1

Solid Tumors Reveal Their Secrets: Predictive and Prognostic Evidence 

from Copy Number Analysis Webinar 

11 June 2014  [0:00:00]  Slide 1  Sean Sanders:  Hello and a very warm welcome to this Science/AAAS audio webinar.  Slide 2    My name is Sean Sanders and I'm the editor for Custom Publishing at Science.    In  today's  webinar,  we'll  be  discussing  the  importance  of  copy  number 

variation  analysis  in  cancer,  particularly  in  solid  tumors. Detection  of  copy number aberrations is becoming increasingly important for tumor profiling in order  to not miss genetic changes potentially not detected by other means including next generation sequencing. 

   Moreover, whole‐genome  copy  number  analysis  can  play  a  critical  role  in 

identifying  clinically‐relevant,  prognostic,  and  predictive  biomarkers. Biomarker  identification  and  validation  is  technically  challenging  especially when  using  formalin‐fixed,  paraffin‐embedded  tissue  or  heterogeneous samples where only a small fraction of the cells may be aberrant.  

   This  webinar  will  explore  the  importance  of  copy  number  analysis  and 

highlight  new  technologies  that  are  making  this  process  more  accessible especially in solid tumor samples. It is my great pleasure to introduce to you our guests  for today's webinar. They are Dr. Paul Boutros  from the Ontario Institute  for Cancer Research  in Toronto, Canada and Dr. Ajay Pandita  from Core Diagnostics  in Palo Alto, California, a warm welcome  to you both and thank you both for being on the line with us today. 

   Before  we  get  started  for  today's  webinar,  as  always,  we  have  some 

information that our audience might find helpful.  Slide 1 

2

   You can change the size or hide any of the windows in your viewing console. 

The widgets  at  the  bottom  of  the  console  control what  you  see.  Click  on these  to  see  the  speaker  bios  or  additional  information  about  technology related to today's discussion, or to download a PDF of the slides. 

   Each of our speakers will give their presentations after which we will have a 

Q&A session, during which we will address some of the questions submitted by our  live online  viewers,  so  if  you're  joining us  live,  start  thinking  about some questions now and submit  them at any  time by  typing  them  into  the box  on  the  bottom  left  of  your  viewing  console  and  clicking  the  "submit" button.  If you can't see this box, click the red Q&A widget at the bottom of the screen. 

   Please do remember to keep your questions as short and clear as possible as 

that will give them the best chance of being put to our panel. You can also log in to your Facebook, Twitter, or LinkedIn accounts during the webinar to post updates or send  tweets about  the event.  Just click  the widgets on  the bottom of the screen. For tweets, you can add the hashtag #ScienceWebinar. Finally, thank you to Affymetrix for their sponsoring of today's webinar. Now, I'd like to introduce our first speaker for today, Dr. Paul Boutros. 

 Slide 3    Dr.  Boutros  is  a  principal  investigator  in  informatics  and  biocomputing  at 

OICR,  and  an  assistant  professor  in  the  Departments  of  Pharmacology  & Toxicology and Medical Biophysics at the University of Toronto. His research focuses  on  personalizing  therapy  for  prostate  cancer  by  developing  novel statistical methodologies. 

   He  is  leading  the bioinformatics analysis of 500 prostate cancers as part of 

the Canadian Prostate Cancer Genome Network and  is using  these data  to develop biomarkers for intermediate risk prostate cancer.  

   A very warm welcome to you, Dr. Boutros.  Dr. Paul Boutros:  Thank you, Sean, and thank you for the organizers for  inviting me to talk to 

you today. I'm going to speak to you about intermediate risk prostate cancer and how we can use copy number aberrations to understand it better. 

 Slide 4  

3

  I'll  start  by  formulating  the  general  problem  that we  face  in  personalized medicine studies and then move to a couple of vignettes about intermediate risk prostate cancer. 

 Slide 5    The core problem that we face in almost any cancer personalization studies is 

that patient outcome  is highly variable and you see that here  in this plot of survival outcome for early stage lung cancer, and this is true for pretty much any tumor type. We have a number of patients who will suffer an event early in their progression into the disease and other patients who will live for many years after treatment. 

 Slide 6    What we would really like to do is to be able to identify those groups a priori 

so  that  we  could  offer  personalized  treatment  to  them,  giving  more treatment to the groups that will have an early event and  less treatment to those  that will have  later events.  In particular,  I've exposed  this as  if  it's a two‐group problem.  It's  really a continuous one and we're  focusing on  this easier dichotomization now, but eventually we'd hope  to give each patient the therapy that's most appropriate to them. 

 Slide 7    Now, this is not a new idea by any means. It's one that's been longstanding in 

the field and the older hypothesis has been that there are a distinct number of  tumor  subtypes  which  have  very  distinctive  molecular  profile.  Those distinctive molecular profiles lead to distinct prognoses or clinical outcomes. And  from  a  computational  biology  perspective,  this  screams  a  class  of techniques called pattern discovery. 

 Slide 8    The first application of pattern discovery was into solid tumors within breast 

cancer  where  there  was  some  classic  work  that  identified  five  distinct subtypes, the subtypes that we still know and use today. 

 Slide 9    And very  importantly, those subtypes are associated with different types of 

outcome.  [0:04:57] 

4

   For example,  if we  focus on  the panel on  the  left,  the  top blue curve with 

about 90% eight‐year survival is the Luminal A subtype of breast cancer. The red curve where all patients have passed on after just four years is the basal subtype.  And  so, we  see  that  there  are  clear,  distinct molecular  subtypes with clinical differences. This is importantly reproducible. 

 Slide 10    For  example,  I'm  showing  you  a  600‐patient  validation  study  by  Rob 

Tibshirani's  group  and  there've  been  many  other  such  validation  studies showing that these are  identifiable  in  labs around the world. Unfortunately, this doesn't turn out to be true for most other tumor types. 

 Slide 11    At  almost  the  exact  same  time,  David  Beer's  group  in  Michigan  was 

identifying  clusters  that  are  associated with  lung  cancer  and  that  defined different  subtypes  of  lung  cancer,  which  had  very  distinctive  outcome. Unfortunately,  they  could  not  reproduce  another  data  set  largely  due  to technical reasons. 

 Slide 12    Similarly, a group  from Duke  showed  some  truly  remarkable differences  in 

outcome associated with some Bayesian modeling technique. Unfortunately, that study turned out to be fraudulent and it was retracted. I guess what we really found is that the fundamental problem we have in most tumor types is that there are too many subtypes. 

 Slide 13    This is well exemplified in lung cancer whereas this heat map shows, you can 

see dozens or hundreds of different  tumor  subtypes  that are present even just defined by a small set of fixed genes. 

