CONTROLDEMICROORGANISMOSPOR

AGENTESANTIMICROBIANOS

MICROBIOLOGIAAMBIENTAL

MICROBIOLOGIAAMBIENTAL 2017INDICEAGENTESANTIMICROBIANOS:.........................................................................................................3

Definición:..............................................................................................................................................3

Puedenclasificarse:...........................................................................................................................3

ANTISÉPTICOSYDESINFECTANTES:.............................................................................................3

Mododeacción:...................................................................................................................................4

Usos:.........................................................................................................................................................4

Condicionesquedebereunirunantimicrobianoideal:..........................................................5

Clasificación:..............................................................................................................................................5

1)Antisépticosinorgánicos:.....................................................................................................5

2)Antisépticosorgánicos:.........................................................................................................6

Factoresqueinfluyensobrelaactividadantimicrobiana:....................................................8

Cuantificacióndeefectoantimicrobiano:.....................................................................................9

Pruebaspordiluciónencaldo:.....................................................................................................9

TÉCNICA:.............................................................................................................................................10

CÁLCULODELACIM:.....................................................................................................................10

CÁLCULODELACBM:...................................................................................................................11

Esquemadetrabajoadesarrollarenelpráctico:...................................................................11

Interferenciadelamateriaorgánicaenlaactividaddeundesinfectante:..................12

MICROBIOLOGIAAMBIENTAL 2017AGENTESANTIMICROBIANOS:

Estoscompuestosactúansobredeterminadossitiosdelmicroorganismoproduciendomodificaciones estructurales, o inhibición de la síntesis de componentes esencialesparalavida,alterandolaintegridadcelularoladivisiónbacteriana.Puedenclasificarse:v Desinfectantes: sustancias químicas empleadas para matar microorganismos

sobresuperficiesuobjetosinanimados,perosontóxicosalaplicarlosdirectamentesobretejidos.

v Antisépticos:germicidainofensivoparaplicarsobrelapiely/omucosas,peronolo suficientemente inofensivo comopara ser ingerido. Seutiliza en la asepsiadeheridasocamposquirúrgicos.

v Antibióticos: sustancias químicas producidas por microorganismos o tambiénobtenidas por síntesis química, ya sea total o parcialmente. En bajasconcentraciones inhiben el crecimiento de otros microorganismos. Losantibióticos son utilizados como agentes quimioterápicos en el tratamiento deenfermedades infecciosas. Se los llama quimioterápicos porque tienen toxicidadselectiva sobre el microorganismo, es decir, no presentan efectos nocivosacentuadossobreelhuésped.

De acuerdo a la concentración empleada, estas sustancias pueden actuar comoagentes:v Germicidasobactericidas:sustanciaquedestruyeomatalosmicroorganismos.v Bacteriostáticos: sustancia que impide el crecimiento y multiplicación de

bacterias.Lamayorpartedelassustanciasbactericidas,abajasconcentracionessecomportancomobacteriostáticos.

ANTISÉPTICOSYDESINFECTANTES:

Mododeacción:

Definición:Sustancias capaces de destruir o inhibir la proliferación de los

microorganismos.

MICROBIOLOGIAAMBIENTAL 20171.Precipitaciónydesnaturalizacióndeproteínasdelprotoplasmaqueseencuentranenestadocoloidal,fragmentandolaestructuraterciariadelasmismas.Ejemplo:fenolyetanol.2.CombinacióneinactivacióndeenzimasbacterianascongruposSH,queúnicamentepuedenfuncionarsiestosgrupospermanecenlibresyreducidos.

Ejemplo:compuestosdemercurio.

3.Oxidacióndeenzimas.Ejemplo:H2O2.

4. Combinación con grupos amínicos de las proteínas bacterianas. Ejemplo:formaldehido.

5. Alteración de las propiedades físicas y químicas de la membrana celular.Impidiendosufuncionamientonormal.Ejemplo:antisépticosdetergentes.

6. Combinación de grupos ácidos y básicos del protoplasma bacteriano ynucleoproteínas.Ejemplo:colorantesbásicosyácidosrespectivamente.

