………………………………………………...4 Figure 3: Structure tridimensionnelle en V inversé de l’ectodomaine du RI…………………………...5 Figure 4: Liaison de l’insuline à l’ectodomaine du RI……………………………………….................6 Figure 5: Modèle de coopérativité négative………………………………………………….................8 Figure 6: Structure tridimensionnelle du domaine kinase du RI………………………………………11 Figure 7: Modèle « yo-yo » du domaine kinase du RI………………………………………………...12 Figure 8: Un modèle de système endolysosomal……………………………………………………...22 Figure 9: Un modèle de conversion des Rabs…………………………………………………………24 Figure 10: Domaines enrichis de Rabs dans des fractions endosomales……………………………...25 Figure 11: Modèle fonctionnel des Rabs GTPases dans le trafic vésiculaire…………………………29 Figure 12: Principales voies de signalisation de l’insuline……………………………………………30 Figure 13: Activation par l’insuline de l’entrée du glucose dans les cellules musculaires et les adipocytes………………………………………………………………………………………………31 Figure 14: Modèle d’organisation radiale des microtubules dans la cellule………………..................34 Figure 15: Communication intramoléculaire à l’intérieur d’un domaine moteur…………..................35 Figure 16: Exemple de bottleneck dans un réseau d’interactions protéines-protéines……..................39 Figure 17: Représentation schématique des quatre catégories de bottlenecks dans un réseau………..42 Figure 18: Catégories de modules dans un réseau d’interactions…………………………..................43 Figure 19: Méthodes d’identification de gènes candidats d’une maladie complexe …………………45 Chapitre 2

Figure 1: Construction of the Golgi/endosome network (GEN) and of the IR subnetwork (IRGEN)……………………………………………………………………………………….............79

x

Figure 2: Kinetics of the localisation of IR, ATIC, PTPLAD1, and AMPK in the plasma membrane (PM) and endosome (G/E) fractions…………………………………………………………………...81 Figure 3: Time course of IR autophosphorylation in isolated endosomes incubated in the presence of purified ATIC……………………………………………………………………………………………………83 Figure 4: ATIC, PTPLAD1 and AMPK bind to IR in cultured cells. ATIC and PTPLAD1 knockdown affects the tyrosine phosphorylation of IR, and ATIC affects the phosphorylation of AMPK………………………………………………………………………………………………….84 Figure 5: ATIC or PTPLAD1 knockdown in HEK293 cells increases IR internalisation, and AMPK knockdown decreases IR internalisation…………………………………………………………….....86 Figure 6: Time course for IR internalisation in liver after AICAR stimulation…………………….....88 Figure 7: Architecture of a signalling network that accounts for the relation between the effects of insulin, ATIC and the cell energy (ATP) level………………………………………………………...89 Supplemental figure 1: Proteins enrichment analysis ……..…………………………………………90 Supplemental figure 2: IR immunoprecipitation and mass spectrometry…………………………….91 Supplemental figure 3: Kinetics of IR, ATIC and PTPLAD1 accumulation in G/E fractions……….92 Supplemental figure 4: ATIC knockdown increases AMPK phosphorylation in HEK293 cells…….93 Chapitre 3

Figure 1: SUMOylation of ANXA2 in LNCaP cells………………………………………………...109 Figure 2: SUMOylation of ANXA2 N-terminal domain…………………………………………….110 Figure 3: Stimulation of ANXA2 SUMOylation by insulin in LNCaP cells………………………...111 Figure 4: Protein SUMOylation in isolated endosomes stimulated with insulin…………………….112 Figure 5: Construction of the endosomal IR/ANXA2/SUMO network (IRASGEN)………………..113

xi

LISTE DES ABRÉVIATIONS

A AAA ATPases Associated with diverse cellular Activities

AICAR 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucléotide, ou 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribotide

AICARFT 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide formyltransferase

ALK Anaplastic lymphoma kinase

AMP Adenosine monophosphate

AMPK Adenosine monophosphate kinase

ANXA2 Annexin A2

AP Adaptor protein

APOE Apolipoprotéine E

ARF6 ADP ribosylation factor 6

ARN Acide ribonucléique

ATIC 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide formyltransferase/IMP cyclohydrolase

ATP Adenosine-5′-triphosphate

B BpV(Phen) Potassium bisperoxo (1,10-phenanthroline) oxovanadate (V)

C CAK1 Cyclin-dependent kinase-activating kinase 1

CAP Cbl-associated protein

CBL Casitas B-lineage Lymphoma

CDC42 Cell division control protein 42

CDK2 Cyclin-dependent kinase 2

CORVET Class c core vacuole/endosomes transport

CR Cysteine rich region of insulin receptor ectodomain

CREB C-AMP Response Element-binding protein

E EE Early endosomes

xii

EEA1 Early endosome antigen 1

EGF Epidermal growth factor

EGFR Epidermal growth factor receptor

EHD2 EH-Domain Containing 2

Epsin15R Epsin 15 receptor

F FAICAR 5-formamidoimidazole-4-carboxamide ribonucléotide

FYVE Fab 1 (yeast orthologue of PIKfyve), YOTB, Vac 1 (vesicle transport protein), and EEA1 domain

G G/E Golgi endosomes

GAD Genetic Association database

GAP GTPase-Activating Proteins

GDI GDP Dissociation Inhibitor

GDP Guanosine diphosphate

GEF Guanosine nucleotide exchange factors

GEN Golgi endosomal network

GLUT Glucose transporter

Grb10 Growth factor receptor-bound protein 10

GSK3 Glycogen synthase kinase 3

GTP Guanosine triphosphate

GWAS Genome Wide Association Studies

H HEK293 Human Embryonic Kidney 293

HOPS Homotypic fusion and protein sorting

HSC70 Heat Shock Cognate Protein 70

I IA2 Islet cell antigen 512

IGF Insulin growth factor

xiii

IGF1R Insulin growth factor -1 receptor

IL2RA Interleukin 2 receptor alpha

IMPCH Inosine monophosphate cyclohydrolase

IR Insulin receptor

IRASGEN IR/ANXA2/SUMO golgi endosomal network

IRGEN Insulin receptor golgi endosomal network

IRS Insulin receptor substrate

J JIPS JNK-interacting proteins

JNK c-JUN-N-terminal kinases

K KIF5A Kinesin family member 5A

L L1 Insulin receptor leucine rich region 1

L2 Insulin receptor leucine rich region 2 LC-MS/MS Liquid chromatography-tandem mass spectrometry

LDL Low density lipoprotein

LDLR Low density lipoprotein receptor

LE Late endosomes

LNCaP Lymph Node Carcinoma of the Prostate cell line

M MAPK Mitogen activated protein kinase

SOS Son of sevenless

MT Microtubule

mTOR Mammalian Target Of Rapamycin

MyoVA Myosin VA

MyRIP Myosin VIIA And Rab Interacting Protein

N

xiv

NEDD4 Neural Precursor Cell Expressed, Developmentally Down-Regulated 4

NFκB Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells

Nrdp1 Synonyme de RNF41 (ring finger protein 41, E3 ubiquitin protein ligase)

O OMIM Online Mendelian Inheritance in Man

P PDGFR-β Platelet-derived growth factor subunit B

PHB Prohibitin

PI3K Phosphoinositide 3-kinase

PI3P Phosphatidylinositol-3-phosphate

PIP2 Phosphatidylinositol-2-phosphate

PKC Protein kinase C

PKM2 Pyruvate kinase muscle isozyme 2

PLVAP Plasmalemma vesicle associated protein

PM Plasma membrane

PTB Phosphotyrosine binding domain

PTPLAD1 Protein tyrosine phosphatase-like A domain containing 1

PTPN22 Protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 22

PTPR Protein tyrosine phosphatases, receptor type

R RabFIP2 Rab-family interacting proteins 2

RabGGT Rab geranylgeranyl transferase

REP Rab escort proteins

RI Récepteur de l'insuline

RIK Rough sheath 2-interacting KH domain protein

RILP Rab-interacting lysosomal protein

RING Really Interesting New Gene

ROR2 receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 2

xv

RTK Receptor tyrosine kinase

S SH2 Src Homology 2 domain

SHC Src homology 2 domain containing protein

SiRNA Small interfering RNA

SNAREs Soluble N-éthylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein REceptor

SNPs Single nucleotide polymorphism

SORBS1 Sorbin and SH3 domain-containing protein 1

STAT3 Signal transducer and activator of transcription 3

SUMO Small Ubiquitin-like Modifier

T T2D Type 2 diabetes

TGN Trans-golgi network

TNF Tumor necrosis factor

TRAP1 TNF receptor-associated protein 1

TRKA Tropomyosin receptor kinase A

t-SNAREs target-SNAREs

V VAMP-4 Vesicle-associated membrane protein 4

VPS34 Vacuolar protein sorting-associated protein 34

VTI1a Vesicle transport through interaction with t-SNAREs homolog 1A

Z ZMP Imidazole monophosphate / Aicar monophosphate

ZnT8A Zinc transporter 8

xvi

DÉDICACES

« Au moment de soumettre ma thèse de doctorat, j’ai une pensée toute particulière pour mes

parents Mr Djidjou Dieudonnée et Mme Djidjou Keumoé Émilienne Gabrielle pour leur soutien

indéfectible, leur confiance absolue et leur engagement sans réserve durant tout le temps de mes

travaux. Ma pensée se porte également vers Carole Matchuindem Kamgaing pour sa présence à

mes côtés malgré les nombreuses difficultés. »

xvii

REMERCIEMENTS

Mes remerciements vont vers tous ceux qui, de près ou de loin ont participé à ce vaste projet avec pour

aboutissement ce diplôme de doctorat.

En toute première place, je remercie mon superviseur Dr Robert Faure pour m’avoir accueilli dans son

laboratoire, pour sa présence permanente, sa patience et son soutien sans faille durant toutes ces années

de doctorat. Grâce à ton expertise Robert, tu as su me guider dans mes travaux et me mener à ces

résultats gratifiant et à l’obtention de mon diplôme. Je te remercie pour ces multiples congrès

nationaux et internationaux auxquels tu m’as permis d’assister et qui ont été des occasions pour moi

d’échanger et de m’enrichir au contact de nombreux experts de mon domaine de recherche.

Je remercie le Dr Christian Landry pour son assistance et sa disponibilité à m’aider à résoudre les

problèmes complexes de bio-informatique. Son expertise et ses conseils m’ont permis de grandir dans

ce domaine qui m’était totalement nouveau.

Je remercie profondément Suzanne Fortier, notre professionnelle de recherche pour son expertise

technique, sa disponibilité, pour sa discipline et sa rigueur de travail, qui ont été des ingrédients

indispensables à réunir pour l’évolution de mes travaux de laboratoire.

Mes remerciements sont également dirigés vers ma famille toute entière. Je pense notamment à mes

parents (Djidjou Dieudonnée et Keumoé Émilienne Gabrielle), à mes frères (Kamdem Djidjou

Thaddée et Kemmegne Djidjou Sébastien) et à mes sœurs (Djidjou Youbi Corine, Kammegne Djidjou

Patricia, Pouomegne Djidjou Diane et Djidjou Kenmegne Mireille). Merci pour votre écoute, vos

multiples conseils. Malgré la distance, malgré votre compréhension limitée du sujet, vous avez été

encore plus concernés par cette thèse que moi-même. Ce diplôme est votre victoire. Nous connaissons

l’endurance que cette thèse a nécessitée, vous avez été au fait des moments les plus délicats et vous

avez savouré avec moi les périodes de joie. Nous arrivons à la fin de ce voyage et je vous dis encore

une fois merci.

Merci à mon épouse Carole Matchuindem Kamgaing, ma compagne de tous les jours. Ta présence à

mes côtés m’a fortifié et ton arrivée à Québec m’a stabilisé. Tu as été un appui certain et ta

xviii

contribution psychologique m’a permis de me relever pendant les moments difficiles. Je te remercie

pour ta patience et ton assistance. Ensemble, nous avons su faire face à ce long challenge. Cette thèse

est aussi la tienne.

xix

AVANT-PROPOS

Cette thèse de doctorat comporte quatre chapitres. Le premier chapitre comporte une revue de

littérature qui actualise nos connaissances sur le trafic membranaire des récepteurs tyrosine kinases et

donc du RI, sur les voies de signalisation qui leur sont communément associées ainsi que sur les liens

entre signalisation et trafic membranaire des dits récepteurs. Il introduit également l’importance des

réseaux d’interactions protéines-protéines en biologie moléculaire et leurs possibles applications dans

la recherche en médecine. Enfin, il distingue les différents types de diabètes et ressort brièvement

quelques mécanismes moléculaires associés au diabète de type 2, maladie complexe régulièrement

associée au métabolisme de l’insuline.

Le chapitre 2 est un article publié par la revue scientifique Molecular and Cellular

Proteomics. Il est intitulé « The last enzyme of the de novo purine synthesis pathway 5-

aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide formyltransferase/IMP cyclohydrolase (ATIC) plays a

central role in insulin signaling and the golgi/endosomes protein network ». Il est publié dans la revue

Molecular and Cellular Proteomics (Molecular & Cellular Proteomics 14 :

10.1074/mcp.M114.047159, 1079-1092, 2015). J’y suis premier auteur. J’ai poursuivi et complété la

majeure partie des expériences, initiées par Gabriel Simard ancien étudiant en maitrise dans notre

laboratoire. Suzanne Fortier, notre professionnelle de recherhe a également pris part aux expériences

de laboratoire. Isabelle Kelly a été en charge de l’analyse protéomique. J’ai participé au design de

l’article avec le Dr Sebastien Hébert et mon superviseur le Dr Robert Faure. La supervision de

l’article a été faite par le Dr Robert Faure.

Le chapitre 3 est le deuxième article auquel j’ai pris part. Il a pour titre « Annexin A2 is SUMOylated

on its N-terminal domain: Regulation by insulin ». Il est publié dans la revue scientifique FEBS Letter

(FEBS Lett. 2015 Apr 13;589(9):985-91). J’y suis coauteur avec Danielle Caron qui a contribué à la

plupart des expériences et à la rédaction de l’article. J’y ai participé à travers les expériences

bioinformatiques et l’analyse des données. Le Dr Robert Tanguay a également pris part au design de

l’article et aux expériences alors que l’article était coordonné et supervisé par le Dr Robert Faure qui a

été le principal auteur du design, des expériences et de la rédaction de l’article.

xx

Au chapitre 4 nous discutons des différents résultats obtenus et mettons en relief quelques points

d’intérets pour la continuité de mes travaux.

1

1. CHAPITRE 1 : Introduction

1.1. Structure et synthèse de l’insuline

La découverte de l’insuline à l’Université de Toronto entre 1921 et 1922 par les canadiens Frederick

Grant Banting et John James Rickard Macleod qui ont reçu le prix nobel de médecine en 1923, a

constitué l’un des évènements les plus importants du siècle dernier (Rosenfeld., 2002). Sous sa forme

biologiquement active, l’insuline est un monomère de 5800 daltons, comprenant chez l’humain, deux

chaînes A et B de 21 et 30 acides aminés respectivement, lesquelles sont liées entre elles par des ponts

disulfures notamment au niveau des acides aminés A7-B7 et A20-B19. En outre, la chaîne A

comprend un pont disulfure interne entre les acides aminés A7 et A11. L’insuline est donc une

hormone polypeptidique sécrétée par la cellule bêta des ilôts de Langerhans du pancréas endocrine.

Son ARN messager est traduit en préproinsuline, un précurseur formé d’une seule chaine dont

l’insertion dans le réticulum endoplasmique cause la perte du peptide signal et résulte en sa maturation

en proinsuline. La proinsuline comprend trois domaines, un domaine amine terminal au niveau de la

chaîne B, un domaine carboxyle terminal à la chaîne A et, tout au milieu, un peptide de connexion

connu sous le nom de peptide C. L’action des endopeptidases du réticulum endoplasmique cause

l’excision du peptide C de la forme mature de l’insuline (Orci et al., 1986; Orci et al., 1987; Rhodes et

Halban., 1987). L’insuline et le peptide C libérés transitent dans des granules de sécrétions qui

s’accumulent dans le cytoplasme avant le relargage de l’insuline par exocytose sous l’action de stimuli

appropriés.

Figure 1 : Séquence en acides aminés de l’insuline humaine, porcine, bovine ou de mouton. (Figure

tirée de (Mayer et al., 2007)).

2

Des études cristallographiques montrent qu’à faible concentration (en micromolaires), l’insuline se

dimérise et en présence d’ions Zinc, elle s’assemble dans une structure hexamérique symétrique (De

Meyts et al., 2004). Autour de sa région hydrophobique, la forme monomérique de l’insuline

comprend deux surfaces non polaires qu’elle utilise lors de sa liaison à son récepteur (Blundel et al.,

1972; Baker et al., 1988). L’une est essentiellement aromatique et est localisée dans une structure de

couches-β antiparallèles après formation du dimère. L’autre est mise en évidence après que la forme

dimérique s’assemble en hexamère (De Meyts et al., 2004)

1.2. Récepteur de l’insuline

1.2.1. Structure, synthèse et récepteurs hybrides de l’insuline

Le RI est codé par un gène unique du chromosome 19 ayant plus de 120 Kbs et comprenant 22 exons

dans sa région codante, séparés les uns des autres par 21 introns. Les 11 exons codant pour la sous-

unité α mature, sont dispersés sur plus de 90 Kpbs alors que les 11 autres codant pour la sous-unité β

sont compactés dans une région d’environ 30 Kpbs. Cette organisation segmentée exon/intron a permis

de définir des éléments structuraux et fonctionnels du RI mature. Par exemple, les exons 1, 2 et 3 sont

connus pour coder respectivement le peptide signal, la région de liaison putative du ligand et la région

riche en cystéine de la sous-unité α. Au niveau de la sous-unité β, le domaine transmembranaire codé

par l’exon 15 est séparé du domaine tyrosine kinase (codée par les exons 17 à 21), par une courte

région associée à l’exon 16, alors que le domaine carboxyle-terminal provient de l’exon 22. En outre,

l’exon 11 est sujet à un épissage alternatif qui résulte en la formation de deux isoformes du RI : Le RI-

B et le RI-A. Ces isoformes, exprimées in vivo, diffèrent par la présence (RI-B) ou l’absence (RI-A)

d’une séquence de 12 acides aminés codés par l’exon 11 dans la région carboxyle-terminale de la sous-

unité α (Seino et al., 1989; Glendorf et al., 2011; Ebina et al., 1985; Ullrich et al., 1985). Outre les

différences d’expression au cours de la différenciation cellulaire et de la phase développementale (RI-

A est plus exprimée au cours du développement du fœtus alors que B est majoritaire dans les tissus

adultes) (Serrano et al., 2005; Frasca et al., 1999), l’expression de ces isoformes varie suivant les tissus

(Moller et al., 1989; Seino et al., 1989; Mosthaf et al., 1990). Ainsi, chez l’humain, les deux isoformes

sont fortement exprimées dans les tissus squelettiques, adipeux, les reins, le coeur et le placenta.

L’isoforme RI-B est la plus abondante dans les tissus sensitifs à l’insuline. Elle est la plus abondante

dans le foie alors que l’isoforme RI-A est plus fortement exprimée dans le cerveau, la rate, les tissus

3

fœtaux et dans plusieurs cancers. Les deux isoformes présentent également des différences

fonctionnelles telles que leur affinité de liaison à l’insuline (elle est deux fois plus importante chez RI-

A) (Mosthaf et al., 1990), leur cinétique d’internalisation, leur capacité et dynamique signalétique

(Yamaguchi et al., 1991; Kellerer et al., 1992; Kosaki et al., 1995; McClain., 1991; Giudice et al.,

2011). Une différence majeure reste cependant leur affinité de liaison au facteur de croissance

analogue à l’insuline (IGF1 et IGFII). Elle est bien plus forte chez l’isoforme RI-A mais reste bien plus

faible que l’affinité de liaison à l’insuline pour les deux isoformes (Glendorf et al., 2011). Le RI est

effectivement structurellement et fonctionnellement assez proche de celui du facteur de croissance

IGF, analogue de l’insuline. Ces deux récepteurs forment dans certains cas des récepteurs hybrides

hétérodimériques composés de deux monomères αβ provenant respectivement du RI et du IGF1R.

Leur importance biologique ainsi que leurs modes d’activation ne sont pas clairement établis. Ils

existent donc sous deux formes différentes (RI-A/IGF1R et RI-B/IGF1R) et ont été retrouvés dans les

tissus présentant une sensibilité à l’insuline. Ces récepteurs hybrides sont d’autant plus formés lorsque

l’un ou l’autre des deux récepteurs (ou alors les deux simultanément) est surexprimé dans un tissu

donné. Il a été démontré que la surexpression de l’un ou l’autre des deux récepteurs résultait en une

perte de sensibilté à l’insuline due à un plus grand nombre de récepteurs hybrides qui lient l’insuline

avec une affinité plus faible (Slaaby et al., 2006; Benyoucef et al., 2007). Chez les patients atteints de

diabète de type 2, il a ainsi été observé une surexpression de ces récepteurs hybrides au niveau des

tissus adipeux, du muscle squeletique, corrélant avec une baisse de sensibilité à l’insuline (Bäck et al.,

2009 ; Federici et al., 1996; Federici et al., 1997; Federici et al., 1998). Cette forte expression de

récepteurs hybrides a également été observée dans des cellules cancéreuses notamment avec le variant

RI-A (Belfiore et al., 2009 ; LeRoith et al., 2003; Trajkovic-Arsic et al., 2013), qui présente une grande

affinité pour IGFII (Slaaby., 2015).

1.2.2. Architecture du récepteur de l’insuline

Le RI est un récepteur de surface de la superfamille des récepteurs tyrosine kinases. Sa forme mature

est formée de deux sous-unités α et deux sous-unités β formant un hétérotétramère α2β2. Si les deux

sous-unités α sont entièrement extracellulaires et sont le site de liaison du ligand, les chaînes β, quant

à elles, sont plutôt transmembranaires. Chaque chaîne de la sous-unité α extracellulaire est composée

dans sa région N-terminale successivement d’un domaine riche en leucine (L1) suivi par un domaine

riche en résidus cystéines (CR), puis un autre domaine riche en Leucine (L2). Ces domaines sont suivis

4

par un domaine complet de fibronectine de type-III (FnIII-1) puis un autre partiel (FnIII-2) et un long

segment carboxyle terminal qui, outre un peptide de 16 acides aminés crucial dans la liaison du ligand,

inclut un domaine insert (ID) de 120 résidus acides aminés comprenant le site de clivage par la furine

des sous-unités α et β au cours de sa maturation et se terminant dans sa portion extracellulaire par un

segment α carboxyle-terminal (αCT). Les deux sous-unités α sont liées l’une à l’autre par des ponts

disulfures des cystéines Cys524 du FnIII-1, Cys682, Cys683 et Cys685 du domaine Insert de FnIII-2.

Chacune des sous-unités α est reliée à une sous-unité β par la cys647 (FnIII-2) et Cys860 de la sous-

unité β (McKern et al., 2006; Sparrow et al., 1997). Dans sa région extracellulaire, la sous-unité β

commence par un tout petit segment N-terminal, suivi par le complément du domaine FnIII-2 et d’un

troisième domaine FnIII-3 qui mène à sa portion transmembranaire. Elle entre dans le cytoplasme par

un domaine juxtamembranaire d’environ 30 résidus comprenant trois résidus tyrosines Y965, Y972 et

Y984 dont les deux premiers sont impliqués dans l’endocytose et le recrutement de protéines

effectrices (Backer et al., 1992). La sous-unité β abrite également un domaine tyrosine kinase de 300

résidus comprenant le site d’activation du RI, et en fin, une région carboxylique terminale de 70

résidus comprenant des tyrosines phosphorylables (Lawrence et al., 2007; Hubbard., 2013; White et

al., 1988; Kohanski., 1993).

5

Figure 2 : Architecture modulaire du RI. A) À gauche les régions correspondantes aux 22 exons et à

droite les différents modules ou domaines du RI. Les flèches de couleur orange décrivent les sites

glycosylés alors que les flèches vertes représentent les sites d’interactions avec le ligand (l’insuline).

Ici les domaines fibronectines sont représentés par Fn0 (FnIII-1), Fn1 (FnIII-2), Fn2 (FnIII-3). (Figure

tirée de (Pierre De Meyts & Jonathan Whittaker., 2002)).

La structure tri-dimensionnelle de l’ectodomaine du RI, le présente comme un homodimère (avec deux

sous-unités α identiques) dans lequel, chacun des monomères présente un arrangement en V inversés

relatif à la membrane cellulaire de leurs domaines structuraux antiparallèles. Les domaines L1-CR-L2

constituent une branche alors que les domaines fibronectines complètent la deuxième branche du V de

chacun des monomères. Les deux chaînes α sont liées au sommet du V inversé, par des ponts salins

entre le domaine L2 de l’un et FnIII-1 de l’autre puis, un peu plus bas, entre les domaines L1 de l’un et

FnIII-2 de l’autre.

6

Figure 3 : Structure tridimensionnelle en V inversé de l’ectodomaine du RI. Les domaines

fibronectines de type III sont ici F1 (FnIII-1), F2 (FnIII-2), F3 (FnIII-2) alors que L1 et L2 décrivent

les domaines riches en leucine et ID le domaine insert. Les Astérisques sont utilisés pour distinguer les

domaines d’un monomère à ceux du second. Les flèches montrent les sites impliqués dans la liaison de

l’insuline. Une rotation de 90° puis de 45° donne un nouvel aperçu (à droite) de l’ectodomaine. (Figure

tirée de (Hubbard., 2013)).

Des analyses crystallographiques plus récentes ont permis d’identifier deux sites impliqués dans la

liaison de son ligand, l’insuline. Le site1 est plutôt formé par une couche centrale-β du domaine L1 de

l’un des monomères, les modules centraux du domaine CR de chaque monomère, complété par le

segment αCT du terminal carboxylique du monomère opposé. Le site 2 quant à lui, implique dans

chaque monomère, les domaines fibronectines FnIII-1et FnIII-2 à travers des boucles au niveau de

leurs régions carboxyle-terminal et amine-terminal respectifs. De même, deux surfaces ont été

identifiées au niveau de l’insuline comme interagissant avec le RI. Elles comprennent des résidus de la

forme dimérique de l’insuline qui se lieront au site1 de l’ectodomaine du RI alors que les résidus de sa

forme hexamérique ont été proposées comme liens avec le site2 du RI.

7

Figure 4 : Liaison de l’insuline à l’ectodomaine du RI. (Figure tirée de (Ward et al., 2007)).

La liaison de l’insuline à son récepteur de surface est caractérisée par des courbes curvilinéaires

Scatchard, une coopérativité négative et une courbe dose-réponse en forme de cloche (Ward et al.,

2013). Ces caractéristiques s’expliquent par la présence de sites de liaison de haute et basse affinité au

niveau du RI. Il s’agit des sites S1 et S2 pour un monomère de l’homodimère puis les sites S1’ et S2’

pour le second monomère. Une molécule d’insuline se lie en premier avec basse affinité par des

résidus de sa forme dimérique, au site S1 du premier monomère du récepteur et forme un lien croisé

avec le site S2’ du second monomère, créant de ce fait un complexe de haute affinité. La formation de

lien croisé de haute affinité du site1/site2’ réduit la capacité d’une autre molécule du ligand à former

un lien de haute affinité avec les sites alternatifs S1’/S2 (c’est la coopérativité négative) sans empêcher

la capacité à cette autre molécule de se lier singulièrement à chacun des composants de la paire

alternative Site1’/Site2 (C’est le principe de la courbe dose-réponse en forme de cloche).

8

Figure 5 : Modèle de coopérativité négative. (Figure tirée de (Ward et al., 2007)).

Des transitions structurelles s’opèrent au cours de la liaison de l’insuline au RI : L’une au niveau de

l’ectodomaine du RI et l’autre au niveau de l’insuline (Huang et al., 2004; Huang et al., 2007;

Lawrence et al., 2007; Vashisth., 2014; Smith et al., 2010; Mynarcik et al., 1996; Molina et al., 2000;

Whittaker et al., 2008; Whittaker etal., 2012; Menting et al., 2009; Menting et al., 2013; Menting et al.,

2014). La liaison de l’insuline avec le site1 du RI implique le segment αCT (du domaine insert du RI)

qui connaît un déplacement en direction du feuillet central β de L1. De même, l’insuline connait un

changement de conformation décrit comme modèle de détachement de l’insuline au cours duquel, la

région C-terminale de la chaîne B (résidus B21-B30) se déplace et se détache des résidus A1 et A2 de

la chaîne-A et expose la partie hydrophobique la plus importante comprenant des résidus A1–A3, A19,

A20, B11, B12, B15 and B19 (Ward et al., 2008; Derewenda et al.,1991; Schäffer., 1994; Ludvigsen et

al., 1998; Xu et al., 2004; Wan et al., 2005). Quant à la chaîne-B elle passe d’un état stable et peu actif

à un état moins stable mais plus actif (Nakagawa et al., 2005). Les deux résidus les plus importants de

la liaison de l’insuline au segment αCT sont His710 qui s’insère dans une poche formée par les résidus

ValA3, GlyB8, SerB9 et ValB12, puis la Phe714 qui occupe une crevasse hydrophobique composée des

résidus GlyA1, IleA2, TyrA19, LeuB11, ValB12 et LeuB15 (Mening et al., 2013). Des études de mutagénèse

dirigées et des constructions de récepteurs chimériques ont permis de distinguer des résidus impliqués

dans l’interaction de l’insuline et du site1 du RI. La surface de liaison classique de l’insuline comprend

les résidus GlyA1, GlnA5, TyrA19, Ile A2, Val A3, Glu A5, Thr A8 et AsnA21 de la chaîne-A, ainsi que les

résidus ValB12, TyrB16, PheB24, PheB25, et TyrB26 de la chaîne-B (Pullen et al., 1976; De Meyts et al.,

1978; Christensen et al., 1997; Chen et al., 2000; De Meyts., 2008; Harish Vashisth and Cameron F.

