1  

CNVs vs. SNPs: Understanding Human Structural Variation in Disease 

[0:00:00] Sean Sanders:  Hello and welcome to today’s Science/AAAS live webinar entitled, “CNVs 

and  SNPs:  Understanding  Human  Structural  Variation  in  Disease”. My name is Sean Sanders and I’m the commercial editor at Science Magazine. 

 Slide 1   Exhaustive analysis of human  single nucleotide polymorphisms or  SNPs 

has  led  to  the  identification  of  interesting  genetic markers  for  certain disorders.  But  these  small  changes  are  not  the  whole  picture.  Copy number  variations  or  CNVs, which  are  the  gain  or  loss  of  segments  of genomic  DNA  relative  to  a  reference,  have  also  been  shown  to  be associated  with  several  complex  and  common  disorders.  Using  array‐based  comparative  genomic hybridization  techniques, CNVs  at multiple loci can be assessed simultaneously allowing  for  their  identification and characterization. CNV microarrays  allow  exploration  of  the  genome  for sources of variability beyond SNPs that could explain the strong genetic component of  several of  these disorders. Now,  advances  in microarray probe  density  have  provided more  comprehensive  coverage  of  CNVs, enabling more in‐depth genotyping research. 

   Joining me in the studio today is an exceptional panel of thought leaders 

to discuss  this  subject. To my  left,  I have Dr. Charles  Lee  from Harvard Medical  School  in Boston, Massachusetts. Next  to him  is Dr.  Lars  Feuk from Hospital for Sick Children  in Toronto, Canada. And finally, we have Dr. Alex Blakemore joining us all the way from Imperial College London in the U.K. Welcome to you all. 

   Before  we  begin,  a  quick  reminder,  as  usual,  that  if  during  the 

presentations, you wish  to see an enlarged version of any of  the slides, you can simply click the enlarge slides button located just underneath the slide window of your web console.  If you  like, you can download a PDF copy of all the slides using the download slides button. 

   To submit a question to the panel or to a particular speaker,  just type  it 

into  the  ask‐a‐question box  in  the bottom  left of  your  viewing  console below the video screen and then click submit. I’ll do my best to get to as many of the questions as possible. As always, keeping them short and to the point will give you the best chance of having them asked. 

 

2  

  Finally,  I’d  like  to  thank  Agilent  Technologies  for  their  sponsorship  of today’s webinar. 

Slide 2   Now on to our first speaker, Dr. Charles Lee received his doctoral degree 

from  the  University  of  Alberta,  Canada  and  completed  his  Clinical Cytogenetics  fellowship  at Harvard Medical  School. Dr.  Lee  is  currently the  director  of  Cytogenetics  for  the  Harvard  Cancer  Center,  Associate Professor  in  Pathology  at  Harvard  Medical  School,  and  an  Associate Member of the Massachusetts Institute of Technology Broad Institute. In 2008,  Dr.  Lee  became  the  youngest  recipient  of  the  Ho‐Am  Prize  in Medicine also referred to as the "Korean Nobel Prize" for his pioneering work in this field. 

   Welcome, Dr. Lee.  Dr. Charles Lee:  Thank you, Sean. Slide 3   So, in 2007, Science Magazine announced its breakthrough of the year as 

human  genetic  variation.  Part  of  the  reason  for  this was  the  fact  that there  were  a  lot  of  associations  being  made  between  these  single nucleotide polymorphisms or SNPs with human diseases. 

Slide 4   Currently,  it’s actually estimated that with respect to SNPs, there are 15 

million sites in the human genome where these SNPs can occur. As of the end  of  2007,  approximately  3.8  million  SNPs  were  catalogued  the HapMap  populations  of  about  270  individuals  from  four  different populations  in  the world.  And  it’s  currently  thought  that  each  person harbors  anywhere  from  3  or  as many  as  5 million  common  SNPs with about 30 new SNPs arising per generation. 

Slide 5   But I think in addition to SNPs, part of the reason why it was announced 

that human genetic variation was the breakthrough of the year was the fact that the scientific community was appreciating that there was a  lot more  genetic  variation  out  there  than we  had  once  appreciated.  And more specifically, a new form of genetic variation, which we now refer to as  structural  genomic  variation, where  you  have  inversions,  insertions, deletions, copy number variation occurring. All these types of variations in addition to SNPs were being uncovered. 

Slide 6   I  believe  that  appreciation  for  the  existence  of  widespread  structural 

genomic variation in the human genome stemmed from these two initial studies  in  2004.  Both  studies  essentially  used  array‐based  comparative hybridization technologies to look at the genomes of healthy individuals. 

Slide 7 

3  

  And shown here  is an example of a profile by array CHG. Where,  if you would expect that humans had essentially SNPs primarily as their genetic variation, when you do array‐based comparative genomic hybridization, you’d see a profile as is shown here. 

Slide 8   However, both groups that did this study found that when they looked at 

the  genomes  of  healthy  individuals,  they  actually  found  profiles  that looked like this. Where the green gains and the red losses were found on every chromosome, a multiple of  these  throughout  the whole genome. And  so basically  showing  that  this was  a new  type of  genetic  variation that really was widespread throughout the human genome. 

 [0:05:22] Slide 9   When we refer to structural genomic variation, some people can  look at 

this, referred to widely as any variants that are essentially non‐SNPs. But among those structural variants that we are currently aware of and have learned about,  to date, copy number variants or CNVs probably are  the largest fraction of this class of variants. 

Slide 10   Summarizing  what  we  know  so  far  about  copy  number  variants, 

estimates  range  from  5%  to  25%  of  the  human  reference  genome  is thought  to  be  copy number  variant.  In  a  study  in  2006,  looking  at  the same  270  HapMap  individuals where  SNPs  data was  collected,  it was revealed that at least 1447 CNVs could be catalogued, representing about 360 million bases of reference DNA sequence or 12% of the genome. 

   Now based on unpublished data,  it’s estimated  that each person  could 

have  approximately  1500  common  CNVs  in  their  genomes.  And  if we believe  that  the  average  size  of  these  common  CNVs  are  about  20 kilobase,  that  equates  to  about  30  million  bases  of  CNVs  that differentiate one person from another. 

   And because the research in this area is still ongoing and this field is still 

fairly new, we really don’t have any data on what the mutation rate is for specific CNVs. Therefore, it’s hard to estimate what is the number of new CNVs that arise per individual per generation. 

Slide 11   Now, with  respect  to  the  genomic  impact of CNVs,  some of  the  things 

that we  do  know  is  that,  CNVs  do  appear  to  be  preferentially  located outside of genes and outside of ultra‐conserved elements  in the human genome.  And  those  CNVs  that  do  overlap  genes  when  we  do  gene ontology  analysis,  they  do  seem  to  show  an  enrichment  for what we would now refer to as environmental interaction genes. These are genes 

4  

such  as  genes  involved  in  sensory  perception,  neurophysiological processes,  drug  detoxification,  immune  response,  and  cell  surface antigens, and integrity genes. 

Slide 12   And  this  slide basically  shows  just how  some of  these CNVs  can  affect 

gene  expression  levels,  especially when  the  CNVs  lie within  or  involve genes  in the human genome. But  it’s  important to understand also that CNVs, as  I mentioned earlier, can also be found outside of genes. And  if they overlap  regulatory elements,  they can also affect expression  levels of genes  that  they’re associated with. And  in  fact,  some  recent  studies have  shown  that a CNV  that  is outside of a gene  can affect  the gene’s expression level that’s 2 million bases away or more. 