 Slide 14    This explains  something  that our  statistical  colleagues have been  telling us 

for years, which was that the patient cohort sizes that we were using weren't sufficient  for  robust  biomarkers,  that  in  reality,  we  should  have  needed thousands of patients to identify these good genomic biomarkers. 

 Slide 15 

5

   And  so,  in  a way,  the  field  pivoted  and  in  the mid‐2000s,  people  started 

redefining the problem saying that there's a large number of tumor subtypes and  their  molecular  profiles  were  overlapping  instead  of  distinctive,  but these  still  lead  to  distinct  clinical  outcomes.  This,  of  course,  indicates machine  learning techniques would be appropriate and there's been a  large series of work to optimize the use of machine learning techniques. 

 Slide 16    I'll  kind  of  summarize  the  field  by  saying  that we  can  essentially  take  any 

single type of data and maximize our information retrieval from it, so modern mRNA based markers are able to use 99.9% of the information available, but it still doesn't achieve what you might consider clinically useful results. 

 Slide 17    This  is what was up until a couple of years ago, the state‐of‐the‐art for  lung 

cancer  biomarkers,  and  you  can  see  it  does  a  reasonable  job.  There  are differences between a survival curve, but unfortunately, this corresponds to about a 66% accuracy of predicting good versus poor outcome. The patient isn't  going  to  accept  being  told,  "Oh, maybe  I  don't  need  chemotherapy because you're two‐thirds confident  in your prediction." Rather, we need to be able to make robust predictions.  

 Slide 18    And in some sense, this is the origin of a lot of large multimodal studies. The 

idea was that we would want to move beyond just using a single data type at a time. We'd want to create accurate algorithms that can work robustly, that could  handle  diverse  types  of  data  in  an  intricate way  that would  handle diverse problems and  that would  incorporate what we know about  clinical features directly into the modeling. 

   In  fact,  in a  lot of healthcare systems, you'd want  these models  to actually 

incorporate  treatment  options  and  even  payment  options,  cost considerations. And of course,  it has to be fast. It should be able to run  in a day from standard biopsy‐type samples. So in some sense, this is the origin of large multimodal projects like the ICGC or the TCGA.  

 Slide 19    What I'll talk to you also is within the framework of one of the ICGC projects 

called the Canadian Prostate Cancer Genome Network. 

6

 Slide 20    This  is  a  project  that's  co‐led  by  four  people  ‐‐  Rob  Bristow,  a  radiation 

oncologist;  John  McPherson,  a  genomicist;  Theo  van  der  Kwast,  a pathologist;  and  myself,  a  computational  biologist,  and  we're  tackling prostate cancer. 

 Slide 21    In  Canada,  that  affects  25,000  people  a  year,  about  250,000  in  the  US. 

Unfortunately, only about one in six or one in seven of those will succumb to their disease. 

   In fact, we often suffer from an overdiagnosis of prostate cancer, and that's 

really  clear  in  this  incidence graph where you  can  see a  sharp peak  in  the early 1990s corresponding to the introduction of PSA screening. By contrast, there's  only  a  slight  decline  in mortality  and  this  is  something  that's  very important to address. 

 Slide 22    In  general,  prostate  cancer  is  considered  or  diagnosed  and  prognosed 

through a series of quite simple tests. There's a digital rectal exam, which  is used to initially detect a large majority of tumors supplemented by imaging, biopsies to confirm the presence of tumor and grade it, and PSA testing both for screening and to allow us to identify patient prognosis. 

   Based on  those criteria, we classify patients  into  low,  intermediate, or high 

risk groups  if  they have  localized disease, and we  selected  to  focus on  the intermediate risk group. 

 Slide 23    The intermediate risk group is defined by Gleason 7 scores.  [0:10:02]    These are measure of how differentiated the cells are, how they look under a 

microscope, and it's really taking a look at the two largest areas of the tumor and asking what are the Gleason scores of those two regions. 

 Slide 24  

7

  When you do so, you can divide patients  into  these  low,  intermediate, and the  high  risk  groups  and  you  can  see  that  they're  treated  with  different modalities.  Low‐risk  patients  are  generally  just  surveilled  to  see  if  their disease  will  progress.  High‐risk  patients  receive  treatment  plus  additional therapy. 

   At the  intermediate risk group, our goal  is to move a  large fraction of these 

patients  into high  risk saying about one‐third of  them are actually going  to succumb  to  their  disease  and  have  a  recurrence.  Can we  figure  out who those  are  in  advance  and  give  them  additional  treatment,  and  can  we identify  those  patients who  are  actually  low‐risk  and  their  disease  doesn't even  need  any  treatment  at  all?  Therefore,  we  want  to  substage  or substratify the intermediate risk group for prostate cancer patients. 

 Slide 25    And so, what have we been doing  to  try  to address  those questions? Well, 

the first thing that we explored was the internal heterogeneity of Gleason 7 prostate cancer. 

 Slide 26    What  you're  seeing  here  are  copy  number  profiles  of  the  entire  genome 

going from Chromosome 1 at the  left to the Y chromosome on the right for Gleason 7 prostate cancer, and there are two groups. The top in dark orange is Gleason 4+3 and the bottom is Gleason 3+4, and you can immediately see a  series of  recurrent  abnormalities  and well‐known  genes  like NKX3‐1  and MYC, and we wanted to investigate these in a bit more detail. 

   As  soon  as we  started  looking  at  these  array‐based  copy  number  profiles 

derived  from  biopsy  specimens,  we  immediately  noticed  some  things  we didn't expect. So we started focusing on the subset of samples ‐‐ and I'll talk about some genome sequencing results from those  in a moment  ‐‐ but one of the most interesting things that we saw was a very unexpected finding in the amplification of a gene called MYCL or LMYC.  

 Slide 27    The MYC  family of oncogenes  is well‐known  to be  associated with  a  large 

number  of  tumor  types  and  it's  recurrently  amplified  in  prostate  cancer. Previously though, small focal amplifications in LMYC had not been reported. We identified these in almost a quarter of our patients and very intriguingly they're exclusive with amplifications in CMYC or to a lesser extent, NMYC. 

 

8

  That's  very  interesting  because  the  MYCs  are  known  to  have  an autoregulatory  function,  which  prevents  multiple  MYC  genes  from  being highly expressed  in  a  single  cell. Additionally,  you  can  see here  that MYCL amplification is strongly associated with p53 deletion. 

 Slide 28    We went to explore this in a bit more detail and that first we actually didn't 

believe  the array analysis because  it was  so  sensitive, and we went ahead and did real‐time PCR and subsequently FISH, and we were able to confirm that  the  arrays were  picking  up  focal  amplifications  to  three,  four,  or  five copies in this single gene with a very small, minimally amplified region. 

 Slide 29    We found that this is associated with genomic instability that LMYC‐amplified 

tumors have  a  significantly  larger  fraction of  the  genome  that's  altered by copy number aberrations. 

