Tesis en opción al grado de Master en Ciencia Título ...

Facultad de Ciencias Agropecuarias

Departamento de Medicina Veterinaria y Zootecnia

Maestría en Salud Animal Avanzada

4ta Edición

Tesis en opción al grado de Master en Ciencia

Título: Digestibilidad in vitro de tres leguminosas tropicales: efecto del

inóculo microbiano y la adición de levadura.

Title: In vitro digestibility of three tropical legumes: effect of the

microbial inoculum and yeast addition.

Maestrante: Dr. MVZ. Beydis Reguera Barreto

Tutor: MSc. Einar Artiles Ortega. Dr. MVZ.

PhD. Raciel Lima Orozco. Dr. MV.

Curso: 2017-2018

Digestibilidad in vitro de tres leguminosas tropicales: efecto del inóculo microbiano y la

adición de levadura. [In vitro digestibility of three tropical legumes: effect of the microbial

inoculum and yeast addition].

Beydis Reguera Barreto Dr. MVZ., fue soportado por el Laboratory for Animal Nutrition

and Animal Product Quality (LANUPRO, University of Ghent, Ghent, Belgium), y el

Laboratorio de Nutrición Animal en conjunto con el Laboratorio de Espectrofotometría,

ambos del Centro de Investigaciones Agropecuarias de la Facultad de Ciencias

Agropecuarias de la Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas (Cuba).

Para referir esta tesis:

Reguera-Barreto, B. 2018. Digestibilidad in vitro de tres leguminosas tropicales: efecto

del inóculo microbiano y la adición de levadura. M.Sc. disertación, Universidad Central

“Marta Abreu” de Las Villas, Santa Clara, Cuba.

RESUMEN

Este estudio evaluó el efecto de las comunidades microbianas ruminales incubadas

durante 14 d con diferentes fuentes de carbohidratos, con o sin levadura sobre la

degradación in vitro de tres leguminosas tropicales: Leucaena leucocephala,

Mucuna pruriens y Canavalia ensiformis, y determinó la influencia de los taninos

sobre la degradabilidad de las mismas. Los forrajes fueron químicamente

caracterizados, y se determinó la presencia de fenoles y taninos totales, y taninos

condensados, evaluándose la actividad biológica de los taninos. Las leguminosas

en estudio no difieren significativamente en los valores de materia seca, proteína

bruta y taninos condensados. L. leucocephala tuvo valores de FDN y FDA dos veces

superior al resto, y al igual que M. pruriens, mostró valores altamente significativos

en fenoles y taninos totales. Los inóculos obtenidos durante 14 d consecutivos de

incubación in vitro no mostraron diferencias en la capacidad de degradación de las

leguminosas. Sin embargo, la degradación de estas con inóculos suplementados

con levadura activa o inactiva se asemejó a la degradación con inóculo fresco,

mientras que con inóculos sin levadura la degradación fue menor. Los valores de

actividad biológica de los taninos no indicaron diferencias significativas en las tres

leguminosas. En conclusión, las comunidades microbianas cultivadas durante 14

días estimulan la fermentación ruminal de las tres leguminosas, y la presencia de

taninos totales y condensados no influyeron en la degradabilidad aparente de los

carbohidratos ni en los patrones de fermentación de las plantas en estudio.

Palabras claves: incubación consecutiva, ARDC, taninos, actividad biológica.

ABSTRACT

This study was carry out to assess the effect of ruminal microbial communities

incubated during 14 d with different sources of carbohydrates, with or without yeast

on the in vitro degradation of three tropical legumes: Leucaena leucocephala,

Mucuna pruriens and Canavalia ensiformis, and determined the influence of tannins

on the degradability of them. The forages were chemically characterized, and the

presence of phenols and total tannins, and condensed tannins were determined,

evaluating the biological activity of the tannins. The legumes under study do not differ

significantly in the values of dry matter, crude protein and condensed tannins. L.

leucocephala had NDF and ADF values twice higher than the rest, and like as M.

pruriens, and showed highly significant values in phenols and total tannins. The

inocula obtained during 14 consecutive days of in vitro incubation did not show

differences in the degradation capacity of legumes. However, the degradation of

these with inocula supplemented with active or inactive yeast resembled the

degradation with fresh inoculum, whereas with inoculum without yeast degradation

was lower. The values of biological activity of the tannins did not indicate significant

differences in the three legumes. In conclusion, the microbial communities cultivated

for 14 days stimulate the ruminal fermentation of the three legumes, and the

presence of total and condensed tannins did not influence the apparent degradability

of the carbohydrates or the fermentation patterns of the plants under study.

Keywords: consecutive incubation, ARDC, tannins, biological activity.

ÍNDICE.

INTRODUCCIÓN: ................................................................................................................... 1

CAPÍTULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ...................................................................... 4

I.1. Características de las leguminosas tropicales ......................................................... 4

I.2. Adaptación de la flora microbiana mediante incubaciones consecutivas y la

suplementación con levaduras para mejorar la digestibilidad de los alimentos. ...... 6

I.3. Presencia de taninos en las leguminosas. ............................................................... 7

I.4. Efecto de los taninos en la fermentación ruminal.................................................... 9

I.5. Uso de Polietilenglicol (PEG) para determinar digestibilidad en leguminosas

con taninos ......................................................................................................................... 12

CAPÍTULO II. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL......................................................... 14

II.1. Obtención del forraje de las leguminosas y preparación de las harinas .......... 14

II.2. Análisis químico proximal ......................................................................................... 14

II.3. Incubación consecutiva con o sin levadura y con diferentes fuentes de

carbohidratos...................................................................................................................... 14

II.4. Incubación ruminal in vitro (24 h) de tres leguminosas tropicales ..................... 15

II.7. Determinación de la actividad biológica de los taninos ....................................... 17

II.8. Análisis estadístico .................................................................................................... 18

CAPÍTULO III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN................................................................ 20

III.1. Análisis químico proximal, fenoles y taninos totales, y taninos condensados

de las leguminosas estudiadas ....................................................................................... 20

III.2. Cultivo consecutivo por lotes .................................................................................. 21

III.3. Incubaciones de rumen in vitro (24 h) de leguminosas...................................... 22

III.4. Actividad biológica de los taninos .......................................................................... 25

CONCLUSIONES: ................................................................................................................ 27

RECOMENDACIONES: ...................................................................................................... 28

BIBLIOGRAFÍA: ................................................................................................................... 29

INTRODUCCIÓN

1

INTRODUCCIÓN:

Los compuestos secundarios producidos por las plantas ejercen actividades

beneficiosas en el organismo animal, debido a su actividad antioxidante y sus

efectos favorables sobre procesos inflamatorios y tumorales, pero sus actividades

más conocidas son como estimulantes digestivos, antisépticos y antimicrobianos

(McArthur et al., 1993). El uso de extractos vegetales en la alimentación animal

constituye actualmente una alternativa natural a los aditivos antibióticos promotores

del crecimiento (Windisch et al., 2008). Existe un gran número de compuestos

secundarios que pueden utilizarse como aditivos en la alimentación de los

rumiantes, pero entre ellos destacan las saponinas, los aceites esenciales y los

taninos (Jouany y Morgavi, 2007).

Las plantas producen taninos como un mecanismo de defensa ante los ataques de

bacterias, hongos e insectos, y además de la preferencia por los herbívoros ya que

generan astringencia, lo que reduce la calidad nutricional de las mismas (McArthur

et al., 1993). Estos complejos se disocian a valores de pH inferiores a 3,5 (pH en el

abomaso) y superiores a 7,5 (pH en el intestino delgado), por lo que las proteínas

pueden ser digeridas en el estómago e intestino delgado sin haberse degradado en

el rumen (Min et al., 2003).

Generalmente las plantas leguminosas tropicales se caracterizan por sus altas

concentraciones de taninos condensados (TC) que tienen alta afinidad por las

proteínas, carbohidratos y otros constituyentes de las plantas, afectando

notablemente la digestibilidad de los nutrientes (Waghorn, 2008; Tiemann et al.,

2008).

Sin embargo, los efectos negativos sobre la digestibilidad dependen de la

concentración de taninos en las plantas, que no guarda un patrón común en éstas,

por ejemplo en Leucaena leucocephala el 0,018-0,046 g/ 100 g MS de la materia

seca son taninos (García et al., 2008; Galindo et al., 2009), en Mucuna pruriens del

0,01-0,033 g/100 g MS de la materia seca (Siddhuraju et al., 2000; Betancur-Ancona

et al., 2004; Kala y Mohan, 2010), mientras que en Canavalia ensiformis los valores

son generalmente insignificantes (Mora et al., 1986; León et al., 1989; Betancur-

Ancona et al., 2004; Estupiñan et al., 2007;). Concentraciones entre el 0,02 g/100 g

MS y 0,04 g/100 g MS de taninos en la materia seca son consideradas óptimas para

la obtención de beneficios de estas plantas (Aerts el al., 1999; Min et al., 2003).

INTRODUCCIÓN

2

Los taninos poseen efectos antimicrobianos y pueden afectar negativamente al

crecimiento de determinados microorganismos ruminales, lo que resulta en efectos

perjudiciales (como la reducción del crecimiento bacteriano) o beneficiosos (por

ejemplo, reducción de la producción de metano y la degradación proteica).

Finalmente, los efectos de los taninos sobre los procesos digestivos varían

ampliamente en función de su estructura química y de la dosis administrada (Frutos

et al., 2004), pero tienen gran potencial para modificar la fermentación ruminal.

En un experimento in vitro precedente realizado por Artiles-Ortega et al., (2016) con

líquido ruminal de ovejas alimentadas a base de heno, encontraron valores de

fermentación aparente de carbohidratos de 43.7, 40.2 y 26.9 g/100 g de MS en

Canavalia ensiformis, Mucuna pruriens y Leucaena leucocephala respectivamente,

donde el diseño experimental no permitió inferir si la presencia de taninos en estas

leguminosas influyó en estos valores de digestibilidad.

Problema científico: Es poco conocido el efecto de la adaptación de la flora

microbiana a diferentes fuentes de carbohidratos y su interacción con la

suplementación de levadura sobre la degradación ruminal in vitro de Leucaena

leucocephala, Mucuna pruriens y Canavalia ensiformis.

Hipótesis: La fermentación ruminal in vitro de Leucaena leucocephala, Mucuna

pruriens y Canavalia ensiformis puede diferir cuando los inóculos microbianos

ruminales han sido previamente sometidos a estrés nutritivo (diferentes fuentes de

carbohidratos) y suplementados o no con levadura.

Objetivo general: Evaluar el efecto de las comunidades microbianas cultivadas

durante 14 días frente a diferentes fuentes de carbohidratos, ya sea en presencia o

no de levadura sobre la fermentación ruminal in vitro de tres leguminosas tropicales.

Objetivos específicos:

1. Evaluar el efecto de inóculos ruminales adaptados a diferentes fuentes de

carbohidratos sobre la digestibilidad in vitro de forrajes de L. leucocephala , M.

pruriens y C. ensiformis.

2. Evaluar el efecto de inóculos ruminales adaptados a diferentes fuentes de

carbohidratos en combinación con la suplementación in vitro de levadura sobre la

digestibilidad in vitro de forrajes de L. leucocephala , M. pruriens y C. ensiformis.

INTRODUCCIÓN

3

3. Determinar la composición químico proximal y las concentraciones de fenoles y

taninos totales y taninos condensados en Canavalia ensiformis, Mucuna pruriens

y Leucaena leucocephala.

4. Determinar la digestibilidad ruminal aparente de carbohidratos y la actividad

biológica de los taninos en Canavalia ensiformis, Mucuna pruriens y Leucaena

leucocephala.

CAPÍTULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

4


I.1. Características de las leguminosas tropicales

Las leguminosas tropicales (por ejemplo, L. leucocephala, M. pruriens, C ensiformis)

son forrajes prometedores para rumiantes ya que poseen un alto potencial

productivo de granos y follaje, y un alto contenido de sustancias nitrogenadas con un

elevado valor nutritivo (Cáceres et al , 1995; Siddhuraju et al., 2000 ; Aye y Adegun,

2013), pero los factores anti-nutricionales (FAN) que contienen afectan

negativamente la fermentación de estas en el rumen (Bhat et al., 1998; Bhatta et al.,

2009; Jayanegara et al., 2015).

Las legumbres son una fuente barata de proteínas, presentando características

nutricionales importantes como: concentraciones elevadas de hidratos de carbono,

contenidos altos de fibra y bajos de grasa (excepto las semillas oleaginosas), y altos

tenores de ácidos grasos insaturados. Además, poseen niveles importantes de

complejo de vitaminas B, y minerales (García et al., 2006). También son conocidas

por contener cierta cantidad de compuestos bioactivadores cuyos efectos

beneficiosos necesitan ser explorados para la explotación (Sridhar y Seena, 2006).

En las leguminosas pratenses tropicales disminuye el valor nutritivo al madurar la

planta, debido a que los cambios en la relación hoja-tallo son menos marcados que

en gramíneas, lo que representa una ventaja sobre estas últimas (Norton y Poppi,

1995).

En el caso de las leguminosas temporales, estos cambios en la proporción de los

componentes de la planta, hacen que su calidad bromatológica se mantenga, aún

más que en las leguminosas perennes, debido a las características morfológicas de

sus vainas y al valor nutritivo de sus granos (Díaz, 2000).

Debido a su alto aporte de nutrientes, y el paso de proteína no degradada al

abomaso, Leucaena se ha convertido en una de las leguminosas más usadas en la

alimentación de rumiantes (Barros-Rodríguez et al., 2014). Un alto contenido de

proteína bruta, que varía entre 24 y 30 % dependiendo de la variedad y la época del

año (García et al., 2008) y valores de digestibilidad de proteínas y materia seca

medidas in vivo que alcanzan 63 % y del 60-70 % respectivamente (Barros-

Rodríguez et al., 2012), permiten que sea ampliamente aceptado el uso de esta

como un suplemento de proteína en los sistemas de producción ganadera en las

regiones tropicales (Galindo et al., 2009).


5

La composición bromatológica de las leguminosas puede variar grandemente en

dependencia del lugar donde se desarrolla el cultivo, la época de siembra o la época

de corte del mismo, por ejemplo en cultivares de L. leucocephala en Sao Pablo,

Brasil se obtuvieron valores de 93.6 g/100 g MS y 23.6 g/100 g MS de materia

orgánica y proteína bruta respectivamente (Soltan et al., 2013) mientras que en

Egipto la proteína bruta obtuvo valores de 20.4 g/100 g MS (Sallam et al., 2010) y en

Cuba los valores alcanzan los 90.7 g/100 g MS de materia orgánica y los 27.0 g/100

g MS de proteína cruda (Rodríguez et al., 2008).

Canavalia ensiformis es una leguminosa que destaca especialmente por su

contenido de proteínas, por lo que ha sido empleada como una fuente proteica en la

alimentación tanto de monogástricos como de rumiantes (Belmar, 1999). C.

ensiformis podría ser un cultivo del futuro como alternativa en la alimentación

animal; esta planta se destaca por su adaptación a un amplio rango de condiciones

climáticas y agronómicas, con capacidad de producir en suelos con bajos contenidos

de nutrientes y regiones con pocas precipitaciones (Beyra et al., 2004).

Un trabajo realizado por Estupiñan et al. (2007) demuestra que la composición

química de los componentes de la pared celular de C. ensiformis varía en diferentes

edades de corte, por ejemplo, la fibra detergente neutra varía en valores de 49.16 –

52.10 – 52.66 – 54.74 g/100 g MS a edades de corte de 60 – 75 – 90 - 105 días

respectivamente.

Canavalia es una leguminosa de alta producción de forraje (7 hasta 12.4 t/ha) y

elevado contenido de proteína bruta en sus hojas y posee un alto potencial de

aminoácidos esenciales, con excepción del triptófano (Sridhar y Seena, 2006).

Los hallazgos de Díaz (2000) evidenciaron la posibilidad agronómica que

manifiestan la especie C. ensiformis para la producción de forrajes y forrajes

integrales, cuando se siembran al inicio de la estación lluviosa, bajo las condiciones

de Cuba. Posteriormente, Díaz et al. (2002) demostraron la posibilidad

bromatológica que manifiesta esta leguminosa para la producción de forrajes,

forrajes integrales y granos, cuando se siembran al final del período lluvioso en

Cuba y además su calidad bromatológica superior al resto de las leguminosas

evaluadas en el estudio (Lablab purpureus y Stizolobium niveum).


6

I.2. Adaptación de la flora microbiana mediante incubaciones consecutivas y la

suplementación con levaduras para mejorar la digestibilidad de los alimentos.

Gaviria et al. (2015) reportaron que la degradabilidad de L. leucocephala solo fue

mayor cuando se combinó con la hierba de guinea, pero no fue diferente entre la

combinación de Leucaena con hierba de guinea (Panicum maximum) y con la hierba

de guinea suplementada (melaza y harina de arroz).

En otro estudio, Blandino y Pineda (2015) informaron que la digestibilidad in vitro de

C. ensiformis con harina de caña de azúcar fue de 71.8 – 73.4 % (5 a 10 % de la

tasa de inclusión de Canavalia), y Mora et al. (1983) demostraron que los niveles

crecientes de inclusión de granos de harina de C. ensiformis en las dietas de forraje

de ovejas disminuyó la digestibilidad de la materia seca (MS) (de 61.7 a 57.4 %

respectivamente).

Además, Herawaty et al. (2013) demostraron que el uso de paja de arroz como un

sustituto del pasto fue similar a los resultados obtenidos con pasto cuando se le

añade 0,5 % de Saccharomyces cerevisiae y 15 % de L. leucocephala.

La incubación ruminal consecutiva in vitro podría permitir una modificación de la

actividad o la composición de la microflora del rumen, Theodorou et al. (1987)

mostró variaciones en la capacidad de la población microbiana ruminal de adaptarse

a los compuestos fenólicos empleando este tipo de incubación como adaptación a

estos compuestos.

Por otro lado, Kondwani (2007), demostraron que tienen una alta digestibilidad y

producción de gas a pesar de su contenido de L- Dopa usando la incubación

consecutiva para adaptar la microflora a los contenidos de este factor presente en

las semillas de Mucuna.

Además, Mbiriri et al. (2015) usando una incubación consecutiva informó que se

observaron adaptaciones microbianas en el rumen cuando se utilizaron como

aditivos dos sustancias diferentes (carvacrol y timol).

En adición, la suplementación con levadura también se ha sugerido para modificar la

comunidad microbiana del rumen (Öztürk et al.,2015), y por tanto mejorar la

fermentación (Chaucheyras et al., 2008). La mejora de la fermentación en el rumen

con la adición de la levadura se atribuyó a la capacidad que tiene esta para

incrementar el número de microorganismos ruminales, especialmente hongos y

poblaciones de bacterias fibrolíticas (Mao et al., 2013). Por otra parte, la


7

suplementación in vitro con levaduras vivas afectó la fermentación ruminal en mayor

grado que las levaduras inactivadas, pero ninguno de ellos mostró efectos

significativos (Opsi et al., 2012).

I.3. Presencia de taninos en las leguminosas.

Los taninos son metabolitos secundarios generados por las plantas para su defensa

contra microorganismos patógenos y la depredación por insectos o herbívoros

(Barry y Manley, 1987; Wallace, 2004), y en relación con estos últimos, afectan los

procesos metabólicos del animal y/o la tasa de crecimiento de algunos

microorganismos después de su ingestión. Son sustancias astringentes que

producen sabores amargos que se encuentran a menudo en las hojas de la planta

(Durmic y Blache, 2012).

Los taninos son un complejo químico de polifenoles hidrosolubles, que se pueden

combinar con otros polímeros como la celulosa, hemicelulosa y pectinas para formar

complejos estables (Mangan, 1988), especialmente cuando se combinan con

proteínas, disminuyen su digestibilidad (Waghorn, 2008).

La presencia de taninos se relaciona con una disponibilidad biológica menor de

algunos nutrientes porque forman complejos con la fibra, las proteínas y otras

macromoléculas e iones metálicos mediante puentes de hidrógeno, enlaces

covalentes, enlaces iónicos e interacciones hidrófobas (Schofield et al., 2001).

Las especies forrajeras que contengan taninos y, además, un adecuado contenido

de proteínas constituyen excelentes fuentes suplementarias para la alimentación de

rumiantes en el trópico (García et al., 2006; Lezcano et al., 2012).

Por el contrario, cuando los niveles de taninos en las forrajeras son cuantiosos

pueden ocasionar pérdidas de nutrimentos y un mal aprovechamiento de las

raciones en los rumiantes, además de toxicidad aguda en animales monogástricos

(Abdulrazak et al., 2000), aspectos estos importantes a la hora de definir la inclusión

de estas leguminosas como alimentos para estos animales en los diferentes

sistemas de crianza.

Hay dos tipos de taninos, hidrolizables (TH) y condensables (TC). Los TC se

localizan en las hojas de numerosas plantas y arbustos, y son compuestos definidos

como compuestos proantocianina-flavonoides con enlace carbono-carbono uniendo

el monómero flavonoide individual que puede ser catequina, galocatequina,

epicatequina y epigalocatequina (Perchellet et al., 1996).


8

Los TC son sustancias complejas con capacidad de reaccionar con macromoléculas

y proteínas del forraje, según su concentración, estructura química y peso molecular.

No son hidrolizables por ácidos ni enzimas y son conocidos como poliflavonoides o

proantocianidinas, ya que están constituidos por flavonoides con diferente grado de

condensación, además de carbohidratos y trazas de aminoácidos y tienen un peso

molecular que fluctúa entre 1 900 y 28 000 Da (Posada et al., 2005).

Estos se encuentran comúnmente en las especies forrajeras de la zona templada y

en leguminosas utilizadas en los sistemas de producción pastoril. La concentración

en estas especies es muy variable: 0.01 a 10 % de la materia seca (MS). Sin

embargo, en un rango de concentración de 0.2-0.4 g/100 g MS, producen cambios a

nivel nutricional productivo y sanitario en los animales que los consumen (Paolini et

al., 2003). Estos polifenoles producen una reducción en el consumo, la digestibilidad

de la proteína, materia seca y fracciones minerales (Ojeda et al., 2010).

Según Barbehenn y Constabel (2011) los taninos hidrolizables (TH) son ésteres

fácilmente hidrolizables por ácidos, bases y enzimas, formados por una molécula de

azúcar (generalmente glucosa) unida a un número variable de ácidos fenólicos,

ácido gálico y elágico, agrupándose así en galotaninos y elagitaninos. Tienen una

distribución limitada en la naturaleza pero abundan en frutos, vainas y hojas de

algunas dicotiledóneas y su peso molecular varía desde 500 a 3 000 Da. Los TH son

generalmente tóxicos para los animales (Haslam et al., 1977; Pérez-Maldonado y

Norton, 1996).

L. leucocephala ha sido ampliamente estudiada en cuanto a la presencia y cantidad

de taninos, estando su estudio y aplicación distribuido ampliamente por todo el

mundo. Trabajos realizados en Egipto por Sallam et al. (2010) y Soltan et al. (2013),

encontraron valores de 0.03 y 0.05 g/100 g MS de taninos condensados,

respectivamente. En América los valores son muy distantes en dependencia del país

en que se muestrea, por ejemplo, García et al. (2008) en evaluaciones en Venezuela

encuentran valores de 0.03- 0.05 g/100 g MS y Soltan et al. (2013) en Brasil de 0.02

g/100 g MS, mientras que Rahim et al. (2012) determinaron que los taninos

condensados se encuentran en la especie en valores de 0.09 g/100 g MS. Por otro

lado, en Cuba la cantidad de taninos condensados en Leucaena oscila entre 0.02-

0.05 g/100 g MS (Galindo et al., 2009).