Slide 13‐Slide 15   In forming these copy number variants, we know that there are at  least 

two major mechanisms  that  can  form CNVs. One  is  shown  here  called non  allelic  homologous  recombination  or  NAHR  where  essentially homologous DNA segments that are on the same chromosomes misalign. And then you have a crossover event occurring, which essentially results in  duplications  or  deletions  of  DNA  segments  that  are  between  those homologous segments. 

Slide 16‐Slide 18   A  second  mechanism  for  producing  CNVs  is  referred  to  as  non 

homologous end  joining or NHEJ, which  is a repair mechanism whereby when  you  have  double‐strand  breaks  occurring  in  the  chromosomes during  the  repair mechanism  ‐‐  the mechanism  to  repair  these double‐strand breaks.  If  the  repair doesn’t occur  correctly,  you  can  essentially get DNA gains and losses near those breakpoints. 

   And more recently, there has actually been ‐‐  it’s been put forward that 

DNA  replication based methods could also  lead  to copy number variant formation such as  the  fastest method  that was  recently put  forward by Jim Lupski’s group at Baylor College of Medicine. 

Slide 19   It’s amazing to see that in the last four years, there’s already been about 

a dozen associations made between  specific  copy number  variants and human diseases. One, which  I’ll show here,  is  the β‐defensin genes and it’s susceptibility to both Crohn’s disease and psoriasis. 

[0:10:03]   So,  β‐defensin genes are  small  secreted peptides  that are coded  for by 

the by  the DEFB genes. The β‐defensin genes are copy number variable with  copy  numbers  ranging  from  2  to  12  per  cell  among  Europeans studied with a modal number of 4, not 2. 

Slide 20 

5  

  So,  individuals  that have  less  than 4 copies of  β‐defensins,  they end up having  a  breakdown  of  the  anti‐bacterial  barrier  in  the  intestinal wall leading  to  the  inflammation  that’s  associated  with  Crohn’s.  So,  lower copy  number  of  β‐defensin  leads  to  increased  susceptibility  to  Crohn’s disease. 

Slide 21   So, you would think that having more copies of this would be a beneficial 

thing. But, in fact, when you have more copies of β‐defensin, greater than 4  copies,  it  actually  elicits  an  inflammatory  response  when  you  have minor  skin  injury  that  increases  cytokine,  EGF‐R  and  STAT  signaling pathways leading to inflammation. So, basically, too little of β‐defensin is not  a  good  thing  and  too much  of  β‐defensin  is  also  not  necessarily  a good thing as well. 

Slide 22   And we’re  also  finding  that  copy number  variants  research  is  giving us 

insights  into  how  our  genomes  are  changing  with  respect  to  human behavior and our ever‐changing environment. One study shown here was where  we  looked  at  the  copy  number  of  amylase,  AMY1,  and  AMY1 produces the amylase enzyme that is used for starch digestion. And when we  looked over 200  individuals, we  found  that  in  fact,  those  individuals that are  from populations of traditionally high‐starch diets tend to have more AMY1 copies than those from low starch diets. 

Slide 23   And when  look even more  closely at  the AMY1 CNV  locus, using  fiber‐

FISH techniques, you can actually appreciate the fact that in the left‐hand panel, a  Japanese  individual with 14 diploid copies of AMY1, 10 on one copy and 4 on the other. And on the right‐hand side, a Biaka pygmy with 6 diploid copies, 3 of the AMY1 gene copies on each chromosome. But in addition to this copy number variability of AMY1, you can appreciate that there  is this structural variation on top of structural variation at this  loci because  you  have  inversions  of  some  of  these  of  AMY1  genes  with respect to one another. 

Slide 24   So,  in  order  to  detect  CNVs  in  a  genome‐wide  manner,  there  are  a 

number  of  platforms  and  several  companies  that  are  providing  array‐based methodologies to pick up CNVs. Some of them are shown here on this slide. 

Slide 25   But we’re also beginning  to  realize how  fast  the cost of whole genome 

sequencing  is  decreasing.  In  fact,  the  1st  human  genome  reference sequenced ‐‐ when we obtained the 1st of the human genome reference sequence, that cost us about $500M. But currently, using next generation sequencing  methods,  we’re  estimating  that  it’s  about  $100,000  to $150,000 to sequence the whole genome. 

6  

Slide 26   And as a result of that, what we’re finding is that due to this low cost of 

DNA  sequencing,  this has prompted  the  launch of  international efforts, such as 1000 Genome Project. Where they’re essentially starting January of  this year,  for a  three‐year period, we are whole genome  sequencing 1000  individuals to  identify both SNPs and copy number variants as well as  other  structural  variation  to  understand  the  total  extent  of  genetic variation in the human genome. 

Slide 27   And so, I guess, in conclusion, this understanding of structural variation is 

really  having  broad  implications  to many  areas  of  biomedical  research including  cancer  research,  clinical  genetic  testing,  disease  association studies,  pharmacogenomic‐based  studies,  and  also  human  population genetics and evolution. 

Slide 28   I guess, our take‐home message based on the last four years of research 

is that our previous notion that two normal individuals share about 99.9% genetic similarity really has to be reevaluated. 

 Slide 29   And based on what we know on structural variants now, this number  is 

probably more  in  the  order  of  99.5%  genetic  similarity  between  two normal individuals. 

Slide 30 Slide 31   So,  I  would  just  like  to  thank  the  Structural  Genomic  Variation 

Consortium  for  some of  the unpublished data  that  I’m presenting here today, as well as others  that have helped with  this research. Thank you very much. 

 [0:15:04] Sean Sanders:  Great. Thanks very much, Dr. Lee. Excellent introduction to this subject. Slide 32   We’re going to move right on to our second speaker today and that’s Dr. 

Lars  Feuk. Dr.  Feuk  completed  his  Ph.D.  in  functional  genomics  at  the Center  for  Genomics  and  Bioinformatics  at  the  Karolinska  Institute  in Stockholm,  Sweden.  His  postdoctoral  training  was  carried  out  in  Dr. Stephen  Scherer’s  lab  in  at  the  Hospital  for  Sick  Children  in  Toronto, Canada. And the current focus of Dr. Feuk’s work is understanding the full spectrum  of  human  genetic  variation,  particularly  as  it  relates  to  copy number variation. Since 2004, Dr Feuk has also been  the curator of  the Database  of  Genomic  Variants,  the  most  widely  used  database  for information  on  structural  genetic  variation.  Last  year,  Dr.  Feuk  was featured  in Genome Technology magazine as one of  “Tomorrow’s PIs”, 

7  

and in 2008 was selected as one of twenty “Future Research Leaders” by the Swedish Foundation for Strategic Research. 

   Dr. Feuk, welcome.  Dr. Lars Feuk:  Thank you very much. It’s great to be here. Slide 33   I’d  like  to  give  an  overview  of  the  current  state  of  the  field  of  copy 

number  variation.  And  talk  about  some  of  the  challenges  that  we’re facing in describing this type of variation in the human genome. 

Slide 34   So,  I’m going to start by a historical overview slide. So,  if we  look at the 

type  of  variation  that  has  been  discovered  in  the  human  genome, we really started with the big thing. So, to the left on this spectrum, we see the things that we detect cytogenetically; chromosomal rearrangements, large deletions and duplications that are maybe over 5 megabases or so in size. 