9

Abrams., 2009). La surface hexamérique de l’insuline est quant à elle constituée des résidus SerA12,

LeuA13, GluA17, HisB10, GluB13, et LeuB17. Au niveau du RI, les résidus 12-15,34, 36, 37, 39, 44, 64, 67,

89–91 du domaine L1 et les résidus du segment αCT 705–709, 710, 711, 712, 714, 716, and 717 ont

été identifiés comme des déterminants de liaison de basse affinité avec la surface classique de

l’insuline. Tandis que les résidus Lys484, Leu552, Asp591 de la boucle carboxylique du domaine

fibronectine de type-III FnIII-1, Ile602, Lys616, Asp620, and Pro621 du terminus-amine du domaine FnIII-

2 seraient impliqués dans l’interaction de haute affinité avec l’insuline (Harish Vashisth and Cameron

F. Abrams., 2009).

1.2.3. Activation du récepteur de l’insuline

Le domaine kinase du RI (RIK) possède une architecture classique des protéines kinases. Sa structure

tridimensionnelle présente un lobe N-terminal qui abrite le site de liaison de l’ATP, et composé d’un

feuillet β à 5 brins et d’une hélice α (αC). Le deuxième lobe C, est situé dans la région carboxylique et

comprend les résidus du site catalytique et de la boucle d’activation. Il diffère de celui des autres RTKs

par la présence d’une hélice (αJ), spécifique au RI, qui est impliquée dans la liaison du RI avec la

tyrosine phosphatase PTP1B (Li et al., 2005). Comme plusieurs autres récepteurs tyrosine kinases, la

boucle d’activation du RI présente des résidus tyrosines phosphorylables suivant le motif YXXYY où

la deuxième tyrosine est la première phosphorylée au cours de son activation (Wei., 1995). L’activité

tyrosine kinase du RI est régulée par l’état de phosphorylation des résidus tyrosines (Y1158, Y1162,

Y1163) de sa boucle d’activation de son lobe C lequel commence par un motif kinase conservé

(DFG1150) et se termine par une proline conservée (P1112) (Hubbard., 2013).

Les premières descriptions cristallographiques du domaine kinase faite par Hubbard (Hubbard., 1994)

décrivent la structure du RI à l’état basal. À l’état basal, le RI est inactif. Cette inactivation du RI a été

expliquée par deux scénarios : Dans l’un, l’ectodomaine du RI a une conformation inhibitrice qui

maintient une distance minimale de séparation entre les domaines kinases intracellulaires, empêchant

de ce fait une transphosphorylation des résidus tyrosines de la boucle d’activation des sous-unités β.

Dans le deuxième, c’est moins la distance que la conformation inhibitrice du domaine kinase qui serait

en cause. Dans ce second modèle, à l’état basal, en absence de Mg-ATP, la boucle d’activation a une

conformation autoinhibitrice décrite comme étant cis-inhibitrice/pseudosubstrate. Selon cette

configuration, le deuxième résidu tyrosine Y1162 de la boucle d’activation est lié dans le site actif

10

kinase par des ponts d’hydrogènes aux acides aminés D1132 et R1136. Bien que dans cette

configuration, la tyrosine Y1162 soit susceptible de recevoir un groupe phosphate, cette possibilité est

bloquée par une région N-terminale de la boucle d’activation qui occlue le site de liaison à l’ATP

empêchant de ce fait une phosphorylation en cis de la tyrosine Y1162. Cette conformation, identifiée

pour la première fois au domaine kinase du RI, a été observée dans plusieurs autres récepteurs tyrosine

kinases tels que TRKA, IGF1R et ROR2 (Munshi et al., 2002; Artim et al., 2012; Bertrand et al., 2012;

Till et al., 2002). Les récepteurs tyrosine kinases présentent une grande similitude structurelle au

niveau de leurs boucles d’activation. Le RI, IGF1R, TRKA-B et ROR2, par exemple présentent dans

leurs boucles d’activations des résidus tyrosines phosphorylables suivant le motif YXXDYY où le

deuxième résidu tyrosine est lié dans le site d’activation comme pseudo- substrat. En outre les

tyrosines kinases ALK (Anaplastic lymphoma kinase) et MET possèdent les trois tyrosines dans leur

boucles d’activations à des positions identiques. Elles ont un état basal différent avec l’absence d’acide

aspartique précédant la deuxième tyrosine et essentiel dans la stabilisation de la conformation pseudo-

substrate du RI (Hubbard., 2013 ; Till et al., 2001 ; Wang et al., 2006 ; Lee et al., 2010). Une seule

molécule d’insuline sous sa forme hexamérique dans la circulation sanguine est nécessaire dans des

conditions physiologiques à l’activation du RI. Sa liaison induit un rapprochement des deux sous-

unités β, une ouverture de la boucle régulatrice qui occluait la liaison à l’ATP. Cette boucle est

stabilisée dans une conformation optimisée pour la liaison des substrats (Mg-ATP, tyrosine) et la

catalyse. Des trois tyrosines, pY1163 est la plus importante pour la stabilisation de la boucle. Il

s’ensuit une trans-autophosphorylation sur Y1162, Y1158, Y1163, suivie par une propagation du

signal aux autres résidus tyrosines des domaines juxtamembranaires et de la région carboxylique

terminale (Figure 6).

11

Figure 6: Structure tridimensionnelle du domaine kinase du RI. (Figure tirée de (Hubbard, 2013)).

Un modèle, connu sous le nom de modèle « Yo-Yo » et décrit par le groupe Hubbard en 2003, pointe

un rôle majeur joué par la région proximale juxtamembranaire du RI dans son activation. Ce modèle

montre qu’à l’état basal, chaque domaine kinase du RI est partiellement enroulé sur lui-même à

proximité de la région juxtamembranaire et y est maintenu dans une conformation inversée par rapport

à la membrane cellulaire, confirmant une impossibilité de transphosphorylation. La tyrosine 984 (du

RI-B ou 972 du RI-A) de la région proximale juxtamembranaire interagit alors avec plusieurs résidus

conservés du lobe N-terminale du domaine kinase, stabilisant ainsi l’hélice αC dans une position non-

réactive. Des analyses par mutations ont démontré que cette inhibition régulée par la tyrosine 984 est

estimée 10 fois plus importante que celle observée avec la tyrosine 1162 de la boucle catalytique. La

liaison de l’insuline causerait ainsi un changement de conformation de l’ectodomaine et un retrait des

contraintes de liaison imposées aux domaines kinases par la région juxtamembranaire. Les domaines

kinases libérés comme des « yo-yo » pourraient ainsi être trans-autophosphorylés (Ward and

Lawrence, 2012; Ward and Lawrence., 2011). (Figure 7).

12

Figure 7 : Modèle « Yo-Yo » du domaine kinase du récepteur de l’insuline (Figure tirée de (Ward and

Lawrence, 2012; Ward and Lawrence., 2011)).

1.3. Trafic membranaire

1.3.1. Protéome des fractions G/E et théorie des marqueurs

1.3.1.1. Ultrastructure

La cellule eucaryote est hautement compartimentée. Elle contient de nombreux organites qui sont

distincts à la fois sur le plan fonctionnel et structural. L’élaboration de l’hypothèse de la sécrétion des

protéines est surtout une conséquence de l’interprétation des données morphologiques obtenues par

microscopie électronique (ME). Par exemple, il a été postulé que le réticulum endoplasmique (RE),

l’appareil de Golgi ainsi que les vésicules de sécrétions agissent de façon séquentielle dans la synthèse,

le transport et l’emballage (packaging) des protéines destinées à être relarguées dans le milieu

extracellulaire par exocytose (Palade., 1975). Les études morphologiques intensives ont été faites à

l’origine principalement sur le pancréas exocrine et le foie de rat à cause de la facilité de visualisation

de leurs contenus sécrétoires respectif ((Claude., 1970), (Ehrenreich et al., 1973); (Palade., 1975);

13

(Novikoff et al., 1978, Novikoff and Yam., 1978a, Novikoff and Yam., 1978b)). L’utilisation de

protéine A marquée à l’or colloïdal sur des sections tissulaires a permis ultérieurement de raffiner la

voie de sécrétion du pancréas exocrine (Geuze et al., 1979); (Bendayan et al., 1984). En particulier,

cette technique a permis d’infirmer l’existence d’un sentier cytosolique pour la sécrétion de zymogène

qui avait été proposé à partir de données pharmacologiques (Palade., 1975).

Dans le parenchyme de foie, parmi les composés majeurs de la voie de sécrétion visualisés par ME, on

trouve les particules de lipoprotéine. Bien que considérées à l’origine comme un marqueur

morphologique de l’appareil de Golgi hépatique (Ehrenreich et al., 1973), un débat existait sur la

frontière délimitant les compartiments Golgiens pour l’hépatocyte puisque ils ont aussi la capacité de

concentrer les particules de lipoprotéines par endocytose. À cet égard, une découverte importante a été

l’identification subséquente de l’insuline ou de la prolactine avec leurs récepteurs de surface cognitifs

dans des éléments considérés comme appartenant à l’appareil de Golgi à cause de i) Leur localisation

intracellulaire (vésicules juxta Golgi), ii) Leur contenu en lipoprotéine et iii) L’absence du marqueur

lysosomial: phosphatase acide (Bergeron et al., 1973). De même, des corps multivésiculaires avec un

contenu en protéines asialilées internalisées ont été décrits par la suite. Ces compartiments ont reçu des

appellations diverses (ex: receptosomes, ligandosomes etc...) ils sont appelés collectivement

maintenant endosomes.

Puisque le contenu en particules de lipoprotéines est une caractéristique des endosomes, une

localisation duale a été proposée : i) Dans les composants sécrétoires Golgiens et ii) Dans les

composants endosomals dont quelques uns sont positionnés très près de l’appareil de Golgi. A cet

égard, il faut noter que ApoE a été aussi localisée par la même technique dans les dilatations sacculaire

de l’appareil de Golgi contrairement à l’albumine qui est la principale protéine hépatique sécrétée et

est distribuée de façon uniforme dans l’appareil de Golgi, ce qui documente l’existence d’une

régionalisation intra Golgienne. Par contre ApoE n’a pas été observée dans les vésicules

intersacculaires qui en principe transportent les protéines de sécrétion entre citernes Golgienne

adjacentes. Cette observation soulève encore des questions sur la nature du véhicule responsable du

transport intra Golgi de Apo E versus albumine (Dahan et al., 1994).

1.3.1.2. Théorie des marqueurs

L’approche de fractionnement cellulaire couplée à l’analyse biochimique a permis de compléter et

d’étendre les données morphologiques. La théorie de centrifugation des particules exposée à l’origine

14

par Svedberg et Pedersen (1940) a été appliquée de façon systématique et avec succès à l’analyse des

organites subcellulaires. En général, il a été observé que le devenir des organelles subcellulaires peut

être décrit par une courbe unique de fréquence de distribution des coefficients de sédimentation et non

par une seule valeur de S.

Au lieu de regarder chaque fraction séparément en essayant de caractériser en détail son contenu

enzymatique, le groupe de de Duve a étudié chaque enzyme séparément et a déterminé sa distribution

entre toutes les fractions (De Duve., 1975). Une représentation en forme d’histogramme a été ainsi

instituée. L’étape logique suivante de ce raisonnement a consisté à assimiler les profils enzymatiques à

une organelle et ainsi interpréter les différences observées dans la distribution de plusieurs enzymes

comme reflétant l’association de cette enzyme avec un compartiment subcellulaire unique. Cette

théorie dite théorie des marqueurs tient à l’intérieur de deux postulats énoncés par Christian de Duve :

1- Le postulat d’homogénéité biochimique (les particules qui sont membres d’une population donnée

ont essentiellement la même composition biochimique). 2- Le postulat de localisation unique (chaque

enzyme est restreint a un seul site intracellulaire). Cette approche a été progressivement validée avec

l’étude d’un nombre croissant d’enzymes, l’émergence de nouvelles techniques (efficacité des rotors,

réactifs etc...) et un nombre limité de profils de distribution possible, ainsi que l’avènement de la

microscopie électronique moderne. Ainsi, par exemple en 1955 deDuve a proposé l’existence d’un

nouveau groupe de particules intracellulaires avec propriétés lytiques appelées lysosomes. Cette

découverte a été confirmé par ME. Ainsi il a été montré que les fractions riches en lysosomes

contenaient des corps denses péricanaliculaires et que les fractions peroxysomes correspondaient à des

particules appelées à l’époque microcorpuscules (microbodies) (De Duve et al., 1955).

1.3.2. Voies d’endocytose des récepteurs tyrosine kinases (RTKs)

Après leur synthèse au niveau du réticulum endoplasmique, les RTKs sont transportés dans l’appareil

de Golgi et délivrés au niveau de la membrane plasmique. Leur disponibilité d’association avec leur

ligand est la conséquence d’un turnover régulé par leur trafic entre la membrane plasmique et

l’appareil endosomal où ils peuvent être dégradés dans les lysosomes ou recyclés. De manière

générale, l’internalisation des RTKs fait suite à une diffusion dans le plan de la membrane plasmique

vers des sites d’endocytose où ils s’internalisent comme cargos dans des vésicules membranaires (Goh

et al., 2013). Ce déplacement latéral est induit par une liaison du ligand pour la plupart des RTKs par

opposition à une internalisation constitutive plus lente observée avec les récepteurs de transferrine et

15

de LDL qui favorise un recyclage bien plus rapide ((McClain., 1992; Burke and Wiley., 1999; Jopling

et al., 2011). L’internalisation de divers cargos transmembranaires dont les RTKs de la membrane

plasmique, peut se faire suivant diverses voies d’endocytoses. Celles-ci peuvent différer par les

composants du manteau associés aux vésicules en formation (exemple : La clathrine, la cavéoline, la

flotilline etc…), la morphologie des bourgeons formés, leur dépendance au cholestérol, le mécanisme

de fission des vésicules générées (dynamine dépendante ou non), leur sensibilité à l’actine, leur

association aux radeaux lipidiques, et aussi par le rôle régulateur des petites GTPases comme la Cdc42,

RhoA et Arf6 (Gary et al., 2009).

1.3.2.1. Endocytose par voie de clathrine

Les voies d’endocytose par clathrine sont les voies majeures d’internalisation des RTKs chez les

cellules de mammifères (Goh et al., 2013). Elles ont été impliquées dans le transport entre organelles

du réseau transgolgien, des endosomes ou des lysosomes (Ohno et al., 2006; Nakatsu and Ohno, 2003;

Robinson., 2004). Une fois dans les puits d’endocytose de la membrane plasmique, l’internalisation

des RTKs y est initiée par l’invagination sous forme de vésicules (de quelques nanomètres de

diamètre), de ce segment de membrane plasmique. Ce processus implique l’action concertée des

protéines de manteau notamment la clathrine (on parle alors d’endocytose clathrine dépendante) avec

leurs complexes d’adaptateurs et d’autres protéines régulatrices. Dans un premier temps, les trikels de

clathrine s’assemblent à la surface cytoplasmique de la membrane cellulaire. Leur liaison à la

membrane, la sélection des cargos à internaliser et le recrutement d’autres protéines régulatrices

impliquées dans la formation des vésicules sont contrôlés par leurs complexes d’adapteurs. Ces

complexes d’adapteurs situés dans la couche interne du manteau assemblé, ont des motifs de liaisons

aux phospholipides de la membrane cellulaire, notamment aux plateformes d’inositol PIP2 de la

membrane plasmique, et ont la capacité de se lier aux protéines transmembranaires par divers

domaines structuraux (Le Roy and Wrana., 2005; Kirchhausen et al., 2000; Bonifacino et al., 2003; ).

Les complexes (AP) sont les principaux adapteurs qui contribuent à la formation de vésicules de

clathrine (Ohno et al., 2006; Nakatsu and Ohno., 2003; Owen et al., 2004; Robinson, 2004). La

clathrine, préalablement formée de pentagones et d’hexagones (Kirchhausen et al., 2000; Wilbur et al.,

2005), sert de protéine d’échafaudage pour d’autres protéines régulatrices qui favorisent le

bourgeonnement membranaire et la formation vésiculaire. La scission des vésicules à clathrine

contenant les cargos à internaliser est sous le contrôle d’une petite GTPase appelée dynamine. La

16

fusion des vésicules à clathrine avec l’appareil endosomal est précédée par l’extraction du manteau de

clathrine régulée par une phosphatase 5-phosphoinositide appelée synaptojamine et d’un complexe de

chaperone comprenant entre autre l’auxiline et l’HSC70 (Sorkin., 2004).

La sélection des récepteurs à internaliser par les adapteurs de clathrine repose sur la reconnaissance de

signaux d’endocytose présents dans leur région cytoplasmique. Il peut s’agir de motifs linéaires dont

des séquences comprennent des acides aminés invariants et variants régulés, soit par leurs résidus

tyrosines comme c’est le cas pour les motifs NPXY, et YXXØ, ou alors par des résidus dileucines

comme identifiés dans le motif [DE] XXXL [LI] (Bonifacino and Traub, 2003). Si les motifs NPXY

interagissent avec les domaines de liaison au phosphotyrosine de plusieurs protéines monomériques

adaptatrices qui à leur tour se lient à AP-2 et au domaine amino-terminal de Clathrine (Traub., 2009),

le motif dileucine se lie directement au complexe AP-2 par les sous-unités α et σ2 (Höning et al.,

2005; Traub et al., 2007; Coleman et al., 2005; Janvier et al., 2003) alors que le motif YXXØ engage

les sous-unités µ de ces protéines adaptatrices (Jackson et al., 2003; Bonifacino and Traub., 2003;

Owen et al., 2004; Ohno et al., 1995; Owen and Evans., 1998). Dans cette notation, chaque acide

aminé est indiqué par une lettre alors que X indique n’importe quel acide aminé et Ø représente une

chaine secondaire lourde hydrophobique d’un acide aminé et les parenthèses suggèrent que chacun des

acides aminés s’y trouvant peut occuper cette position. La liaison de l’insuline à son récepteur de

surface retenu à l’état basal dans des microvilli de la membrane plasmique comme c’est le cas pour

bon nombre de RTKs (Mineo et al., 1999 ; Foti et al., 2004 ; Hommelgaard et al., 2004), est une

condition sine qua non à son internalisation. En induisant une activation du domaine kinase par

transphosphorylation des trois résidus tyrosines de sa boucle catalytique, elle libère le RI des

inhibitions du cytosquelette d’actine et favorise un déplacement latéral du complexe formé vers des

puits de clathrine. Des séquences NPEY et GPLY ont été identifiées dans la région juxtamembranaire

du RI et sont similaires au motif NPXY qui régule l’internalisation du RI et du récepteur de l’IGF1

(Chen et al., 1990; Backer et al., 1992; Prager et al., 1994;Wu et al., 2003). En outre le motif dileucine

serait également utilisé par le RI pour son internalisation par voie de clathrine (Haft et al., 1994;

Morrison et al., 1996; Hamer et al., 1997). Cependant, aucune interaction moléculaire entre le RI et les

adapteurs de clathrine n’a encore été démontrée contrairement au récepteur de l’EGF (Goh and

Sorkin., 2013; Sorkin et al., 1996; Sorkin and Carpenter., 1993).

17

Certains adapteurs de clathrine peuvent également interagir avec des modifications post-

traductionnelles comme l’ubiquitination, l’acétylation ou la méthylation des lysines des RTKs (Traub

et al., 2007 ; Mellmann and Yarden., 2013 ; Goh., 2010). Des travaux récents montrent de plus en plus

que l’ubiquitination, longtemps associée à la dégradation protéasomale des RTKs, peut également

servir de signal de tri au cours du trafic des RTKs (Acconcia et al., 2009). On distingue ici la

polyubiquitination menant à la dégradation par protéasome de la monoubiquitination qui régule les

évènements de trafic de la membrane plasmique au système endosomal et est associé au tri des cargos

vers les lysosomes (Alwan and Van Leeuwen., 2007). La polyubiquitination nécessite l’attachement

d’une chaîne d’au moins quatre fractions d’ubiquitine liées les unes aux autres par la lysine-48, alors

que la monoubiquitination fait appel à l’attachement de monomères d’ubiquitines ou dans certains cas,

implique des chaînes courtes d’ubiquitines liées à la lysine-63. Dans ce second cas de

monoubiquitination le mécanisme associé implique un recrutement de protéine de liaison à

l’ubiquitine, aux cargos ubiquitinés (Urbé., 2005; Marmor and Yarden., 2004). Les récepteurs

PDGFR-β et EGFR ont été les premiers à être identifiés (Mori et al., 1992; Galcheva-Gargova et al.,

1995) comme ubiquitinés avant une généralisation aux autres RTKs dont le RI. Les résidus tyrosines

phosphorylés de la région cytoplasmique des RTKs, après activation de leur domaine kinase par liason

de ligand, servent de sites de liaison pour des protéines médiatrices d’ubiquitination à travers des

liaisons covalentes entre la protéine ubiquitin et des résidus lysines. Le modèle courant présume que

les RTKs ubiquitinés sont recrutés dans des puits de clathrine par des protéines régulatrices comme

l’Epsin, Epsin15, Epsin15R, possédant des domaines de liaison à l’ubiquitine et capable de se lier à la

clathrine ou à son complexe adapteur AP-2. Aucune évidence directe n’a encore permis de mettre en

évidence une machinerie distincte supportant ce modèle (Goh and Sorkin., 2013). Cependant, une

évidence indirecte basée sur des analyses de mutations ou par baisse du niveau de régulation de

composants du système d’ubiquitination ont permis de supporter le rôle de l’ubiquitination dans

l’endocytose des RTKs. L’ubiquitination y est décrit comme l’action séquentielle d’enzymes

d’activation d’ubiquitine (E1), de conjugaison d’ubiquitine (E2) et de ligase d’ubiquitine (E3)

(Pickart., 2004). Ces analyses ressortent le rôle majeur des protéines de la famille des ligases

d’ubiquitine E3 possédant un domaine RING finger telles que Cbl et Nrdp1 dans l’ubiquitination du

récepteur de l’EGF. Ces ligases déterminent la spécificité des substrats d’ubiquitination. Tous les

isoformes de Cbl sont connus pour se lier directement aux résidus tyrosine phosphorylés des RTKs et

Cbl peut également s’y lier indirectement par Grb2 une protéine adaptatrice du domaine SH2. Si peu

18

de mécanismes moléculaires décrivent le lien entre ubiquitination du RI et internalisation par voie de

clathrine, il a été montré que les protéines de la famille NEDD4 sont indirectement nécessaires à

l’ubiquitination du RI en se liant ou en régulant Grb10, une protéine adaptatrice dont le domaine SH2

est capable de se lier simultanément aux domaines C2 de NEDD4-1 et au récepteur homologue du RI,

le récepteur IGF-1R (Goh and Sorkin., 2013).

1.3.2.2. Endocytose par voie de cavéoline

La distribution des puits à clathrine au niveau de la membrane plasmique varie suivant les types

cellulaires. S’ils sont fortement représentés dans des hépatocytes, ils constituent moins de 2% de la

surface membranaire occupée par les cavéoles chez les adipocytes. Dans ce modèle cellulaire, il a été

démontré que le RI se localisait majoritairement dans des cavéoles à la membrane plasmique et aussi

dans des fractions endosomales (Gustavsson et al., 1999; Fagerholm et al., 2009). Identifiées pour la

première fois dans les années 1950 sur la base de leur morphologie caractéristique grâce à la

microscopie électronique (Palade., 1953; Yamada., 1955), les cavéoles sont des invaginations

circulaires de membrane plasmique avec un diamètre de 50nm à 100 nm, enrichies en

glycosphingolipides et en cholesterol et caractérisées par des protéines membranaires intégrales

appelées cavéoline (Pelkmans and Helenius., 2002; Thomsen et al., 2002). Leur composition, leur

apparence et leur fonction dépendent du type de cellules. Elles sont particulièrement abondantes dans

les cellules endothéliales, les adipocytes et les cellules de muscle (Pilch et al., 2011; Komarova et al.,

2010; Hansen et al., 2010; Ludwig et al., 2013).

La biogénèse des cavéoles est un processus impliquant un ensemble de complexes de protéines parmi

lesquelles, les cavéolines, les cavines (Hansen et al., 2010; McMahon., 2009; Vinten et al., 2005), la

Pascine-2 (Hansen et al., 2011; Senju et al.,2011) et les ATPases EHD2 (Hansen et al., 2011; Stoeber

et al., 2012). Les cavéolines sont des protéines palmitoylées au niveau de leur segment C-terminal,

elles sont tyrosines phosphorylables et se lient au cholestérol (Dietzen et al., 1995; Glenney et al.,

1989; Murata et al., 1995). Leur oligomérisation dépendante du cholestérol est une étape critique pour

la formation des cavéoles (Ludwig et al., 2013; Pelmans and Helenius ., 2002). Elles se retrouvent en

abondance au niveau de la membrane plasmique, du réseau trans-golgien et des cavéosomes. Elles ont

été également identifiées dans des endosomes ou le réticulum endoplasmique après extraction ou

oxidation de cholestérol de la membrane plasmique (Carrozzi et al., 2000; Pelkmans et al., 2001;

19

Dupree et al., 1993; Kurzchalia et al., 1992; Smart et al., 1994). La cavéoline-1 est une protéine

membranaire intégrale majeure impliquée dans la formation des cavéoles dans des cellules non-

musculaires (Rothberg et al., 1992; Drab et al., 2001). La cavéoline-2 a une distribution cellulaire

similaire à celle de la cavéoline-1 mais n’est pas essentielle à la formation des cavéoles. La cavéoline-3

est essentiellement exprimée dans les cellules de muscles striées et est déterminante dans la formation

des cavéoles dans ces cellules (Razani et al., 2002; Parolini et al., 1999). Les cavines constituent une

famille de quatre membres de protéines de manteau. La Cavine 1 a une expression cellulaire similaire à

celle des cavéolines, alors que les cavines 2, 3 et 4 ont des expressions tissulaires et cellulaires

spécifiques; la Cavine 4 étant essentiellement identifiable dans des cellules de muscles striées. Des

quatres cavines connues, seule la Cavine-3 n’a encore été associée à la morphogénèse ou à la

biogénèse des cavéoles. Elle a cependant été associée comme la Cavine2 à la régulation du transport

cavéole-dépendant (Ludwig et al., 2013).

Biochimiquement, les cavéoles sont considérées comme des sous-domaines des radeaux lipidiques

(Anderson et al., 1998 ; Kurzchalial and Parton, 1999). Leur sensibilité à une délétion non-aigue du

cholesterol par des agents comme la filipine, la nystatine, la méthyle-β-cyclodextrine les distingue des

voies d’endocytose constitutive pinocytique et des voies d’endocytose clathrine-dépendante (Nabi and

Le., 2003). Ce sont des structures immobiles où une endocytose constitutive est quasi inexistante

(Thomsen et al., 2002). L’internalisation des cavéoles est facilitée par la rupture du cytosquelette

d’actine. Elle est inhibée par des inhibiteurs de kinases comme la genistéine et la staurosporine, et est

amplifiée par des inhibiteurs de phosphatases telles que la vanadate et l’acide okadéique (Parton et al.,

1994; Pelkmans et al., 2001; Mundy et al., 2002; Nichols., 2002; Pelkmans et al., 2002; Thomsen et

al., 2002). En outre, le bourgeonnement des cavéoles de la membrane plasmique comme celui des

vésicules à clathrine, est régulé par l’activité GTPase de la dynamine.

