The macrophage cholesterol exporter ABCA1 functions as an anti-inflammatory receptor

The Journal of Biological Chemistry, published on September 25th, 2009 as Manuscript

Chongren Tang, Yuhua Liu, Peter S.Kessler, Ashley M.Vaughan and John F.Oram

Division of Metabolism, Endocrinology and Nutrition, Department of Medicine, University of Washington, Seattle.

ATP-binding cassette transporter A1

(ABCA1) è una proteina integrale

di membrana, responsabile dell’efflusso

del colesterolo dalle cellule e…

...espleta un’azione immunomodulante!!!

• Funzione e trasporto del colesterolo

• Struttura e regolazione dell’espressione di ABCA1

• Receptor-like activity and lipid transport model

Il colesterolo è un metabolita abbondante nei tessuti dei mammiferi,essenziale per parecchie funzioni biologiche.

Fluidità di membrana

Lipid rafts

Precursore

Ormoni steroidei:-Mineralcorticoidi,-Glucocorticoidi,-Ormoni sessuali

Vitamina D

Acidi Biliari

Esteri delcolesteroloACAT

1

2

3

45

6a

6b

76

6c

8

Le lipoproteine sono formate da : 1) apoproteine (alfa-elica amfipatica)2) fosfolipidi 3) trigliceridi 4) colesterolo libero ed esterificato 5) acidi grassi liberi

Classificazione delle Lipoproteine%proteine

1-2

7-10

10-12

20-22

30-3555-77

99

LDL Le LDL sono il principale trasportatore di

colesterolo ai tessuti. L'uptake delle LDL avviene per via recettoriale al fegato (75/%), corteccia surrenale e tessuto adiposo e MACROFAGI.

12

3a

3b4a

4b

5

Immagine in TEM dell’endocitosiMediata da recettore delle LDL

HDLA subfraction of circulating lipoproteins called high-density lipoproteins

(HDLs) is involved in the export of excess cholesterol from cells

• Una delle maggiori funzioni delle HDL è il trasporto del colesterolo dai tessuti periferici al fegato, dove esso viene escreto nella bile.

• Si ritiene che la rimozione dell’eccesso di colesterolo dai macrofagi del connettivo vascolare da parte delle HDL abbia un ormai ben stabilito effetto cardioprotettivo.

Core di esteri del colesterolo

Sono stati identificati tre trasportatori di membrana che mediano l’efflusso del colesterolo dalle cellule alle componenti delle HDL.

Essi appartengono alla superfamiglia “ ATP-binding cassette transporters (ABCs) “[trasportatori di membrana ATP-dipendenti]:

• ABCA1 trasporto di colesterolo, fosfolipidi ed altri metaboliti alle apoproteine delle HDL;

è altamente espresso in fegato e macrofagi tissutali;• ABCG1 e ABCG4trasporto del colesterolo a HDL e altre

lipoproteine; ABCG1 è anch’esso espresso nei macrofagi e lavora in sinergia con

ABCA1 nel rimuovere il colesterolo in eccesso. ABCG4 è selettivamente espresso nei neuroni dove è specializzato

nel trasporto lipidico

• Funzione e trasporto del colesterolo

• Struttura e regolazione dell’espressione di ABCA1

• Receptor-like activity and lipid transport model

ABCA1

NBD1

NBD2

WalkerB

WalkerAWalkerC

Substrati Accettori

Fosfolipidi(fosfatidilcolina)Colesterolo

Proteine contenenti alfa-eliche anfipatiche (11,22aa),in cui gli aa carichi si dispongono lungo una faccia dell’asse,gli aa idrofobici sulla faccia opposta!

