In addition,polysaccharides may be produced as a by-product of bacteria, such as inyogurt. Recent applications of nonstarch polysaccharides in breakfast cerealsand snack food products have increased due to their perceived physiologicaleffects and health benefits. 2.1 Pendahuluan

Karbohidrat adalah salah satu bahan yang paling penting dalam makanan dan bahan mentah. Yang mungkin terjadi secara alami atau sengaja ditambahkan ke produk makanan untuk menyediakannutrisi dan, dalam banyak kasus, untuk meningkatkan kualitas tekstur dan kualitas keseluruhan dariproduk makanan.

Polisakarida secara alami dalam makanan merupakan bagian intrinsik atau bawaan bahan baku. Misalnya, pati adalah karbohidrat yang paling berlimpah alami dalam produk makanan, diikuti oleh pektin, hemiselulosa dan material dinding sel.

Polisakarida Banyak juga ditambahkan dalam sistem pangan sebagai stabilisator danserat makanan. Misalnya, kacang locust dan guar gum yang digunakan untuk menstabilkanemulsi dan menghambat pertumbuhan es kristal es krim. Banyak polisakarida gum lainnyayang telah banyak digunakan dalam roti dan produk susu untuk meningkatkan sifat tekstur dan organoleptik dipanggang dan sebagai gelling agen untuk membuat makanan penutup (lihat Bab 6 untuk rincian).

Selain itu,polisakarida dapat diproduksi sebagai produk-oleh bakteri, seperti pada yoghurt. Baru-baru ini aplikasi dari polisakarida tanpa pati dalam sarapan sereal dan produk makanan ringan telah meningkat karena fisiologis mereka dirasakan efek dan bermanfaat bagi kesehatan. Kelompok ini disebut komponen makanan berserat. Misalnya, galactomannans dan sereal-glukan yang dapat mengurangi serum kolesterol dan kadar glukosa darah tipis sedangkan psyllium dan biji ramipermen telah digunakan sebagai obat pencahar.

Terlepas jika mereka ditambahkan atau terdapat dalam makanan indigenously, yang paling penting untuk diketahui jenis apa dan berapa banyak karbohidrat yang hadir dalam sistem makanan. Bab ini menjelaskan metode yang digunakan untuk penentuan karbohidrat total dan asam uronic, serta untuk menganalisis oligosakarida dan makanan serat dalam produk makanan.

2.2 Analisis Gula TotalSebagai kelompok, karbohidrat yang cukup heterogen, berbeda dengan struktur primerStruktur (ukuran cincin dan bentuk), derajat polimerisasi (mono dengan oligo dengan polisakarida), karakteristik makromolekul (struktur linear dengan cabang struktur kompak), hubungan (i.e atau glikosidik linkage, posisi linkage), dan biay.

(lihat Bab 1 untuk cakupan lebih rinci struktur karbohidrat).

Perbedaan fisik dan kimia menimbulkan sifat yang berbeda, termasuk kelarutan, reaktivitas, dan kerentanan terhadap enzim pencernaan. Dari perspektif analitis, situasi yang paling sederhana adalah di mana hanya ada satu jenis karbohidrat yang hadir dalam sampel dengan campur senyawa yang minimum - pengukuran oligomer glukosa dalam sirup jagung, sebagai contoh dalam hal ini reaktivitas yang berbeda dari gula berdasarkan struktur (misalnya, bentuk ketosa atau heksosa),

biaya dan jenis (misalnya, glukosa dengan arabinosa) tidak menimbulkan masalah. Kasus ini adalah yang paling sering meskipun, terutama dengan bahan baku (misalnya, benih, biji-bijian sereal) dan produk makanan (es krim, dipanggang), dengan berbagai jenis karbohidrat yang hadir dalam sampel dengan senyawa lain termasuk lipid terlarut, protein, dan mineral. Kelompok heterogenitas dari senyawa dapat membuat menganalisis karbohidrat total dalam sampel yang cukup kompleks.

2.2.1 Preparasi SampelSebelum menganalisis untuk setiap kelompok karbohidrat, apakah itu monosakarida atau

bahan selulosa yang larut, sampel harus siap sehingga zat-zat yang dapat mengganggu analisis dapat dihilangkan. Untuk sampel yang sudah disiapkan larutan gula esensial (jus, madu) preparasi sampel yang diperlukan sangat sedikit. Sebagai contoh lain, seperti biji minyak, sereal atau seluruh makanan,lemak, protein, pigmen, vitamin, mineral, dan senyawa lain berbagai harus dihapus sebelum analisis. Beberapa prosedur rinci diuraikan dalam literatur untuk menghilangkan zat-zat sebelum analisis gula sederhana atau polisakarida.

Perlu dicatat bahwa sejauh mana persiapan sampel yang diperlukan juga tergantung pada analisis teknik dan / atau peralatan yang digunakan. Umumnya, sampel yang dikeringkan dantanah pertama, diikuti oleh langkah defatting. Pengeringan bisa dilakukan di bawah vakum, pada tekanan atmosfer, atau untuk sampel yang sensitif terhadap pemanasan, dalam freeze dryer. Sampel, sekali tanah untuk ukuran mesh /partikel tertentu, yang dihilangkan lemaknya menggunakan pelarut nonpolar seperti heksana atau kloroform. Karbohidrat dengan berat molekul rendah maka dapat diekstraksi dengan menggunakan etanol panas 80%. Ekstrak etanol tersebut akan mengandung garam mineral, pigmen, dan asam organik serta gula dan protein dengan berat molekul rendah, sedangkan residu utama akan mengandung protein dan karbohidrat dengan berat molekul tinggi termasuk selulosa, pektin, pati, dan makanan kenyal (hidrokoloid) yang mungkin ada.

Protein umumnya dihilangkan dari sampel menggunakan protease seperti papain. Polisakarida larut air dapat diekstraksi menggunakan air dan dipisahkan dari bahan terlarut dengan sentrifugasi atau penyaringan. Tergantung pada senyawa penting dalam sampel, pengobatan enzimatik dengan α –amilase dan / atau amiloglukosidase dapat digunakan untuk membersihkan sampel pati. Dalam hal ini pati dihidrolisis menjadi glukosa, yang dapat dipisahkan dari polisakarida berat molekul tinggidengan dialisis atau dengan mengumpulkan bahan berat molekul tinggi sebagai endapan setelah membuat larutan pada etanol 80%.

Glukosa larut dalam etanol 80% sedangkan material polisakarida tidak. Metode kimia yang berlaku untuk gula netral, fenol- sulfat uji asam dan uji antron, adalah metode klasik yang telah lama digunakan, meskipun uji asam fenol-sulfat mungkin lebih populer dari keduanya.

Sebuah metode analisis kimia untuk asam uronat yang tersusun juga diuraikan. Metode enzimatik, sementara banyak digunakan dan tersedia, umumnya khusus untuk satu atau lebih gula dalam sampel. Metode kimia seperti uji asam fenol-sulfat dapat dimanfaatkan untuk memberikan perkiraan nilai, tetapi karena gula yang berbeda dalam larutan bereaksi berbeda dengan reagen uji, pengukuran gula total akan menjadi estimasi yang didasarkan pada reaktivitas gula yang digunakan untuk membangun kurva kalibrasi (biasanya glukosa). Jika nilai perkiraan atau estimasi adalah semua yang diperlukan maka Metode ini sudah cukup. Ketika jumlah yang tepat dari setiap hadir gula

diperlukan, metode enzimatik yang sangat spesifik yang lebih tepat. Hal inisering dilakukan oleh analisis instrumental seperti yang dijelaskan pada Bagian 2.3.

