Translacija2dio

Prof. dr. Lejla Begić

Univerzitet u Tuzli

1

Sinteza proteina, kao i sinteza RNA i DNA, sastoji se iz 3 faze:

1. Inicijacija (započinjanja sinteze),

2. Elongacija (produžavanja lanca) i

3. Terminacija (završetka sinteze)


Univerzitet u Tuzli

2

Osim ove tri faze treba istaći još dvije:

1. Aktivacija aminokiselina prije ugradnje u polipeptidni lanac, koja prethodi inicijaciji i

2. Postranslacijska modifikacija novosintetizovanog polipeptidnog lanca.


Univerzitet u Tuzli

3

Komponente neophodne za odvijanje pet glavnih faza sinteze proteina u E.coli


Univerzitet u Tuzli

4

Transportne RNA služe kao adaptorske molekule u prevođenju jezika nukleinskih kiselina u jezik proteina.

Transportna RNA ima dvije funkcije koje su osnova njihove adaptorske uloge:


Univerzitet u Tuzli

5

1. tRNA aktivira aminokiseline što energetski omogućava stvaranje peptidnog veza. Aktivirane aminokiseline se prenose do poliribosoma gdje se dodaju rastućem polipeptidnom lancu.

2. tRNA prepoznaje kodon u mRNA što je uvjet za korektnu ugradnju aminokiseline u rastući polipeptidni lanac.


Univerzitet u Tuzli

6

Znači da tRNA ima dva aktivna mjesta:

• CCA sekvencu na 3' terminusu za koji se specifično veže aminokiselina i

• antikodonski triplet koji se sparuje sa kodonom u mRNA.


Univerzitet u Tuzli

7

tRNA bakterija i citosola eukariota ima od 73 do 93 nukleotidna ostatka i Mr od 24.000 do 31.000.

Mitohondriji i hloroplasti sadrže nešto manje molekule tRNA.

Ćelije imaju najmanje jednu tRNA za svaku aminokiselinu.

Najmanje 32 tRNA su potrebne za prepoznavanje svih aminokiselinskih kodona.

Neke prepoznaju više od jednog kodona.


Univerzitet u Tuzli

8

Sekundarna struktura tRNA u obliku lista djeteline.

Robert Holley i saradnici 1965. godine iznijeli su podatke o sekundarnoj strukturi transportnih RNA na osnovu eksperimenta sa alanil-tRNA, koja je prva potpuno sekvenirana transportna RNA.

Iako se radi o jednolančanoj molekuli, preko polovine nukleotida je spareno usljed komplementarnosti baza.


Univerzitet u Tuzli

9

Sekundarna struktura tRNA u obliku lista djeteline.

Osam ili više nukleotidnih ostataka ima modificirane baze ili šećere.

Osnovne baze su najčešće metilirane, a nukleotidi sadrže preraspoređene glikozidne vezove.

Preostali dio molekule koji nije sparen predstavlja tzv. petlje, te 5' i 3' kraj.


Univerzitet u Tuzli

10

Na 5' kraju većina tRNA sadrži gvanilat (pG), a na 3' kraju sve tRNA sadrže trinukleotidnu sekvencu CCA. Predstavljena u dvije dimenzije tRNA ima izgled djeteline sa četiri lista. Duže molekule tRNA imaju još jedan dodatak, tzv. ekstra ruku


Univerzitet u Tuzli

11

Dvije petlje, odnosno 2 lista, odgovorna su za adaptorsku funkciju molekule.

Aminokiselinsko mjesto nosi specifičnu aminokiselinu koja je esterificirana preko svoje karboksilne skupine sa 2' ili 3' hidroksilnom skupinom adenozinskog ostatka na CCA 3' kraja tRNA.


Univerzitet u Tuzli

12

Antikodonska petlja sadrži 7 nukleotidnih ostataka od kojih tri predstavljaju antikodon.