Siddhuraju et al. (1996), y Siddhuraju et al. (2000) demostraron que M. pruriens

presenta niveles de taninos condensados dentro del rango de 0.01-0.05 g/100 g MS


9

en la India. Por otro lado, en México los valores oscilaron entre 0.014- 0.023 g/100 g

MS (Kalidass y Mohan, 2011) y en Nigeria, Amira et al. (2014) indicaron niveles de

0.026 g/100 g MS de taninos condensados en esta especie.

I.4. Efecto de los taninos en la fermentación ruminal.

Dependiendo de su concentración los TC pueden tener efectos beneficiosos o

nocivos; los efectos favorables se presentan con concentraciones moderadas (2-4

%), mientras que los efectos nocivos se presentan cuando las concentraciones son

relativamente altas (6-12 %) (Aerts el al., 1999).

Getachew et al. (2000) determinó algunos efectos adversos de los taninos como

son: disminución de la ingesta y la digestibilidad, efectos sistémicos debido a la

asimilación de productos de degradación de los taninos hidrolizables en el tracto

digestivo, inhibición de enzimas digestivas y pérdida de proteína endógena.

Por otro lado, los taninos pueden generar varios efectos positivos pero los más

estudiados son su actividad como antiparasitarios biológicos (McSweeney et al.,

2001; Min y Hart, 2003). Estos provocan la disminución de la solubilidad y

degradabilidad de las proteínas de la pastura de alfalfa, la cual es generadora de

altas concentraciones de amoníaco ruminal y, por ende, más exigente en energía

para detoxificar la urea metabólica (Conti et al., 2007), y generan una mayor eficacia

energética de la dieta al reducirse la producción de metano (Gurbuz, 2009).

Otras interacciones a tener en cuenta son taninos-protozoos que depende del tipo

de taninos, su origen y los niveles de suplementación (Carmona, 2007; Patra y

Saxena, 2011), y taninos-hongos que depende de la naturaleza de la asociación del

tanino con la enzima (Barahona et al., 2006).

Los taninos se unen a proteínas y polisacáridos estructurales (celulosa,

hemicelulosa y pectina, minerales, almidón) retrasando su tasa de digestión e

interfiriendo con la actividad de las enzimas microbianas (McSweeney et al., 2001;

Min et al., 2003).

El efecto de los taninos retardando la digestión de la fibra es considerado un efecto

secundario comparado con la digestión del nitrógeno (N) (Pereira-Filho et al., 2005;

Animut et al., 2008).

Los taninos, por lo general, mejoran la asimilación del N por los rumiantes ya que

reducen la cantidad de N amoniacal (N-NH3) producido en el rumen (Patra y

Saxena, 2011), además reducen el número de bacterias totales y celulolíticas en el


10

rumen lo que está relacionado con la reducción o mantenimiento de la producción de

ácidos grasos volátiles (Patra et al., 2006; Cieslak et al., 2012).

Las altas emisiones de CH4 ocurren particularmente cuando los forrajes de

gramíneas son los ingredientes principales en las dietas para rumiantes,

considerando que las legumbres parecen tener una más baja producción potencial

de CH4. Sin embargo, la mayoría de los esfuerzos por mitigar la producción de CH4

a través de la variación de los forrajes dietéticos produce una reducción en la

degradación de la fibra ruminal o la digestibilidad de los nutrientes en el tracto

gastrointestinal (Tan et al., 2011; Abdalla et al., 2012; Goel y Makkar, 2012).

Un posible beneficio adicional de la utilización de leguminosas en la alimentación de

los rumiantes son los efectos derivados de los compuestos secundarios que

contiene, por ejemplo: taninos, que tienen un posible efecto en la disminución de los

gases de efecto invernadero (Barros-Rodríguez et al., 2014).

Aumentando la dosis en la dieta a 2.5 % de taninos, la producción del metano en el

ganado y ovejas se disminuye en un 15 %, pero a este efecto también podría

atribuirse un 5 % de reducción de digestibilidad de la fibra. Recientemente, se ha

demostrado in vitro que las propiedades antimetanogénicas de la Leucaena (Soltan

et al., 2012) puede ser resultado de las cantidades significativas de CT que

contienen sus hojas (33 - 61 g/kg MS) (Tan et al., 2011; Soltan et al., 2012).

Además, es una fuente de minerales tales como azufre, que actúa como potenciador

de las poblaciones de la microbiota ruminal (principalmente hongos y bacterias

celulolíticas) (Aregheore, 1999).

La digestibilidad in vitro de la proteína de M. pruriens presenta un nivel mayor

comparado otras especies. La presencia de factores antinutricionales no es un

problema para el consumo de estas semillas, una vez sean sometidas a un proceso

adecuado. En vista de su composición química y nutricional, las semillas de estas

leguminosas pueden ser empleadas como materia prima en la elaboración de

alimentos balanceados para animales. Ha sido demostrado que en este forraje los

niveles de fenoles y taninos es eliminado mediante el secado (Siddhuraju et al.,

1996) y autoclaviado (Vijayakumari et al., 1996) y su reducción mejora la

digestibilidad de la proteína.

En las semillas de Mucuna pruriens, Josephine y Janardhanan (1992) reportaron

que la mayor proporción de taninos se encuentra en la testa de la semilla y solo

trazas en los cotiledones.


11

Aunque se han detectado factores anti-nutricionales en M. pruriens (sobre todo en

los granos), no hay evidencia de un efecto perjudicial de estos compuestos cuando

se alimenta con este forraje a los rumiantes en grandes cantidades (Castillo-Caamal

et al., 2003; Pérez-Hernández et al., 2003). La inclusión de vainas de M. pruriens en

las dietas no tienen un efecto negativo en el consumo total de MS (Loyra-Tzab et al.,

2013).

La inclusión de Canavalia tiene un posible efecto sobre las bacterias Gram positivas

ruminales y una disminución en el rumen de amoníaco acompañado por un aumento

de la concentración de aminoácidos libres (Domínguez-Bello y Stewart, 1990) lo que

causaría la depresión de la digestión observado en algunos reportes. Algunos

autores también reportan un incremento de flagelados (clase no común de

protozoario ruminal) y un aumento neto de la población de protozoarios en bovinos

alimentados con Canavalia (Sandoval-Castro y Herrera, 2001).

Numerosos autores señalan que las semillas de Canavalia no contiene taninos o

están presentes en valores muy bajos (Rajaram y Janardhanan, 1992; Betancur-

Ancona et al., 2004; Sridhar y Seena, 2006) y atribuyen los efectos negativos de la

inclusión en la dieta de rumiantes de este forraje a compuestos antrinuticionales

como la canavanina y la concanavanina A (Natelson, 1985; Rodrigues y Torne,

1992; Sridhar y Seena, 2006). La inclusión de taninos, por ejemplo, con utilización

de la harina de plátano verde, puede detoxificar la Canavalia, al formar complejos

irreversibles con los tóxicos, pero puede también reducir la disponibilidad de la

fracción nitrogenada restante (Escobar et al., 1983).

Escobar et al. (1983) informan un buen consumo de Canavalia en animales

adaptados, y recomiendan que estos deben tener un período de adaptación de

alrededor de 30 días. El potencial de la Canavalia para los rumiantes es más amplio

que en las aves y los cerdos, incluyendo el uso de la planta entera como: a) un

componente de un pastizal de gramíneas y leguminosas; b) un banco de proteína

con un pastoreo intensivo adecuadamente controlado; y c) en un sistema de

alimentación en confinamiento total o parcial; puede resultar viable,

alternativamente, usar el grano, las legumbres y las vainas o el follaje remanente

después de la cosecha del grano.


12

I.5. Uso de Polietilenglicol (PEG) para determinar digestibilidad en

leguminosas con taninos

Para evaluar la actividad de taninos en la fermentación ruminal de árboles y

arbustos tropicales se utiliza frecuentemente la técnica de producción de gas in vitro

combinada con un agente inactivador de taninos como el polietilenglicol (PEG) (Ben

Salem et al., 2005; Makkar, 2005).

El PEG (OH(C2H4O)nH) es un detergente iónico que se adhiere a los taninos

hidrolizables y condensados mediante enlaces hidrofóbicos en un rango de pH que

va desde 2 a 8,5 (Getachew et al., 2000). Este compuesto desplaza a los TC de los

complejos tanino-proteína formando complejos insolubles e irreversibles con las

proteínas vegetales y, además formando complejos PEG-taninos que son solubles,

evitando de esta forma la formación tanino-proteína (Jones y Mangan 1977; Barry y

Manley, 1986).

La unión es más fuerte entre PEG y taninos que con las proteínas de la planta por lo

que el tratamiento con PEG se utiliza para separar los efectos nutricionales

atribuibles a los TC en rumiantes alimentados con forrajes que lo contengan

(Getachew et al., 2002).

La afinidad de los taninos al PEG es mayor que las de las otras moléculas presentes

en la solución de incubación y el sustrato fermentado, por lo que los taninos son

inactivados, y el tratamiento con PEG funciona como un control libre de taninos

(Muetzel y Becker, 2006). Getachew et al. (2002) concluyó en un estudio que las

muestras que contengan fenoles y taninos totales por encima de 0,4 y 0,2 g/100 g

DM, respectivamente, no producen un aumento en la producción de gas en conjunto

con PEG.

Los estudios de la proporción de inclusión de PEG para lograr una neutralización

completa de los taninos varían notablemente (Makkar et al., 1995; Kamalak et al.,

2005) por lo que estas proporciones no pueden ser universalmente aplicables.

La eficacia de la inclusión de PEG puede variar por especies de forraje, lo que se

debe a la estructura química y peso molecular diferente de los taninos (Makkar et al.,

1995). También esta inclusión de PEG puede variar en la misma especie si crece en

ambientes significativamente diferentes, por lo que determinar los niveles de

inclusión de PEG óptimos es crítico para evaluar el costo eficaz de forrajes taníferos

en los países en vías de desarrollo (Edwards et al., 2012).


13

Según este propio autor, con niveles de inclusión de 200 mg/g MS de la muestra es

suficiente para el diagnóstico de la actividad biológica de los taninos in vitro en

forrajes de tres especies de leguminosas, dentro de las cuales se encontró L.

leucocephala.

CAPÍTULO II. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL

14


II.1. Obtención del forraje de las leguminosas y preparación de las harinas

La harina de forraje de cada leguminosa tropical se preparó de la siguiente manera:

para C. ensiformis y M. pruriens se utilizó una mezcla de granos y forraje [base seca

1:1], mientras que para L. leucocephala solo se utilizó forraje. Las tres leguminosas

tropicales fueron cultivadas en la vaquería "Tres Caminos" (22º25'22.9 "N, 80º03'13"

W) de la UBPC "Desembarco del Granma", ubicada en Santa Clara, en el centro de

Cuba.

M. pruriens se sembró intercalada con pasto Elefante (King Grass) en una parcela

de 1 ha, mientras que C. ensiformis y L. leucocephala se sembraron en diferentes

parcelas de 0.2 y 1 ha, respectivamente. La precipitación, temperatura y humedad

promedio durante el período de cultivo fueron de 47.5 ± 42.13 mm, 26.3 ± 2.02ºC y

82.5 ± 4.19 %, respectivamente. Los cultivos no fueron fertilizados ni irrigados.

El forraje fresco de las tres leguminosas se cosechó por separado alrededor del

mediodía al finalizar temporada lluviosa (23/10/2014 - 27/10/2014). M. pruriens y C.

ensiformis se cosecharon a unos 5 cm por encima del nivel del suelo (planta entera

en etapa de floración), y los materiales de L. leucocephala se cortaron de las ramas

jóvenes (se extrajeron los tallos para obtener solo las ramitas y las hojas). Además,

los granos de M. pruriens y C. ensiformis se obtuvieron en las mismas parcelas en la

etapa de grano seco.

