Aaliyah Williams 

   

 The Effect of Cadmium on the Cardiac Development of Embryonic Zebrafish  

 Aaliyah Williams 

         Niles North High School  2015 

             

1 

Aaliyah Williams 

 Table of Contents 

Acknowledgements                                            3  Purpose/Hypothesis                                           4  Review of Literature                                        5­10  Procedure                                                           11   Materials                                                            12  Variables                                                            13  Results                                                            14­18  Conclusion                                                        19  References                                                         20  

    

2 

Aaliyah Williams 

 Acknowledgements 

  I would like to acknowledge my teacher, Ms.Camel, who guided me throughout my project and kept me on the right track. 

               

3 

Aaliyah Williams 

 Purpose/Hypothesis  

Hypothesis: If zebrafish embryos are exposed to varying concentrations of cadmium then their hearts will 

exhibit developmental defects. Zebrafish treated with higher concentrations of cadmium will 

have a higher heart rate and a larger ratio of distance between sinus venosus and bulbus 

arteriosus(heart chambers) to body length of the zebrafish embryo.  

 Purpose:  To investigate if there are morphological and functional defects of the zebrafish heart due to 

varying concentrations of exposure to the environmental toxicant cadmium, in the early stages of 

development.  

  

     

4 

Aaliyah Williams 

Review of Literature  

By: Aaliyah Williams Camel Period 9 

 

There are numerous chemicals in our environment that can be considered toxic, but are 

hard to completely avoid, such as the chemical cadmium. Cadmium is an environmental toxicant 

that has been shown to have many health related side effects. Cadmium, like many other toxic 

metals, has been suspected of causing a high amount of reactive oxygen species (ROS), thus 

leading to oxidative stress damage associated with the development of many diseases and aging. 

The overproduction of ROS can lead to damage in proteins, DNA, lipid function and even cell 

death. This overproduction of ROS can lead to diseases, such as cardiovascular disease. Since it 

is very difficult to observe the effect of cadmium on actual organs, such as the heart, many 

scientists have began to use zebrafish as a model because of its similarity to the human heart.  

Cadmium is a toxic chemical that is nonessential to biological processes and there is 

usually low levels of exposure in our environment, but there are still multiple ways one is 

exposed to cadmium. Humans may be exposed to cadmium through cigarette smoke inhalation 

due to tobacco plants high absorption of cadmium. “It has been reported that one cigarette 

contains about 1 ­ 2 µg of cadmium and that about 10% of the cadmium content is inhaled when 

the cigarette is smoked”(ICDA n.d). Also, workers in the industry sector are highly susceptible 

to cadmium exposure, workers usually in the manufacturing and construction field. Workers are 

exposed through the making of batteries, plastics, coatings, and solar panels, and smelting of 

5 

Aaliyah Williams 

metals. landfill operations, recycling of electronic parts or plastics (OSHA n.d) . Another 

common source of cadmium exposure is exposure through ingestion of food. “In general, leafy 

vegetables such as lettuce and spinach, potatoes and grains, peanuts, soybeans, and sunflower 

seeds contain high levels of cadmium, approximately 0.05­ 0.12 mg cadmium/kg.”  Exposure to 

cadmium is also possible through its presence in water sources near industries emitting cadmium. 

The exposure of water to cadmium puts aquatic life at risk, possibly contaminating food 

supply(WHO 2010).  

When cadmium enters the human body, it accumulates in the body throughout a person’s 

lifetime making it very dangerous. It’s half­life is actually 17­30 years in a human being. Once 

cadmium is uptaken from the lung or gastrointestinal tract, is is transported by proteins, such as 

Albumin. Usually, the cadmium that is attached to the Albumin is taken up by the liver, thus 

inducing the synthesis of metallothionein. Then the metallothionein bound cadmium appears in 

the blood plasma. Since cadmium has a low molecular weight, the cadmium­metallothionein is 

efficiently filtered through the glomeruli and taken up by the tubules (Haschek 2013). 

Cadmium exposure may result in overproduction of ROS(reactive oxidative species). 

