Title 大腸菌ミニFプラスミドの複製開始因子RepEの機能と構造( Dissertation_全文 )

Author(s) 石合, 正道

Citation 京都大学

Issue Date 1994-03-23

URL https://doi.org/10.11501/3075832

Right

Type Thesis or Dissertation

Textversion author

Kyoto University

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石合正道

,

●

主論文1

大 腸 菌 ミニFプ ラス ミ ドの複 製 開始 因子

RepEの 機 能 と構這

生物物理学専攻

石合正道

要旨

大 腸 菌 の ミニFプ ラス ミ ドは、 大 腸 菌 染 色 体 あ た り厳 密 に!-2コ ピー に保 た れ、

複 製 制 御 機 構 を解 明 す る モ デ ル系 と して こ れ まで多 くの知 見 を与 え て きた。 ミニF

プ ラ ス ミ ドの複 製 開 始 制御 に は ミニFの 卿E遺 伝 子 に コー ドされ る複 製 開始 因子

(RepE)が 中心 的 な役 割 を して い る。 さ らに、 大 腸 菌 染 色 体 複 製 に必 要 なDnaA、

DnaB、DnaC、Huな ど の 因子 に加 え、DnaK、DnaJ、GrpE熱 シ ョ ック蛋 白質 が必 要

で あ る。RepEは 、 複 製 開始 領 域(ori2)か ら複 製 を開始 させ る イ ニ シエ ー ター と、

repE遺 伝 子 の 転 写 を 自 己抑 制 す る リ プ レ ッサ ー と して の 主 要 な2つ の機 能 を もつ。

しか し、 この 異 な る機 能 が どの よ うな機 構 で発 揮 され るの か 明 らか で は な か った 。

本 研 究 で は、 ミニFプ ラス ミ ド複 製 にお け る熱 シ ョ ック蛋 白質 の作 用 機 構 を解 析

す る 目 的 で 、 は じめ にdnaJ変 異 株 で複 製 可 能 な変 異 ミニFを 多 数 分 離 し、解 析 し

た。 変 異 ミニFの 多 くは 理ρE遺 伝 子 内 に塩 基 置換 が あ り、 しか もほ とん どがRepE

の 中央 領 域 に集 中 して い た 。調 べ た変 異 はす べ て 、 大 腸 菌dnaJ変 異 株 だ けで な く

dnaK、grpE変 異 株 で も複 製 で きた。 これ らの解 析 か ら、 ミニFプ ラス ミ ド複 製 に

お い て熱 シ ョ ック蛋 白質 は協 調 的 に働 いて お り、 お そ ら くRepEの 活 性 化 に関 与 す

る こ と な どが 示 唆 され た 。 また 、 これ らの 変 異 を もつRepEの す べ て は 、 イ ニ シエ

ー ター 活 性 が 上昇 し、多 くは リプ レ ッサ ー活 性が 減 少 して い た。 中 で もRepE54は 、

非 常 に興 味 深 い こ とに、invivoでRepEの イ ニ シ エ ー ター活 性 が著 し く上 昇 し、 逆

に リ プ レ ッサ ー 活性 を ほ とん ど失 っ て い た。 この こ とは、RepEの2つ の機 能 が分

離 で き る こ と を示 して い る。

次 に、RepEの2つ の機 能 が どの よ うなRepEの 構 造 に対 応 す る の か を明 らか にす

る た め 、 本研 究 で は さ らに生 化 学 的 な解 析 を行 った。 精 製 したRepE54は 単 量 体 、

野 生 型RepEは 二 量体 と して安 定 で あ った 。 ゲ ル シ フ ト法 でDNAへ の結 合 活 性 を調

べ た とこ ろ 、invivoの 結 果 と一 致 して、RepE54はori2DNAに 非 常 に効 率 良 く結 合

した が ・ オ ペ レー ターDNAに は ほ とん ど結 合 しな か った 。 ま た、 野 生 型RepEを 蛋

白質変 性 剤 で処 理 す る と、o㎡2へ の結 合 が 上 昇 し、 同時 にオ ペ レー タ ーへ の結 合 が

減 少 した。 この 条件 で、 野 生 型RepEは 部分 的 に単 量体 に変 換 して お り、 さ らに、

面2へ の結 合 活 性 は単 量 体 に のみ検 出 され た。従 って、RepEの 単 量 体 はori2へ 結

合 し、 二 量 体 は オペ レー タ ーへ結 合 す る と結 論 され、 各 々がRepEの イ ニ シエ ー タ

ー、 リプ レ ッサ ー活 性 に対 応 す る と考 え られ る。

本研 究 の解 析 結 果 か ら、 ミニFプ ラス ミ ド複 製 制御 に お け るRepEの 機 能 と構 造

につ い て次 の よ うな作 業 仮 説 が た て られ た。RepEの 大 部分 は二 量 体 と して存 在 し、

オペ レー ターへ 結 合 して 自己遺伝 子 の転 写 抑 制 を行 う リプ レ ッサ ー と して機 能 す る。

RepE二 量 体 が 単 量体 に変 換 され る と、 単量 体 は 面2へ 結 合 し、 複 製 を開始 す る イ

ニ シエ ー ター と して機 能 す る。DnaJ、DnaK、GrpE熱 シ ョ ック蛋 白質 は分 子 シ ャペ

ロ ン と してRepEの 二 量 体 か ら単 量 体 へ の変 換 に関 与 して い る可 能 性 が高 い 。 この

結 果 は、 ミニFプ ラ ス ミ ド複 製 開始 にRepEの 構 造 変 換(二 量体 → 単 量 体)に よる

機 能 変 換 とい う正 の制御 が 重 要 で あ る こ とを示 して い る。

目次

第1章

第1節

第2節

第3節

第4節

第5節

序論

レプ リコン仮説

ミニFプ ラス ミ ドDNA複 製制御 における複製 開始領 域 の

構造 とRepEの 機 能

ミニFプ ラス ミ ド複製 におけ る宿 主 因子 の役 割

ミニFプ ラス ミ ド複製 にお ける熱 シ ョック蛋 白質 の役 割

本研 究 の 目的

1

2

5

6

8

第2章 材料 と方法 9

第3章 結 果

第1節 大腸菌熱 シ ョック蛋 白"RdnaJ変 異株 で複製可能 な

変異 ミニFプ ラス ミ ドの分離 と解析

第2節RepE蛋 白質 の単量体 、二量体 による機能分担

19

31

第4章 考察

第1節 ミニFプ ラス ミ ド複製 における熱 シ ョック蛋 白質 の役 割

第2節RepE蛋 白質 の構造 と機能

第3節RepEの 機i能 ドメイ ン

第4節 今後 の問題点

43

45

47

48

参考文献

謝辞

50

59

第1章 序論

第1節 レプ リコン仮 説

DNA複 製 の過 程 は 開 始 、伸 長 、 終 結 の3段 階 に大 別 す る こ とが で きる。 これ まで

主 に、 大 腸 菌 お よ びそ れ を宿 主 とす る フ ァー ジ 、 プ ラス ミ ドを実 験系 と して 、 そ の

各 段 階 の反 応 が か な り明 らか に され て きた 。特 に、イ申長 過程 に関 して は、 分 子 レベ

ル で ほ ぼ解 明 され た と考 え て よい 。 大腸 菌 な どの原 核 生 物 、 酵 母 、 ヒ トな ど の真 核

生 物 で も細 胞 周 期 に 同調 したDNA複 製 の制 御 機 構 が存 在 す る こ とが 、数 多 く知 ら

れ て い る(KornbergandBaker,1992参 照)。 ま た、Fプ ラ ス ミ ドも、 大腸 菌 染 色体

とは異 な るが 、細 胞 周 期 の特 定 の 時期 に複 製 す る(KeaslingetaL,1991;Koppes,

1992)。 こ の よ うな複 製 制御 機 構 を理 解 す る うえ で、 複 製 の 開始 段 階 に お け る制御

は きわ め て重 要 と考 え られ る。

これ を説 明 す るモ デ ル と して は レプ リ コ ン仮 説 が あ る(JacobetaL,1963)。 この

仮 説 で は、 自己複 製 単位 を レプ リ コ ン と名付 け、 複 製 開始 に必 要 な トラ ンス に働 く

複 製 開 始 因子(イ ニ シエ ー ター)と 、 イ ニ シエ ー ター が結 合 し複 製 開始 に シス に働

く領 域(レ プ リケ ー ター)の2つ の機 能 単 位 を想 定 した(図1)。 複 製 開始 は イ ニ

シエ ー タ ー に よ る正 の制御 を受 け、 イ ニ シエ ー タ ー の合 成 あ る い は活 性 の制御 に よ

り制御 され る 。 レプ リ コ ン と して 、大 腸 菌 、枯 草菌 な ど の原 核 生 物 の染 色 体 、 フ ァ

ー ジ、 プ ラ ス ミ ド、 真 核 細 胞 を宿 主 とす る一 部 の ウイ ルス(SV40な ど)な どが よ

く知 られ て い る。 な か で も プ ラス ミ ドは こ の仮 説 を実証 す る系 と して、 これ まで多

くの知 見 を提 供 して きた。 特 にFプ ラス ミ ドは、 宿 主 染色 体 あ た り1-2コ ピー に

保 た れ、 しか も安 定 に娘 細 胞 に受 け継 が れ て い くた め、 複 製 制御 機 構 を解 明 す るた

め の優 れ た モ デ ル系 と して、 重 要 な役 割 を果 た して きた。

1

◎ ●1し

◎.

～

Illitiator

、φ9●.

.Replicator

図1レ プ リ コ ン仮 説 の モ デ ル

説 明 は本 文 を参 照 。 文 献(Jacobetal.,1963)よ り改 変 して転 載 。

第2節 ミニFプ ラス ミ ドDNA複 製制御 における複製 開始領 域 の構 造 と

RepEの1機 能

大 腸 菌 の ミニFプ ラ ス ミ ドは性 決 定 因子(F因 子)由 来 で あ る。F因 子 ゲ ノ ム

DNA(945kb)をEk)oRI制 限酵 素 に よ り切 断 す る と19個 の 断 片 に分 け られ、 そ の

うちf5断 片(9.1kb)にFの 自律 複 製 能 が あ り、F因 子 レプ リ コ ンの持 つDNA複

製(on・ ㌍ρ)、 コ ピー数 調節(incC)、 娘細 胞 へ の分 配(s()p)な ど の機 能 が 集

約 して い る(図2A)(Kline,1985参 照)。 ミニFプ ラ ス ミ ドの機 能 的 な最小 領 域

は、 複 製 開 始 点(ori2)と 理ρE遺 伝 子 のみ か らな る1.1kbの 断 片 で(Murotsuetal.

,1984>、 我 々 は、 これ に ア ン ピシ リ ン耐性 のbla遺 伝 子 を結 合 した最 小 ミニFプ ラ

ス ミ ド(pKV5110)を 作 成 し、DNA複 製 開 始 調 節 を解析 して い る。 この プ ラス ミ ド

は 、 コ ピー数 を負 に制御 す るincC領 域 を欠 失 してい る ため 、 コ ピー数 が 上 昇 して

い る(細 胞 当 た り約10-15コ ピー)(Kawasakietal.,1991)。

ori2領 域(217bp)に は、2個 の大 腸 菌 染 色 体DNA複 製 の イ ニ シエ ー ター蛋 白質

(DnaA)の 結 合 部 位(DnaABox:5・-TrAT(A/C)CACA-3・)、AT配 列 に富 む 領

2

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1

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監階 ↑ ↑灘lrInitiatorRepressor

RepEprotein

図2F因 子 のf5断 片 とミニFプ ラス ミ ドの複 製制 御 の模 式 図

A.F因 子 のf5断 片 の制 限酵 素 地 図 を上 側 に、既知 の遺伝 子 ま

た は遺伝 子 産 物(矢 印)、 領域(棒 線)を 下側 に示 した。説 明 は

本 文 参 照 。

B.ミ ニFプ ラス ミ ドの最小 領 域 での複 製 制御 の概 略。RepE蛋

白質が結 合 す る イ テ ロ ン とオペ レー ター部 分 で共 通 な塩 基配 列 に

下 線 を引 いた。 詳細 な説 明 は本 文参 照。

3

域 、4個 の19bp(イ テ ロ ン)の 反 復 配 列 か らな るincB領 域 な どの特 徴 的 な構 造 が

見 られ る(図2B)(Kline,1985参 照)。 こ の よ うな 、oriの 構 造 は 大腸 菌 な どの

細 菌 の染 色 体(oriC)、P1、pSC101、R6K、RK2、Rts1な どの プ ラス ミ ド、λな

どの フ ァー ジ に も基 本 的 に共 通 して み られ 、 複 製 開始 の た め の基 本 的 な構 造 と考 え

られ る(図3)(BramhillandKornberg,1988)。

ミニFプ ラス ミ ドのrepE遺 伝 子 産 物(RepE蛋 白質)は 、250ア ミ ノ酸 残 基 よ り

な る29kDaの 塩 基 性 蛋 白質 で、 部 位 特 異 的 なDNA結 合 蛋 白質 で あ る。RepEは ミ

ニFプ ラス ミ ド複 製 に 中心 的 な役 割 を して お り、invivo、il?vitrて)の 両 方 で複 製 開 始

に必 須 で あ る こ とが 証 明 され た(Watsonetal.,1982;TolunandHelinski,1982;Makiet

al.,1983;Muraisoetal.,1987)。RepEはori2か らの複 製 を開 始 す る イ ニ シエ ー ター

と、 自 己 遺伝 子 の転 写 抑 制 を行 う リプ レ ッサ ー と して の主 要 な2つ の機 能 を持 ρ

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図3

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複 製 開 始 領 域 の構 造 の類 似 性

説 明 は本 文 参 照 。 文 献(BramhillandKornberg,1988)よ り転 載 。

4

12,12,11

1η,1q,15

13,11

7,6,7,717

8,8,8,8.

9,9,9

9,8,10

9,11,10

11,11

5,6,6

9,8,9,8

9,8,9

(S¢gaard-Andersenetal.,1984;TrawickandKline,1985)。 こ れ らの 機 能 に は 、o㎡2

内 の4個 の19bp配 列(イ テ ロ ン)、 理ρE遺 伝 子 の プ ロ モ ー タ ー の 一10領 域 に あ る

パ リ ン ド ロ ー ム 配 列(オ ペ レ ー タ ー)に 、 そ れ ぞ れRepEが 結 合 す る こ とが 必 須 で

あ る(図2B参 照)。 こ の イ テ ロ ン と オ ペ レ ー タ ー に は 共 通 の8bpの 配 列 が あ り(

Murotsuetal.,1981)、RepEは そ の 配 列 に結 合 す る こ とがDNaseIフ ッ トプ リ ン テ ィ

ン グ 実 験 に よ り明 ら か に さ れ た(Tokinoetal .,1986;MassonandRay,1986)。RepE

はori2の19bp配 列 と相 同 な 配 列 が5個 存 在 す るincC領 域 に も結 合 す る(Tokinoet

al.,1986;MassonandRay,1986)。RepEは 異 な る い くつ か の 方 法 で 精 製 さ れ た が 、

い ず れ も二 量 体 で あ っ た 。 こ の 二 量 体 が 副2、 オ ペ レ ー タ ー 領 域 に結 合 す る と考 え

られ て き た が 、RepEの2つ の 機 能 が ど の よ う なRepEの 構 造 に 対 応 す る の か 未 解 決

で あ っ た(Tokinoeta1.,1986;MassonandRay,1986,1988;Klineeta1,1992;Kawasakiet

al.,1992)。

P1、pSC101、R6K、Rts1な ど の プ ラ ス ミ ドに お い て も、 そ れ ぞ れ ミ ニFプ ラ ス

ミ ドのRepEに 相 当 す る 複 製 開 始 蛋 白質(イ ニ シ エ ー タ ー 蛋 白 質)が 存 在 し、 こ れ

ら の 蛋 白 質 の 発 現 も ミ ニFのRepEと 同 様 に 自 己 遺 伝 子 の 転 写 抑 制 に よ り調 節 され

て い る 。 ま た 、 こ れ ら の イ ニ シ エ ー タ ー 蛋 白 質 も各 々 の プ ラ ス ミ ドの 複 製 開 始 領 域

(αゴ)に 結 合 す る こ と が 知 ら れ て い る(KornbergandBaker,1992参 照)。 しか し、

こ れ ら の 蛋 白 質 の複 製 開 始 調 節 に お け る作 用 機 構 の 詳 細 に つ い て も、 よ くわ か っ て

い な い 。

第3節 ミニFプ ラス ミ ド複製 におけ る宿主 因子 の役割

ミニFプ ラ ス ミ ドの複 製 開始 には 、第2節 で述 べ た プ ラス ミ ド側 の要 素 に加 え、

宿 主 大 腸 菌 の 因子 に も依 存 す る。 な か で も大 腸 菌 染 色 体 の複 製 開 始 蛋 白質(DnaA)

は、 ミニFプ ラス ミ ド複 製 に も必 須 で あ り、前 述 の よ う にそ の結 合 部位(DnaAbox)