1.3.2.3. Endocytose par voie de flotilline

L’endocytose flotilline-dépendante est une autre voie d’internalisation d’intérêt pour le RI. Les

flotillines sont des protéines membranaires intégrales exprimées dans tous les tissus de mammifères et

identifiées dans des fractions membranaires résistantes au détergent et qui flottent dans des gradients

denses de sucrose (Bickel., 1997 ; Otto., 2011). Elles ont été identifiées à la membrane plasmique,

dans des endosomes tardifs ou lysosomes, dans des phagosomes matures, et elles colocalisent avec des

20

cargos internalisés dans des endosomes primaires (Otto., 2011 ; Babuke., 2009 ; Bared., 2004 ;

Glebov., 2006 ; Staubach., 2009). Elles sont de topologie similaire mais de séquences différentes des

cavéolines (Bauer and Pelkmans., 2006) et forment des microdomaines membranaires distinctes des

cavéoles (Otto., 2011 ; Frick., 2007; Stuermer., 2001). La famille des flotillines composée de flotilline-

1 et flotilline-2 qui partagent ~ 50% d’identité en séquence d’acides aminés, fait partir d’une famille

plus large de protéines ayant en commun un domaine d’interaction Prohibitine (encore appelé Somatin,

Prohibitine, Flotilline et Hflk/C domaine) (Browman et al., 2007; Liu et al., 2005). Le domaine PHB

est situé dans la région N –terminale et est un pré-requis dans l’association membranaire des flotillines

ainsi que leur insertion dans des microdomaines insoluble dans détergent (Solis., 2007). La stabilité

des flotillines est interdépendante et la réduction du niveau de l’un cause une baisse quasi-

systématique du niveau de l’autre (Otto., 2011 ; Ludwig., 2010 ; Langhost., 2008). Contrairement aux

cavéoles, les microdomaines enrichis aux flotillines sont latéralement mobiles dans le plan de la

membrane et bourgeonnent à l’intérieur de la cellule. La distribution de ces microdomaines et leur role

dans l’endocytose semblent régulés par leur tyrosine phosphorylation notamment à travers les kinases

Src comme Fyn (Otto., 2011). La scission des vésicules peut être ou non dépendante de la dynamine.

Bien qu’une endocytose par voie de flotilline ait été suggérée pour plusieurs protéines membranaires

(Ait-Slimane., 2009) et qu’il ait été démontré que les flotillines colocalisent avec des cargos dans des

endosomes, les mécanismes moléculaires comme les motifs de signaux d’endocytose qui lui sont

associés restent quasi-inexistants. Il reste important de mentionner que les flotillines 1 et 2 ont été

associées aux voies de signalisation insulino-dépendante dans des radeaux lipdiques. En 2000,

Baumann et collègues, ont démontré que la stimulation à l’insuline mène à une dissociation des

protéines CBL et de sa protéine associée CAP (ou SORBS1) du RI et à une translocation du RI vers

des radeaux lipidiques, laquelle est régulée par interaction du domaine d’homologie à la SORBIN et de

la flotilline-1. Il en résulte une activation de RhoQ et une translocation du transporteur de glucose

Glut4 vers la membrane plasmique et absorption de glucose (Baumann et al., 2000 ; Kimura et al.,

2001). Un autre argument plaidant pour un rôle majeur des flotillines comme voie d’endocytose est

leur interaction démontrée avec le cytosquelette d’actine, un régulateur important dans des voies

d’endocytose clathrin et cavéoline-dépendantes (Langhorst et al., 2007).

21

1.3.3. Appareil endosomal

L’appareil endosomal est un milieu compartimenté très dynamique où des organelles

fonctionnellement et biochimiquement caractérisées sont intimement interconnectées à travers un

processus qui repose sur l’insertion ou l’extraction sélective de composants membranaires (Mellman,

and Yarden., 2013 ; Huotari et Helenius., 2011). Les compartiments diffèrent par leur morphologie,

leur cinétique d’internalisation des cargos, et leur niveau d’acidité fortement régulé par la pompe à

protons ou ATPases vacuolaires. Après fission de la membrane plasmique, les vésicules contenant les

cargos à internaliser fusionnent avec une population endosomale vésiculo-tubulaire située à la

périphérie: Ce sont les endosomes précoces. Outre les cargos internalisés dans des vésicules issus de la

membrane plasmique, les endosomes précoces reçoivent également du matériel issu du réseau

transgolgien. Ils constituent la première station de l’appareil endosomal. Ce sont des structures

pléomorphiques très dynamiques avec une forte propension aux fusions homotypiques et

hétérotypiques (Gruenberg et al., 1989). Des études ultrastructurelles, montrent qu’elles sont

composées d’extensions tubulaires d’environ 60 nm et de composantes vacuolaires d’environ 400 nm

de diamètre (Gruenberg et al., 2001). Leur niveau d’acidité relativement doux (pH=6.2) favorise la

dissociation des ligands de leurs récepteurs, lesquels une fois déphosphorylés se concentrent dans les

portions tubulaires (pH=6.5) qui se détacheront en vésicules de recyclage pour être destinés

directement ou indirectement à la membrane plasmique ou au réseau trans-golgien par des voies

rétrogrades (Mayor et al., 1993 ; Mellman., 1996). Les ligands libérés de leurs récepteurs et les

récepteurs encore actifs s’accumuleront quant à eux dans les sous-domaines vacuolaires des

endosomes précoces, dus à leur volume interne élevé. Une invagination membranaire des vacuoles

formées dans les endosomes précoces constituera des vésicules intralumenales, qui se détachent ou

maturent en corps multivésiculaires plus acides (pH=5.5). Les corps multivésiculaires traverseront le

cytoplasme périnucléaire à travers des extensions de microtubule pour fusionner avec des endosomes

tardifs qui sont la deuxième station de tri majeure de l’appareil endosomal. Ils se situent à un carrefour

avec les voies d’autophagie, qui, en plus de l’endocytose et du trafic trans-golgien, servent de voies

d’entrée conservées pour la dégradation de composants cytosoliques et d’organelles dans les voies

d’endocytose. En effet, l’autophagie commence par l’assemblage de structures doublement

membranaires appelés phagosomes qui absorbent du matériel à dégrader et fusionnent avec les

endosomes tardifs pour acquérir leur capacité dégradative. Les cargos accumulés dans les endosomes

tardifs peuvent être relargués dans la région extracellulaire sous forme d’exosomes, comme c’est le cas

22

pour certains modèles de cellules immunitaires, après fusion des endosomes avec la membrane

plasmique (Théry et al., 2002; Pan et al., 1985; Harding et al., 1983; Johnstone et al., 1987;Takahashi

et al., 2012; Hyttinen et al., 2013), ou encore ils peuvent être stockés dans des lysosomes où une forte

concentration d’hydrolases lysosomales et une acidité plus importante (pH=5) favoriseront leur

dégradation (Huotari and Helenius.,2011; Mellman and Yarden., 2013).

Figure 8: Un modèle de système endolysosomal. EE: Endosome précoce; LE: Endosomes tardifs; MT:

Microtubule; TGN: Réseau trans-golgien (Figure tirée de Hunatri and Helenius., 2011)

1.3.4. Mécanismes de trafic endosomal : Rôle des petites GTPases Rabs

Si les voies majeures suivies par les cargos internalisés dans l’appareil endosomal sont bien connues,

les mécanismes associés au transport endosomal des cargos ont souvent été sujets à débat. Un premier

modèle présente l’appareil endosomal comme un ensemble d’organelles constituant des stations

distinctes pré-existantes et identifiables par des marqueurs à travers lesquels les vésicules contenant les

cargos internalisés et provenant d’endosomes précoces se déplacent d’une station à une autre (Griffiths

23

and Gruenberg 1991 ; Palade 1975 ; Maxfield and Gruenberg 1995 ; Schekman et Orci 1996 ; Geuze

1988). Un deuxième modèle introduit la notion de maturation des organelles et suggère que les

endosomes précoces se transforment graduellement en endosomes tardifs et lysosomes par remodelage

de leur composition protéique et lipidique. Les changements biochimiques y seraient la conséquence

d’un processus de recyclage qui mène à une perte des marqueurs précoces et à l’acquisition de

marqueurs tardifs nouvellement synthétisés dans l’appareil de Golgi (Duclos., 2002 ; Murphy., 1991).

Une troisième approche, plus mécanistique et résultant d’analyses par imagerie cellulaire, tend à

expliquer le trafic des cargos dans l’appareil endosomal par une conversion des petites GTPases de la

famille des Rabs. Les Rabs y apparaissent comme des organisateurs membranaires régulant, entre

autres, la progression des cargos des endosomes précoces aux endosomes tardifs et lysosomes (Rink.,

2005). Les Rabs constituent la plus large branche de la superfamille des GTPases Ras avec plus de 60

membres. Ce sont des protéines G monomériques exprimées, pour la plupart, de manière ubiquitaire

chez les mammifères (Stenmark et al., 2009). La liaison des Rabs à la surface cytosolique des

membranes est orchestrée par des modifications posttraductionelles de leur domaine flexible C-

terminal comprenant en général deux zones hydrophobiques prénylés (géranylgéranyle). Ces

modifications sont la résultante d’actions concertées entre une transférase de groupes géranylgéranyle

(RabGGT) et une protéine escorte de Rabs (REP) utilisant la pyrophosphate géranylgéranyle comme

cosubstrat pour faciliter l’ancrage la partie hydrophobique des Rabs dans la bi-couche lipidique des

membranes (Oesterlin et al., 2012 ; Shahinian and Sylvius., 1995 ; Overmeyer et al., 2001). Pour leur

fonctionnement, les Rabs passent d’un état actif par liaison à la GTP à un état inactif après hydrolyse

de GTP en GDP et oscillent entre différents sites cellulaires (Stein et al., 2003 ; Stenmark and

Olkkonen., 2001 ; Zerial and McBride., 2001). Ce cycle est régulé par des facteurs d’échanges de

nucléotides de guanine (GEF) favorisant la liaison au GTP et par des protéines activatrices de GTPases

(GAPs) qui accélèrent l’hydrolyse de GTP en GDP (Barr and Lambright., 2010; Pfeffer et al., 2001;

Segev et al., 2001). Leur activité dans le trafic vésiculaire est aussi dépendante d’un cycle d’insertion

et d’extraction membranaire. Au cours de ce cycle, des Rabs sont isoprénylés et un inhibiteur de

dissociation de GDP (GDI) se lie aux Rabs isoprénylés en complexe avec GDP (Rab-GDP-GDI),

masquant ainsi l’ancrage isoprénylique et maintenant de ce fait les Rabs inactifs dans le cytosol (Garret

et al., 1994; Rak et al., 2003; Araki et al., 1990). L’attachement membranaire des protéines Rabs

requiert par conséquent un facteur de déplacement de GDI (GDF) (Pfeffer et al., 2004). Une fois

libérée de GDI, les Rabs sont disponibles à une liaison au GTP stimulée par un GEF. Les Rabs actifs

24

liés aux membranes remplissent leur fonction dans le trafic vésiculaire grâce à leurs multiples surfaces

d’interactions à travers lesquelles elles s’associent à d’autres molécules régulatrices et à des protéines

effectrices en aval (Chen et al., 2003; Pereira-Leal and Seabra., 2000; Pfeffer., 2005). Après

inactivation par des GAPs, les Rabs sont extraits de la membrane par des GDI dans le cytosol

(Grosshans., 2006).

Figure 9 : Modèle de conversion des Rabs (Figure tirée de (Stenmark., 2009)).

Ainsi des marqueurs tels que Rab5 pour les endosomes précoces, Rab4 ou Rab11 pour les vésicules de

recyclage et Rab7 ou Rab9 pour les endosomes tardifs ont été identifiés (Zerial and Mcbride., 2001).

Si Rab4 et Rab11 régulent le recyclage à partir d’endosomes précoces, Rab9 joue un rôle similaire

dans les endosomes tardifs s’assurant qu’une partie des récepteurs destinés aux hydrolases lysosomales

puissent être recyclée pour réutilisation dans le réseau trans-golgien (Koster et al., 2005).

25

Figure 10: Domaines enrichis de Rabs dans des fractions endosomales (Figure tirée de (Stenmark.,

2009)).

Le modèle de conversion des Rabs associé à la progression des cargos dans l’appareil endosomal, tel

que décrit par (Rink et al., 2005), suggère que les domaines Rabs ne sont pas maintenus indéfiniment à

un compartiment donné mais peuvent être désassemblés, notamment sous le contrôle d’un cycle

nucléotidique des Rabs GTPases susceptible de réguler leur liaison à la membrane (Rink et al., 2005).

Leur association ou dissociation de la membrane est sensible à l’état d’activation des domaines

tyrosine kinases des RTKs tels que le récepteur de l’EGF et le RI (Di Fiore and De Camilli., 2005;

Rink et al., 2005). Un ratio plus important de Rab5 actif versus Rab5 inactif retarde sa dissociation des

endosomes précoces et donc le transfert des cargos vers d’autres compartiments (Rink et al., 2005).

Suivant ce modèle de conversion, la composition protéique des endosomes précoces et tardifs

resulterait d’un échange de Rab5 pour Rab7 à l’interface des deux compartiments. Cet échange est

régulé par le complexe VPS/HOPS de classe C ayant une activité GEF vis-à-vis de Rab7 et

interagissant avec Rab5 (Rink et al., 2005).

26

L’arrimage des cargos à la membrane acceptatrice et la fusion des vésicules aux couches lipidiques du

nouveau compartiment constituent des étapes cruciales dans la maintenance de l’intégrité des

organelles et le flux des cargos. Les petites GTPases Rabs y jouent également un rôle régulateur

majeur en interagissant avec les protéines du complexe SNAREs (Rothman and Sollner., 1997; Zerial

and Mcbride., 2001). Les Rabs y exercent leur fonction en régulant une pléthore de protéines

effectrices capables d’oligomériser dans des domaines membranaires enrichis en PI3P (Christoforidis

et al., 1999; Zerial and Mcbride., 2001), et susceptibles d’interagir avec des effecteurs du complexe

SNAREs constituant ainsi un moyen de régulation des SNAREs par les Rabs. Parmi ces effecteurs de

Rab5 impliqués dans l’homofusion endosomale, par exemple, on peut citer celles du complexe Rabex-

5/Rabaptin-5, les protéines du complexe SNARES telles que les syntaxine13 et syntaxine6, Vti1a et

Vamp-4, la PI3-kinase VPS34, les effecteurs d’arrimage tels qu’EEA1 et Rabenosyn-5 (Jovic et al.,

2010). Il a été démontré que la VPS34 est l’un des premiers effecteurs à être recrutés au niveau des

endosomes précoces (Christoforidis et al., 1999). Il permet de générer les phosphoinositol-3-

phosphates, composant membranaire très abondant dans les endosomes précoces. Sa présence

concommittante avec la Rab5-GTP sert de signal au recrutement d’autres effecteurs comme EEA1

(Lawe et al., 2000; Pfeffer., 2001; Lawe et al., 2002), Rabenosyn-5 (Nielsen et al., 2000) susceptibles

de se lier simultanément à Rab5-GTP et PI3P (Jovic et al., 2010). Par son domaine FYVE, EEA1 se lie

aux PI3P membranaires. Il interagit directement avec les syntaxines-6 et -13, deux protéines du

complexe t-SNAREs pour réguler la fusion homotypique des endosomes précoces. La Rabenosyne-5

par contre est un effecteur à la fois de Rab5 et Rab4 avec lesquels il se lie lorsqu’ils sont actifs. Rab4

étant un marqueur de recyclage rapide des cargos vers la membrane plasmique à partir d’endosomes

précoces, cette dualité d’interactions permet à Rabenosyne-5 de réguler les évènements de tri entre

endosomes précoces et recyclage des cargos vers la membrane plasmique (De Renzis et al., 2002).

Deux autres larges ensembles de protéines associées à l’arrimage membranaire ont également été

identifiées. Il s’agit des complexes HOPs et CORVET qui partagent quatre sous-unités (VPS11,

VPS18 et VPS33 A/B) et dont les sous-unités distinctes (HOPS : VPS39, VPS41 et TRAP1 versus

CORVET : VPS8) confèrent leur spécificité fonctionnelle. Une interconversion entre les deux

complexes a été observée chez la levure notamment au cours de la conversion Rab5 – Rab7 et donc

pour le trafic vers les endosomes tardifs et la dégradation. Chez la levure, le recrutement des protéines

de CORVET est régulé par la protéine homologue à Rab5, VPS21, où ils interagissent avec celles du

complexe SNARES pour réguler les évènements de fusion membranaire.

27

Les Rabs ont été également associés au bourgeonnement de vésicules membranaires. L’utilisation de

mutants a permis de mettre en évidence le rôle régulateur des Rab1 et Rab9 dans le bourgeonnement

des vésicules à partir du réticulum endoplasmique et des endosomes tardifs respectivement (Nuoffer et

al., 1994; Riederer et al., 1994). Rab5 a quant à lui été associé à la séquestration des récepteurs et à

l’invagination de vésicules de manteaux de clathrine (McLauchlan et al., 1998). En plus, la

Rabphylline11, un effecteur en aval de Rab11 dans les évènements de recyclage de cargos (Ren et al.,

1998; Ulrich et al., 1996) interagit directement avec Sec13 chez les mammifères (Mammoto et al.,

2000) dont l’ortholgue chez la levure régule l’assemblage de manteau de vésicules (Tang et al., 1997).

Une autre propriété associée aux protéines Rabs est leur capacité à connecter le transport des vésicules

à partir des protéines du cytosquelette, notamment des protéines motrices de microtubules ou des

cables d’actine, aux processus de fusion membranaire. Les premières indications du lien entre des

Rabs et le cytosquelette sont venues des travaux de Deretic et collègues en 1995 suivis par Peranen et

collègues en 1996, qui décrivaient l’implication des câbles d’actine dans le transport des vésicules

enrichies en Rab8 (Peranen et al., 1996; Deretic et al., 1995). Depuis les années 1990s, il est clairement

établi que les GTPases de la famille des Rabs jouent un rôle central dans la régulation des protéines

motrices de microtubules grâce à leurs divers effecteurs. Une des premières descriptions fut celle de

Echard et collègues en 1998 qui révélait une interaction directe entre Rab6, une protéine fortement

associée aux structures tubulaires dynamiques se déplacant par les microtubules de l’appareil de Golgi

vers la périphérie (White et al., 1999), et la Rabkinésine-6 une de ses protéines effectrices de structure

similaire à celle des kinésines (Takai et al., 2001; Gross et al., 2004). En outre d’autres effecteurs de

Rab6 actif (BicD1 et BicD2) ont permis de le relier au complexe dynéine / dynactine (Matanis et al.,

2002; Short et al., 2002; Jordens et al., 2005) et donc au transport des cargos vers les poles négatifs des

microtubules. Ces résultats font de Rab6 un régulateur du trafic bidirectionnel de vésicules issues du

Golgi. Il a également été démontré que l’association des endosomes précoces et leur motilité vers les

poles négatifs des microtubules étaient dépendantes de Rab5 (Nielsen et al., 1999). En effet, Huang et

collègues ont démontré que Rab5 colocalisait avec les dynéines de manière insulino-dépendante

(Huang et al., 2001). Une réduction de Rab5-GTP par l’insuline y avait pour conséquence de réduire

son association aux dynéines et le transport vers le terminus négatif des microtubules. Le groupe Zerial

a démontré que Rab5 était à même de créer un environnement local de recrutement des protéines

28

motrices dans des vésicules endosomales. Ils mettent en évidence un recrutement de Kif16B, une

protéine de la famille des kinésines-3 impliquée dans le transport vers le terminus positif des

microtubules, de manière Rab5-dépendante dans les endosomes précoces (Hoepfner et al., 2005).

Comme Rab6 pour les vésicules golgiennes, Rab5 apparaît donc comme une protéine susceptible de

contrôler le transport bi-directionnel des vésicules d’endosomoes précoces. Contrairement aux effets

inhibiteurs de l’insuline sur l’activation de Rab5, il a été démontré qu’une stimulation à l’insuline

favorise l’association de Rab4 aux GTPs par voie PI3K ou PKCγ dépendante, et de ce fait accentue la

liaison de Rab4-GTP à la kinésine KIF3B et donc à une exocytose des cargos par les poles positifs des

microtubules. La protéine Rab11, par son effecteur Rabphyline-11, avec laquelle elle colocalise tout au

long des microtubules (Casanova et al., 1999; Simon et al., 1995; Zeng et al., 1999) a été associée à la

migration cellulaire par régulation du recyclage des vésicules (Mammoto et al., 1999; Imamura et al.,

1998; Takai et al., 2001). Le marqueur d’endosomes tardifs Rab7 et son effecteur RILP (Cantalupo et

al., 2001; Jordens et al., 2001) altèreraient la structure lipidique des membranes d’endosomes tardifs

pour faciliter le recrutement du complexe dynéine/dynactine (Jordens et al., 2005) et orienter le

transport des vésicules vers l’intérieur de la cellule par voies de microtubules (Jordens et al., 2004).

Les protéines motrices associées à l’actine ont aussi été liées à des protéines Rabs. Rab27A interagit

disctinctement d’une part dans les mélanocytes de souris avec MyoVA (Wu et al., 2001) par son

effecteur la Mélanophilline/Slac 2a (Matesic et al., 2001), et d’autre part avec MyoVII dans les cellules

épithéliales de pigmentation de la rétine par son effecteur MyRIP (Gibbs et al., 2004; Desnos et al.,

2003; Amraoui et al., 2002). Rab11 et son effecteur RabFIP2 interagissent directement avec la MyoVb

au cours du recyclage de différents récepteurs (Hales et al., 2002). Rab8, un régulateur clé des voies de

biosynthèse de l’appareil de Golgi vers la membrane plasmique (Ang et al., 2003; Huber et al., 1993) a

également été associé à la myosine-VI, notamment par un des partenaires l’optineurine (Sahlender et

al., 2005; Hattula et al., 2000), expliquant de ce fait la dépendance des vésicules de Rab8 aux

mouvements des filaments d’actine.

Outre leur rôle dans la conversion des compartiments endosomaux, les petites GTPases de la famille

des Rabs coordonnent donc le trafic vésiculaire dans l’espace et dans le temps. Elles sont initialement

recrutées à la membrane donatrice où elles régulent les étapes de bourgeonnement vésiculaires, et

contrôlent leur transport par modulation du cytosquelette. Leurs effecteurs leur assurent une spécifité

dans leurs interactions et leur permettent en outre de prendre activement part aux évènements

29

d’adhésion ou de téthering, d’arrimage et de fusion membranaires notamment en interagissant avec des

protéines du complexe SNAREs.

Figure 11 : Un modèle fonctionnel des GTPases Rabs dans le trafic vésiculaire (Figure tirée de

(Stenmark., 2009)).

1.3.5. Trafic membranaire et signalisation

Les processus de transduction de signaux cellulaires nécessitent de reconnaître des informations venant

de l’extérieur et de pouvoir les traduire en effets physiologiques à l’intérieur de la cellule. Leur

amplitude est étroitement liée à la densité des récepteurs au niveau de la membrane plasmique, qui, en

se liant à leur ligand, transfèrent les stimuli extracellulaires vers l’intérieur, où des modifications post-

30

traductionnelles reconnues par des protéines adaptatrices qui possèdent des domaines structuraux de

liaison protéines, facilitent la propagation du signal par cascades jusqu’au noyau, menant ainsi à des

réponses physiologiques adéquates induites par des protéines effectrices. Une description brève de la

cascade signalisation issue de la liaison de l’insuline à son récepteur se résumerait en la reconnaissance

de résidus tyrosines phosphorylés de la région juxtamembranaire du RI dans un premier temps par des

domaines PTB (Phosphotyrosine binding domains) contenus par des protéines IRS ou SHC qui

transmettent le signal en devenant à leur tour tyrosine phosphorylées et donc reconnues par les

domaines SH2 d’autres protéines adaptatrices GRB2 en complexe avec mSOS pour SHC et la PI3K

par sa sous unité p85. Cette cascade ouvre sur les deux voies majeures de signalisation associées au RI

au niveau de la membrane plasmique. Il s’agit des voies MAPK par SHC qui mène à l’expression

génique et la prolifération alors que les voies PI3K/AKT ouvrent sur les effets métaboliques majeures

(Figure 12).

Figure 12 : Principales voies de signalisation de l’insuline : A) Voies PI3K. B) Voies MAPK (Figure

tirée de (Capeau., 2003)).

Des voies d’importance et parfois plus complexes régulent également les effets de l’insuline sur le

transport de glucose dans les tissus adipeux et les muscles. Ces voies présentent souvent des points de

31

croisement avec des voies précédentes notamment par l’AKT pour la voie PI3K. Une voie parallèle y

implique la protéine CAP (C-Cbl associated protéine) et fait appel à plusieurs protéines spécialisées du

trafic vésiculaire notamment de la famille des SNAREs, des protéines d’activation de GTPases, des

structures de transport vésiculaire telles que les radeaux lipidiques notamment par la flotilline pour la

translocation de Glut4 vers la membrane plasmique (Figure 13).

Figure 13 : Activation par l’insuline de l’entrée du glucose dans les cellules musculaires et les

adipocytes. A) Voie PI3K/PKB/PKC. B) Voie CAP (Figure tirée de (Capeau., 2003)).

L’identification de plus en plus persistante de protéines de signalisation classiques dans le

fonctionnement de l’appareil endosomal (Exemples : PI3K, AKT, GSK3….), l’implication de

modifications post-traductionelles telles que la phosphorylation et l’ubiquitination aussi bien dans le

trafic endosomal que dans les voies de signalisation classique, constituent des évidences d’une

interdépendance entre signalisation et endocytose des RTKs. Il a par exemple été démontré que

l’activation de la PI3K par l’insuline se faisait préférentiellement à l’intérieur de la cellule plutôt qu’à

la membrane plasmique (Kelly et al., 1993), et aussi une stimulation à l’insuline cause une

accumulation de composants des voies MAPK dans des endosomes isolées des fibroblastes à partir de

billes magnétiques (Li et al., 2005). De même l’EGF a été associée à une accumulation de plusieurs de

ses composantes de signalisation en aval du récepteur dans les endosomes précoces telles que GRB2,

SOS et SHC. L’action combinée du bpV(Phen) un composant de peroxovanadium qui inhibe l’action

32

des tyrosines phosphatases et de la colchicine, une protéine inhibitrice du recyclage des récepteurs

dans des rats a permis de cibler une signalisation du RI spécifique aux endosomes hépatiques par

phosphorylation de son substrat IRS-1 (Bevan et al., 1995). Ces évidences suggèrent l’existence d’une

plateforme signalétique endosomale en continuité à la cascade de signalisation initiée à la membrane

plasmique (Di Guglielmo et al., 1994 ; Vieira et al., 1996 ; Sorkin et al., 2001 ; Galperin and Sorkin.,

2008).

D’un même stimulus ou ligand, plusieurs réponses physiologiques sont envisageables. Par ailleurs,

plusieurs RTKs pouvaient générer des réponses cellulaires distinctes en utilisant la même machinerie

de signalisation (Marshall., 1995). L’exactitude des réponses biologiques dépend de l’amplitude et de

la durée du signal intracellulaire (Marshall., 1995 ; Maroun et al., 2000 ; Nagashima et al., 2007).

Celles-ci requièrent à leur tour une fine régulation temporelle et spatiale de la distribution des RTKs

dans le système endosomal (Villosenor et al., 2015). Dans le cas du RI, l’endocytose est un processus

quasi-concomittant à l’initiation de sa cascade de signalisation à la membrane plasmique. Elle a

longtemps fait office de moyen de régulation de signalisation par sa capacité à fournir des récepteurs

déphosphorylés à la membrane plasmique par voie de recyclage ou encore par son aptitude à dégrader

des récepteurs actifs dans les lysosomes. En vue d’apporter un éclairage à la complexité relationnelle

entre amplitude, durée du signal et réponses physiologiques, Villosenor et collègues, ont caractérisé

des mécanismes de régulation de la signalisation de l’EGFR par les endosomes. Ils fournissent des

indices sur des mécanismes de régulation de la signalisation par l’appareil endosomal tout en mettant

en exergue le rôle capital de la signalisation dans l’équilibre endosomal. Ils y démontrent l’existence

d’un mécanisme ajustant la quantité de récepteurs phosphorylés internalisés dans chaque endosome et

principalement dans les endosomes précoces. Ce modèle, identifié comme « conversion de l’analogue

au digital », serait un mécanisme utilisé par l’appareil endosomal pour permettre un signal robuste, et

une régulation de la signalisation spatio-temporelle des récepteurs tyrosine kinases phosphorylés. Si

les cellules utilisées réagissent en accumulant davantage d’EGFR par endosome en réponse à une

augmentation de concentration du ligand, le niveau moyen de récepteurs phosphorylés par endosome

reste similaire, alors que le nombre d’endosomes les contenant augmentent. Cette quantité moyenne et

constante de récepteurs phosphorylés par endosome s’est revélée correspondre à la quantité de

récepteurs signalétiquement compétents. Cet équilibre quantitatif est régulé par l’activité tyrosine

kinase du récepteur. Cette invariabilité de la quantité moyenne des récepteurs phosphorylés par

33

endosome, malgré l’augmentation de volumes des endosomes fusionnés pour dégradation des

récepteurs encore actifs, serait la conséquence d’un mécanisme auto-régulateur de l’EGFR et

impliquant l’activité de diverses phosphatases endosomales. Le récepteur recruterait des protéines

adaptatrices susceptibles de protéger son domaine et son activité tyrosine kinase contre une attaque

probable par des tyrosines phosphatases. Ces protéines y sont maintenues pour des récepteurs à

dégrader alors que leur absence favoriserait la déphosphorylation des récepteurs internalisés et ainsi

leur recyclage vers la membrane plasmique, permettant de maintenir une quantité moyenne de

récepteurs actifs dans les endosomes malgré les processus de fusion ou la continuité de

l’internalisation.