Apolipoproteine di HDL:A-I, A-II, E, C-I, C-II, C-III, A-IV

PLTP: phospholipid-transfer-protein

Cytogenetic location: 9q31.1

The cellular transporter ABCA1 is a critical protein that transports excess free cholesterol (FC) out of the cell to an acceptor, lipid-poor apo A-I.ABCA1 gene transcription is regulated by the nuclear receptor heterodimer liver X receptor/retinoid X receptor (LXR/RXR). Cellular oxysterols appear to be one of the endogenous ligands for LXR and promote the transcription of ABCA1. Oxysterols are generated from free cholesterol. Presumably, this represents a homeostatic mechanism by which macrophages rid themselves of excess free cholesterol. LXR gene transcription is also influenced by both peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR-) and PPAR-

oxysterolsLXR/RXR

ABCA1

PPARsA-I

• Funzione e trasporto del colesterolo

• Struttura e regolazione dell’espressione di ABCA1

• Receptor-like activity and lipid transport model

Receptor-like activity

ABCA1 is unique among eukaryotic ABC transporters that requires the direct binding of the acceptor for the transported substrate.The ABCA1 binding determinant of apolipoproteins is the amphipatic α-helix.This binding may be mediated by the large extracellular loops of ABCA1,which are unique for this family of transporters.

The interaction of apolipoproteins with ABCA1-expressing cells also activates signaling molecules that modulate ABCA1 expression or lipid transport activity:these findings suggest that apolipoprotein/ABCA1 interactions behave like a ligand/receptor system.In fact, this interaction stimulates autophosphorylation of tyrosine kinase Jak2,thus generating the active Jak2:apo A-I potentiates its own interaction with ABCA1 by activating Jak2,which in turn increases the apo A-I binding to ABCA1 required for lipid removal

RECEPTOR ACTIVITY

(FEEDFORWARD MECHANISM)

ATP

ADP

P

Chamber

LIPID TRANSPORT MODEL

(A)Phospholipids and perhaps free cholesterol ( C ) are translocated across the plasma membrane to form tightly packed and disordered lipid domains that

protrude from the cells. (B) Apo A-I binds to ABCA1 and stimulates phosphorilation of Jak2.( C ) The phosphorilated/activated Jak2 enhances the

Apo A-I binding to ABCA1 required for interaction with lipid domains generated by ABCA1.(D)Apo A-I solubilizes the lipids to form nascent HDL particles.

HDL

3 4 5

2

ATP-binding cassette transporter A1

(ABCA1) è una proteina integrale

di membrana, responsabile dell’efflusso

del colesterolo dalle cellule e…

...espleta un’azione immunomodulante!!!

Cholesterol uptake

• LDL e oxLDL• Uptake di oxLDL: recettori

Scavenger• Signaling pathway associato

a Recettori Scavenger

LDL/LDL-R

LDL

…Le LDL sono tutte uguali?

oxLDL (LDL modificate)

LDL

Danno da Radicali Liberi (ROS,RNS):

-respirazione cellulare(mitocondriale) -ossidasi microsomiali-catalizzatori chimici (metalli di transizione)-prodotti di PMN (NADPH ossidasi, Mieloperossidasi)

-introito alimentare di lipidi ossidati(termo-ossidazione:frittura)

Perossidazione del colesterolo

LDL

Acido linoleico (C18)Acido 9-idrossi-octadecadienoico

Tirosinanitrotirosina

Glucosio SteroliossiSteroli

Formazione di AGECross Links

oxLDL

Site of chemical modifications in in vivo LDL− and ONOO−-treated LDLThe secondary structure of the apoB-100 is showed. We show the chemical modifications in LDL− and ONOO−-treated LDL.

Gli AGE sono in grado di modificare i gruppi aminici primari dei fosfolipidi e delle apo(B-100) delle lipoproteine a bassa densità (LDL).

Gli AGE, inoltre, sono in grado di iniziare una serie di reazioni ossidative che promuovono la generazione di LDL ossidate.

• Treatment of native LDL with ONOO- resulted in extensive tyrosine nitration , accumulation of lipid peroxides, and loss of α-helical structure and, as a corollary, formation of oxLDL:

Nitrotyrosine and lipid peroxide accumulation are synergistically responsible for unfolding of α-helices inherent in LDL− formation.

• Glucose reacts nonenzymatically with the amino groups of proteins to form stable, cross-linking adducts called advanced glycation end products or AGEs.

tyrosine nitration lipid peroxides

cross-linking

Self o NON-SELF?(that’s the question!)

SELF ALTERATO!!

Le LDL modificate sembra che possano essere riconosciute da recettori specifici a livello delle cellule

endoteliali e dei monociti/macrofagi e sono in grado quindi di indurre modificazioni fenotipiche di tipo secretorio e

proliferativo.