   After detecting this  initial variation, we actually moved straight down to 

the  nucleotide  level.  ‘Cause  sequencing  was  discovered,  PCR  was discovered and we started looking at a very, very detailed level and could describe point mutations and so on. But in doing this, there was a whole midrange of variation where we simply didn’t  look. And  it was not until the technology of micro‐arrays and CGH arrays were developed that we could  start  assessing  a  variation  in  the  size  range of 1 Kb up  to 3  to 5 megabases. 

Slide 35   So, as Charles Lee mentioned,  it was not until 2004 that the first studies 

were published where we could describe  that  these  types of variations, copy number variants, are a common feature in the human genome. So, it’s  a  very,  very  young  field  compared  even  to  the  SNP  field.  And  it’s important to keep that in mind when we go towards disease that this is a young field where we still have a lot of challenges to face. 

Slide 36   So,  looking at the  increasing copy number variation data since the  initial 

papers  came  out  in  2004,  at  that  stage,  there were  only  a  handful  of regions known  in the human genome to be copy number variable. Since then,  there’s  been  an  explosion  of  data  and  studies  published. And  to date,  in the Database of Genomic Variants, which  is the major database describing  this  type  of  variation,  we  have  approximately  17,000  copy number variants described. 

   So,  if you’re  interested  in  this  type of variation,  I  recommend you  take 

look at the website of the Database of Genomic Variants. You see the URL 

8  

down  to  the  left  here.  This  is  a  catalogue  of  all  the  published  studies describing  copy  number  variation  in  the  human  genome.  And we  are currently  describing  variants  that  are  a  hundred  base  pairs  in  size  and larger. And at present,  there are approximately 29,000 entries and  this also includes inversions. 

   Inversions  are  less  common  than  copy  number  variants  in  the  human 

genome. To date, there have only been around 500 inversions described to be polymorphic, but copy number variants are very common. 

   So,  if  you  look  at  the  right  side  of  this  slide,  just  an  overview  of  the 

human  chromosomes  and  all  the  copy  number  variants  described  to date. So, each blue bar that you see here  is a copy number variant. And as you  see  from  this  slide,  the copy number variants are distributed all across the genome with a slight bias towards centromeric and telomeric sequences. 

   On  the  left  side of  the  chromosomes, you  see green bars. These green 

bars represent what we call segmental duplications. These are regions in the genome that are present  in more than one copy. And there’s a very strong  correlation  between  copy  number  variation  and  segmental duplications. And that’s important to keep in mind too when you look at this type of variation. 

Slide 37   So, what are the major challenges as I see it? With the current maps we 

have, they’re still very, very crude because the technology  is still  limited on  what  we  can  do.  So,  we  still  have  very  little  information  about variation  in  the  100  bp  to  20  kb  range  because  the  resolution  of  the current high‐resolution technology is still not enough to accurately detect this level of variation. 

   Another thing  is that microarray data tends to be slightly noisy meaning 

that sometimes the probe would be included in the copy number variant and sometimes it would not when you score it. Therefore, the boundary information for the current variants that are described in databases is not very accurate. 

[0:19:54]   So,  to  the  right on  this  slide,  I  show  an  example of  a  variant  that was 

found by a BAC array. And you see that even though it’s the same variant in  all of  these  individuals,  the  algorithms  and  the  approaches used  are calling  very different  boundaries with  different  start  and  endpoints  for these variants. So, it’s important to keep in mind when you see a variant, it’s an approximation of where a variant exists in the genome and not the exact start and endpoint of the variant you’re looking at. 

9  

   Another  problem  currently,  so  another  challenge  that we  have  is  that 

frequency  estimates  are  currently  insufficient.  There  are  a  lot  of  false‐negatives  in  the  current  studies.  So,  things  that  are  there  but  are  not called, and at the same time, the data is slightly noisy and we have some false‐positives also. 

   So,  these  are  challenges  that  we  need  to  deal  with  moving  ahead. 

Currently,  we  cannot  really  score  CNV  genotypes  commonly  for duplications,  for example. We  just say  that  there’s a CNV gained at  this locus, but we cannot properly differentiate whether it’s three copies, four copies, five copies, or six copies due to the noise in the data. 

   Another  part  of  the  genome  that  we’re  not  very  good  at  describing 

currently  is the really complex regions. And by complex regions,  I mean regions that are highly duplicated in the genome. Most of the commercial arrays do not have  good  coverage  in  these  regions  and  if  they do,  the data is very complex to interpret such that the analysis tools that are out there will  basically  fall  apart  in  this  region.  So,  I  think,  this  is  an  area where we need to do a lot more work also. 

   Another challenge, again, many different technologies that are out there 

give  different  results.  If  you would  describe  the  same  DNA  using  two different  high  resolution  platforms,  generally  today  you  may  get something between 50% and 70% overlap of the CNVs that you’re calling. So, it’s important to keep in mind if you’re trying to compare the data in your lab to the neighboring lab’s data that had used a different platform, that  you  can’t  do  a  one‐to‐one  comparison  there  because  they’re describing very, very different things. 

   Finally, with the little picture down to the right here, I just want to show a 

problem with  interpreting  the data on what  is actually one CNV. So,  in the database,  for example, we have a  lot of  situations where  from one platform,  we  would  call  two  different  CNVs  40  kb  in  size  with  some distance  between  them.  You  then  use  a  different  SNP  platform  with maybe a different probe coverage  in the region and you call this as one contiguous  120  kb  variant.  Then  the question  is what  actually  the  two underlying  variations  in  this  region.  And  currently  without  using  high resolution methods, it’s very difficult to answer that question. 

Slide 38   However, it is important to point out that the resolution is getting better 

and better. So,  initially, we used BAC array, CGH to describe these types of variants and the variants described were just the start and endpoint of 

10  

a BAC clone. And BAC clones are very large, they’re 150 to 250 kb in size meaning that we often overestimated the size of the actual variant. 

   So, showing this example here from the database, you see the top orange 

bar representing a  finding with a BAC array  indicating a very, very  large region. But  then, subsequent studies using higher and higher resolution methods ending down at the bottom with the Levy et al., variant, which is actually  a  sequencing  based  approach,  you  see  how  the  resolution  is increasing until we actually get nucleotide resolution data when we can use a sequencing approach to describe the variant. 

Slide 39   So, this  just an overview sort of historically how the field has advanced. 

Initially, as I said  in the initial papers  in 2004, the collaboration between Charles Lee’s  lab and our  lab, we used a BAC array that contained 3000 BAC clones. With this, we found between 1 and 12 CNVs per genome. 

   The  field  then  evolved  to  use  tiling  path  BAC  arrays  that  have 

approximately 30,000 clones on an array, and you could describe maybe between  10  and  70  CNVs  per  genome. And  the  ranges  here  are  quite large  because  depending  on  what  analysis  tool  you  use  and  what thresholds you use with  those analysis  tools, you will get very different results. 

   With  the  500K  SNP  array,  you might  get  something between  2  and  25 

CNVs per genome. And with the currently highest resolutions SNP arrays, the Illumina 1M and Affymetrix 6.0, you can get something in the order of 30  to  150 CNVs per  genome depending  again on how  you  analyze  the data. 

   Again,  it’s  also  important  to  keep  in  mind  that  results  will  differ 

depending  on  input  quality  of  the  DNA.  So,  if  you  have  noisier  data, you’re  forced  to  set  stricter  thresholds  or  stricter  parameters  in  your analysis. And  then you may  call  fewer CNVs and  it makes  it difficult  to compare between studies. 