は ミニFのori2領 域 に も存 在 す る(KlineetaL,1986;HansenetaL,1986;Murakamiet

5

al.,1987)。 こ の ほ か、DnaB、DnaC(KornbergandBaker ,1992参 照)、 ピス トン様

蛋 白質 で あ るHu(WadaetaL,1988)な ど も、 ミニF複 製 に必 須 で あ る。

ま た、 大 腸 菌1poH変 異 株 で は、 ミニFプ ラス ミ ド複 製 は阻 害 され る(Wadaetal .,

1986)。rpoH遺 伝 子 産 物(σ32)は 、 大 腸 菌 の熱 シ ョッ ク応 答 に 中心 的 な役 割 を し

て お り、RNAポ リメ ラー ゼ の コァ酵 素 と結 合 し、 特 異 的 に熱 シ ョック プ ロモ ー タ

ーか らの転 写 を引 き起 こす(Grossetal.,1990参 照)。 ・poH変 異 株 に お け る ミニF

複 製 阻害 機 構 の解 析 か ら、 プ ラス ミ ド上 の 理ρE遺 伝 子 の転 写 は主 に ♂2RNAポ リ

メ ラ ー ゼ に よ り行 わ れ る こ と(Wadaetal.,1987)、 さ ら に、 ミニFプ ラ ス ミ ドの複

製 開始 に ♂2支 配 下 にあ る大腸 菌 の熱 シ ョ ック蛋 白質DnaK、DnaJ、GrpEが 必須 で

あ る こ とが 明 らか とな っ た(Ezaldetal.,1989;Kawasakietal.,1990)。

第4節 ミニFプ ラス ミ ドDNA複 製 における熱 シ ョック蛋 白質の役 割

dnaK、dnaJ、grpEは 、 も と も と λ フ ァ ー ジDNA複 製 に 関 与 す る遺 伝 子 と し て見

つ か っ た 。 λ フ ァ ー ジDNA複 製 系 に お け る こ れ ら の 蛋 白 質 の 役 割 は 、 複 製 開 始 領

域((mX)に お い て λ0蛋 白 質 、 λP蛋 白 質 、DnaBヘ リ カ ー ゼ に よ る複 製 開 始 複 合

体(preprimosomalcomplex)形 成 を介 添 し、DnaK、DnaJのATP加 水 分 解 を伴 っ て

DnaBヘ リ カ ー ゼ を活 性 化 す る こ とで あ る 。GrpEは 、 こ の 反 応 中 で のDnaKの 要 求

性 を減 少 させ る(Georgopoulosetal.,1990参 照)。

ミニP1プ ラ ス ミ ド複 製 に もinvivo、invitroの 両 方 で 、DnaJ、DnaK、GrpEが

必 須 で あ る こ とが 示 さ れ た(Tillyetal.,1989;Bukauetal.,1989;Wickner,1990)。 こ

の系 で は イ ニ シ エ ー タ ー 蛋 白 質RepA二 量 体 が こ れ ら の熱 シ ョ ッ ク 蛋 白 質 に よ り単

量 体 に 変 換 され 、RepAが 活 性 化 し、oriへ 結 合 す る と考 え ら れ て い る(Wic㎞ere`

a乙,1991a,1991b,1992)。

大 腸 菌 染 色 体 複 製 に お け る熱 シ ョ ッ ク 蛋 白 質 の 関 与 と し て は 、 まず 、 高 温 でoric

か ら のDNA複 製 開 始 阻 害 を示 すdnaKU1変 異 株 が あ げ られ る(Sakakibara,1988)。

6

ま た 、invitroのoriCプ ラ ス ミ ド複 製 系 で は 、 複 製 能 が 低 いDnaA46 、DnaA5変 異 蛋

白質 の複 製 活 性 がDnaK、 ま た はGlpEに よ り回 復 す る こ と(HwangandKaguni ,

1991;HuppandKaguni,1993a)、 ア グ リゲ ー トし不 活 性 化 し た 野 生 型DnaAが

DnaKに よ り活 性 化 す る こ と が 報 告 され て い る(Hwangetal .,1990)。 こ れ ら の 熱 シ

ョ ッ ク 蛋 白 質 に よ るDnaAの 活 性 化 は 、DNA複 製 開 始 反 応 以 前 に お こ る が 、 詳 細 な

分 子 機 構 は 明 ら か に さ れ て い な い(Hwangetal.,1990;HuppandKaguni,1993b)。

DnaK(HSP70ホ モ ログ)、DnaJは 生 物 種 を通 じよ く保 存 され、GrpEも 少 な く と

も酵 母 か らそ の ホ モ ロ グが 見 つ か っ て お り、 これ ら は共 同 して細 胞 内 の い ろい ろな

反 応 に分 子 シ ャペ ロ ン と して機 能 す る こ とが知 られ て い る(Georgopoulosetal.,

1990;Grossetal.,1990;Caplanetal.,1993;IkedaandToh-e,1993参 照)。

dnal遺 伝 子 は 、大 腸 菌染 色 体0.3分 に存 在 し、dnaK遺 伝 子 とオペ ロ ン を形 成 して

い る。dnal遺 伝 子 を欠 失 させ る と大 腸 菌 は43℃ 以 上 で生 育 で き な くな る た め、 高

温 で の増殖 に必 須 で あ る(Selletal.,1990)。dnaJ変 異 株 は 、非 許 容 温度 下 でDNA、

RNA合 成 を 阻害 し、 細 胞 周 期 や、細 胞 内 の他 の蛋 白質 の安 定 化 に影 響 す る な どの

報 告 が あ る(Georgopoulosetal.,1990参 照)。DnaJ(375ア ミ ノ酸 残 基 、分 子 量41

kDa)は 二 量 体 の塩 基 性 蛋 白質 で 、 お も に膜 画分 に存 在 し、 一 本 鎖 、 二 本 鎖DNAに

非 特 異 的 に結 合 す る(Zyliczetal.,1985)。 大 腸 菌 のDnaK、DnaB、 λ フ ァー ジ のP

蛋 白質 と相 互 作 用 す る こ と(Georgopoulosetal.,1990参 照)、P1プ ラス ミ ド複 製

開 始 蛋 白質(RepA)と 複 合 体 を形 成 す る こ と も報 告 され て い る(Wickner,1990)。

従 っ て、DnaJは 細 胞 内 で多様 な機 能 を持 つ と考 え られ るが 、 そ の詳細 な分 子機 構 は

まだ 明 らか に され て い な い(Georgopoulosetal.,1990;GrossetaL,1990;Caplanetal.,

1993参 照)。

7

第5節 本研究 の目的

我 々は、 ミニFプ ラス ミ ド複製 開始制御 にお ける熱 シ ョック蛋 白質 の作用機構 を

詳細 に解析 す る目的 で、 まず、遺伝 学的解析 に よ り、dnal変 異株 で複 製 で きる変異

ミニFを 分離 し、解析 を始めた。 この解析 に よ り、熱 シ ョック蛋 白質 が ミニFプ ラ

ス ミ ドの複製 開始 因子RepEの 活性化 に作用 している可能性 が示唆 され た。 また、

RepEの 主 要 な2つ の機 能(イ ニ シエ ーター、 リプ レッサ ー)を 区別で きるrepE変

異 を分離 す るこ とが で きた。 これ までRepEの2つ の機 能が どの ようなRepEの 構

造 と対応 す るのか明 らか に されてなか ったので、 これ らの変異RepEを 精製 し、 さ

らに生化学 的な研 究 を行 った。 これ らの結 果 を報告 す る。

8

第2章 材料 と方法

2・1大 腸 菌株

本 研 究 で使 用 した菌 株 を表1に 示 す 。BL21はB株 、 そ れ以 外 は全 てK12株 で あ

る。 遺伝 学 的解 析 の多 くに はMC4100株 、 お よび熱 シ ョッ ク蛋 白質 遺伝 子 に変 異 を

持 つ 誘 導 株 を使 用 した 。KY1453、KY1454、KY1455、KY1456株 はそ れ ぞ れ

KY1457、DA16、CAG13350、CG992株 か らdnaJ259、grpE280、dnaK204、

dnaJ::Tn10-42変 異 をMC4100株 にPlvfrフ ァー ジ を用 いた普 遍形 質導 入 に よ り移 し、

テ トラサ イ ク リ ン耐 性 と温度 感 受 性 で選択 した。

2・2プ ラス ミ ド

本 研 究 に使 用 した プ ラ ス ミ ドを表2に 示 す。 ミニFプ ラス ミ ドお よび そ の誘 導 プ

ラス ミ ドは 図4Aに 、pKV7190の 構造 と説 明 は 図6Aに 示 した。pKV531、

pKV739は 塑ρE遺 伝 子C末 端 領 域 に フ レー ム シ フ ト変 異(repE602)を 持 つ こ と以

外 は、 そ れ ぞ れpKV5110、pKV7190と 同一 で あ る(図4B)。pKV740は ミニFプ

ラス ミ ドとpBR322の コ ンポ ジ ッ トプ ラス ミ ドでRepEのC末 端 か ら57ア ミノ酸 残

基 欠 失 した変 異RepE蛋 白質(RepE△C57)を 産 生 す る。pBK815はpET3b(Studier

etal.,1990)のT7プ ロモ ー ター の下 流 に野 生 型repE遺 伝 子 をつ な い だ プ ラ ス ミ ド

で 、T7RNAポ リメ ラ ー ゼ に よ りRepEの 発 現 が 著 し く増 大 す る(Kawasakietal.,

1992)。 解 析 に使 用 した ミニF変 異 を持 つ プ ラス ミ ドは 、 始 め に分 離 した変 異 ミニ

FのSmal-EcoRV断 片(635bp>又 は、3り ・1断片(647bp)を 野 生 型 プ ラス ミ ドの対

応 す る断 片 と組 み 替 え て作 成 した 。 ミニF変 異 を持 つ プ ラス ミ ドは、 す べ て シ ー ク

エ ンシ ン グ に よ り構 造 を確 認 した 。

9

表1使 用 した菌株

Strains Relevantgenotype Reference

MC4100

KYl453

KY1454

KY1455

KYl456

KY1457

KY1603

NRK156

CAG13350

CG992

DA16

MT852

KD1087

MA194

BL21

F-araD△(argF-・1ac)Ul69rl)sLre1AflbB

deoCptSFrわsR

MC4100dnaJ259car-96::Tn10

MC4100grpE280pheA::Tn10

MC4100dnaK204thr.:Tn10

MC4100dnaJ:Tn10-42

MT852car-96::Tn10

MC4100△rpoH3α:kanzth-5α:Tn10

suhX401(λpF13-PrpoD-1acZ)

MC4100dnaK756thr-34::Tn10

MC1061dnaK204thr.:Tn10

B178dnaJ:Tn10-42

DA15grpE280

RB85TdnaJ259thrt飴y≠

F-mロ の5△(tonB-mPA,B)1euargE

hi∬pcA

AT2358m厩Tl

F'OI叩T

Casadaban1976

Thiswork

Thiswork

Thiswork

Thiswork

Thiswork

KusukawaandYura1988

Kawasakiαa孟1990

Wildαa孟1992

Selle`a孟1990

Ange`a孟1986

Wadae`an982

DegnenandCox1974

AkiyamaetaL1987

StudieretaL1990

10

表2使 用 した プラス ミ ド

Plasmids Relevantgenotype Reference

pKV5110

pKV531

pKV711

pKV718

pKV7190

pKV739

pKV740

pBK815

pLysS

pACYC184

01ゴ2repE≠1)la

pKV5110repE602

pKV7090Ptrp-△repE

ori2bla

α ゴ(pMB1)trpRcatPmp-repE+

pKV7190repE602

pKV5110ri(pMB1)脚 石△C57

0ri(pMB1)T7promoter-reρE+

Olゴ(p15A)oa`

phageT71ysozyme

ori(p15A)cat

Kawasakie`a孟1991

Thiswork

Kawasakie`a孟1991

Kawasakie`a孟1991

Kawasakiαa孟1991

Thiswork

Thiswork

Kawasakiα ∂孟1992

Studiere`a孟1990

ChangandCohen1978

11

AXSt HSm St E一

1》>>>レ ー ■■■■一 一 闘一 一 ■一 ■■一 ■ ■〉

XSt

9護》lllol

ori2PreρE

H Sm

reρE

St

1E

h

pKV718

pKV7190pKV739

XStH亡Sm

Ptrpレ11

St E

[

B

「eρE≠GATATCACTTCCATGACGACAGGATAG

(pKV5110pKV7190)DlTSMTTG*

　　　　　

rθpE602GATATC尺 πCCATGACGACAGGATAG

(pKV531pKV739)DllP・

247244

図4ミ ニFプ ラス ミ ドお よび ミニF由 来 の 断片 を持 つ プ ラス ミ ドの物 理 地 図

A.ミ ニFフ.ラ ス ミ ドのori2、repE遺 伝 子 領 域 を最 上 段 に示 した 。 黒 の 矢 じ

りは フ.ロ モ ー タ ー を、 白 の 矢 じ りは19bpの 配 列(イ テ ロ ン)を 示 す 。

pKV5110、pKV531、pKV718は こ こ に示 したDNA断 片 以 外 に、 ア ン ピ シ リ ン

耐 性 のbla遺 伝 子 を持 つ 。pKV7190、pKV739はpBR322由 来 でmpプ ロ モ ー ター の 下 流 にrepE遺 伝 子 が つ な が っ て い る

。X,Xhol;St,Styl;H,Hinfl;Sm,Smal;

E,EcoRV制 限 酵 素 サ イ トを示 す 。

B.野 生 型 及 びrepE602フ レー ム シ フ ト変 異 のrepE遺 伝 子 のC末 端 部 分 の 塩

基 配 列 及 び 推 定 さ れ る ア ミ ノ酸 残 基 配 列 。 矢 じ りは 、repE602変 異 の1塩 基 の

欠 失 部 分 を示 す 。EcoRV制 限 酵 素 サ イ トを下 線 で 示 した。

12

2・3培 地

L培 地 一1%バ ク ト トリ プ トン 、05%イ ー ス トエ キ ス トラ ク ト、05%NaCl、1

MNaOHに よ り、pH7 .4に 調 製 した 。

ME培 地 一一〇・02%MgSO、 ・0・2%ク エ ン酸1 .0%K、HPO、 、0.35%N・NH、HPO、 。

本 研 究 で は2pg/m1ビ タ ミ ンB1、0.5%グ ル コ ー ス 、0 .5%カ ザ ミ ノ酸 、 さ ら に必

要 に 応 じL一 ト リ プ トフ ァ ン を加 え た 。

MA培 地 一一1.0%K2HPO4、0.45%KH2PO4、0 .1%(NH4)2SO4、0.05%ク エ ン酸 、1

mMMgSO4。 本 研 究 で は1μ9/mlビ タ ミ ンB1、1μ9/mlビ オ チ ン、0 .2%グ ル コ ー ス

を 加 え た 。

培 地 には 、必 要 に応 じ50μ9/mlの ア ン ピ シ リ ン、20μ9/mlの ク ロ ラ ム フ ェ ニ コー

ル・12・5μ9/mlの テ トラサ イ ク リン を添 加 した。 栄 養 要 求 性 の菌 株 に は、20μ9/ml

のチ ミン、 ウラ シ ル、50μ9/mlのL一 ア ミノ酸 を必 要 に応 じて加 え た。 寒 天培 地 には、

1.2%の 寒 天 を含 む 。

2・4形 質 転 換 、Pl普 遍 形 質 導 入

形 質 転 換 はHanahanの 方 法 に よ り行 っ た(Hanahan,1983)。P1普 遍 形 質 導 入 は

Plvirフ ァ ー ジ を用 い 、Silhavyの 方 法 に従 っ た(SilhavyetaL,1984)。

2・5遺 伝 子 組 換 え に関連 す る実験 技 術

プ ラ ス ミ ドDNAの 調 製 、 制 限酵 素 反 応 、DNA断 片 問 の結 合 、DNA末 端 の リ ン酸

化 、脱 リ ン酸 化 、 電気 泳 動 、 ゲ ル か らのDNA断 片 の 回収 な ど は標 準 的 な方 法 に よ

った(Sambrooketal.,1989)。DNAの 合 成 には 、AppliedBiosystem社 の モ デ ル

380Bを 使 用 し、 方 法 は説 明書 を参 考 に した。PCRに よ るDNAの 増 幅 は、Perkin

ElmerCetus社 の 自動 増 幅装 置 を用 い、GeneAmpDNAAmplificationKit(PerkinElmer

Cetus社)を 使 用 した。 方 法 は説 明 書 に従 っ た。DNAの 塩 基 配列 の決 定 には、

13

SequenaseDNAsequencingKit(USB社)を 使 用 し、 方 法 は説 明 書 に よ っ た。PCR法

に よ り増 幅 したDNAや プ ラ ス ミ ドDNAを 鋳 型 と して用 い た。

2・6プ ラス ミ ドDNAの 突 然 変 異 誘発

突 然 変 異 が 高 頻 度 に お こ る ミュ ー テ ー タ ー遺伝 子 を持 つKD1087株(mutD5)ま

た は、MA194株(mutT1)で ミニFプ ラス ミ ド(pKV531)を 複 製 させ 、変 異 を導

入 した。 この 条件 で 、大 腸 菌染 色 体 上 の遺伝 子 の突 然 変 異 率(具 体 的 に は 、gyrB遺

伝 子 の変 異 に よる ナ リジ キ シ ン酸 耐 性 菌 の 出現 頻 度)を 調 べ た結 果 、 野 生 型 の 親株

に比 べ 、mロ の5株 で約1x106倍 、mutTl株 で約1x103倍 の突 然 変 異 率 の 上 昇 が み

られ、 これ らの株 で複 製 させ た ミニFも 高 頻 度 で変 異 を持 つ こ とが期 待 され る。独

立 な変 異 で あ る こ とを確 実 に す る た め、 形 質転 換 体 をそ れ ぞ れ別 々 に約20世 代 培

養 した もの か ら プ ラス ミ ドDNAを 調 製 した 。

これ とは別 に、 ミニFプ ラス ミ ド(pKV531)を37℃ 、0.4Mヒ ドロ キ シ ル ア ミ

ンで26時 間反 応 させ 、 突 然 変 異 を導 入 した 。 こ の処 理 で は、 確 率 的 に プ ラス ミ ド

DNAあ た り1個 の点 突 然 変 異 が お こ る こ とが期 待 され る(HashimotoandSekiguchi,

1976)。

2.7大 腸 菌dnaJ259変 異株 で複 製 可 能 な変 異 ミニFプ ラス ミ ドの分 離

大 腸 菌dna/259変 異 株 を野 生 型 ミニFプ ラ ス ミ ド(pKV5110)で 形 質 転 換 し、30

℃ で ア ン ピ シ リ ン耐性 で 選択 す る と、 多 くの不安 定 な疑 似 形 質 転換 体が 観察 され る。

こ れ は 、変 異 ミニFプ ラス ミ ドを分 離 す る た め に は大 変 不 都 合 な問 題 で あ っ たが 、

鴛ρE遺 伝 子 のC末 端 に フ レー ム シ フ ト変 異(repE602)を 持 つ ミニF(pKV531)を

使 う こ とで 解 消 で き た。 こ の プ ラ ス ミ ドは 、大 腸 菌 野 生株 にお い て正 常 に複 製 で き

(コ ピ ー数 は8-10でpKV5110よ りわ ず か に少 な い)、 か つ 、dnal259変 異 株 で全

く複 製 で きず 、 疑 似 形 質 転 換 体 は全 くみ られ な い ため(lshiaietaL,1992)、

pKV531を 親 プ ラス ミ ドと して用 い た 。

14

2・6で 述 べ た 方 法 で突 然 変 異 を誘発 したpKV531DNAをMT852株(dna/259)