Pattern di espressione genica (geni della flogosi)

Citochine proinfiammatorieMolecole di adesione cellulare

oxLDL Motilità dei macrofagi

sulla parete arteriosa

Azione chemiotattica induce

IMMUNOGENA

le LDL modificate (oxLDL) non vengono riconosciute dal recettore fisiologico LDL-R

come vengono internalizzate?

OOH

ROOH

.oo

ONOO-

Recettori SCAVENGER

Per Recettori scavenger(=“spazzini”) s’intende un gruppo di recettori capaci di legare le LDL modificate(ossidate,acetilate).

Sono prevalentemente espressi sui macrofagi(immunità innata)

Modified proteins

Oxidised

LDL

Acetylated LDL

AGE-protei

ns

Apoptotic cells’Phosphatidyl serine

Bacterial component

s

LPS Lipoteichoic acid

• Scavenger receptor class A:-Trimers-collagene-like domain-cysteine-rich domain

• Scavenger receptor class B:-two transmembrane domains-situated in specific plasma membrane

microdomains, the caveolae (lipid rafts).

They preferentially bind modified LDL by acetic acid and oxidized LDL

CD36

LOX-1:lectin-like

oxidized low-density

lipoprotein receptor-1

Recettore Scavenger di classe A Recettore Scavenger di classe B

The binding of oxidized low density lipoprotein(LDL) to CD36 is mediated in part by oxidized phospholipids that are associated with

both the lipid and protein moieties of the lipoprotein.

endocitosiOssisteroli

Oxidized fatty acid

CD36-dependent signaling pathway

Dominio di omologia CD4/CD8:

CysXCysX 5lys(CXCX 5K)

Src-family nonreceptor protein

tyrosine kinases fyn, lyn

site of interaction with Src- tyrosine

kinases

LYNATP

Proteina adattatrice

P

P

P

Grb2-SoS

Ras_GDPGTP

MAPK

FosVav

Rac-GDPGTP

JNK

ATP

JunP

AP-1

LYN

Proteina adattatrice

P

P

P

PLCPKC

IKKP

NF- κBIκBP

FosJunP NF- κB

Activator Protein – 1 (AP-1)

• Fas• IL12• MMPs(MMP1, MMP2, MMP3, MMP13)

• TNFα• iNOS• Fas• MMPs• CD40• IL-1• IL-6,IL-12• CCL2(MCP-1)

Induzione della

Flogosi

Innesco dei meccanismi

effettori dell’immunità

innata

CD36

oxLDL

Geni della

Flogosi

Uptake delle oxLDLInduzione di un nuovo profilo trasduttivo

LDL

•Macrophage response to oxidized lipid-loading:

A PATHWAY FOR CHOLESTEROL EFFLUX

PPARγ-LXRα-ABCA1 Pathway

oxLDL

Acidi grassi ossidati

ossisteroli

PPARγAttiva la

trascrizione di

LXRα

RXR α

CD36(Meccanismoa feedback)

Foam Cells

ABCA1

Sembra,quindi,che il rilascio di colesterolo e lipidi ossidati dalle oxLDL provveda alla

clearance dei lipidi attraverso la trascrizione attivata di ABCA1

Efflusso di colesterolo (Apo-A1)

CD36

oxLDL

Geni della

Flogosi

• Uptake delle oxLDL• Induzione di un nuovo profilo trasduttivo

(profilo infiammatorio)

Upregulation di ABCA1

PPARγLXRα

ABCA1

APO-A1

HDL

ABCA1 as an anti-inflammatory

receptor

APO-A1

P

ESPERIENZE

Prima Esperienza (FIG.1,A-D)

A n established line of Syrian hamster cells, descended from a clone (Clone 13) isolated by Stoker and McPherson from an unusually rapidly growing primary culture of new born hamster kidney tissue. Usually described as fibroblastic,

although smooth muscle like in that they express the muscle intermediate filament protein desmin. Widely used as a viral host, in studies of oncogenic transformation

and of cell physiology.