Une illustration de cette coopérativité entre signalisation et trafic est également observable à partir des

petites GTPases de la famille des Rabs telles que Rab5. Rab5 est connu pour son rôle fondamental

dans les évènements d’homofusion et d’hétérofusion au niveau des endosomes précoces et aussi pour

son importance dans le processus de conversion des Rabs par interactions avec des marqueurs tardifs

comme Rab7 ou des marqueurs de recyclage comme Rab11. L’activité de Rab5 est à son tour régulée

par l’activité kinases de certains RTKs dont le récepteur de l’insuline constituant de ce fait un mode de

régulation de la fusion de vésicules endosomales par le RI et réciproquement Rab5 a été associé aux

évènements d’endocytose et de signalisation issus du RI (Jozic et al., 2011; Hunker et al., 2006).

1.4. Cytosquelette et transport bidirectionnel des vésicules endosomales

Le cytosquelette peut être décrit comme un réseau filamenteux comprenant trois classes distinctes de

fibres : Les microtubules, les microfilaments et les filaments intermédiaires. Ses fonctions sont

multiples, mais peuvent se résumer en son aptitude à fournir à la cellule la rigidité et la force dont elle

a besoin pour maintenir sa forme ainsi que les voies nécessaires au mouvement dirigé de ses organelles

durant le traffic intracellulaire. La cellule peut donc être perçue comme un vaste réseau câblé

comprenant deux voies majeures associées d’une part à un réseau de microtubules et d’autre part aux

filaments d’actine. Les microtubules sont une composante dynamique et polarisée du cytosquelette. Ce

sont des fibres cylindriques creuses d’environ 25 nm de diamètre formées par la polymérisation des

hétérodimères de tubuline-α et –β (Wade et al., 2007 ; Horgan and McCaffrey., 2011). Les

hétérodimères de tubuline polymérisent en protofilaments regroupés de façon parallèle donnant lieu à

des microtubules polaires dont l’arrangement radial met en exergue un terminus positif (+), exposant la

34

sous-unité-β et qui s’étend vers la périphérie cellulaire ainsi qu’un terminus négatif (-) montrant la

sous-unité-α et ancré dans le centre d’organisation des microtubules, à proximité du noyau (Figure 14).

Figure 14 : Modèle d’organisation radiale des microtubules dans la cellule. Exemples de transport

bidirectionnel de quelques cargos (Figure tirée de (Gross., 2004)).

L’organisation des filaments d’actine est plus variée. À la périphérie, ils pointent vers l’extérieur alors

qu’à l’intérieur de la cellule, ils n’ont pas d’orientation spécifique. Les microtubules ont été

principalement associées au transport longue distance, bien que des études leur suggèrent une

implication dans un transport plus localisé des cargos, lequel est à priori sous la gouverne des

filaments d’actine (Gross 2004 ; Lewis and Bridgmann, 1992). Les protéines motrices jouent un rôle

clé dans l’organisation cellulaire. Ce sont des ATPases qui agissent comme des locomotives tirant

différents vésicules vers des sites cellulaires spécifiques (Gross, 2004). Elles agissent en convertissant

l’énergie chimique (ATP) en travail mécanique. Elles sont subdivisées en trois classes : Les myosines

utilisent les câbles d’actine alors que les kinésines et les dynéines utilisent le transport par microtubule.

Dans toutes les trois classes de protéines motrices, l’hydrolyse de l’ATP cause un changement

conformationnel du domaine moteur globulaire, qui est amplifié et traduit en mouvement avec l’aide

de motifs structuraux accessoires (Schliwa et al., 2003). Si les changements conformationnels

dépendant de l’hydrolyse de l’ATP sont ressentis et transmis par des éléments structuraux identiques

35

chez la myosine et les kinésines conventionnelles, leur traduction requiert la rotation d’un levier rigide

du site actif carboxylique terminal chez la myosine par opposition à un repositionnement d’une

séquence courte et flexible inducteur de mouvement chez les kinésines (Schliwa et al., 2003). Chez les

dynéines, les changements conformationnels ATP-dépendant sont initiés au niveau de modules AAA-

ATPase d’une boucle du domaine moteur et transmis à une tige qui porte le site de liaison aux

microtubules à sa pointe (Figure 15).

Figure 15 : Communication intramoléculaire à l’intérieur d’un domaine moteur (Myosine (a) ;

Kinésine (b) et dynéine (c). (Figure tirée de (Schliwa et al., 2003)).

Les kinésines constituent une superfamille de plus de 45 membres possédant en commun un domaine

moteur et divergeant par leurs domaines de liaison aux cargos (Caviston et al., 2006 ; Miki et al.,2005).

Elles régulent majoritairement (mais pas exclusivement) le transport vers la périphérie cellulaire, par

exemple du Golgi vers la membrane plasmique, contrairement aux dynéines qui sont plus spécifiques

pour le transport vers les poles négatifs (Cavitson., 2006 ; Gross., 2004 ; Granger., 2014). Parmi les

kinésines impliquées dans le transport vers les poles positifs, on peut citer les membres des familles

des kinésines I, notamment des homodimères ubiquitaires KIF5B ou principalement neuronaux tels

que KIF5A. Ceux de la famille des kinésines II peuvent être hétérotrimériques avec deux sous-unités

motrices (KIF3A pariée à KIF3B ou KIF3C). Enfin les membres des kinésines III peuvent agir comme

36

monomère ou dimère et comprennent entre autres la kinésine KIF16B. Toutes ces familles de kinésines

en plus d’autres kinésines orientées vers les pôles négatifs telles que KIFC1 et KIFC2 ont été associées

au transport de vésicules endolysosomales (Granger., 2014). Les dynéines cytoplasmiques sont

composées, quant à elles, de deux chaînes lourdes, deux chaînes intermédiaires et des chaînes

additionnelles légères et légères intermédiaires. Les chaînes lourdes appartiennent à la famille des

ATPases AAA et possèdent des sites de liaision consensus à l’ATP dont un seul est susceptible

d’hydrolyse. La spécificité de liaison aux différents cargos leur est conférée par les chaînes

intermédiaires, les chaînes légères intermédiaires et les chaînes légères codées par une multitude de

gènes dans les cellules eucaryotes (Caviston., 2006 ; Pfister., 2006). Pour leur fonction, les dynéines

sont souvent en complexe avec la dynactine qui régule l’association aux cargos et facilite la

processivité de leur domaine moteur (Cavitson., 2006).

Les filaments d’actine peuvent tout aussi bien être polarisés avec des extrémités pointues

analogues aux pôles positifs ou négatifs des microtubules. Leurs protéines motrices majeures

impliquées dans le trafic des organelles, les myosines, sont reparties en trois familles I, V et VI. La

polymérisation de l’actine polarisée est importante pour générer des comètes d’actines capables de

supporter le mouvement des organelles (Granger., 2014 ; Taunton., 2000). L’actine joue un rôle crucial

dans la génération d’une force mécanique au cours de l’internalisation des cargos à partir de la

membrane plasmique. Son implication est souvent associée au besoin d’une force importante pour le

bourgeonnement de vésicules à des sites de membrane plasmique présentant un haut niveau de rigidité

ou alors pour l’internalisation de larges cargos (Granger., 2014 ; Boulant., 2011 ; Cureton., 2009).

Outre leur rôle de régulation dans l’activation du complexe Arp2/3 et conséquemment la

polymérisation de l’actine, les myosines de type I ont la possibilité de se lier avec des lipides

membranaires (Granger., 2014 ; Tang., 2002) au cours de leur interaction avec l’actine. Ceci leur

permet de jouer un rôle clé dans la génération de tension et de déformation membranaire (Granger,

2014 ; Nambiar 2009). Elles sont donc fortement impliquées dans l’endocytose de vésicules à partir de

la membrane plasmique. Les myosines VI quant à elles, sont majoritairement orientées vers les pôles

négatifs et sont recrutées sur des sites d’endocytose clathrine-dépendantes (Granger., 2014 ; Taylor.,

2011). La force, qu’elles génèrent, favorise davantage la formation vésiculaire que l’organisation ou la

polymérisation de l’actine (Granger., 2014 ; Buss., 2001). L’association de ces protéines motrices aux

vésicules membranaires est souvent dépendantes des composantes lipidiques des membranes. Les

myosines utilisent une région basique terminale pour interagir avec des phospholipides acides des

37

membranes (Tang et al., 2002) alors que les kinésines KIF1 s’agglomèrent dans des radeaux lipidiques

spécifiquement enrichis en phosphatidylinositol-4,5-diphosphates par leur domaine d’homologie

pleckstrine (Klopfenstein et al.,2002). Dans certains types cellulaires, les dynéines cytoplasmiques et

les kinésines conventionnelles peuvent également interagir avec des protéines membranaires intégrales

aux cargos pour favoriser leur attachement. C’est le cas pour les chaînes légères de kinésines et la

protéine précurseure AAP dans certaines neurones au cours du transport axonal de certaines vésicules

(Kamal et al., 2001). Cette association avec les protéines membranaires intégrales nécessite souvent

une autre protéine de liaison telle que les protéines d’échafaudage JIPS (Junk interacting proteins) qui

se lient aux protéines de la voie de signalisation JNK et aussi aux protéines de la famille des LDLR

(Low density lipoprotéines receptor) (Terada et al., 2000).

Les endosomes se déplacent d’une manière générale à travers les microtubules. Les endosomes

précoces, reconnaissables par leur marqueur Rab5 ont un profil de motilité complexe dépendant de leur

localisation et des processus parallèles de fusion ou de fission vésiculaires pouvant causer des

interruptions instantanées (Granger., 2014). Par exemple, lorsqu’elles se retrouvent dans une zone

riche en actine, elles ont tendance à se mouvoir sur des distances courtes (Nielsen., 1999). Des

analyses par imagerie cellulaire révèlent qu’environ 50% des endosomes précoces ont une motilité

directionnelle et ils se déplacent majoritairement sur des courtes distances. Des analyses biochimiques

complémentaires permettent de se rendre compte que les déplacements sur longues distances vers

l’intérieur de la cellule sont régulés principalement par les dynéines alors que des membres de la

famille des kinésines I ont été principalement associés à des mouvements vers la périphérie. Il reste

important de mentionner que les kinésines conventionnelles et les dynéines ont aussi été impliquées à

des mouvements de cargos dans les directions opposées, suggérant de ce fait que kinésine et dynéines

sont des régulateurs du transport bidirectionnel des vésicules endosomales (Nielsen., 1999).

1.5. Réseaux d’interactions protéines-protéines

1.5.1. Topologies des réseaux d’interactions protéiques dans la cellule

Dans une cellule, une fonction biologique est la résultante d’actions coordonnées impliquant plusieurs

de ses constituants parmi lesquels les protéines. Les effets physiologiques observés dépendent d’une

dynamique d’interactions où l’environnement spatial et temporel des composants cellulaires est

déterminant. Un interactome peut être défini comme une représentation de cette dynamique

d’interactions ayant lieu à un moment spécifique et dans un contexte défini de la cellule. Un

38

interactome protéique est un graphique où les protéines sont des nœuds interconnectés par des liens

symbolisant leur association fonctionnelle ou physique. On distingue les liens directs, caractéristiques

des réseaux métaboliques ou de régulation transcriptionnelle, des liens indirects identifiables dans des

réseaux d’interactions protéines-protéines classiques. Dans un réseau métabolique par exemple, les

nœuds sont des protéines reliées les unes aux autres par des réactions catalysées par des enzymes. La

direction des liens y suggère le sens de la réaction du substrat vers le produit. Dans un réseau à liens

indirects, la direction du flux d’information n’est pas décrite. La connexion de A vers B est similaire à

celle de B vers A. Un des fondements majeurs de la théorie des réseaux suggère que l’architecture des

réseaux, aussi diversifiés qu’ils puissent être dans la nature, reposent sur quelques principes simples

qui leur sont communs. Cette théorie puise ses bases mathématiques dans les travaux de Paul Erdös et

d’Alfred Renyi, qui en 1960, décrivait déjà un réseau aléatoire comme un ensemble de nœuds

interconnectés sur une base aléatoire et dont le nombre d’interconnexions par nœud avait une

distribution suivant la loi de Poisson (Erdös and Renyi., 1960). Cette propriété des réseaux aléatoires

donne au degré de connectivité un caractère uniforme avec un nombre d’interactions par nœud quasi-

identique pour la majorité des nœuds. Elle s’oppose à celle couramment observée dans des réseaux

réels tels que les interactomes cellulaires et biologiques construites à partir de la plupart de génomes

d’eucaryotes où une minorité de nœuds tendent à maintenir la cohésion du réseau par leur nombre

important d’interacteurs et y sont communément décrits comme des hubs (Jeong et al., 2001; Wagner

et al., 2001; Giot et al., 2003; Li et al., 2004). Cette connectivité à échelle libre des réseaux cellulaires

obéit à une loi de puissance (Barabasi et al., 1999). La probabilité pour que chaque nœud du réseau ait

un nombre exact de liens k se résume en l’équation P(k) ̴ k-γ où γ est l’exposant du nombre

d’interactions par nœud et est généralement compris entre 2 et 3 (Barabasi et al., 1999). Cette

topologie des réseaux biologiques et cellulaires qui reposent sur une minorité de hubs pour leur

intégrité, procure une forte tolérance contre les attaques aléatoires mais aussi une grande vulnérabilité

face aux attaques ciblées notamment contre certains hubs, comme ça peut être le cas pour des attaques

de virus et autres agents pathogènes (Albert et al., 2000). Elle est caractérisée par deux mécanismes de

base qui se résumeraient en ce que, plus un nœud est connecté plus il recevra de nouveaux interacteurs.

Ce sont les principes de croissance de réseau et d’attachement préférentiel. En effet, un réseau peut

être perçu comme l’ajout permanent d’un nœud à un nœud central initial et donc l’attachement

préférentiel du nouveau nœud se fera plus rapidement vers les nœuds présentant une plus forte

connectivité générant de ce fait des hubs (Barabasi and Oltvai., 2004; Barabasi et al., 1999).

39

Un autre groupe d’importance dans la topologie d’un réseau moléculaire est celui des nœuds

bottlenecks.Leur importance dans des réseaux d’interactions directes semble supérieure à celui des

hubs. Les bottlenecks sont ces nœuds par lesquels passent le plus grand nombre de courts chemins

pour relier deux nœuds quelconques d’un réseau. Un chemin reliant de nœuds est d’autant plus court

que le nombre d’intermédiaires entre ces nœuds est réduit. Les bottlenecks sont des protéines qui ont

donc le niveau de centralité intermédiaire le plus élevé dans un réseau. Ce sont des protéines

connectrices de deux ou plusieurs complexes de protéines dans une dynamique cellulaire. Ils

apparaissent comme des ponts ou des tunnels permettant de relier plusieurs voies de signalisation ou

plusieurs groupes fonctionnels.

Figure 16: Exemple de bottleneck dans un réseau d’interactions protéines-protéines. CAK1 est dans ce

réseau, un exemple de bottleneck reliant cycle cellulaire et sporulation par voie MAP kinase (Figure

tirée de (Yu et al., 2007)).

Une autre caractéristique commune aux réseaux complexes est décrite sous le terme « effet petit

monde ». Il s’agit ici de stipuler que deux nœuds quelconques d’un réseau peuvent être connectés par

un nombre réduits de liens. Cet effet initialement associé aux réseaux aléatoires se trouve fortement

40

accentué dans un réseau libre d’échelle où la distance de connexion entre deux nœuds est ultra petit

(Milgran., 1967; Watts and Strogatz., 1998; Chung and Lu., 2002; Cohen and Havlin., 2003). En outre

dans un tel réseau à échelle libre, les hubs tendent à ne pas être directement interconnectés mais ont

une préférence pour des nœuds de plus faibles degrés (le terme degrés de connectivité fait référence au

nombre d’interacteurs dans un réseau). Ce principe est caractéristique des réseaux cellulaires,

biologiques et technologiques (Maslov and Sneppen., 2002; Pastor-Satorras et al., 2001; Newmann.,

2002). Une conséquence de cette notion est illustrée dans les réseaux métaboliques où trois ou quatre

réactions peuvent être suffisantes pour interconnecter les différents nœuds du réseau et donc une

perturbation d’une des réactions résulterait en une dégradation plus rapide de la dynamique du réseau.

L’effet petit monde peut être illustré par des mesures telles que la longueur moyenne des plus courts

chemins entre deux nœuds quelconques, le calcul de la plus longue distance entre deux nœuds du

réseau.

Les réseaux peuvent également présenter une architecture en module hiérarchique. La modularité est

un terme utilisé pour définir l’aptitude à un groupe de molécules fonctionnellement ou physiquement

associées à agir ensemble pour atteindre une fonction distincte. Un module représenterait cet

agglomérat de molécules ou nœuds fortement interconnectés dans un réseau. Un réseau réel présentant

une organisation hiérarchique est donc composé de modules de différentes tailles. Il est caractérisé par

son coefficient d’agglomération qui serait identique à celui d’un réseau aléatoire en absence de

modules. Cependant il est le plus souvent supérieur à celui d’un réseau aléatoire de taille et de

distributions d’interactions similaires. Ce coefficient d’agglomération élevé est l’une des

caractéristiques des réseaux biologiques et cellulaires (Wuchty., 2001; Wagner et al., 2001). Le

coefficient d’agglomération mesure la probabilité de connexion entre deux nœuds A et C ayant un

interacteur commun B. Il se calcule suivant la formule Ci=2ni/k (k-1) où ni est le nombre de liens

connectant un nombre de voisins k du nœud I entre eux. La fonction C(k) ~ k-1 définie comme la

valeur moyenne de tous les nœuds ayant un nombre de liens k est est une caractéristique d’une

orgnaisation hiérarchique des réseaux réels (Ravasz and Barabasi., 2003; Ravasz et al., 2002).

1.5.2. Réseaux d’interactions moléculaires et maladies complexes

Compte tenu des interdépendances entre différents composants moléculaires de la cellule, une maladie

complexe paraît difficilement imputable à un seul gène. Elle résulterait davantage d’une perturbation

41

systématique de réseaux d’interactions moléculaires aux niveaux tissulaires ou organelles. Explorer les

maladies complexes de manière systématique est une approche permettant de mieux cerner les

mécanismes moléculaires associés aux différentes pathologies à travers de nouveaux modules ou

autres voies de signalisation affectées. Une telle approche peut également servir à établir des liens

fonctionnels entre différents phénotypes. Cette approche favorise l’identification de nouveaux gènes

pour des pathologies connues et apparaît complémentaires aux avancées du séquençage du génome

humain ou aussi comme complément aux nombreuses études du génome total (GWAS). Parmi les

réseaux moléculaires on peut citer les réseaux métaboliques, les réseaux d’interactions protéines-

protéines et les réseaux transcriptionnels, alors que les réseaux phénotypiques englobent des réseaux

génétiques dans lesquels c’est la liaison de plusieurs gènes qui définit le phénotype associé ou encore

des réseaux de coexpression des gènes dans lesquels les gènes sont liés parce que leur expression est

similaire dans deux maladies différentes. Comme les réseaux biologiques classiques, ces réseaux

pathobiologiques sont d’échelle libre, présentent une architecture avec un nombre réduit de hubs et

aussi des nœuds bottleneck (nœuds reliant plusieurs complexes entre eux dans un réseau). Leur

arrangement topologique suit les principes de regroupement similaire à celui d’un « effet petit

monde ». L’importance des protéines hubs comme cibles majeures dans un réseau associé aux

maladies complexes est aujourd’hui largement discuté. Les gènes codant pour des protéines hubs, de

par leur grande connectivité, y apparaissent comme des cibles majeures. Des mutations de ces gènes ou

leur extraction d’un réseau causerait une dislocation de ce dernier en petits groupes de nœuds.

Cependant, des analyses montrent que les hubs ont très souvent un caractère essentiel et sont donc

souvent associés à une léthalité embryonaire pouvant ainsi remettre en question leur impact comme

causes de maladies complexes (Goh et al., 2007). Il faut cependant dissocier les hubs-bottlenecks des

hubs-nonbotllenecks. Les premiers décrivent des protéines bottlenecks ayant un nombre d’interacteurs

élevés. Ces protéines auraient donc une importance plus grande dans l’équilibre des réseaux et la

communication cellulaire et seraient davantage associés aux maladies complexes que des hub-

nonbottlenecks dont l’effet est plus localisé dans un complexe fonctionnel.

42

Figure 17 : Une représentation schématique des quatre catégories de bottlenecks dans un réseau

(Figure tirée de (Yu et al., 2007)).

Dans un réseau d’interactions, les protéines dont les gènes codants ont des variants associés aux

maladies complexes, évoluent en modules dont l’identification par des algorithmes adaptés et des

analyses fonctionnelles complémentaires (par ontologie de gènes par exemple) permettent de mettre en

évidence les voies de signalisations ou les liens fonctionnels impliqués. Le concept de modules de

maladies complexes repose sur une hypothèse dite « locale » suivant laquelle les protéines impliquées

dans une même maladie ont une forte propension à interagir entre elles. Il en est de même pour les

gènes associés à des maladies avec des phénotypes similaires. Ces deux hypothèses montrent

l’importance de la proximité ou du voisinage des nœuds dans un réseau pour identifier des modules de

maladie et aussi pour leur suggérer de nouveaux gènes candidats. Trois groupes de modules sont

couramment décrits dans la littérature : Ainsi, on parlera de module topologique pour définir un groupe

de nœuds fortement interconnectés dans un voisinage proche mais où les liens sont plus dépendants de

la proximité géographique. Par opposition, dans un module fonctionnel, des nœuds voisins sont

interconnectés uniquement s’ils ont des fonctions similaires ou identiques. Dans un module de

maladie, les interactions fonctionnelles sont complétées entre les nœuds par un lien cause à effet établi

43

avec la maladie étudiée. L’identification de modules de maladies complexes dans un réseau

d’interactions est une étape clé dans l’application des réseaux en médecine. Bien que certains

chercheurs tendent à trouver une similarité entre les trois groupes de modules arguant de liens

fonctionnels établis dans les trois cas, un module de maladie présente quelques points qui lui sont

particuliers. Ces modules peuvent ne pas être identiques aux modules topologiques et fonctionnels

associés mais pourraient présenter des nœuds communs. En outre ce sont des modules spécifiques à

des maladies connues et donc à chaque maladie ses modules et enfin, un nœud peut appartenir à

plusieurs modules de maladie (Barabasi et al., 2011) (Figure 18).

Figure 18 : Catégories de modules dans un réseau d’interactions (Figure tirée de (Barabasi et al.,

2011)).

1.5.3. Réseaux cellulaires et gènes candidats pour maladies complexes

L’un des objectifs ultimes de la construction de réseaux protéines-protéines est la capacité à prédire

des fonctions nouvelles à des protéines données ou encore d’identifier des gènes nouveaux dont les

variants seraient associés à des maladies complexes. De nombreux outils informatiques notamment des

44

algorithmes ont été développés à cet effet. Ils reposent en général sur des principes de liaison

fonctionnelle dans un voisinage proche, de proximité chromosomique ou encore par des similitudes

structurelles à travers des domaines de liaison similaires ou complémentaires et aussi des séquences

tout court des différents protagonistes. Les approches couramment utilisées peuvent se résumer en trois

groupes tels que décrits par (Barrabasi et al., 2011).

La méthode par liens génétiques repose sur le principe que les partenaires d’interactions d’une protéine

causative d’une maladie complexe seront eux aussi associés aux phénotypes de cette maladie si leurs

gènes codant appartiennent au même locus génétique que celui du gène codant pour la protéine

causative. Ainsi pour un locus identifié à une maladie donnée, les gènes de ce locus dont les produits

interagissent avec la protéine causative sont probablement eux aussi associés à cette maladie. Il a par

exemple été démontré que l’ensemble des gènes appartenant à des loci de maladies connues et dont les

produits ou protéines interagissaient avec des produits causatifs de maladie du même locus étaient 10

fois plus enrichi en gènes causatifs de la dite maladie. Cet enrichissement devenait 1000 fois plus

important si la localisation cellulaire des produits en question était similaire (Oti et al., 2006 ; Barabasi

et al., 2011).

Une approche basée sur l’existence de modules de maladie pose comme hypothèse que tous les

composants cellulaires appartenant à un module donné qu’il soit topologique, fonctionnel ou de

maladie, auront de fortes chances d’être impliqués à la même maladie (Navlakha et al., 2010 ; Lage et

al., 2007 ; Barabasi et al., 2011). Ici, il sera dans un premier temps question de définir clairement un

sous-réseau ou module compact de maladie comprenant les produits de gènes codant qui lui sont

associés à partir d’un interactome dans le tissu ou la lignée cellulaire de choix et d’étudier les membres

de ce module en vue de déterminer leur association fonctionnelle et donc leur probabilité d’implication

à la même maladie. Cette approche a déjà permis d’identifier des gènes susceptibles du cancer du sein

tel que décrit par (Wu et al., 2008).

Une troisième approche basée sur un principe de diffusion permet de prioririser les protéines et les

voies fonctionnelles sur la base de leur implication potentielle à une maladie donnée. Il s’agit

d’identifier des nœuds et des voies ou interactions les plus proches de gènes associés à la maladie

étudiée. Ainsi les gènes candidats en liaison avec plusieurs gènes causatifs d’une maladie auront une

45

plus grande probabilité à devenir gènes candidats que ceux du même voisinage topologique

n’interagissant pas directement dans le réseau avec les mêmes gènes causatifs. Cette approche a déjà

servi à l’identification de gènes candidats pour des maladies comme alzheimer, le diabète mellitus ou

le cancer de prostate (Kohler et al., 2008 ; Vanunu et al., 2010 ; Barabasi et al., 2011).

Figure 19 : Méthodes d’identification de gènes candidats d’une maladie complexe. (Figure tirée de

(Barabasi et al., 2011)).

46

1.5.4. Concept de « diseasome »

Dans ses travaux en 2007, (Goh et al., 2007) s’exerce à appliquer le concept de réseaux à la médecine

moderne à travers trois types de réseaux d’interactions. Il y développe le concept de « diseasome », le

définissant comme un graphique permettant de relier des maladies complexes à des gènes dont des

mutations ont été établies comme causatives de ladite maladie. Partant de ce concept, il approfondit ses

analyses en décrivant d’une part un réseau des maladies humaines qui relie les maladies complexes ou

les classes de maladies complexes chez l’humain entre elles sur la base de gènes causatifs communs. À

travers ce réseau il ressort les origines communes entre différentes maladies appartenant à une même

classe ou à un degré moins important entre les maladies appartenant à des classes différentes. Un

second réseau (réseau de gènes de maladies) lui permet de relier les gènes causatifs entre eux s’ils sont

à l’origine de maladies complexes identiques. Ce nouveau concept de diseasome nous donne des

renseignements sur les mécanismes moléculaires communs à différentes maladies complexes et nous

renseigne sur des probables raisons favorisant l’avènement simultané d’un ou plusieurs phénotypes. Il

pourrait être un outil important de diagnostic, de prévention et aussi de développement de nouveaux

produits pharmaceutiques (Barabasi et al., 2011).

1.6. Diabète : Résistance à l’insuline et génétique

1.6.1. Histoire : Du diabète à la découverte de l’insuline

La découverte de l’insuline et les nombreuses études qui lui sont associées constituent des étapes

importantes dans la lutte contre le diabète, dont les premières descriptions sont mentionnées dans le

Papyrus de Thèbes écrit près de 1550 ans avant Jésus-Christ mais contenant des passages datant

d’environ 3400 ans avant Jésus-Christ. Ce papyrus a été découvert par l’égyptologue allemand Georg

Ebers en 1872 d’où le nom papyrus d’Ebers qui lui est communément attribué (Sanders., 2002). Très

vite, la maladie est associée à une rétention ou à une perte d’eau corporelle. Au deuxième siècle après

Jésus-Christ, un médecin grec du nom d’Arétée de Cappadoce la caractérise comme une fonte

musculaire des membres dans l’urine. Ses racines grecques signifient « siphon » alors qu’en Inde on

lui donne les noms de « Prameha : flux d’urine chez des patients urinant pour la plupart comme des

éléphants » ou encore « madhumea : Maladie avec du miel dans l’urine ». Ces deux caractéristiques

font référence à la polyurie et à la glycosurie deux symptomes cardinaux du diabète. Ce n’est qu’au 17e

47

siècle que les propriétés liées au sucre dans l’urine diabétique sont émises en Europe par Thomas

Willis avant leur utilisation par l’écossais John Rollo pour distinguer le diabète mellitus (diabète sucré)

du diabète insipidus (diabète insipide ou sans goût) (Barnett., 2010). Il faudra attendre la fin du 19e

siecle avec l’avènement de la médecine expérimentale et l’introduction des animaux dans la recherche

en médecine, pour établir un lien entre le diabète et le pancréas par les allemands Oskar Minkowski et

Josef von Mering. L’ablation de cet organe chez le chien causa une hyperglycémie, une glycosurie et

une mort après ketose et coma, tous des symptômes du diabète (Von Mering and Minkowski., 1890;

Rosenfeld., 2002). Ils proposèrent que le pancréas comprend un ensemble d’enzymes digestives et une

sécrétion endocrine permettant le contrôle du sucre sanguin. Cette fonction fut plus tard attribuée aux

cellules de Langerhans par Eugene Opie du Johs Hopskins University. Il faudra attendre 1922 pour que

l’insuline soit effectivement isolée et purifiée par Banting et Best avec l’assistance de Macleod et

Collips. Cette découverte qui changea la stratégie de lutte contre le diabète mena à l’attribution du Prix

Nobel 1923 à Maccleod et Banting, le premier patient traité, ayant été Leonard Thomson à l’hôpital

général de Toronto en 1922 (Rosenfeld., 2002).

