Takashi Hashimoto et al- Two Tropinone Reductases with Distinct Stereospecificities from Cultured...

8/3/2019 Takashi Hashimoto et al- Two Tropinone Reductases with Distinct Stereospecificities from Cultured Roots of Hyoscyamus niger

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P l a n t P h y s i o l . ( 1 9 9 2 ) 1 0 0 , 8 3 6 - 8 4 50 0 3 2 - 0 8 8 9 / 9 2 / 1 0 0 / 0 8 3 6 / 1 0 / $ 0 l . 0 0 / 0 R e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n M a r c h 2 , 1 9 9 2A c c e p t e d M a y 1 5 , 1 9 9 2

Two T r o p i n o n e R e d u c t a s e s w i t h D i s t i n c t S t e r e o s p e c i f i c i t i e sf r o m C u l t u r e d R o o t s o f H y o s c y a m u s n i g e r 'T a k a s h i H a s h i m o t o * , K e i j i N a k a j i m a , G o d e l i e v e O n g e n a 2 , a n d Y a s u y u k i Y a m a d a

D e p a r t m e n t o f A g r i c u l t u r a l C h e m i s t r y , F a c u l t y o f A g r i c u l t u r e , K y o t o U n i v e r s i t y , K y o t o 6 0 6 , JapanA B S T R A C T

T r o p i n o n e i s a n a l k a m i n e i n t e r m e d i a t e a t t h e b r a n c h p o i n t o fb i o s y n t h e t i c p a t h w a y s l e a d i n g t o v a r i o u s t r o p a n e a l k a l o i d s . Twos t e r e o s p e c i f i c a l l y d i s t i n c t N A D P H - d e p e n d e n t o x i d o r e d u c t a s e s , T R -I a n d T R - 1 1 , w h i c h , r e s p e c t i v e l y , r e d u c e t r o p i n o n e t o 3 a - h y d r o x y -t r o p a n e ( t r o p i n e ) a n d 3 j @ - h y d r o x y t r o p a n e ( 4 - t r o p i n e ) , w e r e d e -t e c t e d m a i n l y i n t h e r o o t o f t r o p a n e a l k a l o i d - p r o d u c i n g p l a n t s b u tn o t i n n o n p r o d u c i n g c u l t u r e d r o o t . B o t h r e d u c t a s e s w e r e p u r i f i e dt o n e a r h o m o g e n e i t y f r o m c u l t u r e d r o o t o f H y o s c y a m u s n i g e r a n dc h a r a c t e r i z e d . T h e T R - 1 r e a c t i o n w a s r e v e r s i b l e , w h e r e a s t h e T R - 1 1r e a c t i o n w a s e s s e n t i a l l y i r r e v e r s i b l e , r e d u c t i o n o f t h e k e t o n e b e i n gh i g h l y f a v o r e d o v e r o x i d a t i o n o f t h e a l c o h o l 4 - t r o p i n e . M a r k e dd i f f e r e n c e s w e r e f o u n d b e t w e e n t h e t w o r e d u c t a s e s i n t h e i r a f f i n -i t i e s f o r t r o p i n o n e s u b s t r a t e a n d i n t h e e f f e c t s o f a m i n o a c i dm o d i f i c a t i o n r e a g e n t s . S o m e d i f f e r e n c e s i n s u b s t r a t e s p e c i f i c i t yw e r e a p p a r e n t . F o r e x a m p l e , N - p r o p y l - 4 - p i p e r i d o n e w a s r e d u c e db y T R - 1 1 b u t n o t b y T R - 1 . C o n v e r s e l y , 3 - q u i n u c l i d i n o n e a n d 8 -t h i a b i c y c l o [ 3 , 2 , 1 ] o c t a n e - 3 - o n e w e r e a c c e p t e d a s s u b s t r a t e s b y T R -I b u t h a r d l y a t a l l b y T R - 1 1 . B o t h e n z y m e s w e r e s h o w n t o b e c l a s sB o x i d o r e d u c t a s e s , w h i c h t r a n s f e r t h e p r o - S h y d r o g e n o f N A D ( P ) Ht o t h e i r s u b s t r a t e s . P o s s i b l e r o l e s o f t h e s e t r o p i n o n e r e d u c t a s e s i na l k a l o i d b i o s y n t h e s i s a r e d i s c u s s e d .

T r o p i n o n e i s a n a l k a m i n e i n t e r m e d i a t e a t t h e b r a n c h p o i n to f b i o s y n t h e t i c p a t h w a y s l e a d i n g t o v a r i o u s t r o p a n e a l k a l o i d sm a i n l y f o u n d i n S o l a n a c e a e ( F i g . 1 ) . T h e 3 - k e t o group o ft r o p i n o n e ca n b e r e d u c e d t o h y d r o x y l s h a v i n g two d i f f e r e n tc o n f i g u r a t i o n s : t r o p i n e h a s a h y d r o x y group on t h e o p p o s i t es i d e o f t h e t r o p a n e n i t r o g e n atom ( a - c o n f i g u r a t i o n ) , w h e r e a s0 - t r o p i n e h a s t h e group on t h e same s i d e ( f l - c o n f i g u r a t i o n ) .T h e 3 a - h y d r o x y l o f t r o p i n e i s t h e n e s t e r i f i e d w i t h o r g a n i ca c i d s t o g i v e v a r i o u s t r o p a n e e s t e r s , s u c h a s h y o s c y a m i n e a n ds c o p o l a m i n e ( f o r a r e v i e w , see r e f . 2 0 ) . I n c o n t r a s t , t h em e t a b o l i s m o f # - t r o p i n e i s n o t w e l l u n d e r s t o o d . C o c a i n ef o u n d i n E r y t h r o x y l u m i s a w e l l - k n o w n t r o p a n e e s t e r w i t h a