 Slide 30    And  in  a  very  unusual  way  where  rather  than  having  a  few  large 

amplifications,  they  have  a  large  number  of  small  deletions  and amplifications. 

 Slide 31    The gene  itself  is weekly prognostic.  It predicts patient survival to a modest 

extent.  Slide 32    And  maybe  most  interestingly,  it's  associated  with  a  very  unique  mRNA 

profile. So  from this copy number array analysis, we're  immediately able to identify  a  single  gene  that  defines  a  subtype  of  prostate  cancer  that was previously unrecognized. 

 Slide 33    Now, we went  ahead  to  say  next we want  to  take  a  look  at  the  internal 

heterogeneity  and  here  we  linked  copy  number  aberration  assessments using  arrays  to  SNV  and  rearrangement  assessment  using  sequencing analysis, and what we did is we focused on a small number of tumors and we looked internally at their heterogeneity. 

9

 Slide 34    So what we  really did  is we  sliced  through  the prostate  at many different 

layers  and  at  each  layer, we would  take  a  look  in  detail  or  a  pathologist would take a look in detail at all of the different regions of tumor. 

 Slide 35    You'd  see  in  this  type  of  plot  that  there  is  a  subset  of  the  tumor  in  the 

bottom left that's purple. It's mixed Gleason pattern 3 and 4, and we micro‐dissect  out  that  spot  and  we'd  give  array  and  sequencing  analysis  on  it. Similarly,  the  little blue  spot above  it  that's about 5% Gleason 4 would be dissected and separately sequenced and analyzed. 

 Slide 36    The net effect of  this  is  it allows us  to assess  the  internal heterogeneity  in 

prostate cancer. Now, what you're seeing here is a fairly complex slide. Let's just focus initially on the box itself. This box defines nine regions taken from a single man's tumor and you can  immediately see striking variability  in the number of point mutations. One region of the tumor has about 150. Another region has only about 15, so in order of magnitude. 

 [0:15:01]    Similarly,  this other box describes another  set of  five  regions  from a  single 

man's prostate and again, you see an order of magnitude difference  in  the number of point mutations, protein coding point mutations seen from region to region. 

 Slide 37    That's not  just  true at  the  level of point mutations. You can  see  in  the  top 

panel here the number of copy number aberrations. And in the last group of five,  you  can  see  one  region  from  this man's  prostate  has  about  350  and others only have a few tens of copy number aberrations. The same is true for any characteristic that we look of the tumor. 

   Of course, the obvious question you might ask  is, "Is this clinically relevant? 

Does it matter?"  Slide 38  

10

  Again, a fairly complicated plot, and I'll blow up this area focusing on cancer‐related genes. This plot here is actually focusing on a small set of genes that are  particularly  clinically  relevant.  The  green  squares  in  PIK3CA  are identifying  non‐synonymous  point  mutations,  actionable  point  mutations from sequencing that might tell you this patient might be amenable to mTOR inhibition. 

   By contrast, the blue dots are pointing out copy number aberrations and you 

can  see  in  four  regions of  this man's prostate, he has deletions of BRCA1, which  is commonly associated with germline or  familial prostate cancer  for completely separate regions of p53 deletions. 

   And  when  we  superimpose  upon  this  the  clinical  information  about  the 

disease, you can see  that  it  turns out  that  the BRCA1  regions are  the most aggressive and the potentially targetable PIK3CA ones are not. So that gives a sense of just how much heterogeneity there is in an individual tumor. 

 Slide 39    Now, this affects copy number markers as well very substantially and we're 

looking here at biomarkers that might predict a response. You can see in any individual man,  there's heterogeneity  in  the deletions of p53 or NKX3‐1 or CDH1 suggesting  that a biomarker needs  to be able  to address  this  type of concern. 

 Slide 40    Now, to the extreme extent that we observed here, we found multi‐clonality 

in a couple of patients. Here is an individual, four regions from his tumor and the top panel  is showing copy number aberrations. What you can see  is the two  regions,  the  tumor  have  striking  deletions  in  Chromosome  8  and Chromosome 16. Two other regions have deletions in Chromosome 19. They don't share anything in common. 

   Similarly, at the point mutation  level at the bottom, we can see clearly that 

there  is no point mutation  share between  these  two  regions.  In  short,  the man has two completely genetically distinct tumors within his prostate. 

 Slide 41    And  so,  that  suggests  that  there's  a  real  importance  to  developing 

biomarkers  based  on  biopsy  specimens,  based  on  what  will  be  used  to diagnose the tumor so that we can optimize treatment selection before the tumor actually is resected. 

11

 Slide 42    And so, working with Rob Bristow and a brilliant PhD student co‐supervised 

by Rob  and myself, we  started  to  take  a  look  at how  you might use  copy number assays to do so. 

 Slide 43    We chose a very unique cohort of 126 radiotherapy patients where we had 

pre‐radiotherapy  biopsies  frozen  for  analysis,  and  then we  validated  it  on surgery patients. Again, we subjected each of these to copy number profiling and used them to try to asses biomarkers. 

 Slide 44    We  see  that  the  common  genes  themselves  are  altered,  so  you  see  here 

about 40 patients with MYC  amplification  and  that  itself  serves  as  a weak biomarker.  On  the  other  hand,  these  only  account  for  a  fraction  of  the patients  and  they're  not  very  strong  biomarkers,  so we  need much more powerful trends to be able to actually make this clinically useful. 

 Slide 45    So  what  Emilie  did  is  start  with  an  unsupervised  analysis.  She  began  by 

creating a novel clustering technique  identifying groups of patients that she could then validate and eventually associate with clinical outcome.  

 Slide 46    When  she  did  so,  she  identified  four  clusters  shown  by  the  bright  yellow, 

green,  purple,  and  red  bars  on  the  right  side  of  the  plot.  Those  clusters turned out to have quite distinctive genomic profiles. 

 Slide 47    For example, Cluster 1 has a characteristic amplification of Chromosome 7. 

Cluster 3 has a characteristic deletion on Chromosome 8 and a deletion on Chromosome 16. 

 Slide 48    When we  looked at the outcome of these patients, you would  immediately 

see that the red cluster has very good outcome relative to the other three. 

12

And this red cluster, if we go back to the profile plot, is the one with very few alterations. 

 Slide 47    That made us hypothesize  that perhaps  it wasn't  the  individual genes  that 

were important, but the level of genomic instability.  Slide 49    So Emilie developed PGA or the proportion of the genome altered as a proxy 

for genomic instability, and that turns out to be a wonderful biomarker.  Slide 50    By  itself,  just knowing  the copy number profile allows us  to make clinically 

useful predictions.  Slide 51    She then said, "Maybe I can incorporate this and use both gene‐specific and 

general genomic instability information in my biomarker."  [0:20:04]    So  what  she  did  was  develop  a  machine  learning  technique  that  would 

maximize  the number of genes  in a  signature  instead of  try  to minimize  it. She used standard machine learning techniques on that data set, used cross‐validation to try to optimize it, and then would validate it in her independent cohort. 