   There are also many different analysis  tools  for  the  same platform. For 

example,  if  you’re  on  Affy  6,  there  are  probably  four  or  five  different analysis tools you can use, and each of those again give different results. So, it’s important to keep these things in mind. 

Slide 40   So, what are we doing in our lab? So, in a collaboration with Charles Lee 

and the Sanger  Institute, we are trying to create a really high resolution map  of  copy  number  variation  in  the  human  genome.  And  to  do  this, we’ve  created  a  custom  set of  a NimbleGen  arrays.  This  is  a  set of  20 

11  

arrays with 2.1 million probes on each totaling 42 million probes across the genome. 

Slide 41 [0:25:14]   So  just as a comparison here,  I show a screen grab where we have  the 

density of probes and our NimbleGen Array compared to the Affy, 500K, and the  Illumina 650Y, and you see that there’s a significant  increase  in the resolution. So, we’re hoping with that that we’ll be able to capture all common  variants over 1  kb  in  size  and with high enough  resolution of breakpoints that it could be followed up with a PCR based assay. 

   Here are some of the examples of the data from this array. Things in the 

order of 30 kb, we reliably pick them up as does the Affymetrix 6.0 array. But we can reliably  find  things as small as 1 kb without a problem. You see on the bottom right, that there are  lots of probes detecting this 1.3 kb  variant. And  there’s  not  a  single  probe  on  the Affy  6  array  actually representing this variant. 

   So,  we’re  hoping  with  the  results  of  this  study,  we’ll  have  a  high 

resolution map of all the common variants in the human genome. Slide 42   There are some challenges when taking this data out to disease studies. 

As I mentioned, the data is a little bit noisy so when you compare patient and  control  groups,  it’s  important  to  keep  in mind  that  there may  be plate defects and batch effects. What I mean by that is if you have all of your  controls on one plate  and  all  your patients on  another plate,  you may get batch effects or plate defects that give false differences between these groups. So,  I would recommend you should mix your controls and cases on the same plates to avoid those types of effects. 

   It’s difficult, as I mentioned, to get accurate genotype data for CNVs. This 

is  needed  for  some  of  the  population  genetics  and  association  type analysis that you want to do. 

   And to identify true de novo calls is also difficult. So, currently, if you look 

at trios with the data that’s out there, you get a de novo rate. So, that is, variants that are found  in the offspring, but not in the parents of maybe around 5% to 15% depending on which platform you use. But, of course, not all these are true de novo. So, you really have to  follow up with an independent validation method and  test  it both  in  the parents and  the offspring.  Because  often,  these  seemingly  de  novo  regions  are  due  to false‐negatives in the parents. So, they’re there in the parent, but they’re not called and it looks like a de novo event. 

 

12  

  At the bottom here, I’m just showing what you would expect if you type a new set of controls compared to existing HapMap data. And, of course, the same would be true  if you typed a new set of patients compared to any control data set; that a  large fraction of the variants called  in a new data  set  are  novel.  Of  course,  this  does  not  mean  that  they  will  be associated with a disease  you’re  studying at present.  So,  it’s  important then to go on and prioritize which ones are the one to follow up with. 

Slide 43   Finally, I just want to end with talking about CNVs in a clinical setting. So, 

many of the problems that  I discussed are not as relevant  in the clinical setting because you often set a threshold of looking at things only larger than,  for example 300 kb or 500 kb. And most analysis  tools and most approaches will very reliably pick those things up. But that doesn’t mean that interpretation is simple. 

   So, I have some examples here of data produced in our autism spectrum 

disorder studies that we’re doing  in our  lab and  I have some pedigrees. To  the  top  left,  I  show  an  example where  there  are multiple  de  novo events  in  one  of  the  affected  offspring  and  no  de  novo  events  in  the other affected offspring. Then the question must be, are any of these de novo events actually causative  for  the disorder? And  the answer  is, we simply don’t know. 

   Another example is the SHANK3 region in chromosome 22 where we find 

the  offspring  having  two  de  novo  events,  one  of  them  being  SHANK3, which  is known to cause autism. But as you see, the SHANK3 deletion  is much  smaller  than  the other de novo event. And people  tend  to  think that  if things are bigger, they’re more  likely to cause disease. So, again, it’s important to interpret this in the right way. 

   Finally,  at  the  bottom,  are  examples  of  a  region  at  16p11  that  was 

recently found by multiple different groups to be associated with autism. Here again, we show that  it’s de novo. But  in one family,  it’s de novo  in one  offspring  that’s  affected  in  the  proband,  but  not  in  its  affected sibling. So again, it’s open to interpretation. But I think here, the strength is  in  the numbers. So  if people will  report  their data, other groups will find similar things and then using combined results, we can actually say what’s implicated in disease and not. 

Slide 44   Finally, tying back to my initial slides, I think looking ahead, of course, the 

next  generation  sequencing  technologies  are  giving  us  much  higher resolution and faster and cheaper sequencing. And I think in the future, it will be possible to describe all  levels of variation of the entire spectrum from  one  base  pair  and  up  using  the  next  generation  sequencing.  So, 

13  

we’re not going to talk about CNVs vs. SNPs anymore, we’re just going to talk  about  variation  in  the  human  genome  as  a  whole.  And  there’s enormous potential going forward with these technologies. 

Slide 45   Finally, I’d just like to acknowledge the people involved in producing the 

data  I  have  presented:  At  The  Centre  for  Applied  Genomics  at  the Hospital  for  Sick  Children  in  Toronto,  especially  the  Director,  Steve Scherer. And our collaborators at  the Sanger  Institute  in Boston  for  the high resolution NimbleGen arrays; Matthew Hurles, Nigel Carter, Charles Lee, Don Conrad, Richard Redon, Dalila Pinto, and Chris Tyler‐Smith. 

   Thank you very much.  [0:30:26] Sean Sanders:  Great. Thank you very much, Dr. Feuk. Slide 46   Before we get to our final speaker, just a quick reminder that you can use 

the download slides button to download a PDF of all the slides today. And you can click on the enlarge slides button to get a larger view of each of the individual slides. 

   So,  on  to  our  final  speaker  today,  we  have  Dr.  Alex  Blakemore.  Dr. 

Blakemore obtained  her  Ph.D.  in  the Department  of Molecular Biology and  Biotechnology  at  Sheffield  University.  She  joined  Imperial  College London  in  2001,  and  is  currently  Senior  Lecturer  in  Human Molecular Genetics and Chair of the Metabolic and Endocrine Technology Network at Imperial College London and is a member of the Council of the British Society  for  Human  Genetics.  Dr.  Blakemore  is  making  breakthrough discoveries  in associating specific CNVs with common diseases  including type II diabetes. 

   Dr. Blakemore?  Dr. Alex Blakemore:  Hello. Thank you. Slide 47   So, my talk  is going to concentrate a  little bit on  looking at some of the 

problems around  trying  to assign phenotypes  to CNVs  that we  see. So, it’ll follow along quite well,  I hope, from what Lars has  just been saying, and picking up some of the issues that have been mentioned before. 

Slide 48   So,  as was  discussed  at  the  beginning  of  this webinar, CNVs  are much 

more  common  than  we  had  first  appreciated  and  they  involve many genes. And  for  the  genes  that  are  involved,  about 26% of  those  genes include  coding  sequences  in  the  CNV.  In  fact,  some  workers  have 

14  

estimated that about 18% of the variance in gene expression that we see between individuals is due to copy number variation. 

