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Troubleshooting de Vials:

Revisão dos parâmetros críticos em sistemas de injeção

Sandra Cachopo & Pedro Batista 13 de Outubro 2016


Bom dia a todos!

Sejam bem vindos a mais um seminário online da Waters.

Já iniciamos o nosso seminário e caso não nos esteja a ouvir

indique-nos, por favor, através do chat.

Assim que apresentação termine irá aparecer no vosso

ecrã um pequeno questionário o qual agradecemos a

vossa participação no envio de uma resposta.

Muito obrigada a todos!


Desafios nos laboratórios

Realizar e assegurar a exatidão dos resultados cromatográficos

através de uma abordagem de garantia de qualidade.

Trabalhar com métodos robustos que forneçam resultados

sólidos, fiáveis e duradouros.

Minimizar o tempo que é utilizado para o diagnóstico de

problemas de mau funcionamento.


Tempo de Retenção Área

Linearidade

Resolução

Tailing Número de pratos

teóricos Ruído

Estratégia de Troubleshooting

Reservatório de solventes

Bombas Injector

Coluna

Detector


Problemas associados aos vials

À partida é o último parâmetro a considerar em caso de problemas*, no entanto, deverá ser considerado e analisado no início para a resolução de problemas.

(*) Problemas: - Forma de pico - Área/Sensibilidade - Linearidade - Contaminação cruzada - Contaminação: picos fantasma - Mau funcionamento dos equipamentos


Agenda

Origem dos problemas cromatográficos

relacionados com o injetor

Contribuição dos vials para os problemas

cromatográficos

– Aspectos Dimensionais

– Aspectos Químicos

Vials Certificados: a qualidade dos vials e a sua

contribuição para a qualidade das análises em LC


Agenda




cromatográficos






Problemas com origem no injetor

Injetor

– Parâmetros programados erroneamente

– Ar na seringa de injeção ou seringas de lavagem

– Volume de injeção inconsistente ou fora da gama de injeção

– Loop obstruído

– Loop mal configurado

– Parafusos e ferrrules “cravados” incorretamente

– Seringa danificada ou mal configurada

– Seringa contaminada

– Fuga nas válvulas

– Fuga nos retentores

– Volume de amostra insuficiente no vial para realizar a injeção

– Vial colocado numa posição errada

– Utilização de vials inadequados

– Solventes do injetor inadequados


Possíveis problemas relacionados com sistema de injeção: “Carryover”

Problema Origem Injector Solução

Mais picos que os esperados, ou maior área que o esperado

Carryover: compostos que se arrastam de uma injeção anterior. Pode dever-se a: 1. Injetor que não limpa

corretamente/suficientemente entre cada injeção

a. Sistema de lavagem da agulha/injetor não funciona

b. Solventes de lavagem da agulha/injetor inadequados

c. Tempo de limpeza insuficiente.

d. Solventes de lavagem da agulha/injetor contaminados

e. Vials inadequados: fontes de contaminação

2. Coluna que não se limpa

corretamente/suficientemente entre cada injeção.

Verificar o equipamento para diagnosticar a origem da contaminação (documento de ajuda: diagnóstico de contaminação) Determinar se o carryover é na coluna ou no injetor.

a. Verificar o injetor e substituir peças defeituosas

b. Verificar os solventes de limpeza da agulha/injetor e substituir por uns mais adequados ao método

c. Aumentar tempo/volume de limpeza no método

d. Fazer uma injeção em full loop, se a cromatografia está ok, o solvente de limpeza está contaminado.

e. Descartar vials como fonte de contaminação (trocar vials, eliminar septo)

- Implementar fase de limpeza no gradiente ou tempo entre injeções.

?


Possíveis problemas relacionados com sistema de injeção: Forma de pico

Problema Origem Injetor Solução

Picos largos ou com “Tailing”

Volume de injeção ou concentração da amostra demasiado elevada Solvente de dissolução da amostras demasiado orgânico em relação à fase móvel Solvente de purga do injetor com demasiado orgânico Modo de injeção inadequado (no caso de injetores com vários modos de injeção) Parafusos e ferrules conectados de modo incorreto e que provocam um volume morto.