 Slide 52    When  she  did  so,  it  resulted  in  a  truly  remarkable  classifier,  one  that  has 

about  80%  accuracy,  which  you might  consider  the  boundary  for  clinical utility, and a hazard  ratio  showing  relative  risk between  the  two groups of about six even after adjusting for other clinical criteria. 

 Slide 53    This signature turns out to work better than any of the RNA signatures that 

have  been  performed  to  date.  We  did  a  heads  up  comparison  on  an independent cohort of the predictive ability and significantly better than the blue clinical signature, which is the area under the raw curve of 0.6.  

13

 Slide 54    Very interestingly, when we took a look at this, we were able to identify that 

many of  the genes  that were  important were on Chromosome 8.  In  fact,  it turned out that while many people in the field had assumed that there is the deletion  of  NKX3‐1  and  the  amplification  of  MYC  that  mattered  on Chromosome  8,  rather  there  is  a  large  number  of  features  that  carry independent  prognostic  capability  and  those  genes  turned  out  to  have interesting biology. 

Slide 55    Just a simple example, the copy number alterations in a gene called SBF1 are 

also associated with methylation and mRNA abundance differences.  Slide 56    And in fact, it goes in exactly the direction you might expect. Here is a gene 

that shows enhanced mRNA  levels that are associated with good outcomes, so  it's  a  tumor  suppressor.  It's  deleted  in  prostate  cancer  and  it's hypermethylated in the subset of patients as well. 

 Slide 57    So what I hope I showed you is that copy number base biomarkers can teach 

us a  lot about the  internal heterogeneity of prostate cancer. In fact, we can even identify that it's potentially multi‐clonal. That highlights the importance of using CNAs as a biomarker from diagnostic material from small amounts of FFPE samples. 

 Slide 58    I  spent most  of my  time  saying  "we". We,  of  course,  is  a  large  group  of 

people who  are  involved  in  CPC‐GENE.  I mentioned  Rob,  Theo,  John,  and Emilie  at  the  beginning.  And  of  course,  I'd  like  to  thank  all  of  the  other members of my lab. Now, I'll turn it over to Ajay. 

 Sean Sanders:  Thanks so much, Dr. Boutros.  Slide 59    We're  all  going  to move  right  on  to  our  next  speaker  and  that  is Dr. Ajay 

Pandita.  

14

Slide 60    Dr.  Pandita  has  over  20  years  of  experience  in  the  field  of  molecular 

cytogenetics and molecular biology. He previously worked as a scientist  for Genentech  where  he  was  responsible  for  developing  personalized  health care strategies for Genentech molecules in their pipeline. 

   In 2011, he moved to OncoMDx (recently renamed Core Diagnostics) where 

he  presently  serves  as  chief  science  officer.  In  this  position, Dr.  Pandita  is responsible  for  developing  personalized  strategies  for  projects  from  early research and preclinical  studies  and  for  generating novel biomarker  assays for their clinical labs. 

   A very warm welcome to you, Dr. Pandita.  Dr. Ajay Pandita:  Thanks,  Sean,  for  the  kind  introduction  and  also  for  the  opportunity  to 

present here. I'll try to continue from where Paul left, and Paul showed how greatly  in the  lab you could do a  lot of work and find signatures or markers that  could  be  used  ultimately  for  the  best  management  or  clinical management for the patients. 

   I'll  give  an  example  of  something  that we  use  in  a  Phase  2  trial  that was 

published  earlier  this  year, which  basically  enhances  the  point  of  taking  it from the bench to the bed, but also in the initial study that we published late last year where we were  trying  to get  information  from what happened  in the  patients  and  trying  to  see  how  can we  bring  that  back  to  the  lab  to understand how again to  look for markers or ways  in which we can provide management to patients at the best possible way we can. 

 Slide 61    Chromosomal alterations or aberrations  that  lead  to copy number changes 

are a hallmark for a cancer cell. I begin by showing a normal karyotype where you  see  on  your  left  hand  side  a  routine  G‐banded  image  of  the chromosomes,  which  has  been  really  helpful  especially  in  liquid  tumors where actively mitotic cells can grow and we can look at the alterations that are  present,  and  define whether  you  stratified  the  patients  really well  in terms of how they would do and if there are any treatments that quickly can be targeted towards that. 

   However, with the advent of molecular biology, we try to  infuse some color 

into our black and white world of G‐banding and using FISH, which  is more amenable to solid tumors. We could also look into what's happening on a cell 

15

to cell basis for the known genes, and specifically, it has been really helpful in solid tumors. 

   The  image that you see towards your right  is a normal FISH pattern in a cell 

for a gene that's a locus‐specific gene. In this case, it's p10; that's in red color, and the control centromeric probe that is for Chromosome 10 that you see in the green color. 

 [0:25:02]  Slide 62    However,  when  you  go  to  a  cancer  patient's  karyotype  ‐‐  and  this  is 

something  that  you  see  that  there  could  be  changes  that  could  vary, specifically  this  one  ‐‐  to  illustrate  my  point  of  how  many  changes  can happen,  it was  really  tough  to  illustrate  that  in a normal G‐banded or a G‐banded image. 

   So what  you  see over here  is  spectral  karyotype where each  chromosome 

has its distinct color. Wherever you see a deviation, that means there's some kind of a rearrangement or aberration that's happening on the chromosome. And as you can see, there are multiple copies of the chromosomes, unusual chromosomes, and also the rearrangements. 

   Ultimately, there were a lot of losses and gains that happened in this patient 

due to these alterations. Again, this can also be seen ‐‐ I don't know whether you  can  see  it  properly  or  not,  but  this  can  also  be  seen  using  the  FISH analysis.  In  this  case,  this  is  a  HER2  FISH  status  performed  on  a  patient sample where there are multiple copy gains, where there are low copy gains, and where you  could  see  three  to  four  red  signals  in  the  individual nuclei, which can  range  from being highly amplified where you  see  in  the bottom panel  ‐‐  where  you  could  see  there  at  least  50  to  60  copies  of  HER2  in comparison to two to three copies of the control gene. 

 Slide 63    However, that said,  it always doesn't have to be as complex as that. Even a 

small  change  of  extra  chromosome  or  tiny  Chromosome  21  in  Down syndrome,  which  you  can  see  in  this  G‐banded  image,  also  is  a  bit  ‐‐  a number of developmental disability and significantly reduced life span of the patient. So  it could be a small change as a mutation, a single chromosome gain, or a single loci or gene gain to highly amplified and polyploid genomes that could cause changes  into  the patient  taking  it  from a normal cell  to a cancer cell. 