D petlja sadrži neobični nukleotid dihidrouridin. TC petlja sadrži ribotimidin(T), koji obično nije prisutan u ribonukleinskim kiselinama i pseudouridin (), koji ima neobičnu C-C vezu između baze i riboze.

D i TC su važne za interakcije tRNA sa enzimima i ribosomima te za cjelokupno svijanje molekula tRNA.


Univerzitet u Tuzli

13

Trodimenzionalna struktura tRNA ima oblik uvijenog slova L


Univerzitet u Tuzli

14

Jedna od uloga tRNA je aktivacija aminokiselina.

Tokom prve faze translacije, koja se odvija u citosolu, 20 različitih aminokiselina esterifikuje se sa odgovarajućim tRNA.

Reakciju esterifikacije omogućavaju enzimi aminoacil-tRNA sintetaze,

Aktivnost aminoacil-tRNA sintetaze ovisi o koncentraciji Mg2+.


Univerzitet u Tuzli

15

Svaki enzim je specifičan za pojedinu aminokiselinu i za jednu ili više odgovarajućih tRNA.

Kada jedna aminokiselina ima više od jedne tRNA, obično isti enzim povezuje datu aminokiselinu sa njenom pripadnom tRNA.


Univerzitet u Tuzli

16

Princip reakcije koju katalizira aminoacil-tRNA sintetaza je:

Mg2+

aminokiselina + tRNA + ATP aminoacil-tRNA + AMP + PPi aminoacil-tRNA sintetaza


Univerzitet u Tuzli

17

Struktura aminoacil tRNA

Aminoacilna skupina esterificirana je sa adenilatnim ostatkom na 3’ položaju tRNA. Esterska veza aktivira aminokiselinu i povezuje je sa tRNA.


Univerzitet u Tuzli

18

Povezivanje aminokiseline na tRNA pomoću enzima aminoacil tRNA sintetaze

Reakcija aktivacije odvija se u dva koraka na aktivnom mjestu enzima.

U prvom koraku nastaje intermedijer vezan za enzim, aminoacil-AMP-enzim kompleks.

U ovom kompleksu karboksilna grupa aminokiseline reaguje s -fosfatom ATP uz formiranje anhidridne veze i oslobađanje pirofosfata.


Univerzitet u Tuzli

19

U drugom koraku aminoacilna grupa prenosi se sa aminoacil-AMP-enzim kompleksa na odgovarajuću specifičnu tRNA.

Kod klase I enzima u reakciji se formira esterska veza između 2’ hidroksilne grupe riboze na 3’-terminalnom adenilatnom ostatku i karboksilne grupe aminokiseline.


Univerzitet u Tuzli

20

Esterska veza se, zatim, transesterifikacijom premješta na položaj 3’ riboze.

Kod enzima klase II aminoacilna grupa direktno se prenosi na 3’OH grupu riboze terminalnog adenilatnog ostatka.


Univerzitet u Tuzli

21

Pirofosfat formiran u prvom koraku hidrolizira se do neorganskog fosfata pomoću enzima neorganske pirofosfataze.

Znači da se dvije energetski bogate veze troše za aktivaciju svake molekule aminokiseline.


Univerzitet u Tuzli

22

Prilikom vezanja aminokiseline za tRNA dolazi do aktivacije aminokiseline što je neophodno za formiranje peptidne veze.

Vezanje aminokiseline za tRNA, takođe, osigurava postavljanje aminokiseline na odgovarajuće mjesto na rastućem polipeptidnom lancu.


Univerzitet u Tuzli

23

Vjernost proteinske sinteze zavisi od vezanja prave aminokiseline za odgovarajuću tRNA jer se identitet vezane aminokiseline ne provjerava ponovo na ribosomima.


Univerzitet u Tuzli

24

Tačnost vezanja aminokiseline i tRNA kontroliše enzim aminoacil-tRNA sintetaza.

Ova kontrola odvija se u dva sukcesivna stepena.

Prvi stepen je inicijalno vezanje aminokiseline za enzim i stvaranje aktiviranog intermedijera aminoacil-AMP.