ROS is generated by pro­oxidants, thus inducing oxidative stress. ROS and consist of free 

radicals and reactive species and breakdown products of lipids proteins, nucleic acids and 

carbohydrates made by them. Free radicals can be positively,negatively or neutrally charged and 

contain unpaired electrons. The most common and most important free radicals are superoxide 

anion, free hydroxyl radical and nitric oxide that are able to produce other free radicals from 

unsaturated fatty acids mostly. These free radicals have aggressive characteristics that allow 

them to take electrons from other molecules or give away their unpaired electron in order to 

6 

Aaliyah Williams 

maintain stability. They are commonly known for this ability to fragment other molecules and 

are produced from the cellular membrane mitochondria , lysosomes, nucleus, cytoplasm, 

peroxisomes, and endoplasmic reticulum. These free radicals can play an important role 

physiologically, but can also lead to the development of  chronic inflammatory diseases when in 

excess(Singh). Oxidative stress is defined as a continuous imbalance between antioxidants and 

pro­oxidants, that can result in damage to cells. ROS as previously discussed before, is an 

oxidant that may be overproduced by the mitochondrial respiratory chain. The ROS creates 

oxidative stress damage that can be visually represented in Figure 1. Oxidative stress is caused 

by ROS due to it being overly reactive “causing breaks and mutation in DNA, by inactivating 

proteins and enzymes, by oxidizing sugars, and by inducing lipid peroxidation among the 

polyunsaturated fatty acids of lipoproteins or of the cell membrane”(Probiox).  

 

Figure 1. Mechanisms of oxidative stress­induced cell damage(Agarwal 2005).  

The effects of Cadmium have been researched throughout many studies, and recently a 

connection between cardiovascular disease and cadmium exposure has been hypothesized due to 

7 

Aaliyah Williams 

increased ROS production . Researchers have performed a systematic review of epidemiologic 

studies and have concluded that there is reason to suspect that cadmium may be a risk factor of 

cardiovascular disease. Their experimental evidence suggests that this connection is due to 

cadmium initiating and progressing atherosclerosis due to its ability to raise the blood pressure. 

“Cadmium may increase reactive oxygen species formation and interfere with anti­oxidative 

stress responses by binding metallothionein , a low molecular weight protein that regulates zinc 

homeostasis and acts as a free radical scavenger”. The study also explains a correlation between 

cadmium and blood pressure, a side effect of Cardiovascular Disease. This systematic review 

supports the theory that Cadmium is responsible for ROS production, leading to oxidative stress, 

potentially creating a causal relationship between cadmium and cardiovascular disease 

(Tellez­Plaza). 

 

Many researchers use a zebrafish model in order to examine the cardiovascular system. 

Figure 2 shows a visual representation of the heart development of zebrafish during the 5 hour 

post fertilization phase through the 48 hour post fertilization phase.  

8 

Aaliyah Williams 

 

Figure 2. Heart development of zebrafish(Stainier 2001). 

The ventricular end of the heart tube assembles first, then the the atrial end develops. At 24 hpf, 

the tube lies along the anterioposterior axis with the atrial end to the left of the midline. At 30 

hpf, visibly distinct ventricular and atrial chambers form. At 36 hpf, the heart undergoes looping 

morphogenesis and, by 48 hpf, functional valves are formed(Stainier 2001). During 

embryogenesis of zebrafish, the heart is the first organ to fully develop and function. Even 

though the heart is able to function and is developed it will not be essential to the embryos ability 

to live until after several days. This is because the connection of circulation has not developed 

yet prevent full blood circulation. Since the heart is not essential during the early stages of 

development, zebrafish embryos are great models because they are able to survive without 

cardiac function because they’re oxygen is delivered by diffusion than the cardiovascular system. 

The heart has 4 chambers , sinus venosus, atrium, ventricle, and bulbus arteriosus, in 

9 

Aaliyah Williams 

zebrafish(Hu 2011).The embryonic zebrafish heart has the same electrical excitation as the 

human heart. It has pulses generated in the sino­atrial node, propagated through the atrium, 

pausing in the atrio­ventricular node, and then sent to the ventricle. A regular resting heart beat is 

usually between 60­90 beats per minute for humans, but for zebrafish a heart rate is usually 

between 120­180 beats per minute, which is relatively similar to humans.(De Luca 2014). 