16

 Slide 64    Structure  and  numerical  changes  are,  as  I  said,  a  hallmark  for  the  cancer 

genome. What we have here is the multiple ways in which these aberrations can  affect  a  cell  where  it  could  be  either  changes  in  the  individual chromosomes or you could see changes in the whole genome. Going from a diploid, it could be a triploid, tetraploid and so on. 

   More  interestingly also, there could be  low  level and high  level gains, which 

is gene amplification that has been started for a while and have been one of the first alterations in terms of copy number changes that have been studied vastly  and  used  as  a  factor  especially  in  breast  cancer  patients where  the HER2 amplified patients have a drug especially targeting against it. 

   I won't talk about the structure changes here, but they have also been shown 

to  be  quite  important,  and  one  of  the  recent  examples  has  been  the ALK translocation  in  lung  cancer  where  it's  a  highly  specific  drug  against  the alteration has been very fruitful in the management of the patients. 

 Slide 65    As we know,  for  the  last many years, a  lot of  focus has been documented 

towards  the  accumulation of  genetic events, be  it epigenetic mutations or copy number structural changes  that  lead  to a cancer cell. A  lot of  interest currently  in  the  community  has  been  to  identify  and  understand  the contributions  that  these  alterations  have  towards  the  progression  or  the biology of the tumor. 

   However, in recent years, a lot of interest has been towards to see whether 

we  can  understand  these  changes  a  bit  better  and  use  drugs  against  it  to benefit  the patient ultimately where you would  see  that  there would be a cohort of patients where the diagnostic positive and the diagnostic negative patients would  show  difference  in  their  prognosis,  but  then  ultimately,  if there's  a  drug  that  specifically  targeted  against  it,  the  patient  that would have the alteration gain the maximum benefit of the drug. 

 Slide 66    However,  this  is  not  a  very  new  concept.  This  is  a  concept  that was  put 

forward  in  the  early  1900s  by  Boveri  where  he  did  mention  on  his experiments  on  sea  urchin  eggs  that  they  are  growth‐inhibiting  and promoting chromosomes that result in unlimited multiplication. 

 

17

  I  think  that's where  I would  think  the basis  is of  looking at  these abnormal conditions  in  the  chromosomes  and  apply  it  until  we  had  technologies ultimately  where  we  could  record  and  document  these  changes  and associate it with different cancers and what they do on cancers. 

 Slide 67    However, with the completion of the human genome project,  it has greatly 

made a big difference  in  terms of  the data  that's available and very nicely covered by Paul, that you could see that you could  look at different regions of  the genomes, abnormalities of  the genomes with new  technologies  that are upcoming each and every day where you can look into the stratifications of  these  signatures  that were  supposed  to  be  for  smaller  portions  of  the genome. However, one of the challenges is how do we incorporate it into our diagnosis or the diagnostic world. 

 [0:30:04]  Slide 68    Until now, pathologists have done a great  job  in  identifying and diagnosing 

the  cancers,  and  also  in  helping  in  mapping  and  reading  the  tumors. However, one of the limitations ‐‐ 

 Slide 69    Before that, this is just an H&E Slide of which the majority of Pathology works 

off of where they use it to diagnose, and this is a case of a prostate cancer.    Whenever  there are  little bit challenges,  they do have markers  in  terms of 

protein expressions  that do help  identify and confirm  the diagnosis  in case there are difference of opinions in what the final diagnosis is.  

 Slide 70    However, one of the limitations in pathology, conventional pathology, is that 

sometimes it's really difficult to diagnose rare tumors, but at the same time, it's  really  hard  to  predict  which  are  the  good  or  bad  tumors,  also,  if  a particular  tumor  would  be  more  sensitive  to  one  type  of  treatment  as compared to the other. 

 Slide 71  

18

  I think that's where biomarkers have played a great role in trying to help the pathologist as an additional tool to help stratify these patients where we can make those decisions and help make those decisions on this patient. 

   Again, I go back to what Paul  illustrated where you see  low risks, high risks, 

and the intermediate type, and then you can tailor your treatment based on that whether you want to go more aggressive or with indolent tumors where you want  to wait  and watch  and be  actively  surveilling  the  tumors  to  see what's happening. 

   Again, biomarkers are the ‐‐ every time, I guess, you have to create a term for 

anything  that you use, biomarker  is one of  such  things.  It's basically  just a marker that you use to measure any biological process. Even though you may not think about it, even high blood pressure is a biomarker for increased risk of stroke, so you can take it to something as simple as that. 

 Slide 72    However,  through  the  years,  the biomarkers have  also  evolved quite  a bit 

starting  from  something  that  was  quite  helpful  in  terms  of  making  the appropriate diagnosis for the patients.  

   Second  in  line  came more  about  the  prognosis where  they  could  ‐‐  and  I 

think  it's more relevant now where we do manage  to  identify  tumors early on,  and  at  that  stage,  there's  a  lot  of  talk  about  overdiagnosis  and overtreatment.  These  markers  definitely  can  help  the  clinicians  to  make those strategies that would be ultimately beneficial to the patient.  

   The most  exciting  part,  I  think,  in  these  days  is  the  predictive  biomarkers 

where a  lot companies and a  lot of studies and a  lot of work  is being done towards matching  the  patient  to  a  particular  drug.  As we  know,  all  these drugs have side effects and we want to minimize  it and maximize the effect of  the  drug,  and  selecting  for  that  group  of  patients  always  is  helpful  in making that. 

   This  is  something  that  I  think  is  becoming  much  more  interesting  more 

recently, is looking into the resistant markers. This was something that we're seeing more  and more  regarded  in  therapy,  but  there  is  resistance  that's developing after a period of time. This is something where a lot of work now is started being done  for patients where we do see that there are targeted therapies against  them, how  can we  look  for  these markers,  can we  know them upfront, and can we have drugs  tailored  that would  try  to combat or treat the patients much better. 

 

19

Slide 73    Just to reiterate that prognostic value of biomarkers, as I was mentioning, is 

that especially  these days,  since we do diagnose  these patients quite early and  with  a  lot  of  talk  about  overdiagnosis  and  overtreatment,  these biomarkers do help in deciding how to go ahead with the patient in terms of its indolent tumor or progressive tumor. 

 Slide 74    This  is  a  classic  example  of  HER2  gene  amplification  being  used  as  a 

prognostic  factor  in  breast  cancer.  You  can  see  the  dotted  line where  the patients with HER2 amplifications do much worse than the patients that are not amplified for the gene. 

 Slide 75    Inclusive of  that,  there are many other prognostic markers  that have been 

used. P10 has been used  for prostate  cancer. MET has been used  for  lung cancer. There were a lot of studies, and anyone who just attended the recent ASCO Conference would have seen that there's a lot of work that's being put towards  both  the  companion  diagnostic  of  predictive  biomarkers  and prognostic biomarkers in terms of patient stratification for clinical therapies. 

