“Second-generation bioethanol” Transformation of promissory microorganisms for the

production of bioethanol on an industrial scale

Godfrey Idrobo LibrerosBSc, PhD. Sci. Biology Stu.

Utilización de microorganismos para la producción de etanol a partir de azúcares

obtenidos de residuos de caña

MADR

Godfrey Idrobo Libreros, BSc. Biol. Genética, Ph.D

Programa: Producción de etanol a partir de residuos de caña de azúcar_(MADR2008D3210)

Proyecto 1: Hidrólisis de residuos de la caña de azúcar para la obtención de azúcares simples como materia prima para la obtención de etanol (2007D3718-346-07)

Proyecto 2: Utilización de microorganismos para la producción de etanol a partir de azúcares obtenidos de residuos de caña(MADR 2008D3210-3466)

MADR

ProyectoMetodología - Marco lógico - Resultados

Toma de muestras biológicasFormulación de medios de cultivo-revisión bibliografía

Macerado o triturado de muestras molino

Diluciones 1:10 en H2O pep, estéril, y Exudados directos

Siembra en medio de cultivo idóneo Caracterización:

morfológica Gram. y lactofenol.

Purificación (re-asilamiento)

Incubación a (26-27ºC) 28-37ºC

Preparación inóculos frescos (Xilosa, ara, glucosa)

Biomasa (peso seco, absorbancia)Consumo de azúcar (HPLC)Producción de alcohol (HPLC)Cambio de pH

Asimilen, Crezcan y Co-fermenten Xilosa-Ara-Glucosa

Selección de microorganismos

Pruebas de tolerancia a Et-OH

Pruebas de fermentación (10-15 L)Alcohol producido será:

Evaluado (Alcotest), cuantificado (densímetro)

Prueba de Oxido-Fermentación

Fermentación en lote 30ºCCinética de crecimiento C5 y

C61

MetodologíaAislamiento

YEAmod2: Composición por litroP: 0.5 gramosEL: 0.5 gramosAA: 15 gramosXil y/o Ara: 5.0 gramosAgua dd: 1 Litro

Frecuencia de bacterias, levaduras y hongos aislados del muestreo en Bahía Málaga.

8.8 %

35.3 %

55.9 %

Cepas aisladas de Bahía Málaga con capacidad de crecimiento sobre azúcares C5 y C6.

3/34 aislamientos probados presentaron crecimiento a partir de xilosa y/o arabinosa o glucosa.

+: crecimiento

Frecuencia de crecimiento en glucosa (C6), xilosa y arabinosa (C5) de las cepas

aisladas de muestras colectadas en Bahía Málaga.

8.8 %

Aislamientos de sustratos vegetales

Crecimiento arabinosa Crecimiento xilosa

La utilización directa del medio selectivo permitió aislar un total de 6 bacterias, 1 levadura y 2 hongos de los residuos vegetales analizados.

De las cepas Amb 1 a 5 solamente presentó crecimiento en xilosa y arabinosa fue la Amb1.

Resultados preeliminares de prueba OF (Hugh & Leifson)

Contenido• Introducción• Antecedentes• Metodología de clonación (Termófilos

Gram+)• Producción de etanol

(Thermoanaerobacterium saccharolyticum )• Perspectivas

Ford Modelo A 1896

Godfrey

Vehículo Ford adaptado por el INT en el año 1925 para demostraciones del uso de bioetanol puro como combustible (BNDES y CGEE. 2008. Bioetanol de caña de azúcar: energía para el desarrollo Sostenible)

fatt

y ac

id p

athw

ays

Trends in Biotechnology. 2008. 26 (7)

isop

reno

id p

athw

ays

Central metabolic pathways and the potential fuel molecules derived from them

Nature reviews Microbiology 2009 (7) 715-23

Nature 2008 454: 841-45

Science 2007 315, 804-07

Waites et. al 2005

Approximately 6–8 tons of dried leaves called trash is produced from one hectare of sugarcane crop (Singh et al. 2008)40%- celulosa (40-60% BNDES y CGEE 2008)25% hemicelulosa (20-40% BNDES y CGEE 2008)18-20% lignina (10-25% BNDES y CGEE 2008)

25%-85% w/w hemicellulose: xylose is the second much abundant sugar in nature after D-glucose

Saccharomyces cerevisiae más común Zymomonas mobilis homo fermentador Escherichia coli silvestre etanol + ácidos orgánicos

A well-known problem in S. cerevisiae is that xylose transport into the cell is inhibited by glucose, since xylose and glucose compete for the same transport systems (Kilian et. al 1988, Meinander et al. 1997)

etanol

Godfrey

Two routes to xylose assimilation:When xylose enters Sacchromyces cerevisiae it can be incorporated into the pentose phosphate pathway through either the three-enzyme pathway containing a xylitol intermediate or a two-step process that uses a fungal or bacterial xylose isomerase gene. The two-step process bypasses the need for the reducing power that is incorporated in NAD- and NADP-reducing partners and has been shown to improve ethanol production. Xylulose-5-phosphate is formed by both pathways and can enter into central carbon metabolism through the transketolase and transaldolase reactions.