Univerzitet u Tuzli

25

Drugi stepen provjere je vezanje neodgovarajućeg produkta aminoacil-AMP za drugo, odvojeno aktivno mjesto na enzimu.

Supstrat koji se veže na ovo odvojeno mjesto se hidrolizira.


Univerzitet u Tuzli

26

Struktura Gln-tRNA sintetaze iz E.coli je primjer monomernog tipa I sintetaze.

Aminoacil-tRNA sintetaza.

Sintetaza je kompleksirana sa pripadajućom tRNA (zeleno).


Univerzitet u Tuzli

27

Aminoacil-tRNA sintetaza.Sintetaza je kompleksirana sa pripadajućom tRNA (zeleno).

Asp-tRNA sintetaza iz kvasca je primjer dimernog tipa II sintetaze.


Univerzitet u Tuzli

28

Greška koja se javlja prilikom sinteze proteina je jedna na 104 ugrađenih aminokiselina i mnogo je veća nego pri replikaciji DNA.

Ali, ove greške se eliminišu jer se, usljed razgradnje proteina, ne prenose na sljedeće generacije.


Univerzitet u Tuzli

29

Enzim, aminoacil-tRNA sintetaza mora biti specifičan i za određenu aminokiselinu i za određenu tRNA.

Interakcija između aminoacil-tRNA sintetaze i tRNA veoma je važna i označena je kao “drugi genetski kod”.


Univerzitet u Tuzli

30

U prepoznavanju tRNA od strane odgovarajućeg enzima može učestvovati deset i više nukleotida, ali ponekad je dovoljan samo jedan nukleotidni par da bi došlo do odgovarajuće interakcije.


Univerzitet u Tuzli

31

Jedan G=U bazni par (boja) jedini je elemenat neophodan za specifično vezivanje i aminoacilaciju.

Desno je pokazan kratki miniheliks sintetske RNA koji čvrsto veže alanin kao i tRNAAla jer sadrži kritični par GU

Strukturni elementi tRNAAla koje prepoznaje enzim Ala-tRNA sintetaza.


Univerzitet u Tuzli

32

Sinteza proteina započinje na amino terminusu i odvija se postepenim dodavanjem aminokiselina prema karboksi terminusu.

(5’)AUG inicijacijski kodon određuje aminokiselinu metionin na amino-terminalnom završetku.


Univerzitet u Tuzli

33

Mada metionin ima samo jedan kodon, AUG, svi organizmi imaju dvije tRNA za metionin.

Jedna transportna RNA nosi metionin za započinjanje sinteze proteina i naziva se inicijalna metionil-tRNA (Met-tRNAi).

Druga tRNA umeće metionin u unutrašnjost polipeptidnog lanca.


Univerzitet u Tuzli

34

U bakterija dvije tRNA specifične za metionin označene su kao tRNAMet i tRNAfMet.

Aminokiselinski ostatak koji odgovara startnom kodonu (5’)AUG u bakterija je N-formilmetionin (fMet).


Univerzitet u Tuzli

35

Ova aminokiselina se veže za transportnu RNA u dvije sukcesivne reakcije i dolazi do ribozoma kao N-formilmetionil-tRNAfMet (fMet-tRNAfMet):

Metionin + tRNAfMet + ATP Met-tRNAfMet + AMP + PPi).


Univerzitet u Tuzli

36

Nakon ove reakcije enzim transformilaza prenosi formilnu grupu sa N10-formiltetrahidrofolata na amino grupu metioninskog ostatka:

N10-formiltetrahidrofolat + Met-tRNAfMet tetrahidrofolat + fMet-tRNAfMet).


Univerzitet u Tuzli

37

Transformilaza je selektivnija od Met-tRNA sintetaze.

Ona je specifična za ostatke metionina vezane za tRNA fMet, vjerovatno prepoznavajući strukturne karakteristike ove transportne RNA.


Univerzitet u Tuzli

38

Polipeptidi koji se sintetiziraju na ribosomima mitohondrija i hloroplasta takođe započinju sa N-formilmetioninom.