に導 入 し、30℃ で ア ン ピ シ リ ン耐 性 の 形 質 転 換 体 を分 離 した。 得 られ た形 質 転 換

体 か らプ ラス ミ ドDNAを 調 製 し、 高 頻 度 で 、MT852株 を形 質 転 換 で きる もの を さ

ら に解 析 した 。 内 訳 は、mutD5株 処 理 か ら32個 、mutTl株 処 理 か ら2個 、 ヒ ドロ

キ シ ル ァ ミン処 理 か ら15個 、合 計49個 で あ る。

2・8リ プ レ ッサ ー活性

MC4100(λ 一PrepE-1acZ)株 とpKV7190(又 はそ の誘導 プラス ミ ド)を 使 用 した 。

プ ラス ミ ド上 の 卸 プ ロモ ー タ ー か ら野 生 型 また は変 異RepEが 発 現 し、 そ の量 は培

地 中 の レ トリ プ トフ ァ ン濃 度 に よ り制御 で き る。 培 地 中 の トリプ トフ ァン濃度 が

上 昇 す る に つ れ て 、発 現 す るRepE量 は減 少 す る(図6参 照)。 これ らの細 胞 内 で

は、 トラ ンス に供 給 され たRepEが λ プ ロ ファー ジ上 のrepEオ ペ レー ター に結 合 し、

β一ガ ラ ク トシ ダー ゼ(1acZ遺 伝 子 産 物)の 発 現 を抑 制 す る。従 っ て 、 β一ガ ラ ク ト

シ ダ ー ゼ の活 性 を測 定 す る こ と に よ り、見 か け上 のRepEの リプ レ ッサ ー活 性 を知

る こ とが で き る(図7A参 照)。 そ れ ぞ れ の菌 を ク ロ ラ ム フ ェ ニ コー ル 、0、5、

10ま た は 、50μ9/mlのL・ トリプ トフ ァン を含 むME培 地 を用 い て30℃ で3x108

細 胞/mlま で培 養 し、 β一ガ ラ ク トシ ダー ゼ 活性 の測 定 を行 っ た(Kawasakietal.,

1991)。

2・9イ ニ シエ ー ター活 性

MC4100株 とpKV7190(又 はそ の 誘導 プ ラ ス ミ ド)、ori2プ ラス ミ ド(pKV718)

を使 用 した 。ori2プ ラス ミ ドの複 製 は、 トラ ンス に供 給 され たRepEに 完 全 に依 存

す る の で 、 α氾 プ ラ ス ミ ドの コ ピー 数 はRepEの 見 か け上 の イ ニ シエ ー ター 活性 を

反 映 して い る(図8A参 照)。 そ れ ぞれ の菌 を ア ン ピシ リ ン、 ク ロ ラ ム フ ェニ コー

ル 、50μ9/mlのL一 トリプ トフ ァ ン を含 むME培 地 を用 い て30℃ で培 養 し・ プ ラ ス

ミ ドDNAを 調 製 し、EcoRIで 処 理 した後 、 ア ガ ロー ス ゲ ル 電気 泳動 した。DNAバ

15

ン ド を デ ン シ トメ ー タ ー で 走 査 し、 コ ピ ー 数 はpKV718とpKV7190の 比 で 表 し た

(Kawasakieta1.,1991)。

2.lOβ 一ガ ラ ク トシ ダー ゼ 活性 の測 定

文 献(Miller,1972)に よった。30℃ で対 数 増殖 期 の培 養液(ク レ ッ トユ ニ ッ ト50)

を採 取 した後 、緩 衝 液 を加 えて細 胞 を破 砕 し、 β一ガ ラ ク トシ ダー ゼ に よるONPG

の分 解 に伴 う発 色 を分 光 光 度 計(Beckman社DU-64)で 測 定 した。

2・11イ ム ノ ブ ロ ッテ ィ ン グ

サ ン プ ル をSDS-PAGE後 、GVフ ィ ル タ ー(Millipore社)に プ ロ ッ テ ィ ン グ し 、

ウサ ギ 由 来 の 抗RepE一 次 抗 体 、 抗 ウサ ギ ニ 次 抗 体(Amersham社)、horseradish

peroxidase(Amersham社)と 順 次 か け て い き、 コ ニ カ イ ム ノ ス テ イ ンHPR(コ ニ カ

社)又 は 、ECLWestemblottingdet㏄tionreagents(Amersham社)を 用 い検 出 し た(

Kawasakieta1.,1991)。

2・12RepEの 精 製

野 生 型 及 びRepE54を 除 く変 異RepEの 精 製 法 は 基 本 的 に 文 献 の 記 載 に従 い(

Klineetal.,1992;Kawasakietal.,1992)、RepE54の 精 製 は い くつ か の 変 更 を し た 。

pLysSとpBK815(又 はpBK815にrepE変 異 を 導 入 し た 誘 導 フ。ラ ス ミ ド)を 持 つ

BL21(λDE3)株 を ア ン ピ シ リ ン、 ク ロ ラ ム フ ェ ニ コ ー ル を含 むL培 地 を用 い て 、

37℃ で600nmの 吸 光 度 がO.4に な る ま で 培 養 し、IPTGを05mM加 え 、3時 間 さ

ら に 培 養 し た(IPTGに よ りT7RNAポ リ メ ラ ー ゼ が 発 現 し、 最 終 的 にRepEが 大 量

発 現 さ れ る)。 集 菌 後 、Tris-0.45MKClバ ッ フ ァ ー(20mMTris-HCIpH7.5、0.1

mMEDTA、450mMKCI、10mMβ 一mercaptoethanol、10%glycerol)中 で ソ ニ ケ ー シ

ョ ン に よ り細 胞 を破 砕 し、30,000xgで15分 間 遠 心 した 。RepE54を 除 く変 異RepE

お よ び 野 生 型RepEは 沈 殿 画 分 に あ り、 こ れ を5M塩 酸 グ ア ニ ジ ン で 溶 解 し た 。

16

RepE54は 上 清 画 分 に あ り・ さ ら 。こ15・,・…gで 塒 間 遠 心 し

、 そ の 上 清 をDEAE-

sepha㏄1カ ラ ム(Ph・ ・maci・LKB3± 〉 へ か け、 報 緬 分 を 回 収 し た

.そ れ ぞ れ の

RepEをMES-0 ・3MKCIバ ツ フ ァ ー(2・mMMES -K・HpH6.・、 。.1mMEDTA、3。 。

mMKC1・10mMβ 一m・・cap・…h・n・1・1・%91yce・ ・1)で 透 析 し

、FPLC陽 イ オ ン交 換 カ

ラ ム(M・n・SHR5/5・Pharmaci・LKB社)、FPLCサ イ ズ カ ラ ム(S、p,,。 、e12HR

lO/30;Pha「maciaLKB社)1こ か け た・ 野 生 型 及 びR・pE54を 除 く変 異R,pEは こ の標

品 を 噺 に用 い た が ・R・pE541まT・is 一α45MKC1バ ・ フ ァ ー で 透 析 し、FPLC陰 イ

オ ン交 換 カ ラ ム(M・n・QHR5/5・Ph-ci・LKB社)で ア イ ソ ク ラ ク テ イ ク に 展 開

し・ さ ら に 精 製 し た ・ 精 製 は4℃ で 行っ た ・2・ ・m1の 培 養 液 か ら約1mgの 骸

RepE(純 度99%以 上)を 得 た(図9A参 照)。

2・13RepEの 濃度 の決 定

日立L-8500ア ミノ酸分 磯 で激 を測定 したR・pE襯 を対 照 と して、 精 製

RepEの サ ン プル を 同 じゲ ル 中 でSDS -PAGEを 行 い、 クマ シ ー ブ ル ー(CBB)で 染

色 後 ・ ゲ ル を デ ン シ トメ ー ター で走 査 し濃 度 を測定 した。

2・14RepEの 分 子 量 の決 定

鮪 レーザ ー光 散 乱 法(LALLS法)と、 沈 髄 度法 の異 なる2つ の方 法 を用 い た

.

L肌S法 を用 い たR・pEの 分 子 量 決定 は・ 献 の方 法 に従 ・・(T。k、gi

,1981)、 東

レ'リ サ ー チ セ ン ター に依 頼 した・精 製R・pEを サ イ ズ カ ラム(S。p,,dex75HR

10/30:Ph・ ・maci・LKB社)を イ吏用 して ゲ ル濾 過 し、UV計(28・ 。m)(島 潮

SPD"2A)・LALLS計(H・-N・ レーザ ー;633・m)(Chr・m、・i。3±KMX-6)、 示差

屈 折 計(W・ ・ers杜R4・1)で 検 出 した・nv定 は、MES一 α5MKC1バ ッ フ ァー をイ吏用

し・23℃ で行 っ た・R・pEの 屈 折 率 厳 変 化(d・/d・)を 鹸 測 定 す るか わ りに、分

子 量 既 知 の 蛋 頗 で 同 じ測定 を行 った・ 理 論 的 に、 分 子 量 はLALLS計 の出 力 と示

差 屈 折 率 計 の出 力 の 比 に比 例 す る(Takagi,1981)。

17

沈 降 速 度 法 は、Beckman社 の分 析 用 超 遠 心 機(OptimaXL-A)を 使 用 した(Olsen

etal.,1992)。 分 析 用 超 遠 心 に用 い たサ ンプ ル の濃 度 は280nmの 吸光 度 で、 野 生 型

RepEが0.2、RepE54が0.4で あ り、 ゲ ル シ フ ト法 のバ ッフ ァー(後 述)か らBSA、

poly(dl-dC)、 プ ロ ー ブDNAを 除 い た もの を使 用 した。 実 験 条 件 は 、 ロ ー ター 回転

速 度50,000rpm、1時 間 、25℃ で6分 毎 に測 定 した。

2・15RepEのDNA結 合 活 性 の 測 定

ゲ ル シ フ ト法 に よ っ た(Kawasakietal.,1992)。 プ ロ ー ブDNAは 、 ミニFプ ラ ス

ミ ド をStul、Alul、Smalで 切 断 し、 ア ガ ロ ー ス ゲ ル 電 気 泳 動 後 、130bpのori2

DNA断 片 と180bpの オ ペ レー タ ーDNA断 片 を回 収 し、AlkarinePhosphatase処 理 後 、

T4PolynucleotideKinaseを 用 い 、[γ一32P]-ATPでDNAの 末 端 を ラ ベ ル し、 作 成 し た

(図10参 照)。

反 応 液 は 、20mMTris-HCI(pH75)、40mMNaC1、40mMKCI、10mMMgCl2、0.1

mMEDTA、1mMDTr、0.1mg/mlBSA、10μg/mlpoly(dI-dC)と[32P]ラ ベ ル の プ ロ

ー ブDNA、RepEを 含 み 、30℃ 、30分 間 静 置 した 。10%PAGE後 、 ゲ ル を乾 燥 し、

DNAバ ン ドはFujixBioimagingAnalyzerBAS2000(富 士 フ イ ル ム社)を 使 っ て定 量

し た 。

2・16【 泊]-RepE54の 調 製

pLysSとpBK815(repE54)を 持 つBL21(λDE3)株 を ア ン ピ シ リ ン、 ク ロ ラ ム フ

ェ ニ コ ー ル 、 各 々200P9/mlの20種 のL一 ア ミ ノ酸 を含 む100mlのMA培 地 で37

℃ で 培 養 し、OD,,,=0.6で 一 度 集 菌 し、Leu、Lysを 除 い た 同 じ培 地 に懸 濁 し た 。1。6

mCi[『H]-Leu(1mCi/m1)、1.6mCi[憤]-Lys(1mCi/ml)と 、0.5mMIPTGを 加 え 、

3時 間 さ ら に 培 養 し た 。RepE54の 精 製 は2・12の 記 述 に従 っ た が 、Superosel2

の段 階 ま で 精 製 し た も の を 実 験 に使 用 し た 。

18

第3章 結果

第1節 大腸 菌熱 シ ョック蛋 白"Adnal変 異株 で複製可能 な変 異 ミニF

プラス ミ ドの分離 と解析

3・1大 腸vadnaノ 変 異 株 で複 製 可 能 な変 異 ミニFプ ラス ミ ドの分 離

ミニFプ ラス ミ ドは 大腸 菌dnaJ、dnaK、grpEの そ れ ぞ れ の 温度 感 受 性 変 異 株 で

30℃(許 容 温 度;大 腸 菌 の増 殖 は正 常)で も複 製 す る こ とが で き な い(Kawasaki

etal.,1990)。dnaJ259変 異 株(MT852)で 複 製 可 能 な49個 の独 立 な変 異 ミニFプ

ラ ス ミ ドを分 離 した(2・7参 照)。 まず 、 変 異 ミニFを 適 当 な 制 限 酵 素 を使 っ て

切 断 し、 親 プ ラ ス ミ ドのpKV531由 来 の制 限酵 素 断 片 と入 れ替 え、dnaJ259変 異 株

で複 製 で きる変 異 が どの 断 片 に存 在 す る か を調 べ た。30個 がRepE蛋 白質 の コー デ

ィ ン グ領 域 内 に対 応 す るSmal-EcoRV(635bp)断 片 内 に、4個 が複 製 開 始 点(α ゴ2)

か らRepE蛋 白質 のN末 端領 域 に相 当 す るStyl-Smal(407bp)断 片 内 に変 異 を もつ こ

とが わ か っ た。

次 に こ れ ら34個 の変 異 の塩 基 配 列 上 の変 化 を決 定 した(図5)。RepE蛋 白質 の

コー デ ィ ング領 域 内 のSmal-EcoRV断 片 内 にマ ップ され た30個 の うち22個 は、

GlUg2(16個)又 は、Glu1。g(6個)に 置 換 が お こ って い た。 これ らは、 以 前我 々 の

研 究 室 か ら σ32欠失 変 異株(△rρoH)で 複 製 可 能 な変 異 ミニFと して報 告 した

repEIO変 異 、repE26変 異 と全 く同一 の塩 基 置 換 で あ る(Kawasakietal.,1991)。7

個 の変 異(repEl8、rep・E40、repE54、repE105)は 、今 まで に報 告 の な い1塩 基 置換

で 、 いず れ もRepEの 中央 の狭 い領 域(92-134残 基)に 局 在 し、repEIO、repE26変

異 の近 傍 に起 こ っ てい た。 この うち4個 は、 同 一 の塩 基置 換(repE105)で あ っ た。

残 りの1個(r(1ρE30変 異)は 、 二 重 変 異 で あ り99番 目 と100番 目のGlu残 基 が と

も にLys残 基 に変 化 して い た。 興 味 深 い こ とに、前 者 はrepE18変 異 と、 後 者 はF

19

T

↑AGTGTGACAA

reρEρ1ブO

H2H7

HlOH11

ori2一 一 一

incB

AT

1 92134 250

repEcodingregion

DnaA DR lR

92

EGAA

99100

EE

「 」『AAA

K

reρEブO

DID4

D5D6

D7D10

DllD13

DlsD22

D23D31

D41Hl

H8H9

GCA

A

reρE40

T40

GAAGAG

ポ焚A

reρEブ8

D18

AAG

K

COρA1

H30

109

G民A

↓AAA

K

reρE26

D2D3D12H12

H13H14

117134

RLCGT--CTC

↓c8T

reρE54

D54

↓T召c

rθρEブ05

H3H4H5H6

図5repE変 異 の塩基置換お よび予想 され るア ミノ酸残基 の変化

RepEは 翻訳 後N末 端 のMetが 除去 され る との報告 に従 い、 ア ミ ノ酸 の番 号 は

Alaを1と した(TokinoetaL,1986)。mutD、mutT、 ヒ ドロキ シル ア ミ ン処 理

に よ り得 られ た プラ ス ミ ド変 異体 は、 そ れぞ れD、T、Hで 表 し分 離 番 号 を併

記 した。

20

プ ラス ミ ドの コ ピー数 が 上 昇 す る と報 告 され たcopA1変 異 と全 く同 一 の塩 基 置 換 で

あ っ た(Helsbergetal.,1985>。coρA1変 異 だ け をpKV531に 導 入 した変 異 プ ラ ス ミ

ドも、dnaJ259変 異株 で複 製 で きた の で、 この プ ラス ミ ドをrepE30二 重 変 異 の か わ

りに さ ら に解 析 した 。Sty/-Smal断 片 内 の4個 の変 異 は 同一 で 、repE遺 伝 子 の プ ロ

モ ー ター/オ ペ レータ ー の 一10領 域 に1塩 基 置換(repEpl10変 異)を お こ して お り、

以 前repE遺 伝 子 の 自己転 写 抑 制 能 が 欠 失 す る と報 告 され た変 異 と同 一 で あ っ た(

Rokeachetal.,1985>。

3.2熱 シ ョ ック関 連 変 異 株 にお け る変 異 ミニFプ ラス ミ ドの複 製 能

dnaJ259変 異 株 で 複 製 可 能 な変 異 ミニFプ ラ ス ミ ドが 大腸 菌 の 他 の熱 シ ョ ック蛋

白質 変 異 株(dnaK、grpE)や 熱 シ ョック シ グマ 因子 ♂2の 欠 失 変 異株(△rpoH) .で、

複 製 で き るか ど うか を調 べ た(表3)'。 変 異 ミニFか ら親 プ ラ ス ミ ド由来 の

repE602変 異 を分 離 した ミニFプ ラス ミ ドを構 築 し、 これ 以 降 の実 験 に用 い たが 、

repE40、 卿E54変 異 だ け を持 つpKV5110プ ラス ミ ドは分 離 で きず(後 述)、

repE602変 異 との二 重 変 異 を用 い た。

表3変 異 ミニFプ ラス ミ ドの形質転換効率a

Mini-FplasmidscarryingrepEallele:Strain

十 10 18 26 ノ05 copAl P〃0 602 40-602 54-601

MC4100wildtype1.O

KY1453d'1α ノ259(0.1)

