TM 08 POLYMERASE CHAIN REACTION 2014.pptx

8/21/2019 TM 08 POLYMERASE CHAIN REACTION 2014.pptx

1/17

TATAP MUKA 8

Polymerase Chain Reaction

(PCR)


2/17

LO 34: menjelaskan prinsip dasar PCR

LO 35: menjelaskan perancangan prmer PCRLO 36: menjelaskan reverse transcriptase PCR (RT-PCR)

LO 3: menjelaskan nested PCR

LO 3!: menjelaskan R"P#-PCR


3/17

INSIP DASAR PCR

1. DNA temlat DNA yang sebagian urutannyaakan diamplifkasi

!. Primer • Oligonucleotide• untuk memulai amplifkasi• membatasi ragmen yang

akan diamplifkasi.". DNA olimerase

• DNA polimerase termostabil• mengamplifkasi ragmen

DNA#. $NTP

•

Monomer DNA• dATP, dTTP, dGTP, dTP

MP%N&N PCR

'% "# menelas*an rinsi $asar PCR


4/17

D!NAT"#AT$ON %&'() Duple* DNA is +eat

denatured to giesingle strands

ANN!A-$NG %''() to oligonucleotide

primers are annealedto t+eircomplementaryse/uences on t+e

target DNA. !0T!N1$ON %23() Ta/ polymerase

%t+ermostable) is usedto synt+esise

complementary

US DAN TA+APAN PCR



5/17

US DAN TA+APAN PCR



6/17

RANCAN,AN PRIM&R PCR

'% "- menelas*an erancanan rmer PCR

Aspek yang +arus dipertimbangkan4

urutan primerasal inormasi urutandata sekuens asam amino

kode degenerasi genetik"rutan basa DNA yang tela+

diketa+ui

1intesis primer4Posisi 5obble6asa inosin


7/17

RANCAN,AN PRIM&R PCR


/i. 0." Primer $esin. $n %a) t+e amino acid se/uenceand number o codons per amino acid are s+on. T+ose

amino acids it+ 7 codons %circled) are best aoided. T+ebo*ed se/uence is t+ereore selected.


8/17

/i. 0." Primer $esin. $n %b) a mi*ed probe is synt+esisedby including t+e appropriate mi*ture o dNTPs or eac+degenerate position. Note t+at in t+is e*ample t+e fnaldegenerate position or proline is not included, giing anoligonucleotide it+ 38 bases %a 389mer). T+ere are :3;

possible permutations o se/uence in t+e mi*ture.'% "- menelas*an erancanan rmer PCR


9/17

/i. 0." Primer $esin. $n %c) inosine %$) is used to replacet+e our9old degenerate bases, giing eig+t possiblese/uences.



10/17

arian PCR2erse transcritase PCR (RT3PCR)

P# menggunakan m#NA sebagai templatDigunakan dalam penentuan tingkat ekspresi

gen Proses penyalinan m#NA memerlukan reerse

transcriptase Primer Oligo%dT) digunakan untuk mensintesis

untai pertama cDNA. Primer P# digunakan setela+ untai pertama

cDNA disintesis

'% "4 menelas*an reverse transcriptase PCR (RT3PCR)


11/17

/i. 0.# RT3PCR. %a) #eerse transcriptase is used to synt+esise a cDNAcopy o t+e m#NA. $n t+is e*ample oligo%dT)9primed synt+esis is s+on.%b) T+e cDNA product is amplifed using genespecifc primers. T+e initialP# synt+esis ill copy t+e cDNA to gie a duple* molecule, +ic+ is t+enamplifed in t+e usual ay. $n many kits aailable or #T9P# t+e entire

procedure can be carried out in a single tube.'% "4 menelas*an reverse transcriptase PCR (RT3PCR)


12/17'% "4 menelas*an reverse transcriptase PCR (RT3PCR)


13/17

. Neste$ PCR

'% "0 menelas*an nested-PCR

/i. 0.4 Neste$PCR.

%a)1tandard P#amplifcation o aragment using aprimer pair.

%b)$n t+e secondP#, a set oprimers t+at lieinside t+e frstpair is used toprime synt+esis oa s+orterragment. NestedP# can be used

to increase t+e


14/17

. RAPD3PCR

#andom amplifed polymorp+ic DNA

P# %#APD9P#) didasarkan padapenempelan primer ekurangan #APD9P#4 reproduktibilitasrenda+, yaitu kesulitan untukmemperole+ tingkat penempelan yang

sama pada percobaan berbeda.'% "8 menelas*an RAPD3PCR


15/17'% "8 menelas*an RAPD3PCR


16/17'% "8 menelas*an RAPD3PCR


17/17

TM 08 POLYMERASE CHAIN REACTION 2014.pptx

Documents

Transcript of TM 08 POLYMERASE CHAIN REACTION 2014.pptx