Univerzitet u Tuzli

39

Kompleks se formira u tri koraka uz hidrolizi GTP do GDP i Pi. IF1,IF2 i IF3 su faktori inicijacije.

P označava peptidil mjesto, a A aminoacilno mjesto.

Antikodon tRNA je orijentiran od 3’ prema 5’ s lijeva na desno.

Stvaranje inicijalnog kompleksa.


Univerzitet u Tuzli

40

Za početak sinteze u bakterija potrebno je da se za 30S ribosomsku podjedinicu vežu dva inicijalna faktora, IF-1 i IF-3. Inicijalni faktor 3 (IF-3) sprječava povezivanje 30S i 50S podjedinice prije stvaranja inicijalnog kompleksa.

Za 30S podjedinicu veže mRNA. Inicijalni kodon 5’(AUG) nalazi pravu poziciju pomoću tzv. Shine-Dalgarno sekvence u mRNA.


Univerzitet u Tuzli

41

Shine-Dalgarno konsenzus sekvenca je inicijalni signal sastavljen od 4 do 9 purinskih ostataka udaljenih 8-13 nukleotida od 5’ kraja inicijacijskog kodona. Ova purinska sekvenca sparuje se sa komplementarnom sekvencom koja je bogata pirimidinima u blizini 3’ kraja 16S rRNA na 30S ribosomskoj podjedinici.


Univerzitet u Tuzli

42

Shine-Dalgarno sekvenca (osjenčena crveno) sparuje se sa sekvencom u blizini 3’kraja 16S rRNA.

Zeleno je osjenčen startni kodon AUG.


Univerzitet u Tuzli

43

Interakcija između mRNA i rRNA postavlja (5’)AUG sekvencu mRNA na tačnu poziciju na 30S ribosomskoj podjedinici.

(5’)AUG gdje se veže fMet-tRNAfMet razlikuje se od drugih kodona za metionin po blizini Shine-Dalgarno sekvence na mRNA.


Univerzitet u Tuzli

44

Bakterijski ribosomi imaju tri mjesta gdje se vežu aminoacil-tRNA: aminoacilno ili A mjesto, peptidilno ili P mjesto i izlaz ili E mjesto.

Obje podjedinice učestvuju u formiranju A i P mjesta, dok E mjesto formira velika podjedinica ribosoma.

(5’)AUG je smješten na P mjestu, i na tom mjestu se jedino može vezati fMet-tRNAfMet.

Ova aminoacil tRNA se jedina veže za P mjesto.


Univerzitet u Tuzli

45

Ostale aminoacil tRNA tokom procesa elongacije vežu se na mjesto A, a nakon njega na P i E mjesto. E mjesto je mjesto sa kojeg se oslobađa slobodna tRNA tokom procesa elongacije. Inicijalni faktor IF-1 veže se za mjesto A i sprječava vezanje tRNA na mjesto A u fazi inicijacije.

Kompleks koji se sastoji od 30S ribosomske podjedinice, IF-3, i mRNA veže se za kompleks GTP-IF-2 i inicijacijske fMet-tRNAfMet. Antikodon ove tRNA sparuje se sa inicijalnim kodonom mRNA.


Univerzitet u Tuzli

46

Ovaj veliki kompleks povezuje se sa 50S ribosomskom podjedinicom uz istovremenu hidrolizu GTP vezanog za IF-2. Nakon toga sva tri inicijalna faktora odvajaju se sa ribosoma. Ovim je završeno kompletiranje funkcionalnog 70S ribosoma koji se zove inicijalni kompleks.


Univerzitet u Tuzli

47

U eukariota je početak translacije kompleksniji jer sadrži mnogobrojne inicijalne faktore i proteine za vezivanje. Na 3’ kraju, mRNA je vezana za protein koji se zove poli (A) vezujući protein (PAB).