翻 霧灘諾否撃1011ヨ

畏響 轟翻6(18判KY1603△ ηフoH3010-3

0.60.8

0。20.5

0.505

0.50.4

0.40.7

0.10.3

0.310-4

0

0

0

0

0

0

0

3

6

4

2

4

8

3

0

0

0

0

0

0

0

9

7

9

4

6

7

5

0.8

0.4

0.6

0.3

0.6

0.7

10-♂

1

0

0

0

0

0

0

0

4

8

3

3

3

1b

0.90.9

10.5'0.6

10『40.4

10-40.3

10-sO.8

10-40.3

10-510-4

1

0

0

1

1

0

0

0

4

5

0

1

6

8

a.pKV5110(repe)ま たは各 々の変異 を持 つpKV5110誘 導 プ ラス ミ ドを使 用 した。形質転換

は30℃ で行 い、pBR322に よる形質転換効 率 との比 で表 し、大腸菌野生株(MC4100)に おける野

生 型 ミニF(pKV5110)の 値 を1.Oと した時の相対値 を示 した。O内 は疑似 形質転換体 を示す。

b,効 率 は低 いが小 さな コロニーが観 察 され、 これ らの変異 ミニFは △rpoHで 効率 は悪いが複製

で きた。

21

宿 主 は温 度 感 受 性 変 異 で あ る た め、 宿 主 菌 の増 殖 に影 響 の な い許 容 温度(30℃)

で 実 験 を行 っ た。 調 べ た全 て の変 異 ミニFはdnaK、grpE変 異株 で も複 製 可 能 で あ

っ たが ・ 親 プ ラ ス ミ ド[pKV531(repE602)、pKV5110(repE)]は 複 製 で きな か

っ た(表3)。 この こ とは、 ミニFの 複 製 に も大 腸 菌 のDnaK 、DnaJ、GrpE熱 シ ョ

ック蛋 白質 が協 調 的 に働 くこ とを示 して い る。 さ ら に、dnaノ 遺伝 子 にTn10を 挿 入

したKY1454株(AdnaJ)で も、 こ れ らの変 異 ミニFは 複 製 可 能 な こ とか ら、 こ れ

らはDnaJ蛋 白質 の機 能 に全 く依 存 しな くな っ た こ とが 示 唆 され る。

一 方、 ♂2の 欠 失 変 異 株(ArpoH)で は、 以 前 報 告 したreρE10、 ㌍ρE26変 異(

Kawasakietal.,1991)に 加 え、㌍ρE54-602、repEIO5変 異 は安 定 に複 製 で きたが 、

repEpl10、copA1変 異 もわず か なが ら複 製 が 観 察 され た(表3)。repE18、

repE40-602変 異 ミニFは 、ArpoH株 で ほ とん ど複 製 で きな か っ た。 後 者 の場 合 、

repE遺 伝 子 の 転 写 量 、 あ る い はDnaK、DnaJ、GrpE熱 シ ョ ック蛋 白質 の産 生 量 が 減

少 し、 お そ ら く複 製 に充 分 な量 供 給 され な い こ とが 原 因 で は な い か と想 像 され る。

3・3変 異 ミニFプ ラス ミ ドの コ ピー数

プ ラス ミ ド変 異 が ミニF複 製 制 御 に及 ぼ す影 響 を調べ るた め、 変 異 ミニFの コ ピ

ー数 を大 腸 菌 野 生株(MC4100)、dnaJ259変 異 株(KY1453)で 調 べ た 。

pACYC184プ ラス ミ ドを持 った大 腸 菌 を用 い 、変 異 ミニFの コ ピ ー数 はpACYC184

との相 対 値 で表 した(表4)。pACYC184の コ ピー数 は実 験 に用 い た大腸 菌 変 異 に

よ る影 響 を受 け な い(KawasakietaL,1991)。repEIO、repE26変 異 ミニFは 野 生 株

と同様 、dnaJ259変 異株 で も非 常 に高 い コ ピー数 を示 した。coρA1変 異 プ ラス ミ ド

も同様 で 、 特 にdna/259変 異株 で高 い コ ピー数 を示 した。 そ の他 の変 異 ミニFは 、

dnaJ変 異 株 で の コ ピー 数 が 野 生株 に比 べ低 い傾 向 が み られ るが 、 これ は お そ ら く

dnaノ 変 異 の 間接 的 な影 響 と思 われ る。 一 見 矛 盾 す るが 、 こ れ らの高 い コ ピー数 を示

す変 異 ミニFは 、非常 に不 安 定 で あ る。 お そ ら く、 コ ピー数 が高 す ぎ る こ とに よ り、

22

宿 主 菌 に 強 い 増 殖 阻 害 が お こ る た め と考 え られ る(Kawasakietal.,1991参 照)。

一 方、repElO5、repE18、repE40-602変 異 ミ ニFは 野 生 株 で わ ず か に コ ピ ー 数 の 上

昇 が み られ る。repE54-602二 重 変 異 プ ラス ミ ドは高 い コ ピー数 を示 す が 、 こ れ は主

に変 異RepEの 示 す高 い イ ニ シ エ ー タ ー活 性 と、repE遺 伝 子 の 自己 転 写 抑 制 能 を欠

い た た め で あ ろ う(後 述)。repE40、repE54変 異 を単独 で持 つ 変 異 ミニFプ ラ ス ミ

ドを作 る こ とは で きな か っ た。repE40、repE54変 異 は 高 い イ ニ シ エ ー タ ー活 性 を持

つ た め(後 述)、 プ ラ ス ミ ドの コ ピ ー数 が 高 くな り過 ぎて、 宿 主 の増 殖 阻害 を引 き

起 こす と考 え られ る。

表4変 異 ミニFプ ラス ミ ドの コ ピー数 お よ びRepE量a

CQpynumberina= RepEproteinleve且inb:

PlasmidMC4100KY1453'MC4100

(dnCtS「+)(dnaノ'259)(dnal+)

KYI453

(dnaJ259)

repE+

reρEIO

reρE26

cop41

repE18

repE105

repEp〃O

repE602

relフE40-relフE602

repE54-relフE602

ID22`(89)19`(60)561219,270718

22`(90)

10c(25)7.2c(29)20r(91)0.81.02.2

0.86.3c(65)

1.0

1

1

2

6

1

1

4

6

0

7

5

0

9

1

1.0

0.7

1.4 .

2.7

1.0

3.0

a.ミ ニFプ ラス ミ ドとpACYC184を 持 つ菌 をアン ピシ リン、 クロラムフェニ コール を含 むL培

地 で1晩 培養 した。 プラス ミ ドDNAを 調製 し、EcoRI、Bgnl制 限酵素 で処理 した後 、 アガロース電

気 泳動 した。DNAの バ ン ド濃度 をデ ンシ トメー ターで走査 し、pACYCI84の バ ン ドの濃度 を対照 に

ミニFDNAの バ ン ド濃度 を比 較 した。3回 の実験 の平均値 を示 した。大腸 菌野生株(MC4100)に

おけ る野生型 ミニF(pKV5110)の 値 を1.0と した時の相対 値 を示す。b.各 々の変 異 ミニFを

持つ菌 の対 数増殖期 の培養液 に、対照 と してC末 端が短 くなったRepE(RepE△C57)を 一定量加 え、

TCA処 理 し、SDSPAGE後 、イムノブ ロッ トに よりRepE量 を測定 した。大腸菌 野生株(MC4100)

における野生型 ミニF(pKV5110)の 値 を1.0と した時の相対 値 を示す。c.こ れ らの場合 は、

プ ラス ミ ドを持 たない菌が高頻度 で出現す るため、()内 に示 した培養 液中 に見 られる プラス ミ

ドを脱 落 した菌 の出現頻度 で補 正 した。実 際の コピー数 はこ こに示 したもの よ り高い と思 われる

(本文参 照)。

23

最 後 に、repEIO、repEl8、repE26変 異 ミニFに つ い てdnaK204、dnaK756、grpE280、

△η)oH変 異 株 で コ ピ ー 数 を 調 べ た と こ ろ 、 上 記 の 結 果 と ほ とん ど変 わ ら な か っ た

(デ ー タ ー 提 示 せ ず)。

3・4細 胞 内 の変 異RepEの 量

野 生 株(MC4100)、dnal259変 異 株(KY1453)で の細 胞 内 のRepE量 を イ ム ノブ

ロ ッテ ィ ング に よ り調 べ た(た だ し、repEIO、repE26変 異 は プ ラ ス ミ ドが 非 常 に不

安 定 な た め 除外 した)。 表4に 示 した よ う に ミニFの コ ピー数 とRepEの 発 現 量 に

は相 関 性 が見 られ た。 コ ピー数 の著 し く上 昇 した変 異 ミニF(coρA1、repE54-602

変 異 〉 のRepE量 は、 変 異 ミニFが 不 安 定 で あ る た め、 明 らか に少 な く見 積 っ た値

で あ る 。 興 味 深 い こ と に、野 生 株(MC4100)に お け る プ ロモ ー ター/オ ペ レー タ

ー領 域 の変 異 ミニF(爬 ρ珈110変 異 〉 の コ ピー数 は野生 型 ミニFに 比 べ2 .7倍 で あ

る が 、RepE量 は野 生 型 ミニFの65倍 と多 い。 この結 果 は、3・3で 見 られ た多 く

の変 異 ミニFが 示 す高 い コ ピー数 は、RepEの 量 が 多 い こ とだ け で は な く、高 い コ

ピー 数 に見 合 う よ うなRepEの 活 性化 が お こっ て い る こ と を示 唆 して い る。

3・5変 異RepEの リプ レ ッサ ー活 性

変 異RepEに よ るrepE遺 伝 子 の 自 己転 写 抑 制(リ プ レ ッサ ー)活 性 を測定 した

(図7A、2・8参 照)。 調 べ た変 異 の うち、RepE54は ほ とん ど完 全 に、

RepE105は 著 し く リプ レ ッサ ー活 性 を失 っ て い た(図7B)。RepE10、RepE26、

RepE40で も、 野 生 型RepEに 比 べ 、 少 しで は あ る が 明 らか に活 性 は減 少 して い た。

一 方、RepE18、CopAlの 示 す 活性 は、野 生 型RepEと 比 べ 顕 著 な差 は認 め られ なか

っ た。 リ プ レ ッサ ー活 性 を測 定 した条 件 で細 胞 内 に存 在 す るRepEの 量 をイ ム ノ ブ

ロ ッテ ィ ン グで 調 べ た と ころ 、RepE105以 外 は野 生 型RepEの 量 とほ とん ど変 わ ら

な か っ た。RepE105の 量 は、 野 生 型 の50%程 度 に まで 減少 して い た た め、何 らか

の 理 由 でRepE105は 細 胞 内 で不 安 定 に な っ て い る と考 え られ る。

24

A

0直

(pBR322)

卵R

pKV7190

Pttlp

re戸E

`認

B1.2

も1.o

冒コ むり　

薙 …の ロき ロ むロる

範 国一 Ω司① ①02

属 属

0.0

01020304050

L-tryptophan(P9/ml)

図6pKV7190の 構 造 と、 トリ プ トフ ァ ン濃 度 に よ るRepEの 発 現 量

A.pKV7190はpBR322の レ プ リ コ ンで 、trpプ ロ モ ー タ ー/オ ペ レー タ ー の

下 流 にrepE遺 伝 子 を、 さ ら にmpR遺 伝 子 を つ な ぎ作 成 した 。 培 地 中 の レ トリ

プ トフ ァ ン濃 度 に よ りRepEの 発 現 を制 御 で き る(KawasakietaL,1991)。

B.培 地 中 のL一 トリ プ トフ ァ ン濃 度 に よ るRepEの 発 現 量 。pKV7190を 持 つ 大

腸 菌 野 生 株(MC4100)を そ れ ぞ れ の濃 度 の トリ プ トフ ァ ン を含 むME培 地 で

30℃ で 培 養 し対 数 増 殖 期 に サ ン プ ル を と り、 イ ム ノ ブ ロ テ ィ ン グ に よ りRepE

量 を測 定 した 。 トリ プ トフ ァ ンOμg/mlの 値 を1.0と して 相 対 値 で 表 した。

25

ARepressorActivity

attλ

chromosome

pK膣O

Rep更Repressi・ ・

PrepE一 ノacZ

B

100

_80

ζ・ξ

に860

霧

遷鴛840茄9こ

雪'焉20

石匡

一 一 一1-一 一 鰯 囎 ・

十

OI

O1020304050

L-tryptophan(μ9/ml)

図7RepEの リ プ レ ッサ ー 活 性 の 測 定 法 と、 変 異RepEの リ プ レ ッサ ー活 性

A.RepEの リ プ レ ッサ ー 活 性 はpKV7190か ら トラ ンス に 供 給 さ れ たRepEに よ

る大 腸 菌 染 色 体 上 のrepEプ ロ モ ー ター 下 流 に あ るlacZ遺 伝 子 の 転 写 抑 制 活 性 を

β一ガ ラ ク トシ ダ ー ゼ活 性 を測 定 す る こ と に よ り求 め た 。

B.pKV7190(ま た はrepE変 異 を持 つ そ の 誘 導 プ ラ ス ミ ド)を 持 つMC4100

(λpF13-PrepE-lacZ)株 を30℃ で 培 養 し、 対 数 増 殖 期 に培 養 液 を採 取 し、 β一 ガ

ラ ク トシ ダ ー ゼ 活 性 を測 定 し た。repE遺 伝 子 を 欠 失 し たpKV711(△repE)プ ラ

ス ミ ドの活 性 を100と して相 対 値 で 表 した 。+,noRepE;◇,野 生 型RepE;○,

RepElO;●,RepE18;口,RepE26;■,RepE40;△,RepE54;▲,RepE105;◆CopA1.

26

3・6変 異Rep蛋 白質 の イ ニ シエ ー タ ー活 性

変 異RepEの イ ニ シエ ー ター活 性 は、2・9に 述 べ た方 法 に よ りori2プ ラス ミ ド

(pKV718)の コ ピ ー数 を測 定 して 求 め た(図8A)。ori2プ ラス ミ ドの複 製 は ト

ラ ンス に供 給 され た変 異RepEの 活性 に定 量 的 に依 存 す る。 調 べ た全 て の変 異

RepEは 、 野 生 型RepEに 比 ベ イ ニ シエ ー ター 活性 の上 昇 が 見 られ た(野 生 型 の2-

6倍)(図8B)。RepE10、RepE26、RepE40、RepE54、CopA1は 特 に高 い イ ニ シ

エ ー タ ー活 性 を示 した。RepE18は わ ず か に活性 の 上昇 が 見 られ た 。

興 味 深 い こ とに、RepEのC末 端 のrepE602変 異 が 共存 す る とRepE40、RepE54の

示 す 高 い イ ニ シエ ー ター活 性 が抑 制 され た(図8C)。 この現 象 と対 応 して、

r(1ρE40-602、repE54-602変 異 を持 つRepEを トラ ンス に供 給 す る プ ラス ミ ドを あ らか

じめ持 たせ た菌 をori2プ ラス ミ ドで形 質 転換 した場 合 、 野 生 型RepEを 供 給 で きる

菌 に比 べ 、形 質 転 換 効 率 が1/10～1/100に 低 下 した(デ ー ター提 示 せ ず)。 こ れ に

対 し、reρE602変 異 が 野 生 型 、reρE40変 異 、repE54変 異 と共存 して も、 リプ レ ッサ

ー活 性 に は ほ とん ど影 響 しなか っ た(デ ー タ ー提 示 せ ず) 。 これ らの結 果 は、

RepEの イ ニ シ エ ー ター 活性 に、RepEの 中央 領 域(92-117残 基 領 域)とC末 端 領 域

との相 互作 用 が 特 異 的 に重 要 で あ る可 能性 を示 唆 す る。

27

AInitiatorActivity

pKV7190

repε

一 ・堺 脚

BRepE+RepE10

RepE18

RepE26

RepE40

RepE54

RepEIO5

CopA1

C

十RepE

RepE602

RepE40

RePE40-602

RepE54

RepE54-602

05

Relativecopynumbersof

theori2plasmid

105

Relativecopynumbersoftheori2plasmid

図8RepEの イ ニ シエ ー タ ー活 性 の 測 定 法 と、 変 異RepEの イ ニ シエ ー タ ー活 性

A.RepEの イ ニ シエ ー タ ー 活 性 はoガ2プ ラ ス ミ ド(pKV718)の コ ピー 数 を測 定

して 求 め た 。ori2プ ラ ス ミ ドの複 製 は トラ ンス に供 給 され たRepEに 依 存 す る。

B.変 異RepEの イ ニ シ エ ー ター 活 性 。pKV718とpKV7190(ま た は 理ρE変 異 を

持 つ そ の 誘 導 プ ラス ミ ド)を 持 つMC4100株 を30℃ で培 養 し、 対 数 増 殖 期 に培 養

液 を採 取 し、pKV7190(ま た は そ の 誘 導 プ ラス ミ ド)を 対 照 と してpKV718の コ

ピー 数 を 求 め た 。pKV7190お よ び そ の 誘 導 プ ラ ス ミ ドの コ ピ ー数 はrepE変 異 に よ

り影 響 を 受 け な い 。 測 定 は 培 地 中 の トリ プ トフ ァ ン濃 度50P9/mlで 行 い 、 野 生 型

RepEの 値 を1.0と した と きの相 対 値 を グ ラ フ に示 した ・

C.RepEのC末 端 変 異(repE602)がRepEの イ ニ シ エ ー タ ー活 性 に与 え る影 響 。

28

今 まで述 べ て きた大腸 菌dnaJ変 異株 で複製 で きる ようになった変異 ミニFの 主 な

性 質 を表5に ま とめた。

表5ミ ニFプ ラ ス ミ ド変 異 の ま とめa

雁Transformation

dnal259 △,poH30累辮

Plasmid

わcopyno・ 是藩RepE

「ep「ρ『so「

adMty

Rep.

i・illi・l

activi

十

10

18

26

40

54

105

c()pAl

P〃0

602

40・602

54-602

;

よ

謁B

‡

亡

‡

;

;

認

士;

十

士

土

需

‡

‡

±

十

,十 十十

十

十十十

ND

ND

十

十十

十

十

十

十十十

十

NDC

十

ND

ND

ND

十

十

十十

十

十

十十

士

;'…

;　　

ゴ

.‡

潔

‡‡:

潔

士;