Slide 49   So, I just want to show you some data that we have in normal individuals, 

and  just talk about the  interesting kinds of genes that we see and show you. So, this  is something  in the taste receptor gene. And what you see here is CGH data from 50 normal, healthy adult males ‐‐ French males as it happens ‐‐ for a taste receptor gene. And each person is represented by a  different  colored  line.  You  can  see  here  that  there  are  three  copy number states at this position. We don’t know actually, what effect this might have. Maybe  it’s why French people  like certain foods, maybe  it’s why they like snails, or why other people don’t like garlic. Who knows? 

Slide 50   A similar thing we see in the olfactory receptor genes where ‐‐ this is one 

person. We see some small variants  there, which are common,  just  like the one I just showed you. But this is one person who has a much larger variant. It’s over a megabase long and it involves about 24 genes. So, we see not only small common things, but rarer things are larger and involve many  genes  in  normal  individuals. And we  have  no  idea whether  they have a phenotypic effect. Some of them we suspect might. 

Slide 51   This  is probably five copy number variant  levels of a gene that might be 

involved  in  differences  in  hair  structure  and  texture  between  different individuals. 

Slide 52   This is in the immunoglobulin E gene. So, we don’t know whether it might 

have any effect in the propensity to allergy. Slide 53   Here,  this  is  a  gene  that’s  involved  in psychiatric disorders  so  Tourette 

syndrome or obsessive‐compulsive disorder and some forms of epilepsy. It might  be  interesting  for  some  of  you  to  look  at  this  in  personality differences in normal individuals. You can see it’s a common variation. 

Slide 54   And  we  very  commonly  see  differences  between  people  in  their 

oncogenes and a  lot of cancer related genes come up. And you have to speculate what are  the  implications of  these  for susceptibility  to cancer and what’s  the  relationship between  the  inherited CNVs  that we bring down  from  our  parents  at  any  subsequent  copy  number  changes  that arise during  cancer. We  know  there  are  a  lot of  chromosomal  changes that arise during cancer and we don’t know how they relate to the CNVs we inherit. So, we have a lot of questions just right there. If you’ve seen your favorite gene, you know, write to me and we can talk about it. 

 Sean Sanders:  [Laughs] 

15  

 Slide 55 Dr. Alex Blakemore:  We  have  a  big  problem  in  general  in  assigning  phenotypes  to  copy 

number variants and  let’s talk about that. So, people who have  ‐‐  if you were, for example,  looking at a child with  learning disability and a  lot of dysmorphic  features  and  you  think  maybe  it’s  a  new  microdeletion syndrome,  you might do  an  array CHG experiment  then  you might  get 600 copy number variations in that child. And you’d have to ask yourself, well how do I prioritize these? And some people will say, “Well, look at de novo changes.” But you’ve had the problems there. We don’t know quite the rate of de novo changes. We don’t know quite how to measure those. 

 [0:35:02]   Some  people will  say  look  at  big  changes  that  involve multiple  genes. 

Well,  I’ve shown you a big change now  involving 24 genes  in a perfectly normal individual. So just because something is big, we can’t assume it’s important. 

   And  changes  in  genes  relevant  to  phenotype.  Well,  that’s  nice,  but 

there’s a long way from showing a change in a gene that you like and the mechanism by which it might or might not cause disease. It’s no easier to do that with a copy number variant than it has been to do that with a SNP so… 

Slide 56   And this is another example of a very large copy number variant in one of 

our normal males.  It’s over  a megabase  long.  It  involves  four perfectly good metabolic  genes.  And  it  was  not  only  carried  by  this male,  but inherited by his two, also apparently, normal daughters. So  just because something is big and contains genes doesn’t mean that you should write to Stockholm and claim your Nobel Prize just yet. 

Slide 57   So, we don’t know really what is normal. And where we do know, we only 

know it in a handful of population groups. So, if you’re looking at an Inuit for example or a Maori, all bets are off, we have no idea what is normal in those populations. 

   And we do know that you can’t just rely on something being big because 

we know that a single based change can be deleterious for a phenotype. And we know that big changes might be benign. 

   We don’t know how often CNVs arise  in meiosis, but another emerging 

question  is how  frequently  they  arise during mitosis.  So, we  know,  for example,  that  there  are  copy  number  variants  between  monozygotic twins  and  we’d  always  assumed  that  identical  twins  were  genetically 

16  

identical. That turns out not be true. And the other question in our minds is  if  that  is  true,  then  there  is mitotic  change  in  copy number  variants then are there differences between different tissues and how does that change during  life? Do  copy number variants accumulate during aging? These are all questions we don’t really know the answer to very well yet. 

Slide 58   The other thing that some of you might work on monogenic disease. So, 

turning from our putative microdeletion syndrome to a simpler situation of monogenic disease, we still have many questions. So, how many cases of monogenic disease where we can’t find mutations are actually due to a copy number variation? 

Slide 59   Looking at our 50 guys again, here’s one of them. And you see that one of 

these  persons,  represented  by  the  green  line  here,  has  a  deletion involving deletion of  the whole copy of  this gene  that’s associated with autosomal recessive deafness. 

   Now, most sequencing strategies to analyze that gene would just look at 

the  coding  sequence  and  they would  amplify  up whatever was  there. They would amplify up the good copy and they’d say, “Okay, this guy  is normal.” They would not find that mutation by standard methods. So,  if you work on monogenic disease, you need to bear that in mind. 

Slide 60   Turning  to  complex disease, and we’ve already had  some discussion of 

that from Charles, there have been a handful of especially candidate gene approaches  that  have  been  successful  here. And  this  one  that  I’m  just showing you  is  in the Fc gamma receptor. It’s work done by Tim Aitman at  Imperial College where  I’m  from. And this particular polymorphism  is associated with systemic autoimmunity. 

Slide 61   But we have a real problem when we’re taking that out further and trying 

to  look at  the  implications  for  copy number variation  in other  complex diseases.  And  in  particular,  using  the  data  that  we’ve  already accumulated  from  genome‐wide  SNP  association  studies,  to  try  and harvest again  from  that data another set up  information about not  just what SNPs are  there, but what copy number variants are  there.  ‘Cause we have a problem. We’ve done all this very expensive work and we still have a good deal of what we call “missing heritability”. That is, we know that  there  is  a  genetic  effect  here  and  the markers  that we’re  finding from our SNPs don’t account for it all. 

Slide 62   So, here are the potential problems for that. The first one is I’ve just told 

you  that  monozygotic  twins  are  not  in  fact  identical  so  maybe  our heritability  estimates  need  adjusting.  Although,  it  maybe  that  the 

17  

differences we see would mean  that  things are more heritable  than we currently think nonetheless, but we don’t know. 

   There  are  very  many  technical  problems  in  predicting  copy  number 

variants from our SNP data. The first is that we have different subclasses of copy number variants. Some of them are old and stable and therefore in  strong  linkage  disequilibrium  with  surrounding  SNPs,  and  not  too difficult.  Then we  have  other  regions  of  the  genome where  new  copy number variants  frequently arise, and  they do not show strong LD with surrounding SNPs. So, they’re not well tied in our data. 

   Another problem  is that  in early SNP arrays and  in  later ones too, there 

are  gaps  in  the  genome  in  difficult  regions,  that  is,  very  repetitive, troublesome regions, which are the very ones where some of our finest CNVs arise. So, we’ve got holes in the data here. 