2.2.2 Uji Fenol-Asam Sulfat 2.2.2.1 Teori ReaksiDi hadapan asam kuat dan panas, karbohidrat mengalami serangkaian reaksi yang mengarah pada pembentukan turunan furan seperti furanaldehyde dan hidroksimetil furaldehyde.Reaksi awal, yaitu Reaksi dehidrasi (Gambar 2.1) diikuti dengan pembentukan furan derivatif, yangkemudian mengembun dengan diri mereka sendiri atau senyawa fenolik untuk menghasilkan kompleks berwarna gelap. Gambar 2.2 menampilkan beberapa turunan furan dan karbohidratdari mana mereka berasal. Yang dikembangkan kompleks menyerap cahaya UV-VI, dan absorbansi sebanding dengan konsentrasi gula dalam linear. Sebuah absorbansi maksimum yang diamati pada 490 nm untuk heksosa dan 480 nm untuk pentosa dan asam uronic yang diukur dengan spektrofotometer UV-VI (Gambar 2.3).

.

GAMBAR 2.2Turunan furan dari (a) pentosa dan asam hexuronic, (b) heksosa, (c) 6-deoxyhexoses, dan(d) keto-heksosa, masing-masing.

GAMBAR 2.3Uji Fenol-asam sulfat absorbansi maxima untuk heksosa dan pentosa.

2.2.2.2 Operating ProcedurePhenol, in a 5 or 80% solution is added to a glass test tube containing a clearsample solution. Concentrated sulfuric acid is added in a rapid streamdirectly to the surface of the liquid in the test tube. The mixture is thoroughlycombined using a vortex mixter and then permitted to stand a sufficient timeto allow for color development. The solution absorbance is read at 490 or480 nm using a spectrophotometer, depending on the type of sugar present.Mixing and standing time should be kept the same for all samples to assurereproducible results.2.2.2.2 Prosedur OperasiFenol, dalam 5 atau 80% larutan ditambahkan ke tabung kaca yang berisi jelaslarutan sampel. Asam sulfat pekat ditambahkan dalam aliran yang cepatlangsung ke permukaan cairan dalam tabung tes. Campuran ini benar-benardikombinasikan menggunakan Mixter vortex dan kemudian diizinkan untuk berdiri waktu yang

cukupuntuk memungkinkan pengembangan warna. Solusi absorbansi dibaca pada 490 atau480 nm menggunakan spektrofotometer, tergantung pada jenis gula hadir.Mencampur dan waktu berdiri harus disimpan sama untuk semua sampel untuk menjamindireproduksi hasil.

FIGURE 2.2Furan derivatives from (a) pentoses and hexuronic acids, (b) hexoses, (c) 6-deoxyhexoses, and(d) keto-hexoses, respectively.

GAMBAR 2.2Turunan furan dari (a) pentosa dan asam hexuronic, (b) heksosa, (c) 6-deoxyhexoses, dan(d) keto-heksosa, masing-masing.

FIGURE 2.3Phenol–sulfuric acid assay absorbance maxima for hexoses and pentoses.

GAMBAR 2.3Fenol-asam sulfat uji absorbansi maxima untuk heksosa dan pentosa.

FIGURE 2.2Furan derivatives from (a) pentoses and hexuronic acids, (b) hexoses, (c) 6-deoxyhexoses, and(d) keto-hexoses, respectively.

GAMBAR 2.2Turunan furan dari (a) pentosa dan asam hexuronic, (b) heksosa, (c) 6-deoxyhexoses, dan(d) keto-heksosa, masing-masing.

FIGURE 2.4Phenol–sulfuric acid assay calibration curve.

GAMBAR 2.4Asam fenol-sulfat uji kurva kalibrasi.

2.2.2.3 QuantificationA calibration curve is constructed using the sugar being assayed. A stock1 mg/ml aqueous sugar standard solution is used to prepare 5 or 6 standardsranging from 10 to 100g/ml. Each standard is subjected to the reactionprocedure outlined above, transferred to a cuvette, and its absorbance read at480 or 490 nm. The absorbance of the blank should be subtracted from theabsorbance of the standards manually, or the blank should be used to zero thespectrophotometer. A graph of absorbance vs. concentration is constructedand the amount of analyte is derived from the calibration curve (Figure 2.4).

2.2.2.3 KuantifikasiKurva kalibrasi dibangun menggunakan gula sedang diuji. Sebuah saham1 mg / ml larutan standar gula yang digunakan untuk menyiapkan 5 atau 6 standarmulai dari 10 hingga 100μg / ml. Setiap standar terkena reaksiprosedur yang diuraikan di atas, dipindahkan ke kuvet, dan absorbansi yang dibaca pada480 atau 490 nm. Absorbansi kosong harus dikurangkan dariabsorbansi standar manual, atau kosong harus digunakan untuk nolspektrofotometer. Sebuah grafik absorbansi vs konsentrasi dibangundan jumlah analit berasal dari kurva kalibrasi (Gambar 2.4).

2.2.2.4 ApplicabilityThe phenol–sulfuric method is widely used to determine the total concentrationof carbohydrates in a sample. It can be used on lipid-free extracts fromcereals, seeds, and plants, provided the sample is in solution, and is appropriatefor both reducing and nonreducing sugars. It is advantageous in that thereagents are low cost and readily available, the required equipment is minimal,and the assay is simple. Additionally, it can be used to quantify monosaccharides,oligosaccharides, and polysaccharides. Absorption curves are characteristicfor different sugars; therefore, this method provides the most accurateresults when applied to samples containing only one type of carbohydrate.This assay has been used to quantify total sugars in a sample containingmore than one type of carbohydrate. In this case, glucose is often used toconstruct the calibration curve and the results are then approximate onlyand should be stated as glucose equivalents.2.2.3 Anthrone–Sulfuric Acid Assay2.2.3.1 Reaction TheorySimilar to the phenol–sulfuric acid assay, the anthrone method is based onthe condensation of furaldehyde derivatives, generated by carbohydrates in

2.2.2.4 PenerapanMetode fenol-sulfat banyak digunakan untuk menentukan konsentrasi totalkarbohidrat dalam sampel. Hal ini dapat digunakan pada ekstrak lipid-bebas darisereal, biji-bijian, dan tanaman, disediakan sampel dalam larutan, dan sesuaiuntuk kedua mengurangi dan nonreducing gula. Hal ini menguntungkan dalam bahwareagen yang murah dan tersedia, peralatan yang dibutuhkan adalah minimal,dan pemeriksaan sederhana. Selain itu, dapat digunakan untuk mengukur monosakarida,oligosakarida, dan polisakarida. Kurva absorpsi karakteristikuntuk gula yang berbeda, karena itu, metode ini memberikan yang paling akurathasil bila diterapkan pada sampel yang mengandung hanya satu jenis karbohidrat.Uji ini telah digunakan untuk mengukur total gula dalam sampel yang mengandunglebih dari satu jenis karbohidrat. Dalam hal ini, glukosa sering digunakan untukmembangun kurva kalibrasi dan hasilnya kemudian hanya perkiraandan harus dinyatakan sebagai setara glukosa.2.2.3 antron-Asam Sulfat Assay2.2.3.1 Teori ReaksiSerupa dengan uji asam fenol-sulfat, metode antron didasarkan padakondensasi derivatif furaldehide, yang dihasilkan oleh karbohidrat dalam

the presence of a strong acid, with a reagent, in this case anthrone (9,10-dihydro-9-ozoanthracene), to produce colored compounds.5

The reaction ofcarbohydrates in a strongly acidic environment with anthrone results in ablue-green color and the absorbance is read at 625 nm.2.2.3.2 Operating ProcedureA cooled mixture of 2% anthrone in concentrated sulfuric acid is mixed withan aliquot of a clear sample solution containing the sugar being assayed.After incubation in a temperature-controlled environment for sufficient timeto allow color development, the solution is poured into an appropriatespectrophotometric cuvette and the absorbance measured at 625nm.5,6

2.2.3.3 QuantificationSimilar to the phenol–sulfuric acid assay, the anthrone reaction is nonstoichemetricand therefore requires the construction of a standard curve forquantitative purposes.