辱±

a.表3、 表4、 図7B、 図8BCの デ ー タ ー を 半 定 量 的 に表 し た 。

b.野 生 株(MC4100)で 求 め た 値 を 示 す 。c.ND、 実 験 不 能 。

3・7変 異RepEの'ori2、 オ ペ レ ー タ ーDNAへ の 結 合

大腸 菌 のdnaJ変 異株 で複製 で きるRepE変 異蛋 白質 をT7RNAポ リメラー考系 で

大量発 現 させ 、2・12の 方法 で精製 した。RepE54、RepE54-602は 単量 体(後 述)、

これ ら以 外 はす べ て野 生 型RepEと 同様 に二 量体 と して精 製 され た(デ ー タ ー提 示

せ ず)。 これ らのRepEのori2、 オ ペ レー タ ーDNAへ の結 合 活 性 をゲ ル シ フ ト法 で

測 定 した。invivoで 調 べ た性 質 と一一lkし て、ori2DNAへ の結 合 は上 昇 し(野 生 型 の

2-12倍)(表6)、 一 部 の変 異RepEの オ ペ レー タ ー一・DNAへ の結 合 は減 少 して い

た(野 生 型 の0,3-0.5倍)。 特 に、ori2DNAへ の 結 合 効 率 とinvivoの イ ニ シエ ー

タ ー活 性 、 コ ピー数 は良 く一・致 す る(表6)。RepE105は 精 製 過 程 で は比 較 的安 定

で 、 オ ペ レー ターDNAに は効 率 良 く結 合 した。 従 って 、invivoで 見 られ た リプ レ

ッサ ー活 性 の低 下 は、細 胞 内 でRepE105が や や不 安 定 な た め量 が少 な い こ と に よ る

29

と考 え られ る。

invivoで は、repE602変 異 が 共 存 す る とRepE40、RepE54の 示 す高 い イ ニ シエ ー タ

ー活 性 が 抑制 され たが、 リ プ レッサ ー活 性 にはそ れ ほ ど影 響 しない(3・6参 照)。

ori2お よび オ ペ レー ターDNAへ の結 合 活性 を調 べ た とこ ろ、 オ ペ レー ター へ の結

合 活 性 に はinvivoと 同様 にrepE602変 異 の影 響 は ほ とん ど観 察 され な か った。ori2

へ の結 合 活 性 は、repE40変 異 はrepE602変 異 の影 響 を受 け るが 、repE54変 異 で はそ

れ ほ ど顕 著 で な か っ た(表6)。 従 って 、repE602変 異 がRepE40、RepE54に 与 え

る影 響 はDNAへ の 結 合 段 階 だ け で は な く、 結 合 した後 の複 製 開 始 段 階 に もお よぶ

可 能性 が 考 え られ る。

表6変 異RepEのori2DNA結 合 活性 とinvivoの 性 質 の 比 較

Relativeori2DNARelativeinitiatorRelative

M・tantRepEbi・di・gefficien・yaacti・ity,in・iv・bc・pynumbersc

RepE+

RepEIO

RepE18

RepE26

RepE40

RepE54

RepE105

CopAl

RepE602

RepE40-602

RepE54-602

1.O

l2.4d

2.3

10.od

3.5

500

2.3

d5.1

0.8

0.6

500

1.0

4.9

2.3

5.9

4.9

6.0

2.9

4.8

0.7

1.3

0.4

1.0

22

1.2

19

NDe

NDe

1.9

5.6

0.7

1.8

22

a.2・15に 記述 したゲルシ フ ト法 の実験 条件 下で、使 用 した αゴ2DNAの50%が シフ トする

の に必要 なRepEの 量 を求 め、野生 型RepEの 値 を1.0と して相対 値 で示 した。

b.図8Bの 値 を再 び記 した。

c.表4の 大腸菌 野生株(MC4100)の 値 をその まま記 した。

d.文 献(Kawasakietal.,1992)よ り引用 した。

e.ND実 験不 能

30

第2節RepE蛋 白質 の単量体 、二量体 に よる機能分担

3・8変 異RepE54は 単 量 体 と して精 製 され る

第1節 で 示 した よ うにRepE54は 、invivoでRepEの イ ニ シエ ー ター活性 が上昇 し、

リプ レ ッサ ー活 性 を ほ とん ど失 っ て い た。 この こ とは 、RepEの2つ の機 能 は分 離

で きる こ と を示 して い る。 こ れ ま でRepEの2つ の機 能 が どの よ う なRepEの 構 造

と対 応 す る の か 明 らか に され て な か っ た の で、 本研 究 で はRepE54を 精 製 し、 さ ら

に詳 細 な解 析 を行 った 。RepE54の 構 造 が こ れ まで精 製 され た野 生 型RepEや 多 くの

変 異RepEと 異 な る こ との最 初 の示 唆 は、RepEを 大 量発 現 した細 胞 を破 砕 し、 遠 心

した後 、RepE54が 上 清 か ら回収 され た とい う実験 結 果 か ら得 られ た。 大 量発 現 系

で 産 生 させ た野 生 型RepEや 多 くの変 異RepEは 、80%以 上 が 沈 殿 画 分 か ら回収 さ

れ るが 、RepE54は90%以 上 が 上清 画分 にあ っ た(図9A参 照)。 精 製RepEを

FPLCサ イ ズ カ ラ ム に か け る と、RepE54は 野 生 型RepEよ りも溶 出 され て くる時 間

が 明 らか に遅 れ た。 精 製 したRepEのKav値(分 配定 数)(LaueandRhodes,1990)

か ら分 子 量 を推 定 す る と、 野 生 型RepEは55kDa、RepE54は27kDaと な った(デ ー

ター提 示 せ ず)。

次 に、 我 々 は溶 液 中 のRepEの 分 子 量 を、低 角 レーザ ー光 散 乱 法(LALLS法)に

よ り決 定 した。 この 方法 で は、 蛋 白質 の形 な どが 測 定 結 果 へ ほ とん ど影 響 しな い と

考 え られ て い る(Takagi,1981)。 求 め た分 子 量 は、 野 生 型RepEは58.6(±15)

kDa、RepE54は28.3(±3.0)kDaで あ っ た(図9B)。 沈 降速 度 法 に よ り溶 液 中

のRepEの 沈 降 定 数 を求 め る と、 野 生 型RepEは4.lS、RepE54は2.8Sで あ っ た。

塩 基 配 列 か らRepEの 分 子 量 は29kDaと 推 定 され(Murotsuetal.,1981)、 精 製 した

野 生 型RepEは 他 の グ ル ー プか ら も報 告 され て い る よ うに二 量 体 と して(Masson

andRay,1988;Klineetal.,1gg2;Kawasakietal.,1gg2)、RepE54は 単 量 体 と して安 定

に存 在 す る と結 論 され る。 これ らの条件 下 で 、RepE54は 二 量体 が 形 成 で き ない か、

ある い は二 量体 を形 成 す るがRepE54の 二 量 体 は非常 に不 安 定 で あ る と考 え られ る。

31

Al2345(kDa)B6

の

碧

響窪

●8望

伽

一97

-69

一46

一d-30

一21

一4

＼

の

2

0

RepE+

RepE54

050100150Molecularweight(kDa)

図9RepE精 製 過 程 の サ ン プル のSDS-PAGE解 析 と、RepEの 分 子 量 の 決 定

A。 精 製 過 程 のRepEを12%SDS-PAGE後 、 ク マ シ ー ブ ル ー で 染 色 した 。

レ ー ン1、 野 生 型RepE、Superose12溶 出 後;レ ー ン2-5、RepE54、 そ れ ぞ れ

DEAE-Sepha㏄1溶 出 後 、MonoS溶 出 後 、Superose12溶 出 後 、MonoQ溶 出 後 。 右 側

の 数 字 は分 子 量 マ ー カ ー の 位 置 を 表 す 。

B.精 製RepEを 低 角 レ ー ザ ー 光 散 乱 法(LALLS法)に よ り測 定 した(2・14

参 照)。 縦 軸 はLALLS計 の 出 力(LS)と 示 差 屈 折 率 計 の 出 力(RI)の 比 、 横 軸 は

分 子 量 。 ○,RepE;●,BSAdimer(132kDa),creatinekinase(82kDa),BSAmonomer(66

kDa),carbonicanhydrase(29kDa),RNaseA(13.7kDa)。

32

3・9野 生 型RepE、RepE54のori2、 オペ レー タ ーDNAへ の結 合 活性

は じめ に、 野 生 型RepE、RepE54のori2DNAへ の結 合 活 性 をStul-AlulDNA断 片

(図10)を プ ロー ブ と して、 ゲ ル シ フ ト法 で解 析 した。使 用 す るRepEの 量 が増

加 す る に従 っ て 、移 動 度 の遅 くな る4個 のバ ン ドが見 られ 、1、2、3、4番 目の バ ン

ドの量 が順 次 増 加 した(図ll)。 この事 とバ ン ドの移 動 度 とか ら判 断 して 、 これ

らのバ ン ドはori2内 の4個 の イ テ ロ ンにRepEが そ れ ぞ れ!、2、3、4分 子 結 合

した もの で あ る と考 え られ る(図11;3・10参 照)。 図11に 見 られ る よ う に、

野 生 型RepEのori2DNAへ の結 合 活 性 は、 以 前 報 告 され た よ うに低 か った(Tokino

etal.,1986;MassonandRay,1986,1988;Klineetal.,1992;KawasalCietal,1992)。

RepE54はori2に 非 常 に効 率 良 く結 合 し(図11CD)、RepE54がinvivoで 高 い

イ ニ シエ ー ター 活性 を示 す こ とに対 応 す る(図8B)。 この条 件 下 で αゴ2DNAの

50%がDNA-RepE複 合 体 を形 成 す る時 のRepEの 濃 度 を求 め る と、 野 生 型RepEは

450fmol、RepE54は0.9fmolで あ り、RepE54は 野 生 型RepEに 比 べ 約500倍 αゴ2

DNAへ の結 合 効 率 が 上 昇 して い る と考 え られ る。

オペ レー ターDNAへ の結 合 活 性 をAlul-Smal断 片(図10)を プ ロ ー ブ と して用

い て調 べ る と、 プ ロー ブDNAの 大 部 分(約96%)と 結 合 す るの に必 要 な野 生 型

RepE量(10pmo1)を 使 って も、RepE54は ほ とん ど結 合 で きな か っ た(図12)。

オペ レー ターDNAの50%がDNA-RepE複 合 体 を形 成 す る時 の 野 生 型RepEの 濃 度

は、210fmolで あ り、RepE54は 少 な く とも100倍 は結 合 効 率 が 減少 して い る。 この

結 果 は、invivoでRepE54が ほ とん ど リ プ レッサ ー活 性 を示 さな い とい う結 果(図

7B)と 良 く一 致 す る。

これ らの結 果 は、RepEの 単 量 体 がori2へ 結 合 し、複 製 を開 始 す る た め の活 性 型

で あ り、 二 量 体 が オペ レー ター に結 合 し、 リ プ レッサ ー と して機 能 す る とい う興 味

深 い 可 能 性 を示 唆 して い る。

33

轟 寒偽

罵§碕

>

8

励ori2promoter/

operator

/誤 專

図㌍ρEgene

[〉>[〉[〉

覧

§碕1

[;〉<]

ori2(130bp)*

図10

二operator(180bp)

ゲ ル シ フ トに用 い たDNAプ ロー ブ

*

34

A

C

頭]B・und

●M色 ・-Free

OO.512510

RepE+(pmol)

Blo

§8

誉6ろ←40

も当20

畠0

o

Dloo

0 2468

RepE+(pmo1)

10

ピ セ`-il]-d

圏 ●-Free

Ol251020

RepE54(fmol)

(80

　憲60ろ

140

を

820m

O0 51015

RepE54(fmol)

20

図11ゲ ル シ フ ト法 に よるRepEのori2DNAへ の結 合 活 性

詳 細 は本 文 を参 照 。A.C.DNAの バ ン ドの オ ー トラ ジ オ グ ラ フ。B.D. ●、 バR

,pEの 糸吉合 したDNAと 総DNAの 上ヒで示 した・ 値 は4回 の実 蜘 平 均 値 ・

ン ド1;□ 、 バ ン ド2;■ 、 バ ン ド3;△,・ ・ン ド4;○ ・4本 のバ ン ドの合 計 ・

35

A

_】 】 】 】 】-B。und

B

】 』 、麟 の

00.10.20.5125

RepE+(pmol)

100

　ま80ご

暮60

ヒ℃40

舅

820

Free_】 】 】 】 」■の

012510

RepE54(pmol)

0

o RepE+

RepE54

0 2468RepE(pmol)

10

図12ゲ ル シ フ ト法 に よるRepEの オペ レー ターDNAへ の結 合 活 性

詳 細 は本 文 参 照 。A.DNAの バ ン ドの オ ー トラ ジ オ グ ラ フ。B.RepEの 結 合 し

たDNAと 総DNAの 比 で示 した。 値 は野 生 型RepE(○ 〉 が4回 、RepE54(●)が

2回 の実 験 の平 均 値

36

3・100ri2-RepE複 合 体 の量 比

ori2-RepE複 合 体 の量 比 を直接 調 べ る ため に、[3H]-RepE54と[32P}ori2DNAの 二

重 ラベ ル法 を用 い た(YangandNash,1989;SchneiderandGeiduschek ,1990)。 ゲ ル シ

フ ト法 に よ り得 られ る4つ の αゴ2DNAの バ ン ドを切 り出 し、[泊]と[32P]の そ れ ぞ

れ の放 射 線 活 性 を測定 し、 解析 した。 表7に 示 した よ うに 、ori2DNAとRepE54の

モ ル比 はバ ン ド1、2、3、4に つ い て そ れ ぞ れ1、2、3、4で あ り、RepE量

へ の依 存 性 と、 移 動 度 か ら期 待 され た結 果 と一 致 して い た(図11参 照) 。 こ の結

果 は 、 こ の条 件 下 でRepE54がo㎡2内 の4個 の イ テ ロ ン に結 合 し、 そ れ ぞ れ の イ テ

ロ ン当 た りRepE54の 単量 体 が1個 の割 合 で結 合 す る こ とを明快 に示 して い る。 図

11で 見 られ る バ ン ドの移 動 度 が 野 生 型RepEとRepE54と で ほ とん ど変 わ らな い

こ とか ら、 お そ ら く野 生 型RepEも イ テ ロ ン当 た りRepEの 単 量 体 が1個 の割 合 で結

合 して い る と考 え られ る。

表70ri2-RepE複 合 体 の量 比

Complex

RepE54bound

peroが2DNA

(molarratio)

Deducedno.ofRepE54

monomerbound

perlteron

bandl

band2

band3

band4

freeDNA

1.15(1.00)

2.42(2.11)

3.10(2.70)

4.67(4.07)

0.07(0.06)

1.15

1.21

1.03

1.17

ゲ ル シ フ ト反 応 液(50μ1)に は 、3pmolの[32P]-ori2DNA(630cpm/pmol)と55-28pmolの

[3H]-RepE54(70cpm/pmo1)を 含 む 。 反 応 後 、6%ゲ ル で 電 気 泳 動 し、 オ ー トラ ジ オ グ ラ フ に よ っ て

図11の バ ン ド1か ら4に 対 応 す るDNA-RepE複 合 体 を 検 出 し、 ゲ ル か ら 切 り出 し た 。 各 バ ン ドの

【32P]と[3H]の 放 射 線 活 性 を 測 定 し、 モ ル 比 を 算 出 した 。2回 の 実 験 の 平 均 値 を 示 し た 。()内 は 、

バ ン ド1に 対 す る 相 対 値 。

37

3.11蛋 白質変 性 剤 処 理 した野 生 型RepEのDNA結 合 活 性

RepEの 二 量 体 、単 量 体 の機 能 を さ ら に詳 し く解 析 す る 目 的 で、 野 生 型RepEを 蛋

白質 変 性 剤 で処 理 した後 、DNAへ の結 合活 性 を調 べ た。塩 酸 グ アニ ジ ン(2-6M)

処 理 したRepEは 、変 性 剤 濃 度 の増 大 と共 に、 明 らか にori2へ の結 合 が 増 大 し、 逆

に オ ペ レー ターへ の結 合 が 減 少 した(表8)。RepEを2-6M尿 素 、1-4MNaCl

で処 理 した場 合 も、 同 じよ うな効 果 が観 察 され た(デ ー ター提 示 せ ず)。 しか し、

TritonX-100(05%)、sarcosyl(0.1%)処 理 した場 合 、RepEのDNAへ の結 合 活

性 には顕 著 な影 響 は見 られ な か っ た(表8)。 塩 酸 グァ ニ ジ ンの効 果 は、RepEと

30℃ で30分 間反 応 させ る こ とに依 存 して お り、 塩 酸 グ アニ ジ ンがDNAへ の結 合

反 応 や ゲ ル シ フ ト法 の 反応 段 階 に影 響 しな い た め、RepEに 直接 作 用 して い る こ と

が 示 唆 され る(表8の3列 目、5列 目 を比 較)。

表8野 生型RepEのDNA結 合 に与 える蛋 白質変性剤 の効果

DNAbindingefficiency(%)

Treatment ori2 repEoperator

none

2Mguanidine-HCl

4Mguanidine-HCl

6Mguanidine-HCl

4Mguanidine-HCI*

0.5%TritonX-100

0.1%sarcosy1

9.4

27.9

53.8

68.3

11.0

8.8

14.3

(1.0)

(3.0)

(5.7)

(7.3)

(1.2)

(1.0)

(15)

45.9

0.9

1.3

(1.0)

(0.02)

(0.03)

<0.03(く0.01)

535

60.4

24.6

(1.2)

(1.3)

(05)

反 応 液(12μ1:MES-05MKCIバ ッ フ ァ ー 、0.1μgのBSA、8pmolの 野 生 型RepE)に 、 そ れ

ぞ れ の 変 性 剤 を 加 え 、30℃ で30分 間 静 置 した 。 こ れ ら を バ ッ フ ァ ー で40倍 に希 釈 しゲ ル シ フ ト法

で 解 析 し た 。2fmolのori2、 オ ペ レ ー タ ーDNAに 対 し50、200fmo1のRepEを そ れ ぞ れ 用 い た 。 少

な く と も2回 の 実 験 の 平 均 値 を 示 す 。*30分 間 静 置 し な か っ た コ ン ト ロ ー ル 。

38

　

●)