Modello sperimentale: BHK-Cells

TRANSFEZIONEIntroduzione di acidi nucleici (DNA,RNA) in cellule

eucariotiche. Si avvale dell’uso di genomi virali ingegnerizzati(gene Target,sequenze di integrazione),

sfruttando la capacità del virus di trasmettere DNA. (in genere retrotrascrizione tramite Retrovirus)

- + - + - +

ABCA1

APO-A1

ABCA1C JAK2

IP IB

JAK2

JAK2

ABCA1

P-JAK2

JAK2

P-JAK2

A

B

D

immunoblottingimmunoprecipitazione

BHK-cells

RU-486

• L’incubazione di BHK-cells che esprimono ABCA1 con APO-A1 induce un aumento di Fosfo-JAK2 (N.B. JAK2 si autofosforila,attivandosi, e fosforila un residuo tirosinico su ABCA1)-(Fig.1A)

• L’aumentata fosforilazione di JAK2 non è direttamente correlata ad un aumento della propria espressione genica: la forma fosforilata,secondo un meccanismo APO-A1/ABCA1-dipendente è relativa ad un pool citoplasmatico preesistente (Fig.1B)

• L’immunoprecitpitazione di ABCA1 e la rivelazione di JAK2 tramite anticorpi anti-JAK2,(immunoblotting),rivela un’interazione tra ABCA1 e JAK2(non fosforilata) ,non quantitativamente correlabile con il pretrattamento con APO-A1,suggerendo che tale interazione sia costitutiva. (Fig.1C)

• La forma fosforilata di JAK2,tuttavia,viene rivelata(con anticorpi anti JAK-2-Fosforilato) , solo successivamente a pretrattamento con APO-A1, suggerendo che l’attivazione di JAK2 (P-JAK2) sia da imputarsi all’interazione di APO-A1 con ABCA1. (Fig.1D)

*AG490:potente inibitore della tirosin-chinasi JAK2; permea attraverso la membrana plasmatica.

Le BHK-Cells che esprimono ABCA1sono state incubate con APO-A1. Il pretrattamento con AG490*(+) è stato operato 30minuti prima. Gli immunoprecipitati(ABCA1) sono stati trattati con anticorpi anti-fosfotirosina.

Plasmide vuoto(controllo

negativo)

• La tirosin-chinasi JAK2 è responsabile della fosforilazione di ABCA1.

• Inibitori di JAK2(es.AG490) rivelano,infatti,una minore (ma non nulla)fosforilazione di ABCA1,definibile come “basale”.

• L’attivazione di JAK2 incrementa di due volte lo stato di fosforilazione di ABCA1

ApoA-I stimulates ABCA1-bound JAK2 autophosphorylation and ABCA1 tyrosine phosphorylation

XII

P

APO-A1

JAK2P

P -Tyr

JAK2..e STATs?

STAT: Signal Transducers and Activator of Transcription(fattori trascrizionali attivati da Chinasi della famiglia Janus)

2a esperienza (Fig.2)

Modello sperimentale -Linea cellulare J774 (macrofagi murini): modello Biologico-BHK-cellsInduttori di ABCA1 (N.B.:in assenza dell’induttore,ABCA1 non si rileva!)

- TO-901317:agonista non steroideo di LXR,permeante la membrana (in J774,acLDL overnight)

-Mifepristone / RU-486(in BHK-cells)

(/P-STAT5)

AG409

• L’attivazione di JAK2 lascia prevedere che associato ad ABCA1 sussista un meccanismo di trasduzione tramite il sistema JAK/STAT.

• L’incubazione con di BHC-cells non transfette non rivela nessun effetto sulla fosforilazione di STAT1,3,5.

• Tuttavia sia nel modello sperimentale(BHC-Cells transfette cn ABCA1) sia in quello biologico di macrofagi carichi di colesterolo (J774,trattate cn TO-901317 che induce ABCA1),si determina un aumento di P-STAT3 ma solo dopo preincubazione con APO-A1. Tale effetto non si osserva per STAT1,5.

• L’interazione di APO-A1,induce il reclutamento di STAT3 nonché della tirosin-chinasi-JAK2.