El problema cuando se quiere desinfectar material no viviente es diferente quecuandosetratadetejidosvivos.En el primer caso deben destruirse todos los gérmenes, es decir efectuar laesterilización,porquesisedejanvivasalgunasbacterias,sereproducenrápidamente,luegoesnecesarioundesinfectantemuypotente.En el segundo caso, los tejidos vivos poseenmedios de defensa contra la invasiónbacteriana. Por ello, el objetivo del empleo de antisépticos y otras drogas antiinfecciosasesdeayudaradichasdefensas,siendomuchasvecessuficienteinhibirelcrecimiento de los gérmenes (acción bacteriostática). Deben buscarse drogas quedañenlasbacteriasyalavezafectenlomenosposiblelostejidosdelhuésped.

Usos:• Antisepsiadelapielsana:serefiere,porejemplo,alaantisepsiadelasmanosdel

cirujano. En estos casos es necesario la acción en forma rápida, no sólo de lasuperficiesinotambiéndelasglándulassebáceasysudoríparas.

• Antisepsia de heridas pequeñas (en heridas grandes se corre el peligro deabsorción)ymucosas (previendoelusodeantisépticospoco irritantesyquenoseanabsorbidosporlamucosatratada).

• Desinfeccióndeobjetosinanimados.

• Desinfección del agua (se debe recurrir a sustancias que no sean tóxicas ni desabordesagradable).

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CLASIFICACIÓN1)Antisépticosinorgánicos.Halogenados:

* Iodo y derivados: Acción germicida potente y rápida. Actúa sobre bacterias,esporos, hongos, virus y amebas. Se combina con las proteínas bacterianasprecipitándolas.Esinactivadoporlamateriaorgánicaporcombinaciónconproteínas.Ej.:solucióndeiodo,povidonaiodo.Secombinaconproteínasdelasangreformandoiodurosinactivosporloquenoserecomiendaparaantisepsiadeheridasprofundas.Muypotenteparaantisepsiadepiel.

*Cloroyderivados:Germicidadeacciónpotentesobrebacterias,virus,amebasyesporos.Estassustanciasse transformanenácidohipocloroso(ClOH)quereaccionacon los grupos aminos de los aminoácidos de las proteínas bacterianas, formandocloraminas, o por monooxidación ya que el ClOH libera oxígeno fácilmente, poderdesodorizante.Ej:cloroqueseutilizacomprimidoentubosdeaceroalestadolíquidoparadesinfeccióndelagua,Hipoclorito.

Condicionesquedebereunirunantimicrobianoideal:ü Poseeractividadpotentecontratodoslosmicroorganismos.ü Deacciónrápida.ü Inocuoparaelhombreylosanimales.ü Eficazenpresenciademateriaorgánica.ü Capacidaddepenetración.ü Solubleenagua.ü Estable.ü Sinolordesagradable.ü Nosercorrosivonimanchar.ü Económicoydefáciladquisición.

MICROBIOLOGIAAMBIENTAL 2017Antisépticosoxidantes:

*Agua oxigenada: germicida, los microorganismos más sensibles son losanaerobios.Elmecanismodeacciónconsisteenlaoxidacióndelosgrupossulfhidriloslibresde lasenzimasbacterianas, ligandogrupossulfhidrilosvecinos,dando lugarapuentesdedisulfuro.Seproduceasí,cambiosenlaconformacióndelasproteínasqueformandichasenzimas,pérdidadefunciónymuertecelular.

*Permanganato de potasio tiene mayor poder oxidante que el anterior y suacciónesinespecífica.Actúasobrebacterias,virus,trichomonas.

Metalespesados:

*Compuestos demercurio. Son bacteriostáticos, necesitanmucho tiempo paraactuar y son poco activos frente a esporos. Los iones mercúricos se adsorben a laparedbacteriana,luegopenetran.Enelcasodesolucionesconcentradas,secombinancon las proteínas del protoplasma precipitándolas. En soluciones diluidas se hademostrado que la acción se realiza sobre sistemas enzimáticos que tienen grupossulfhidrilos de gran importancia metabólica, inactivándolos por combinación conéstos grupos. Los iones mercúricos son removidos de estos sitios por sulfuros ocompuestosquetenganestegruporeactivándoseelmetabolismobacteriano,deallísuacción bacteriostática. Ej: cloruro mercúrico, óxido mercúrico, timerosal omerthiolate.