国Ao

脳〇-

o

∈

o

.≧

罵

寄

30

20

10

0

30

20

10

0

60

40

20

0

A

B

C

664529▽ ▽ ▽

1

▽

30405060

Fractionnumber

　20き

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10卜

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08

δ　10h

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.≧

ぢ

Obの

100.ヨ℃.ヨ

D

50<z

QN

o.§

図13ゲ ル濾過 に よるRepE単 量体 、二量体 の分離

A.MES-0.5MKCIバ ッ フ ァ ー 、0.1μgのBSA、15pmolの 野 生 型RepE、

4M塩 酸 グ ァ ニ ジ ン を含 む 変 性 反 応 液(12μ1)を30℃ で30分 間 静 置 し、

バ ッ フ ァー で50倍 希 釈 し、 サ イ ズ カ ラ ム(Superdex75)で ゲ ル 濾 過 し、 分

画 し た 。RepEの 回 収 率 は 約80%で あ る 。 各 画 分 に つ き、RepE量 を イ ム ノ

ブ ロ テ ィ ン グ で 、ori2DNAへ の 結 合 活 性 を ゲ ル シ フ ト法 で そ れ ぞ れ 解 析 し

た 。 ゲ ル シ フ トの 反 応 液(30μ1)に は 、10fmolのori2DNAと 野 生 型

RepE(4μ1)ま た はRepE54(O.4μ1)を 含 む 。2回 の 実 験 の 平 均 値 を 示 す 。

矢 じ りは サ イ ズ マ ー カ ー の 位 置 を 示 す:BSA(66kDa),ovalbumin(45kDa),

carbonicanhydrase(29kDa),RNaseA(13.7kDa).B.C.未 処 理 の 野 生 型

RepEま た はRepE54そ れ ぞ れ を 用 い て 、 同 様 の 解 析 を 行 っ た 。 ● 、RepEの

相 対 量(総 量 に対 す る 割 合 を%で 示 す)。 ○ 、ori2DNAへ の 結 合 活 性 。

39

3・120ri2へ の結 合 活 性 はRepE単 量 体 にの み検 出 され る

4M塩 酸 グ ァ ニ ジ ンで処 理 した野 生 型RepE(15pmol)を サ イ ズ カ ラ ム に通 し、

単 量 体 が 検 出 され る か ど うか検 討 した 。各 分 画 につ き、RepEの 量 をイ ム ノブ ロ ッ

テ ィ ン グ に よ り、ori2DNAへ の結 合 活性 をゲ ル シ フ ト法 に よ りそ れ ぞ れ測 定 した。

4M塩 酸 グ ア ニ ジ ン処 理 した野 生 型RepEで は 、 単量 体 、 二 量体 に相 当 す る#41-43

付 近 と#49-51付 近 の2つ の ピー クが 見 られ た(図13A)。 非 処 理 の野 生 型RepE

は 二量 体 の ピー クが み られ 、 一 部 単 量 体 の肩 が 見 られ る(約8%)(図13B)。

非処 理 又 は4M塩 酸 グア ニ ジ ン処 理 したRepE54は#49-51に 溶 出 す る(図13C)。

最 も興 味 深 い こ とに、ori2DNAへ の結 合 はRepEの 単 量体 に の み見 られ(図13)、

オペ レー タ ーへ の結 合 は 二量 体 に見 られ た(デ ー タ ー提 示 せ ず)。

4MNaCl、4M尿 素 処 理 した野 生 型RepEで も同様 に#49-51付 近 に新 た な ピー ク

が み られ、 同 時 に そ の位 置 に顕 著 なori2DNAへ の結 合 活 性 が観 察 され た(デ ー タ

ー提 示 せ ず)。 た だ し、 こ れ らの処 理 に よ り生 じるRepE単 量 体 の量 は、塩 酸 グ ァ

ニ ジ ンの場 合 と比 較 して少 な か っ たが 、 単 量体 の持 つori2へ の結 合 活 性 は、 どの場

合 で もほ とん ど定 量 的 に等 しか っ た。 つ ま り、 蛋 白質 変 性 剤 の種 類 を問 わ ず野 生 型

RepE二 量 体 か ら生 じる単 量 体 はori2へ の結 合 活性 を示 す 。 しか し、 そ の活 性 は

RepE54単 量 体 よ りも1桁 低 い(デ ー タ ー提 示 せ ず)。

表9溶 液 中の野 生型RepE単 量体、二量体 の存在比

TotalRepE(nM)* Monomer(%) DeducedKd(10-9M)†

20

25

150

1500

2600

8

7

5

<1

<1

0.28

0.26

0.78

<0.3

<0.5

*単 量体 換算 †Kd=[RepE単 量体 の濃度]2/[RepE二 量体 の濃度]

40

最 後 に、 解 離 定 数(Kd)を 概 算 す る 目 的 で 、野 生 型RepEの 濃 度 を数 点 と り(20

-2600nM) 、 サ イ ズ カ ラ ムで 二 量体 、 単 量体 の割 合 を測 定 した(表9)。Kdは 約

1x1(y9Mと 見 積 られ、 この 条件 下 で平 衡 は二 量 体 に強 く片 寄 っ てい る こ とを示 す 。

3・13結 論 とRepEの 作 業 仮 説

第2節 で 、 我 々 は ミニFプ ラ ス ミ ドのRepEは 単 量 体 、 二 量 体 とい う機 能 的 に異 な

る少 な くと も2つ の フ ォー ム を もつ こ と を示 した。 野 生 型RepEの 低 い解 離 定 数

(表9)は 、 野 生 型 の 大 部 分 が 二 量 体 で存 在 す る とい う事 実(図9B)と 良 く一 致

して い る。 野 生 型RepE二 量 体 はrepE遺 伝 子 の オペ レー タ ー に効 率 良 く結 合 し、

ori2内 の イ テ ロ ンへ の結 合 効 率 は非 常 に低 い(図ll、 図12)。 一 方 、RepE54変

異 蛋 白質 は ほ とん どが 単 量 体 と して得 られ(図9B)、ori2内 の イ テ ロ ンへ は非 常

に効 率 よ く結 合 したが(野 生 型RepEの 約500倍)、 オ ペ レー タ ー に は ほ とん ど結

合 しな か っ た(図11、 図12>。 さ ら に、 野生 型RepE二 量 体 を蛋 白質 変 性 剤 で

処 理 す る と、 一 部 に二 量 体 か ら単量 体 へ の解 離 が見 られ 、 面2へ の結 合 が上 昇 し、

オ ペ レー タ ーへ の結 合 は減 少 した。 二量 体 と単量 体 を分 離 して調 べ る と、単 量 体 画

分 に の み 高 いori2へ の結 合 活性 が 見 られ た(表8、 図13)。 この条 件 で 、

RepE54の1分 子 が1個 の イ テ ロ ンに結 合 して お り、 この量 比 は野 生 型RepEで もほ

とん ど変 わ らな い(表7;3・10参 照)。 こ れ らの結 果 は 、野 生 型RepE二 量 体

で見 られ るori2へ の結 合 活性 は実 験 に使 用 したRepEに 存 在 す る ご く少 量 の単 量体

に よ る もの で あ り、 二量体 そ の もの はori2へ 結 合 しな い こと を示 して い る。従 っ て、

RepE単 量 体 はori2結 合 の活 性 型 と考 え られ る。ori2へ の結 合 はRepEの イ ニ シエ ー

ター機 能 に必 須 で あ り、RepEの 二 量 体 か ら単 量 体 へ の変 換 反応 は イ ニ シ エ ー ター

機瀧 の 活 性化 に極 め て重 要 な ス テ ップ と考 え られ る 。

第1節 で 示 した よ うに、repE変 異 に よ り ミニFプ ラ ス ミ ドのDnaK、DnaJ、GrpE

熱 シ ョ ック蛋 白質 の要 求 性 が 失 わ れ る こ と(表3)は 、 これ らの熱 シ ョッ ク蛋 白質

がRepEの 活 性 化 に協 同 して働 く可 能性 を示 して い る。 これ らの変 異 ミニFは 、in

41

vivoでRepEの イ ニ シ エ ー タ ー活性 の上 昇 が み られ、 い くつ か は リプ レ ッサ ー活 性

が低 下 して い た(図11、 図12)。 これ らの変 異RepE蛋 白質 はRepE54を 除 き、

二 量 体 と して精 製 され 、invivoの 性 質 と一致 して 、ori2DNAへ の結 合 は上 昇 し、 オ

ペ レー タ ーDNAへ の結 合 は減 少 して い た(表6)。 お そ ら くこれ らの変 異RepEの

二 量 体 は野 生 型 に くらべ 単 量体 に解 離 しや す くな っ て い る と思 わ れ る。

本研 究 で得 られ た知 見 を総 合 す る と、 ミニFプ ラ ス ミ ドのRepEの 制御 に つ い て

以 下 の よ うな作 業 仮 説 が た て られ る(図14)。 細 胞 内 で、RepEの 大 部 分 は二 量

体 と して存 在 し オ ペ レー タ ー へ結 合 し、 リプ レ ッサ ー と して 自 己遺伝 子 の転 写 抑

制 を行 う。 この た め細 胞 内 のRepEは 低 い レベ ル に保 た れ る。RepEの 二 量体 が 単 量

体 に変 換 され る と、 単 量 体 は 面2内 の イ テ ロ ンへ 結 合 し、DNA複 製 を開 始 す る イ

ニ シエ ー ター と して機 能 す る。 このRepEの 二 量 体 か ら単 量 体 へ の変 換 に、DnaJ、

DnaK、GrpE熱 シ ョ ック蛋 白質 が 分 子 シ ャペ ロ ン と して働 い て い る可 能性 が 高 い。

Ofl'2 operator1「 彫)E

鰹'ノ毒鱗 簿罷堀 蹉^5灘ゴ箱襯鵜難 凹棚寧

___≒ レmRNA

↓[⊂⊃]RepEprotein

↓o--8

膿 器(DnaJDnaKGrpE)?(R認r)

図14ミ ニFプ ラス ミ ドの複 製 制御 にお け るRepEの 作 業仮 説

説 明 は本 文 参 照 。

42

第4章 考察

第1節 ミニFプ ラス ミ ド複製 における熱 シ ョック蛋 白質 の役 割

我 々 の研 究 室 は以 前 に、 大 腸 菌 のdnaK、dηa入 即E熱 シ ョ ック蛋 白質 変 異株 で は

ミニFプ ラ ス ミ ドは複 製 で きな いが 、 トラ ンス に過 剰 量 のRepEを 供 給 す れ ば これ

らの変 異株 で ミニFは 複 製 で きる こ と を示 した(Kawasakietal.,1990)。 本 研 究 で

分 離 した 理ρE遺 伝 子 の オ ペ レー ター/プ ロモ ー ター領 域 の変 異 を持 つ ミニF(

repEpl10)は 、 これ らの大 腸 菌 変 異 株 で複 製 で きた(表3)。 こ の変 異 ミニFは 以

前 、invivoで 辺ρE遺 伝 子 の 自己転 写 抑 制 が で きな い変 異 体 と して報 告 され た もの

と同 一 の塩 基 置 換 を お こ して い た(RokeachetaL,1985)。 ゲ ル シ フ ト法 で

repEpl10変 異 を持 つ オ ペ レー ターDNA断 片 へ の結 合 活 性 を測 定 す る と、 野 生 型

RepEは ほ とん ど結 合 で きず(石 合 未 発 表)、invivoの 結 果 と良 く一 致 す る。 結

果 的 に 、細 胞 内 に多 くのRepEが 存 在 す る こ と(表4)が 、 こ の変 異 ミニFが 大 腸

菌 の熱 シ ョ ック蛋 白質 変 異 株 で複 製 で き る主 な理 由 で あ ろ う。 こ の変 異 プ ラ ス ミ ド

は、 野 生 株 で の プ ラ ス ミ ドコ ピー数 はそ れ ほ ど上昇 せ ず 、 ま た、△rpoH変 異 株 で は

複 製 で きな い(表3、 表4)。

一 方、repE遺 伝 子 の コー デ ィ ング領 域 にお こ っ た ミニFプ ラ ス ミ ド変 異 は、in

vivoでRepEの イ ニ シエ ー タ ー活性 の上昇 が み られ、 い くつ か は リ プ レ ッサ ー活 性

が低 下 して い た(図11、 図12)。 これ らの変 異RepE蛋 白質 を精 製 してDNAへ

の結 合 を調 べ る と、invivoの 性 質 と一 致 して、ori2DNAへ の結 合 は上 昇 し、 オペ レ

ー タ ーDNAへ の結 合 は減 少 して い た(表6) 。 従 っ て、 これ らの変 異 ミニFが 大

腸 菌 の熱 シ ョ ック蛋 白質 変 異 株 で複 製 で きる主 な理 由 は、 プ ラ ス ミ ド変 異 に よ り

RepEの αゴ2へ の結 合 が上 昇 し、 結 果 的 に イ ニ シ エ ー ター活 性 が 上 昇 す る こ とで あ

ろ う。 以 前 の △rpoH変 異 株 で複 製 可 能 な変 異 ミニFの 選 択 で はhyperactiveRepEし

43

か得 られ なか っ た(Kawasakietal.,1991)が 、 本 研 究 で は、 イ ニ シエ ー ター活 性 が

中 くらい に高 く、△rpoH変 異 株 で は複 製 で きな い ミニF変 異(repE105、reρE40-602)

が 得 られ た こ とは特 記 に値 す る。

ミニFプ ラ ス ミ ド複 製 に必 要 なDnaA、DnaB、DnaCそ れ ぞ れ の変 異株 にお い て、

㌍ρE10、repE18、repE26変 異 ミニFは 野生 型 ミニFと 同様 複 製で きなか っ た(石 合 、

和 田 未 発 表)。 さ ら に、dnaA、dnaB、dnaC変 異株 で は熱 シ ョ ック蛋 白質 変 異 株

の場 合 と異 な り、 野 生 型RepEを 過剰 に供 給 して も ミニFは 複 製 で きな か った(和

田 未 発 表)。 また 、調 べ た変 異 プ ラス ミ ド(repEIO、repE26)は 、Hu蛋 白質 を

コー ドす る 加ρA、 加 ρB遺 伝 子 の変 異株 で も複 製 で きな か っ た(川 崎 未 発 表)。

以 上 の こ とは 、 これ らの変 異 ミニFに は、依 然 と してDnaA、DnaB、DnaC、Hu蛋

白質 の要 求 性 が残 り、 こ の こ とは ミニFプ ラ ス ミ ド複 製 に お い てDnaJ、DnaK、

GrpE蛋 白質 はDnaA、DnaB、DnaC、Hu蛋 白質 とは異 な る反 応(お そ ら くRepEの

活 性 化)に 要 求 され る こ と を示 唆 して い る 。

DNA複 製 にお け るDnaK、DnaJ、GrpE熱 シ ョッ ク蛋 白質 の役 割 は λ フ ァー ジ、P

1プ ラス ミ ドの系 で 良 く研 究 され て い る(Georgopolosetal.,1990参 照)。P1プ ラ

ス ミ ドの イ ニ シ エ ー ター 蛋 白質(RepA)二 量体 はDnaJ二 量体 と安 定 な複 合 体 を形

成 し、DnaK、DnaJ、GrpEとATPの 存 在 下 で 活性 化 され 、olゴ領 域 のDNAに 結 合 す

る が 、 こ の活 性 化 に はRepAの 二 量体 か ら単 量 体 へ の変 換 を伴 う こ とが 報告 され て

い る(Wickner,1990;Wicknere`aZ,1991a,1991b,1992)。 しか しなが ら、 最 近 の報

告 で はRepA二 量 体 の解 離 定 数 の測 定 結 果 か ら、RepAが 単量 体 と して存 在 し、 熱 シ

ョ ック蛋 白 質 に よ り活 性 型 単 量 体 に変 換 され る可 能性 も示 唆 され て い る(DasGupta

etal.,1993)。

44

第2節RepE蛋 白質 の構造 と機 能

本 研 究 で我 々 は ミニFプ ラス ミ ドのRepEに 単 量体 、 二 量 体 とい う機 能 的 に異 な

る少 な く と も2つ の フ ォー ムが あ る こ とを示 した。RepE単 量 体 はori2内 の イ テ ロ

ンへ 非 常 に効 率 よ く結 合 し、RepE二 量体 はrepE遺 伝 子 の オ ペ レー ター に効 率 良 く

結 合 した。 ミニFプ ラス ミ ドの複 製 制御 に お け るRepEの 機 能分 担 につ い て 、 これ

まで の 実 験 結 果 か ら3・13で 述 べ た よ うな作 業 仮 説 をた て た(図14)。

この 仮 説 と関連 して、 我 々 は最 近 、invitroでRepEはDnaJ(DnaK、ATP)の 存 在

下 で 活 性 化 され 、 αゴ2、オ ペ レー ターDNAへ 効 率 良 く結 合 す る こ とを報 告 した(

Kawasakietal.,1992;和 田 未発 表)。 また 、RepE54のori2へ の結 合 活 性 もDnaJ

(DnaK、ATP)に よ り促 進 され た(石 合 、和 田 未発 表)。 また、 野 生 型RepE二

量 体 か ら生 じた単 量 体 のori2へ の結 合 活性 は、RepE54単 量体 よ り明 らか に低 い

(図13参 照)。 これ らの こ とは、RepE二 量体 の解 離(モ ノマ ー化)以 外 に も分

子 シ ャペ ロ ン に依 存 す る(あ る い は しな い)活 性化 機 構 が存 在 す る可 能性 を示 して

い る。 この場 合 、RepE54は 部 分 的 に活 性 化 され た単 量 体 と考 えれ ば よい。 こ の考

え は、 ミニP1のRepAは 単 量 体 と して存 在 し、熱 シ ョ ック蛋 白質 に よっ て活 性 型

単量 体 に変 換 され る とい う ご く最 近 の推 測 と類 似 して い る(DasGuptaetal.,1993)。

ミ ニFプ ラ ス ミ ドのRepEの 異 な る2つ の機 能 が 、 二 量 体 、 単 量 体 に よ り担 わ れ

て い る こ と は 、RepEの2つ の機 能 を 説 明 す るTrawickandKlineの 「2段 階 分 子 モ デ

ル(two-stagemolecularmodel)」 を 連 想 させ る 。 彼 ら は 、normal(unmodified)