II.2. Análisis químico proximal

El análisis químico proximal fue realizado de acuerdo a lo descrito en AOAC (2005)

(MS: material seca – número ID 930.15; PB: proteína bruta – como 6.25 x N -

número ID 954.01); MO: materia orgánica (EC, 2009) y el fraccionamiento de la fibra

según Van Soest et al. (1991). Además, se realizó determinación de Fenoles y

Taninos totales, y taninos condensados según lo recomendado por Makkar et al.

(2007).

II.3. Incubación consecutiva con o sin levadura y con diferentes fuentes de

carbohidratos

La incubación ruminal consecutiva in vitro se llevó a cabo de acuerdo a lo

recomendado por Castro-Montoya et al (2015), con algunas modificaciones que se

muestran a continuación: los frascos de incubación de 120 mL recibieron uno de tres


15

sustratos (530 mg de celulosa, 470 mg de almidón o 500 mg de mixto [1:1 almidón y

celulosa]) según lo planteado por Vlaeminck et al (2014), en combinación con uno

de tres tratamientos con Saccharomyces cerevisiae (40 mg de células de levadura

vivas [AY], 40 mg de levadura inactivada [IY] [AY esterilizada en autoclave a 121°C

durante 20 min] o sin levadura [-Y]). La fuente de levadura fue Yea Sacc®, cultivo de

levadura vivo basado en la cepa CNCM I-1026 (Alltech, Deinze, Bélgica) (Hassim et

al., 2012).

Posteriormente, los frascos se cerraron con tapones de goma y se enjuagaron

exhaustivamente con CO2 para obtener condiciones anaeróbicas. Para la primera

incubación, el fluido ruminal se obtuvo a partir de tres ovejas fistuladas de la raza

Texel [aprobado por la comisión ética del Instituto de Investigación Agrícola y

Pesquera (ILVO), Bélgica (EC 2014, 241)] alimentadas con heno ad libitum y con

acceso libre al agua potable.

El fluido ruminal obtenido se recogió en matraces aislados para el transporte y se

mezcló, homogenizó y filtró según lo planteado por Castro-Montoya et al. (2015), y

modificado para suministrar N extra (g/L de agua destilada: hidrolizado de caseína

ácida: 1.25; peptona: 1.25; Na2HPO4.12H2O: 2.685; KH2PO4: 1.1625; MgCl2.6H2O:

0.093; NaHCO3: 6.555; NH4HCO3: 0.75) y se incubaron a 39°C en una incubadora

con agitación intermitente (Edmund Bühler GmbH SM - 30 Control, Alemania),

empleándose tres frascos/tratamiento como réplicas estadísticas (Figura 1).

Después de 48 h, todos los frascos se retiraron de la incubadora y se transfirió 10

mL de cada uno con una jeringa estéril a otro nuevo con los mismos sustratos y

suplementos de levadura, y se les añadieron 40 mL del buffer mencionado

anteriormente en combinación con fluido ruminal clarificado de acuerdo con Kenters

et al. (2011) (3:1 v/v). Todos los frascos se incubaron de nuevo durante 48 h y se

realizaron transferencias consecutivas durante un período de 12 días.

II.4. Incubación ruminal in vitro (24 h) de tres leguminosas tropicales

Las incubaciones ruminales in vitro (24 h) se llevaron a cabo siguiendo el método

descrito por Vlaeminck et al. (2014), con inóculos derivados de la última

transferencia de las incubaciones consecutivas descritas anteriormente. Se

transfirieron 5 mL de cada inóculo a un nuevo frasco de 120 mL al cuál se le añadió

24 mL del mismo buffer descrito anteriormente mezclado con líquido ruminal

clarificado (3:1 v/v), y una de tres leguminosas (mezcla de granos y forraje de


16

Mucuna pruriens o C. ensiformis [250 mg, 1:1 base seca], o 250 mg de forraje de

Leucaena leucocephala (Figura 1), y se incubaron durante 24 h a 39ºC en

incubadora con agitación intermitente (Edmund Bühler GmbH SM - 30 Control,

Alemania).

Leyenda: Color carmelita: sustrato (530 mg de celulosa, 470 mg de almidón, o 500 mg de mixto [1:1 celulosa y

almidón]) y suplementación con levadura (40 mg de levadura viva [AY], 40 mg de levadura inactivada [IY] [AY

autoclaveada a 121º C durante 20 min] o sin levadura [-Y]); Color azul: Buffer; Color dorado y : inóculo

frescamente obtenido a partir de ovejas fistuladas; Color naranja: Buffer + Fluido ruminal clarificado; Color

verde: Legumbres (250 mg): Canavalia ensiformis, Mucuna pruriens, o Leucaena leucocephala; Color rojo:

inóculo obtenido a partir de la incubación consecutiva.

Figura 1. Representación esquemática de la incubación consecutive durante 14 d, así como la

incubación ruminal in vitro (24 h) de las tres legumbres tropicales.

El control de los tratamientos se preparó con 6 mL de inóculo fresco obtenido de las

mismas ovejas, y 18 mL de tampón bicarbonato/fosfato. Se incubaron bajo las

mismas condiciones descritas anteriormente. Todos los frascos se retiraron de la

incubadora después de 24 h, deteniéndose la actividad fermentativa en un baño de


17

hielo. Después de 5 minutos, se prepararon las muestras para el análisis de ácidos

grasos de cadena corta (AGCC), y bases púricas y pirimidínicas.

II.5. Análisis de los productos finales de la fermentación.

La producción total de AGCC, la proporción molar de cada AGCC y la

degradabilidad ruminal aparente de carbohidratos (ARDC) fueron empleados como

proxy de la capacidad fermentativa. El análisis de los AGCC fue realizada según lo

descrito por Castro-Montoya et al (2012).

ARDC fue calculado como sigue:

ARDC (g/100 g MS) = (acetato/2+propionato/2+butirato+caproato)*162

Donde 162 es asumido como peso molecular de 1 mol de carbohidratos

fermentables; acetato, propionato, butirato y caproato son expresados en mol/100 g

MS de sustrato añadido (Demeyer, 1991). Como se puede observar a la relación

estequiométrica descrita previamente por el autor mencionado, se le añadió el

caproato basado en los mismos principios estequiométricos de formación de AGCC

a partir de carbohidratos fermentables como lo subrayó Demeyer (1991).

II.6. Análisis de bases púricas y pirimidínicas.

La determinación de bases nitrogenadas (púricas y pirimidínicas) se realizó basado

en lo metodología propuesta por Makkar and Becker (1999) con algunas

adaptaciones, las cuales fueron descritas detalladamente por Vlaeminck et al.

(2005). El total de nucleobases (mg/mL) fue calculada como la suma de la cantidad

de purinas y pirimidinas.

II.7. Determinación de la actividad biológica de los taninos

La determinación de la actividad biológica de los taninos se realizó según lo

recomendado por Makkar et al. (1995) con algunas modificaciones.

La incubación ruminal in vitro (24 h), fue llevada a cabo siguiendo la metodología

descrita por Vlaeminck et al. (2014). El fluido ruminal fue obtenido de tres ovejas

fistuladas (aprobado por el comité de ética del Instituto de Investigación

Agropecuaria y Pesquera (ILVO), Bélgica (EC 2009, 114), las cuales fueron

alimentadas con heno ad libitum y libre acceso al agua.

Se emplearon frascos de 120 mL, cada uno recibió una de tres leguminosas (250

mg de harina mixta de granos y follaje de Canavalia ensiformis [50:50 en base seca],


18

250 mg de harina mixta de granos y follaje de Mucuna pruriens [50:50 en base

seca], o 250 mg de harina de forraje of Leucaena leucocephala) en combinación con

la adición o no de 250 mg de polietilenglicol (PEG 6000).

El fluido ruminal obtenido fue colectado en frascos aislados para su mezclado y

transporte, fueron homogenizados y filtrados a través de una tamiz con poros de 1

mm bajo continuo enjuagado con CO2 y mantenidos luego en baño María a 39ºC

para ser usados como fuente de inóculo. El fluido ruminal colado y una mezcla

anaeróbica saturada con CO2 (lavado con CO2 durante 30 min) de buffer

carbonato/fosfato (conteniendo en g/L de agua destilada: Na2HPO4.12H2O: 3.58;

KH2PO4: 1.55; MgCl2.6H2O: 0.124; NaHCO3: 8.74; NH4HCO3: 1.0) fue añadida a

cada frasco de incubación.

Un mL de etano fue añadido como estándar interno y se incubaron durante 48 h

a39ºC en una incubadora con agitación intermitente (Edmund Bühler GmbH SM – 30

Control, Alemania). Fueron utilizados tres frascos por tratamiento como replicas

estadísticas.

Todos los frascos fueron extraídos de la incubadora luego de 24 h, y la actividad

fermentativa fue detenida en un baño con agua helada. Luego de 5 min se les midió

el contenido de gases por cromatografía gaseosa (GC) (3000 micro – GC, Agilent,

USA) y las muestras fueron preparadas para el análisis de ácidos grasos de cadena

corta (AGCC) por GC (Shimadzu 2010, Shimadzu Corporation‘s-Hertogenbosch,

The Netherlands).

II.8. Análisis estadístico

Todos los datos fueron analizados usando SPSS 21.0 (SPSS, 2012). Se usó un

modelo lineal general (GLM) para analizar la producción de AGCC, nucleobases y la

degradabilidad ruminal aparente de carbohidratos (ARDC) para cada una de las

leguminosas, de acuerdo con Y =μ+Ai=1-3+Bj=1-3+ ABij+ξ, con Ai=1-3 efecto del sustrato

(celulosa vs. almidón vs. mixto) utilizado en la incubación consecutiva, Bj = 1-3 el

efecto de la levadura (levadura activa vs. levadura inactiva vs. sin levadura) durante

la incubación consecutiva, ABij la interacción entre los factores indicados; y ξ el error

residual. Las diferencias se declararon significativas a P<0.05 mediante el

procedimiento de Tukey para comparaciones múltiples. Además, se completó una

prueba de Dunnett para evaluar si el ARDC con inóculo derivado de la incubación

consecutiva difería de aquellos con inóculo fresco.


19

Los valores de los indicadores obtenidos en el análisis químico proximal se

analizaron usando el paquete estadístico SPSS 21.0 (SPSS software for Windows,

release 11.0; SPSS, 2012). El Modelo Lineal General fue empleado para analizar los

datos de acuerdo al modelo Yij=µ+Ai+ξij, siendo Yij la respuesta esperada; µ la

media total; Ai el efecto de la leguminosa (factor fijado), y ξij el error residual. Las

diferencias fueron declaradas significantes con P<0.05 y la comparación de las

proporciones fue hecha usando el procedimiento Tukey’s para múltiples

comparaciones.

La actividad biológica de los taninos y la fermentación ruminal in vitro de cada

leguminosa individualmente fueron analizados estadísticamente mediante un Modelo

Lineal General de acuerdo al modelo Yij=µ+Ai+ξij, siendo Yij la respuesta esperada;

µ la media total; Ai el efecto de la inclusión de PEG (factor fijado), y ξij el error

residual. Las diferencias fueron declaradas significantes con P < 0.05 y la

comparación de las proporciones fue hecha usando el procedimiento Tukey’s para

múltiples comparaciones.

CAPÍTULO III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

20


III.1. Análisis químico proximal, fenoles y taninos totales, y taninos

condensados de las leguminosas estudiadas

Existe una amplia variación en cuanto a la composición bromatológica de las tres

leguminosas, siendo de especial atención los niveles de FDN y FAD (Tabla 1), así

como los valores de PB.

Tabla 1. Análisis químico proximal de Leucaena leucocephala, Mucuna pruriens y

Canavalia ensiformis (n = 3).