Reduzir para a metade o volume de injeção para verificar se esta na origem do problema. Diluir a amostras caso seja necessário. Verificar e substituir se necessário. Diluir a amostra com fase móvel (se possível) Solvente de purga deve ter composição similar a fase móvel inicial (proporção orgânico/água) e deve ser compatível com o solvente de dissolução da amostra. Testar com outro modo de injeção. Por ex. com Full Loop, podemos estar a injetar uma quantidade demasiada alta para a coluna. Verificar ligações. Corrigir problemas com as ligações


Possíveis problemas relacionados com sistema de injeção: Forma de pico

Problema

Origem Injector Solução

Picos com “ombros” ou Fronting Picos saturados

Volume de injeção demasiado grande ou concentração demasiada alta ( sample overload) Solvente de dissolução da amostra demasiado orgânico Composição do solvente de purga do injetor demasiado orgânico Volume ou concentração de amostra injetada demasiado elevado .

Diluir amostra ou reduzir volume de injeção. Reduzir volume de injeção ou diminuir percentagem de orgânico no solvente de dissolução da amostra Solvente de purga do injetor deve ter composição semelhante a da fase móvel Diluir amostra ou reduzir volume de injeção.


Possíveis problemas relacionados com sistema de injeção: Perda de sensibilidade

Problema

Origem Injector Solução

Linha de base plana Perda de Sensibilidade

Não injetou Agulha ou loop obstruído Volume de injeção incorretamente programado Injetor mal configurado Concentração insuficiente A amostra não esta completamente dissolvida ou precipita ao longo do tempo. Amostra evapora ou degrada-se Amostra aderida ao vial ou partes do injetor (por exemplo com agulha de peek, os compostos hidrofóbicos ficam aderidos a agulha )

Verificar que existe volume suficiente de amostra no vial, se a sua posição é a correta. Teste de pesagem do vial para verificar que aspira amostra corretamente. Substituir agulha ou Loop Verificar volume de injeção Verificar volume do loop e agulha. Caracterizar novamente volume de loop e agulha Aumentar a concentração ou volume de injeção. Verificar a solubilidade e se necessário aumentar a temperatura do compartimento de amostras (a baixas temperaturas pode precipitar) Diminuir a temperatura do compartimento de amostras. Utilizar vials adequados (descativados, plástico). Utilizar peças do injetor adequadas (experimentar outro tipo de agulhas)


Possíveis problemas relacionados com sistema de injeção: Perda de sensibilidade

Problema

Origem injector Solução

Perda de sensibilidade

Agulha calibrada demasiado alta, ou mal programada no método Solventes do injetor: demasiado orgânico, resulta em má forma de pico, especialmente para os compostos mais hidrofílicos Seringa da amostra: Não se purgou bem ou existem bolhas de ar. Seringa de amostras mal configurada Fuga no injetor (seringa, loop, agulha…) Velocidade de aspiração da seringa demasiado alta. Pode originar bolhas Bolha de ar no fundo do vial. Típico na utilização de inserts Volume de amostra inferior ao volume residual do vial ou placa. Efeito vácuo/pressão vial

Realizar nova calibração Z da agulha. Comprovar que a altura da agulha no método é correta. Mudar a composição dos solventes do injetor. Purgar o injetor e verificar a agulha Verificar a configuração do injetor Realizar teste de fugas ao injetor. Verificar fugas nas ligações do injetor. Mudar a velocidade de aspiração no método. Colocar volume de amostra superior ao volume residual. Verificar volumes residuais de cada vial ou placa. Utilizar septos pre-slit


Possíveis problemas relacionados com sistema de injeção: Variação tempos de retenção

Problema Origem injetor Solução

Diminuição progressiva do Tr Incremento progressivo do Tr Alteração do Tr para um novo valor fixo

Solução de dissolução da amostra mais forte que a fase móvel Volume de injeção e concentração excessivos Em modos de injeção PLUNO quando o solvente de purga (Weak Wash) é diferente da fase móvel.

Reduzir o volume de injeção ou diluir com a fase móvel. Quando se utiliza um solvente mais fraco que a fase móvel pode injetar-se até 10% do volume da coluna, mas se este solvente é mais forte, o valor máximo é de 1%. Reduzir o volume de injeção ou diluir com a fase móvel. Quando se utiliza um solvente mais fraco que a fase móvel pode injetar-se até 10% do volume da coluna, mas se este solvente é mais forte, o valor máximo é de 1%. Verificar ou mudar o solvente de purga do injetor por um adequado e voltar a caracterizar o volume do sistema.