1.6.2. Diabète : Présentation générale

Le diabète mellitus peut être défini comme un ensemble de conditions métaboliques associées à

l’hyperglycémie avec des défauts de sécrétion et d’action de l’insuline. Ses causes majeures sont une

combinaison de prédispositions génétiques et de facteurs environnementaux. Suivant l’organisation

mondiale de la santé, la prévalence du diabète a atteint des proportions épidémiques avec plus de 347

millions de personnes atteintes en 2012 et une croissance mortifière conséquente, prédite à plus de

50% au cours des dix prochaines années. Ceci fait du diabète, la septième cause majeure de mortalité

au monde. Outre le diabète gestationel caractérisé par un niveau de sucre sanguin au dessus de la

normale chez les femmes enceintes, on distingue deux formes principales de diabète telles que

proposées par la Société Américaine de Diabète en 1997 (Kharroubi and Darwish., 2015): Le diabète

de type I et le diabète de type II.

Le diabète de type I est caractérisé par une faible ou une absence de production d’insuline par les

cellules béta du pancréas (Maahs et al., 2010 ; Daneman et al., 2006). Il représente environ 10% des

cas diagnostiqués dans le monde. Il représente cependant 80% à 90% de diabètes diagnostiqués chez

les enfants et les adolescents (Craig et al., 2009; Dabelea et al., 2014), avec environ 497100 cas chez

48

les jeunes de moins de 14 ans en 2013, et une moyenne annuelle estimée à 78900 nouveaux cas

(Kharroubi., 2015). Le diabète de type I est associé à une destruction autoimmune des cellules bétas du

pancréas due à une réponse inflammatoire médiée par les cellules-T ou à une réponse humorale médiée

par les cellules-B. Les autoanticorps dirigés entre autres contre les cellules du pancréas ou encore

contre l’insuline, l’acide glutamique decarboxylase, la protéine tyrosine phosphatase (IA2 et IA2β), le

transporteur de Zinc (ZnT8A) constituent les marqueurs généraux du diabète de type I. Des formes de

diabètes de type I non-autoimmunes ont aussi été identifiées. Il s’agit de formes idiopathiques moins

sévères et plus recurrentes chez des descendances aficaines et asiatiques ou encore des formes

fulminantes plus sévères et caractérisées par une kétoacidose sans sécrétion d’insuline due à la

destruction conséquente des cellules bétas du pancréas. Cette forme est plus fréquente dans l’est de

l’Asie et consitue 20% des cas diagnostiqués au Japon (Kharroubi and Darwish., 2015). Bien que le

rôle des facteurs environnementaux, notamment des virus ou autres polluants dans l’origine du diabète

de type I soit controversé, de nombreuses études ont mis en évidence plusieurs loci génétiques

impliqués dans l’établissement du diabète de type I. La région la plus importance identifiée à ce jour

reste celle des HLA (Human Leucocyte Antigen). Cette association génétique est suivie par celle liée

au polymorphisme dans la région promotrice du gène de l’insuline, et aussi les loci PTPN22 et IL2RA

parmi les plus importantes (Noble and Erlich., 2012).

Le diabète de type II est la forme la plus courante avec plus de 90% des patients diagnostiqués. Les

personnes les plus touchées sont des adultes agés entre 40 et 59 ans. Cependant on assiste à une

incidence accrue du diabète de type II chez les personnes agées de moins de 20 ans. Cette

augmentation est associée au changement du style de vie notamment à l’obésité qui est la cause

majeure de la résistance à l’insuline (Kharroubi and Darwish., 2015). Outre le style de vie et l’obésité

comme facteurs déclenchant, des éléments génétiques ont également été associés à la pathogénèse du

diabète de type II. Le niveau d’héridité y est plus important que dans le cas du diabète de type I. Il a

été établi que le risque de développer le diabete de type II doublait dans une famille présentant un

passif avec la maladie et que des enfants issus de patients ayant souffert de ce même diabète le

développeraient dans 15-25 pourcent des cas à l’âge adulte. En outre, dans une famille où les deux

parents seraient atteints du diabète de type II, la prévalence chez les enfants passeraient à plus de 60%

des cas à l’âge de 60 ans (Stumvoll et al., 2005).

49

Le développement du diabète de type II est marqué par une détérioration progressive de la tolérance au

glucose sur plusieurs années, suite à une prise de poids, des défauts de sécrétion d’insuline, une

résistance à l’action de l’insuline et une augmentation de production de glucose hépatique endogène

(Weyer., 1999). Si l’ordre chronologique d’établissement de ces différents points chez les patients

n’est pas clairement établi, un modèle suggèrerait que la résistance à l’insuline cause un besoin plus

important en sécrétion d’insuline du pancréas qui, à long terme, ne serait plus à même de fournir une

quantité adéquate dû à un disfonctionnement des cellules bétas transformant un diabète non-insulino

dépendant en diabète insulino-dépendant.

1.6.3. Mécanismes moléculaires associés au diabète de type II

La résistance à l’insuline est, avec la sécrétion de l’insuline, un des déterminants majeurs de la

dérégulation métabolique du glucose dans le diabète de type II. Elle est cliniquement établie lorsqu’il y

a perte d’effets biologiques de l’insuline vis-à-vis de l’utilisation du glucose sanguin dans les muscles

squelettiques ou alors vis à vis de la suppression de production du glucose endogène par le foie. À

jeûn, les muscles squelettiques utilisent seulement une faible proportion de glucose alors que la

production de glucose est essentiellement issue du foie. Cette production est fortement augmentée chez

des patients atteints de diabètes, notamment en présence d’hyperinsulinémie, faisant de la résistance

hépatique à l’insuline la force motrice de l’hyperglycémie (Stumvoll et al., 2005). Sur le plan

cellulaire, la résistance à l’insuline peut être définie comme une perte de signal de l’insuline à partir de

son récepteur jusqu’aux effecteurs finaux susceptibles d’induire les multiples actions métaboliques et

mitogéniques de l’insuline dans le fonctionnement cellulaire (Saini., 2010). La liaison avec son

récepteur de surface induit une cascade de signalisation dont certaines protéines majeures ont été

associées à la résistance à l’insuline. Le premier substrat du RI, appartenant à la famille des IRS, a

longtemps été indexé dans la régulation de la résistance à l’insuline. Cette implication a été clairment

mise en évidence par des essais de mutations génétiques chez la souris où la délétion de IRS1 a induit

des phénotypes de résistance à l’insuline notamment au niveau des muscles et des tissus gras. Parmi

les mécanismes moléculaires associés, une régulation négative par des sérine/thréonine kinases en

amont des IRS serait mise à profit par de nombreux agents inducteurs de résistance de l’insuline. On

peut ainsi citer parmi ces sérine/thréonine kinases, mTOR qui a été associée à l’hyperinsulinémie, mais

aussi la JNK qui, outre le stress cellulaire, semble activé par une dérégulation métabolique des lipides

et les voies d’inflammation comme c’est aussi le cas pour la PKCθ et la TNFα. Il est à noter que ces

50

deux dernières kinases ont également été associées à une hyperglycémie pour la première et à la

dysfonction mitochondriale pour la deuxième menant à la résistance à l’insuline. La sérine

phosphorylation joue un rôle inhibiteur sur l’activation et la tyrosine phosphorylation des IRS1,

réduisant de ce fait le recrutement des effecteurs en aval dans la cascade de signalisation, notamment la

PI3K, et induisant aussi la dégradation des IRS1. En outre une hyper-sérine phosphorylation des IRS1

par les Ser 302, 307, 612 et 632 a été observée chez des modèles rongeurs résistants à l’insuline alors

qu’une triple mutation des Ser 302, 307 et 612 confère une protection contre la résistance à l’insuline

induite par une diète grasse in vivo (Saini., 2010).

Une autre protéine d’intérêt dans les voies associées à la résistance à l’insuline est l’AKT. L’activation

de cette sérine/thréonine kinase en aval de la PI3K, déclenche des effets métaboliques de l’insuline

dans le foie, notamment la synthèse du glycogène en inhibant l’activité kinase de la GSK3 après

phosphorylation de ses sérines S21 (GSK3alpha) ou S9 (GSK3 beta), donc en activant la glycogène

synthase. En outre, l’activité de l’AKT a été associée à la suppression de production du glucose

hépatique et à la translocation insulino-dépendante du transporteur de glucose Glut4 vers la membrane

plasmique dans les muscles squelettiques. Un knock-out de son isoforme AKT2 chez la souris a été

suivie du développement de la résistance à l’insuline et d’un phénotype similaire au diabète de type II

chez l’humain. La GSK3, quant à elle, est présente dans la cellule sous les formes GSK3α et GSK3β.

Elle est active à l’état basal. Bien qu’elle soit pour la plupart du temps associée à la résistance à

l’insuline pour son rôle sur la synthèse du glycogène, d’autres études suggèrent qu’elle régulerait aussi

des facteurs de transcriptions associés à la signalisation de l’insuline et l’homéostase du glucose. On

peut citer entre autres, NFκB impliqué dans les voies de signalisation liées à l’inflammation et aussi à

la résistance de l’insuline, la β-catenine qui fonctionne dans l’adipogénèse et le facteur de transcription

CREB impliqué dans la gluconéogénèse hépatique (Lee et al., 2007). Bien que ces études in vivo

confirment que les protéines de signalisation identifiées sont importantes pour la réponse insulinique,

elles n’expliquent pas leur implication dans les maladies chez l’homme car très peu de mutations

(moins de 1 % des cas) ont été identifiées.

1.6.4. Génétique du diabète de type II

Le diabète de type II est une maladie multifactorielle complexe. Dans la majeure partie des cas, le

diabète de type II est plutôt une maladie polygénique pouvant correspondre à l’hypothèse « Aux

51

variants communs – maladie commune ». Suivant cette hypothèse, la susceptibilité génétique à une

maladie complexe est conférée par l’apparition simultanée de variants génétiques communs (>5% de la

population) dans plusieurs gènes, chacun de ces variants ayant seulement un effet modeste sur la

fonction du gène en question (Shäffer., 2011). Les SNPs (single nucleotide polymorphisms) ont des

séquences très variables dans tout le génome humain et constituent les variants génétiques les plus

couramment étudiés. L’identification des gènes susceptibles au diabète de type II résulte d’une

approche par identification de gènes candidats ou alors elle provient d’analyse du génome totale d’une

population donnée. Dans le premier cas, un gène est considéré comme candidat pour une maladie

complexe lorsque ses fonctions connues ou présumées sont supposées être impliquées dans la

pathogénèse de la maladie (on parle alors de gènes candidats fonctionnels), ou alors lorsque des

mutations de ce gène causent la maladie d’intérêt comme c’est le cas pour les formes monogéniques du

diabète, ou encore à partir d’une région chromosomale identifiée comme à risque pour le diabète de

type II. Une fois le gène candidat identifié, des études subséquentes sur les variants communs ainsi que

leur fonctionnalité biologique permettront de les valider. Avec cette approche, peu d’allèles à risque

ont été identifiés et fonctionnellement associés au diabète de type II. L’avènement des GWAS aura

permis à la communauté scientifique d’explorer davantage l’aspect génétique dans l’établissement du

diabète de type II. Portant sur des populations diverses et ciblées, les GWAS permettent d’identifier

des variants communs, les SNPs, dans différentes régions chromosomales sans pour autant établir les

mécanismes moléculaires ou l’association avec les autres facteurs environnementaux dans les causes

du diabète de type II.

52

OBJECTIFS ET HYPOTHÈSES

L’insuline est une hormone sécrétée par les cellules-β du pancréas. Elle joue un rôle majeur dans

l’homéostase du glucose et elle agit en se liant à son récepteur de surface (RI). Le RI est un récepteur à

activité tyrosine kinase (RTK) et hétérotétramérique. La liaison de l’insuline à ses deux sousunités- α

extracellulaires induit un changement de conformation et une activation du site régulateur tyrosine

kinase intracellulaire des deux sousunités-ß transmembranaires. Il en résulte une

transautophosphorylation des résidus tyrosines permettant la propagation du signal par

phosphorylation de substrats endogènes jusqu’à la réponse cellulaire. Après liaison de l’insuline au RI,

il s’ensuit également une internalisation rapide (en quelques secondes) du complexe insuline-RI vers

les compartiments endosomaux précoces où l’insuline est dissociée du RI. Le RI est soit recyclé vers la

membrane plasmique pour réutilisation, soit dégradé dans les lysosomes.

Au cours de ma thèse de doctorat, il sera question d’étudier l’environnement du RI au cours de son

trafic entre la membrane plasmique et l’appareil endosomal. Une approche systématique s’appuyant

sur des réseaux d’interactions protéines-protéines permettra de décrire cette dynamique d’interactions

dans des fractions G/Es hépatiques de rats sous stimulation d’insuline. Nous pourrons ensuite étudier

les mécanismes de régulation du RI à partir de ses protéines partenaires endosomales, plus

particulièrement ATIC et de la tyrosine phosphatase putative PTPLAD1 avec des modèles animaux

(rats) et des cellules en culture aisni que leur impliquation dans le transport du glucose. Nous

vérifierons conjointement l’activité tyrosine phosphatase de PTPLAD1. Les effets

pathophysiologiques associés à l’endocytose du RI concluront nos travaux et seront mis en exergue

grâce à une étude comparative entre réseaux d’interactions moléculaires et maladies complexes dans

des fractions G/Es hépatiques.

Ma thèse de doctorat s’intègre à un vaste projet initié dans notre laboratoire, qui a permis d’identifier

par spectrométrie de masse une série de partenaires protéiques liés au RI internalisé dans des fractions

G/E hépatiques de rats. Parmi ceux-ci, on peut citer des protéines de trafic comme la sous-unité delta

des coatomers, des protéines de signalisation connues comme celles de la famille Grb, mais aussi une

enzyme métabolique ATIC (5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide transformylase/inosine

5’-monophosphate cyclphydrolase) dont le score mascot fut le plus élevé. Nous avons émis

l’hypothèse que ATIC, une enzyme limitante de la voie de synthèse de novo des purines était liée à la

53

régulation du RI. Des analyses biochimiques préliminaires à ma thèse de doctorat, ont montré

qu’ATIC était bel et bien associé au RI et non au récepteur de l’EGF immunoprécipités à partir de

fractions G/E. Elles décrivent une cinétique d’autophosphorylation in vitro du RI en présence d’ATP et

montrent que l’ajout d’ATIC purifié au RI immunoprécipité à partir de fractions G/E, stimule la

phosphorylation des résidus tyrosines de ce dernier dans une dynamique similaire aux effets du

bpV(Phen) (bis peroxovanadium 1,10-phenanthroline), un inhibiteur de tyrosine phosphatases

connues. ATIC est une enzyme métabolique de la voie de synthèse des purines de novo. Sa structure

cristallographique en complexe avec AICAR, son substrat naturel, telle que révélée par (Cheong et al.,

2004), montre l’existence d’un site d’arrimage pour les groupes phosphates d’AICAR phosphorylé en

ZMP au niveau de la boucle d’activation du domaine AICARFT. ATIC n’est donc pas une kinase

connue et l’existence de tyrosines phosphatases endosomales comme régulateurs de l’activité du RI et

de son trafic, a déjà été suggérée.

Nous posons donc comme hypothèse de travail que l’enzyme métabolique ATIC régulerait l’activité et

le trafic du RI en inhibant une tyrosine phosphatase, probablement PTPLAD1, la seule protéine

pouvant avoir une activité tyrosine phosphatase dans notre liste de partenaires du RI internalisé.

54

2. CHAPITRE 2 : La dernière enzyme de la voie de novo de biosynthèse des purines (ATIC) joue un rôle central dans la signalisation de l’insuline et le réseau golgi-endosomal

2.1. Résumé en Français

Contexte : Peu de temps après sa liaison dans les hépatocytes, l’insuline est internalisé avec son

récepteur de surface (RI) dans l’appareil endosomal. Cependant les mécanismes moléculaires

supportant la régulation du RI restent largement inconnus. Dans ce chapitre, nous caractérisons un

réseau d’interactions des protéines partenaires du RI dans des fractions golgi-endosomales (G/E)

hépatiques.

Résultats : Nous identifions par analyses bioinformatiques, une hétérogénéité fonctionnelle

substantielle dans l’environnement du RI internalisé, notamment avec la présence d’ATIC, une

enzyme limitante dans la voie de biosynthèse des purines de novo, et de PTPLAD1, une tyrosine

phosphatase putative. L’interactome du RI dans les dites fractions (IRGEN) connecte ATIC à

l’AMPK. Cet interactome est composé à 45% de variants communs héréditaires associés au diabète de

type 2. Nous montrons que PTPLAD1 et AMPK sont rapidement compartimentalisés à la membrane

plasmique et dans les fractions G/E après stimulation de l’insuline et qu’ATIC s’accumule tardivement

dans les G/Es. Une reconstitution in vitro et des délétions partielles par SiRNA d’ATIC et de

PTPLAD1 dans les cellules HEK293, nous montrent qu’ATIC et PTPLAD1 affectent la tyrosine

phosphorylation et l’endocytose du RI. Nous montrons également qu’une stimulation de l’insuline et

une délétion d’ATIC augmentent le niveau de phosphorylation de l’AMPK par sa thréonine-172 dans

les complexes du RI. L’internalisation du RI a été fortement réduite par une délétion partielle de

l’AMPKα2, alors qu’un traitement avec AICAR, substrat d’ATIC et activateur allostérique de

l’AMPK, augmentent l’endocytose du RI dans des cellules en cultures et dans le foie.

Conclusion: Nos résultats suggèrent la présence d’un mécanisme de signalisation sensible à la synthèse

des adénylates, au niveau d’ATP et aux états d’activation du RI en régulant l’autophosphorylation et

l’endocytose du RI.

55

2.2. Avant-propos du chapitre 2

Ce chapitre 2 a été soumis pour la première fois le 19 Décembre 2014 à la revue Molecular and

Cellular Proteomics. La version révisée a été envoyée le 11 Février 2015 et acceptée le 16 Février

2015 pour publication dans l’édition du 01 Avril 2015. Le Dr Robert Faure a agit comme

coordonnateur et acteur des principales tâches notamment le design, l’analyse des données et la

rédaction de l’article. J’ai pris activement part au design, à l’exécution des expériences biochimiques et

bioinformatiques ainsi qu’à la rédaction de l’article. J’ai été accompagné par Suzanne Fortier, Gabriel-

Collard Simard Isabelle Kelly, pour l’analyse des données de spectrométrie de masse et les expériences

biochimiques de laboratoire. Dr Christian Landry et Dr Sébastien Hébert ont participé au design, à

l’analyse des données et la rédaction de l’article.

56

The last enzyme of the de novo purine synthesis pathway ATIC plays a central role in insulin signalling and the Golgi/endosomes protein network.

Martial Boutchueng-Djidjou1, Gabriel Collard-Simard1, Suzanne Fortier1, Sébastien S. Hébert2, 3,

Isabelle Kelly3, 4, Christian R. Landry5, Robert L. Faure1, 3.

From 1Department of Pediatrics, Laboratory of Cellular Biology, 2Department of Psychiatry and

Neurosciences, 3Centre de Recherche du CHU de Québec, Centre-Mère-Enfant, 4Plateforme

Protéomique de l’Est du Québec, Université Laval. 5L’institut de Biologie Intégrative et des Système

(IBIS), PROTEO, Département de Biologie, Université Laval, Québec, QC, Canada.

Contact: [email protected]

Running title: The insulin receptor is regulated by ATIC, PTPLAD1 and AMPK.

Keywords: insulin receptor, tyrosine phosphorylation, protein interaction network, de novo purine

synthesis pathway, endocytosis.

Abbreviations: ATIC, 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide formyltransferase/IMP

cyclohydrolase; PTPLAD1, protein-tyrosine phosphatase-like A domain-containing protein 1; IMP,

inositol monophosphate; AMP, adenosine monophosphate; AMPK, AMP-activated protein kinase;

AICAR, 5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-b-D-ribofuranoside.

57

2.3. Abstract

Insulin is internalized with its cognate receptor into the endosomal apparatus rapidly after binding to

hepatocytes. We performed a bioinformatic screen of Golgi/endosome (G/E) hepatic protein fractions

and found that ATIC, which is a rate-limiting enzyme in the de novo purine biosynthesis pathway, and

PTPLAD1 are associated with IR internalisation. The IR interactome (IRGEN) connects ATIC to

AMPK within the G/E protein network (GEN). 45% of the IRGEN have common heritable variants

associated with type 2 diabetes, including ATIC and AMPK. We show that PTPLAD1 and AMPK are

rapidly compartmentalised within the plasma membrane (PM) and G/E fractions after insulin

stimulation and that ATIC later accumulates in the G/E fraction. Using an in vitro reconstitution

system and siRNA–mediated partial knockdown of ATIC and PTPLAD1 in HEK293 cells, we show

that both ATIC and PTPLAD1 affect IR tyrosine phosphorylation and endocytosis. We further show

that insulin stimulation and ATIC knockdown readily increase the level of AMPK-Thr172

phosphorylation in IR complexes. We observed that IR internalisation was markedly decreased after

AMPKα2 knockdown, and treatment with the ATIC substrate AICAR, which is an allosteric activator

of AMPK, increased IR endocytosis in cultured cells and in the liver. These results suggest the

presence of a signalling mechanism that senses adenylate synthesis, ATP levels and IR activation

states and that acts in regulating IR autophosphorylation and endocytosis.

58

2.4. Introduction

The insulin receptor (IR) (1, 2) activates its tyrosine kinase activity through cross-phosphorylation

upon insulin binding, which initiates subsequent signalling and metabolic events (3). The activated

complexes are internalized into the endosomal apparatus within seconds following insulin binding (4).

Some factors that govern IR endocytosis have been previously described. For instances topogenic

sequences in the juxtamembrane region (GPLY and NPEY) are necessary but not sufficient for rapid

endocytosis. The IR tyrosine kinase activity is necessary for the autophosphorylation and exposure of

the otherwise buried endocytosis sequences (for a review, see (5)). IR autophosphorylation is thought

to release a constraint that maintains IR on the microvilli and that allows free, mobile insulin-bound

IRs to reach specialised surfaces where endocytosis and signalling are allowed and initiated (6, 7). The

interaction with the actin cytoskeleton is an important element as IR compartmentalisation at the

microvilli on the surface of hepatocytes depends on its coupling with actin (8, 9). IR has also been

observed in caveolin-enriched hepatic plasma membrane domains that rapidly associate with the actin

cytoskeleton in response to insulin (10). By contrast with the EGF receptor (EGFR, a low recycling

receptor), the IR is a rapid recycling receptor in liver and this is important both for insulin signalling

and clearance (11, 12). The molecular mechanisms underlying IR regulation remain largely unknown.

Emerging evidence indicates that for coping with cellular and organismal needs the vesicular transport

of proteins and lipids to particular regions of the cell, requires plasma membrane and endosome-based

signalling devices that would coordinate membrane traffic in response to extracellular signals (13-16).

The physiological significance of trafficking and the molecular bases of such coordination have

received little attention. In the current work, we characterized an IR protein interaction network in

hepatic Golgi/endosomal membranes. We found substantial heterogeneity within the close

environment of the internalised IR complexes, with the presence of ATIC, a metabolic enzyme of the

de novo purine synthesis pathway.

The de novo purine synthesis pathway includes 10 sequential steps, beginning with phosphoribosyl

pyrophosphate and ending with IMP. Purines are the building blocks of DNA and RNA but are also

found in adenylates and are thus a source of ATP and cofactors for numerous metabolic and signalling

enzymes (17). ATIC, is the last enzyme in this pathway and is a cytosolic enzyme (64 kDa) that

includes a transformylase domain (residues 200-593), which transfers a formyl group to the AMP

59

analogue AICAR to produce the intermediate formyl-AICAR (FAICAR) and IMP (18). AICAR is an

efficient activator of the energy sensor AMPK (19) in a way that is similar to anti-diabetic drugs such

as metformin (20). ATIC is also a rate-limiting enzyme up-regulated by insulin in C2C12 mouse

mesenchymal cells; a 20% decrease in its activity results in a 50% decrease in AICAR-dependent

purine synthesis (21). Massive AICAR accumulation and urinary excretion have been observed in

children with only 40% of the normal level of ATIC activity (22). We show here the presence of

mechanism involving an ATIC protein network and the metabolite AICAR that acts in regulating IR

autophosphorylation and endocytosis.

60

2.5. Experimental procedures

Reagents and antibodies. Porcine insulin (I5523) was obtained from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO,

USA). Mouse receptor-grade EGF was purchased from BD Biosciences (Bedford, MA, USA). The

following antibodies were used: anti-phosphotyrosine (PY20, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA);

anti-PTPLAD1 (ab57143, Abcam, Cambridge MA, USA); anti-AMPKα and anti-phospho-AMPK

(Threonine-172) (#2532 and #2531, Cell Signaling Technology); anti-Akt1/3 and anti-phospho-Akt

(Ser473) (#9271 and #9272, Cell Signaling Solutions, Lake Placid, NY, USA); and anti-ATIC

(#410100, Zymed Laboratories, San Francisco, CA, USA). The anti-Glut 2 antibody, which was

directed against the epitope that corresponds to amino acids 32-98 in the human Glut2 extracellular

domain (sc-9117: H-67), and the anti-Kif5A (sc-25734: H-75), the EGFR (sc-03) and the IR β-subunit

(Sc-711) antibodies were obtained from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). The anti-

beta actin antibody was obtained from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Peroxidase-conjugated

secondary antibodies were used (1:10,000, Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA,

USA). The antibody signals were analysed using an ImageQuant LAS 4000 Imager (GE Healthcare

Biosciences). AICA-Riboside was obtained from Calbiochem (Cat # 123040). All other chemicals

were of analytical grade and were purchased from Fisher Scientific (Sainte-Foy, Québec) or from

Roche Laboratories (Laval, Québec).

Hepatic fractions. Harlan Sprague-Dawley rats (female 120-140 g b.w.) were purchased from Charles

River Ltd. (St. Constant, Québec, Canada) and were maintained under standard laboratory conditions

with food and water available ad libitum, except that the food was removed 18 h before the

experiments. All animal procedures were approved by the CPA-CRCHUQ (certificate 055-3). The G/E

and the PM fractions were prepared as previously described (4, 23). The protein content of each

fraction was determined using a modified Bradford method, with bovine serum albumin as the

standard (Bio-Rad protein assay, Bio-Rad, Hercules, CA, USA). The G/E fraction was also

characterised using an MS-based proteomic analysis of the major proteins (24) and enrichment here

against the entire rodent proteome (online Fig. 1).

Database and network analyses. A list of proteins (666 unique proteins) from the G/E fraction that

we identified in (24) was used to construct the mouse G/E network (GEN), which was generated from

functional and physical protein-protein interaction data. The data were obtained using the STRING

61

database (filter set at 0.700) (25). Additional physical interactions were provided by the Biological

General Repository for Interaction Datasets (BioGRID) (26). Protein interactions were visualised on

the Cytoscape platform (Version 2.8.2) (27). Self-loops and duplicated edges were removed before the

analysis using the “network analyzer” plugin (28). Cellular component grouping was performed

following a gene ontology analysis using the Biological Networks Gene Ontology tool (BINGO

version 2.4) (29). We used a cluster analysis to determine the dense regions of highly interconnected

proteins with confident functional relations with the receptor complex (IRGEN) to analyse the

environment that was most similar to that of the internalised IR. We used this method with the affinity

propagation algorithm implemented in Cytoscape software using clusterMaker plugin (30).

Identification of internalised IR partners. The G/E fractions were solubilised and subjected to

immunoprecipitation and in-gel analysis procedures using an anti-IR antibody (31).

Liquid chromatography-multiple reaction monitoring analysis (LC-MRM). Peptides (0.5 mg/µl)

were analysed on an ABSciex 5500 QTRAP™ hybrid triple quadrupole/linear ion trap mass

spectrometer equipped with an Eksigent nanoLC AS2 cHiPLC nanoflex controlled by Analyst 1.6™

software and with a nanospray ionisation source. The quantification value was obtained for each

peptide by comparing the peak area of the endogenous peptide with the peak area of the labelled

peptide. The data were averaged at the replicate level and the peptide level to obtain the protein

quantification values (online Table 1).