*Compuestosdeplata:Germicidaspotentesyrápidos,ensolucionesdiluídassonbacteriostáticos. Tienen igualmodo de acción que elmercurio. Ej: Nitrato de plata,soluciónoftálmicadenitratodeplata(enoftalmologíadelreciénnacido).

*Compuestosdezincycobre:Bacteriostáticos,igualqueelmercurio.Ej:SulfatodeZinc,Sulfatodecobre,Solucióncuprozíncicaalcanforada(aguaDalibour).

Ácidosinorgánicos:

*Acido bórico: se utiliza en la dermatofitosis del tipo pie de atleta. EsBacteriostático,ysuacciónnoestácompletamentedilucidada.

2)Antisépticosorgánicos.Alcohol:

MICROBIOLOGIAAMBIENTAL 2017*Alcohol etílico: acción germicida, efectivo contra bacterias, con menor acción

sobre virus ymuypoca sobre esporos. Lamejor concentración es al 70°debido a sumayor penetración en el protoplasma bacteriano. El alcohol puro (96°) coagula lasproteínas en la superficie celular y se hace difícil la penetración; en condiciones dehidratación la penetración es más fácil. El alcohol desnaturaliza las proteínas delprotoplasmabacteriano.

*Fenoles:Accióngermicida,penetran fácilmente,utilizadosensoluciónacuosa,

atraviesan fácilmente la membrana celular bacteriana. En altas concentraciones secombinan y coagulan las proteínas protoplasmáticas desnaturalizándolas. En bajasconcentracionesactúanporinactivacióndesistemasenzimáticos.Supotenciaespocoafectadaporlamateriaorgánica.

Aldehídos:

*Formaldehido:potentegermicidadeacciónbastantelenta,contratodaclasedemicroorganismos, inclusive esporas. Precipita las proteínas y tiene la capacidad deinactivar las toxinas transformándolas en toxoides, sin perder las característicasantigénicas. Su acción se debe a la combinación con grupos aminos libres de lasproteínas, desnaturalizando la proteína que coagula. Sus soluciones son tóxicas,irritantesenojosymucosas.

*Glutaraldehidoyderivados:actúandelmismomododelformaldehido.NecesitaunaactivaciónapHalcalinoparaqueseaefectivo.

Ácidosorgánicos:

*Ácido mandélico: utilizado exclusivamente como antiséptico urinario, siendobactericidaparabacteriasGramnegativasyderivados.

Detergentesaniónicos:

*Jabones: son agentes tensioáctivos. Tienen un grupo hidrofílico y un grupolipofílico. Son sales metálicas de ácidos grasos superiores de cadenas largas. Losácidospuedensersaturadosonosaturados.Poseenaccióngermicida,actúansobrelamembrana celular donde se concentran (interfase líquido-agua) y la lesionanalterandosupermeabilidad.Tambiénejercenaccióndearrastre.

Detergentescatiónicos:

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*Compuestosdeamoniocuaternario:secaracterizanporqueelgrupolipofílicollevacargapositiva(catión).Loscompuestosdeamoniosondeorigensintético.SongermicidasparabacteriasGrampositivas,Gramnegativas,hongosyprotozoarios.Enbajasconcentracionessecomportancomobacteriostáticos.Sonantagonizadosporlosdetergentes aniónicos. Actúan de igual forma que los anteriores, además inhibenenzimáticosque actúanen la respiración, rigen las glucólisis ydesnaturalizacióndelasproteínas.

Colorantes:

*Secombinanconconstituyentesácidoscomonucleoproteínasyácidofosfórico.Ej.Violetadegenciana,verdedemalaquitayvioletademetilo.