The zebrafish heart is a great model because it consists of mammalian traits allowing it to serve 

as a model for human heart development. The zebrafish and humans both have a closed 

cardiovascular system, so their developments are extremely similar. It is an ideal model to be 

studied because during its stage as an embryo it is transparent easily allowing observation under 

a dissecting microscope(Hu 2011). 

The toxic effects of cadmium and its role in the development of diseases is very 

important to investigate because of the high chances of exposure to cadmium. It is known that 

cadmium is toxic, but researchers are not aware of the direct effects relating to diseases such as 

cardiovascular disease. Exposure to cadmium could explain the development of various diseases 

that many are diagnosed with unexpectedly. A sudden high rate of certain diseases that may be 

related to cadmium exposure may help to detect when their is a higher than normal cadmium 

exposure in certain areas. If cadmium is a potential cause for some diseases, then the method of 

treatment could be altered in order to ensure a better result and halt any further cadmium 

exposure. 

    

10 

Aaliyah Williams 

 

Procedure:  Part I 

1. Label the petri dishes depending on the concentration of cadmium chloride(0 mg/L, 0.25 mg/L, 0.50 mg/L, 1.0 mg/L) that the embryos will be exposed to. 

2. Separate the alive embryos from the dead ones using forceps. Then rinse the alive ones. 

3. Transfer embryos into 20 miniature petri dishes(6 embryos per petri dish). Place petri dishes in cooler and keep at 28 degrees celsius.  

4. Using the balance mass out 0.25 mg, 0.50 mg, 1 mg of cadmium chloride and mix into 1 L of water to make cadmium solutions. 

5. Distribute 120 hatched zebrafish (24 hpf) embryos into 10 six­well microplates in 3 mL of fish water with differing cadmium concentrations and 30 embryos per concentration group(0 mg/L, .25 mg/L, .5 mg/L, 1 mg/L) for 18 hours. 30 zebrafish embryos will only contain .1% DMSO and fish water(0 mg/L). 

6. Transfer zebrafish from microplates to depression glass slides and examine under dissecting microscope . 

7. Using a timer, count the beats per minute of each of the zebrafish embryo’s heart for 30 seconds(multiply to get beats per minute) . 

8. Return zebrafish embryos to petri dishes filled with fish water.  Part II(At 72 hpf of the zebrafish embryos):  

1. Using a pipette place a drop of 2% methylcellulose inside of the wells. 2. Examine under a dissecting microscope under room temperature. 3. Count the number of embryos that have died and those that are still alive. 4. Take pictures of the the embryos under the dissecting microscope. 

11 

Aaliyah Williams 

       a.Examine morphological changes. Measure the distance between SA­BA, and the body length of the embryo.    

Materials: ● 10 6­well Microplates ● 120  Zebrafish Embryos  ● 25 g Cadmium Chloride Solution  ● Dissecting Microscope ●  Methylcellulose  ● Stopwatch  ● 3 mL Pipette(Automatic Pipette)  ● DMSO(1%),Depression slides ●  3 Micro Dissection Forceps  ● 30 Petri dishes ●  Computer  ● Motic 2.0 ● Face Mask ● Gloves ● Goggles ● Balance 

            

12 

Aaliyah Williams 

    

Variables   Independent Variables: 

● Cadmium Concentrations(0 mg/L, 0.25 mg/L ,0.50 mg/L , 1 mg/L)  Dependent Variables: 

● Heart Rate(Beats Per Minute) ● Distance Between SA­BA/Body Length 

 Control: 

● 0 mg/L CdCl2  Controlled Variables: 

● Temperature ● Amount of Cadmium Solution  ● Number of embryos within each experimental group ● Amount of Hours Post Fertilization(hpf) data was recorded ● Hours of cadmium exposure ● Amount of Hours Post Fertilization cadmium was introduced to embryos 

   

    

13 

Aaliyah Williams 

 Results: Data:  Figure 1. 