Legumbres MS Cenizas PB FDN FDA FT TT TC

Leucaena 916.5 61.3a 297.2 532.5a 318.7a 47.4a 47.3a 0.4

Canavalia 952.3 53.9b 237.0 284.0c 146.5b 7.0b 6.9b 0.1

Mucuna 954.7 62.8a 253.9 316.0b 181.6b 44.6a 44.6a 0.3

SEM 3.14 0.09 4.2 0.68 2.82 0.15 0.15 0.01

Leyenda: MS: materia seca (g/kg MF); PB: proteína bruta, FDN: fibra detergente neutra, FDA: fibra

detergente ácida (g/kg MS); FT: fenoles totales (eq-g ácido tánico/kg MS); TT: taninos totales (eq-g

ácido tánico/kg MS); TC: taninos condensados (eq-g leucocianidina/kg MS); SEM: Error estándar de

la media.

a, b, c media con diferentes superíndices en la misma columna denota diferencias significativas

(P<0.05) de acuerdo con la prueba de Tukey’s.

Las tres leguminosas contienen valores similares, que no difieren significativamente

(P>0.05), en cuanto a MS, PB y TC. L. leucocephala presenta mayor contenido de

PB y valores significativamente superiores en FDN y FDA (P<0.05), mientras que los

valores más significativos de MS son los obtenidos por las especies Canavalia

ensiformis y Mucuna pruriens aunque no difieren de Leucaena. Esta elevación de la

fibra en Leucaena se debe a que al ser una planta arbustiva, su crecimiento es más

prolongado, acumulando mayores niveles de lignina en sus tallos y hojas que en las

leguminosas rastreras.

Sallam et al (2010) exponen que L. leucocephala tiene altos valores de NDF, ADF y

compuestos fenólicos particularmente TC, indicando que este compuesto es un

factor limitante de la fermentación in vitro, lo que además es consistente con lo

planteado por Haque et al. (2008) que reportan una correlación negativa entre NDF

y ADF, y el rango y extensión de producción de gas (incluyendo la degradabilidad).


21

Existen diferencias significativas en las cantidades de FT, TT entre Leucaena y

Mucuna con respecto a Canavalia, no siendo así con respecto a los TC. Podemos

observar que los valores más altos los posee también Leucaena mientras que

Canavalia presenta escasas cantidades de estos metabolitos secundarios. Los

valores de TC obtenidos en Leucaena coinciden con los resultados de Soltan et al.

(2013) en Egipto, y Galindo et al. (2009) en Cuba; este último autor plantea que los

TC de esta especie en Cuba oscilan entre 0.9 y 0.5 g/kg MS. En Mucuna los

resultados coinciden con los de Siddhuraju et al. (2000), y en Canavalia son más

altos que los encontrados por Betancur-Ancon et al. (2004) y Sridhar y Seena (2006)

que solo contabilizaron trazas de taninos condensados en esta especie.

III.2. Cultivo consecutivo por lotes

La incubación consecutiva durante dos semanas usando diferentes fuentes de

carbohidratos, afectó la producción total de AGCC (P <0,05) (Tabla 2), la cual fue

1,6 veces mayor cuando se usó almidón como sustrato en comparación con la

celulosa.

Tabla 2. Efecto del tipo de sustrato (celulosa, almidón o mezcla) sobre la producción

total de AGCC (μmol / mL) y nucleobases (mg / mL) después de 14 días de

incubación discontinua consecutiva (n = 9).

Parámetros Cellulose Starch Mixture SEM p-value

Producción total de

AGCC 1920b 3128a 2246b 124.8 <0.001

Nucleobases 8c 22a 16b 1.2 <0.001

Los valores con diferentes superíndices (a, b, c) difieren significativamente (P <0,05) de acuerdo con la prueba

de Tukey’s .

Además, la incubación con almidón como fuente de carbohidrato dio como resultado

un aumento de aproximadamente tres veces en la cantidad nucleobases en

comparación con la incubación con celulosa. Lo anterior expuesto sugiere que el

inóculo derivado de las incubaciones consecutivas con almidón, potencialmente

contenía tres veces más bacterias (Tabla 2).

La suplementación con levadura no cambió (P> 0,05) la producción total de AGCC ni

la cantidad de nucleobases (datos no mostrados).


22

III.3. Incubaciones de rumen in vitro (24 h) de leguminosas

Aunque los inóculos derivados de la incubación con almidón contenían más

nucleobases, la producción neta de nucleobases durante las 24 h de incubación con

las leguminosas generalmente generó menos nucleobases en la incubación con

almidón - inóculo (Tabla 3), mientras que la cantidad producida no fue afectada por

la exposición del inóculo a la levadura.

Tabla 3. Cuantificación de la producción neta de nucleobases (mg / mL) durante 24

h de incubación in vitro con diferentes leguminosas utilizando inóculo de cultivo

consecutivo que había sido expuesto a almidón, celulosa o su mezcla en presencia

(Ay e IY) o ausencia (- Y) de levadura (n = 3).

Adaptación del inóculo a C. ensiformis M. pruriens L. leucocephala

Substrato Suplementos A

Celulosa

AY 10.7cd 12.8 10.4

IY 12.0bcd 13.1 11.1

-Y 10.5d 13.0 9.9

Almidón

AY 7.3e 11.6 10.5

IY 7.2e 10.6 9.1

-Y 6.4e 9.6 9.5

Mixto

AY 14.7a 14.9 9.9

IY 12.8abc 13.5 9.9

-Y 13.1ab 15.0 13.3

SEM 0.56 0.40 0.33

P – value B

S <0.001 <0.001 0.204

YS 0.051 0.507 0.451

S x YS 0.032 0.385 0.068

Los valores con diferentes superíndices (a,b,c,d) en una misma columna difieren significativamente (P<0.05) según

la prueba de Tukey’s .

A Suplementos: AY = levadura activa; IY = levadura inactivada; - Y = sin levadura.

B S = sustrato, YS = suplemento de levadura; S x YS = interacción sustrato x suplemento de levadura.

Las cantidades más bajas de nucleobases generalmente estaban de acuerdo con

una menor producción neta de AGCC en incubación con almidón - inóculo, como se

observó para las tres leguminosas (Tabla 4). Independientemente de la

suplementación de levadura, los inóculos obtenidos después de 14 días de


23

exposición a almidón como fuente de carbohidratos degradaron menos las tres

leguminosas tropicales en comparación con la celulosa y el inóculo expuesto a la

mezcla.

Tabla 4. Degradación ruminal aparente de carbohidratos (g / g de MS) de tres

leguminosas tropicales durante 24 h de incubación in vitro utilizando inóculo de

cultivo consecutivo que había sido expuesto a almidón, celulosa o su mezcla en

presencia (AY y IY) o ausencia (-Y) de levadura (n = 3).

Adaptación del inóculo a C. ensiformis M. pruriens L. leucocephala

Substrate Supplements A

Celulosa

AY 0.47a 0.36 0.28ab

IY 0.38c 0.36 0.35a

-Y 0.41abc 0.38 0.24ab

Almidón

AY 0.35c* 0.40 0.20b

IY 0.39bc 0.36 0.23b

-Y 0.40bc 0.32* 0.23b

Mixto

AY 0.45ab 0.38 0.24ab

IY 0.45ab 0.37 0.22b

-Y 0.40bc 0.39 0.31ab

SEM 0.008 0.006 0.011

Control 0.44 0.40 0.28

P – value B

S 0.004 0.371 0.004

YS 0.417 0.469 0.417

S x YS 0.006 0.105 0.006

Los valores con diferentes superíndices en la misma columna (a, b, c, d, e, f) difieren significativamente (P<0,05)

según la prueba de Tukey’s.

Los valores con * difieren significativamente (P <0,05) de acuerdo con la prueba de Dunnett.

A Suplementos: AY = levadura activa; IY = levadura inactivada; - Y = sin levadura.

B S = sustrato, YS = suplemento de levadura; S x YS = interacción sustrato x suplemento de levadura.

La suplementación de levadura al cultivo consecutivo no indujo un cambio

consistente en el inóculo con respecto a su capacidad para degradar las tres

leguminosas tropicales. De hecho, para todas las leguminosas el efecto de la

levadura dependía de la fuente de hidratos de carbono (PS x YS <0,05).

El inóculo de celulosa al que se había suplementado la levadura activa dio como

resultado una degradación más amplia de C. ensiformis (Tabla 4), aunque esto no


24

difirió del inóculo fresco o del inóculo de celulosa sin levadura. Por otra parte, la

ausencia de levadura durante 14 días de incubación consecutiva con almidón, dio

como resultado un inóculo que mostró una capacidad considerablemente inferior

para degradar M. pruriens (Tabla 4).

La suplementación de levadura inactivada a cultivos consecutivos con celulosa dio

como resultado un inóculo que degradaba más ampliamente L. leucocephala. No

obstante, ARDC cuando se empleó el inóculo procedente de la incubación

consecutiva no superó la degradación con inóculo de fluido ruminal fresco (Tabla 4).

Se ha informado que la levadura estimula el crecimiento de microorganismos

beneficiosos en el rumen (Denev et al., 2007) y aumenta el número microbiano

(Kholif et al., 2016), específicamente anaerobios ruminales totales, bacterias

celulolíticas (Castillo-González et al. , 2014), hongos (Chaucheyras et al., 1995, Mao

et al., 2013) y bacterias acetogénicas que convierten el hidrógeno molecular en

acetato (Chaucheyras et al., 1995).

Otros estudios sugirieron que los cultivos de levadura potencian el crecimiento de

las bacterias que utilizan ácido láctico (Jouany, 2001), mientras que la población de

protozoos en general no es estimulada por la levadura (Doreau y Jouany, 1998, Mao

et al, 2013). Sin embargo, en el presente estudio, la suplementación con levadura no

cambió el número de nucleobases al final de los 14 d de cultivo consecutivo, ni

resultó en inoculaciones que aumentaran la producción de biomasa microbiana

durante la degradación de las tres leguminosas tropicales.

Después de 14 d de cultivo consecutivo se crearon diferentes poblaciones

microbianas que mostraron diferencias en los parámetros de fermentación después

de 24 h de fermentación in vitro de las tres leguminosas. Los inóculos obtenidos

después de la exposición al almidón como fuente de hidratos de carbono - bajo

condiciones extremas de estrés de nutrimentos - aumentaron la cantidad de

caproato producido en detrimento de la cantidad de propionato producido. Sin

embargo, la capacidad de degradación ruminal aparente de carbohidratos de los

diferentes inóculos obtenidos después del cultivo consecutivo tuvo un

comportamiento similar al obtenido con inóculo fresco.

De hecho, los inóculos de ovejas adultas no adaptadas cambiaron después de 14 d

de incubación consecutiva en condiciones extremas de nutrimentos, pero no

mostraron diferencias en su capacidad para degradar las leguminosas,


25

especialmente L. leucocephala, que fue significativamente inferior a las otras

leguminosas.

III.4. Actividad biológica de los taninos

Luego de 24 h de incubación in vitro con y sin PEG de las tres leguminosas en

estudio (Tabla 5) se pudo apreciar que no existieron diferencias significativas entre

los valores obtenidos para los patrones de fermentación y la digestibilidad aparente

de los carbohidratos (P>0.05), excepto para la proporción molar de butírico, el cual

fue significativamente superior (P<0.05) cuando fue empleado el PEG en la

incubación de Canavalia y Leucaena, no así en el caso de Mucuna.

Tabla 5. Efecto del PEG sobre los productos finales de la fermentación de cada

leguminosa [metano (mL/g OM), AGCC totales (µmol/g OM), proporción molar de

los AGCC (mmol/mol AGCC), (ARDC g/100g MS)] (n=6).

Parámetros Canavalia

SEM Mucuna

SEM Leucaena

SEM - PEG + PEG - PEG + PEG - PEG + PEG

CH4 44,8 45,8 1,20 52,0 49,2 0,87 29,0 28,4 1,30

AGCC Totales 5966,0 5796,2 103,0

0 5679,2 5712,8 76,9

4 3745,2 3737,7 29,7

4

acético 610,2 601,8 3,40 591,4 600,4 4,70 660,3 650,4 3,31

propiónico 263,4 263,5 1,90 252,5 240,6 3,67 233,2 234,5 1,84

butírico 82,6b 90,9a 3,74 95,2 98,9 1,48 68,9b 74,4a 1,32

ARDC 47,5 46,5 0,81 45,0 45,5 0,61 29,57 29,58 0,23

PEG: Polietilenglicol, CH4: metano, AGCC: Ácidos Grasos de Cadena Corta, ARDC: Degradabilidad

Ruminal Aparente de los Carbohidratos, SEM: Error estándar de la media.

a, b, c media con diferentes superíndices en la misma fila dentro del efecto principal denota diferencias

significativas (P<0.05) de acuerdo con la prueba de Tukey’s.