• STAT3 è fosforilata da JAK2

ApoA1 interactions with ABCA1-expressing cells increases phosporylation of ABCA1-

associated STAT3

I domini citoplasmatici di legame a STAT3(docking sites) presentano una sequenza aa altamente conservata

YXXQ(-Tyr-X-X-Gln-)

aa 924927 aa 19901993

Tyr Glu Gly GlnTyr

Cys Pro GlnY E G QY C P Q

J NBD1 J NBD2

G

gp130(prototypic STAT3 docking site)

3° esperienzaModello sperimentale: transfected BHK-cells

(Mifepristone; [ 3H]colesterolo)

•ABCA1-WT•ABCA1 Y924F•ABCA1 Y1990F•ABCA1 Y924/1990F

Tyr924,1990

Phe

Mutagenesi sito-diretta(QuikChange XL SiteDirected Mutagenesis Kit)

Mutagenesi sito-specifica• è una tecnica di biologia molecolare in cui una mutazione è

creata in modo selettivo in un particolare sito di una molecola di DNA, solitamente un plasmide. La tecnica differisce quindi dalla normale mutagenesi in cui vengono indotte mutazioni che però si distribuiscono in modo casuale nella sequenze di DNA. In genere la mutagenesi sito specifica richiede la conoscenza della sequenza di tipo selvatico (wild type) del gene da mutagenizzare. La mutazione inserita potrà essere una sostituzione di base o una inserzione o delezione di nucleotidi rispetto alla sequenza originaria.La tecnica è talvolta chiamata anche mutagenesi sito diretta o mutagenesi oligonucleotide diretta.

DNAsi di restrizione per DNA metilato

Fig.3

• La mutazione sito diretta su ABCA1 dei siti di interazione di STAT3 ha prodotto i risultati attesi:le cellule Y924P,Y1990P e Y924/1990P mostrano una marcata riduzione nella fosforilazione di STAT3 APO-A1-indotta;essa è abolita nelle cellule a doppia mutazione,suggerendo un meccanismo di cooperazione tra i due docking-sites(Fig.3B)

• La co-immunoprecipitazione di ABCA1 e STAT3 si osserva in cellule WT e non in cellule a doppia mutazione(Y924/1990P),implicando il ruolo determinante di tali siti di legame(aa924,aa1990) nel reclutamento APO-A1 dipendente di STAT3(Fig.3C)

• Il reclutamento di STAT3,inoltre,sembra essere non richiesto per l’attività di trasporto del colesterolo da parte del trasportatore ABCA1(Fig.3A)

Mutating candidate STAT3 docking sites in ABCA1 reduces apoA-I-stimulated STAT3phosphorylation and ABCA1 association without affecting cholesterol efflux

XII

P

APO-A1

P -Tyr(924,1990)

JAK2

P P-STAT3

P

4° EsperienzaModello biologico(macrofagi carichi di colesterolo):

J774(+colesterolo derivato da acLDL) + TO901317(LXR-agonistABCA1)

• Pre-Incubazione con/senza APO-AI (3h)• Incubazione con/senza LPS (3h)[=attivazione cellulare,profilo proinfiammatorio]

NF-κB

IL-6 TNF-α

IL-1β(RT-PCR)

Fig.4 L’interazione di APO-A1 riduce l’effetto stimolatorio(proinfiammatorio) dell’LPS

RNAi:silenziamento genico a livello post-traduzionale

• RNAi is a form of post-transcriptional gene regulation in which double-stranded RNA (dsRNA) molecules called small interfering RNA (siRNA) mediate sequence specific degradation of homologous mRNA.

mSTAT3:5’-AAGGCCGTGGTGGTGCGTGAGAAA-3’

Scramble siRNA:5’-GCGTGGAAGCGGAGCATGATA-3’

siRNA

J774

MP

Ctrl STAT3

100nM 50nM 100nM

MP: mouse peritoneal macrophages(+acLDL)

STAT3-IB

60%

80%

L’interazione di APO-A1 con differenti

linee macrofagiche che esprimono ABCA1, deprime la produzione

di citochine proinfiammatorie

attraverso il sistema JAK2/STAT3

Inbitore solubile di STAT3

MP

SH2-DOMAIN

5° ESPERIENZA

Modello in-vivo:

Topi C57B/6 che non esprimono STAT3 (˜macrofagi)

C57Black/6

KnockOut (ricombinasi CRE-Lox)

Cholesterol-loaded macrophages from WT or myloid-specific STAT3 KO micewere pretreated for 3h with apoA-I or10 ng/ml IL-10 and incubated for 3h with LPS, and cytokine mRNA levels were measured.