   The  exciting  part  again  being  predictive  biomarkers where  the  companion 

diagnostic ‐‐ and I've listed some examples here where you could clearly see that it does create a benefit and can go forward in the top without showing one of the poster children for solitary which was the HER2 amplification and the use of the drug trastuzumab. 

 Slide 76    And what you see  in the plot, a couple of plots right now,  is that there was 

basically no difference between the patients who did receive the drug with the patients who were not stratified by it. 

 [0:35:08]    But once we  started  stratifying  the patients  and  looking  into which of  the 

ones were HER2 positive and negative,  you  could  see  that  the patients do stratify quite nicely where the patient that did receive the drug and have the amplification did much better than the patients that did not. 

 Slide 77 

20

   This  is  just a  list and obviously by no means a complete  list.  It seems to be 

changing and being updated every other month, but there is a lot of focus to what's right now using biomarkers and matching the drugs to it to the effect that a lot of the biotech companies now or biopharma companies are using it in their clinical development pipeline where  initially  it was  like this and  just the  TMN  staging  are  just  based  on  the  pathology  and  going  through  the process of the drug development. 

 Slide 79    However, now ‐‐ even though I won't go into the details of it ‐‐ biomarkers do 

play  an  important  role  throughout  the  role  in  the  drug  development with ultimately a companion diagnostic being launched with the drug wherever is possible.  One  of  the  recent  examples  as  I've mentioned was  ALK  in  lung cancers, but  there was a  lot of excitement at ASCO and a  lot of new areas where biomarkers are being used for these purposes. 

 Slide 80    I'll take you to a study by the Phase 2 trial that was done and published early 

this  year  in  non‐small  cell  lung  cancer where  I was  a  part  of  it  being  at Genentech at the time. 

   Basically, what  it was  is  that  looking at  the MET overexpression, and  there 

was a lot of underlying evidence based on ‐‐  Slide 81    ‐‐  the  genetics,  the pre‐clinical work,  the  transgenic model,  and  also more 

importantly, that MET has been shown to be a really great prognostic factor in  lung  cancer  patients  where  the  patients  that  do  have  the  MET overexpression or amplification do worse than the patients that do not. 

 Slide 82    On the same  line, you could see that from a drug company standpoint, you 

could see that there are a lot of alterations in MET that are observed across the board. In multiple tumor types, it does make it an interesting proposition to start a drug development program in the area. 

   However,  one  of  the  challenges  at  the  time was  how  to  come  up with  a 

diagnostic and one of the best diagnostics for it.  

21

Slide 83    Something  unique  that was  done  in  this  study  is  that we  tried  to  look  at 

multiple  assays,  at  the  same  time  looking  for  the  same  alteration  via  IHC, FISH,  mRNA  expression,  HGF  and  plasma  levels  of  it.  The  aim  was  that ultimately, we can find the best ‐‐ ultimately, once we have all the data, we could find the best diagnostic that would select for the patients. 

   And what  they could see and understand  that  if  the pathway  is completely 

turned on,  truly  turned on, and  if you  look at  those alterations at multiple levels, it gives you much more confidence in what's happening to the patient. 

 Slide 84    Again,  just  the  diagnostic  strategy,  as  I  said,  we  went  with  multiple 

alterations, multiple tests, but the focus was  looking towards IHC where we went  through  the  process  ‐‐  and  I  won't  show  it  over  here  ‐‐  a  lengthy process of looking at IHC and coming up with the cutoffs and everything else. 

   Similarly  for  the FISH assay,  looking at  the copy number changes based on 

the  published  literature  from  Dr.  Garcia's  group  from  the  University  of Colorado and doing some  in‐house studies. We did see how we could best have the cutoffs for these patients.  

 Slide 85    What was quite  interesting  is that  in the Phase 2 study that we could see ‐‐ 

and this is the station stratification that was based on IHC, MET IHC, and the blue  line  is  the  patient  that  did  get  a  combination  of  erlotinib,  which  is against EGFR, again, a common change in lung cancer patients.  

   So patients that did receive both an anti‐MET therapy and erlotinib did much 

better compared to the patient that did not, and we did see the hazard ratios and the range of 0.5 for the PFS and around 0.37 for overall survival, which was quite exciting to see in a small group of 120‐odd patients. 

 Slide 86    We did also  look at other biomarkers  that we had  in  the exploratory assay 

and we  did  see  that  FISH  also  very  nicely  predicted  and  showed  that  the benefit  that  was  provided  to  the  patient  that  did  receive  the  anti‐MET therapy along with erlotinib did much better compared to the patients that did not. 

 

22

  However,  the hazard  ratios were not  as  good  and  the numbers, obviously because of the numbers of patients that were selected under each category, under  each  analyte were  different,  so  the  significance  of  it  also  changed according to that. 

   However, for the other markers based on the numbers or anything else, we 

just could not see that they really helped in the stratification of the patient.  [0:40:05]    In any, we do show that there was a select group that would get any benefit 

from those drugs. So in hindsight, it was kind of nice that we had a chance to go through all of this and understand what was happening and use the best appropriate test moving forward in the Phase 3 trial to see what happens to the patient. 

 Slide 87    In this case obviously,  it was potent and selected toward that  IHC and FISH 

were  independent predictors. As I mentioned, we went ahead with IHC  into the Phase 3 to do that. 

 Slide 89    Going  into  the  second  part where  I was  talking more  about  the  resistant 

biomarkers ‐‐ and this was a recent study that we finished towards the end of last  year  and  published  towards  the  end  of  last  year  ‐‐  is  that  in  a  lot  of targeted  therapies now, we're  seeing  a  lot of  resistance on  these patients coming in. 

   It would be nice to  look and understand these alterations or these resistant 

biomarkers or mechanisms upfront so that we could help the patients at the time when  these  patients  stop  responding  to  the  drug,  or  if  possible,  the mechanism  or  the  biological means  to  look  at  them  even  upfront  to  see whether there are population of cells that do have them. 

 Slide 88    Some  of  the  good  examples  for  resistant  biomarkers  have  been  studied, 

which has shown that the mutations in the abl‐kinase domain of imatinib or more classically, the T790M in anti‐EGFR therapy. 

 Slide 90  

23

  So based on that, we went ahead and tried to see what we could do for the PI3K starter where a lot of trials currently are being done and to understand whether there are many mechanisms that we could look for. 

   So we took cell lines that were HER2 positive and had the mutation of PIK3CA 

and  that were  anti‐PI3K  inhibitors. We  developed  resistance  in  these  cell lines to these inhibitors and went on to study what the alterations would be. This is where using the new technology from Affymetrix came in quite handy and this technology of looking at copy number changes is based on molecular inversion probes. I've  listed the website there that you can get more details about the technology and how it works. 