2.2.3.4 ApplicabilityThe anthrone–sulfuric method is most applicable to solutions containing onetype of hexose because even sugars with similar structures result in differentrates and quantities of color development. Other sugars, such as pentosesand hexuronic acids, will also react to produce colored compounds thatabsorb at the same wavelength, but this only becomes a problem if they arepresent in a solution above a certain level.5

This assay can also be used forquantitative analysis of oligo- and polysaccharides provided only one typeis present in solution.The anthrone method has been modified for use with a micro-plate, thuspermitting the analysis of many samples within a short period of time andreducing the quantity of reagent needed.

kehadiran asam kuat, dengan reagen, dalam hal ini antron (9,10 -dihidro-9-ozoanthracene), untuk menghasilkan senyawa berwarna.5Reaksikarbohidrat dalam lingkungan asam kuat dengan hasil antron dalamWarna biru-hijau dan absorbansi dibaca pada 625 nm.2.2.3.2 Prosedur OperasiCampuran didinginkan dari 2% antron dalam asam sulfat pekat dicampur dengansebuah alikuot dari larutan sampel yang jelas mengandung gula sedang diuji.Setelah inkubasi dalam lingkungan suhu yang dikendalikan untuk waktu yang cukupuntuk memungkinkan pengembangan warna, larutan dituangkan ke yang sesuaikuvet spektrofotometri dan absorbansi diukur pada 625nm.5,62.2.3.3 KuantifikasiSerupa dengan uji asam fenol-sulfat, reaksi antron adalah nonstoichemetricdan karena itu memerlukan pembangunan kurva standar untuktujuan kuantitatif.2.2.3.4 PenerapanMetode antron-sulfat paling berlaku untuk solusi yang mengandung satujenis heksosa karena bahkan gula dengan struktur hasil yang serupa dalam berbagaitarif dan jumlah pembangunan warna. Gula lainnya, seperti pentosadan asam hexuronic, juga akan bereaksi untuk menghasilkan senyawa berwarna yangmenyerap pada panjang gelombang yang sama, tapi ini hanya menjadi masalah jika merekahadir dalam larutan di atas tingkat tertentu.5Uji ini juga dapat digunakan untukanalisis kuantitatif oligo-dan polisakarida disediakan hanya satu jenishadir dalam larutan.Metode antron telah dimodifikasi untuk digunakan dengan mikro-piring, sehinggamemungkinkan analisis sampel banyak dalam waktu singkat danmengurangi jumlah reagen yang dibutuhkan.

2.2.4 Analysis of Uronic AcidsColorimetric methods for determining uronic acids are similar to the phenol–sulfuric acid and the anthrone assay in that they are based on the reactionof a reagent with carbohydrate derivatives formed in concentrated acid. Thecarbazole assay reported by Dishe8

essentially involves mixing a samplecontaining uronic acid with concentrated sulfuric acid, heating it at 100

C,cooling it and then reacting it with 0.1% carbazole in ethanol. After sufficienttime for color development, absorbance is read at 535 nm. Modifications tothis assay include alterations to the timing of steps and reagent concentrations.9

The carbazole assay, while simple, rapid, and sensitive suffers interferencesfrom hexoses and pentoses. The replacement of carbazole withm-hydroxydiphenyl10

increased the specificity and sensitivity of the assay.

2.2.4 Analisis Asam uronat yang tersusunMetode kolorimetri untuk menentukan asam uronat yang tersusun mirip dengan fenol-asam sulfat dan uji antron dalam bahwa mereka didasarkan pada reaksidari reagen dengan derivatif karbohidrat terbentuk dalam asam pekat. itukarbazol uji dilansir dishe8dasarnya melibatkan pencampuran sampelmengandung asam uronat yang tersusun dengan asam sulfat pekat, pemanasan itu pada 100°C,pendinginan dan kemudian bereaksi dengan 0,1% karbazol dalam etanol. setelah cukupwaktu untuk pembangunan warna, absorbansi dibaca pada 535 nm. modifikasipengujian ini meliputi perubahan pada waktu langkah-langkah dan konsentrasi reagen.9The karbazol assay, sementara sederhana, cepat, dan sensitif menderita gangguandari heksosa dan pentosa. Penggantian karbazol denganm-Hydroxydiphenyl10meningkatkan spesifisitas dan sensitivitas tes.

2.2.4.1 Reaction Theory — m-Hydroxydiphenyl MethodWhile all carbohydrates react in concentrated acid to form colored compounds,uronic acids react withm-hydroxydiphenyl in a strongly acidicenvironment to form pink colored complexes. Absorbance measurementsread at 520 nm increase linearly with uronic acid concentration from 0 to100g/ml.2.2.4.2 Operating ProcedureA sample solution is thoroughly mixed with sulfuric acid containing tetraboratein a test tube and placed in a boiling water bath for 5 minutes. Afterrapid cooling in an ice water bath,m-hydroxydiphenyl is added to eachsample test tube and vortexed to ensure adequate mixing. The absorbancefor each sample is read after allowing the color to develop for 20 minutes.A sample blank (containing a sample solvent) should be prepared at thesame time as the samples.2.2.4.3 QuantificationA solution of an appropriate uronic acid standard (i.e., galacturonic acid) isused to prepare several dilutions and these are used to prepare a standard

curve. A graph of concentration vs. absorbance is constructed and the sampleabsorbance reading plotted along the curve to obtain concentration values.Standard curves typically range from 10 to 100g/ml.2.2.4.4 ApplicabilityThem-hydroxydiphenyl assay can tolerate the presence of nonuronic acidsugars, up to ~200g/ml has been reported,11

but higher concentrations ofneutral sugars may artificially increase absorbance readings. Additionally,the presence of protein in a sample may interfere with the absorbances.12

This method is appropriate for the quantification of pectic material in fruitsand vegetables13

and has been adapted for use with a micro-plate.12

2.3 Monosaccharide AnalysisThe most frequently used methods for determining the concentration ofmonosaccharides in a sample are probably gas chromatography (GC) andhigh performance liquid chromatography (HPLC). These methods can alsobe suitable for qualitative determinations provided appropriate detectionsystems and/or standards are used. Unlike enzymatic methods, which tendto be specific for one type of monosaccharide only, chromatographic techniquesprovide qualitative and quantitative information about one or severalmonosaccharides in a sample.

2.2.4.1 Teori Reaksi - m-Hydroxydiphenyl MetodeSementara semua karbohidrat bereaksi asam pekat membentuk senyawa berwarna,asam uronat yang tersusun bereaksi denganm-Hydroxydiphenyl dalam sangat asamlingkungan untuk membentuk kompleks berwarna merah muda. Pengukuran absorbansidibaca pada 520 nm meningkat secara linear dengan konsentrasi asam uronat yang tersusun dari 0 sampai100μg / ml.2.2.4.2 Prosedur OperasiSebuah solusi sampel dicampur dengan asam sulfat yang mengandung tetraboratdalam tabung reaksi dan ditempatkan dalam bak air mendidih selama 5 menit. Setelahpendinginan cepat dalam air es,m-Hydroxydiphenyl ditambahkan ke masing-masingsampel tabung reaksi dan vortexed untuk memastikan memadai pencampuran. Absorbansiuntuk setiap sampel dibaca setelah memungkinkan warna untuk mengembangkan selama 20 menit.Sebuah sampel kosong (berisi sampel pelarut) harus disiapkan disaat yang sama sebagai sampel.2.2.4.3 KuantifikasiSuatu larutan standar asam uronat yang tersusun sesuai (yaitu, asam galacturonic) adalahdigunakan untuk menyiapkan beberapa pengenceran dan ini digunakan untuk menyiapkan standarkurva. Sebuah grafik konsentrasi vs absorbansi dibangun dan sampel

membaca absorbansi diplot sepanjang kurva untuk mendapatkan nilai konsentrasi.Kurva standar biasanya berkisar dari 10 hingga 100μg / ml.2.2.4.4 PenerapanItum-Hydroxydiphenyl assay dapat mentolerir adanya asam nonuronicgula, sampai ~ 200μg / ml telah dilaporkan,11tetapi konsentrasi yang lebih tinggigula netral artifisial dapat meningkatkan pembacaan absorbansi. Selain itu,adanya protein dalam sampel dapat mengganggu absorbansi.12Metode ini cocok untuk kuantifikasi bahan pectic dalam buah-buahandan sayuran13dan telah diadaptasi untuk digunakan dengan mikro-piring.122.3 Analisis MonosakaridaMetode yang paling sering digunakan untuk menentukan konsentrasimonosakarida dalam sampel mungkin kromatografi gas (GC) dankromatografi cair kinerja tinggi (HPLC). Metode ini dapat jugacocok untuk penentuan kualitatif disediakan deteksi yang tepatsistem dan / atau standar yang digunakan. Tidak seperti metode enzimatik, yang cenderunguntuk lebih spesifik untuk satu jenis monosakarida saja, teknik kromatografimemberikan informasi kualitatif dan kuantitatif tentang satu atau beberapamonosakarida dalam sampel.