Knock-OUT:metodo Cre-Lox

• Il metodo Knock-out condizionale più usato è il metodo Cre-Lox, che si basa sull’azione della Ricombinasi Cre, che è un enzima che taglia un frammento di Dna inserito tra due siti LoxP: la ricombinasi fa avvenire lo scambio di filamenti (ricombinazione omologa) tra due strutture Lox allineate originando delezione del frammento interposto.

LysM STAT-3

STAT-3

Macrofagi (STAT3 -/- )

STAT3 flox/flox/C57BL/6 mouseLys-M-Cre/C57BL/6 mouse

PM= macrofagi peritoneali

BMM= macrofagi del midollo osseo

WBC= cellule della serie bianca(leucociti)

Fig.5

Il K.O. di STAT3 chiaramente

deprime l’azione antiinfiammatoria

di APO-A1, supportando l’idea

di un coinvolgimento

centrale di STAT3(APO-A1 mimics IL-10 in suppressing inflammatory

cytokine production)

…ABCA1 -/- ?

L’abilità di APO-A1 di sopprimere la produzione

di citochine pro-infiammatorie (TNF-α ,IL-6)

è abolita dal K.O. di ABCA1,

Indicando che ABCA1 è primariamente richiesto per

l’attività di APO-A1.

P

APO-A1

JAK2

PP

P-STAT3

PP Dimero P-STAT3

Il sistema trasduttivo APO-A1/ABCA1 e IL-10/IL-10R

è del tutto analogo!(JAK/STAT3)

STAT3 NETWORK

IL-10 family:

• IL-10• IL-20• IL-22

APO-A1

• BIRC5(survivin)

• HSP-90

• MCL1(BCL2

family)

•TNF-α• IFN-γ• IL-1• IL-6

OncogeneRisoluzione

dell’infiammazione

CD36

oxLDL

Geni della

Flogosi

• Uptake delle oxLDL• Induzione di un nuovo profilo trasduttivo

(profilo infiammatorio)

Upregulation di ABCA1

PPARγLXRα

ABCA1

APO-A1

HDL

Efflusso del

colesterolo

Attività antiinfiammatoria

STAT-3

BilancioColesterolo

LDLoxLDL

LDL-RRecettori Scavenger

Acidi Grassiossisteroli

PPARγLXR

ABCA1

PAMP

RESOLUTION

• Dinamiche di una risposta infiammatoria• Centralità nel ruolo dei macrofagi

OMEOSTASI

Segnali proinfiammatoriSegnali antiinfiammatori

• Livelli plasmatici di HDL(colesterolo HDL

> 40 mg/dL )• Funzionalità di ABCA1

• Livelli plasmatici di LDL (colesterolo LDL

<100mg/dl)• Ossidanti/antiossidanti• Quota di lipidi ossidati

Pathophysiology

Gene variantsOver 70 mutations in ABCA1 have been identified in subjects with low

plasma HDL levels

ABCA1 GENE

1

23

ABCA1 and Cardiovascular disease

• Numerous population studies have shown an inverse relationship between plasma HDL levels and CVD risk..it‘s clear that the relative activity of ABCA1 plays a role!

• Subjects with loss-of-function homozygous or heterozygous mutations in ABCA1 have a 4-6 fold higher than normal incidence of CVD,which applies equally to both men and women.

• Accumulation of sterol-laden “foam cells” in the artery wall and inflammation are early events in formation of atherosclerotic lesions.Thus,ABCA1’s role in cholesterol export and anti-inflammation suggests its impact on ATHEROGENESIS.

ATEROSCLEROSI

L’ATEROSCLEROSI è una patologia delle grosse e medie arterie,

caratterizzata da lesioni infiltrate dilipidi,definite PLACCHE ATEROMATOSE,

che si sviluppano sulla superficie interna dei vasi.

Ateroma (o placca fibrolipidica)

Inflammation & Atherosclerosis• Numerose e controverse sono le ipotesi formulate nel tentativo di

identificare meccanismi responsabili di comparsa e progressione dell’aterosclerosi.