Nature reviews Microbiology 2007 5 248-50

1. Producción de enzimas sacarolíticas (celulasas y hemicelulasas)

2. Hidrólisis de los polisacáridos presentes en la biomasa pretratada, es decir las rutas metabólicas para poder realizar dicha hidrólisis

3. Fermentación alcohólica de hexosas (glucosa)

4. Fermentación de pentosas Xilosa y Arabinosa

Metodology

Gene Cloning and Plasmid Construction (Desai et al. 2004) 18

Transformation of T. saccharolyticum (Mai et al. 1997, Klapath et al. 1996 ,Tyurin et. al 2005)14-16

Media Composition and Strain Storage (Baskaran et al. 1995) 25

Fermentation Conditions

Analytical Methods (Lu et al. 2006) 28

Enzymatic Assays (Shaw et al. 2008b) 12

Thermoanaerobacterium saccharolyticum L-ldh- (Desai et al. 2004) 18

Thermoanaerobacterium saccharolyticum L-ldh-, ack- pta-, ack- pta- L-ldh-(Shaw et al. 2008)

Transformation of T. saccharolyticum (Mai et al. 1997, Tyurin et. al 2005)14-16

pIKM1: pKD102 cut EcoRI/PstI and 1.5 Kpb band (gene aph3 kanr) isolate (agarose gel 1%) ligated EcoRI/PstI cut pIMP1

Ori Gram-negative ColEH1, Gram-positive pIM1 (ORF2), Selectable markers Ampicillin (ampr), Macrolide Lincosamide Streptogramin (MLS) Kanamycin (kanr) resistance

pIM

P1

lam

bda

pIK

M1

EcoRI

pIK

M1

EcoR

I/Pst

I

pIKM1

EcoR

I/Pst

I

EcoR

I

pIKM1

EcoR

I/Pst

I

EcoR

I

E. coli transformed Thermoanaerobacterium

Hin

dIII.

Immediately before electroporation.

Transformation of T. saccharolyticum (Mai et al. 1997, Tyurin et. al 2005)14-16

Transformation of T. saccharolyticum (Mai et al. 1997, Klapath et al. 1996, Tyurin et. al 2005)14-16

Transformation of T. saccharolyticum (Mai et al. 1997, Klapath et al. 1996, Tyurin et. al 2005)14-16

Electropermeabilization• 24Mhz• 10kV• Oscillations are correlated with

high-frequency transformation

Thermoanaerobacterium saccharolyticum L-ldh- and Gene Cloning and Plasmid Construction (Desai et al. 2004) 18

Thermoanaerobacterium saccharolyticum L-ldh-, ack- pta-, ack- pta- L-ldh-(Shaw et al. 2008)

Thermoanaerobacterium saccharolyticum JW/SL-YS485 (Provided by Wiegel).25% glicerol + 75% medio N2

Culture recoveredDMS61 broth, 0.5 g cysteina/l, TransformatiónMYE mineral, YEA 2g/l, Xyl or Glu 5 g/l caracterization

Selectión 50-400µg kanamycin/ ml

Cloning of L-lactate dehydrogenase

Conserved regions from: C acetobutylicum, KPGETR, NPVDIL,Bacillus megaterius GEHGD, KGATYYBacillus sterothermophilus

Degenerated primers were designed CODEHOP program

Genomic DNA Thermoanaerobacterium saccharolyticum

Ldh fragment (Sau3AI) cloned DNA library secuenced GenBank AN: JW/SL-Y485-AY278026

Thermoanaerobacterium saccharolyticum L-ldh- and Gene Cloning and Plasmid Construction (Desai et al. 2004) 18

Thermoanaerobacterium saccharolyticum L-ldh-, ack- pta-, ack- pta- L-ldh-(Shaw et al. 2008)