 Slide 91    But what was  interesting  to us  is  that when we  looked at  the plot,  to our 

surprise, we saw that PIK3CA  itself was highly amplified, which was not the case in the original parental tumor line. 

   To further confirm and it's something similar to what Paul mentioned is that 

initially since we were surprised, we just wanted to make sure that we were reading it correctly, and what we could see quite nicely is that in the parental line, even though there were six copies of the low copy number gains, there was nothing as amplified as you can see on the right hand side where one of the mutant cell lines, KPL‐4PR.5 where there are multiple copies on the range of at least 30 to 50 copies of PIK3CA, which are presented as red bars on the chromosomes where the arrows are. 

   So this was something really new especially  in the PI3K pathway that hadn't 

been shown before. The amplification of the mutant gene  itself did make a difference. 

 Slide 92    However, to confirm whether it really meant anything biologically, we did go 

ahead and  then used  siRNAs  to knock down  the expression of  the PI3 100 alpha unit and try to see whether we could bring back the sensitivity of these cell lines, these resistant cell lines to the drug to what it was for the parental cell lines. 

   In the graph over here, you could see the red and blue  lines and you could 

see  that  the  amplified  resistant  lines,  once  they were  knocked  down,  the expression  of PIK3CA was  knocked down,  you  could  see  that  the  levels of inhibition were almost the same as they were in the parental lines. 

 

24

  It's  quite  exciting  that  we  could  use  the  technologies  to  find  novel mechanisms  of  that  resistance  especially  in  PIK3CA  and  try  to  take  it  into patient samples more and try to see whether these would be the means of looking into alterations. 

 Slide 93    Basically, what I wanted to take forward from what Paul said is that the one 

part in the lab is to look for these signatures and biomarkers that would be a good use to stratify these patients, and I believe there are new technologies to provide us a lot of means in doing that and ultimately being used in where it ultimately matters  the most  in  the patients where we  could  stratify  the patients  and  see  how  best  can  they  be  clinically  managed  in  terms  of prognosis and prediction and drug  response  to  the drugs  that are given  to them. 

 Slide 94    Ultimately, where  it would be helpful  is  that  ‐‐  this cartoon  is  just  to  show 

that  there's  a  lot  of  heterogeneity  that  happens  in  terms  of  sensitivity  to drugs or similar drugs, and the biomarkers would be something that  I hope going  forward  is going  to be able and we are  seeing  that  it  is doing  it, but kind of take it forward and see how we can segregate these different groups and where we can know which drug is going to be effective, where to go for active  therapy  or  aggressive  therapy,  where  do  we  wait  and  watch,  and which drugs would be best suited for the patient with the least toxic effects. 

 [0:45:18]  Slide 95    So  with  that,  I  end  it  and  acknowledge  again  a  lot  of  people  who  were 

involved  in  these groups being  in  the Phase 2  trial. A  lot of  this work was done  when  I  was  at  Genentech,  but  definitely  foremost,  thanks  to  the patients and  the  families of  the patients  that do provide  the  tumor  for  the studies  and  go  through  the process where we  can make  these discoveries and  try  to understand how best  to  then ultimately provide  them  the best clinical management we can. Thank you. 

 Sean Sanders:  Fantastic! Thank you so much, Dr. Pandita. Thank you also to Dr. Boutros for 

the very engaging presentation. We're going to move quickly along to some questions a bit of our online viewers. 

 Slide 96 

25

   Now, we  just have a  few minutes  left on  the webinar, but we might  run a 

couple  of minutes  over  time  so we  can  squeeze  in  some  questions,  and  I hope our audience will stay with us.  

   A  reminder,  too,  if  you're watching  us  live  that  you  can  still  submit  your 

questions by typing them into the text box and clicking the submit button. If you don't see that box, just click the red Q&A icon and it should appear. 

   Dr.  Boutros,  I'm  going  to  give  you  the  first  question,  and  that  is,  is  it 

important  to complement  seeing  the analysis  studies with gene expression analysis and why might that be? 

 Dr. Paul Boutros:  That's a great question. I think it's absolutely valuable to do so. By doing that 

complementation,  you're  able  to  really  identify  potential  pathways  or mechanisms  of  the  copy  number  aberrations  that  you  see.  You  can  also identify  the dysregulation of  a  gene  that's not  always present  at  the  copy number level. 

   For example, SPF1 we showed  is also changed at the methylation  level, but 

has the same kind of consequence, so I think it's absolutely very valuable to do so. 

 Sean Sanders:  Great! Dr. Pandita, anything to add to that?  Dr. Ajay Pandita:  I  would  just  like  to  further  really  quick  what  Paul  just  mentioned  that 

definitely yes, that's what I had just shown in the Phase 2 study that we did. In fact, we did look at multiple levels of alterations that can be detected for a gene or a pathway as  it gives a better  sense of when  is  the pathway  truly being turned on or off and getting us a better handle of where do the patient benefit most by a given drug and understanding how to move forward. 

 Sean Sanders:  Great!  And  coming  back  to  you,  Dr.  Boutros,  in  your  studies,  how much 

genomic DNA was extracted  from  your biopsies? The  viewer  is  also  asking what platform for array CGH you're using. 

 Dr. Paul Boutros:  Good  question.  The majority  if  our  biopsy  specimens, we were  extracting 

anywhere  between  about  10  nanograms  and  200  nanograms,  and  the majority of our arrays were done with 14 nanograms of material. Some were actually done with smaller amounts of material and I think the smallest that we used was something  like 10 or 15 nanograms of  input. Of course, as  I'm sure most people know, how you quantitate input DNA is tricky and we were using  a  cubit  for quantitation,  so  that might put  into perspective  just how small those amounts are. 

26

   For  the platform, we standardized this  independent of whether  the sample 

was FFPE or large volume or small volume. And so, we used OncoScan arrays for everything that we did and some of the data that I showed you was the version two of the OncoScan and some was version three.  

 Sean Sanders:  Great! Let me stay with you, Dr. Boutros, for the next question. This viewer 

asks whether  the variation of mutation  frequency  that you seek could be a function of the percentage of tumor being analyzed. 

 Dr. Paul Boutros:  Yeah. We thought about that a  long time, so a couple of things. One  is that 

we were microdissecting  these  regions  so  they  are  inherently much  pure than most you would see. And in addition, by estimation by pathologists, we would  get  tumor  nuclei  percentages  around  80%  to  85%,  but  we independently  validated  that  computationally  using  both  the  sequencing data and using the array data.  