Purified synthetic peptides. Purified synthetic peptides used for LC-MRM analysis containing

[13C6]Lys and [13C6]Arg were obtained from Pierce (Rockford, IL, USA). A solution containing a mix

of all the peptides was prepared with concentrations ranging from 0.1 fmol to 20 pmol and used to

reconstitute the samples after tryptic digestion for relative quantification (online Table 1).

Endosomal IR autophosphorylation in vitro. IR endosomal autophosphorylation was measured as

previously reported (4) with the following modifications. Freshly prepared G/E membranes isolated at

their IR concentration time-peak (100 µg of protein; 2 min after insulin injection; 1.5 µg/100 g b.w.)

were suspended in the cell-free system, maintaining the structural integrity of the endosomes. The IR

62

autophosphorylation reaction was initiated at 37°C by adding ATP to a final concentration of 1 mM.

Where indicated, ATIC (20 ng of protein) that was immunoaffinity-purified from hepatic cytosol (anti-

ATIC clone F38P7H9, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) or fresh cytosol (diluted 1/10) was pre-

incubated for 15 min on ice before beginning the reaction. After stopping the reaction at the indicated

times, membranes were solubilised, IR was immunoprecipitated (insulin Rb (C19): sc-711, Santa Cruz

Biotechnology Inc., CA, USA), and a phosphotyrosine content analysis was performed using western

blotting. EGF (1.0 µg/100 g b.w.; receptor grade, BD Biosciences, Bedford, MA, USA) was injected

where indicated (4). EGFR was immunoprecipitated (EGFR [1005]: sc-03, Santa Cruz Biotechnology,

CA, USA) following autophosphorylation and submitted to a western blot analysis.

siRNA knockdown in HEK293 cells. HEK293 cells express IR and allow measurements of insulin-

mediated endocytosis (31). We used the following predesigned human sequences to deplete ATIC,

PTPLAD1 and AMPKα2 in HEK293 cells:

ATIC: CAGUCUAACUCUGUGUGCUACGCCA, NM_004044.5_stealth_1459; PTPLAD1:

GACCCAGAGGCAGGUAAAACAUUACA, NM_016395_stealth_367; and AMPKa2:

GAAGUCAUCUCAGGAGAUUGUAUG, NM_006252_stealth_618 (Invitrogen, Life Technologies

Corporation, Frederick, MD, USA). Cells were cultivated in DMEM high-glucose medium with 10%

foetal bovine serum without antibiotics (Hyclone) and were transfected using Lipofectamine™ (Life

Technologies Corporation, Frederick, MD, USA) for 48 or 72 h and then subjected to the described

analysis. The surface trypsinisation assay was performed as previously reported (32), except that the

α2β2 IR tetramer was detected by western blotting under non-denaturing conditions (33) using 5%

resolving gels.

63

2.6. Results

Bioinformatics and proteomic screens identify ATIC and PTPLAD1 in internalised IR

complexes.

The Golgi/endosome protein interaction network (GEN) was reconstituted from the previous G/E

proteome of major proteins (24) and from protein-protein interaction data. This network is

characterised by a general vesicle-like topology, with lumenal cargo (lipoproteins, albumin, and

proteases) and peripheral membrane elements that are involved in trafficking (SNAREs), cytoskeleton

proteins, a lumenal acidification system (vATPase complexes) and other endosome and Golgi

elements (Fig. 1A). However, the GEN provides limited information about the interaction partners of

IR. Thus, we identified IR interaction partners during insulin-mediated endocytosis using a mass

spectrometry (MS)-based screening approach.

Following intravenous insulin injection, IR complexes accumulate in endosomes in the G/E fraction

(4). We identified the following five primary proteins that interacted with internalized IR complexes

15 min after insulin stimulation: Grb14, ATIC, PTPLAD1, delta-COP and PLVAP (Table 1, online

Fig. 2 and online Table 2). Grb14, is a IR adapter that binds to tyrosine phosphorylation sites in the

activation loop (34) and inhibits IR tyrosine kinase activity in cell based assays (35, 36). This adapter

protein was previously identified as a common heritable variant in type 2 diabetes (37). The other

candidates have not been previously associated with IR. The highest probability identification score

was attributed to ATIC, which is a cytosolic protein that has not been previously reported to interact

with IR. ATIC forms a complex with its substrate AICAR via the phosphate-binding pocket of the

IMP cyclohydrolase (IMPCH) domain (residues 1-599) (38). The functions of PTPLAD1 (also called

B-ind1 or PTAD1) are unknown. We recapitulated the presence of ATIC and PTPLAD1 15 min after

insulin stimulation and performed quantitative MS with the internalised IR as a reference (LC-MRM;

Online Fig. 3 and Online Table 1). Other identified proteins, such as the non-clathrin coat proteins

(delta-COP) and plasmalemma vesicle-associated protein (PLVAP), which belongs to caveolae stromal

and fenestral diaphragms (Table 1), were not further characterized here.

We included ATIC and PTPLAD1 in the GEN and analysed their associations. Because AICAR is a

potent allosteric AMPK activator (39), AMPK was also included in the analysis. The IR subnetwork

64

(IRGEN) indicated a connection with Kif5A and the microtubule network through AMPK (Prkaa1).

Kif5A also possesses two AMPK-dependent phosphorylation sites in the cargo-binding kinesin light

chain KCL2, regulating the association of Kif5A with PI3K (40). PTPLAD1 also interacts with the

actin network through Rac1 (Fig. 1B and online Table 3). We verified the presence of proteins

corresponding to validated type 2 diabetes common variants in the IRGEN to estimate the

pathophysiological importance of the IRGEN. We found that 45% of the IRGEN proteins (identified

with squares, representing 107 genes) are associated with type 2 diabetes (41-44). A 57% enrichment

was calculated for proteins closer to IR (yellow squares), including IR, Grb14, ATIC, AMPK, Kif5A

and GLUT2 (Fig. 1B and online Table 4). This enrichment indicates that these interactions are of

mechanistic and pathophysiological importance.

ATIC, PTPLAD1 and AMPK compartmentalisation in vivo in response to insulin

We confirmed the importance of the IRGEN by measuring the responses of ATIC, PTPLAD1 and

AMPK to acute insulin stimulation. We conducted these studies with doses of injected insulin which

resulted in 50% rat liver IR occupancy (1.5 µg/100 g body weight [b.w.]) and saturation (15 µg/100 g

b.w.) of receptors (4). Rats were killed at different times after insulin injection, PM and G/E cell

fractions were prepared and directly submitted to analysis. The time-dependent changes of PM and

G/E IR as well as ATIC, PTPLAD1 and AMPK content relative to control fractions were determined.

Following insulin injection, there was a rapid and marked increase in G/E IR concentration which

peaked at 2-5 min postinjection at about 10-fold-over control for both doses. At 15 min, the G/E IR

concentration returned to near control level for the non-saturating dose of insulin but remained at 6-

fold above control for the saturating dose. IR autophosphorylation followed a similar profile (Fig. 2, B

and D). There were corresponding rapid decreases in PM receptor concentration with an initial

maximal decline by 2-5 min to approximately 60-80 % of control. At 15 min post-injection, the PM IR

concentration returned to control value for the non-saturating dose. The IR was rapidly (30 sec)

autophosphorylated in the PM fractions for both doses and then rapidly declined as internalization

proceeded (4) (Fig. 2A and C).

ATIC was barely detected in both the PM and G/E fractions. There was however a rapid 2-3-fold

increase in PM ATIC concentration for the saturating dose (Fig. 2C). The G/E ATIC concentration

65

increased to 1.5-3 fold over control for both doses (Fig. 2B and D). This was consistent with the results

of the quantitative MS analysis (online Figs. 2 and 3).

PTPLAD1 was also barely detected in the PM and G/E fractions. However, coincident with IR

autophosphorylation, there was a rapid and marked increase in PM PTPLAD1 concentration to about

5-7 fold over control for both doses. A 3-fold increase in G/E PTPLAD1 concentration was also

observed in response to injection with the largest insulin dose (Fig. 2D), which is also consistent with

the quantitative MS results (online Fig. 3).

AMPK was detected in both fractions. There was a rapid and marked increase in PM AMPK

concentration that peaked at 2-15 min postinjection at about 6-fold-over control for the saturating dose.

AMPK phosphorylation followed the same profile. (Fig. 2 C). Following insulin injection, there was

also a rapid and marked increase in G/E AMPK concentration that peaked at 2 min postinjection at

about 4-fold-over control for both doses. At 15 min, G/E AMPK concentration returned to near control

level for both doses. AMPK phosphorylation followed a similar profile but remained at 4-fold above

control for the saturating dose (Fig. 2, B and D).

There was a rapid and marked increase in PM Akt concentration and phosphorylation that peaked at 30

sec postinjection at about 6-fold-over control for both doses. Following insulin injection, there was

also a rapid and marked increase in G/E Akt phosphorylation which peaked at 2 min postinjection at

about 4-fold-over control for both doses. At 15 min, G/E Akt phosphorylation returned to near control

level for the lower insulin dose.

The presence of ATIC, PTPLAD1 and AMPK, but not Akt, which is also stimulated by insulin, was

confirmed in the IR immunocomplexes prepared following the injection of the 1.5 µg/100 g b.w. dose

(Fig. 2E).

Thus the results showed the presence of an insulin-dependent response for ATIC, PTPLAD1 and

AMPK in vivo. They also confirmed their association with the IR.

66

ATIC increases IR autophosphorylation in vitro

We sought to assess the process of IR autophosphorylation in endosomes directly. Therefore, we used

a previously characterised reconstitution system where endosomes isolated 2 min following the

injection of insulin were incubated in the presence of purified ATIC. Fig.3A depicts the time-course of

IR autophosphorylation. IR autophosphorylation reached a maximum at 2 min following the addition

of ATP and subsequently declined to 60 % of the maximal value by 15 min of incubation. In the

presence of the protein tyrosine phosphatase (PTP) inhibitor bpV(phen) (pV), IR autophosphorylation

was augmented to 6-fold above that of control incubations as a result of the inhibition of the

endosomal PTP activity (45). In the presence of ATIC, IR autophosphorylation reached a maximum at

2 min following the addition of ATP with no decline by 15 min and 30 min of incubation (Fig. 3A).

The IR/ATIC association was recapitulated using fresh cytosol (Fig. 3B). However, ATIC was not

detected when IR was replaced with EGFR (Fig. 3B, left; G/E endosomes isolated at the peak of

EGFR accumulation, 15 min post-EGF injection, 1.0 µg/100 g b.w. representing approximately the

same number of sites) (45). Thus, the results show that IR autophosphorylation is favoured by the

addition of ATIC.

ATIC and PTPLAD1 knockdown affects IR autophosphorylation in HEK293 cells

To confirm whether ATIC and the candidate partner PTPLAD1 regulate IR autophosphorylation in a

cellular context, we transfected HEK293 cells with siRNA oligonucleotides corresponding to the

human ATIC or PTPLAD1 sequences and analyzed IR autophosphorylation. The total ATIC levels

were reduced by ~65% after 48 (Fig. 4A) and 72 h (online Fig. 4) of transfection, and PTPLAD1 levels

were reduced by ~85% (Fig. 4A). The typical flat, square morphology of the cells was unchanged,

except after 72 h of transfection with PTPLAD1 siRNA, at which point most of the cells were round

and loosely attached to the substratum. ATIC depletion (48 h post-transfection) reduced IR tyrosine

phosphorylation by 40% 5 min after insulin stimulation (Fig. 4A, B). In contrast, PTPLAD1 depletion

increased IR tyrosine phosphorylation (Fig. 4A, C). Akt phosphorylation followed also a similar

profile (Fig. 4A). The phosphorylated AMPK-Thr172 readily co-precipitated with IR after ATIC

depletion, which was observed before and after insulin stimulation (Fig. 4B). Of further interest, the

accumulation of phosphorylated AMPK-Thr172 in whole cell extracts was not detected 48 h after

67

transfection with ATIC siRNA (Fig. 4A) but was readily detected 72 h after transfection and was not

fully restored by insulin (online Fig. 4), consistent with AICAR accumulation as a function of time

after ATIC depletion (21). Hence, ATIC and PTPLAD1 indeed affect IR tyrosine phosphorylation,

then ATIC downregulation also leads to efficient AMPK-Thr172 phosphorylation and to its rapid

compartmentalisation in IR complexes. In addition, ATIC depletion also resulted in the presence of

KiF5A in IR complexes (Fig. 4B), which is consistent with the link between ATIC and Kif5A, through

AMPK, that was suggested by the IRGEN (Fig. 1B). Of further interest, PTPLAD1 depletion and

insulin stimulation resulted in the marked presence of actin in the IR complexes (Fig. 4C).

ATIC, PTPLAD1 and AMPK knockdown affects IR internalisation in HEK293 cells

Next, we assessed the relationship between IR endocytosis and ATIC and PTPLAD1 in HEK293 cells.

We used an IR (α2β2) protection assay in which cells were surface-trypsinised before and after insulin-

mediated endocytosis (32). α2β2 IR protection peaked 15 min after insulin stimulation and then

decreased at 30 min in control cells (Fig. 5A). Both ATIC and PTPLAD1 knockdown increased

markedly IR internalisation; greater accumulation was observed 5 min after insulin stimulation, and

the IR levels then declined to basal levels after 30 min (Fig. 5A). As a control, we blotted for Glut2,

which is primarily inside the cells and translocates to the cell surface in an insulin-dependent manner

under high glucose conditions (46). Thus, Glut2 was used in the present study as a control to confirm

the efficiency of the cell surface protection assay. The results showed that the intracellular Glut2 pool

was indeed protected and that this pool rapidly disappeared after insulin stimulation (Fig. 5A). We

noted that ATIC depletion delayed the insulin response of Glut2 (Fig. 5A). The opposite effect was

observed for PTPLAD1 depletion; a lower Glut2 signal was also observed under basal (no insulin)

conditions (Fig. 5A), indicating that ATIC and PTPLAD1 influence the insulin response with an

inverse flux from an intracellular compartment to the cell surface. AICAR was reported to affect Glut2

translocation through Akt phosphorylation at its C-terminal Ser-473 by AMPK (47). As the ATIC

depletion decreases the insulin-dependent Akt phosphorylation (Fig. 4A), this should explain the effect

of ATIC downregulation on Glut2 translocation.

We sought to determine whether AICAR increases IR endocytosis and Glut2 transportation to the cell

surface. Coincident with AMPK phosphorylation, a large increase in IR internalisation was observed

68

after pre-incubating the cells with AICAR, despite a 50% decrease in AICAR-induced IR expression

(Fig. 5B). We cannot explain this AICAR-dependent reduction in IR expression; however, similar

effects were previously observed in hepatoma cells (48). Glut2 disappeared after AICAR stimulation,

even under basal (time 0) conditions (Fig. 5B).

The AMPKα2 catalytic isoform is the primary contributor to AMPK activation, even during AICAR

stimulation, which is not compensated for by the AMPKα1 isoform (for a review, see (49)). Thus, we

partially depleted AMPKα2 to determine whether AMPKα2 could inversely affect IR internalisation

compared with ATIC. The results showed that AMPKα2 knockdown decreased IR internalisation (Fig.

5C). Therefore, ATIC, PTPLAD1 and AMPK are effectors of IR internalisation in HEK293 cells.

IR internalisation after AICAR stimulation in the rat liver

A key first step in determining the importance of ATIC is to verify whether AICAR has the capacity to

affect the kinetics of IR internalisation in vivo. Fig. 6 depicts the time course for IR augmentation in

the G/E versus PM fractions after the acute administration of AICAR 15 min before insulin injections.

Under these conditions, we found that the kinetic of IR endocytosis was perturbed by AICAR with a

significant (P<0.001, n=3, two-tailed unpaired Student's t-tests) 50% decrease in IR level observed in

the PM (Fig. 6A). A coincident increase in IR internalisation was observed in the G/E fraction under

basal conditions (P<0.001, n=3, two-tailed unpaired Student's t-tests) with no further increase 2 min

after insulin injection and with a similar area under the curve (Fig. 6B). Consistent with the results

obtained in HEK293 cells, Glut2 rapidly appeared in the PM fraction after insulin injection (Fig. 6A).

However, Glut2 was not present in the G/E fraction (Fig. 6B), supporting the idea that, as for

PTPLAD1, Glut2 is in a rapidly insulin-responsive intracellular compartment that is not present in the

G/E fraction. Notably, the insulin-dependent appearance of Glut2 along with IR in the G/E fraction,

which was almost abolished by AICAR, is consistent with a previously described Glut2 pool that is

physically associated with IR in hepatic cells (50) (Fig. 6B). Hence, the results showed that AICAR

markedly affects the IR internalisation process under acute conditions, as well as the rapid appearance

of Glut2 at the cell surface in vivo.

69

2.7. Discussion

The results reported in this study reveal the presence of an ATIC network that minimally contains

proteins PTPLAD1 and AMPK and that regulate IR tyrosine phosphorylation and endocytosis (Fig. 7).

The marked increase in IR internalisation that was observed at early and later time points after

PTPLAD1 knockdown in HEK293 cells is consistent with higher IR tyrosine kinase activity (5, 51).

This perturbation may be relevant to local changes in the actin cytoskeleton that indirectly favour IR

autophosphorylation (7). In support of this possibility, actin was recruited into IR complexes in an

insulin- and PTPLAD1-dependent manner (Fig. 4C). In addition, PTPLAD1 action was also related to

Rac1-mediated events (52). Alternatively, or in addition, PTPLAD1 may be a bona fide PTP as

strongly suggested in Fig.3A. We were unable to detect any consistent enzymatic activity against the

artificial substrate para-nitrophenyl phosphate using bacterially expressed full-length PTPLAD1 or the

well-positioned soluble cytosolic loop containing a conserved C(X)5K motif

(FRYSFYMLTCIDMDWKVLTWLRY, 257-279). We previously showed however that a IR tyrosine

dephosphorylating activity is abolished following the addition of Triton-X100 to isolated endosomes

suggesting that an intact membrane microenvironment was critical (45). The topology of PTPLAD1 (a

multipass transmembrane protein) is compatible with such a behavior. Also, the rapid insulin-

dependant compartmentalization of PTPLAD1 at the cell surface (Fig. 2A, C) may explain original

observations in rat hepatic cells where IR tyrosine dephosphorylation was shown to occur

predominantly in endosomes and not at the cell surface following bpV(phen) administration (53). At

this point, the results showed that PTPLAD1 is a protein that is highly responsive to insulin in vivo and

in cultured cells. Taguwa et al. reported that PTPLAD1 localises to endoplasmic reticulum-derived

vesicles that display fast movement (54), which may explain the rapid PTPLAD1 accumulation in the

PM fraction following insulin stimulation. Thus, similar to Glut2, PTPLAD1 is located in a membrane

compartments with flotation properties that differ from those of G/E membranes (devoid of

lipoproteins). This suggests that an efficient use of fast-moving insulin-responsive shuttles occurs, with

the same insulin input being able to activate IR autophosphorylation and PTPLAD1

compartmentalization, as well as to stimulate glucose entry through Glut2.

ATIC deficiency also increased insulin-mediated endocytosis (Fig. 5A). This result was the opposite of

our original expectation of lower IR tyrosine kinase activity. ATIC is a rate-limiting enzyme, and

70

AICAR accumulates over time under conditions of lower ATIC expression (21, 22). AICAR is a

nucleoside that is converted inside the cell to its mono-phosphorylated form, ZMP (5-amino-4-

imidazolecarboxamide ribotide), by adenylate kinase; thus, AICAR behaves as an AMP analogue that

allosterically activates AMPK (19). AMPK activation results in the phosphorylation of the cargo-

binding kinesin light chain, KCL2, of Kif5 and in the disruption of Kif5 association with PI3K and Akt

(40). The insulin-dependent presence of phosphorylated AMPK and Kif5A in IR complexes (Fig. 4B)

argues for the involvement of the AMPK/kinesin/microtubule axes in IR trafficking. PI3K itself is

necessary for early and late endocytosis events (55, 56). Kif5 is involved in the Rab5-dependent

movement of vesicles towards either the plus or the minus ends of microtubules (56). Thus,

compartmentalised AMPK has a wide range of actions during the early and late stages of endocytic

trafficking. The mechanism of AMPK localisation within the IR environment has yet to be

characterised but may be related to the recently described large hydrophobic pocket at the

carbohydrate-binding domain/kinase interface (57).

ATIC is the only enzyme involved in the de novo synthesis of purine nucleotides that is bifunctional in

every organism studied thus far (18). This apparent evolutionary conservation raised the question of

whether a functional advantage to this structural arrangement may exist because substrate channelling

is not used by ATIC (58). Another possible advantage of the bifunctionality of ATIC might be more

structural in nature. Hence, ATIC exists in a monomer/dimer equilibrium in solution (59). The crystal

structure of ATIC has been depicted with a considerable dimer interface for a protein of its size,

burying 4929 Angstroms per monomer, of which the IMPCH domain makes up 38% (18, 60). With

such a large percentage of the protein contributing to the interface, the physical association of these

two activities on the same polypeptide may help to maintain the homodimeric or multimeric

organisation of the protein.

Insulin-mediated endocytosis is followed by insulin dissociation from IR at the acidic lumenal pH of

hepatic endosomes and by free insulin degradation by proteases. A high rate of recycling of the free

and tyrosine-dephosphorylated IR is important because the liver is a site for insulin clearance,

removing 50-80% of insulin during portal passages (for a review see (12)). A deficiency in insulin-

degrading enzyme (IDE), which has also been described as a cell surface protein (61), results in a

marked insulin degradation deficit in mouse liver, causing hyperinsulinemia and glucose intolerance

71

(62, 63). By having the capacity in the same time to sense ATP levels and synthesis, and to control IR

autophosphorylation and endocytosis, the ATIC node may explain mechanistically the perceived

promiscuity that exists between insulin resistance and clearance and thus the difficulty to define the

primary mechanism for type 2 diabetes (64, 65).

In conclusion, the connection between IR and ATIC support recent observations indicating that

cellular signalling systems are not organised in a linear fashion but rather rely on densely connected

protein interaction networks (66). The elevated number of common heritable variants associated with

type 2 diabetes in the actual IRGEN (Fig. 1B and online Table 4) favours the idea that the observed

confusing genetic heterogeneity (37, 67-69) converges however towards few unanticipated cell biology

mechanisms (70, 71).

2.8. Supplemental data

Four figures and 3 tables can be found online. Online Fig. 1 depicts the protein enrichment analysis of

the G/E fraction, which was calculated relative to the whole mouse proteome (see also Methods).

Online Fig. 2 depicts the IR immunoprecipitation profiles from G/E fractions prepared 15 min after

insulin injection. Online Table 1 is a list of the peptides and their MRM transitions, which were used

for the relative quantification in online Fig. 3. Online Table 2 presents the raw data from the mass

spectrometry report related to online Fig. 2. Online Fig. 3 depicts the kinetics of IR, ATIC and

PTPLAD1 accumulation in the G/E fractions after insulin injection, as quantified by LC-MRM. Online

Fig. 4 depicts the increased AMPK phosphorylation in whole cell extracts of HEK293 cells 72 h after

transfection with the ATIC siRNA. Online Table 3 is the list of the IRGEN proteins. Online Table 4 is

a list of the common gene variants that are associated with type 2 diabetes and that are present in the

IRGEN.

2.9. Acknowledgments

This work was supported by the National Research Sciences and Engineering Council of Canada (RF,

NSERC Discovery Grant: 155751). MBD holds a scholarship from the Foundation of Stars. GCM

holds a scholarship from the NSERC. CRL is a FRQ-S Junior II investigator and is funded by CIHR

Grants GMX-324265 and GMX-299432. SSH is a FRQ-S Junior I investigator. We also acknowledge

72

Guillaume Diss for his assistance with the bioinformatic analysis. We thank Dr Sabine Elowe for the

critical reading of the manuscript.

Authors’ contributions MBD performed and analysed most of the experiments in this work and wrote

the paper. GCS, IK and SF performed experiments and analysed data. SSH designed experiments and

analysed data. CRL designed analysis and contributed to the paper. RLF designed experiments,

contributed to the paper and led the research program.

73

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77

2.11. Tables

1. Mass spectrometry analysis of internalised IR complexes in the liver. Protein name Mass

(Dalton) Accession number

Sequence covered

(%)

Peptide (n)

Mascot score

Function

Bifunctional purine biosynthesis protein PURH (ATIC)

64681 Q6IN16 33 26 459 Catalyses the final step of the de novo purine s pathway that produces IMP/AICAR transformylase.

Growth factor receptor bound protein 14 (Grb14)

61181 O88900 17 11 115 Interacts with the cytoplasmic domain of the autophosphorylated insulin receptor.

Protein-tyrosine phosphatase-like A domain-containing protein 1 (PTPLAD1)

43132.8 Q8K2C9 9 32 89.2 Transmembrane protein in the ER. Putative protein-tyrosine phosphatase.

Coatomer subunit delta

57637 Q5XJY5 8 5 62 Reversibly associates with non-clathrin-coated vesicles.

Plasmalemma vesicle-associated protein

50572 Q9WV78 6 3 49 Involved in the formation of stromal and fenestral diaphragms of caveolae.

Golgi/endosome fractions were isolated after insulin stimulation. The membranes were solubilised,

and IR was immunoprecipitated. The proteins were separated and submitted to LC/MS/MS analysis

(online Fig. 2 and online Table 2).

78

2. Suplemental table 2.1

Protein/Peptide Q1 (charge) Q3 (type, charge)

P15127_IR TIDSVTSAQELR 660.3 (+2) 804.4 (2y7, +1) TVNESASLR 488.8 (+2) 776.4 (2y7, +1) O35567_ATIC NLASLGLSLVASGGTAK 779.9 (+2) 890.5 (2y10, +1) D4ABI7_PTPLAD-1 QVNITVQK 465.3 (+2) 588.4 (2y5, +1) LESEGSPETLTNLK 759.4 (+2) 915.5 (2y8, +1)

Peptides and MRM Transitions used for relative quantification

79

2.12. Figures and legends

Fig. 1. Construction of the Golgi/endosome network (GEN) and of the IR subnetwork (IRGEN).

A, A set of 666 proteins from the G/E fraction (24) were grouped and linked according to their

functional and molecular associations; circles correspond to proteins. A link is placed between proteins

if a functional or physical association exists, thus forming the GEN. The color corresponds to the

cellular component categorization, as calculated by the Gene Ontology plugin Bingo. B, Projection of

IR within the GEN (IRGEN). The colors correspond to the functional class to which the associated

protein belongs. Yellow represents the IR and the associated proteins (proteins in magnified fonts were

80

identified in the present study). The width of a link is proportional to the distance from IR. Squares

correspond to proteins for which the gene was associated with type 2 diabetes. In the IRGEN, 107

genes (45% of the IRGEN) are associated with type 2 diabetes (supplemental Table 4).

82

Fig. 2. Kinetics of the localisation of IR, ATIC, PTPLAD1, and AMPK in the plasma membrane

(PM) and endosome (G/E) fractions. Rats were injected with the noted insulin doses via the jugular

vein. The PM A, C, and G/E B, D, fractions were prepared from two livers each time. Time 0

corresponds to buffer alone with immediate sacrifice of the animals. Membranes (70 µg proteins) were

subjected to immunoblot analysis with the indicated antibody. The relative protein content was

determined by expressing all of the densitometric data as a percentage of their levels in the fractions at

time 0. The autoradiograms (left) depict data from a typical experiment with each dose of insulin. Each

point on the progress curve (right) is the mean ± s.d. of three to five separate experiments (*p < 0.01;

two-tailed unpaired Student's t-tests). E, IR was immunoprecipitated from solubilized (200 µg

proteins) PM (left) and G/E (right) fractions as described under Methods. The immunoprecipitated

proteins were blotted and incubated with antibodies against IR (95 kDa β-subunit), phosphotyrosine

(PY-20, IR tyrosine phosphorylation, PY-95 kDa), AMPK, AKT, ATIC, and PTPLAD1.

83

Fig. 3. Time course of IR autophosphorylation in isolated endosomes incubated in the presence

of purified ATIC. Endosomes (G/E) were prepared at 2 min after insulin injection (1.5 µg/100 g b.w.)

or 15 min after EGF injection (1.0 µg/100 g b.w.), corresponding to the time of peak kinase

accumulation. The intact membranes were incubated at 37 °C in a buffer mimicking the intracellular

milieu in the presence of ATP and in the presence or absence of the PTP inhibitor bpV(phen) (pV) or

immunopurified ATIC (100 ng, 5 min preincubation on ice before adding ATP) for the indicated

times. A, Left panel: IR immunoprecipitation. IR was detected using an anti-β subunit antibody. IR

autophosphorylation (PY 95 kDa) was measured using an antiphosphotyrosine antibody (PY20). The

presence of ATIC was verified using an anti-ATIC antibody (portions of the same membrane,

detection representing ∼2% or less of the total fraction). Right panel: IR β-subunit tyrosine

phosphorylation (PY 95 kDa) densitometry, expressed as the proportion of the control signal

(ATIC/minus ATIC). The values shown are the means±s.d. (*p < 0.001; **p < 0.05, n = 5, two-tailed

unpaired Student's t-tests). B, The experiments were recapitulated with the presence of cytosol instead

of purified ATIC. EGFR or IR-loaded endosomes were incubated for 5 min in the presence or absence

of cytosol from fresh liver samples (diluted 1/10, portions of the same membrane; three experiments).