Sample preparation is simplest when starting with a relatively pure, drysample. For an HPLC analysis, the sample needs only to be finely ground,solubilized, diluted if required, and filtered prior to injection onto the column.In some cases, especially when analyzing complex food products,sample preparation becomes somewhat more complex and one or more cleanup steps may be required. Lipid soluble compounds are generally removedvia extraction with a suitable solvent, such as ether or hexane. Protein canbe removed from samples enzymatically using a suitable protease (i.e.,papain). The presence of inorganic salts can negatively affect column lifeand these can be removed using pre-packed preparatory columns thatemploy a mixed anion/cation exchange resin.When the sample starting material is a polysaccharide and a quantitativeand/or qualitative analysis of its constituent monosacharides is required,the sample must be depolymerized. This is most commonly accomplishedusing acid hydrolysis.2.3.1 Acid HydrolysisIn the presence of a strong acid and heat, the glycosidic bond betweenmonosaccharide residues in a polysaccharide is cleaved. During this reaction,one molecule of water is consumed for every glycosidic linkage cleaved.During an acid hydrolysis released monosaccharides are susceptible to degradationin the presence of hot concentrated acid. However, not all glycosidiclinkages are cleaved at the same rate and the hydrolysis time must be sufficientto hydrolyze all linkages in the sample. These two needs must bebalanced; the need for hydrolysis of sufficient strength and length to permit

complete hydrolysis, but not so long so as to lead to sample degradation.Sulfuric acid and trifluoracetic acid (TFA) are commonly used for hydrolysis.It has been reported that sulfuric acid is superior to TFA for the hydrolysisof fibrous substrates such as wheat bran, straw, apples, and microcrystallinecellulose.14

However, sulfuric acid can be difficult to remove post-hydrolysisand its presence can interfere with some analyses. TFA is volatile and canbe easily removed prior to an HPLC analysis.A hydrolysis procedure appropriate for neutral polysaccharide gums usingTFA requires heating ~10 mg of polysaccharide material in 1 ml of 1M TFAat 121C for 1 hour.2

After cooling to room temperature, the TFA can beremoved under a stream of nitrogen. A hydrolysis procedure using sulfuricacid appropriate for water soluble dietary fiber material in foods has beenoutlined. It requires mixing the sample material with 1M sulfuric acid andheating at 100C for 2.5 hours.6

Another recommended procedure for neutralpolysaccharides involves mixing 2 to 5 mg of accurately weighed dry samplewith 0.1 to 0.25 ml of 2M HCL and heating at 100C for 2 to 5 hours.15

Whilemany hydrolysis procedures exist in the literature, when working with anew or unknown polysaccharide, it is best to check that the hydrolysisprotocol is not resulting in excessive decomposition and is also cleavingbonds quantitatively. This is done by subjecting the sample to a chosen

Persiapan sampel yang paling sederhana ketika memulai dengan relatif murni, keringsampel. Untuk analisis HPLC, sampel hanya perlu digiling halus,dilarutkan, diencerkan jika diperlukan, dan disaring sebelum injeksi ke dalam kolom.Dalam beberapa kasus, terutama ketika menganalisis produk makanan yang kompleks,persiapan sampel menjadi agak lebih kompleks dan satu atau lebih bersihup langkah mungkin diperlukan. Senyawa larut lipid umumnya dihapusmelalui ekstraksi dengan pelarut yang cocok, seperti eter atau heksana. Protein dapatdihapus dari sampel enzimatis menggunakan protease yang sesuai (yaitu,papain). Keberadaan garam-garam anorganik negatif dapat mempengaruhi kehidupan kolomdan ini dapat dihapus dengan menggunakan kolom persiapan pra-dikemas yangmempekerjakan anion / kation resin penukar campuran.Ketika bahan awal sampel adalah polisakarida dan kuantitatifdan / atau kualitatif analisis monosacharides penyusunnya diperlukan,sampel harus Depolymerized. Hal ini paling sering dilakukanmenggunakan hidrolisis asam.2.3.1 Asam HidrolisisDi hadapan asam kuat dan panas, ikatan glikosidik antararesidu monosakarida dalam polisakarida yang dibelah. Selama reaksi ini,satu molekul air yang dikonsumsi untuk setiap linkage glikosidik dibelah.Selama hidrolisis asam monosakarida dirilis rentan terhadap degradasidengan adanya asam panas pekat. Namun, tidak semua glikosidikhubungan yang dibelah pada tingkat yang sama dan waktu hidrolisis harus cukupuntuk menghidrolisis semua hubungan dalam sampel. Kedua kebutuhan harus

seimbang, kebutuhan untuk hidrolisis kekuatan yang cukup dan panjang untuk mengizinkanhidrolisis lengkap, tapi tidak begitu lama sehingga menyebabkan degradasi sampel.Asam sulfat dan asam trifloroasetat (TFA) biasanya digunakan untuk hidrolisis.Telah dilaporkan bahwa asam sulfat lebih unggul TFA untuk hidrolisissubstrat berserat seperti dedak gandum, jerami, apel, dan mikrokristalinselulosa.14Namun, asam sulfat bisa sulit untuk menghapus posting-hidrolisisdan kehadirannya dapat mengganggu beberapa analisis. TFA stabil dan dapatdengan mudah dihilangkan sebelum analisis HPLC.Sebuah prosedur hidrolisis yang tepat untuk gusi polisakarida netral menggunakanTFA membutuhkan pemanasan ~ 10 mg bahan polisakarida dalam 1 ml 1M TFApada 121°C selama 1 jam.2Setelah pendinginan sampai suhu kamar, TFA dapatdihapus di bawah aliran nitrogen. Sebuah prosedur hidrolisis menggunakan sulfatasam yang sesuai untuk larut dalam air bahan serat dalam makanan telahdiuraikan. Hal ini membutuhkan pencampuran bahan sampel dengan 1M asam sulfat danpemanasan pada 100°C selama 2,5 jam.6Prosedur lain direkomendasikan untuk netralpolisakarida melibatkan pencampuran 2 sampai 5 mg akurat ditimbang sampel keringdengan 0,1-0,25 ml 2M HCL dan pemanasan pada 100°C selama 2 sampai 5 jam.15Sementarabanyak prosedur hidrolisis ada di literatur, ketika bekerja denganbaru atau polisakarida diketahui, yang terbaik adalah untuk memeriksa bahwa hidrolisisprotokol tidak mengakibatkan dekomposisi yang berlebihan dan juga membelahobligasi kuantitatif. Hal ini dilakukan dengan menundukkan sampel ke terpilih

hydrolysis protocol and monitoring the quantity of each sugar present inthe solution at timed intervals. As hydrolysis proceeds, the quantity of eachsugar should increase until all of that sugar present has been released fromthe polysaccharide. Degradation of released sugars will be evident as adecrease in monosaccharide concentration as hydrolysis time increases.Table 2.1 summarizes various hydrolysis procedures found in the literature.The following two sections outline the chromatographic techniques mostfrequently used for the analysis of monosaccharides.Samples containing acidic sugar residues such as pectins and certain fungalpolysaccharides can be difficult to hydrolyze quantitatively using traditionalmethods that employ TFA or sulfuric acid. The difficulty arises fromthe disparate susceptibilities to hydrolysis of neutral and acidic sugar residuesas well as different linkage types. In cases where quantitative hydrolysiscannot be achieved, qualitative information can be obtained using an appropriatechromatographic technique post–acid hydrolysis (see next sections),and the uronic acid content determined using the spectrophotometricmethod outlined in Section 2.2.4.