La inclusión de PEG en legumbres tropicales resulta en un incremento de

producción de gas, particularmente en plantas ricas en taninos condensados (Sallam

et al., 2010). No se encontraron diferencias significativas en la producción de

metano en ninguna de las especies estudiadas con PEG y sin este compuesto, lo

que sugiere que la producción in vitro de metano en estos forrajes no fue afectada

por la presencia de taninos, lo que difiere con los resultados de Sallam et al. (2010)

que encontró una reducción de metano del 88 % en el fluido ruminal con inclusión de

PEG en L. leucocephala. Sin embargo, otra investigación realizada por el propio

autor en el 2013 plantea que en el experimento in vivo usando PEG los taninos


26

presentes en esta leguminosa no afectaron la digestibilidad de la MS ni de los

nutrientes.

Consecuentemente, es improbable que la baja degradabilidad ruminal in vitro de L.

leucocephala sea causada por la concentración de taninos presentes en ella,

pudiendo deberse a los bajos tenores de TC contenidos en las tres leguminosas

estudiadas. En efecto, existen otros compuestos fenólicos que son más fácilmente

degradados por los microrganismos ruminales (Bhat et al., 1998; Patra and Saxena,

2011).

CONCLUSIONES

27

CONCLUSIONES:

1- Las leguminosas en estudio presentan valores similares de MS y PB,

presentando L leucocephala las mayores concentraciones de cenizas, FDN y

FDA.

2- Leucaena y Mucuna presentan mayores concentraciones de fenoles y taninos

totales, siendo bajas las concentraciones de taninos condensados para las

tres leguminosas en estudio.

3- Las comunidades microbianas cultivadas in vitro durante 14 d con diferentes

fuentes de carbohidratos en presencia de suplementos de levadura estimulan

la fermentación ruminal de Leucaena leucocephala, Mucuna pruriens y

Canavalia ensiformis, la cual depende de las fuentes de carbohidratos

empleadas en la misma.

4- Los taninos totales y condensados no influyeron en la degradabilidad

aparente de los carbohidratos ni en los patrones de fermentación de las tres

leguminosas en estudio.

RECOMENDACIONES

28

RECOMENDACIONES:

1- Realizar análisis de digestibilidad in vitro con líquido ruminal de ovejas

tropicales adaptadas al consumo de estos alimentos para comparar con los

realizados en ambos experimentos.

2- Determinar la presencia de otros factores antinutricionales (factor inhibidor de

tripsina y quimiotripsina, mimosina e intermediarios, canavanina, y Con A) y

su influencia en la digestibilidad de estas leguminosas.

BIBLIOGRAFÍA

29

BIBLIOGRAFÍA:

Abdalla, A.L., Louvandini, H., Sallam, S.M.A.H., Bueno, I.C.S., Tsai, S.M., Figueira,

A.V.O. 2012. In vitro evaluation, in vivo quantification, and microbial diversity

studies of nutritional strategies for reducing enteric methane production. Trop

Anim Health Prod, 44: 953–964.

Abdulrazak, S.S., Fujihara, T., Ondiek, J.K., Ørskov, E.R. 2000. Nutritive evaluation

of some Acacia tree leaves from Kenya. Anim Feed Sci Technol, 85: 89.

Aerts, R.J., Barry, T.N., McNabb, W.C. 1999. Polyphenols and agriculture: Beneficial

effects of proanthocyanidins in forages. Agric Ecosyst Environ, 75: 1-12.

Aharoni, Y., Gilboa, N., Silanikove, N. 1998. Models of suppressive effect of tannins.

Analysis of the suppressive effect of tannins on ruminal degradation by

compartmental models. Anim Feed Sci Tech, 71: 251-267.

Amira, P.O.; Daramola, A.S., Oyelade W.A. 2014. Comparative studies on some

anti-nutritional factors in seeds of Mucuna Pruriens (Velvet Beans) and

Sphenostylis Stenocarpa (African Yam Beans). J Biol Agric Healthc, 16 (4):

13-16.

Animut, G., Puchala, R., Goetsch, A.L., Patra, A.K., Sahlu, T., Varel, V.H., Wells, J.

2008. Methane emission by goats consuming diets with different levels of

condensed tannins from lespedeza. Anim Feed Sci Tech, 144: 212–227.

AOAC, 2005. Official Methods of Analysis of AOAC International, 18th edition;

Association of Official Analytical Chemists, Gaithersburg, Maryland, USA.

Aregheore, E.M. 1999. Nutritive and antinutritive value of some tree legumes used in

ruminant livestock nutrition in Pacific island countries. Journal of South

Pacific Agriculture, 6: 50- 61.

Artiles-Ortega, E., Lima-Orozco, R., Fievez, V. 2016. Effect of changed rumen

microbial community (as resulted of the sequential in vitro incubation) and

yeast supplementation, on the in vitro rumen fermentation of three ANF-

containing feedstuff. VII Edition of the International Scientific Conference of

Agricultural Development and Sustainability “AGROCENTRO 2016”. Hotel

Memories Paraíso Azul, Caibarién, Villa Clara, Cuba. ISBN: 978-959-312-174-

3.

BIBLIOGRAFÍA

30

Aye, P. A., Adegun, M. K., 2013. Composición química y algunas propiedades

funcionales de Moringa, Leucaena y harinas de hojas de Gliricidia. Agric Biol

J N Am, 4: 71-77.

Barahona, R., Sanchez, S., Lascano, C.E., Owenc, E., Morris, P., Theodorou, M.K.

2006. Effect of condensed tannins from tropical legumes on the activity of

fibrolytic enzymes from the rumen fungus Neocallimastyx hurleyensis. Enzym

Microb Technol, 39: 281–288.

Barbehenn, R.V., Constabel, C.P. 2011. Tannins in plant–herbivore interactions.

Phytochemistry, 72 (13): 1551-1565.

Barros-Rodríguez, M., Sandoval-Castro, C. A., Solorio-Sánchez, J., Sarmiento-

Franco, L. A., Rojas-Herrera, R., Klieve, A. V. 2014. Leucaena leucocephala

in ruminant nutrition. Trop Subtrop Agroecosyst, 17 (2): 173-183.

Barros-Rodríguez, M., Solorio-Sánchez, J., Ku-Vera, J.C., Ayala-Burgos, A.,

Sandoval-Castro, C., Solís-Pérez, G. 2012. Productive performance and

urinary excretion of mimosine metabolites by hair sheep grazing in a

silvopastoral system with high densities of Leucaena leucocephala. Trop

Anim Health Pro, 44: 1873-1878

Barry, T.N., Manley, B.J. 1987. Secondary compounds of forages. In: The Nutrition of

Herbivores. Pp: 91-119.

Barry, T.N., Manley, T.R. 1986. Interrelationships between the concentrations of total

condensed tannin, free condensed tannin and lignin in Lotus sp. and their

possible consequences in ruminant nutrition. J Sci Food Agric, 37: 248-254.

Belmar, R., Nava-Montero, R., Sandoval-Castro, C., McNab, J.M. 1999. Jack bean

(Canavalia ensiformis L. DC) in poultry diets: Antinutritional factors and

detoxification studies- a review. World’s Poultry Sci J, 55: 37-59.

Ben Salem, H., Saghrouni, L., Nefzaoui, A. 2005. Attempts to deactivate tannins in

fodder shrubs with physical and chemical treatments. Anim Feed Sci Tech,

122: 109.

Betancur-Ancona, D., Peranza-Mercado, G., Moguel-Ordoñez, Y., Fuertes-Blanco,

S. 2004. Physicochemical characterization of lima bean (Phaseolus lunatus)

and jack bean (Canavalia ensiformis) fibrous residues. Food Chem, 84: 287–

295.

BIBLIOGRAFÍA

31

Beyra, A., Reyes, G., Hernández, L., Herrera, P. 2004. Revisión Taxonómica del

género Canavalia D.C. (Leguminosa E-Papilionoideae) en Cuba. Rev Acad

Coloma Cienc, 28 (107): 158-175.

Bhat, T. K., Singh, B., Sharma, O.P., 1998. La degradación microbiana de los

taninos - Una perspectiva actual. Biodegradación, 9: 343-357.

Bhatta, R., Uyeno, Y., Tajima, K., Takenaka, A., Yabumoto, Y., Nonaka, I., Enishi,

O., Kurihara, M., 2009. La diferencia en la naturaleza de los taninos en en

vitro metano ruminal y la producción de ácidos grasos volátiles y en las

poblaciones de archaea metanogénicas y por protozoos. J Dairy Sci, 92:

5512 - 5522.

Blandino, GA, Pineda, JA, 2015. Caracterización nutricional de la fermentación en

estado Sólido de Caña de Azúcar (Saccharum officinarum) con Diferentes

Niveles de inclusión de harina de granos de Canavalia (Canavalia ensiformis).

Tesis para obtener el grado de Ingeniería Zootecnista. Animal Facultad de

Ciencias. Universidad Nacional Agraria. Nicaragua., Pp. 11-13.

Cáceres, O., González, E., Delgado, R., 1995. Canavalia ensiformis: leguminosa

forrajera promisoria para la Agricultura tropicales (Canavalia ensiformis:

prometiendo leguminosa forrajera para la agricultura tropical). Pastos y

Forrajes, 18: 107-119.

Carmona, J.C. 2007. Efecto de la utilización de arbóreas y arbustivas forrajeras

sobre la dinámica digestiva en bovinos. Rev Lasallista Investig, 4 (1): 40-50.

Castillo-Caamal, A.M., Castillo-Caamal, J.B., Ayala-Burgos, A.J. 2003. Mucuna bean

(Mucuna spp.) supplementation of growing sheep fed with a basal diet of

Napier grass (Pennisetum purpureum). Trop Subtrop Agroecosyst, 1: 107–

110.

Castro-Montoya, J., De Campeneere, S., Van Ranst, G., Fievez, V. 2012.

Interactions between methane mitigation additives and basal substrates on in

vitro methane and VFA production. Anim Feed Sci Technol, 176: 47-60.

Castro-Montoya, J., Peiren, N., Cone, J.W., Zweifel, B., Fievez, V., De Campeneere,

S., 2015. In vivo and in vitro effects of a blend of essential oils on rumen

methane mitigation. Liv Sci. 180, 134–142.

Chaucheyras-Durand F., Walker, N. D. y Bach, A., 2008. Efectos de las levaduras

secas activas en el ecosistema microbiano del rumen: pasado, presente y

futuro. Anim Sci Technol. 145, 5-26.

BIBLIOGRAFÍA

32

Cieslak, A., Zmora, P., Pers-Kamczyc, E., Szumacher-Strabel, M. 2012. Effects of

tannins source (Vaccinium vitisidaea L.) on rumen microbial fermentation in

vivo. Anim Feed Sci Tech, 176: 102–106.

Conti, G., Garnero, O., Bértoli, J., Gallardo, M., Gatti, E., Zoratti, O. 2007. Efecto de

los taninos condensados sobre la producción y composición de leche de

vacas lecheras en pastoreo de verano. Rev Arg Prod Anim, 27 (Supl. 1):

104-105.

Demeyer, D., 1991. Quantitative aspects of microbial metabolism on rumen and

hindgut, in Jouany, J. P. (Ed.), Rumen microbial metabolism and ruminant

digestion. INRA. Paris, France, pp. 217-237.

Denev, S.A., Peeva, Tz., Radulova, P., Stancheva, N., Staykova, G., Beev, G.,

Todorova, P., Tchobanova, S., 2007. Yeast cultures in ruminant nutrition.