Agenda




cromatográficos






Variação na aspiração do volume de amostra – implicação na

reprodutibilidade

Evaporação

Desenho da agulha– seleção correta do vial

Deslocamento do septo

Agulhas danificadas– implicações no funcionamento do

equipamento

Mechanical Issues

Total Recovery Max Recovery QSert

Aspectos Dimensionais


Sintoma – área de pico aumenta em relação à primeira injeção do

mesmo vial

o Primeira injeção– área do pico menor

o Injeções posteriores– área de pico maior

Possível causa:

– Inadequada ventilação – formação de vácuo

o A formação do vacúo provoca perda de parte da amostra na retirada da

agulha (quando sai do vial)

Teste – confirmação

– Eliminar a tampa e septo do vial

– Realizar múltiplas injeções

– Área de pico consistente – o problema resolvido

Variação na aspiração do volume da amostra


Recomendação

– Utilização de septos com “pre-slit” para uma melhor precisão na

aspiração da amostra

Não podendo utilizar septos “pre-slit” (relacionado com a evaporação)

– Conselho:

o Não encher os vials até ao topo

Variação na aspiração do volume da amostra


Pode ser causada por:

– Perda de solvente

o Septo resselável

• “Slit” ou “no-slit”

o Septo não resselável

– Perda de analito da amostra

Estudo de evaporação:

Septo (PTFE/Silicone) “pre-slit” vs “no slit”

– Acetona – volátil (T ambiente ~20 C)

o Septo perfurado com agulha Alliance

o 20 vials para cada condição

Evaporação

Non Slit Slit

No pierce 2 hours 0 0

3 days 0.16% 2.16%

Pierced 2 hours 0 0

3 days 1.53% 3.20%


Perda por evaporação – septo não resselável

Apenas PTFE – não resselável – grande perda

PTFE / Silicone – resselável

Temperatura ambiente ~20 C

-8.0%

-7.0%

-6.0%

-5.0%

-4.0%

-3.0%

-2.0%

-1.0%

0.0%

0 5 10 15 20 25 30

% lo

ss

Hours

Perda por Evaporação

50/50 Acetonitrile/Water

PTFE

Slit PTFE/Silicone


Evaporação - Perda do analito

~1.5% perda por evaporação ~10 C

Concentração do analito varia

– Naftaleno (neutral + menor MW) evapora

– Componentes polares (ex: propranolol) não

QCRM 186006363 Methanol/20 mM potassium phosphate

-100000

-80000

-60000

-40000

-20000

0

20000

40000

60000

0 20 40 60 80

Ch

an

ge P

eak A

rea

Hours in Vial

Concentração do Analito

propranolol

amitriptyline

butyl paraben

naphthalene

dipropyl phthalate

acenaphthene

propranolol

naphthalene

amitriptyline

butyl paraben

dipropyl phthalate

propranolol amitriptyline naphthalene

% Change 19.73% 19.23% -62.59%

MW 296 277 128

BP 435C 398°C 78°C

http://www.google.com/url?url=http://lifeinthefastlane.com/toxicology-conundrum-044/&rct=j&frm=1&q=&esrc=s&sa=U&ei=-z72U8X6GqzNsQTuuICwCA&ved=0CCoQ9QEwCg&usg=AFQjCNG1m9gJumfLy8RraD8LoZCw85vKUg

http://www.google.com/url?url=http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Amitriptyline-2D-skeletal.png&rct=j&frm=1&q=&esrc=s&sa=U&ei=5ED2U87gGZLnsAS0zILwAw&ved=0CCAQ9QEwBQ&usg=AFQjCNEDom5zyadyr0RxOtH_9bwVwdT_9A


Evaporação - Recomendações

Considerar:

Volatilidade do analito/solvente

Tempo que amostra permanece nos vials após a primeira injeção da

agulha

Septos resseláveis ou não

Opções:

Tempos de análise curtos:

– Muitas possibilidades- incluindo septo não resselável

Tempos de análise longos: requer septo resselável ou septo “no slit”

– Re-injetar a amostra – muito tempo após injeção inicial

o Dividir a amostra em mais do que um vial

o Refrigerar as amostras


Desenho da agulha

Desenhos de agulha diferentes:

– Agulha ACQUITY UPLC H-Class com

orifício de aspiração na extremidade

– Agulha Alliance – agulha com orifício

de aspiração lateral

– Agulha “Fixed Loop” ACQUITY UPLC

Binário com agulha de punção –

sucção na ponta da agulha

o Agulha que desliza através do

interior da agulha de punção

Piercing Needle

Sample Needle

Bottom Draw


Desenho da agulha

Agulha dos sistemas Alliances

– Combinação vial/desenho da agulha para correta aspiração da

amostra

– Agulha com orifício lateral

Vial de 2 mL Vial Total Recovery


Desenho da agulha

Agulha dos sistemas ACQUITY UPLC H-Class

- Vials Maximum Recovery – aspira o volume limitado de amostra volume limitado de amostra no centro do vial

Vial Max Recovery Agulha com aspiração na ponta


Desenho da agulha “Default offset”