Figure 1. visually compares the heart beats per minute of zebrafish embryos 48 hours post fertilization after exposure to cadmium.        Figure 5. Zebrafish Heart Rate After Exposure to Varying Concentrations of Cadmium Chloride 

Embryos 0 mg/L CdCl2 

0.25 mg/L CdCl2 

0.50 mg/L CdCl2  1 mg/L CdCl2 

1  128  152  178  204 

2  138  153  166  198 

3  142  168  182  194 

4  134  158  178  202 

14 

Aaliyah Williams 

5  146  168  174  192 

6  130  170  168  190 

7  126  160  176  204 

8  138  164  182  196 

9  124  168  174  188 

10  154  154  176  198 

11  132  172  166  190 

12  136  162  182  208 

13  143  156  174  197 

14  128  166  178   

15  138  162     

16  132  168     

17  144  162     

18  136       

19  142       

20  140       

21  134       

22  132       

23  128       

24  136       

Figure 5. gives the heart beats per minute for the zebrafish embryos in the experimental groups.      Figure 6. Average Heart Rate(Beats Per Minute) of Zebrafish  Embryos Treated with Varying Concentrations of Cadmium 

15 

Aaliyah Williams 

0 mg/L CdCl2 0.25 mg/L CdCl2 

0.50 mg/L CdCl2 

1.0 mg/L CdCl2 

135.875  162.5294118  175.2857143  197 Figure 6. shows the average of the ratio of SA­BA/ Body Length.  Figure 3. Mortality Rates(%) of Zebrafish Embryos after Cadmium Chloride  Exposure at Varying Hours of  Post­fertilization Concentration of Cadmium Chloride  24 hpf  48 hpf  72 hpf 

            0 mg/L  6.67%  23.33%  43.33% 

.25 mg/L  13.33%  53.33%  60.00% 

.50 mg/L  10.00%  56.67%  66.67% 

1 mg/L  6.67%  63.33%  73.33% 

Figure 3. has the percentages of zebrafish embryos that died during each interval of hours post fertilization. Zebrafish were treated with cadmium after 24 hours post fertilization.   Figure 4. The Distance Between the Sinus Venosus and  Bulbus Arteriosus of the Zebrafish Embryo Heart 0 mg/L CdCl2  0.25 mg/L CdCl2  0.5 mg/L CdCl2  1 mg/L CdCl2 

0.09  0.14  0.16  0.24 

0.14  0.15  0.19  0.26 

0.1  0.16  0.2  0.22 

0.12  0.17  0.22  0.24 

0.11  0.18  0.16  0.22 

0.16  0.17  0.21  0.24 

0.14  0.15  0.19  0.21 

0.13  0.19  0.18  0.25 

0.09  0.14  0.17   

0.12  0.15  0.23   

0.14  0.18     

0.08  0.12     

0.15       

16 

Aaliyah Williams 

0.13       

0.11       

0.14       

0.17       

Figure 4. gives the ratios of the heart chambers SA­BA.   Figure 2. 

 Figure 2. shows the ratio of the distance between the heart chambers, sinus venosus and bulbus arteriosus,  of the zebrafish embryo heart to the body length of the embryo.  Figure 7.The Average Ratios of the  Distance Between the Sinus Venosus and  Bulbus Arteriosus of the Zebrafish Embryo Heart: 

Concentration   0 mg/L CdCl2  0.25 CdCl2 0.50 mg/L CdCl2  1.0 mg/L 

Ratios  0.1247058824  0.1583333333  0.191  0.235 

Figure 7. shows the average ratios of SA­BA/body length of zebrafish embryos.   

17 

Aaliyah Williams 

 Data Analysis:  

The mortality rate of the zebrafish embryos were recorded in figure 3. The percentage dead at 

each interval of hour post­fertilization(24, 48,72) is presented. The zebrafish embryos were 

treated with cadmium at 24 hpf, so the 48 hpf and 72 hpf show the effects of the cadmium on 

mortality. By the end of the experiment the mortality rates of the zebrafish were 43.33% for 0 

mg/L CdCl2, 60.00% for 0.25  mg/L CdCl2, 66.67% for 0.50 mg/L CdCl2, 73.33% for 1.0 mg/L 

CdCl2. The highest percent mortality rate was the 1.0 mg/L CdCl2 treatment group and the 

lowest was the control treatment group. Figure 1. visually shows the heart beats per minute 

recorded at 48 hours post­fertilization for the different treatment groups. The average heart 

beat for the control was 136 bpm, for 0.25  mg/L CdCl2 the average is 163 bpm, for 0.50 mg/L 

CdCl2 the average 175 bpm, for 1.0 mg/L CdCl2 the average is 197 bpm. Figure 2 visually 

shows the ratios of the distance between sinus venosus and bulbus arteriosus of the heart, to 

its body. The graph shows a tendency of a higher ratio for the zebrafish embryos treated with 

higher concentrations of cadmium chloride.  