Knockout vector construction

pSGD8: pUC18Amplification: primers degenerate Ldh (up and down): 1.0 kb and 0.43 KbA-tailed TOPO pCR2.1 pSGD8

KmR: kanamycin R, ApR: bla penicillin R, ldh fragments.

pIKM1

Thermoanaerobacterium saccharolyticum L-ldh- and Gene Cloning and Plasmid Construction (Desai et al. 2004) 18

Thermoanaerobacterium saccharolyticum L-ldh-, ack- pta-, ack- pta- L-ldh-(Shaw et al. 2008)

W TD1pIMM1Primers

Thermoanaerobacterium saccharolyticum L-ldh- and Gene Cloning and Plasmid Construction (Desai et al. 2004) 18

Thermoanaerobacterium saccharolyticum L-ldh-, ack- pta-, ack- pta- L-ldh-(Shaw et al. 2008)

Glu

cose

Xylo

se

Wild TD1 (ldh-)

X : OD□ : Ethanol : Substrate• : Lactate∆ : Acetate

Thermoanaerobacterium saccharolyticum L-ldh-, ack- pta-, ack- pta- L-ldh-(Shaw et al. 2008)

L-ldh- L-lactate dehydrogenase

ack- acetate kinase

pta- phosphateacetyltransferase

X

X

X

Thermoanaerobacterium saccharolyticum L-ldh-, ack- pta-, ack- pta- L-ldh-(Shaw et al. 2008)

L-ldh-

ack- pta-

ack- pta- L-ldh- (Lk1)

Thermoanaerobacterium saccharolyticum L-ldh-, ack- pta-, ack- pta- L-ldh-(Shaw et al. 2008)

1.2- and 0.6-kb regions 5´ and 3´ ofthe pta and ack genes were amplified

K1, K2 Kanamycin promoter region E1, E2 adenine methylase gene conferring erythromycin

resistance

Knockout vector construction

pSGD9: pUC18Amplification: primers degenerate pta and ack (up and down): 1.2 kb and 0.6 KbA-tailed TOPO pCR2.1 pSGD8

KmR: kanamycin R, ApR: bla penicillin R, ldh fragments.

thermostable S. faecalis kanamycin resistance cassette

Thermoanaerobacterium saccharolyticum L-ldh-, ack- pta-, ack- pta- L-ldh-(Shaw et al. 2008)

pta and ack homology regions

Fermentaciones en Batch cepa silvestre, L-ldh, pta/ack, y ALK1

En tubos bajo anaerobiosis (Ngas 5% v/v)4 g/l xilosa, 2.5 g/l extracto de levadura, 10 g/l buffer MES (pH 6.2). Temperatura: 55°C (Sin agitación)

Fermentaciones en continuo ALK1 y ALK2

Bioreactor de 2 L, Vt:0.5L, Applikon Instruments20–70 g/l xilosa10 g/l extracto de levadura 5 g/l triptona. Temperatura: 55°CpH: buffer del medio MTCAnaerobiosis: 30-60 min. Ngas, ResazurinRecuperación de CO2 : contenedor con agua

Fermentaciones en Batch ALK2

Bioreactor de 3 L, Vt:1L, Sartorius12 g/l xilosa, 5 g/l extracto de levadura, pH 5.5, 200 rpmTemperatura: 55°C

Thermoanaerobacterium saccharolyticum L-ldh-, ack- pta-, ack- pta- L-ldh-(Shaw et al. 2008)

*Peso seco, etanol, ● xilosa, □ ácido acético, ◊ ácido láctico

Thermoanaerobacterium saccharolyticum L-ldh-, ack- pta-, ack- pta- L-ldh-(Shaw et al. 2008)

Thermoanaerobacterium saccharolyticum L-ldh-, ack- pta-, ack- pta- L-ldh-(Shaw et al. 2008)

Xylose, glucose Mannosegalactose EthanolDry weight (*).

Thermoanaerobacterium saccharolyticum L-ldh-, ack- pta-, ack- pta- L-ldh-(Shaw et al. 2008)

Thermoanaerobacterium saccharolyticum L-ldh-, ack- pta-, ack- pta- L-ldh-(Shaw et al. 2008)

Perspective• Transition first second generation biofuel: wild-type

genetically engineered variants with superior catabolic properties and homoethanologenic production phenotypes.

• Research strategy in thermophiles by a lack of the same degree of knowledge (Colombia)

• Construction of nonnatural metabolism that allows the biosynthesis, for the first time, of an array of alcohols not readily produced by microorganisms (Higher-chain alcohol)