RepEは リ プ レ ッ サ ー と し て働 き、 こ の う ち の ご く少 量 のRepEがmodifiedRepEへ

変 換 し、01ゴ2に 結 合 し、 イ ニ シ エ ー タ ー と して 機 能 す る と考 え た(Trawickand

Kline,1985)。normalRepE(リ プ レ ッ サ ー)は 二 量 体 、mOdifiedRepE(イ ニ シ エ

ー タ ー)は 単 量 体 と考 え れ ば 、 我 々 の 結 果 は 、 こ の モ デ ル と 良 く一 致 す る 。

い ず れ に して も本 研 究 の結 果 は 、 ミニFプ ラ ス ミ ドの 複 製 開 始 制 御 を考 え る 上 で 、

45

RepEの 構造変 換(二 量体 →単量体)に よる機 能変 換 とい う正 の制御 が重要であ る

こ とを示 している。 さらに、負 の制御 も働 いている と考 え られ るが、 これは今後 明

らか に しなければな らない問題 である。

ミニFプ ラ ス ミ ド と複 製 様 式 が 類 似 した ミニP1、pSC101、R6Kな ど の 複 製 開 始

因 子 も、 ミ ニFのRepEと 同 様 に 、 複 製 を 開 始 す る イ ニ シ エ ー タ ー と 自 己 遺 伝 子 の

転 写 抑 制 を行 う リ プ レ ッサ ー の 主 要 な2つ の 機 能 を も つ 。 こ れ ら の 複 製 開 始 因 子 も

多 くが 二 量 体 で 精 製 さ れ 、 分 子 量 もRepEと 似 て い る が 、 一 次 構 造 上 の 類 似 性 は 見

ら れ な い(KornbergandBaker,1991参 照)。 興 味 深 い こ と に 、 こ れ ら の プ ラ ス ミ ド

で も、 高 い コ ピ ー 数 を 示 す 変 異 の 大 部 分 が ミ ニFと 同 様 に 、 複 製 開 始 因 子 の 中 央 部

分 に 集 中 し 、 そ の 変 異 の 多 くは 、 イ ニ シ エ ー タ ー 活 性 、 リ プ レ ッサ ー 活 性 に 影 響 が

見 られ る(forminiF;Helsbergetal.,1985;TrawickandKline,1985;Bexetal.,1986;

Kawasakieta1.,1991;IshiaietaL,1992:forminiP1;Scotteta1.,1982;Baumstarketal.,

1984;Austineta1.,1985;FroehlichandScott1988:forR6K;Stalkereta1.,1983;Inuzuka

andWada,1985:forpSC101;Armstrongetal.,1984;XiaetaL,1991,1993:forRts1;

Karnioetal.,1984:forRK2;DurlandetaL,1ggO;Hauganetal.,1992)。 ま た 、 変 異 イ ニ

シ エ ー タ ー 蛋 白 質 を 精 製 し、DNAへ の 結 合 活 性 を調 べ た 報 告 もあ る(forminiF;

Klineeta1.,1992;Kawasakietal.,1992:forminiP1;SozhamannanandChattoraj,1993:

forR6K;Filutowiczetal。,1986;Mironeta1.,1992;YorkandFilutowicz.,1993:for

pSC101;Xiaetal.,1991,1993;Manenetal.,1992:forRK2;LinandHelinski,1992>。

しか し、 本 研 究 で 分 離 し たrepE54変 異 の よ う に イ ニ シ エ ー タ ー 、 リ プ レ ッ サ ー 活

性 を分 離 で き る よ う な 表 現 型 を示 す も の は ま だ 報 告 され て お らず 、 し か も単 量 体 と

して 精 製 さ れ るRepE54が 分 離 さ れ た こ と は特 記 に値 す る 。 本 研 究 で 示 した よ う に

複 製 開 始 因 子 が 二 量 体 で オ ペ レ ー タ ー に結 合 し、 単 量 体 でoriへ 結 合 す る こ と は 、

pSC101で も報 告 さ れ て い る 。pSC101の イ ニ シ エ ー タ ー 蛋 白 質(RepA)は 、 ヘ テ

ロニ 量 体 を使 っ た ゲ ル シ フ ト法 に よ る解 析 か ら オ ペ レ ー タ ー に 二 量 体 で 結 合 し、

46

oriへ 単 量体 で結 合 す る と結 論 して い る(Manenetal .,1992)。P1の 場 合 、repA遺

伝 子 の オペ レー タ ー はoriの 一部 と重 複 して い る ため 、RepAがoriへ 単量 体 で結 合

し、2つ の機 能 を発 揮 す る と考 え られ(Chattorajetal .,1985;Wickneretal.,1991b)、

プ ラス ミ ドに よ り少 しず つバ リエ ー シ ョンが あ る よ うで あ る。 そ の他 の プ ラ ス ミ ド

の複 製 開始 因子 の機 能 と構二造 につ い て は 、 まだ 報告 され て い な い 。

第3節RepEの 機i能 ドメ イ ン

高 い イ ニ シエ ー ター活 性 を示 す ミニFプ ラス ミ ドのrepE変 異 は、RepEの92-134

残 基 の 限 られ た狭 い領 域 に1塩 基 置 換 をお こ して お り、 そ の うち 幾 つ か は 同時 に リ

プ レ ッサ ー活 性 が低 下 して い た。 これ は 、 ミニFの コ ピー数 調節 に92-129残 基 領

域 が 重 要 で あ ろ う とい う以 前 か らの主 張 と良 く一致 す る(KawasakietaL,1991)。

reρE54変 異 はArg117がProに 変 わ る1塩 基 置 換 変 異 で あ るの で 、Argll7は 二 量体

形 成 に 関 わ る と思 わ れ る。 もち ろ ん、 変 異 が蛋 白質 の コ ン フ ォー メ ー シ ョン に影 響

し、 間接 的 に二量 体 形 成 に影 響 して る可 能 性 もお お い に考 え られ る。 いず れ にせ よ、

二量 体 形 成 に関 わ る ドメ イ ンの決 定 は 明 か に すべ き今 後 の課 題 で あ る。

repEIO、repE40変 異 は、Gluepが それ ぞ れLys残 基 、Ala残 基 に変 わ る変 異 で あ る。

また 、 以 前 に 攻poH変 異株 で複 製 可 能 な変 異 ミニFプ ラス ミ ドと して分 離 した

repE22変 異 も、 このGlu,,がGly残 基 に変 わ る変 異で あ っ た(Kawasakietal.,1991)。

これ ら3種 のrepE変 異 は全 て、 イ ニ シエ ー ター活 性 が上 昇 し、 か つ 、 リプ レ ッサ

ー活 性 の 減 少 が見 られ た こ とは、 興 味 深 い。repE18、coρA1変 異 は、Glug9、Glul。 。の

そ れ ぞ れ が どち ら もLys残 基 へ 置 換 す る変 異 で あ り、 この どち ら もイ ニ シエ ー ター

活 性 は上 昇 す る が リ プ レ ッサ ー活 性 は野 生 型 と変 わ らな か った 。 ま た、repEl8、

coρA1の 二 重 変 異 も同様 で あ っ た(石 合 未 発 表)。 す な わち 、 こ れ らの残 基 は イ

ニ シ エ ー タ ー機 能 に特 異 的 に機 能 す る ら しい。

47

RepEの 機i能 に関 連 した別 の 、 非 常 に興 味 深 い知 見 はRepE40 、RepE54(そ れ ぞ れ

RepEの92、117残 基 に変 異 を持 つ)の 高 い イ ニ シ エ ー ター 活性 が 、RepEのC末 端

のrepE602フ レーム シ フ ト変異 に よ り抑 制 され る こ と(intergenicsupression)で あ る。

repE602変 異 単 独 で は イ ニ シ エ ー ター 活性 にそ れ ほ ど顕 著 な影 響 を与 え な い(図11

C)。 一 方.repE602変 異 はRepE40、RepE54の リプ レ ッサ ー機 能 に ほ とん ど影 響

を与 え な か っ た(デ ー ター提 示 せ ず)。 また 、repE40変 異 と同 じ残 基(GIUg,)が

Glyに 変 わ っ て い るrepE22変 異 もRepEのC末 端 のrepE317変 異 に よ りイ ニ シエ ー

タ ー活 性 が 減 少 したが 、repE317変 異 単 独 で は イ ニ シ エ ー ター 活性 の顕 著 な減 少 は

み られ な か った(川 崎 未 発 表)。 以 上 の結 果 は、RepEの イ ニ シエ ー ター機 能 特

異 的 にRepEの 中央 領 域 とC末 端 とが 相 互 作 用 す る こ と を強 く示 唆 す る。 な お、精

製RepEの ゲ ル シ フ ト法 に よる解析 で は、RepE40、RepE54のo㎡2へ の結 合 効 率 にC

末 端 の 辺ρE602変 異 が 与 え る影 響 はRepE40で は観 察 され たが 、RepE54に はそ れ ほ

ど顕 著 で は な か っ た(表6)。 従 っ て、RepEの 中央領 域 とC末 端 との相 互作 用 は

ori2へ の結 合 だ け で は な く、結 合 した後 の段 階 で も影 響 す る ら しい。 考 え られ る

RepEの 機 能 と して は、DNAの ベ ンデ ィ ング、 ア ン ワイ ンデ ィ ン グ(二 本 鎖DNAの

開裂)(川 崎 未 発 表)、 プ ラ イマ ー合 成 等 が あ り、 今後 ぜ ひ明 か に すべ き問 題 で

あ る。

第4節 今後 の問題点

本研 究 によ りRepEの 二量体 、単量体 がそれぞれ異 な るDNA領 域(オ ペ レーター、

イテ ロ ン)に 結合 す る ことが明確 に示 されたが、DNA結 合蛋 白質 としてRepEを と

らえた場 合、 同一 の蛋 白質 の フォームの違 い によ り、結合 す るDNA配 列 の好 みが

異 な るこ とは非常 に興味深 い。RepEとDNAの 相互作用 を結 晶解析 などの物理化 学

的方法 で検 討 する こ とも有効 であろ う。大腸菌 の比較 的低 い コピー数 の プラス ミ ド

や ファー ジ、 あるい は大腸 菌染色体 複製 のイニ シエー ター蛋 白質 は機瀧 的 に ミニF

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のRepEと 類 似 して い る(KombergandBaker ,1992参 照)が 、 これ らの イ ニ シエ ー

タ ー蛋 白質 問 の一 次 構造 上 の類 似 性 は少 な く、 既 知 のDNA結 合 モ チ ー フ も見 い だ

せ な い。 これ らは まだ知 られ て い な い新 しい タイ プ のDNA結 合 モ チ ー フ を持 つ も

の か も しれ な い。

次 に、 ミニFプ ラス ミ ド複 製 に お け る熱 シ ョック蛋 白質DnaK、DnaJ、GrpEの 役

割 を分 子 レベ ル で よ り直 接 的 に調 べ る必 要 が あ ろ う。 最 近 、 これ らの蛋 白質 の 「分

子 シ ャペ ロ ン」 と して の機 能 が 注 目 され、 また 、 これ らの ホ モ ロ グが真 核 生 物 で も

続 々 と見 つ か っ て きて い る(GeorgopoulosetaL,1990;Grossetal.,1990;CaplanetaL,

1993参 照)。 熱 シ ョック蛋 白質 とRepE、 宿 主 由来 の複 製 因子 等 の相 互作 用 も まだ

ほ とん どわ か っ て い な い。 そ の解 明 に 、変 異 蛋 白質 を組 み合 わ せ た 生化 学 的 な解 析

や、 遺伝 解 析 も有 力 な手 段 とな ろ う。

また 、RepEの 機 能 ドメ イ ンの 問題 もあ る 。前節 で も触 れ たが 、RepEの 中央領 域 、

C末 端 領 域 、 二 量 体 形 成 領 域 、DNA結 合 領 域 な ど、RepEの 機 能 、 蛋 白質 、DNAと

の相 互 作 用 な ど と密 接 に関 わ る問題 で もあ るが 、 まだ ほ とん どが 未 解 決 で あ る。 生

化 学 的 な解析 に加 え 、変 異体 を多 数分 離 、解 析 す るな ど遺伝 学 的 デ ー ター を多 く蓄

積 す る必 要 が あ る 。

最 後 に、 ミニFプ ラス ミ ドの複 製 制御 と我 々 の作 業 仮 説 との対 応 を検 討 す る こ と

が非 常 に重 要 で あ る。 現段 階 で は、RepEの 二 量体 か ら単 量体 へ の変 換 と、 複 製 制

御 、 コ ピー数 調 節 につ い て は全 く対 応 づ け られ て い な い。Fプ ラ ス ミ ドは宿 主 染色

体 とは異 な る が細 胞 周 期 の決 まっ た時 期 に複 製 す る こ とが 報 告 され て お り(

Keaslingetal.,1991;Koppes,1992)、 この 問題 は お そ ら く細 胞 周 期 制 御 と密 接 に関

連 して い る と思 わ れ る。 今 後 、 宿 主 大 腸 菌 の増 殖 と も関連 づ け て 、 ミニFプ ラス ミ

ド複 製 の制御 機 構 を解 析 す る必 要 が あ る。

49

参考文献

Akiyama,M.,Horiuchi,T.,andSekiguchi,M.(1987).Molecularcloningandnucleotide

sequenceofthemutTmutatorof、EscherichiacolithatcauseA:TtoC:Gtransversion.Mol.

Gen.Genet.206,9-16.

Ang,D.,Chandrasekhar,G.N.,Zylicz,M.,andGeorgopoulos,C.(1986).Escherichia

coli8rpEgenecodesfbrheatshockproteinB25.3,essentialfbrbothλDNAreplicationatall

temparaturesandhostgrowthathightempareture.J.Bacteriol.167,25-29.

Armstrong,K.A.,Acosta,R.,Ledner,E,Machida,Y.,Pancotto,M.,McCormick,M.,

Ohtsubo,H.,andOhtsubo,E.(1984).A37x103molecularweightplasmid-encoded

proteinisrequiredfbrreplicationandcopynumbercontrolintheplasmidpSC101andits

temparature-sensitivederivativepHS1.J.Mol.Biol.175,331-347.

Austin,S.J.,Mural,R.J.,Chattoral,D.K,,andAbels,A.L.(1985).Trans-and

Cis-actingelementsforthereplicationofPIminiplasmids.J.Mo1.Biol.183,195-202.

Baumstark,B.R.,Lowery,K.,andScott,J.R.(1984).LocationbyDNAsequence

analysisofc()ρmutationsaffectingthenumberofplasmidcopiesofprophagePl.Mol.Gen.

Genet.194,513-516.

Bex,F.,Pi6rard,P.,Desmyter,A.,Dr6ze,P.,Colet,M.,andCouturier,A.(1986).

Mini-FEprotein:thecarboxy-terminalendisessentialforEgenerepressionandmini-Fcopy

numbercontrol.J.Mol.Bio1.183,293-303.

Bramhill,D.,andKornberg,A.(1988).AmodelfbrinitiationatoriginsofDNA

replica口on.CeU54,915-918.

Bukau,B.,andWalker,G.C.(1989).△dnaK52mutantsofEscherichiacolihavedefects

inchromosomesegregationandplasmidmaintenancesatnormalgrowthtemperatures.J.

Bacteriol.171,6030-6038,

Casadaban,M.∫.(1976).Transpositionandfusionofthelacgenestoselectedpromotersin

EscherichiaooliusingbacteriophageLambdaandMu.J.Mol.Biol.104,541-556.

Caplan,A.J.,Cyr,D.M.,andDouglas,M.G.(1993).Eukaryotichomologuesof

EscherichiacolidnaJ:adiverseproteinfamilythatfunctionswithHSP70stressproteins.

50

Mol.Biol.Cell.4,555-563.

Chang,A.C.Y.,andCohen,S.N.(1978).J.Bacteriol.134,1141-1156.

Chattoraj.,D.K.,Snyder,K.M.,andAbeles,A.L(1985).PIplasmidreplication:

multiplefunctionsofRepAproteinattheorigin.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82,

2588-2592.

DasGupta,S.,Mukhopadhyay,G.,Papp,P.P.,Lewis,M.S.,andChattoraj',D.K.

(1993).ActivationofDNAbindingbythemonomericformofthePlreplicationinitiator

RepAbyheatshockproteinsDnaJandDnaK.J.Mol.Bio1.232,23-34.

Degnen,G.E.,andCox,EC.(1974).ConditionalmutatorgeneinE3chen'chiacoli:

isolation,mapping,ande脆ctorstudies.J.Bacteriol.117,477-487.

Durland,R.H.,Toukdarian,A.,Fang,F.,andHelinski,D.R.(1990).Mutationsinthe

崩replicationgeneofthebroad-host-rangeplasmidRK2resultinelevatedplasmidcopy

numbers.∫.Bacterio1.172,3854-3867.

Ezaki,B.,Ogura,T.,Mori,H.,Niki,H.,andHiraga,S.(1989).InvolvementofDnaK

proteininmini-Fplasmidreplication:temperature-sensitivesegmutationsarel㏄atedinthe

dnaKgene.Mol.Gen.Genet218,183-189.

Filutowicz,M.,Uhlenhopp,E.,andHelinski,D.R.(1986).Bindingofpurifiedwild-type

andmutantπinitiatorproteinstoareplicationoriginregionofplasmidR6K.J.Mol.Bio1.

187,225-239.

Froehlich,B.J,,andScott,J.R.(1988).AsingleaminoaciddifferencebetweenRep

proteinofPlandP7affectsplasmidcopynumber.Plasmid.19,121-133.

Georgopoulos,C.,Ang,D.,Liberek,K.,andZylicz,M.(1990).Propertiesofthe

Eschenichiacoliheatshockproteinsandtheirroleinbacteriophageλgrowth.inStress

proteinsinbiologyandmedicine,R.1.Morimoto,A.Tissieres,andC.Georgopoulos,eds.

(ColdSpringHarbor,NY:ColdSpringHarborLaboratory),pp.191-222..

Gross,C.A.,Straus,D.B.,Erickson,J.W,andYura,T.(1990).Thefunctionand

regulationofheatshockproteinsinEschen'chiacoli・inStressproteinsinbiologyand

medicine,R.1.Morimoto,A.Tissieres,andC.Georgopoulos,eds.(ColdSpringHarbor,

NY:ColdSpringHarborLaboratory),pp.167-189.