[0:40:07]   Even where we  have  SNPs  and  even where  there’s  strong  LD, we  still 

have a problem predicting where the copy number variants are. And you can tell this  is a problem by a cursory glance at the  literature and you’ll see that there are several algorithms out there for doing this. And where you see that you know that the technology  is still maturing and that we haven’t  yet  settled  on what’s  the  best  approach.  And  that’s  the  case where  people  are  still  defining  different  algorithms  and  arguing  about what’s the best approach. 

   Even if you choose an algorithm, it gives you an answer that you like, you 

then have to validate and replicate your results; and that’s an additional problem. Some CNVs because they have local sequence variations around them  are  very  difficult  to  PCR  up  or  to  analyze.  And we  also  need  to replicate, to do studies  in say obesity and diabetes, as we do, we might want to do 20,000 in our replication cohort. And finding a technology to do  that  conveniently  and  quickly  is  very  difficult  for  copy  number variants. 

Slide 63   But I’ll show you where we are in our data so far. It’s very much a work in 

progress so I’m not saying we have found the answer to this. I’ll tell you what we’re doing and you can  ‐‐ we’ll wait and see whether  it’s true or not. 

   So,  I’ll  start off with  type  II diabetes where we’re using  some genome‐

wide Illumina SNP data from a French study of type II diabetes published by Sladek et al., in 2007. And for that, we’re using our own CNV algorithm developed by Lachlan Coin at Imperial College London. And we developed that ourselves using not only the CHG data from the 50 normal guys I told 

18  

you, but matched Illumina 1 million SNP chip data so we could check the predictions that we make. And we could estimate the false‐positives and false‐negatives where  the probes happen  to coincide. So, our algorithm also assigns a haplotype so that gives us increased power. 

Slide 64   To cut a long story short, to our somewhat pleasure, we did find some of 

the genes we expected. So, we found some of the MODY genes. They are single  gene  forms  of  type  II  diabetes  like  the  classic  MODY  gene, glucokinase  in  cell.  They weren’t  at  very  significant  p  values,  but  they were there on our list, which was comforting. 

   We also  found 23 new putative  type  II diabetes‐associated CNVs,  some 

copy  number  losses,  some  copy  number  gains,  and  13 where we  had both  losses and gains. And they’re quite heartening  in a way because  in 10 of those, we see the  losses only  in diabetes and the gains only  in the controls, which is heartening. In 9 of those 13 loci, they are subtelomeric. And, I think, Charles said earlier, there is a tendency to increased number of CNVs at  telomeres. We’re  still not entirely  sure how much of  that  is truth and how much of  it  is artifact. So, we rather hope that this data  is true. 

Slide 65   We have increased confidence in our data where we see the same CNVs 

coming up as associated with different related data sets or coming up as predicted by different algorithms. And I’m just showing here our CNVs in cohorts of adult obesity and adult  controls and  child obesity with  child controls. So, they’re separate, but related cohorts. And  I’m showing you here our top hits of CNVs that come up in both cohorts. 

   I want you  to  focus on  the asterisks  there. We have a black asterisk.  It 

means  that  the CNV was present  and where  the  asterisk  is  red,  it was counted as significant to a p value of 10‐6 or below in that cohort. So, you see the top one was picked out only by our own CNV hap algorithm in the children, but by all three  in the adults. So, we see  it both with different algorithms and the different cohorts so we have increased confidence in that one. 

   Some of these are known CNVs and some of them are as yet unknown. 

Obviously, if it’s reported before then we’re really happy. But we have a problem analyzing  this data  in  truth because  the boundary  information given by the different algorithms differs. So, it’s very difficult to say quite how big these are and sometimes there’s some difference in who they’re predicted  in and who they’re not predicted  in according to the different algorithms used. 

Slide 66 

19  

  So,  that’s where we are. And we are currently  trying  to go back  to  the gold standard now of using high resolution CHG  in the  loci of  interest to pick up those and detect whether they’re really there. And for the larger scale replication studies, we’re developing Sequenom MALDI‐TOF based assays for doing our 20,000‐replication cohorts so… 

[0:45:09] Slide 67 Slide 68   Just  to  say  for  the  future, we  need  to  expand  our work  on  CNVs  into 

more ethnic groups. We need to think more carefully about how we map and report CNVs. We still have a lot of work to do on the mechanisms of their  generation,  their  stability  through  life,  and  their  functional consequences.  That’s  really  still  very much  under  researched.  And we need more and better developed high throughput, very high throughput screening  technologies  to do  the  large numbers we  really need  for  this so… 

 Sean Sanders:  Great. Thank you very much Dr. Blakemore. Slide 69   Thank you all for the excellent presentations. And we’re going to go on to 

our Q&A portion of the webinar.    My first question was actually going to be about those French males, but 

you took my fun there. ‘Cause I’m intrigued to know whether it’s specific to  that  French  population,  you  know,  or maybe  to  kids  that  don’t  like Brussels sprouts. 

 [Laughter]  Dr. Alex Blakemore:  Well, we don’t really know. I just happen to have access to French males. 

And a lot of what we see is mirrored in other populations particularly the common ones. But what’s  interesting  is when you  look at the crossover between  the different studies  is  that  there are Venn diagrams, and you showed one, didn’t you? We never see 100% crossover even in the same population of results from different studies. 

 Sean Sanders:  Okay.    So, the first question that I have ‐‐ we’ve had a  lot of questions come  in 

online,  but  this  one  was  from  somebody  who  emailed  before  the webinar, and  it relates to  this. And  they were asking whether  there are any CNVs that can be detected in tissues within the same individual. And maybe we’ll start with Dr. Lee to answer that. 

 

20  

Dr. Charles Lee:  Sure. So, I think, as was mentioned by Dr. Blakemore earlier, there was a paper  that  came  out March  of  this  year  in  the  “American  Journal  of Human  Genetics”,  showing  that  there  appears  to  be  copy  number variants  between monozygotic  twins.  And  so,  presumably,  these  copy number variants arose early during embryogenesis or a  little bit  later on so meaning that these occurred mitotically. And that would suggest that if  this  kind  of  phenomenon  can  occur when  you  look  at monozygotic twins, then you could have tissue‐to‐tissue differences occurring as well. 

   In  fact,  recollection  is  that  in 2006  in  the  “American  Journal of Human 

Genetics”,  Sharp et  al.  [0:47:26]  [Phonetic]  also made  a  comment  that when  they did  their CNV  studies,  they  also  saw  some preliminary data that demonstrated  this.  So,  I  think  that  there  is  growing evidence  that there  is  some  degree  of  CNV  differences  between  tissues  in  a  given individual. 

 Sean Sanders:  Dr. Feuk, you have anything to add?  Dr. Lars Feuk:  Just to  follow‐up on that,  I  just want to say that the number of somatic 

CNVs is much, much smaller than what you would find in the genome as whole. And again,  coming back  to  these problems of  interpreting noisy data, before you can actually say  that something  is somatic, you would have to validate it by an independent method. Because right now even if you run exactly the same DNA twice, you will find some differences based on the array results. So, it’s important to point that out that you need to validate it in some way. 

 Sean Sanders:  Okay.    And  Dr.  Blakemore  a  question  for  you  that was  asked  about whether 

SNPS and/or CNVs can explain  the different manifestations of  the same disease in two individuals. 