Univerzitet u Tuzli

48

Eukariotske ćelije imaju najmanje devet inicijalnih faktora. Inicijalni kodon (5’)AUG smješten je u unutrašnjosti i ne postoji sekvenca slična Shine-Delgarno sekvenci. Prvi AUG kodon signalizira početak okvira čitanja.


Univerzitet u Tuzli

49

Inicijalni faktor, označen kao eIF4F kompleks, vjerovatno učestvuje u skeniranju startnog kodona koristeći RNA helikaznu aktivnost eIF4A radi eliminacije sekundarne strukture na 5’-neprevedenom dijelu mRNA. Ovo skeniranje olakšava još jedan protein označen kao eIF4B.


Univerzitet u Tuzli

50

Proteinski faktori neophodni za inicijaciju translacije u bakterija i eukariota


Univerzitet u Tuzli

51

U bakterija, za fazu elongacije su potrebni:

1. prethodno opisani inicijacijski kompleks,

2. aminoacil-transportne RNA,

3. elongacijski faktori (EF-Tu, EF-Ts i EF-G) koji su topivi proteini,

4. GTP.


Univerzitet u Tuzli

52

Druga aminoacil tRNA ulazi na A mjesto ribosoma vezana za EF-Tu (na slici prikazano kao Tu) koji sadrži i GTP. Vezanje druge aminoacil-tRNA na mjesto A povezano je sa hidrolizom GTP do GDP i Pi, te oslobađanjem kompleksa EF-Tu.GDP sa ribozoma. Vezani GDP se oslobađa kada se EF-Tu.GDP veže za EF-Ts, a EF-Ts se, nadalje, oslobađa kada se druga molekula GTP veže za EF-Tu. Ovako se reciklira EF-Tu i omogućava ponavljanje ciklusa.

Prvi stepen u elongaciji (bakterije): vezanje druge aminoaciltRNA.


Univerzitet u Tuzli

53

Ovu reakciju katalizira ribozim 23S rRNA.

N-formilmetionilna grupa se prenosi na amino grupu druge aminoacil-tRNA na A mjestu. Tako nastaje dipeptidil-tRNA. U ovoj fazi obje tRNA vezane za ribosom pomiču se na 50 S podjedinici zauzimajući hibridni položaj. Prazna tRNA se pomiče tako da su joj 3’ i 5’ krajevi na E mjestu. Slično, 3’ i 5’ krajevi peptidil-tRNA pomiču se na P mjesto. Antikodoni ostaju na A i P mjestima.

Drugi korak elongacije u prokariota - stvaranje prve peptidne veze.


Univerzitet u Tuzli

54

Ribosom se pomjera za jedan kodon prema 3’-kraju mRNA.Ovo kretanje premiješta antikodon od dipeptidil-tRNA, koji je još uvijek vezan za drugi kodon mRNA, sa mjesta A na mjesto P. Takođe se premiješta i deacilirana tRNA sa mjesta P na mjesto E, koja se zatim sa mjesta E oslobađa u citosol. Treći kodon mRNA sada je postavljen na mjestu A, a drugi kodon na mjestu P. Promjene u konformaciji ribosoma omogućavaju njihovo kretanje duž mRNA.

Treći korak u elongaciji u prokariota-translokacija


Univerzitet u Tuzli

55

Za kretanje ribosoma duž mRNA neophodan je elongacijski faktor EF-G (zove se i translokaza) i energija oslobođena hidrolizom druge molekule GTP. Ribosom sa vezanom dipeptidil tRNA i mRNA spreman je za sljedeći elongacijski ciklus i vezanje aminokiseline. Proces se odvija na isti način kao i dodatak druge aminokiseline. Za svaku aminokiselinu koja se pridodaje rastućem polipeptidnom lancu hidroliziraju se dva GTP na GDP i Pi , a ribosomi se kreću od kodona do kodona duž mRNA prema njenom 3’ kraju.

Treći korak u elongaciji u prokariota-translokacija


Univerzitet u Tuzli

56

Elongacijski ciklus eukariota veoma je sličan kao i kod prokariota.