   In each case, they confirm that  it's about 80% to 90% tumor cellular, so we 

actually  don't  think we  had  a  contamination  issue  at  all.  That  being  said, some of  the differences are  just so  large  that  it's almost  impossible. We've got amplifications of several hundredfold in one region and it's not present at all  in another,  so we  should've been  robust  to  see  that even  if  there were fairly acellular tumors, I think, so I don't think that's a major concern for the study. 

 Sean Sanders:  Dr.  Pandita,  let me  come  to  you.  Have  you  seen  if  copy  number  change 

detected  in FFPE samples can be reproduced  from  fresh  frozen  tissue  from the same biopsy? 

 [0:50:04]  Dr. Ajay Pandita:  That's a good question. I think we get a lot of those comments from time to 

time as whether  it can be done on  fresh  frozen. The point  I would make  is that  it  can  be  done,  but  how  reproducible  it  is  sometimes  becomes  very tough. One  of  the major  problems we  have  is  that  one  tends  to  lose  the architecture of the tissue at the same time.  

   So  to kind of  see  the nucleic quite compact and  the way we  see  it  in FFPE 

tissues, sometimes  it becomes very tough to diagnose. For that reason, the preference  is  generally  given  towards  FFPE  tissues,  but  as  I've  said,  even though  not  reproducible,  we  have  managed  to  get  it  working  on  frozen tissues. 

 Sean Sanders:  All right. Dr. Boutros, anything to add to that? 

27

 Dr. Paul Boutros:  No, I completely agree with that. There are some clear advantages for frozen 

for some things and FFPE for others.  Sean Sanders:  Here's another question  in the same vein whether CNVs can be detected  in 

circulating tumor cells. Have you looked at that, Dr. Boutros?  Dr. Paul Boutros:  Yeah. We're trying that exact assay right now. Unfortunately or fortunately, 

we work largely in localize prostate cancer and these patients don't generally have  a  large  number  of  CTCs.  We  have  been  successful  doing  it  from circulating DNA, so not from the cells themselves, but from DNA that's found in the plasma. 

   We  published  on  that  a  couple  of  years  ago  and we  actually  found  some 

interesting profiles of  it, so at  least  it's  technically possible, but whether or not it's clinically useful for these patients, that I'm not sure. 

 Sean Sanders:  All right. Dr. Pandita, have you got any experiences with CTCs?  Dr. Ajay Pandita:  Yes. We  have  from  the  point  of  view  of  FISH  for  detecting  copy  number 

changes, I think it's very well‐established in HER2 cancer and even in prostate cancer. There have been studies to show it and we've also done it. 

   However,  the  challenging  part  for  CTCs  only  come  through  the  platform 

we're  using  to  enrich  the  cells  where  how  eminent  they  are  for  the downstream  analysis,  if  they  can  be  easily  harvested  and  put  on  a  slide where  they're preserved and you could still maintain  that you're  looking at the CTCs and not the confounding other cell types in there, then definitely it can be useful. It has its challenges, but it can. 

 Sean Sanders:  Excellent! Dr. Boutros, back  to  you,  can  you explain how  you differentiate 

focal amplification and regular copy number gain based on your microarray data? 

 Dr. Paul Boutros:  Yes, so this  is something that I confess that we hadn't really expected to be 

able to do, but the array platform that we use actually does it really robustly. Basically,  it  all  comes down  to  the  reproducibility probe  to probe  and  the spacing  of  probes  and  the  arrays  that  we're  using  of  several  hundred thousand  probes.  That  means  that  you  already  would  have  reasonable confidence, but very  importantly,  I guess they designed  it so that there are more probes around oncogenes and around key genic regions. 

   As an example, if you compare the classic SNP‐6 or other genotyping arrays, 

their probe density  in the region that we  found that really  interesting  focal 

28

amplification on was actually not particularly high and you would've missed it. Actually, other studies have missed it.  

   By contrast, having a bit higher probe density, that really helps and you can 

pick  these  things  out  quite  quickly  just  because  the  signal  is  robust  and you've got a good probe density, so yeah, it turns out to be bioinformatically very straightforward. 

 Sean Sanders:  All right. Dr. Pandita, I'm going to come to you with maybe a similar question. 

You said that whole genome technologies provide contextual information, in other  words,  the  ability  to  distinguish  focal  from  broader  events.  For example,  focal  MET  amplification  versus  the  amplification  of  the  entire chromosome. Is this information informative especially for the clinic? 

 Dr. Ajay Pandita:  I  think  there were  studies  that have been  shown  in  terms of  ‐‐  I  think  it's 

more shown in the deletions rather than in the gains or amplifications where how the  large the deletion  is does have an  impact on how well the patient does or not. However, on the other part, if we're looking at it being used as a predictive marker,  in  terms of your drug,  it  could  start  it against a  specific gene. 

   In that case, what really matters is whether that gene is being overexpressed 

or altered and not so much what's happening on the rest of the part of the genome. However,  that may either  as  a passenger or even biologically  co‐amplify other genes that may make an effect there, but  in general,  if you're looking  at  targeted  directly,  then  you're  pretty much  looking  at what  the target  is and  looking at whether  that's being overexpressed or amplified or altered. 

 Sean Sanders:  Dr. Boutros,  I'm going  to come  to you with one  final question. What  is  the 

degree of CNV that you observe  in non‐tumor cells  in the patients that you look at? 

 [0:55:05]  Dr. Paul Boutros:  That's a very good question. We did not do direct profiling of tumor‐adjacent 

normals.  I know  that  there are  several groups  that have done  that  type of study and  I believe those manuscripts are now  in submission, so  I think the community will find out shortly. I'm very curious about what that would look like as well.  

   What we used as normal controls was blood, and in the blood, of course we 

see very few CNVs concordant with the germline analyses from Steve Share's 

29

group and other groups, but in tumor‐adjacent normal tissue, that's an open question in prostate cancer that's going to be very fascinating. 

 Sean Sanders:  Great! Well, we are unfortunately out of  time  for our webinar  today.  I  just 

want  to  say  a big  "thank  you"  to our  speakers, Dr. Paul Boutros  from  the Ontario  Institute  for  Cancer  Research  and  Dr.  Ajay  Pandita  from  Core Diagnostics for being on the line with us today and for their very interesting talks and discussion. 

   Many thanks to our online audience for the questions you submitted to the 

panel. Sorry that we didn't have time to get through all of them. Please go to the URL now at the bottom of your slide view to learn more about resources related  to  today's discussion and  look out  for more webinars  from Science available at webinar.sciencemag.org. 

 Slide 97    This particular webinar will be made available to you again as an on‐demand 

presentation within about 48 hours from now. We'd also  love to hear what you thought of the webinar. Send us an email at the address now up in your slide viewer, webinar@aaas.org. 

   Again,  thank  you  very much  to  our  panel  and  to Affymetrix  for  their  kind 

sponsorship of today's educational seminar. Goodbye.  [0:56:43]  End of Audio