 Dr. Alex Blakemore:  Right. Well, there is some data emerging on that too.  Sean Sanders:  Uh‐hum.  Dr. Alex Blakemore:  For a while, we’ve looked at different lengths of mutation in people who 

have known genomic disorders.  It’s been known quite well  in William’s syndrome for instance. And we can map the occurrence of particular sub‐phenotypes according to the length of mutation. So, we know that can be done and I happen to know this, there’s going to be some data published showing  in a particular microdeletion syndrome that the sub‐phenotype 

21  

of  obesity  can  be mapped  to  a  nearby  gene  that  is  included  in  some people’s mutation and not in others. So, I would say the answer is yes. 

   But on  top of  that, perhaps we  can also  look at  something we  think  is 

quite simple, so trisomy 21. So, we think of all the phenotypic things that we  see  in  trisomy  21  as  arising  from  there  being  three  copies  of chromosome  21.  But,  of  course,  chromosome  21  like  the  other chromosomes has regions of copy number variants. And so, in that case, where  there’s a deletion,  for example,  then  that person only may have two copies or one with no copies of that region or consequently in some areas, they might have four. And that might explain why for example 40% of  children with Down’s  syndrome have  cardiac abnormalities and 60% don’t. 

 Sean Sanders:  So, here’s a question  I’m going  to  throw out  to  the group  that came  in 

online. What about CNVs between two and a hundred base pairs, can we see  them? Do we have  the  resolution yet  in  the  technology? Let’s start with Dr. Feuk. 

 [0:49:58] Dr. Lars Feuk:  I  think  for  that  really  sequencing  is  going  to  be  the  answer.  I  mean 

sequencing  is  very,  very  good  at  picking  up  these  smaller  variants.  It’s actually maybe more difficult to pick up the big variants with sequencing. You have to use some different strategies to find those. But for the small variants that are less than a hundred base pairs, I think, sequencing is the way to go to really create that map of variation in the human genome. 

 Sean Sanders:  Okay. Any other comments?  Dr. Charles Lee:  You know, Sean, I would agree with that. I think and it’s comforting to see 

that whole  genome  sequencing  is becoming more widely  available  just precisely to identify these small imbalances. Yeah. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum.  So,  you  think  as  the  next  generation  sequencing  technology 

advances, it’s going to get easier to see these?  Dr. Charles Lee:  Yes.  Sean Sanders:  Okay.  Dr. Alex Blakemore:  You  can  pick  up  small  things  by  CHG.  We  accidentally  picked  up 

something  that  turned out  to be only 15 bases  long by sequencing. But you have to have just by ‐‐ happen to stand put to your probe there. And it has to do with the density of probes that you can use. 

22  

 Sean Sanders:  Okay.    Question about inversions, are they less common or just more difficult to 

detect? Dr. Lee, you want to start us off?  Dr. Charles Lee:  So,  I  think,  inversions  and  other  balanced  rearrangements  are  part  of 

structural  variation  that  really  hasn’t  been  explored  up  to  now.  I’m thinking of a paper  in 2005  in “Nature Genetics” by Tüzün et al. where they  actually  looked  at  structural  genomic  variation  by  sequence comparison methods  in  the  size  range  of  8  to  40  kb.  And  they  found approximately 300 copy number variants and about 50 odd inversions. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum.  Dr. Charles Lee:  So, clearly, there’s more ‐‐ in that study, they showed that there are more 

genomic  imbalances  occurring  in  this  whole  spectrum  of  structural variation,  but  not  an  insignificant  amount  of  balanced  rearrangements such  as  inversions.  But  I  think  the  problem  is  right  now  that  the technology  to  do  sort  of  a  genome‐wide  scan  for  these  balanced rearrangements doesn’t exist to my knowledge. And so, this is an area of structural variation that we really haven’t fully explored. 

 Dr. Alex Blakemore:  But you saw it in your fiber‐FISH, you saw it rather beautifully there.  Dr. Charles Lee:  Right.  But  that was  a  locus‐specific method.  But  to  screen  for  it  in  a 

genome‐wide manner, I think, is still not something that’s really possible. There are methods to look at balanced rearrangements, yes, in a specific locus. 

 Dr. Lars Feuk:  I  think another way  to address  the question  is  to actually compare  the 

chimpanzee genome to the human genome. ‘Cause there, we see what’s happened evolutionarily in the last few million years. And we do see a lot more  copy  number  variation  between  those  genomes  than  we  do inversions. 

 Dr. Charles Lee:  That’s true.  Dr. Lars Feuk:  So, again,  indicating  that copy number variants are more common  than 

inversions ‐‐  Dr. Charles Lee:  Yup.  Dr. Lars Feuk:  ‐‐ independent of technologies used to assess it. 

23  

 Sean Sanders:  Okay. And do we see CNVs in the chimp that we in human?  Dr. Lars Feuk:  Well, Charles has the answer for that –  Sean Sanders:  [Laughs]  Dr. Lars Feuk:  ‐‐ specifically of this so…  Dr. Charles Lee:  So,  I think, the work  is preliminary. But some of the earlier studies from 

our group and others have shown that  in fact when you  look at CNVs  in chimpanzees,  in macaques, other primates,  indeed  there  is a significant number of overlap of CNVs that we find in these primates that are also in humans. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum.  Dr. Charles Lee:  And in particular, those that are fairly large and associated with ancestral 

segmental  duplications.  So,  presumably,  these  ancestral  segmental duplications are mediating the formation of these CNVs independently in the different lineages. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum. And how does  that play  into human evolution?  Is  there a  role 

for these duplications or these structural changes in human evolution?  Dr. Charles Lee:  So,  I  really do believe  that  these segmental duplications  in our genome 

are allowing our genomes to be much more plastic, which is a good thing. I  think,  we’re  in  a  constantly  changing  environment  and  in  order  to continue  to adapt  to  that environment, our genomes need  to adapt as well. And these segmental duplications that are throughout our genome are  making  ways  for  our  genomes  to  rearrange  and  to  have  more variation to allow us to adapt to that. So, I think, that is a good thing. 

 Sean Sanders:  Okay.    Dr.  Blakemore,  are  you  seeing  this?  Relating  evolution  to  disease,  you 

know, can you see a link there? You know, for instance mutations that we know are advantageous in certain climates, say, that are disadvantageous in others. 

 Dr. Alex Blakemore:  It’s  a  very early  stage.  I  can’t  really  comment  in detail, but  I would be 

surprised  if we don’t  see  those  various associations.  I mean,  there  is a paper by Voigt a couple of years ago  identifying  regions of  the genome that had been subject to recent selection. And some of those regions of 

24  

the genome definitely overlap with regions where we see a  lot of CNVs. And  the  types  of  genes  involved  definitely  overlap  with  the  types  of genes that we see CNVs in. But nobody’s put that data together really as far as I know. Do you know anything of that? 

 Dr. Lars Feuk:  No. Just ‐‐ I mean, to reiterate that you said, that the types of genes that 

we do see to be copy number variable and to be increased. Like if we look at GO  terms  for example,  it  is  a  lot of  genes  that have  to do with our interaction with the environment. 