Factoresqueinfluyensobrelaactividadantimicrobiana:

1. Tiempodecontacto:lamuertemicrobiananoesunprocesoinstantáneoporloqueresultaindispensablenosóloelegirelagenteletal,sinoestablecercorrectamenteel tiempo mínimo que debe aplicarse para lograr el efecto deseado. El tiemponecesario para matar los microorganismos presentes es proporcional a laconcentración inicial, es decir que se requiere mayor tiempo para matar altasconcentracionesdemicroorganismos.Porestoesdegranimportanciareducirlacargainicial de microorganismos de los materiales a desinfectar mediante operacionespreviasdeLIMPIEZA.2. Concentración: la concentración del antimicrobiano se relaciona, en formaexponencial, con el tiempo de contacto. Es decir que cuando menor sea laconcentración del desinfectantemayor será el tiempo de exposición necesario paraqueelprocesoseaefectivo.3. Temperatura: algunoscompuestosaumentansuactividadcon la temperaturaperootros,principalmentelosdesinfectantesreductoresnosonafectados.4. pH: influye en el grado de disociación de moléculas activas. Cada grupo dedesinfecantestieneunpHóptimodeacción.Porejemplo:

a. Salesdeamoniocuaternario:pHneutrooligeramentealcalino.b. Cloro:pHneutrooácido.c. Glutaraldehido:pHalcalino.

5. Influenciadesustanciaspresentes,principalmentemateriaorgánica:paraqueeldesinfectanteactúe,debeponerseencontactoconelmicroorganismo.Lasuciedad,grasa,proteínasymateriaorgánica,engeneralconstituyenBARRERASqueimpidenelcontactoprotegiendoalmicroorganismo.6. Espectroantimicrobiano:algunassustanciassonmuyespecíficosconrespectoalosmicroorganismosqueafectanyotrostienenunamplioespectroantimicrobiano.

MICROBIOLOGIAAMBIENTAL 2017Lascélulasjóvenesymetabólicamenteactivassonmássensiblesquelascélulasviejasoenestadodereposo.7. Estabilidaddeldesinfectante:engenerallosdesinfectantessonestablesensusformulaciones originales y sin diluir. Luego de la dilución sufren alteracionesgradualesconpérdidadeactividadporloqueserecomiendasiempreusardilucionesrecientementepreparadasquenodebenalmacenarse.8. Resistenciamicrobiana:lacomposicióndelaparedofreceunagranvariacióndeefectosalosdesinfectantes.9. Incompatibilidadeseinactivación:comoseexpusoenelpunto6,lapresenciadeciertassustanciaspuedeninactivareldesinfectanteempleado.Entrelosejemplosde incompatibilidad tenemos a las gomas y plásticos que inactivan desinfectantesfenólicos(porlotantonopuedenseralmacenadosenrecipientesplásticosnipuedenserutilizadosparadesinfectarestetipodematerial)olosdetergentesaniónicosqueinactivan otros antisépticos como nitratos, halogenados, permanganato y cromato.Porlotantonopuedenserusadosenformacombinada.

CUANTIFICACIÓNDELEFECTOANTIMICROBIANO

PRUEBASPORDILUCIONENCALDO:

Característicasdelmétodo:

- Es un método cuantitativo mediante el cual puede determinarse laconcentración del agente antimicrobiano necesario para inhibir o matar unmicroorganismodado.

-Noestáinfluenciadasporlavelocidaddecrecimientodelosmicroorganismosenestudio,porlotantopuedeutilizarsetantoparamicroorganismosderápidocomodelentodesarrollo.

-Seutilizaparabacteriasaerobiasyanaerobias.

-Sóloseaplicaacultivospuros.

Fundamentosdelmétodo:

En los métodos de dilución en caldo se colocan concentraciones decrecientes delagenteantimicrobianoentubosconuncaldonutritivoquesostendráeldesarrollodelmicroorganismo.Aquellostubosenlosquelaconcentracióndeantimicrobianonoesefectivaapareceránturbiosporelcrecimientobacteriano.