2.3.2 Gas-Liquid Chromatography (GC)Gas-liquid chromatography is a technique whereby components in a mixtureare separated based on their degree of affinity for or interaction with a liquidstationary phase. In the case of GC, the sample components are dissolvedin a gas phase and moved through a very small bore column, the interior ofwhich is coated with the stationary phase. These separations occur at highpressure and high temperatures. Components in the sample mixture with ahigh affinity for the stationary phase will stay in the column longer and elutelater than those with less affinity for the stationary phase. The degree ofaffinity for or interaction with the stationary phase that a molecule has isgoverned by its structure, properties, and the chemistry of the stationaryphase being used.The prerequisite of a GC separation in the sample must be volatile. Giventhat monosaccharides are not volatile, they must be derivatized prior toanalysis.

protokol hidrolisis dan memantau jumlah masing-masing hadir gulasolusi pada interval waktunya. Sebagai hasil hidrolisis, jumlah masing-masinggula harus meningkatkan sampai semua yang hadir gula telah dibebaskan daripolisakarida. Degradasi gula dirilis akan tampak jelas sebagaipenurunan konsentrasi monosakarida sebagai waktu hidrolisis meningkat.Tabel 2.1 merangkum berbagai prosedur hidrolisis ditemukan dalam literatur.Dua bagian berikut menguraikan teknik kromatografi yang palingsering digunakan untuk analisis monosakarida.Sampel yang mengandung residu gula asam seperti pektin dan jamur tertentupolisakarida bisa sulit untuk menghidrolisis kuantitatif menggunakan tradisionalmetode yang mempekerjakan TFA atau asam sulfat. Kesulitan timbul darikepekaan para berbeda untuk hidrolisis residu gula netral dan asamserta jenis hubungan yang berbeda. Dalam kasus di mana hidrolisis kuantitatiftidak bisa dicapai, informasi kualitatif dapat diperoleh dengan menggunakan yang sesuaiteknik kromatografi hidrolisis pasca-asam (lihat bagian berikutnya),dan kandungan asam uronat yang tersusun ditentukan dengan menggunakan spektrofotometriMetode yang diuraikan dalam Bagian 2.2.4.2.3.2 Gas-Cair Kromatografi (GC)Kromatografi gas-cair adalah teknik dimana komponen dalam campurandipisahkan berdasarkan tingkat mereka afinitas untuk atau interaksi dengan cairanfase diam. Dalam kasus GC, komponen sampel dilarutkandalam fase gas dan bergerak melalui kolom lubang yang sangat kecil, interioryang dilapisi dengan fase diam. Ini pemisahan terjadi pada tinggitekanan dan suhu tinggi. Komponen dalam campuran sampel denganafinitas tinggi untuk fase diam akan tinggal di kolom lama dan mengelusikemudian dibandingkan dengan afinitas kurang untuk fase diam. Derajatafinitas untuk atau interaksi dengan fase diam bahwa molekul memiliki adalahdiatur oleh struktur, sifat, dan kimia stasionerfase yang digunakan.Prasyarat pemisahan GC dalam sampel harus stabil. Mengingatbahwa monosakarida tidak stabil, mereka harus diderivatisasi sebelumanalisis.

FIGURE 2.5Alditol acetates and TMS derivatives from neutral and acidic sugars, respectively

GAMBAR 2.5Asetat Alditol dan turunannya TMS dari gula netral dan asam, masing-masing

2.3.2.1 DerivatizationNeutral monosacharides are most often derivatized into alditol acetates priorto GC analysis. The age of this derivatization technique and the frequencywith which it is used is evident from the number of methods for this procedureavailable in the literature.6,16,17

The essential elements of this derivitizationprocedure are the reduction of neutral sugars to alditols and theirsubsequent acetylation. The resulting alditol acetates are then dissolved ina suitable solvent and injected onto a GC column. Acidic sugars are treateddifferently to yield trimethylsilyl (TMS) derivatives. The derivitization processis shown in Figure 2.5 for both neutral (alditol acetates) and acidic (TMSderivatives) sugars.2.3.2.1.1 Neutral SugarsThe starting material must be a dry sample of one or more monosaccharides.Polysaccharide material must first be hydrolyzed and the acid removed priorto analysis. Trifluoracetic acid works well for this purpose because it isvolatile and can be easily removed by rotary evaporation.

2.3.2.1 DerivatisasiMonosacharides netral yang paling sering diderivatisasi menjadi alditol asetat sebelumanalisis GC. Usia teknik derivatisasi dan frekuensidengan yang digunakan terbukti dari sejumlah metode untuk prosedur initersedia dalam literatur.6,16,17Unsur-unsur penting dari derivitization iniProsedur adalah pengurangan gula netral terhadap alditols dan merekaasetilasi berikutnya. Hasil asetat alditol kemudian dilarutkan dalampelarut yang cocok dan disuntikkan ke dalam kolom GC. Gula Asam diperlakukanberbeda untuk menghasilkan trimetilsilil (TMS) derivatif. Proses derivitizationditunjukkan pada Gambar 2.5 untuk kedua netral (asetat alditol) dan asam (TMSderivatif) gula.2.3.2.1.1 Sugars NetralBahan awal harus sampel kering dari satu atau lebih monosakarida.Bahan polisakarida pertama harus dihidrolisis dan asam dihapus sebelumanalisis. Asam trifloroasetat bekerja dengan baik untuk tujuan ini karenastabil dan dapat dengan mudah dihilangkan dengan penguapan putar.

The dry sample containing a small amount (~10mg) of accurately weighedmonosacharide material and inositol hexa-acetate (internal standard) ismixed with a solution of sodium borohydride in ammonium hydroxide toconvert monosaccharides into alditols. Acetic acid is added to acidify thesample and destroy excess sodium borohydride after the reaction hasreached completion. The mixture is dried (rotary evaporation or under astream of nitrogen) and methanol is added and removed by drying with anitrogen stream several times. Treatment with methanol removes borate ionsas volatile methyl borate. When the final portion of methanol has beenremoved and the sample is dry, the mixture of alditols is acetylated by addingacetic anhydride and heating it at 121C for a few hours. A few drops ofwater are added to the reaction vial to destroy any residual acetic anhydrideand the entire mixture is brought to dryness.2

The resulting alditol acetatesare solubilized in methylene chloride in preparation for GC analysis.

