Filogenia Microbiana

Genómica ambiental- Metagenómica

Revisión estructura celular procariota

Referencias:

-The Legacy of Carl Woese and Wolfang Zillig: from phylogeny to landmark discoveries.

S. Albers et al. Nature Rev. Microbiol. 11, 713-719 (2013)

-Metagenomics: Application of genomics to uncultured microorganisms.

Jo Handelsman. MMBR 68 (4): 669-685 (2004)

-Metagenomic Analysis: Past and Future Trends.

Simon, C. and Daniel R. AEM 77(4): 1153-1161 (2011)

Filogenia:

Historia evolutiva de un grupo de organismos

Inferida indirectamente por comparación de secuencias nucleotídicas

Genes empleados en análisis filogenéticos

- Universalmente distribuidos en los grupos en estudio

- Funcionalmente homólogos

- Poseen regiones de secuencias conservadas (alineamiento de

secuencias)

Small subunit rRNAs (SSU rRNA), genes codificantes de ARNr 16S

(procariotas) y 18S (eucariotas)

Otros genes: ATPasas, componentes aparato de traducción (factor de

elongación Tu), RecA, Hsp60, t-RNA sintetasas.

Carl Woese (1977) usa por primera vez SSU rRNA como herramienta

filogenética y propone el Arbol Filogenético Universal con 3 Dominios:

Bacteria, Archaea, Eukarya.

PROCARIOTAS EUCARIOTAS

(Adapted from Woese et al. PNAS 87: 4576-4579, 1990)

Estructura primaria y secundaria del ARNr de E. coli. El ARN 16S de las arqueas posee un plegamiento similar pero presenta numerosas diferencias en la secuencia nt.

Signature sequences en los ARNrs:

Son oligonucleótidos cortos únicos a ciertos grupos de microorganismos.

Se conocen para los 3 dominios de la vida y para microorganismos específicos.

Sirven para el diseño de sondas o probes filogenéticos usados en la técnica FISH

y para el diseño de cebadores en PCR

Aplicación de los SSU rRNAs. Identificación de microorganismos.

El análisis de SSU rRNAs permitió el desarrollo de herramientas que se utilizan

en ecología microbiana y medicina.

Complementa técnicas fenotípicas y genotípicas usadas para la Taxonomía

bacteriana.

Ribotipificación (huellas moleculares) :

Se basa en el análisis del perfil de restricción de los genes codificantes de rRNA

16S.

Extracción del ADNg del microorganismo, digestión con enzimas de restricción

(ERs), electroforesis de fragmentos de ADNg, hibridación con sondas de SSU

rRNA.

Da un patrón de bandas característico para cada microorganismo que

depende de la secuencia de nt del rRNA (presencia/ausencia sitio de

reconocimiento de las ER usadas). Se compara el perfil obtenido con patrones de

restricción de rRNA de microorganimos conocidos.

Usado en diagnóstico clínico y análisis de alimentos.

Técnicas basadas en la amplificación de rRNA por PCR

Secuenciación de los genes SSU rRNAS y Filogenia

Estudia la biodiversidad y actividades existentes en las comunidades

microbianas (poblaciones de microorganismos que interaccionan en la

naturaleza)

Métodos de análisis de comunidades microbianas

1. Dependientes de cultivo. Enriquecimiento y aislamiento de los

microorganismos. Ej. Columna de Winogradsky (TP1). Ecosistema

microbiano artificial que permite el enriquecimiento y aislamiento de

distintos grupos fisiológicos.

2. Independientes de cultivo. No requiere el aislamiento de los

microorganismos. Estos son detectados mediante el análisis de sus genes

directamente de las muestras ambientales.

El estudio de biodiversidad requiere identificación y cuantificación de

microorganismos directamente en su habitat.

Ecología microbiana

Métodos de tinción generales

Permiten cuantificar microoganismos en muestras naturales. No dan información sobre la

fisiología o filogenia de la células.

Cuantificación de células totales. DAPI (4, 6 diamido 2 phenylindole), naranja de acridina.,

SYBR Green I . Son colorantes fluorescentes que se unen al ADN. No son específicos. No

distinguen células vivas o muertas.

Análisis de comunidades microbianas

independiente de cultivo

Tinción de células viables. Se basan en la

integridad de la membrana celular.

Ej. LIVE/DEAD. El verde penetra en todas las

células; el rojo (ioduro de propidio) penetra

sólo en las células que poseen la membrana

rota (células muertas).

Tinciones genéticas:

Probes filogenéticos y FISH (fluorescence sin situ hybridization)

Identificación y cuantificación de microorganismos. Muy específico.

Se usan probes muy específicos complementarios a SSU rRNAs marcados con un

fluoróforo. Penetran en las células e hibridizan con los ribosomas. Observación en

microscopio de fluorescencia.

Análisis de muestras ambientales o células en cultivo.

Aplicación en ecología microbiana, diagnóstico clínico, microbiología de alimentos.

FISH

A, C. Tinción de células totales (DAPI).

B, D. Probes específicos para Acidithiobacillus ferrooxidans (B) y Acidiphillium spp (D).

Muestras tomadas del Rio Tinto, España.

DGGE

Permite separar genes de igual tamaño y

diferente composición de bases (diferente Tm)

en geles desnaturalizantes con gradiente de

urea o formamida.

Metagenómica

(Genómica Ambiental)

Estudio molecular de

comunidades microbianas

- Diversidad filogenética

- Diversidad metabólica

- Expresión génica

- Análisis funcional

- Reconstrucción total o parcial

de los genomas de

microorganiamos no cultivados

Método de PCR para analizar comunidades microbianas

(SSU rRNAs y genes metabólicos)

Más de 200 metagenomas secuenciados de diferentes ambientes:

- Tierra

- Océanos

- Intestino humano

- Ambientes extremos

- Aplicación en investigaciones médicas y forenses

- 2009. Projecto Metagenoma Humano.

Mapear comunidades microbianas asociadas con el intestino humano, boca, piel.

Metatranscriptómica

Provee información sobre capacidades metabólicas y funcionales de una

comunidad microbiana.

Secuenciación directa de ADNc usando nuevas tecnologías de secuenciación

(next -generation sequencing technologies )

Ej. Pirosecuenciación

Metaproteómica

Caracterización en gran escala del conjunto de proteínas de la microbiota

ambiental en un determinado momento.

Su finalidad es determinar el potencial catalítico de una comunidad microbiana.

Electroforesis 2D y espectrometría de masas.

Es un área emergente.

Estructura general de la célula procariota

Micrografía electrónica

de transmisión (MET)

de una bacteria.

Comparación de la envoltura celular en bacterias Gram + y Gram

negativas

Envoltura celular de

bacterias y arqueas

a. Arquea

b. Bacteria Gram +

c. Bacteria Gram -

S. Capa S

CM. Membrana citopl.

CW. Pared celular

OM. Membrana externa

PG. Péptidoglicano

(mureína)

Lípidos de las Membranas celulares de bacterias y arqueas

Los fosfolípidos en bacterias son

ésteres de glicerol y ácidos grasos.

a. Fosfatidiletanolamina

b. Fosfatidilglicerol

Las cadenas hidrofóbicas de fosfolípidos arqueanos son alcoholes isoprenoides,

forman uniones éter con el glicerol (a-b-c). Forman bicapas o monocapas lipídicas

(d). Membranas más estables en condiciones ambientales extremas