84

Fig. 4. ATIC, PTPLAD1 and AMPK bind to IR in cultured cells. ATIC and PTPLAD1 knockdown

affects the tyrosine phosphorylation of IR, and ATIC affects the phosphorylation of AMPK. A,

HEK293 cells were transfected for 48 or 72 h with ATIC or PTPLAD1 siRNAs. The cells were

preincubated in a serum-free medium for 2 h and stimulated for the indicated times with insulin (35

nm). Immunoblots (25 µg protein extracts) show the levels of IR, PY-95 kDa, PTPLAD1, ATIC,

AMPK, pAMPK-Thr172, AKT, pAKT-Ser473, and actin in the cells that were transfected with control

(SCR: scrambled 48 h), ATIC and PTPLAD1 siRNAs. The salient 5 min time point for pAKT-Ser473

and PY-95Kda (lower panel) is the mean ± s.d. of three experiments (*p < 0.01; two-tailed unpaired

Student's t-tests). B, IR immunoprecipitation: After transfection with ATIC siRNA, the cells were

85

incubated in serum-free medium for 2 h and stimulated for 15 min with vehicle (−) or insulin (+, 48 h

post-transfection). The tyrosine phosphorylation of the IR β-subunit was measured using an

antiphosphotyrosine (PY20) antibody. The presence of AMPK and pAMPK-Thr172 was verified using

portions of the same membrane (three experiments). C, IR immunoprecipitations: After transfection

with PTPLAD1 siRNA, the cells were incubated in serum-free medium for 2 h and stimulated for 15

min with vehicle (−) or insulin (+, 48 h post-transfection). The tyrosine phosphorylation of the IR β-

subunit (PY 95 kDa) and the actin (ACTB) levels were measured using antibeta actin and PY20

antibodies (portions of the same membrane; three experiments).

86

Fig. 5. ATIC or PTPLAD1 knockdown in HEK293 cells increases IR internalisation, and AMPK

knockdown decreases IR internalisation. A, HEK293 cells were transfected for 48 h with ATIC or

PTPLAD1 siRNA. The cells were preincubated in serum-free medium for 2 h and stimulated with

insulin (5 nm). The cells were trypsinized at 4 °C before lysis. The immunoblots (50 µg protein

extract) show the IR tetramer (α2β2; 5% resolving gels, no heat, anti-β subunit antibody). PTPLAD1,

87

ATIC, Glut2 (epitope corresponding to amino acids 32–98 in the human Glut2 extracellular domain),

and actin were resolved on denaturing gels (resolving gels 7.5%). B, HEK293 cells were preincubated

at 37 °C in serum-free medium for 2 h and with AICAR for 15 min before insulin stimulation for the

indicated time. The cells were then trypsinized before lysis. The immunoblots (50 µg protein extract)

show the IR tetramer (α2β2), PTPLAD1, ATIC, Glut2, and actin. Glut2-total was from control

nontrypsinized cells that were submitted to the cell lysis, denaturing electrophoresis and

immunoblotting. The values for α2β2 shown in the right panel were corrected according to the total IR

signals obtained in the presence of AICAR. C, HEK293 cells were transfected for 48 h with AMPKα2

siRNA. The cells were preincubated in serum-free medium for 2 h and stimulated with insulin. At the

indicated time, the cells were trypsinized before lysis. The immunoblots (50 µg protein extract) show

the IR tetramer (α2β2). AMPKα and tubulin were resolved on denaturing gels (7.5% resolving gels).

The values shown are the means±s.d. (*p < 0.001, n = 3, two-tailed unpaired Student's t-tests).

88

Fig. 6. Time course for IR internalisation in liver after AICAR stimulation. A, The plasma

membrane (PM), and B, endosome (G/E) fractions were prepared as described in Fig.2 except that

vehicles (−) or AICAR (10 mg/100 g b.w.) (+) were injected via the jugular vein 15 min before the

insulin (1.5 µg/100 g b.w.) injections. Portions of the same membranes (70 µg proteins) were subjected

to immunoblot analysis (7.5% resolving gels) with the anti-IR-β subunit (IRβ), anti-PY (PY-20, PY-95

kDa), and anti-Glut2 antibodies. The relative contents of the IR and Glut2 proteins, which are shown

in the right panels, were determined by expressing the densitometric data as a percentage of their levels

the fractions at time 0, without AICAR. Each point on the progress curve is the mean ± s.d. of three

separate experiments.

89

Fig. 7. Architecture of a signalling network that accounts for the relation between the effects of

insulin, ATIC and ATP level. Insulin inputs in a double incoherent mode: IR autophosphorylation

plus PTPLAD1 recruitment at the cell surface (1) are converted into robust oscillations in output

through the overlay of two positive feedback systems with delay driven by the metabolic enzyme

ATIC (2). A local interacting loop counteracting the action of PTPLAD1 (3). Adenylates production.

Variations in ATIC levels or in adenylates synthesis or a decline in ATP levels independent of de novo

purine biosynthesis increase the AMPK activity and IR endocytosis.

90

Supplemental Fig.1 : Proteins enrichment analysis : A comparative analysis of protein enrichment

of the G/E fraction with respect to the total mouse proteome points out a strong enrichment of proteins

involved in transport activity (4 times more than in the total mouse) (Pannel A), ER/Golgi proteins are

the mosty represented in the G/E fraction (8.3 times more than in the total mouse proteome) (Pannel

B).

91

Supplemental Fig. 2 : IR immunoprecipitation and mass spectrometry (A) The G/E fraction was prepared as depicted for Figure 2 and methods except that rats were preinjected with

the PTP inhibitor bpV(phen) (intraperitonaly, 0.5 mg/100g b.w., 30 minutes before the experiments). The

membranes were analyzed using the anti-IR and anti-phosphotyrosine (pY-95 kDa) antibodies. (B) Membranes

were solubilized and submitted to the immunoprecipitation procedures (0.3% EmpigenBB, Fiset, A. et al. Cell

Signal 23, 911-919, 2011). Protein bands that were stained with SYPRO Ruby (Bio-Rad, Hercules, CA) were

excised and subjected to tryptic digestion. The resulting peptides were separated and analyzed by tandem mass

spectrometry (Online Table 2). (C) Electron microscopy of the G/E fraction shows typical tubulovesicular

structures as well as lipoprotein-filled vesicles of 70-200 nm.

92

Supplemental Fig. 3: Kinetics of IR, ATIC and PTPLAD1 accumulation in G/E fractions. Rats

were injected with insulin (1.5 mg/100g body weight). G/E fractions were prepared from two livers at

each time. Relative proteins contents were determined by LC –MRM as described in methods (see

online table 1 for peptides and MRM transitions used). Each point of the progress curve is the mean

S.D. of three experiments. Note that the 2 minutes peak value post-insulin injection for the IR is

similar (3.5 fold) to the original values obtained using radiolabelled insulin saturation methods (Khan,

M. N. et al. J Biol Chem 261, 8462, 1986).

0

50

100

150

200

250

300

350

400

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Rel

ativ

e qu

antif

icat

ion

in %

of i

nitia

l

Post-injection time in minutes

IR

ATIC

PTPLAD-‐1

93

Supplemental Fig. 4: ATIC knockdown increases AMPK phosphorylation in HEK293 cells. HEK293 cells were transfected for 72 hours with ATIC or PTPLAD1 SiRNAs. They were preincubated in a

serum free medium for 2 hours and stimulated for the indicated times with insulin. Immunoblots (25 µg protein

extracts) show IR, PTPLAD1, ATIC, AMPK, pAMPK-Thr172, levels. Note the increase in pAMPK-Thr172

phosphorylation levels not totally resumed after insulin stimulations.

94

3. CHAPITRE 3 : Annexine A2 est SUMOylé à son domaine N-terminal : Régulation par l’insuline

3.1. Résumé en Français

Contexte: L’endocytose du récepteur de l’insuline (RI) nécessite un remodelage du cytosquelette

d’actine. Les annexines fonctionnent en interagissant de manière régulée avec les membranes

cellulaires. En association avec S100A10, l’annexine A2 (ANXA2) a été la première annexine dont la

liaison aux filaments d’actines a été démontrée in vitro, notamment par sa région N-terminale.

Contrairement à l’Annexine A1, ANXA2 interagit avec l’actine et le cholesterol. ANXA2 a également

été associée à la biogénèse des endosomes et n’interfère pas avec l’invagination des corps

multivésiculaires. Il lui a été associé un rôle important dans le transport entre endosomes précoces et

tardifs en stabilisant l’actine-F et en forçant le remodelage membranaire et la biogénèse des

endosomes. Son activité aux points d’assemblage de l’actine est régulée par la phosphorylation de sa

tyrosine-24 (Y24) de son domaine N-terminal par vSrc. Il a par ailleurs été démontré que l’insuline

induit des changements majeurs dans la distribution de l’actine-F et que la tyrosine phosphorylation de

l’Annexine par sa tyrosine-24 est impliquée dans le traffic endocytique du RI.

Résultats : Nous montrons qu’ANXA2 est sumoylée à sa lysine-10 (K10) dans un motif de

SUMOylation non-consensus du domaine N-terminal. Cette SUMOylation est régulée par l’insuline et

par sa tyrosine-24 dont une mutation réduit le signal de SUMOYlation alors qu’une stimulation de

l’insuline l’augmente. La construction d’un réseau d’interactions protéins-protéines autour du

complexe IR/ANXA2/SUMO (IRASGEN) dans des fractions G/Es nous montre que SUMO1 connecte

ANXA2 aux changements de topologie membranaire régulés par l’actine et les microtubules. Des

variants héréditaires associés au diabète de type 2 représentent 41% de l’IRASGEN pointant ainsi

l’importance pathophysiologique de ce sous-réseau.

Conclusions: Comme l’annexine A1, l’annexine A2 est SUMOylable. Cette SUMOylation peut être

imputée à un site que nous identifions dans son domaine N-terminal sous régulation de l’insuline dans

des cellules en culture.

95

3.2. Avant-propos du chapitre 3

Le manuscrit a été soumis pour publication comme article dans la revue FEBS Lettre le 11 Décembre

2014. Il a été révisé le 27 Février 2015 et accepté le 02 Mars 2015. J’y suis co-premier auteur avec ma

collègue Dr Danielle Caron qui a participé à la redaction de l’article, l’analyse des données et a

exécuté les experiences biochimiques. J’y ai analysé les données et exécuté les expériences

bioinformatiques. Dr Robert Tanguay a participé au design des experiences et Dr Robert Faure a

participé au design des experiences, à la rédaction de l’article et à la supervision générale.

96

Annexin A2 is SUMOylated on its N-terminal domain: Regulation by insulin.

Danielle Carona, Martial Boutchueng-Djidjoua, Robert M. Tanguayb,c,d and Robert L. Faurea

From aDepartment of Pediatrics, Laboratory of Cellular Biology Centre de recherche du CHU de

Québec, bInstitut de Biologie Intégrative et des Système (IBIS), cLaboratory of Cellular and

Developmental Genetics, Department of Molecular Biology, Medical Biochemistry and Pathology, dPROTEO, Université Laval, Québec, PQ, Canada.

Address correspondence to: Robert L. Faure, Centre de Recherche du CHU de Québec, 2705 Blvd

Laurier, T3-55, Québec QC, G1V 4G2, Canada. Phone: (418) 654-2152. Fax: (418) 654-2753. E-mail:

[email protected]

97

3.3. Abstract

Insulin receptor (IR) endocytosis requires a remodelling of the actin cytoskeleton. We show here that

ANXA2 is SUMOylated at the K10 located in a non-consensus SUMOylation motif in the N-terminal

domain. The Y24F mutation decreased the SUMOylation signal, whereas insulin stimulation increased

ANXA2 SUMOylation. A survey of protein SUMOylation in hepatic Golgi/endosome (G/E) fractions

after insulin injections revealed the presence of a SUMOylation pattern and confirmed the

SUMOylation of ANXA2. The construction of an IR/ANXA2/SUMO network (IRASGEN) in the G/E

context reveals the presence of interacting nodes whereby SUMO1 connects ANXA2 to actin and

microtubule-mediated changes in membrane topology. Heritable variants associated with type 2

diabetes represent 41% of the IRASGEN thus pointing out the physio-pathological importance of this

subnetwork.

Key words: SUMOylation, annexin A2, tyrosine phosphorylation, insulin, insulin receptor,

endocytosis.

Abbreviations: SUMO: small ubiquitin-related modifier, ANXA2: Annexin A2, IR: insulin receptor.

Highlights:

- Annexin A2 is SUMOylable in its N-terminal domain.

- AnnexinA2 SUMOylation is regulated by insulin.

- A protein-protein interactions network (IRASGEN) connects annexinA2 SUMOylation to actin

and microtubule-mediated trafficking.

- 41% of IRASGEN have common heritable variants associated with type 2 diabetes.

98

3.4. Introduction

The functions of annexins are linked to their ability to interact with cellular membranes in a regulated

manner [1 , 2, 3]. ANXA2, in association with S100A10, was the first annexin shown to be able to

bind and bundle actin filaments in vitro. An N-terminal sequence (residues 1- 30) appears to be

involved in the bundling activity [4]. Despite their ability to bundle actin filaments, imaging studies

have shown that annexins are not associated with prominent actin bundles and cables such as stress

fibres within cells. Instead, more dynamic actin structures, in particular those associated with cellular

membranes, were noted [4]. In contrast to ANXA1, ANXA2 interacts with cholesterol and actin [5].

The depletion of ANXA2 with siRNA has shown that it is involved in the biogenesis of endosomes

without interfering with the invagination of multivesicular bodies [5, 6]. ANXA2 plays an important

role in early to late endosomal transport by nucleating and stabilising F-actin, forcing membrane

remodelling and thus endosome biogenesis [5, 7, 8]. In addition, the activity of ANXA2 at actin

assembly points is regulated by phosphorylation at Y24 at the N-terminal domain by vSrc [8].

Insulin, in addition to initiating metabolic responses, elicits major changes in the F-actin distribution

[9 , 10]. Previous reports have suggested that the tyrosine phosphorylation of ANXA2 at Y24 is

involved in the endocytic traffic of the IR [11 , 12]. In a recent study, we showed that the

SUMOylation of ANXA1 occurs in the consensus SUMO motif (ψKXE/D) located at the C-terminal

domain and is regulated by EGF [13]. We show here that ANXA2 is also SUMOylated. We identified

a SUMOylatable site in the N-terminal domain of ANXA2. We also demonstrate that ANXA2

SUMOylation is regulated by the ligand insulin in cultured cells.

3.5. Materials and methods

Cell culture- LNCaP (LNCaP.FGC, ATCC/CRL-1740) cells were maintained in RPMI 1640 medium

(HyClone) containing 10% FBS, 2.05 mM L-glutamine, 1.105/0.1 mg/ml penicillin/streptomycin and

were cultured at 37°C in a 5% CO2 constant atmosphere. In some experiments (Fig. 3), cells were

grown in the absence of FBS for 2 h prior to insulin stimulation (15 minutes, 10 ng/ml).

Cells Transfection- Cells were plated 20 h in advance at a 60% confluence. They were washed once

with the culture medium and incubated 24 h in medium containing the plasmid:Fugene HD (Roche

Diagnostics Canada, Laval, QC) complex (ratio 2 µg DNA:9 µl Fugene HD) prepared according to the

99

manufacturer’s protocol. The non-transfected (NT) control was realised using empty vector. Cellular

lysates were solubilised in Laemmli sample buffer and boiled for 5 min.

Plasmid Constructs- Total cellular RNA from mouse fibroblasts (MF WT) was extracted using

TRIzol Reagent (Invitrogen) according to the manufacturer’s instructions. Two micrograms of total

RNA was used to synthesise the cDNA using Omniscript reverse transcriptase (Qiagen). The pEGFP-

SUMO-1GG and pEGFP-SUMO-1Δ plasmids, expressing enhanced GFP-tagged SUMO-1 coding

sequence in its constitutively active form with a diglycine group at the end (SUMO-1GG) or an inactive

form (G96Δ) where the glycine group has been replaced by a stop sequence (SUMO-1Δ), respectively,

were realised using the complete SUMO1 human coding sequence amplified with SUMO-1GG forward

primer: 5’-GATCTCGAGATGTCTGACCAGGAGGC-3’; SUMO-1GG reverse primer: 5’-

GCTCTAGACTAACCCCCCGTTTGTTCCTG-3’; SUMO-1Δ forward primer: 5’-

GATCTCGAGATGTCTGACCAGGAGGC-3’; and SUMO-1Δ forward reverse primer: 5’-

GCTCTAGACTACGTTTGTTCCTG-3’. All PCR products were digested with XhoI and XbaI, gel

purified and individually inserted in pEGFP-C3 vector (BD Bioscience, Mississauga, ON) at

corresponding sites previously treated with the same restriction enzymes as described previously [13].

The plasmid pcDNA3-N-MYC-ANXA2 coding for ANXA2 was constructed using the complete

mouse coding sequence amplified with ANXA2 forward primer: 5’-

CACGCGGCCGCTCATGTCTACTGTCCACGAAATCCTG-3’; ANXA2 reverse primer: 5’-

GCTCTAGATCAGTCATCCCCACCACACAGG-3’. PCR products were digested with NotI and

XbaI, gel purified and inserted into pcDNA3-N-MYC at corresponding sites to generate a fusion

protein bearing an N-terminal MYC tag [13].

Site-directed mutagenesis- Mutagenesis was carried out by polymerase chain reaction (PCR). The

mutations were made in the plasmid template pcDNA3-N-MYC–ANXA2 using the GeneTailorTM

Site-Directed Mutagenesis System (Invitrogen Life Technology, Carlsbad, CA) according to the

manufacturer’s protocol. Base substitution mutagenic overlapping oligonucleotide primers

corresponded to the noted position and used the relevant plasmids as template.

100

The (G/E) hepatic fractions- Fractions were prepared and characterised based on enzyme markers,

electron microscopy and ligand-mediated endocytosis as originally described. A proteomic survey of

major proteins in the G/E fraction was also previously reported (666 unique proteins) [14].

Immunoblots Analysis- Antibodies were obtained from various suppliers: anti-MYC (9E10), anti-IR,

anti-p-TYR (PY20) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-ANXA2 (BD Transduction

Laboratories, Montreal) Anti-GFP (Invitrogen life technology, Carlsbad, CA), anti-MYC (9E10)

(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). The anti-beta actin antibody was from Sigma-Aldrich

(St Louis, Mo). The anti-SUMO1 antibody was produced in the lab and its properties previously

described [15]. Membranes (PVDF) were revealed using a chemiluminescence kit (ECL, PerkinElmer

Life Science, Boston, MA). In some experiments (Figure 3) the signals were analysed using an

ImageQuant LAS 40000 imager (GE Healthcare Biosciences). All other chemicals were analytical

grade and were purchased from Fisher Scientific (Sainte-Foy, Québec) or Roche Laboratories (Laval,

Québec).

Immunoprecipitation (IP)- G/E fractions (200 mg proteins) were solubilized (4OC, 60 min) in the

presence of 0.3 % Empigen BB and centrifuged at 240 000 g for 30 min. Supernatants were submitted

to immunoprecipitation (IP). IPs were performed using the anti-SUMO antibody covalently coupled to

beads (Carbolink, Pierce, Rockford, IL) and proteins were eluted with 100 mM glycine pH 2.4. The

eluates were immediately neutralized (Tris 1M, pH 7.5) and submitted to the immunoblotting analysis.

Database and network analyses.

Functional and physical protein-protein interaction networks (PPIN) were generated based on a

previous protein survey of the G/E fraction [14]. The PPIs were provided by the STRING database

(filter set at 0.700) [16] and by the Biological General Repository Interaction Datasets (BioGRID)

[17]. The interactions were visualised on the Cytoscape platform (Version 2.8.2). Self-loops and

duplicated edges were removed prior to the analysis. Cellular component grouping and functional

analysis were performed after a gene ontology analysis with the Biological Networks Gene Ontology

tool (BINGO version 2.44) [18, 19]. A cluster analysis helped to discern compact groups of highly

interconnected proteins with functional relationships with AnxaA2 with confidence. This was done

101

with the affinity propagation algorithm, a component of the cluster maker plugin implemented in

Cytoscape [20]. The analysis for type 2 diabetes common variants content within IRASGEN was done

as previously decribed [21].

3.6. Results

SUMOylation of the ANXA2 N-terminal domain.

Co-transfections of GFP-tagged SUMO-1 with Mus musculus MYC-ANXA2 in LNCaP cells [13]

revealed the presence of a weak but consistent 78 kDa signal on immunoblots (Fig. 1A). This 78 kDa

signal is compatible with the presence of a complex composed of one GFP-SUMO-1 molecule

(approximately 40 kDa) bound to the MYC-ANXA2 (approximately 38 kDa). To further confirm these

results we immunoprecipitated the GFP, and MYC tagged proteins before immunoblot analysis. The

results confirmed enhanced MYC-ANXA2 SUMOylation signal (Fig. 1B) that was not affected by the

K248 mutation located in the C-terminal VKGD consensus motifs (not shown, K257 for ANXA1

[13]). Phosphorylation, truncation and mutations within the N-terminal regions of annexins have an

important impact on their functions [22-27]. The fact that SUMO can be conjugated to K residues in

non-consensus motifs [28, 29] led us to think that membrane aggregation properties or other functions

might be modulated by the SUMOylation of N-terminal residues. We reasoned that if at least one of

the two N-terminal K residues (Mm ANXA2 K10R, K28R) is scored, a functional model for ANXA

SUMOylation might be validated. We therefore mutated residues K10 and K28 of ANXA2. The

results confirmed that the presence of signal at 78 kDa was significantly decreased by 50 % by the

K10R mutation but not the K28R mutation (Fig. 2). We concluded that K10 in the N-terminal loop of

ANXA2 is a major SUMOylatable site.

Insulin increases ANXA2 SUMOylation.

Phosphorylation of Y- (and S-) residues in the N-terminal region of annexins regulates their function

[2, 3, 8, 22, 25, 30-34]. ANXA2 is also a putative substrate for the internalised IR [11]. We thus

verified if ANXA2 SUMOylation is regulated by insulin. We found that the Y24F mutation in ANXA2

significantly decreases the SUMOylation signal of the 78 kDa complex by 60 % (Fig. 3A). Cells

cultivated in the absence of serum for 2 hours displayed an approximately 50 % lower ANXA2

102

SUMOylation signal (Fig. 2B). In contrast, after 15-minute insulin stimulation, the IR 95 kDa b-

subunit autophosphorylation increased concurrently with the reappearance of the SUMOylation signal.

For the Y24F mutant, there was no increase in the SUMO signal (Fig. 3B). Therefore, insulin,

presumably through Y24 tyrosine phosphorylation, markedly influences the SUMOylation of ANXA2.

Insulin-dependent SUMOylation in liver Golgi/endosome fractions.

To further assess the significance of the ANXA2 SUMOylation modification and its regulation by the

IR, we verified the presence of SUMOylation signals and their responsiveness to insulin in vivo. To

achieve this goal, we used a well-characterised mixed Golgi/endosome (G/E) fraction isolated from the

rat liver [35]. After the intravenous injection of a single insulin dose, the tyrosine phosphorylated IR

internalised in the G/E fraction in a time-dependent manner, as originally reported [35] (Fig. 4A, lower

panels). Under these conditions, protein bands of approximately 40 to 200 kDa revealed by the anti-

SUMO1 antibody appeared at 2 and 15 minutes after insulin injections (Fig. 4A, upper panel). Of

further interest, ANXA2 was readily detected in anti-SUMO1 immunocomplexes prepared following

insulin stimulation. The 55 kDa doublets are compatible with the presence of a complex composed of

one or two SUMO-1 molecules (approximately 12 kDa) bound to ANXA2 (approximately 38 kDa)

(Fig. 4B).

Analysis of IR-ANXA2-SUMO interactions in Golgi/endosome fractions (IRASGEN).

To predict the functions of the ANXA2 SUMOylation process, we analysed the IR-ANXA2-SUMO

connectivity in the G/E context by using a previous protein survey [14]. We used an affinity

propagation plugin set at 25 iterations and implemented in cytoscape (2.8.2) to generate subnetworks

of dense protein complexes. The network is made up of 202 nodes and 526 edges. Its functional

analysis was performed with the Gene Ontology plugin BINGO version 2.44. A first dense complex

(yellow) is mainly formed of the different Annexins (ANXA1, ANXA5) and cytoskeletal proteins

(S100a 6, CEACAM, vimentin and the src family kinase Lyn). A second dense network is related to

the IR connected with elements of the vATPase involved in proton pumping and the dissociation of

insulin from the IR at acidic lumenal pH [36 , 37 , 38]. Through SUMO and elements of the ubiquitin

machinery (Uba1, Ubb), ANXA2 interacts with elements of the endolysosomal trafficking machinery

103

(Arhgdia and Gdi2, Rab5, Rab7) and with the actin-microtubule cytoskeleton (RhoA, Kif5A),

suggesting that by regulating ANXA2 SUMOylation, the IR controls its own traffic by acting on the

local organisation of actin and microtubules (Fig 5). Of further interest, the physiopathological

importance of IRASGEN is pointed out by the fact that common heritable variants associated with

type 2 diabetes represent 40.9 % of the network (Fig. 5, squares) and 72.7 % for the ANXA2 first

interactors (Fig. 5, yellow squares) including ANXA2, ANXA1, LYN, S100 and CEACAM1.

3.7. Discussion

The SUMOylation of annexins and the regulation of ANXA1 SUMOylation by EGF in LNCap cells

has been reported recently [13, 15]. We found here that SUMO1 can be conjugated within a non-

consensus motif (LCK10LSL) located in the N-terminal domain of ANXA2. Picard et al. reported the

presence of a non-consensus motif, similar to the one involved here, in which a phosphorylated S

residue replaced the negatively charged D/E residues [39]. The finding that ANXA2 SUMOylation is

regulated by insulin is also consistent with previous reports suggesting that the tyrosine

phosphorylation of ANXA2 is involved in the endocytic traffic of the IR [11 , 12].

ANXA2 is found on actin tails that propel motile vesicles [40], where it appears to function by

supporting the assembly of membrane lipids and recruiting proteins initiating actin-remodelling events

[12, 41]. SUMO1 can add a new dimension by connecting with Arhgdia, Rhoa and Rabs 5, 7 (Fig. 5).

The Rho GTPase family contains proteins that are involved in the regulation of the actin cytoskeleton,

cellular migration [42, 43] and endocytic traffic [44]. Arhgdia itself is a protein that is ubiquitously

expressed in tissues and binds to most of the GTPases, including Rac1, RhoA, and Cdc42. It can act: i)

by masking the membrane anchoring domain of GTPases, thereby restricting them to the cytosol; ii) by

blocking the interaction with guanine nucleotide exchange factors (GEF), thus inhibiting GTPase

activation; and iii) by blocking binding to downstream partners [45]. Transgenic mice lacking

RhoGDIa present intense vacuolisation at the basal side of epithelial cells [46]. In Dictyostelium

species lacking GDI-1, a RHOGDI homologue, the contractile vacuolar system is severely affected

[47]. RhoGDI can be viewed as a global regulator of Rho-dependant signalling pathways due to its

ability to maintain the equilibrium between vacuolar transport and apoptosis.

104

Spatial and temporal regulation of actin polymerisation is critical for endocytosis [48-50]. Particularly,

the endocytic recycling compartment is a site that integrates vesicular transport with signalling

modules that control actin remodelling [51]. Recycling endosomes are enriched in lipid microarrays

that are involved in membrane curvature and facilitate actin-regulated signalling [52]. It was inferred

that these domains have a role in the formation of membrane carriers [53], making the endocytic

recycling compartment a centre that integrates vesicular transport with the signalling modules that

control actin remodelling [54, 55]. In this regard, the IR (a high-recycling receptor) locates in an actin-

dependent manner at the microvilli on the hepatocyte cell surface [56, 57]. The IR has also been

observed in caveolin-enriched hepatic plasma membrane microdomains that rapidly associate with the

actin cytoskeleton in response to insulin [58]. IR autophosphorylation is thought to release a constraint

that maintains the IR on the microvilli and allows free, mobile insulin-bound IR to reach competent

membrane environments [59, 60]. The link with the actin network appears to be a key component of IR

traffic because ANXA2 is also linked with the CEACAM1/b-catenin complexes (Fig. 5) that were

shown to be involved in glucose metabolism and IR regulation [61 , 62].