• Al momento, la teoria più accreditata è quella infiammatoria di Russel Ross (The response to injury),che ipotizza nell’infiammazione il meccanismo mediante il quale i fattori di rischio cardiovascolare evocano una risposta riparativa da parte della parete vascolare,risposta che inizia con l’attivazione endoteliale (alterazione meramente funzionale), per poi progredire e stabilizzarsi con la formazione della placca aterosclerotica,vera e propria alterazione morfologica.

• Le basi biologiche dell’infiammazione applicata all’aterosclerosi hanno fornito una nuova chiave di lettura dei meccanismi fisiopatologici,sottolineando il ruolo del RECLUTAMENTO LEUCOCITARIO.

1

2

3

4

5

6

7

IFN-γ

e LDL ox

INFIAMMAZIONE CRONICA

Durata relativamente lunga (giorni - anni)

Accumulo di linfociti e macrofagi

Caratterizzata dalla infiltrazione di linfociti e macrofagi, da proliferazione vascolare e formazione di tessuto fibroso

Le cellule predominanti sono, in genere, quelle mononucleate (macrofagi, linfociti)

ATEROSCLEROSI=Patologia infiammatoria cronica multifattoriale

Citochine & Aterosclerosi

• Macrofagi e linfociti secernono una serie di mediatori,tra cui le CITOCHINE, responsabili di amplificare e perpetuare il processo infiammatorio fino alla rottura della placca a livello del cappuccio fibroso,come risultato dello sbilanciamento tra fattori pro- e anti-infiammatori (perdita del BALANCE CITOCHINICO).

• Non a caso, i pz aterosclerotici presentano elevati livelli sierici di PCR e di citochine pro-infiammatorie (IL-1,IL-6,IFN-γ,etc.)

CITOCHINEMediatori polipeptidici che fungono da segnali di comunicazione fra

le cellule del sistema immunitario, non antigene specifici, e fra queste e diversi organi e tessuti.

La composizione cellulare delle placche vulnerabili è caratterizzata da infiltrati di linfociti Th1 e macrofagi,entrambi attivati dalle LDL

ossidate,le quali possono stimolare i monociti a produrre fattori pro-infiammatori e citochine.

LDL ox

IFN-γ

IFN-γ è la principale citochina per l’ATTIVAZIONE CLASSICA dei macrofagi e svolge importanti funzioni sia nell’immunità innata sia nelle risposte cellulo-mediate specifiche contro i microrganismi intracellulari.

IFN-γ signallingpathway

•Attività biologiche di IFN-γ

• IFN-γ e ABCA1

IFN-γ

X

IFN-γ inibisce l’espressione di LXR,determinando così DOWN REGULATIONDI ABCA1 e conseguente diminuzione dell’efflusso di colesterolo dai macrofagi:

IFN-γ EFFETTO PRO-ATEROGENICO

PROLIFERATION

L’espressione della citochina anti-infiammatoria IL-10 è stata rilevata negli ateromi umani e suoi alti livelli sono stati associati a significativa

riduzione di morte cellulare ed espressione di iNOS.

IL-10Inibizione di NFkb edelle metalloproteasi

TNF-αe

COX-2 Inibizione apoptosi monociti/macrofagi esoppressione della

funzione macrofgica

Inibizione produzionedi citochine

pro-infiammatorie

Linfociti Th1

Linfociti Th2

Si può prevedere che la misurazione della concentrazione plasmatica delle citochine pro-infiammatorie nei pz aterosclerotici assumerà nel futuro un’importanza

clinica sempre maggiore,che permetterà di individuare terapie mirate perdeterminati sottogruppi di pazienti.

L’ATEROSCLEROSI si sviluppa anche in soggetti che presentano livelli

perfettamente normali di colesterolo e dilipoproteine.Alcuni dei fattori che

predispongono all’aterosclerosi sono:(1) inattività fisica e obesità;

(2) Diabete mellito;(3) Ipertensione;(4) Iperlipidemia;

(5) Fumo.Questi fattori predisponenti interagiscono tra

loro in modo sinergico nell’aumentareIl rischio di aterosclerosi.