 [0:55:07.0] Sean Sanders:  Uh‐hum.  Dr. Lars Feuk:  So,  that’s  an  indication  that  it  is  currently  going  on.  The  evolution  is 

currently  going  on  in  human  genome  and  it  is  a mechanism  for  us  to interact with our environment. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum. Okay.    Well, I’m going to stay with you, Dr. Feuk, and a question came in about 

the  Toronto  database. And  they  say, whether  you’ll  agree with  this  or not,  that  the  database  often  gives  a wrong  estimate  about  the  size  of CNVs  because  of  the  BAC  related  data  within  it.  Is  this  going  to  be corrected and will the database have ‐‐ so, what will we have, a database that is ‐‐ will we have a database that’s solely based on oligo data. 

 Dr. Lars Feuk:  So, no. He or she is absolutely right that we are currently showing the old 

BAC data, which we know  is overestimating the sizes of the variant. So, we leave a lot of interpretation up to the user currently of the database. And if there are BAC data as well as oligonucleotide data, of course, you should look at the oligonucleotide data because it has higher resolution. 

   What we’re  doing  to  sort  of  address  this  is  in  the  next  update  of  the 

database, we’re going to separate the BAC data from the other types of data that are out there, which will give  it much better ‐‐ you know, give the  user  a  much  better  understanding  of  what  the  actual  picture  of variation at each site looks like. 

 Sean Sanders:  Okay. Great.    I’m  going  to  jump  into maybe a  snake pit here.  So,  somebody  asked  a 

question  about  nomenclature. Does  the CNV  imply  a  benign  alteration and does  the CNA  implies  a disease  associated  change? Who wants  to start? [Laughs] 

25  

 Dr. Alex Blakemore:  I think that’s one for Charles.  [Laughter]  Dr. Charles Lee:  So,  yes.  CNV  nomenclature  has  been  a  very  tricky  issue.  And  this  is 

something, which I’m sure not only our group, but others have debated. Classically for those doing clinical service in genetic diagnostics, we refer to variants as those that are benign. So, the whole  idea of copy number variants  generally  implies  to  most  clinical  geneticists  or  clinical cytogenetecists  that  that  imbalance  is  not  contributing  to  the  clinical phenotype. 

   Now,  I  think, one of  the  things  that have been proposed  is  that we use 

identifiers before  the CNV. So,  is  it a pathogenic CNV or a benign CNV? And  I  think  that proposal  came  forward because of  the  fact  that we’re discovering  these  CNVs  at  such  a  rate  that  we  don’t  understand  the biological functions behind them. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum.  Dr. Charles Lee:  And  some  of  these  CNVs  that we  think  currently  are  benign,  are  not 

contributing  to  a  clinical  phenotype,  may  later  be  shown  to  actually indeed  contribute  to  that phenotype. And  that  could be on  its own,  it could  in combination with various SNPs. So,  I think,  it’s more of a factor that we just ‐‐ our understanding in this area is still quite limited. And so, we’re using this kind of a terminology to be more all encompassing and to protect ourselves. 

 Sean Sanders:  Okay. Any other comments? Stay away from that one?  [Laughter]    Okay. So, I’m going to jump into some technical questions now. We had a 

question  come  in by email asking what  tools are available  for  SNP and CNV  screening  in non‐model  species,  in other words,  species where we don’t have a reference genome. So, Dr. Feuk, you want to try that one? 

 Dr. Lars Feuk:  Most of the strategies that we currently have for annotating variation are 

built on using  these different array‐based  technologies. So, of course,  if you don’t have a genome, you cannot build an array because you don’t have any sequences to put on the array. So, it depends a little bit on what stage  this model organism would be at.  If you have  for example a BAC library, you could actually make an array with those BACs. But if you have 

26  

nothing at all, it’s very difficult to start the annotation of that genome by looking for SNPs and CNVs. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum.  Dr. Lars Feuk:  I would say you should start by sequencing a genome and trying to make 

at  least  the  rough assembly on which  you  could  then base  your  future studies. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum. Uh‐hum. Okay. Dr.  Blakemore,  you’re  going  to  ‐‐  anything  to 

add?  Dr. Alex Blakemore:  That’s  true  for  genome‐wide  approaches.  Of  course,  if  you  know 

something about your favorite gene, then perhaps you can do something locally  in  that  region more quickly. But on  the whole  line,  I agree with Lars. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum.    Okay. Well,  we’re  almost  out  of  time  so  I’m  going  to  ask  one  more 

question and I’ll go through all the panelists and see what your answer is to this. This question comes  in online, what  is the biggest challenge you feel  in  this  field?  So,  maybe  we’ll  start  with  ‐‐  let’s  start  with  Dr. Blakemore at the end. 

 Dr. Alex Blakemore:  For  me  in  my  field,  it’s  having  a  technique  that  is  fast  enough  and 

efficient enough to  look at thousands of people. There are things that ‐‐we’ve gotten very good at looking at thousands of CNVs in a few people and we need something to look at a few CNVs in thousands of people. 

 [1:00:04] Sean Sanders:  Uh‐hum. Dr. Feuk?  Dr. Lars Feuk:  To me,  it’s really what  I’ve been working on  for the  last  few years. And 

it’s  to  create  a  really  high  resolution  map  of  this  type  of  variation. Because I think we need that map to be able to go on and do really well designed studies in disease and so on. So, that’s the biggest challenge to me,  to  make  an  accurate  map,  start  and  endpoints  are  correct,  the frequencies are correct in the populations. And we have all the different populations  that  are  out  there, we  have  data  for  those.  I  think  that’s crucial to be able to take this to the disease studies. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum. Dr. Lee?  

27  

Dr. Charles Lee:  So, Sean, the thought that  I have  is that  it was the technology advances that became available,  like array CGH,  that allowed us  to  identify  copy number  variants  and  other  structural  variants.  And,  I  think,  there  are areas where we need to continue to make technological advances. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum.  Dr. Charles Lee:  Some things that come to mind for example is a lot of the things that we ‐

‐ the information we get now is relative copy number. I’d like to see more absolute copy number data come out. We need to get allelic information, if there are four copies in a cell, is it two on one chromosome, two on the other, or one and three, or etc. ‐‐ I think that information. 

   And  as  was  mentioned  earlier,  I  think  we  really  need  to  get  high 

definition of  the architecture,  the CNV’s breakpoint  information, where are they  in the genome. And that’s going to give us the most power for future  association  studies  and  other  studies  like  in  evolution, pharmacogenomics.  And  I’m  really  looking  forward  to  seeing  what breakthroughs are coming over in the next years, you know, on this. 

 Sean Sanders:  Great. Well, I wish we had more time to continue this discussion. It’s very 

interesting, but unfortunately, we’ve reached the end of our hour. So,  it just  remains  for me  to  thank  our  excellent  speakers  for  being with  us today and  for  the enlightening discussion  they’ve provided; Dr. Charles Lee from Harvard Medical School, Dr. Lars Feuk from the Hospital for Sick Children, and Dr. Alex Blakemore from Imperial College London. 

   Thank you also to our online viewers for the wonderful questions. Sorry 

we didn’t manage to get to all of them.    Please go to the URL at the bottom of your slide viewer now if you would 

like  to  learn  a  little  bit more  about  some  products  related  to  today’s discussion.  And  look  out  for more webinars  from  Science  in  the  near future available at www.sciencemag.org/webinar. 

   We encourage you to share your thoughts about the webinar with us by 

sending  an  email  to  the  address  now  up  in  your  slide  viewer, webinar@aaas.org. 

   Again,  thank you  to all  the participants and  to Agilent Technologies  for 

their kind sponsorship of this educational seminar.    Goodbye.  

28  

  Okay. Thank you very much.  [1:02:45]  End of Audio