ANXA2 was recently implicated in type 2 diabetes and cancers [63]. High recycling of the IR is

important because the liver is also the main site of insulin clearance [64]. A deficiency of hepatic

clearance results in glucose intolerance [65, 66]. It is thus possible that the insulin receptor can control

actin-assembly activity mediated by the SUMOylated ANXA2, which may in turn contribute to the

changes in actin characteristics in membrane trafficking-related pathophysiological conditions.

ANXA2 was initially identified as a major substrate of pp60src and thus has been proposed to play a

role in cellular differentiation, cell transformation and cancer [67]. The activity of ANXA2 at actin

assembly points is regulated by Y phosphorylation at the N-terminal domain by pp60src [8]. The fact

that the IR and Lyn are functionally related to ANXA2 (Fig. 5) highlights the idea that insulin and

pp60src signalling are not organised in a linear fashion but instead rely on densely connected protein

interaction networks. The particular enrichment of IRASGEN in common heritable variants further

support the idea that the genetic heterogeneity observed for type diabetes, in lean and obeses subjects,

converges towards few cell biology mechanisms. Further deciphering the IRASGEN should allow a

better understanding of the role of ANXA2 SUMOylation in complex diseases [68].

105

3.8. Acknowledgments

DC and MBD are first coauthors. We thank Suzanne Fortier for expert technical assistance. Work was

funded by the CIHR (RT) and NSERC (RF, NSERCC Discovery Grant: 155751). Authors’

contributions DC performed and analyzed most of the experiments in this work and also wrote the

paper. MDB performed experiments and analyzed data. RMT designed experiments and contributed to

the paper. RLF designed experiments, contributed to the paper and led the research program.

3.9. References

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109

3.10. Figures and legends

Fig.1. SUMOylation of ANXA2 in LNCaP cells.

LNCaP cells were co-transfected with EGFP-SUMO-1GG or EGFP-SUMO-1Δ and mus musculus

MYC-ANXA2 constructs. A) Immunoblot were realized on whole cell extracts using α-MYC, α-GFP,

and α-β-galactosidase. B) Immunoprecipitation (IP) of SUMOylated ANXA2. LNCaP cells co-

transfected with EGFP-SUMO-1GG and MYC-ANXA2. IPs were done using α-MYC or α-GFP

antibodies. Proteins were separated on SDS-PAGE (10 % resolving gels) and immunoblotted using the

α-MYC or the α-GFP antibody.

110

Fig. 2 SUMOylation of the ANXA2 N-terminal domain.

LNCaP cells were co-transfected with the EGFP-SUMO-1Δ or EGFP-SUMO-1GG and with the wild

type construct or constructs bearing the single (K10R or K28R) or double (K10/28R) K mutations in

the N-terminal sequence of mus musculus (Mm) MYC-ANXA2. Immunoblots were realised using an

α-MYC antibody (pieces of the same membrane). NT=non-transfected cells. Upper panel, MYC-

Anxa2S: SUMOylated form of ANXA2. Higher panel: ANXA2 SUMOylation densitometry,

expressed as the proportion of the control signal (MmA2 plus SUMOGG). The values shown are the

means±s.d. (* P<0.001, n=4, two-tailed unpaired Student's t-tests).

111

Fig. 3 Stimulation of ANXA2 SUMOylation by insulin in LNCap cells.

A) LNCaP cells were co-transfected with the EGFP-SUMO-1GG and the wild type construct or a

construct bearing the Y24F mutation in the N-terminal sequence of mus musculus (Mm) MYC-

ANXA2. Densitometry data were normalized for b-tubulin and expressed as a % of the control

(MmA2) value (two-tailed unpaired Student's t-tests, n=4, *p≤0.001). B) LNCaP cells were co-

transfected with the EGFP-SUMO-1GG and the wild type mus musculus (Mm) MYC-ANXA2

constructs. Cells were cultivated in the presence or absence (two hours) of FBS and stimulated with

insulin (10 ng/ml) for 15 minutes. Immunoblots were realised using an α-MYC, IR α-subunit (95 kDa)

or α-p-TYR antibody (PY-95 kDa, pieces of the same membrane, representative of two independent

experiments, 7.5% resolving gels). NT=non-transfected cells. MYC-Anxa2S: SUMOylated form of

ANXA2.

112

Fig. 4 Protein SUMOylation in isolated endosomes stimulated with insulin.

Rats were injected via the jugular vein with a single dose of insulin (15 mg/100 g body weight).

Endosomes (G/E fraction) were prepared from two livers at each indicated time. Time 0 is buffer alone

with immediate sacrifice of the animals. Membranes (70 mg proteins) were subjected to (A)

immunoblot analysis with the anti-SUMO-1 (higher panel), anti-IR (95 kDa b-subunit),

phosphotyrosines (PY-20, IR tyrosine phosphorylation, PY-95 kDa) and the anti-beta actin antibodies.

(B) The SUMOylated proteins were immunopurified from the solubilised G/E fraction (200 mg

proteins) isolated 2 minutes after insulin injections. The eluted proteins were blotted against the

ANXA2 or SUMO1 antibodies.

113

Fig. 5 Construction of the endosomal IR/ANXA2/SUMO network (IRASGEN).

IRASGEN was constructed from a set of 666 G/E proteins (Bilodeau et al. J. Proteome Research 2010;

9: 708-717). A link is placed between proteins if there is a functional or physical association between

them. Out of the Anxa2 protein complex (nodes in yellow), the node color varies with the associated

biological process as identified by the Gene Ontology tool (BINGO) implemented in the visualisation

platform Cytoscape. The edge thickness decreases according to the progression from Anxa2 (red to

grey), indicating a functional relationship. Squares correspond to proteins for which the gene was

associated with type 2 diabetes.

114

4. CHAPITRE 4 : Conclusions générales et perspectives

4.1. Protéome des fractions G/E et théorie des marqueurs

De nos jours, une définition plus moderne des organelles du système vacuolaire impliquées dans le

transport membranaire des voies endocytiques ou exocytiques demande une description formulée à la

fois en termes statiques et dynamiques. Une organelle est définie en terme statique par son propre

répertoire de protéines résidentes (études protéomiques) et en terme dynamique par leur localisation

temporelle le long d’une voie de circulation sur la base des vitesses de transit d’une organelle à l’autre.

Les informations concernant les voies de l’endocytose ont donc émergé de l’exploitation de

l’hypothèse des marqueurs, l’endocytose induite par des récepteurs de surface (receptor-mediated

endocytosis), ou encore l’utilisation de mutants de levure comme modèle génétique. L’exploitation de

l’hypothèse des marqueurs a permis rapidement l’identification et l’isolement de plusieurs organelles

sur la base de leurs caractéristiques de sédimentation et les activités enzymatiques. De nombreuses

protéines qui jouent des rôles importants dans la signalisation ou les processus de bourgeonnement et

de fusion ont été aussi récemment identifiées. Parmi elles, on retrouve les petites protéines G des

familles Rab et ARF, les protéines de fusion NEM-sensibles (NSFs), les annexines, la clathrine, des

adaptateurs associées à la clathrine, la dynamine ainsi que des kinases, des phosphatases et autres

protéines de signalisation. Ordonner chaque étape dans laquelle ces protéines fonctionnent, identifier

d’autres composants et démontrer leur importance relative dans le trafic intracellulaire sont les défis

actuels. Les approches protéomiques et bioinformatiques disponibles aujourdhui nous permettent de

passer le mur “DeDuvien” et de revenir à l’idée originale des années 1950 qui consistait à caractériser

chaque organelle selon le contenu protéique (De Duve et al., 1955). Une idée qui a été abandonnée à

cause de l’impossibilité technique de l’époque.

À partir d’un protéome de fractions G/E hépatiques de rats, obtenu sous stimulation de l’insuline par

LC-MS/MS, des analyses comparatives d’enrichissement avec le génome total de souris, nous révèle

une forte hétérogénéité fonctionnelle et compartimentale des protéines identifiées. Cette hétérogénéité

relève ainsi les limites de la théorie des marqueurs. Des résultats préliminaires récents d’analyses

protéomiques obtenues à partir d’endosomes immunocapturés sur billes magnétiques anti-RI

(Boutchueng et al., résultats non publiés) nous révèlent un environnement encore plus spécifique en

fonction du temps d’injection d’insuline et nous montre le rôle majeur des petites GTPases de la

115

famille des Rabs comme coordonnateurs de trafic dans le transit du RI des endosomes précoces vers

des fractions plus tardives. Ces Rabs s’y retrouvent au centre d’interactions avec les grands groupes de

protéines du cytosquelette notamment des microtubules, des microfilaments et des filaments

intermédiaires, des protéines du cycle cellulaire, des protéines d’acidification de la pompe à proton,

des protéines de manteaux membranaires et des groupes de trafic comme le complexe SNARES. Nos

résultats distinguent un protéome spécifique à 2 minutes et distinct d’une part d’un second protéome

spécifique à 15 minutes et aussi d’un protéome de transition identifié à la fois à 2 et 15 minutes post-

injection d’insuline. Ils ressortent surtout la coexistence dans ce protéome de transition de plusieurs

marqueurs Rabs traditionnellement associés à un compartiment spécifique (Rab5 pour les endosomes

précoces, Rab11b pour le recyclage et Rab7 pour les endosomes tardifs). Bien que nos résultats soient

essentiellement qualitatifs, ils s’harmonisent avec des prédictions récentes faites sur la base d’analyse

d’imagerie cellulaire par le groupe de Marino Zerial pour qui la conversion des Rabs est un mécanisme

de progression des cargos des endosomes précoces vers les endosomes tardifs (Rink et al ., 2005). Les

petites GTPases de la famille des Rabs peuvent peupler plusieurs microdomaines et être colocalisées

sur un endosome unique dans la cellule (Pfeffer, 2013; Sönnichsen et al, 2000). Dans une revue

récente, Suzanne Pfeffer juxtapose deux modèles de conversion de Rabs. Pour les adeptes du premier

modèle, Rink et collègues ont décrit en 2005 la conversion des Rabs comme étant un processus de

maturation où le compartiment de Rab5 est substitué par le compartiment arrivant avec Rab7. Le

deuxième modèle, davantage proche de nos résultats préliminaires, décrit quant à lui un compartiment

tardif contenant Rab7 qui se détache du compartiment préexistant Rab5 par une fission pouvant être

régulée par des protéines motrices différentes pour Rab5 et Rab7 ou encore par d’autres évènements

associés au remodelage du cytosquelette (Vonderheit et al., 2005 ; Mesaki et al., 2011). Ce deuxième

modèle suggère par conséquent la possible coexistence des deux marqueurs dans un même protéome et

il met en exergue les difficultés limitrophes entre deux compartiments endosomaux. Dans un cas

comme dans l’autre, la proximité géographique entre les marqueurs Rabs que nous retrouvons dans

nos travaux semble clairement établie.

4.2. Analyse systématique des fractions G/E à partir du récepteur de l’insuline

L’appareil endosomal est maintenant reconnu comme une plateforme signalétique qui perpétue le

signal émis et initié depuis la membrane plasmique. Signalisation et trafic endosomal apparaissent de

116

plus en plus comme deux processus dont l’interdépendance est essentielle pour la spécificité de la

réponse cellulaire. Nous avons utilisé des outils bioinformatiques pour analyser le système que

constituent des fractions G/E hépatiques (GEN). À partir de réseau d’interactions moléculaires nous

avons su restreindre un environnement encore plus spécifique au RI (IRGEN) pour ressortir cette forte

hétérogénéité des groupes fonctionnels qui le constituent. Des techniques de biologie cellulaire

classiques nous ont ensuite permis de l’explorer. Nous y avons, par exemple, identifié et caractérisé un

nouveau circuit de signalisation autour de l’enzyme métabolique ATIC qui est une protéine partenaire

du RI internalisé dans les G/E. ATIC est une enzyme bifonctionnelle de la voie métabolique de novo

de synthèse des purines. Son substrat AICAR est un activateur connu de l’AMPK dont l’activité est

associée au traitement de nombreuses maladies complexes incluant le diabète de type 2 et des cancers.

Nous montrons au chapitre 2 qu’une délétion partielle d’ATIC favorise l’internalisation du RI dans des

cellules HEK293, laquelle est inhibée lorsqu’on réduit partiellement le niveau d’AMPKα2. De même,

la baisse du niveau d’ATIC cause de manière chronique l’activation de l’AMPK et favorise le

recrutement de l’AMPK actif dans le complexe du RI de manière insulino-dépendante. L’activation de

l’AMPK a été longuement associée à la régulation des protéines motrices de microtubules, les

kinésines, pouvant justifier la présence insulino- et ATIC-dépendante de KIF5A dans le complexe du

RI (Mihaylova and Shaw., 2011 ; Amato et al., 2011). Une conséquence est qu’en délétant ATIC, on

puisse réguler le trafic directionnel des vésicules endosomales par les kinésines. Par ailleurs, des essais

in vitro avec des G/E hépatiques de rats, confirmés par des tests avec SiRNA dans des cellules

HEK293 nous permettent de dire sans équivoque qu’ATIC favorise la tyrosine phosphorylation du RI.

L’ajout d’ATIC purifié à des fractions G/E enrichies au RI et tyrosines phosphorylées par ATP in

vitro, montre une association ATIC/RI dépendante du niveau de tyrosine phosphorylation du RI. ATIC

peut donc avoir une fonction de protéine adaptatrice essentielle dans la distribution endosomale du RI

par son effet de protection de son activité tyrosine kinase vis-à-vis des tyrosines phosphatases

endosomales, notamment PTPLAD1, dont la dynamique d’association similaire à celle d’ATIC dans le

complexe du RI endosomal atteint son peak 15 minutes après injection d’insuline. Cette dynamique

insulino-dépendante des tyrosines phosphatases se retrouvent renforcer par nos résultats préliminaires

du prochain manuscrit, où une analyse d’un environnement spécifique du RI dans les G/Es montre une

accumulation insulino-dépendante des seules tyrosines phosphatases identifiées par LC-MS/MS de la

famille des PTPRs dans les compartiments tardifs (Boutchueng et al., données non publiées).

L’importance d’ATIC sur la signalisation de l’insuline est davantage illustrée par ses effets sur

117

l’activité de l’AKT et conséquemment sur le transport de glucose par Glut2 dans des cellules en

cultures. L’AKT est une protéine de signalisation majeure présentant une affinité structurelle pour les

lipides membranaires. Elle se trouve à la croisée des voies AMPK et la cascade de signalisation issue

de l’insuline, de laquelle elle médie les effets signalétiques de l’insuline sur le transport de glucose en

provenance de la voie PI3K (Taniguchi et al., 2006; Jiang et al., 2003; Summers et al., 1998). Des

analyses compartimentées (membrane plasmique versus Golgi-endosomes) nous montrent une

cinétique insulino-dépendante de la phosphorylation de la Sérine-473 de l’AKT et donc de son

activation. Celle-ci se retrouve inhibée en temps aigus (48h) de délétion partielle d’ATIC dans des

cellules en culture HEK293 avec une conséquence similaire sur l’effet insulino-dépendant de la

cinétique de translocation de Glut2 vers la membrane plasmique. Par opposition, les effets chroniques

de la délétion partielle d’ATIC (72h) et donc AICAR-dépendants, rétablissent le niveau basal de

phoshorylation d’AKT par la dite Sérine, probablement en activant l’AMPK. De même, nous montrons

qu’une incubation des cellules avec de l’AICAR purifié, amplifie les effets de l’insuline sur la

translocation de Glut2.

ATIC pourrait réguler la tyrosine phosphorylation du RI par inhibition d’une tyrosine phosphatase.

PTPLAD1 est la seule protéine identifiée dans le complexe du RI internalisé qui présente les

caractéristiques pouvant être celles d’une tyrosine phosphatase. PTPLAD1 est une protéine

transmembranaire dont le recrutement insulino-dépendant à la membrane plasmique est compatible

avec des travaux antérieurs qui suggéraient déjà que la déphosphorylation des RTKs se produit

essentiellement au niveau de l’appareil endosomal (Faure, 1992). Bien que nous travaillions encore à

mettre en évidence une activité tyrosine phosphatase directe de PTPLAD1, sa structure révèle une

boucle soluble (FRYSFYMLTCIDMDWKVLTWLRY, 257-279) cytosolique comprenant une

cystéine caractéristique dans un motif C(X)5K similaire à celui de nombreuses phosphatases où

l’arginine est remplacée par une lysine. En outre, Nous démontrons par délétion partielle que

PTPLAD1 est un régulateur de la tyrosine phosphorylation du RI. Nos résultats montrent que cette

régulation de la tyrosine phosphorylation du RI et donc de son internalisation, peut aussi être

conséquente à un remodelage du cytosquelette d’actine dont l’une des protéines majeures, l’ACTB, se

retrouve recrutée dans le complexe du RI de manières insulino- et PTPLAD1-dépendantes. En outre,

PTPLAD1 amplifie l’effet insulino-dépendant de la translocation de Glut2 dans les cellules HEK293

conséquente à une suractivation de l’AKT.

118

Comme suggéré par (Villosenor et al, 2015), les RTKs tels que le RI ne s’internalisent pas de manière

isolée mais leur trafic résulte d’interactions protéines-protéines finement coordonnées. En caractérisant

un nouveau nœud de signalisation dans le trafic du RI comprenant une enzyme métabolique (ATIC),

une tyrosine phosphatase (PTPLAD1), un senseur d’énergie (AMPK), nos travaux illustrent un modèle

nouveau de cohésion entre métabolisme intermédiaire, signalisation par modèle quantal (Villosenor et

al., 2015) et trafic endosomal par remodelage du cytosquelette.

4.3. Le récepteur de l’insuline contrôle son trafic en régulant la SUMOylation de l’annexine A2

L’Annexine A2 est aussi un régulateur connu du cytosquelette d’actine et est une protéine

déterminante dans la biogénèse endosomale et le trafic des RTKs en général. Son activité, comme celle

de plusieurs autres annexines est dépendante de la phosphorylation des résidus tyrosines et sérines

(Futter et al., 2007; Gerke et al., 2002; Hayes et al., 2009; Caron et al., 2015). Nos travaux initiés par

ma collègue Danielle Caron et décrits au chapitre 3 montrent que l’insuline, en régulant la tyrosine

phosphorylation de l’Annexine A2, est à même d’influencer sur sa SUMOylation régulée par la

tyrosine-24. Annexin A2 est abondamment représenté sur les comètes d’actine impliquées dans la

propulsion et la motilité des vésicules (Merrifield et al., 2001). Elle y joue un rôle en recrutant des

lipides membranaires et des protéines susceptibles d’initier des évènements de remodelage d’actine.

Nous démontrons que l’Annexine A2 est physiquement associée à SUMO1, qui, de par ses interactions

avec la machinerie d’ubiquitine, favorise une interconnection entre le RI, l’Annexine A2, les

cytosquelettes d’actine et de microtubules, et aussi avec les petites GTPases telles que Rab5 et Rac1.

Cette habilité à réguler l’activité de ses interacteurs comme Anxa2, permet au RI de contrôler sa propre

destinée au cours de son trafic. Il est en effet clairement établi que le remodelage de l’actine est

important au recyclage des RTKs initiée dans l’appareil endosomal.

4.4. Importance pathophysiologique du réseau Golgi-endosomal du récepteur de l’insuline

L’avènement des études épidémiologiques libres d’hypothèses du génome total humain a été un pas

important dans l’identification de gènes associés aux maladies complexes et à une meilleure

compréhension des modèles de transmission. Le développement de nombreuses bases de données

permettant de compiler ces résultats nous permettent aujourd’hui de pouvoir faire des analyses de

119

recoupement systématiques et ressortir les mécanismes moléculaires liés à chacune de ces maladies

complexes ou aussi de mettre en évidence les connexions moléculaires qu’elles ont entre elles. Parmi

les bases de données communément utilisées comme outils bio-informatiques, OMIM est un catalogue

de maladies relevant de composant génétiques du génome humain auxquels elles sont reliées. OMIM

fait partir du projet d’héritage mendélien humain et ressort les liens entre maladies complexes et gènes

associés avec ou sans mécanisme moléculaire connu. Dans la base de données d’associations

génétiques (GAD), des informations sur des maladies complexes et non sur celles uniquement de types

mendéliennes y sont archivées à partir d’articles publiées dans des journaux crédibles. Par ailleurs, les

études du génome total humain sont en général compilées dans un catalogue communément connus

sous le nom de « GWAS catalog » où les variants en forme de SNPs sont associés à des maladies

complexes. En utilisant cette grande diversité de base de données, nos résultats montrent une

augmentation du nombre de gènes codant dont les variants sont associés au diabète au fur et à mesure

que les liens fonctionnels se rapprochent du RI dans des G/E (Boutchueng-Djidjou et al., 2015). En

outre des analyses préliminaires à partir de billes magnétiques enrichies au RI dans les G/E en fonction

du temps d’injection de l’insuline (Boutchueng et al., données non publiées) confirment cette forte

concentration de variants communs associés au diabète de type II parmi les interacteurs de trafic du RI.

Ces résultats mettent en relief des voies de signalisation similaires entre trafic endosomal du RI et

réseaux spécialisés de diabète de type II.

En conclusion, les mécanismes moléculaires qui régissent des maladies complexes comme le diabète

de type II tendent à converger vers des mécanismes classiques associés au trafic du RI relevant encore

plus la possibilité que la clairance de l’insuline puisse être une cause primaire du diabète de type II.

120

4.5. Perspectives

4.5.1. La flotilline est-elle une voie d’endocytose pour le récepteur de l’insuline

Nous avons vu que l’endocytose du RI est un processus dont les mécanismes moléculaires sont peu

connus, par contraste avec d’autres récepteurs transmembranaires à activité tyrosine kinase comme le

EGFR. Nos résultats préliminaires montrent aussi une distribution non-insulino dépendante des

isoformes 1 et 2 de la flotilline à la membrane plasmique et dans des fractions G/E. Des analyses avec

des billes magnétiques enrichies nous permettent de dire sans équivoque qu’une portion du RI

internalisé et de certains de ses partenaires auxquels il est physiquement associés (PLVAP) dans les

G/E hépatiques, se retrouvent accumulés dans des vésicules endosomales enrichies de flotilline-1 et

vice versa après deux et quinze minutes d’injection de l’insuline. Nous montrons également que

l’internalisation de la PLVAP est régulée par des tyrosines phosphatases dont l’inhibition par bpV

(phen) tend à favoriser le transit dans les G/Es. Ces résultats sont un complément aux voies

d’endocytose associées au RI, notamment l’endocytose par voie de clathrine et par les cavéoles dans

les tissus adipeux.

4.5.2. ATIC rentre – t- elle dans la catégorie des morphéines?

Les morphéines sont des protéines homo-oligomériques qui peuvent se dissocier sous les conditions

physiologiques et dont les sous-unités dissociées ont la capacité de changer de conformation avant de

se rassembler dans un état conformationel altéré en oligomère structurellement et fonctionnellement

différent. Ce phénomène peut servir de base pour des effecteurs allostériques, pour les maladies

conformationnelles, pour la découverte de nouveaux médicaments et pour la prédiction d’effets

secondaires de médicaments en médecine personnalisée (Jaffee, 2010). Pour Gallina Semenova, il

existe une académie de morphéines à laquelle l’entrée est conditionnée par l’existence d’enzyme

homo-oligomérique dont la fonction dépend donc de la conformation flexible de l’oligomère

(Semenova et al., 2012). Un exemple couramment décrit est celui de l’enzyme métabolique PKM2 des

voies de glycolyse. Sous sa forme tétramérique, PKM2 est une pyruvate kinase déterminante dans la

glycolyse aérobique. Lorsque PKM2 est dimérique après stimulation par un facteur de croissance

comme c’est le cas dans le noyau des cellules cancéreuses, on lui attribue plusieurs autres fonctions

dont une activité tyrosine kinase activant STAT3 et favorisant de ce fait la prolifération et la

transformation des cellules cancéreuses par STAT3 et ses substrats.

121

Nos travaux mettent en relief une dualité fonctionnelle peu courante d’ATIC en la reliant aux voies

AMPK et à la tyrosine phosphorylation du RI. ATIC est une enzyme dont la bifonctionnalité dans la

voie des purines est conservée chez les procaryotes et eucaryotes et qui catalyse les deux dernières

étapes de la voie de novo de biosynthèse des purines (Wolan et al., 2004; Vergis et al., 2000; Rayl et

al., 1996). Chez l’humain, ATIC comprend deux domaines AICARFT (résidus 199-592) et IMPCHase

(résidus 1-198) dont l’expression et l’activité catalytique sont indépendantes l’une de l’autre (Bulock et

al., 2002 ; Cheong et al., 2004). Une des caractéristiques des enzymes allostériques est leur capacité à

changer d’état conformationnel en vue de faciliter leur liaison à un substrat donné. ATIC existe dans

un équilibre monomère-dimère en solution, qui est pertubée en homodimère juste par une présence

simultanée d’AICAR et de son analogue folique, utile dans la formation du produit intermédiaire

FAICAR. Les sites de liaison du domaine AICARFT se retrouvent répartir à l’interface dimérique

entre les deux unités monomériques avec un site de liaison pour l’analogue folique sur un monomère et

un autre site de liaison pour AICAR sur l’autre monomère. Par opposition, les sites de liaisons à

l’intermédiaire FAICAR et impliquées dans l’activité IMPCHase, se retrouvent sur des monomères

uniques. La forme dimérique est donc requise pour son activité transformylase (AICARFT) laquelle ne

présente aucune ou peu d’activité enzymatique sous la forme monomérique. La structure

cristallographique d’ATIC en complexe avec AICAR montre l’existence d’un site d’arrimage pour des

groupes phosphates d’AICAR phosphorylé au niveau de la boucle d’activation du domaine AICARFT

(Cheong et al., 2004). Des études récentes impliquant des composés thérapeutiques (métothrexate,

Compound 14) établissent des liens entre état conformationnel d’ATIC et sa fonction comme il est

décrit pour des morphéines connues (Pirkmajer et al., 2015; Asby et al., 2015). Ces résultats montrent

qu’en inhibant l’homodimérisation d’ATIC on favorise l’activation de l’AMPK par une accumultaion

d’AICAR. En outre, la metformine qui est de loin le composé pharmaceutique le plus utilisé contre le

diabète, s’est vue attribuée des mécanismes moléculaires dépendant de l’activation de l’AMPK comme

ceux observés avec AICAR (Zhou et al., 2001; Sajan et al., 2010). Cependant des défaillences d’un

second traitement à la metformine chez des patients, probablement dues à une progression de la

maladie ou à une tachyphyllaxie, ont remis au goût du jour la nécessité de développer des agents

pharmaceutiques qui lui sont fonctionnellement similaires (Ferrannini, 2014). ATIC pourrait en être

une cible priviligiée. Son activité cyclohydrolase (IMPCHase) est plus importante sous forme

dimérique mais existe aussi considérablement sous forme monomérique (Vergis et al., 2004), forme

122

sous laquelle elle peut être indépendante de l’activité AICARFT. Le rôle primaire de son site actif est

d’induire un changement de conformation du substrat intermédiaire FAICAR en une conformation

favorable à une cyclisation intramoléculaire impliquant des résidus (Ile126 and Gly127) du domaine

IMPCHase. Il en ressort que d’autres résidus incluant une tyrosine (Tyr104) peuvent être associés à la

spécificité de liaison à des substrats différents (Wolan et al, 2004). En outre, une fusion de gène du

domaine IMPCHase avec une tyrosine kinase connue (ALK) a permis de favoriser une tyrosine

phosphorylation constitutive de la protéine codée (Zhigui Ma et al., 2000). Nos essais in vitro avec du

RI immunoprécipité de fractions G/E hépatiques de rats, montrent une affinité insulino-dépendante

d’ATIC vis-à-vis du RI phosphorylé. Ils établissent de manière certaine que l’ajout d’ATIC à nos

fractions favorise sa tyrosine phosphrylation et nous pose donc la problématique d’un lien structurel

possible entre ATIC et le RI, probablement par des résidus tyrosines du domaine IMPCHase (Lee et

al., 2006).

Fort de ces liens structures-fonctions d’ATIC et des premiers résultats thérapeutiques récents qui en

découlent et confirment l’importance de notre réseau (Boutchueng et al., 2015; Pirkmajer et al., 2015;

Asby et al., 2015), il paraît raisonnable de se poser la question de l’appartenance d’ATIC à une

académie de morphéines. Des analyses structurelles plus approfondies sur les liens d’ATIC et les

différents composants de l’IRGEN dont le RI ou encore PTPLAD1 permettront certainement d’y

trouver une réponse définitive.

4.5.3. Mécanismes moléculaires de trafic du récepteur de l’insuline in vivo chez la souris

Outre les analyses structurelles préconisées plus haut, il serait tout aussi intéressant de confirmer si

l’effet phosphatase observée chez PTPLAD1 est un effet direct, auquel cas il sera question ici

d’identifier le motif séquentiel impliqué. On pourrait ensuite se projeter davantage dans des modèles

animaux, en vue d’y évaluer la solidité des mécanismes moléculaires et de ressortir leur importance

pathophysiologique ou thérapeutique avec des interacteurs moéculaires comme les peptides cycliques

qui permettront de manipuler un résau plus qu’une voie métabolique particulère.

123

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