Os sistemas de injeção têm um “Default offset” ou posicionamento da agulha por defeito – Direção Z – onde pára a agulha

Uma definição incorrecta do “Needle offset” pode:

– Incapacitar a aspiração suficiente da amostra do vial

– Volume residual excessivo

– Danificar a agulha

– Danificar o vial


Desenho da agulha - Recomendações

Conhecer especificações dimensionais do injetor

Calibrar o posicionamento da agulha

Escolher o desenho do vial para maximizar o volume de

amostra (volume total e volume residual)


Desenho da agulha - Recomendações

Selector de Vials http://www.waters.com/app/selector/en/vials.html



Calibrar posicionamento da agulha para evitar danos – ex. Z

Alinhar injetor /rack vials ou carrossel para punção central no septo

Sistemas não alinhados e posição incorrecta da agulha podem causar

danos na agulha e/ou rutura do vial

Teflon

Silicone


Deslocamento do septo Desenho da agulha pontiaguda vs redonda

Possíveis razões para as agulhas arredondadas:

– A agulha pode ficar arredondada ao furar uma

superfície dura

– Não visível a uma simples vista

Agulhas arredondadas requerem 3-5 vezes mais

de força para perfurar o septo

O deslocamento do septo pode ser um sinal ou

aviso de um problema no sistema de injeção

Pontiaguda

Arredondada


Deslocamento do septo O que acontece durante a punção

Com agulha afiada: – Silicone é elástico e a agulha estica e

separa.

– Película de PTFE– estica até à rutura – não tem a elasticidade do silicone

Com agulha arredondada: – Silicone não se separa facilmente e terá

dificuldades em romper a película de PTFE.

– O septo cede até à rutura da película de PTFE ou o septo descola da tampa



Pode também acontecer a aspiração de

parte do material do septo provocando

uma obstrução na agulha podendo ficar

danificada:

– Em situações em que os vials possuem

amostras congeladas


Deslocamento do septo - Recomendações

Não aplicar demasiada força ao enroscar a tampa

Calibrar posicionamento da agulha para evitar danos– ex. Z

Definir “Default Offset” adequado

Alinhar injetor/rack vials ou carrossel para punção central

do septo

Utilizar tampas com septo adequado e proporção ótima de

PTFE/Silicone


Agulha danificada

A agulha fica danificada ao romper uma superfície dura:

– Vial inadequado (ou inadequado “Needle Offset”)

– Pode alterar a capacidade resselável do silicone ao deformá-lo: falta

de reprodutibilidade de áreas


Agulha danificada

Vial fora de tolerância Vial Certificado Waters

Todos os recipientes de vidro necessitam de um fundo côncavo para ser estável.

Para injetores– largura deve ser controlada.

O fundo deste vial pode danificar a agulha e até pode ocorrer a

rutura do vial


Agulha danificada - Recomendações

Vials com tampas e septos adequados

“Needle offset” em função do vial

Dimensões adequadas do vial:

• Altura

• Largura

• Rosca

• Proporção Silicone/PTFE e características do material (rigidez, fragilidade)

• O vial deve ser cilíndrico com septo centrado para punção

Vials fora das tolerâncias dimensionais podem causar danos na agulha!


Aspectos Dimensionais Resumo

Considerar o tipo de agulha do injetor

– Calibrar posicionamento da agulha, alinhamento

o Evitar falhas de injeções e danos na agulha

Septo “pre-slit” recomendado para uma melhor injeção e uma

aspiração precisa e repetitiva da amostra

Considerar vials adequados para o volume de amostras limitado

- seguir recomendações do fabricante.

Os vials certificados asseguram a qualidade!


Picos fantasma

– Provenientes do septo

Degradação analito/amostra

Adsorção analito/amostra no vial

Mechanical Issues Aspectos Químicos

Vidro (superfície polar Si-O-H)

Tampa (PP/PE, polímeros)

Septo (Silicone/PTFE, polímeros)


Picos fantasma

Produção do Vidro – processo final de “annealing”

– Resultado: superfície polar muito limpa e seca

– Facilita a aderência de impurezas

– Podem ser resíduos de:

o Processamento incompleto

o Manipulação inapropiada

o Processo de embalamento

Septo

– PTFE/Silicone

o Processo incompleto– podem originar picos (depende detector/sensibilidade)

Cuidado!:evitar que o laboratório seja a origem

• Manipulação (rotulagem) e armazenamento

• Equipamentos mais sensíveis

Surfactantes, Lubrificantes, Antiestáticos, Antioxidantes, Silicone baixo Mw


Escolha o septo correcto

Material Compatibility Recommendations Self Sealing Max. Temp.