Various conditions for separating alditol acetates exist in the literature; theone most appropriate is dependant on the column used. There are manycolumns on the market that are appropriate for the separation of alditolacetates including SPB-1701 (30 m0.25 mm ID), which separates alditolsisothermally at 220C using helium as the carrier gas, and SP-2380 (30 m0.25 m ID), which separates the derivatized sugars isothermally at 275C inhelium (Supelco, Bellefonte, PA). A DB-210 column (30 m0.25 ID) has alsobeen used to separate alditol acetates isothermally at 220C using nitrogenas a carrier gas.18

2.3.2.1.2 Acidic SugarsAs with neutral polysaccharides, polysaccharides containing uronic acidsmust be hydrolyzed and dried prior to analysis. It is very difficult to obtaina quantitative yield of acidic monosaccharides using acid hydrolysis, andwhen this is required, it is advisable to use a spectrophotometric methodsuch as is outlined in Section 2.2.4.A sample containing a small amount (~10 mg) of accurately weighed carbohydratematerial is dissolved in sodium carbonate and then treated withsodium borohydride. Acetic acid is added to destroy excess borohydride andborate ions are removed with methanol as described for neutral monosaccharides.The resultant mixture of aldonic acids and aldoses (from neutral sugarsif present) is made into TMS derivatives by treating the dry residue with amixture containing pyridine, hexamethyldisilazane, and trifluoracetic acid.2

An internal standard, such as docosane, should be used for quantification.2.3.2.2 QuantificationA flame ionization detector (FID) is the most commonly used detector. Withan FID, quantification requires using an internal standard and the formulationof response factors (RF). Response factors are used to correct for disparateGC response to monosaccharides and losses arising from hydrolysis andderivatization. They are obtained for each monosacharide by subjecting a

Sampel kering yang mengandung sejumlah kecil (~ 10mg) dari secara akurat ditimbangBahan monosacharide dan inositol hexa-asetat (standar internal)dicampur dengan larutan natrium borohidrida di amonium hidroksida untukmengkonversi monosakarida ke dalam alditols. Acetic acid ditambahkan ke mengasamkansampel dan menghancurkan kelebihan natrium borohidrida setelah reaksi memilikimencapai penyelesaian. Campuran adalah kering (penguapan berputar atau di bawahaliran nitrogen) dan metanol ditambahkan dan dihapus oleh pengeringan dengannitrogen aliran beberapa kali. Pengobatan dengan metanol menghilangkan ion boratesebagai volatile metil borate. Ketika bagian akhir dari metanol telahdihapus dan sampel adalah kering, campuran dari alditols adalah asetat dengan menambahkananhidrida asetat dan memanaskannya pada 121°C selama beberapa jam. Sebuah Beberapa tetesair ditambahkan ke dalam vial reaksi untuk menghancurkan setiap anhidrida asetat sisadan seluruh campuran dibawa sampai kering.

2The dihasilkan asetat alditolyang dilarutkan dalam metilena klorida dalam persiapan untuk analisis GC.Berbagai kondisi untuk memisahkan asetat alditol ada dalam literatur, yangsalah satu paling tepat adalah tergantung pada kolom yang digunakan. Ada banyakkolom di pasar yang sesuai untuk pemisahan alditolasetat termasuk SPB-1701 (30 m×ID 0,25 mm), yang memisahkan alditolsisotermal pada 220°C menggunakan helium sebagai gas pembawa, dan SP-2380 (30 m×0,25 m ID), yang memisahkan gula diderivatisasi isotermal pada 275°C dihelium (Supelco, Bellefonte, PA). A DB-210 kolom (30 m×0,25 ID) memiliki jugatelah digunakan untuk memisahkan asetat alditol isotermal pada 220°C menggunakan nitrogensebagai gas pembawa.182.3.2.1.2 Sugars bersifat asamSeperti dengan polisakarida netral, polisakarida yang mengandung asam uronat yang tersusunharus dihidrolisis dan dikeringkan sebelum analisis. Hal ini sangat sulit untuk mendapatkanhasil yang kuantitatif monosakarida asam menggunakan hidrolisis asam, danketika hal ini diperlukan, itu disarankan untuk menggunakan suatu metode spektrofotometriseperti diuraikan dalam Bagian 2.2.4.Sebuah sampel yang mengandung sejumlah kecil (~ 10 mg) dari karbohidrat secara akurat ditimbangmateri dilarutkan dalam natrium karbonat dan kemudian diobati dengannatrium borohidrida. Acetic acid ditambahkan untuk menghancurkan berlebih borohidrida danion borate akan dihapus dengan metanol seperti yang dijelaskan untuk monosakarida netral.The resultan campuran asam aldonat dan aldoses (dari gula netraljika ada) dibuat menjadi derivatif TMS dengan memperlakukan residu kering dengancampuran yang mengandung piridin, heksametildisilazan, dan asam trifloroasetat.2An standar internal, seperti docosane, harus digunakan untuk kuantifikasi.2.3.2.2 KuantifikasiSebuah detektor ionisasi nyala (FID) adalah detektor paling umum digunakan. Dengansebuah FID, kuantifikasi membutuhkan menggunakan standar internal dan formulasifaktor respon (RF). Faktor-faktor Respon digunakan untuk mengoreksi yang berbedaRespon GC ke monosakarida dan kerugian yang timbul dari hidrolisis danderivatisasi. Mereka diperoleh untuk setiap monosacharide dengan menundukkan

mixture of standard monosaccharides corresponding to the monosaccharidespresent in the sample to the same hydrolytic and derivatization conditionsand using the following equation:RF = (AS

W

M

)/(AM

WS

)where AS

= peak area of internal standard, WM

= weight in mg of individualmonosaccharide standard, AM

= peak area of monosaccharide standard, andWS

= weight in mg of internal standard.Once response factors have been determined for each monosacharidepresent, they are used to determine the percent content of each monosaccharideresidue, %M, in the sample according to the following equation:%M = (RFAM

WS

F100)/(AS

S)where RF = the response factor for each monosaccharide, AM

= peak areafor monosacharide in sample, WS

= weight in mg of internal standard insample solution, F is a factor for converting monosaccharides to polysaccharideresidues (use 0.88 for pentoses and 0.90 for hexoses), AS

= peak area ofinternal standard in sample solution, and S is the dry weight in mg of startingsample material.2.3.2.3 Advantages/DisadvantagesGC analysis of carbohydrates is advantageous because it is an establishedtechnique and much of the method optimization has been done. It alsorequires small sample sizes and is very sensitive, a vital advantage whenonly a small amount of sample is available. The disadvantages of this techniqueoriginate chiefly from the preparatory steps. If either the reduction orthe acetylation steps do not proceed to completion, the quantity of derivatisedsugars will be underestimated. In short, there is ample opportunity forsample loss. Additionally, preparation may appear prohibitively laborious,especially when compared to HPLC techniques (see next section).2.3.3 High Performance Liquid Chromatography (HPLC)Similar to GC, HPLC is a separation technique whereby compounds in amixture are separated on a stationary phase. In this case, the mobile phase(eluant) containing the sample and the stationary phase are both liquids.Unlike GC, HPLC separation is a function of the compatibility (or differingcompatibility) of sample components for the eluant and stationary phase. AHPLC separation can be manipulated by changing the concentration and/ormakeup of the eluant. For example, a compound that is very compatible

with the stationary phase (and therefore one that stays on the column longerand elutes later) can be forced off the column faster by changing the solventmakeup such that sample components favor it vs. the stationary phase.

campuran monosakarida standar sesuai dengan monosakaridahadir dalam sampel dengan kondisi hidrolitik dan derivatisasi yang samadan menggunakan persamaan berikut:RF = (AS×WM) / (AM×WS)dimana AS= Luas puncak standar internal WM= Berat dalam mg individustandar monosakarida, AM= Luas puncak standar monosakarida, danWS= Berat dalam mg standar internal.Setelah faktor-faktor respon telah ditentukan untuk setiap monosacharideini, mereka digunakan untuk menentukan isi persen dari setiap monosakaridaresidu,% M, dalam sampel sesuai dengan persamaan berikut:% M = (RF×AM×WS×F×100) / (AS×S)di mana RF = alamat faktor respon untuk setiap monosakarida, AM= Luas puncakuntuk monosacharide dalam sampel, WS= Berat dalam mg standar internal