Eukarioti imaju tri elongacijska faktora koja se označavaju kao eEF1, eEF1 i eEF2 čije funkcije su analogne elongacijskim faktorima u prokariota EF-Tu, EF-Ts i EF-G.

Eukariotski ribosomi nemaju E mjesto.

Slobodna, deacilirana tRNA uklanja se direktno sa P mjesta.


Univerzitet u Tuzli

57

Provjera vjernosti ugradnje aminokiselina odvija se u prvom stepenu elongacije u bakterija.

EF-Tu-GTP i EF-Tu-GDP kompleksi traju nekoliko milisekundi i u ovom vremenskom intervalu se provjerava tačnost kodon-antikodon interakcija.

Treba ponovo naglasiti da se na ribosomu ne provjerava identitet aminokiseline koja je vezana na tRNA, nego se provjerava samo odgovarajuće sparivanje kodon-antikodon.


Univerzitet u Tuzli

58

Terminacija je odgovor na terminacijski kodon koji se pojavljuje na mjestu A.

Vezivanje faktora oslobađanja (RF1 ili RF2) na terminacijski kodon dovodi do hidrolize esterske veze između nascentnog polipeptida i tRNA na mjestu P.

Konačno, mRNA, deacilirana tRNA i faktori oslobađanja napuštaju ribosom, a ribosom disocira na veliku i malu podjedinicu.

RF1 prepoznaje terminacijske kodone UAA i UAG, a RF2 prepoznaje UAA i UGA.

Završetak sinteze proteina-terminacija u prokariota.


Univerzitet u Tuzli

59

Za stvaranje jedne peptidne veze neophodno utrošiti više od četiri energetski bogate veze:

• hidroliza ATP i pirofosfata neophodni su za aktivaciju aminokiselina i vezanje za tRNA,

• 1 GTP se hidrolizira u toku inicijacije, • 2 GTP u toku faze elongacije.


Univerzitet u Tuzli

60

Najmanje, 4 x 30,5 kJ/mol = 122 kJ/mol energije fosfodiesterskih veza neophodno je za stvaranje jedne peptidne veze koja ima standardnu slobodnu energiju hidrolize od – 21 kJ/mol.

Neto promjena slobodne energije od 101 kJ/mol predstavlja veliko energetsko ulaganje.


Univerzitet u Tuzli

61

Cilj biosinteze proteina nije sinteza bilo koje peptidne veze, nego peptidne veze između dvije tačno određene aminokiseline.

Zato je veliki utrošak energije neophodan da bi se osigurala tačnost prevođenja genetske poruke sadržane u mRNA, u aminokiselinsku sekvencu proteina.


Univerzitet u Tuzli

62

Već smo spomenuli da se više ribosoma udružuje u polisome koji simultano “prevode” jednu mRNA molekulu.

Ova paralelna sinteza višestruko povećava efikasnost procesa translacije.

Ribosomi kao jedinice poliribosoma djeluju neovisno i svaki sintetizira kompletan polipeptidni lanac.


Univerzitet u Tuzli

63

Maksimalna gustoća ribosoma na mRNA je jedan ribosom na 80 nukleotida.

Ribosom najbliži 5’ kraju mRNA ima najkraći polipeptidni lanac, a ribosom najbliži 3’ kraju ima uglavnom završen polipeptidni lanac.


Univerzitet u Tuzli

64

Dijagram poliribosoma (polisoma). Ribosomi se kreću duž mRNA u 5’→3’ smjeru. Oni djeluju neovisno jedan od drugog.


Univerzitet u Tuzli

65

U bakterija, transkripcija i translacija su prostorno i vremenski čvrsto povezani. Informacijska RNA se sintetiše i prevodi u smjeru 5’3’. Ribosomi započinju translaciju prokariotske mRNA sa 5’ kraja prije nego što se transkripcija završi. U eukariota novosintetizirana mRNA mora izaći iz nukleusa u citosol prije nego započne translacija.

Translacija2dio

Documents

Transcript of Translacija2dio