MICROBIOLOGIAAMBIENTAL 2017Consideracionesatenerencuenta:

-ElcaldomáscomúnmenteusadoparaestaspruebaseseldeMüellerHinton.

- Los agentes antimicrobianos se preparan en soluciones concentradas en un

diluyenteapropiadoyluegosediluyenhastaobtenerlasconcentracionesapropiadas(generalmentedilucionesalmedio).

- El inóculo estándardelmicroorganismoes, conmayor frecuenciade1 x10⁶

mo/ml,quecorrespondeconeltuboN°0,5delaescaladeMcFarland.

TÉCNICA

• Seseleccionan4o5coloniasdelmismotipomorfológico.• SepreparaunasuspensióndemicroorganismosenelcaldoMH,conturbidez

querepresente1x10⁶mo/ml.• Sepreparanlasdilucionesaprobardelantimicrobianoysecoloca1mldecada

unade ellas en tubos estérilesperfectamente rotulados con la concentraciónprobadacorrespondientemente.

• A cada tubo anterior con antimicrobiano se le agrega 1ml de la suspensiónbacteriana(tenerencuentaquelaconcentracióndelantimicrobianosediluiráalamitad).

Seutilizandostuboscontrol:

1. Caldo sin inocular como control negativo en la lectura de los resultados.Tambiénesútilparacontrolarposiblecontaminación.

2. Caldoinoculadoperosinantimicrobianocomocontrolpositivodedesarrolloy de utilidad en el cálculo de la CBM. De este tubo se realiza un recuentobacterianoenunaplacadeagarnutritivo.

Lostubossonincubadosadecuadamente.

CÁLCULODELACIMSeobservalaturbidezdelostubosporcomparaciónconelcontrolnegativo.El microorganismo crecerá en el control positivo y en todos los tubos que nocontengansuficienteagenteantimicrobianocomoparainhibireldesarrollo,conestosresultadossecalculalaCIM:

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AcadatuboquenopresentaturbidezselerealizaunrecuentoenplacaparahallarlaCBM.CÁLCULODELACBM

Secomparanlosvaloresdelosrecuentosobtenidosdelostubosnegativosconeldeltuboconsideradocontrolpositivo(éstenosda lacantidaddebacterias inoculadasyrepresentael100%).Deestaformasecalculaelporcentajedecrecimientoseobtuvodecadatubosinturbidez.

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ESQUEMADETRABAJOADESARROLLARENELTRABAJOPRÁCTICO:

DIA1A)PREPARACIÓNDELASUSPENCIÓNDELMICROORGANISMO

B)PREPARACIÓNDELASDILUCIONESDELATB-CALDO

CIM: está dada por lamenor concentración del agente que presentafaltadeturbidez.

CBM: está dada por lamenor concentración del antimicrobiano quepermite el crecimiento del 0,1% de los microorganismos inoculadosoriginalmente.

MICROBIOLOGIAAMBIENTAL 2017C)SIEMBRAAgregar a todos los tubos (excepto el control negativo) 2ml de la suspensión delmicroorganismopreparadaenA).Incubar18-24HS.a37°C.

DIA2D)LECTURACIM–SIEMBRACBM

DIA3D)LECTURACBM

MICROBIOLOGIAAMBIENTAL 2017Interferencia de la materia orgánica en la actividad de undesinfectante:

Materiales:• Microorganismodeprueba:Escherichiacoli.• Desinfectantedeprueba:Hipocloritodesodio• Concentracióndeprueba:1%-10%• Mediodecultivo:caldonutritivocontiosulfatodesodiocomoinactivante.

Técnica:

Repetir el esquema de trabajo anterior realizando diluciones del desinfectante enleche.Luegodelaincubaciónaquellostubosquepresentanturbidezvisiblesalcompararloconuntubosinsembrar,seconsideraráncondesarrollo,esdecireldesinfectantenocumpliósufuncióneneltiempodecontactoensayado.

Objetivo:Determinarcómovaríaeltiempodecontactonecesarioparaqueel

desinfectanteseaefectivoenpresenciademateriaorgánica.