larutan sampel, F adalah faktor untuk mengkonversi monosakarida untuk polisakaridaresidu (menggunakan 0,88 untuk pentosa dan 0,90 untuk heksosa), AS= Luas puncak daribaku internal dalam larutan sampel, dan S adalah berat kering di mg mulaibahan sampel.2.3.2.3 Keuntungan / KerugianAnalisis GC karbohidrat adalah menguntungkan karena merupakan mapanteknik dan banyak dari metode optimasi telah dilakukan. Hal ini jugamembutuhkan ukuran sampel yang kecil dan sangat sensitif, keuntungan penting ketikahanya sejumlah kecil sampel yang tersedia. Kelemahan dari teknik iniberasal terutama dari langkah-langkah persiapan. Jika salah pengurangan ataulangkah asetilasi tidak dilanjutkan sampai selesai, jumlah derivatisasigula akan diremehkan. Singkatnya, ada banyak kesempatan untukhilangnya sampel. Selain itu, persiapan mungkin muncul prohibitively sulit,terutama bila dibandingkan dengan teknik HPLC (lihat bagian berikutnya).2.3.3 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC)Mirip dengan GC, HPLC adalah teknik pemisahan dimana senyawa dalamcampuran dipisahkan pada fase diam. Dalam kasus ini, fase gerak(Eluan) yang berisi sampel dan fase diam keduanya cairan.Tidak seperti GC, HPLC adalah pemisahan fungsi kompatibilitas (atau berbedakompatibilitas) komponen sampel untuk tahap Eluan dan stasioner. APemisahan HPLC dapat dimanipulasi dengan mengubah konsentrasi dan / ataumakeup Eluan tersebut. Sebagai contoh, senyawa yang sangat kompatibeldengan fase diam (dan karena itu salah satu yang tetap pada kolom lagidan elutes kemudian) dapat dipaksa dari kolom lebih cepat dengan mengubah pelarutmakeup sehingga komponen sampel mendukung itu vs fase diam

Under the broad category of HPLC there are several sub-types characterizedby the type of stationary and mobile phases employed and therefore the chemistryof the separation. In normal phase chromatography the stationary phaseis hydrophilic and the mobile phase varies in its hydrophilic/hydrophobicnature depending on the sample components being separated. In reverse phasechromatography, the stationary phase is hydrophobic. High performance anionexchange chromatography (HPAEC), an increasingly popular choice for theseparation of carbohydrates, is characterized by an anionic stationary phaseand a mobile phase with a high pH. At high pH (10 to 14), carbohydratehydroxyl groups ionize and their separation is based on their differing affinityfor the oppositely charged stationary phase and the mobile phase.2.3.3.1 High Performance Anion Exchange Chromatography (HPAEC)A sample containing monosaccharides, either as its natural state or after ahydrolysis step, must be separated chromatographically so that eachmonosaccharide can be identified and quantified. Over the past few years,high performance anion exchange chromatography has proven invaluablein the analysis of carbohydrate material. This type of chromatography isbased on the fact that carbohydrates in a strongly alkaline environment willionize, thereby rendering them amenable to separation on an ion exchangecolumn. HPAEC columns used for carbohydrates are coated with an anionexchange resin. For example, the Dionex (Sunnyvale, CA) PA1 column, optimizedfor the separation of mono-, di-, oligo-, and low molecular weightpolysaccharides, is composed of 10 m nonporous beads covered in a quaternaryamine anion exchange material. HPAEC systems typically usesodium hydroxide as the eluant to separate mono- and disaccharides, whileeluants for larger molecules often include sodium acetate to increase ionicstrength. The detector of choice for HPAEC is the pulsed amperometric

detector (PAD). In general, amperometry measures the change in currentresulting from the oxidation or reduction of a compound at an electrode. InPAD, it is the change in current resulting from carbohydrate oxidation at agold or platinum electrode that is measured. The advantage of PAD is notonly its low detection limits, reportedly in the picomole range,19 but also itssuitability for gradient elution, which provides an analyst with more flexibilitywhen optimizing separation conditions.Figure 2.6 presents the HPAEC separation profile of arabinose, rhamnose,glucose, galactose, mannose, and xylose. These six standards were separatedusing a sodium hydroxide gradient. Excellent baseline separation is alsoachieved for mixtures of mono- and oligosacchrides (Figure 2.7), sugar alcohols,20,21 and uronic acids.22 HPAEC-PAD permits the separation and quantificationof both neutral and acidic monosaccharides in one analytical run.A sodium hydroxide/sodium acetate gradient and PA1 column (Dionex,Sunnyvale Ca.) has been used to separate and identify neutral sugars (rhamnose,arabinose, galactose, glucose, mannose) and uronic acids (galacturonicand glucuronic acid) from citrus pectin and fungal polysaccharides after

Di bawah kategori luas HPLC ada beberapa sub-jenis ditandaioleh jenis fase stasioner dan mobile bekerja dan karena itu kimiapemisahan. Dalam kromatografi fase normal fase diamhidrofilik dan fase gerak bervariasi dalam hidrofilik / hidrofobikalam tergantung pada komponen sampel dipisahkan. Dalam fase terbalikkromatografi, fase diam adalah hidrofobik. Anion kinerja tinggikromatografi penukar (HPAEC), pilihan yang semakin populer untukpemisahan karbohidrat, ditandai dengan fase diam anionikdan fase gerak dengan pH tinggi. Pada pH tinggi (10 sampai 14), karbohidratgugus hidroksil mengionisasi dan pemisahan mereka didasarkan pada afinitas mereka berbedauntuk fase diam malah dibebankan dan fase gerak.2.3.3.1 Kinerja Tinggi Kromatografi Pertukaran Anion (HPAEC)Sebuah sampel yang mengandung monosakarida, baik sebagai keadaan alami atau setelahtahap hidrolisis, harus dipisahkan chromatographically sehingga setiapmonosakarida dapat diidentifikasi dan diukur. Selama beberapa tahun terakhir,kromatografi penukar anion kinerja tinggi telah terbukti sangat berhargadalam analisis bahan karbohidrat. Jenis kromatografi adalahdidasarkan pada kenyataan bahwa karbohidrat dalam lingkungan basa kuat akanmengionisasi, sehingga membuat mereka setuju untuk pemisahan pada pertukaran ionkolom. Kolom HPAEC digunakan untuk karbohidrat yang dilapisi dengan anionexchange resin. Misalnya, Dionex (Sunnyvale, CA) PA1 kolom, dioptimalkanuntuk pemisahan mono-, di-, oligo-berat molekul, dan rendahpolisakarida, terdiri dari 10 manik-manik keropos pM tercakup dalam kuarteneramina bahan penukar anion. Sistem HPAEC biasanya menggunakannatrium hidroksida sebagai Eluan untuk memisahkan mono-dan disakarida, sementaraeluants untuk molekul yang lebih besar sering termasuk natrium asetat untuk meningkatkan ionikkekuatan. Detektor pilihan untuk HPAEC adalah berdenyut amperometridetektor (PAD). Secara umum, amperometry mengukur perubahan arusdihasilkan dari oksidasi atau reduksi senyawa pada elektroda. DiPAD, itu adalah perubahan arus yang dihasilkan dari oksidasi karbohidrat padaemas atau elektroda platina yang diukur. Keuntungan dari PAD tidakhanya batas rendah deteksi, dilaporkan dalam kisaran picomole, 19 tetapi juga yangkesesuaian untuk elusi gradien, yang menyediakan analis dengan lebih fleksibel

ketika mengoptimalkan kondisi pemisahan.Gambar 2.6 menyajikan profil pemisahan HPAEC dari arabinosa, rhamnosa,glukosa, galaktosa, manosa, dan xylose. Keenam standar dipisahkanmenggunakan gradien natrium hidroksida. Baik dasar pemisahan jugadicapai untuk campuran mono-dan oligosacchrides (Gambar 2.7), gula alkohol,20,21 dan uronat yang tersusun acids.22 HPAEC-PAD memungkinkan pemisahan dan kuantifikasikedua monosakarida netral dan asam dalam satu run analitis.Sebuah natrium hidroksida / sodium gradien asetat dan PA1 kolom (Dionex,Sunnyvale Ca.) Telah digunakan untuk memisahkan dan mengidentifikasi gula netral (rhamnose,arabinosa, galaktosa, glukosa, mannose) dan asam uronat yang tersusun (galacturonicdan asam glukuronat) dari pektin jeruk dan polisakarida jamur setelah