ABCA1 is highly expressed in islet β-cells, where its selective ablation increases their cholesterol content.These islets have reduced glucose-

stimulated insulin secretion,suggesting that the increased cell cholesterol caused by the absence of ABCA1 impairs islet function.

rosiglitazone

Activation of genes in insulin-responsive

cellsRosiglitazone improves glucose tolerance,but these beneficial effects disappear when ABCA1 is ablated in β-cells.These findings suggest that β-cells ABCA1 contributes to

The insulin sensitizing effects of thiazolidinediones.

• Difetti di ABCA1 potrebbero essere implicati nelle complicazioni microvascolari del diabete mellito di tipo 2.

• Due caratteristiche del diabete e della sindrome metabolica sono eccessodi glucosio e acidi grassi.

Prolonged hyperglycemia

AGE

Distruzione diretta diABCA1 nei macrofagi

Fosforilazione diABCA1

Degradazione di ABCA1

Conclusioni

ABCA1activity

Previene l’aterosclerosiinibendo la

formazione difoam cells e

sopprimendol’infiammazione

nei macrofagiLivelli plasmatici delle

HDL cardioprotettive

nel fegato

Stimola la produzionedi

insulina

nelle β-cellule

ABCA1 target terapeutico contro aterosclerosi e diabete!

PharmacologyThe activity of the ABCA1 pathway can be modulated at

multiple levels.

• Transcription

Agonisti di LXR inducono la trascrizione diABCA1 e forniscono un ulteriore vantaggio,inducendo altre proteine coinvolte in alcuni steps del trasporto del colesterolo:• ABCG1efflusso di colesterolo alle HDL• APO-Eefflusso di colesterolo dai macrofagiin modo sia dipendente che indipendente da ABCA1• ABCG5 e ABCG8escrezione del colesteroloendogeno e di quello esogeno nella bile.

RISCHI: gli agonisti di LXRinducono l’espressione dellaACIDO GRASSO SINTASIe di un fattore trascrizionale

detto “Sterol RegulatoryBinding Protein-1c”

(SREBP-1c) che attiva genidi diversi enzimi coinvoltinella biosintesi degli acidi

grassi.

ipertrigliceridemia

Agonisti di RXR, il partner eterodimericodi LXR,stimolano anch’essi l’espressione di ABCA1.

Rischi: il limite maggiore diquesta classe di agonisti è che

RXR forma eterodimeri attivi con molti altri recettori nucleari che

controllano diversi pathwaysmetabolici.Tuttavia,gli attivatori di

RXR inducono ABCA1 senza influenzare i geni target di LXR e

ciò rende il “sistema RXR” il possibile bersaglio di una terapia

selettiva.

• Post-transcriptionAgonisti che stimolano la trascrizione di ABCA1hanno un’efficacia limitata,giacchè

i livelli e l’attività di ABCA1 sono regolati soprattutto a livello post-trascrizionale.

La ricerca,attualmente,mira allo sviluppo di peptidi e altri piccoli agonisti che interagiscano con ABCA1.Finora,sono stati prodotti alcuni peptidi dotati di α-elica anfipatica di 18- e 37- aa

che mimano le interazioni della apolipoproteine con ABCA1.

Un potenziale vantaggio di questi peptidi è che si possono somministrare per via orale e hanno una lunga emivita. Uno svantaggio è che essi hanno effetti detergenti non specifici sulle membrane fosfolipidiche e possono accumularsi nei tessuti e danneggiare le cellule.

Studi recenti supportano l’ipotesi che peptidi e molecole apolipoproteino-mimetichepotrebbero essere validi agenti terapeutici nel trattamento della CVD e della

sindrome metabolica.

…in conclusione…

LDL e oxLDL• Yin e Yang sono opposti 

• Lo Yin e lo Yang sono interdipendenti 

• Lo Yin e lo Yang si consumano e si sostengono a vicenda 

• Lo Yin e lo Yang possono trasformarsi l'uno nell'altro 

LDL e oxLDL

LDL e oxLDL

LDL e oxLDL

LDL e oxLDL

YIN e YANG

GRAZIE PER

L’ATTENZIONE

BUONOMO BARBARA

TRAPANI DARIO

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