Bulg J Agric Sci. 13, 357-374.

Díaz, M.F. 2000. Producción y caracterización de forrajes y granos de leguminosas

temporales para la alimentación animal. Tesis en opción al grado científico de

Doctor en Ciencias Agrícolas. Instituto de Ciencia Animal, La Habana. Cuba:

91.

Domínguez-Bello, M.G., Stewart, C. 1990. Effects of feeding Canavalia ensiformis on

the rumen flora of sheep, and of the toxic amino acid canavanine on rumen

bacteria. System Appl Microbiol, 13: 388-393.

Doreau, M., Jouany, J.P., 1998. Effect of a Saccharomyces cerevisiae culture on

nutrient digestion in lactating dairy cows. J Dairy Sci. 81, 3214–3221.

Durmic, Z., Blache, D. 2012. Bioactive plants and plant products: effects on animal

function, health and welfare. Anim Feed Sci Technol, 176 (1): 150-162.

Edwards, A., Mlambo, V., Octavius, C.H., Wayne, G., Davanan, M. 2012. In vitro

ruminal fermentation of leaves from three tree forages in response to

incremental levels of polyethylene glycol. J Anim Sci, 2 (3): 142-149.

Escobar, A., Mora, M., Preto, J. 1983. Efecto del tratamiento con taninos sobre la

toxicidad de Canavalia ensiformis. IPA. Informe anual, 81: 26.

Estupiñan, K., Vasco, D., Duchi, N. 2007. Digestibilidad de los componentes de la

pared celular del forraje de Canavalia ensiformis (L) DC. en diferentes edades

de corte. Revista Tecnológica-ESPOL, 20 (1): 223-228.

Frutos, P., Hervas, G., Giraldez, F.J., Mantecon, A.R. 2004. Tannins and ruminant

nutrition. Review. Span J Agric Res, 2 (2): 191-202.

BIBLIOGRAFÍA

33

Galindo, J., Marrero, Y., Ruiz, T., González, N., Díaz, A., Aldama, A., Moreira, O.,

Hernández, J., Torres, V., Sarduy, L. 2009. Efecto de una mezcla múltiple de

leguminosas herbáceas y Leucaena leucocephala en la población microbiana

y productos fermentativos del rumen de añojos mestizos de Cebú. Rev

Cubana Cienc Agríc, 43: 256-264.

García, D., Wencomo, H., Gonzáles, M., Medina, M., Cova, L. 2008. Caracterización

de diez cultivares forrajeros de Leucaena leucocephala basada en la

composición química y la degradabilidad ruminal. Revista MVZ Córdoba. 13:

1294-1303.

García, D.E., Medina, M.G. 2006. Composición química, metabolitos secundarios,

valor nutritivo y aceptabilidad relativa de diez árboles forrajeros. Zootecnia

Trop. 24 (3): 233.

Gaviria, X., Naranjo, J. F., Barahona, F. 2015. Cinética de fermentación in vitro de

Leucaena leucocephala y géneros Megathyrsus maximus y sus mezclas, con

o sin suplementación energética. Pastos y Forrajes, 38: 55-63.

Getachew, G., Crovetto, G.M., Fondevila, M., Krishnamoorthy, U., Singh, B.,

Spanghero, M., Steingass, H., Robinson, P.H., Kailas, M.M., 2002. Laboratory

variation of 24 h in vitro gas production and estimated metabolisable energy

values of ruminant feeds. Anim Feed Sci Technol, 92: 51-57.

Getachew, G., Makkar, H.P.S., Becker, K. 2000. Effects of polyethylene glycol on in

vitro degradability of nitrogen and microbial protein synthesis from tannin-rich

browse and herbaceous legumes. Br. J. Nutr, 84: 73-83.

Goel, G., Makkar, H.P.S. 2012. Methane mitigation from ruminants using tannins and

saponins, a status review. Trop Anim Health Prod, 44: 729–739.

González-Díaz, L.A., Hoedtke, S., Castro, A., Zeynerb, A., 2010. Effect of ensilage

on canavanine reduction in soaked grains of Canavalia ensiformis sole or

mixed with Sorghum bicolor, In: Staudacher, W. (Ed.), Gesellschaft für

Ernährungsphysiologie: Proceedings of the Society of Nutri tion Physiology.

19, DLG-Verlags GmbH, Frankfurt, Germany, p. S. 153.

Gurbuz, Y. 2009. Efectos del contenido de taninos condensados de algunas

especies de leguminosas en la emisión de gas metano. Rev Cubana Cienc

Agríc, 43 (3): 265-272.

BIBLIOGRAFÍA

34

Haque, N., Toppo, S., Saraswat, M. L., Khan, M.Y. 2008. Effect of feeding Leucaena

leucocephala leaves and twigs on energy utilization by goats. Anim Feed Sci

Technol, 142 (3): 330-338.

Haslam, E., Opde C.B.T., Porter, L.J. 1977. Procyanidin metabolism, a hypothesis.

Phytochem, 16: 99-102.

Hassim, H.A., Lourenço, M., Goh, Y.M., Baars, J.J.P., Fievez, V., 2012. Rumen

degradation of oil palm fronds is improved through pre-digestion with white rot

fungi but not through supplementation with yeast or enzymes. Can J Anim

Sci. 92, 79–87.

Herawaty, N., Jamarum, N., Zain, M., Arnim, A., Ningrat, R.W.S., 2013. Efecto de la

suplementación de Saccharomyces cerevisiae y Leucaena leucocephala en la

baja calidad de alimentación de fibra en la dieta de ganado vacuno. Pakistán

J Tuerca, 12: 182-184.

Jayanegara, A., Makkar, H.P.S., Becker, K., 2015. La adición de tanino purificadas

Fuentes y tratamiento con polietilenglicol en metano de emisiones y la

fermentación ruminal in vitro. J Anim Sci Technol, 38: 57-63.

Jones, W.T. Mangan, J.L. 1977. Complexes of the condensed tannins of the sainfoin

(Onobrychis viciifolia Scop.) with Fraction I leaf protein and with submaxillary

mucoprotein, and their reversal by polyethylene glycol and pH. J Sci Food

Agric, 28: 126-136.

Josephine, M.R., Janardhanan, K. 1992. Studies on chemical composition and anti-

nutritioal factors in three germplasm seed materials of the tribal pulses,

Mucuna pruriens (L.) DC. Food Chem, 43: 13 – 18.

Jouany, J. P., 2001. 20 years of research and now more relevant than ever- the

coming of age of yeast cultures in ruminant diets. In: Responding to a

Changing Agricultural Landscape. Alltech’s European, Middle Eastern and

African Lecture Tour, pp. 44-69.

Jouany, J.P., Morgavi, D.P. 2007. Use of ‘natural’ products as alternatives to

antibiotic feed additives in ruminant production. Animal, 1 (10): 1443-1466.

Kala, B.K., Mohan, V.R. 2010. Nutritional and anti-nutritional potential of three

accessions of itching bean (Mucuna pruriens (L.) DC var. pruriens): an under-

utilized tribal pulse. Int J Food Sci Nutr, 61(5): 497–511.

Kalidass, C., Mohan, V.R. 2011. Genetic resources of under exploited legumes/tribal

pulses of Western Ghats, Tamil Nadu. J. Eco. Tax. Bot, 35: 241-248.

BIBLIOGRAFÍA

35

Kamalak, A., Canbolat, O., Sahin, M., Gurbuz, Y., Oz-kose, E., Ozkan, C.O. 2005.

The effect of polyethylene glycol (PEG 8000) supplementation on in vitro gas

production kinetics of leaves from tannin containing trees. S Afr J Anim Sci,

35: 229-237.

Kenters, N., Henderson, G., Jeyanathan, J., Kittelmann, S., Janssen, P.H., 2011.

Isolation of previously uncultured rumen bacteria by dilution to extinction using

a new liquid culture medium. J Microbiol Meth. 84, 52–60.

Kholif, A.M., Salem, A.Z.M., Kholif, S.M., Domínguez-Vara, I.D., Kholif, A.E., Morsy,

T.A., 2016. Chapter 5. Yeast and rumen fermentation activities and

digestibility. In: Yeast additive and animal production. PubBioMed Central

Research Publishing Services, Tamilnadu, India, pp. 40-63.

Kondwani, S. 2007. Nutritive value of Mucuna pruriens and effects of replacing

soybean meal with Mucuna on in vitro rumen fermentation, lamb performance

and meat safety. Thesis in option to degree of Doctor of Philosophy. University

of Florida. USA, pp. 94 – 96.

León, A., Angulo, I., Picard, M., Carré, B., Derouet, L., Harscoat, J.P. 1989.

Proximate and amino acid composition of seeds of Canavalia ensiformis.

Toxicity of the kernel fraction for chicks. Ann. Zootech, 38: 209-218.

Lezcano, Y., Soca, M., Sánchez, L.M., Ojeda, F., Olivera, Y., Fontes, D., Montejo,

I.L., Santana, H. 2012. Caracterización cualitativa del contenido de

metabolitos secundarios en la fracción comestible de Tithonia diversifolia

(Hemsl.) A. Gray. Pastos y Forrajes, 35 (3): 283-292.

Lima-Orozco, R. 2011. Evaluation of sorghum–soybean (Sorghum bicolor (L.)

Moench – Glycine max (L.) Merr.) silage as ruminant feed. PhD Thesis, Ghent

University, Ghent, Belgium.

Loyra-Tzab, E., Sarmiento-Franco, L.A., Sandoval-Castro, C.A., Santos-Ricalde,

R.H. 2013. Nutrient digestibility and metabolizable energy content of Mucuna

pruriens whole pods fed to growing Pelibuey lambs. Asian-Australas J Anim

Sci, 26 (7): 981–986.

Makkar, H.P.S. 2005. In vitro gas methods for evaluation of feeds containing

phytochemicals. Anim Feed Sci Tech, 124: 291.

Makkar, H.P.S., Blummel, M., Becker, K. 1995. Formation of complexes between

polyvinyl pyrrolidones or polyethylene glycols and tannins, and their

BIBLIOGRAFÍA

36

implication in gas production and true digestibility in in vitro techniques. Br J

Nutr, 73: 897-913.

Makkar, H.P.S., Siddhuraju, P., Becker, K., 2007. Methods in molecular biology

"Plantsecondary metabolites", Humana Press, Totowa, New Jersey, pp. 47-

49.

Mangan, J.L. 1988. Nutritional Effects of Tannins in Animal Feeds. Nutr Res Rev, 1:

209-231.

Mao, H.L., Mao, H.L., Wang, J.K., Liu, J.X., Yoon, I., 2013. Effects of

Saccharomyces cerevisiae fermentation product on in vitro fermentation and

microbial communities of low-quality forages and mixed diets. J Anim Sci, 91

(3): 291–3298.

Mbiriri, D., Cho, S., Mamvura, C., Choi, N., 2015. Evaluación de la adaptación

microbiana del rumen de aceite de ajo, carvacrol y timol usando el sistema de

cultivo por lotes consecutivos. J Vet Sci Anim Husb, 3: 1.

McArthur C., Robbins, C.T., Hagerman, A.E., Hanley, T.A. 1993. Diet selection by a

ruminant generalist browser in relation to plant chemistry. Can J Zool. 71:

2236-2243.

McSweeney, C.S., Palmer, B., McNeill, D.M., Krause, D.O. 2001. Microbial

interactions with tannins: nutritional consequences for ruminants. Anim Feed

Sci Technol, 91: 83-93.

Min, B.R., Barry, T.N., Atwood, G.T., McNabb, W.C. 2003. The effect of condensed

tannins on the nutrition and health of ruminants fed fresh temperate forages: a

review. Anim Feed Sci Technol, 106: 3-19.

Min, B.R., Hart, S.P. 2003. Tannis for suppression of parasites. J Anim Sci, 81 (E.

Suppl. 2): 102-109.