hydrolysis with TFA, sulfuric acid, and methanolysis combined with TFA.22

Furthermore, a sodium hydroxide/sodium acetate gradient can also be usedto separate neutral and acidic monosaccharides as well as oligogalacturonicacids from strawberries after treatment with pectolytic enzymes.23 For manysamples, preparation entails extraction of the desired components withwater, centrifugation to remove precipitated matter, and filtering.20,21 Thefinal filtering step prior to injection onto the HPLC column is usually throughat 0.45 μm filter.2.3.3.2 QuantificationQuantifying the amount of each individual mono-, di-, oligo-, or polysaccharidefrom an HPAEC chromatogram is quite simple provided 4 to 5dilutions of appropriate standards are run with a set of samples. The softwareassociated with the HPLC system will integrate peaks, provide peak areas/heights, and give concentration values provided standards with known concentrationshave been run. It is important to run standards corresponding

hidrolisis dengan TFA, asam sulfat, dan methanolysis dikombinasikan dengan TFA.22Selanjutnya, hidroksida / sodium gradien natrium asetat juga dapat digunakanuntuk memisahkan monosakarida netral dan asam serta oligogalacturonicasam dari stroberi setelah pengobatan dengan pectolytic enzymes.23 Bagi banyaksampel, persiapan memerlukan ekstraksi komponen yang diinginkan denganair, sentrifugasi untuk menghapus materi diendapkan, dan filtering.20, 21akhir langkah penyaringan sebelum injeksi ke kolom HPLC biasanya melalui0,45 m filter.2.3.3.2 KuantifikasiMenghitung jumlah setiap individu mono-, di-, oligo-, atau polisakaridadari kromatogram HPAEC cukup sederhana yang disediakan 4 sampai 5pengenceran standar yang sesuai dijalankan dengan set sampel. perangkat lunakberkaitan dengan sistem HPLC akan mengintegrasikan puncak, menyediakan area puncak /ketinggian, dan memberikan nilai konsentrasi disediakan standar dengan konsentrasi diketahuitelah dijalankan. Hal ini penting untuk menjalankan standar yang sesuai

to sample constituents because PAD response varies with the analyte. Detectorresponse decreases with the increasing degree of polymerization (DP),19

therefore, the relative percentage of each component in a chromatogram (andtherefore the sample) cannot be determined by peak areas alone, especiallywhen the sample contains mono-, di-, oligo-, and polysaccharides. Sugarconcentration values obtained for acid hydrolysates need to be furtheradjusted to account for the molecule of water that was added to each residueupon hydrolysis. For hexoses this requires a conversion factor of 0.90 and

for pentoses a factor of 0.88 is used.2.3.3.3 Advantages/DisadvantagesThe advantage of HPAEC for the analysis of carbohydrates is that samplesdo not require derivatization and the analysis itself is usually quite fast. Inthe past, disadvantages of HPLC originated with detection systems, whichfor the most part were not very sensitive. Refractive index detectors havetraditionally been the detector of choice, because more sensitive detectors,for example UV or fluorescence detectors, are not appropriate for analyzingcarbohydrates since carbohydrates do not contain moieties that respond tothese detection systems. HPAEC-PAD has overcome this disadvantage,enabling the separation and quantification of monosaccharides with lowdetection limits. In addition, using sodium hydroxide as eluant is inexpensiveand relatively safe. Because carbohydrates are typically soluble in themobile phase, derivatization is unnecessary and sample preparation is usuallylimited to the removal of interfering substances such as lipids andproteins. The PAD is also appropriate for use with gradient elution.2.3.4 Enzymatic AnalysisEnzymatic methods for determining sugar content rely on the ability of anenzyme to catalyze a specific reaction and employ a suitable method formonitoring the progression of the reaction or the concentration of reactionproduct. Enzymatic methods are highly specific, usually rapid and sensitiveto low sugar concentrations.There are enzymatic methods for most common sugars, and for some suchas glucose several different enzymes can be used, and these assays areavailable in kit form. Enzymatic methods for the quantitative analysis ofglucose, fructose, sucrose, lactose, and galactose are presented below. Enzymaticmethods have been developed for the quantification of variouspolysaccharides, including -glucan24 (American Association of CerealChemists [AACC] method 32-23; Association of Official Analytical Chemists[AOAC] method 995.16), starch25 (AACC method 76-13; AACC method 76-11),and the galactomannans locust bean gum and guar gum.26,27 These generallyrequire enzymatic hydrolysis of the polymer followed by enzymatic determinationof the released monosaccharides using one of the methods below.

untuk sampel konstituen karena respon PAD bervariasi dengan analit. Detektorrespon menurun dengan peningkatan derajat polimerisasi (DP), 19Oleh karena itu, persentase relatif dari setiap komponen dalam kromatogram (danOleh karena itu sampel) tidak dapat ditentukan oleh luas puncak saja, terutamabila sampel mengandung mono-, di-, oligo-, dan polisakarida. GulaNilai konsentrasi diperoleh untuk hidrolisat asam harus lebihdisesuaikan untuk memperhitungkan molekul air yang ditambahkan ke residu masing-masingpada hidrolisis. Untuk heksosa ini memerlukan faktor konversi 0,90 danuntuk pentosa faktor 0,88 digunakan.2.3.3.3 Keuntungan / KerugianKeuntungan dari HPAEC untuk analisis karbohidrat adalah bahwa sampeltidak memerlukan derivatisasi dan analisis sendiri biasanya cukup cepat. Dimasa lalu, kerugian dari HPLC berasal dengan sistem deteksi, yanguntuk sebagian besar tidak sangat sensitif. Detektor indeks bias memilikitradisional detektor pilihan, karena detektor yang lebih sensitif,misalnya detektor UV atau fluoresensi, yang tidak sesuai untuk menganalisiskarbohidrat karena karbohidrat tidak mengandung gugus yang meresponini sistem deteksi. HPAEC-PAD telah mengatasi kerugian ini,memungkinkan pemisahan dan kuantifikasi monosakarida dengan rendahdeteksi batas. Selain itu, menggunakan natrium hidroksida sebagai Eluan adalah murahdan relatif aman. Karena karbohidrat biasanya larut dalamfase gerak, derivatisasi tidak perlu dan persiapan sampel biasanya

terbatas pada penghapusan zat mengganggu seperti lipid danprotein. PAD ini juga cocok untuk digunakan dengan elusi gradien.2.3.4 Analisis enzimatikMetode enzimatik untuk menentukan kadar gula bergantung pada kemampuan suatuenzim untuk mengkatalisis reaksi tertentu dan menggunakan metode yang sesuai untukmemantau perkembangan reaksi atau konsentrasi reaksiproduk. Metode enzimatik yang sangat spesifik, biasanya cepat dan sensitifuntuk konsentrasi gula rendah.Ada metode enzimatik untuk sebagian gula umum, dan untuk beberapa sepertisebagai glukosa beberapa enzim yang berbeda dapat digunakan, dan tes initersedia dalam bentuk kit. Metode enzimatik untuk analisis kuantitatifglukosa, fruktosa, sukrosa, laktosa, dan galaktosa disajikan di bawah ini. Enzimatikmetode telah dikembangkan untuk kuantifikasi berbagaipolisakarida, termasuk β-glucan24 (American Association of CerealKimiawan [AACC] metode 32-23, Asosiasi Kimiawan Official Analytical[AOAC] metode 995,16), starch25 (metode AACC 76-13, metode AACC 76-11),dan galactomannans kacang locust gusi dan guar gum.26, 27 ini umumnyamemerlukan hidrolisis enzimatik dari polimer diikuti dengan penentuan enzimatikdari monosakarida dirilis menggunakan salah satu metode berikut.