Experimental Error:  

Although the concentrations of cadmium and amount of solution were precisely measured, a 

difference in cadmium concentration and distribution may have taken place throughout the 

trials. This may have caused vast differences within the cardiac development of zebrafish 

embryos in the same experimental group. Also, error may have occurred through the counting 

of zebrafish heart beats due to human eyes counting the beats per minute. 

  

18 

Aaliyah Williams 

 

Conclusion: 

 

If zebrafish embryos are treated with varying concentrations of cadmium chloride 

solution then their hearts will abnormally develop. The  ratio of the distance between sinus 

venosus and bulbus arteriosus of the heart and body length will be higher in embryos treated 

with high amounts of cadmium chloride compared with the control group of 0 mg/L CdCl2. It 

was also predicted that the heart rate of the embryos would be concentration dependent, 

resulting in higher heart rates for larger concentration treatment of CdCl2. Based on 

experimentation results, the original hypothesis was supported because as the cadmium 

chloride concentration increased, so did the heart rate of the zebrafish embryos. The ratio of 

SA­BA/body length also increased as concentrations increased showing a possible 

morphological defect. The implications of this experiment involve exposing specific effects 

toxic heavy metals such as cadmium. can not only have on zebrafish, but possibly on humans 

due to our similarities. Discovering a causual relationship between cardiovascular disease 

and cadmium exposure is very useful because it may explain sudden onsets of cardiovascular 

disease cases and it can be used to even further understand the drastic effects of cadmium. 

In order to improve this experiment, more trials with more zebrafish embryos would have to be 

used due to the lack of quantity of zebrafish due to their high death rate within this 

experiment, causing redesign of the experiment throughout the process. Also, further 

research could include measuring the heart development of an actual fully developed 

zebrafish and its heart function, so the full effects of cadmium can be observed. 

 

19 

Aaliyah Williams 

      References:  Chang, K., Hsu, C., & Liu, S. (2013). Cadmium Induces Apoptosis in Pancreatic β­Cells through a Mitochondria­Dependent Pathway: The Role of Oxidative Stress­Mediated c­Jun N­Terminal Kinase Activation. Plos One, 8(2)(Doi:10.1371/journal.pone.0054374). Retrieved October 26 , 2014.  De Luca,Elisa. (2014). ZebraBeat: a flexible platform for the analysis of the cardiac rate in zebrafish embryos. Scientific Reports. 4898. Haschek, Wanda M.(2013). Handbook of Toxicologic Pathology:Elsevier  Hu,Norman.(2000) Structure and Function of the Developing Zebrafish Heart. THE ANATOMICAL RECORD. 260:148­157.   ICDA (Ed.). (n.d.). Cadmium Exposure and Human Health. Retrieved October 30, 2014.  OSHA. (n.d.). Safety and Health Topics | Cadmium. Retrieved November 2, 2014.  WHO. (2010, January 1). Exposure to Cadmium: A Major Public Health Concern. Retrieved November 4, 2014.  ProBiox. (n.d.). What is Oxidative Stress. Retrieved November 1, 2014.  Agarwal et al. Reproductive Biology and Endocrinology 2005 3:28   Stainier, Didier Y. R.(January 2011). Zebrafish heart development. Nature Reviews Genetics 2 .39­48. doi:10.1038/35047564  Tellez­Plaza, M., Jones, M., Dominguez­Lucas, A., Guallar, E., & Navas­Acien, A. (2013). Cadmium Exposure and Clinical Cardiovascular Disease: A Systematic Review. Current Atherosclerosis Reports, 15(10).  

20 

Aaliyah Williams 

  

21