51

Hanahan,D.(1983).

Biol.166,557-580.

StudiesontransformationofEscherichiac(》liwithplasmids.J.Mol,

Hansen,E.B.,andYarmolinsky,MB.(1986).Hostparticipationinplasmidmaintenance:

dependentupondnaAofrepliconsderivedfromPIandF.Proc.Nat1.Acad.Sci.USA.83,

4423-4427.

Hashimoto,T.,andSekiguchi,M.(1976).Isolationoftemparature-sensitivemutantsofR

plasmidbyinvitromutagenesiswithhydroxylamine.J.BacterioL127,1561-1563.

Haugan,K.,Karunakaran,P.,Blanty,J.M.,andValla,S.(1992).Thephenotypesof

temparature-sensitivemini-RK2repliconscarryingmutationsinthereplicationcontrolgene

tTfAalesuppressednonspecificallybyintrageniccqρmutants.J.BacterioL174,7026-7032.

Helsberg,M.,Ebbers,J.,andEichenlaub,R.(1985).Mutationsaffectingreplicationand

copynumbercontrolinplasmidmini-Fbothresideinthegeneforthe29-kDaprotein.

Plasmid14,53-63.

Hupp,T.R.,andKaguni,J.H.(1993a).ActivationofDnaA5proteinbyGrpEandDnaK

heatsh㏄kproteinsininitiationofDNAreplicationinEscherichiacoli.J.Biol.Chem.268,

13137-13142.

Hupp,T.R.,andKaguni,J.H.(1993b).ActivationofmutantformsofDnaAproteinof

Esc乃erたhfacolfbyDnaKandGrpEproteinsoccurspriortoDNAreplication.J.Biol.Chem.

268,13143-13150.

Hwang,D.,S.,Crooke,EandKornberg,A.(1990).AggregateddnaAproteinis

dissociatedandactivatedforDNAreplicationbyphospholipaseordnaKprotein.

J.Biol.Chem.265,19244-19248.

Hwang,D.,S.,andKaguni,J.M.(1991).dnaKproteinstimulatesamutantformofdnaA

proteininE3chehohfaoolfDNAreplication.J.Biol.Chem.266,7537-7541.

Ikeda,E.,andToh-e.,A.(1993).RstlproteinisayeasthomologueofEscherichiacoli

heatsh・ ・kp・ ・t・i・GrPEandisrequi・edf・ ・mai・tenance・fmit・ch・ ・drialfuncti・n・ 第16回

日 本 分 子 生 物 学 会 年 会 要 旨 集 、pp.151.

Inuzuka,M.,andWada,Y. (1985).Asingleaminoacidalterationintheinitiatorproteinis

52

responsiblefortheDNAoverproductionphenotypeofcopynumbermutantsofplasmidR6K .

E】〉[BOJ.4,2301-2307.

Ishiai,M.,Wada,C.,Kawasaki,Y.,andYura ,T.(1992).Mini-Fplasmidmutantsable

toreplicateinEscherichiacolideficientintheDnaJheatshockprotein.J.Bacteriol.174,

5597-5603.

Jacob,B.,Brenner,S.,andCuzin,F.(1963).OntheprocessregulationofDNA

replicationinbacteria.ColdSpringHarborQuant.Biol.28,329-348.

Kamio,Y.,Tabuchi,Y.,Itoh,Y.,Katagiri,H.,andTerawaki,Y.(1984).Complete

nucleotidesequenceofmini-Rtslanditscopymutant.」.Bacteriol.158,307-312.

Kawasaki,Y.,Wada,C.,andYura,T.(1990).RolesofE3c力e加 力ゴacoliheatshock

proteinsDnaK,DnaJandGrpEinmini-Fplasmidreplication.Mol.Gen.Genet.220,

277-282.

Kawasaki,Y.,Wada,C.,andYura,T.(1991).Mini-Fplasmidmutantsabletoreplicatein

theabsenceofσ32:mutationsinthe爬 ρEcoごHngregionproducinghyperactiveinitiatorprotein。

J.Bacteriol.173,1064-1072.

Kawasaki,Y.,Wada,C.,andYura,T.(1992).BindingofRepEinitiatorproteintomini-F

DNAorigin(ori2):enhancingeffectsofr(4)EmutationsandDnaJheatshockprotein.J.BioL

Chem.267,11520-11524.

Keasling,J.D.,Palsson,B.0.,andCooper,S.(1991).Cell-cycle-specificFplasmid

replication:regulationby㏄11sizecontrolofinitiation・J・Bacteriol・173,2673-2680.

Kline,B.C.(1985).Areviewofmini-Fplasmidmaintenan㏄.Plasmid14,1-16.

Kline,B.C.,Kogoma,T.,Tam,J.E,andShields,M・S.(1986).Requirementofthe

EschenichiacolidnaAgeneproductforplasmidFmaintenance.J.BacterioL168,440-443.

Kline,B.C.,Sandhu,G.S.,Eckloff,B.W.,andAleff,R.A.(1992).Site-specific

proteolysisofmini-FplasmidreplicationproteinRepEdestroysinitiatorfunctionand

generatesanincompatibilitysubstance.J.BacterioL174,3004-3010.

KoPPes,L.J.H.(1992).NonrandomF-plasmidreplicationinEscherichiacoliK-12・J・

Bacteriol.174,2121-2123.

53

Kornberg.A.,andBaker,T.(1992).inDNAreplication.(NewYork:W.H。Freemanand

company),pp.637-687.

Kusukawa,N.,andYura,T.(1988).HeatshockproteinGroEofEscheri'chiao()li:key

protectiverolesagainsttherrnalstress.GenesDev.2,874-882.

Laue,T.M.andRhodes,D.G.(1990).inMethodsinenzymology,vol.182,M.

P.Deutscher,ed.(SanDiego,CA:AcademicPress),pp.566-587

Lin,J.,andHelinski,D.R.(1992).Analysisofmutationsin崩,thereplicationinitiation

geneofthebroad-host-rangeplasmidRK2.J.BacterioL174,4110-4119.

Maki,S.,Kuribayashi,M.,Miki,T.,andHoriuchi,T.(1983).Anamberreplication

mutantofFplasmidmappedintheminimalreplicationregion.Mo1.Gen.Genet.191,

231-237,

Manen,D.,Upegui-Gonzalez,L-C.,andCaro,L(1992).Monomersanddimersofthe

RepAproteininplasmidpSC101replication:domainsinRepA.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.

89,8923-8927.

Masson,L,andRay,D.S.(1986).MechanismofautonomouscontroloftheE3cゐ ㎝'chia

coliFplasmid:differentcomplexesoftheinitiator/repressorproteinareboundtoitsoperator

andtoanFplasmidreplicationorigin.NucleicAcidsRes.14,5693-5711.

Masson,L,andRay,D.S.(1988).MechanismofautonomouscontroloftheEscherichia

coliFplasmid:purificationandcharacterizationofthe鐙 ρEgeneproduct.NucleicAcidsRes.

16,413-424.

Miller,J.H.(1972).inExperimentsinmoleculargenetics,(ColdSpringHarbor,NY:Cold

SpringHarborLaboratory),pp.352-355.

Miron,A.,Mukherjee,S.,andBastia,D.(1992).Activationofdistantreplicationorigins

invivobyDNAIoopingasrevealedbyanovelmutantformofaninitiatorproteindefectivein

cooperativityatadistance.EMBOJ.11,1205-1216.

Muraiso,K,Tokino,T.,Murotsu,T.,andMatsubara,K.(1987).Replicationofmini-F

plasmidinvitropromotedbypurifiedEprotein.MoLGen.Geneし206,519-521.

54

Murakami,Y.,Ohmori,H.,Yura,T.,andNagata,T.(1987).Requirementofthe

Eschen'chiacolidnaAgenefunctionforori-2-dependentmini-Fplasmidreplication.J.

Bacteriol.169,1724-1730.

Murotsu,TりMatsubara,K.,Sugisaki,H.,andTakanami,M.(1981).Nineunique

repeatingsequencesinaregionessentialfbrreplicationandincompatibilityofthemini-F

plasmid.Gene15,257-271.

Murotsu,T.,Tsutsui,H.,andMatsubara,K.(1984).Identificationoftheminimal

essentialregionforthereplicationoriginofmini-Fplasmid.Mol.Gen.Genet.196,373-378.

01sen,P.H.,Esmon,N.L,Esmon,C,T.,andLaue,T.M.(1992).Ca2+dependenceof

theinteractionsbetweenproteinC,thrombin,andtheelastasefragmentofthrombomodulin.

Analysisbyultracentrifugation.Bi㏄hemistry31,746-754.

Rokeach,LA.,S②gaard-Andersen,L,andMolin,S.(1985).TwofunctionsoftheE

proteinarekeyelementsintheplasmidFreplicationcontrolsystem.J.Bacterio1.164,

1262-1270.

Sakakibara,Y.(1988).ThednaKgeneofEscherichiacolifunctionsininitiationof

chromosomereplication.J.Bacteriol.170,972-979.

Sambrook,J.,Fritsch,ER,andManiatis,T.(1989).inMolecularcloning:alaboratory

manual.(ColdSpringHarbor,NY:ColdSpringHarborLab.).

Schneider,G.J.,andGeiduschek,E.P.(1990).StoichiometryofDNAbindingbythe

bacteriophageSPO1-encodedtypeHDNA-bindingproteinTF-1.J.Bio1。Chem.265,

10198-10200.

Scott,J.R。,Kropf,M.M.,Padolsky,L,Goodspeed,J.K。,Davis,R.,andVapnek,D.

(1982).MutantsofplasmidprophagePlwithelevatedcopynumber:isolationand

characterization.J.Bacteriol.150,1329-1339.

Sell,S.M.,Eisen,C.,Ang,D.,Zylicz,M.,andGeorgopoulos,C.(1990).Isolationand

characterizationofdnaJnullmutantsofEscheriのchiaco〃.J.Bacteriol.172,4827-4835.

Silhavy,T.J.,Berman,M.L.,andEnquist,LW.(1984).inExperimentswithgene

fusions.(ColdSpringHarbor,NY:ColdSpringHarborLab.).

55

Sogaard-Andersen,L,Rokeach,L.A.,andMolin,S.(1984).Regulatedexpressionofa

geneimportantforreplicationofplasmidFinE.coli.EMBOJ.3,257-262.

Sozhamannan,S.,andChattoraj,D.K.(1993).HeatshockproteinsDnaJ,DnaK,and

GrpEstimulatePlplasmidreplicationbypromotinginitiatorbindingtotheorigin.J.

Bacteriol.175,3546-3555.

Stalker,D.M.,Filutowitcz,M.,andHelinsky,D.R.(1983).Releaseofinitiationcontrol

byamutationalalterationintheR6KπproteinrequiredforplasmidDNAreplication.Proc.

Natl.Acad.Sci.USA.80,5500-5504.

Studier,F.W.,Rosenberg,A.H.,Dunn,J.J.,andDubendo㎡f,J.W.(1990).in

Methodsinenzymology,vol.185,Goedde1,D.V.,ed,(SanDiego,CA:AcademicPress),

pp.60-89.

Takagi,T.(1981).ConfirmationofmolecularweightofAspergillusoryzaeor-amylaseusing

thelowanglelaserIightscatteringtechniqueincombinationwithhighpressuresilicagel

chromatography.J.Biochem.89,363-368.

Tilly,K.,andYarmolinsky,M.(1989).ParticipationofEschenichiacoliheatshock

proteinsDnaJ,DnaK,andG】q)EinPIplasmidreplication.J.Bacterio1.171,6025-6029.

Tokino,T.,Murotu,T.,andMatsubara,K.(1986).Purificationandpropertiesofthe

mini-Fplasmid-encodedEproteinneededforautonomousreplicationcontrolofheplasmid.

Proc.Natl.Acad.Sci.USA.83,4109-4113.

Tolun,A.,andHelinski,D.R.(1982).Separationoftheminimalreplicationregionofthe

Fplasmidintoareplicationoriginsegmentandatrans-actingsegment.Mol.Gen.Genet.

186,372-377.

Trawick,J.D.,andKline,B.C.(1985).Atwo-stagemolecularmodelforcontrolof

mini-Freplication.Plasmid13,59-69.

Wada,C.,Akiyama,Y.,Ito,K.,andYura,T.(1986).InhibitionofFplasmidreplication

inhtpRmutantsofEscherichiacolideficientinsigma32protein.Mol.Gen.Genet.203,

208-213.

Wada,C.,Imai,M.andYura,T.(1987).Hostcontrolofplasmidreplication:requirement

oftheσfactorσ32intranscriptionofmini-Freplicationinitiatorgene.Proc.Natl.Acad.Sci.

56

USA.84,8849-8853.

Wada,M.,Kadokami,Y.,andItikawaH.(1982) .ThermosensitivesynthesisofDNAand

RNAindηa/mutantsofEscherichゴacoliK-12.Jpn.J .Genet.57,407-413.

Wada,M.,Kohno,K.,Imamoto,F.,andKano,Y.(1988).Panicipationofhupgene

productinoni2-dependentreplicationoffenilityplasmidF.Gene70,393-397.

Watson,LA.,S.H.Phua,P.L.Berguist,andLane,H.E.D.(1982).AnMr29000

proteinisessentialformini-FmaintenanceinE.coli.Gene.19,173-178。

Wickner,S.H.(1990).ThreeEscherichiacoliheatshockproteinsarerequiredforPl

plasmidDNAreplication:fbrmationofanactivecomplexbetweenE.coliDnaJproteinandthe

PIinitiatorprotein.Proc.Nat1.Acad.Sci.USA.87,2690-2694.

Wickner,S.,Hoskins,J.,andMcKenney,K(1991a).FunctionofDnaJandDnaKas

chaperonesinorigin-specificDNAbindingbyRepA.Nature350,165-167.

Wickner,S.,Hoskins,J,,andMcKenney,K.(1991b).MonomerizationofRepAdimers

byheatshockproteinsactivatesbindingtoDNAreplicationorigin.Proc。Natl.Acad.Sci.

USA.88,7903-7907.

Wickner,S.,Skowyra,D.,Hoskins,J.,andMcKenney,K.(1992).DnaJ,DnaK,and

GrpEheatshockproteinsarerequiredinonPlDNAreplicationsolelyattheRepA

monomerizationstep.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89,10345-10349.

Wild,J.,Kamath-Loeb,A.,Ziegelhoffer,E.,Lonetto,M.,Kawasaki,Y.,andGross,C.

A.(1992).PartiallossoffunctionmutationsinDnaK,theEscherichiacolihomologueofthe

70-kDaheatshockproteins,affecthighlyconservedaminoacidsimplicatedinATPbinding

andhydrolysis.Proc.NatLAcad.Sci.USA.89,7139-7143。

Xia,G.-X.,Manen,D.,Goebel,T.,Linder,P.,Churchward,G.,andCaro,L.(1991).

Acopy-numbermutantofplasmidpSClO1.Mol.Microbiol.5,631-640.

Xia,G.-X.,Manen,D.,Yu,Y.,andCaro,L.(1993).Inviyoandinvitrostudiesofa

copynumbermutationoftheRepAreplicationproteinofplasmidpSC101.J.Bacteriol.175,

4165-4175.

Yang,C-C.,andNash,H.A.(1989).TheinteractionofE.coliIHFproteinwithitsspecific

57

bindingsites.Cell57,869-880.

York,D.,andFilutowicz,M.(1993).Autoregulation-defectivemutantoftheplasmid

R6K-encodedπproteindistinguishesbetweenpalindromicandnonpalindromicbindingsites.

」.Biol.Chem.268,21854-21861.

Zylicz,M.,Yamamoto,T.,McKittrick,N。,Sell,S.,andGeorgopoulos,C.(1985).

PurificationandpropertiesofthednaJreplicationproteinofEscheri'chiacoli.J.Biol.Chem.

260,7591-7598.

58

謝辞

本研 究 を進 め るにあた り、本 当に多 くの方 々か ら御 指導、御 協力 、そ して激励 を

頂 きました。指導 していただいた由良隆名誉 教授(現HSP研 究所)、 和 田千 恵子

助手 には、大変感 謝 してい ます。又、永 田俊夫助教授、森浩禎助手(現 奈 良先 端

大 、助 教授)に は、 セ ミナーな どで多 くの御 助言 を頂 きました。

東 京都立大 学の市川比 良久教授、九州大学 の堀内嵩助教授(現 基生研 、教授)、

C.Georgopoulos教 授 、Wisconsin大 学 のC.Gross教 授 には菌株 を、B.Kline博 士 に

は菌株 とプラス ミ ドを、R.Eichenlaub博 士 にはプラス ミ ドを、大 阪大 学の松原謙 一

教授 には抗体 をそれ ぞれ分 与 していただ きま した。又、京大 ウイルス研 の重定勝哉

助教授 には、蛋 白質 の精製 な どの生化学実験 につ いて多 くのア ドバ イス を頂 きま し

た。大阪大 学 の高木俊 夫教授 、八木芳子 さん、東 レ ・リサ ーチセ ンターの絹川 明夫

博 士、 ベ ックマ ン ・テクニカルセ ンターの小 泉正博 さんには蛋 白質 の分子量決定 の

際、多 くの御助 言 と御協 力 を賜 りました。 ここに、厚 くお礼 申 し上 げ ます。

学会 や ワー クシ ョップな どで も、多 くの方 々か ら議論 をしていただ き、有益 な御

助 言 を頂 きま した。特 に、金沢大学 の山口和 男教授 、福 井医科大学 の犬塚 学教授 、

奈 良先端技術大 学 の真 木寿治教授 、基礎 生物学研 究所 の堀 内嵩教授、 国立遺伝 学研

究所 の堀 内賢介教授 の名前 をあげ、感謝 の意 を記 してお きます。

また、京大 ウイ ルス研 究所 の諸先生方 な らびに、大学院生 の方 々か らも多 くの御

助 言、御 援助 を していただ きました。特 に、川崎泰生 さん(現 阪大助手)に はい

ろ いろ とお世話 にな りま した。又、 三原真 理子 さん、 田中喜代 子 さん、吉 岡幸代 さ

ん には実験準備 な どで大変 お世話 にな りま した。心 か ら感謝 いた します。

最後 に、影 なが ら支 えて くれた家族 に感謝 します。

平成6年1月

石合 正道

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