Mora, M., Escobar, A., Parra, R., 1983. Crecimiento de Ovejas estafadores Tres

Niveles de inclusión de harina de granos de Canavalia ensiformis baño

raciones completa. IPA. Report’81 anual, 22. (En español).

Mora, M., Parra, R., Escobar, A. 1986. Canavalia ensiformis, su utilización en la

alimentación de rumiantes, resultados preliminares. Rev Fac Agron.

Venezuela, 7: 179-192.

Muetzel, S., Becker, K. 2006. Extractability and biological activity of tannins from

various tree leaves determined by chemical and biological assays as affected

by drying procedure. Anim Feed Sci Tech, 125: 139.

BIBLIOGRAFÍA

37

Natelson, S. 1985. Canavanine to arginine ratio in alfalfa (Medicago sativa), clover

(Trifolium) and jack bean (Canavalia ensiformis). J Agric Food Chem, 33:

413–419.

Norton, B.W., Poppi, D.P. 1995. Composition and nutritional attributes of pasture

legumes. En: Tropical Legumes in Animal Nutrition. Eds. JPF D’Mello and C.

Devendra. CAB International,: 58.

Ojeda, A., Frías, A., González, R., Linares, Z., Pizzani, P. 2010. Contenido de

taninos, fósforo fítico y actividad de fitasas en el grano de 12 híbridos de

sorgo granífero (Sorghum bicolor (L) Moench). ALAN, 60 (1): 93-98.

Opsi, F., Fortina, R., Tassone, S., Bodas, R., López, S., 2012. Efectos de las células

inactivadas y vivas de Saccharomyces cerevisiae sobre la fermentación

ruminal in vitro de dietas con diferente forraje: Concentrado de relación. J

Agric Sci, 150: 271-283.

Öztürk, H., Demirbaş, Y.S., Aydin, F.G., Pişkin, i., Unler, F. M., Emre, M. B., 2015.

Efectos de las levaduras hidrolizadas y en vivo en la fermentación microbiana

ruminal en un sistema de cultivo semicontinuo (RUSITEC). Turk J Vet Anim

Sci, 39: 556-559.

Paolini, V., Bergeaud, J., Grisez, C., Prevot, F., Dorchies, P., Hoste, H. 2003. Effects

of condensed tannins on goats experimentally infect with Haemonchus

contortus. Vet. Parasitol, 113: 253 – 261.

Patra, A.K., Kamra, D.N., Agarwal, N. 2006. Effect of plant extracts on in vitro

methanogenesis, enzyme activities and fermentation of feed in rumen liquor of

buffalo. Anim Feed Sci Tech, 128: 276–291.

Patra, A.K., Saxena, J. 2011. Exploitation of dietary tannins to improve rumen

metabolism and ruminant nutrition. J Sci Food Agricul, 91: 24–37.

Perchellet, E.M, Mohtaseb, H.U., Makkar, H.P.S., Perchellet, J.P. 1996. Ability of

tannins extracted for various trees leaves to inhibit the biomarkers of tumor

promotion in mouse skin in vivo. Int J Oncol, 9: 801-809.

Pereira-Filho, J.M., Vieira, E.L., Kamalak, A., Silva, A.M.A., Cezar, M.F., Beelen,

P.M.G. 2005. Correlação entre o teor de tanino e a degradabilidade ruminal

da matéria seca e proteína bruta do feno de jurema-preta (Mimosa tenuiflora

Wild) tratada com hidróxido de sódio. Livest Res Rural Dev, 17 (8).

[Consultado 04/02/2016]. Disponible en URL:

http://www.lrrd.org/lrrd17/8/pere17091.htm.

http://www.lrrd.org/lrrd17/8/pere17091.htm

BIBLIOGRAFÍA

38

Pérez-Hernández, F., Ayala-Burgos, A.J., Belmar-Casso, R. 2003. Performance of

growing lambs supplemented with Mucuna pruriens. Trop Subtrop

Agroecosyst, 1: 119–122.

Pérez-Maldonado, R.A., Norton, B.W. 1996. Digestion of 14 C-labelled condensed

tannins fron Desmodium intortum in sheep and goats. Br. J. Nut, 76: 501-513.

Posada, S.L, Montoya, G., Ceballos, A. 2005. Caracterización de los taninos en la

nutrición de rumiantes. En: Bioquímica, nutrición y alimentación de la vaca.

Pabón M y Ossa J (eds). Medellín: 161-180.

Rahim, P.F., Carrillo, A., Rocha, A., Alvarado, M.A., Cardenas, M.L. 2012. Nutrient

Content and in vitro Dry Matter Digestibility of Gliricidia sepium (Jacq.) Walp.

and Leucaena leucocephala (Lam. De Wit.). J Anim Vet Adv, 11: 1708-1712.

Rajaram, N., Janardhanan, K. 1992. The chemical composition and nutritional

potential of the tribal pulse, Abrus precatorius L. Plant Food Hum Nutr, 42

(4): 285-290.

Rodrigues, B.F., Torne, S.G. 1992. Estimation of canavanine in the seeds of three

Canavalia species. Trop Sci, 32: 319–320.

Rodríguez, R., García, C.C., Oramas, A., Hernández, Y., Domínguez, M. 2008.

Empleo del polietilenglicol y la zeolite para mejorar el valor nutritivo de Albizia

lebbekoides en condiciones in vitro. Rev Cubana Cienc Agríc, 42: 259.

Sallam, S.M.A., Bueno, I.C.S., Godoy, P.B., Nozella, E.F., Vitti, D.M.S.S., Abdalla,

A.L. 2010. Ruminal fermentation and tannins bioactivity of some browses

using a semiautomated gas production technique. Trop Subtrop

Agroecosys, 12: 1

Sandoval-Castro, C., Herrera, F. 2001. Cambios en la población de protozoarios

ruminales por efecto de la inclusión de Canavalia ensiformis a la dieta de

bovinos. Rev. Biomed, 12: 166-171.

Schofield, P., Mbugua, D.M., Pell, A.N. 2001. Analysis of condensed tannins: a

review. Anim Feed Sci Tech, 91: 21.

Siddhuraju, P., Klaus, B., Makkar, H.P.S. 2000. Studies on the nutritional

composition and antinutritional factors of three different germplasm seed

materials of an under-utilized tropical legume, Mucuna pruriens var. utilis. J

Agric Food Chem, 48: 6048–6060.

BIBLIOGRAFÍA

39

Siddhuraju, P., Vijayakumari, K., Janardhanan, K. 1996. Chemical composition and

protein quality of the little known legume, velvet bean (Mucuna pruriens (L.)

DC). J Agric Food Chem, 44: 2636–2641.

Soltan, Y.A., Morsy, A.S., Sallam, S.M., Lucas, R.C., Louvandini, H., Kreuzer, M.,

Abdalla, A.L. 2013. Contribution of condensed tannins and mimosine to the

methane mitigation caused by feeding Leucaena leucocephala. Arch Anim

Nutr, 67 (3): 169-184.

Soltan, Y.A., Morsy, A.S., Sallam, S.M.A., Louvandini, H., Abdalla, A.L. 2012.

Comparative in vitro evaluation of forage legumes (prosopis, acacia, atriplex,

and leucaena) on ruminal fermentation and methanogenesis. J Anim Feed

Sci, 21 (4): 759–772.

Sridhar, K.R. Seena, S. 2006. Nutritional and antinutritional significance of four

unconventional legumes of the genus Canavalia – A comparative study. Food

Chem, 99: 267-288.

Tan, H.Y., Sieo, C.C., Abdullah, N., Liang, J.B., Huang, X.D., Ho, Y.W. 2011. Effects

of condensed tannins from Leucaena on methane production, rumen

fermentation and populations of methanogens and protozoa in vitro. Anim

Feed Sci Technol, 169 (3):185–193.

Theodorou, M. K., Gascoyne, D. J., Akin, D. E., Hartley, R. D., 1987. Efecto de los

ácidos fenólicos y fenólicos de las paredes celulares vegetales en el rumen

como la fermentación en cultivo por lotes consecutivos. Appl Environ

Microbiol, 53: 1046-1050.

Tiemann, T.T., Avila, P., Ramírez, G., Lascano, C.E., Kreuzer, M., Hess, H.D. 2008.

In vitro ruminal fermentation of tanniferous tropical plants: plant-specific tannin

effects and counteracting efficiency of PEG. Anim Feed Sci Technol, 146:

222-241.

Van Soest, P.J., Robertson, J.B., Lewis, B.A., 1991. Methods for dietary fiber, neutral

detergent fiber, and nonstarch polysaccharides in relation to animal nutrition. J

Dairy Sci, 74: 3583-3597.

Vijayakumari, K., Siddhuraju, P., Janardhanan, K. 1996. Effects of different post-

harvest treatments on anti-nutritional factors in seeds of the tribal pulse,

Mucuna pruriens (L.) DC. International J Food Sci Nutrition, 47: 263-272.

BIBLIOGRAFÍA

40

Vlaeminck, B., Braeckman, T., Fievez, V., 2014. Rumen metabolism of 22:6n-3 in

vitro is dependent on its concentration and inoculum size, but less dependent

on substrate carbohydrate composition. Lipids. 49, 517–525.

Vlaeminck, B., Dufour, C., van Vuuren, A.M., Cabrita, A.R.J., Dewhurst, R.J.,

Demeyer, D., Fievez, V., 2005. Use of odd and branched-chain fatty acids in

rumen contents and milk as a potential microbial marker. J Dairy Sci. 88,

1031–1042.

Waghorn, G. 2008. Beneficial and detrimental effects of dietary condensed tannins

for sustainable sheep and goat production. Progress and challenges. Anim

Feed Sci Technol, 147: 116–139.

Wallace, R.J 2004. Antimicrobial properties of plant secondary metabolites. Proc

Nutr Soc, 63: 621–629.

Windisch, W., Schedle, K., Plitzner, C., Kroismayr, A. 2008. Use of phytogenic

products as feed additives for swine and poultry. J Anim Sci, 86 (14_suppl):

140-148.

OPINIÓN DEL TUTOR

41

OPINIÓN DEL TUTOR.

La tesis de maestría presentada por la aspirante Dr. MVZ. Beydis Reguera Barreto,

titulada “Digestibilidad in vitro de tres leguminosas tropicales: efecto del inóculo

microbiano y la adición de levadura”, se enmarca en la línea científica del Grupo de

Producción Animal adscrito al Centro de Investigaciones Agropecuarias de la

Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Central “Marta Abreu” de Las

Vilas.

La tesis posee actualidad dada la importancia de la producción local de alimentos

capaces de reducir importaciones y con ellos costos productivos en los sistemas de

crianza ganadera, así como, del incremento en la degradabilidad y asimilación de

estos alimentos especies. El presente trabajo es novedoso ya que evalúa el efecto

de la modificación microbiana ruminal ante situaciones de estrés alimentario

suplementado o no con levadura, sobre la degradabilidad de tres leguminosas

tropicales poco empleadas en la alimentación del ganado lechero y de carne. La

investigación demuestra que la degradabilidad de estas leguminosas y el empleo de

levadura dependen del sustrato empleado como fuente de carbono en la adaptación

de la flora microbiana, y que las concentraciones de taninos no influyeron en la

degradabilidad de las plantas, especialmente de L. leucocephala.

La tesis cumple con la estructura metodológica reglamentada para la confección de

la misma, durante el desarrollo del trabajo el aspirante alcanzó un satisfactorio grado

de cumplimiento de los objetivos propuestos, mostrando un elevado nivel de

independencia y dedicación; resolviendo satisfactoriamente los problemas prácticos

y científico-técnicos que se le presentaron durante el desarrollo de la misma, lo que

demuestra la experiencia y preparación del aspirante que lo hacen merecedor del

grado científico al que aspira.

_________________________

Dr. MVZ. Beydis Reguera Barreto

Aspirante

_________________________

MSc. Einar Artiles Ortega

Tutor

Santa Clara, Septiembre 12, 2018

Tesis en opción al grado de Master en Ciencia Título ...

Documents

Transcript of Tesis en opción al grado de Master en Ciencia Título ...