PTFE (Teflon) +

PE Septumless

All solvents;

Ideal for MS applications

Only suitable for one injection -

evaporationNo

260°C PTFE

80°C for PE

PTFE/Silicone

PTFE resistance until

punctured. After 1st

injection: alcohols,

acetone, ether, DMF, DMSO

Recommended for multiple

injections and sample storage.Very good 200°C

PTFE/Silicone

pre slitsame as above

Very good for multiple injections.

Eliminates vacuum formation and

delivers excellent reproducibility.

Prevents coring from bottom draw-

port needles.

Good 200°C


Picos fantasma Provenientes do septo

Resistência a solventes de lavagem

(PTFE/Silicone)

– Agulhas “Flow through” FTN

o maioria dos injetores Alliance e ACQUITY H-

Class e I-Class

– Ao inserir a agulha no septo, o solvente lavagem

da agulha entra em contacto com septo

– Ao retirar a agulha a amostra entra em contacto

com o solvente de lavagem

Se re-injetarmos do mesmo vial:

o Contacto agulha com solvente de lavagem da

injeção anterior

o Os solventes pode solvatar algo do septo e a

agulha levará a contaminação para a amostra

o Aparecem picos na segunda injeção e em

posteriores

Solvente de lavagem da agulha

Septo degradado com o solvente de lavagem


Picos fantasma Provenientes do septo - Múltiplas injeções

Alliance HPLC / ELSD, THF como solvente lavagem da agulha

Pico inesperado

Linha de base verde - vial sem septo


Tabela criada segundo as recomendações dos fornecedores de vials

Classificação com base na utilização feita

Coluna com indicações de silicone provém de PTFE/silicone – resistência do

PTFE até perfuração

Solvent PTFE PE Silicone Chemical Resistance Rating

Acetone A A D A = excellent resistance

Acetonitrile A A B B = good

Acetic Acid A A A C = fair

Chloroform A A B D = poor

Dimethyl formamide A A D

Dimethyl sulfoxide A A C

Ethanol A A B

Ethyl acetate A A A

Ethyl ether A A D

Heptane A A D

Hexane A A B

Methanol A A A

Methylene chloride A A D

Methyl ethyl ketone A A C

Isopropanol A A A

Tetrahydrofuran A A D

Toluene A A B

Water A A A

Resistência Química


Picos fantasma Provenientes septo - Recomendações

Condições Químicas

– Utilizar a menor % ACN na lavagem da agulha

Escolha correcta do septo

– Utilizar septos de acordo com a resistência a químicos

Estratégia injeção da amostra

– Dividir as amostras em diferentes vial

– Evitar re-injeção/contaminação

Nota: Considerar que a maior sensibilidade do sistema requer

material mais exigente - utilização de Vials Certificados.


Degradação dos analitos

Analitos sensíveis à luz: vials âmbar filtram alguns comprimentos de onda

da luz

Analitos sensíveis ao pH: Atenção! o vidro pode aumentar o pH das

soluções aquosas.

Recomendações:

– Vials de plástico

– Vials TruView– são neutros

– Amostras tamponadas

Vidro âmbar Vidro claro


Adsorção de analitos

O vidro contem intercambiadores iónicos, grupos silanois na sua

superfície que pode ser complexa e alguns analitos podem ter uma

grande reactividade (mais crítico para concentrações muito pequenas).


Adsorção de analitos Recomendações

Vials vidro desactivado (DV): vidro tratado com organosilano

para neutralizar os grupos silanóis da superfície e tornar a

superfície hidrófobica.

Vials TruView™: proceso patentado de produção do vidro.

Vials de plástico: polipropileno PP.


Agenda




cromatográficos






Vials Certificados

Testing LC/GC Certified LCMS Certified TruView LCMS Certified

Dimensions

Septum GC Test

HPLC UV Test - residues

MS Scan - ionizable masses

and polymer

Low Adsorption Test - ng/mL

level

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Recommended

Analyte Concentration µg/mL 100's ng/mL ng/mL or less

Detection UV/ RI MS more sensitive MS

Key Features cleaner septa

low adsorption glass,

cleanest/lowest bleed

septum

Certification Tests

Certificação para garantir a qualidade dimensional-

composicional dos vials em análise LC


Vials Certificados


Vials Certificados Recomendações

Analyte

ConcentrationDetection Source

Recommended

Product

µg/mL UV, RI (non MS) LC/GC Certified Vials

100's ng/mLsingle quadrapole and

older MS/MSLCMS Certified Vials

1 ng/mL and

lowerMS/MS

Truview LCMS

Certified Vials


Documentação técnica

Catálogo 720001818EN

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