t - t r o p i n e d e r i v a t i v e .An N A D P H - d e p e n d e n t o x i d o r e d u c t a s e ( T R 3 - I ; F i g . 1 ) t h a tc o n v e r t s t r o p i n o n e t o t r o p i n e was f i r s t d i s c o v e r e d i n c u l t u r e dr o o t s o f D a t u r a s t r a m o n i u m ( 1 5 ) , b u t a s i m i l a r enzyme w i t hd i f f e r e n t s t e r e o s p e c i f i c i t y t h a t r e d u c e s t r o p i n o n e t o 4 I - t r o p i n e

1 T h i s work was s u p p o r t e d i n p a r t b y a g r a n t f r o m t h e M i n i s t r y o fE d u c a t i o n , S c i e n c e , a n d C u l t u r e o f J a p a n ( N o . 2 6 6 0 0 9 0 t o T . H . ) .

2 P r e s e n t a d d r e s s : I n n o g e n e t i c s NV, I n d u s t r i e p a r t Z w i j n a a r d e 7 ,B o x 4 , B - 9 0 5 2 G h e n t , B e l g i u m .3 A b b r e v i a t i o n s : T R , t r o p i n o n e r e d u c t a s e ; TBON, 8 - t h i a b i c y -c l o [ 3 , 2 , 1 ] o c t a n e - 3 - o n e .

( T R - I I ) w a s l a t e r f o u n d i n c u l t u r e d r o o t s o f H y o s c y a m u s n i g e r( 5 ) . S u b s e q u e n t s t u d i e s b y u s ( 2 3 ) a n d o t h e r s ( 4 ) i n d i c a t e dt h a t t h e t w o s t e r e o s p e c i f i c a l l y d i s t i n c t r e d u c t a s e a c t i v i t i e s c a nc o e x i s t i n a g i v e n a l k a l o i d - p r o d u c i n g s p e c i e s . How t h e m e t -a b o l i c f a t e s o f t r o p i n o n e a r e c o n t r o l l e d b y t h e s e r e d u c t a s e s i sa n i n t e r e s t i n g q u e s t i o n , p a r t i c u l a r l y i n v i e w o f o u r o b s e r v a -t i o n t h a t t h e { - t r o p i n e - f o r m i n g a c t i v i t y s e e m e d t o b e p r e d o m -i n a n t i n c u l t u r e d H . n i g e r r o o t s t h a t a c c u m u l a t e d m o s t l yt r o p i n e - d e r i v e d a l k a l o i d s ( 5 ) . H e r e we r e p o r t d i s t r i b u t i o n o ft h e t w o r e d u c t a s e s i n v a r i o u s p l a n t s p e c i e s , t h e i r o r g a n -s p e c i f i c e x p r e s s i o n , a n d d e t a i l e d b i o c h e m i c a l c h a r a c t e r i z a t i o no f t h e e n z y m e s h i g h l y p u r i f i e d f r o m c u l t u r e d r o o t s o f H .n i g e r .

MATERIALS AN D METHODSP l a n t M a t e r i a l s

C u l t u r e d r o o t s o f H y o s c y a m u s n i g e r L . h a v e b e e n m a i n -t a i n e d i n o u r l a b o r a t o r y s i n c e 1 9 8 4 a s d e s c r i b e d e l s e w h e r e( 1 3 ) . S e v e r a l p l a n t s p e c i e s ( P h y s o c h l a i n a o r i e n t a l i s M . B . D o n ,A t r o p a a c u m i n a t a R o y l e e x L i n d l , P h y s a l i s a l k e k e n g i L . , a n dC a l y s t e g i a s e p i u m R . B r ) w e r e t r a n s fo r me d w i t h A g r o b a c t e r i u mr h i z o g e n e s ( s t r a i n 1 5 8 3 4 ) b y D r . P . B a c h m a n n a t o u r l a b o r a -t o r y . A h a i r y r o o t c l o n e ( D 1 5 / 5 ) o f D a t u r a s t r a m o n i u m w a so b t a i n e d f r o m D r . R . R o b i n s , I n s t i t u t e o f F o o d R e s e a r c h ,N o r w i c h , U K . T h e s e r o o t s w e r e c u l t u r e d i n a u x i n - f r e e B 5m e d i u m ( 7 ) s u p p l e m e n t e d w i t h 3% ( w / v ) s u c r o s e . A l l o f t h eo t h e r c u l t u r e d r o o t s h a v e b e e n m a i n t a i n e d i n o u r l a b o r a t o r yf o r s e v e r a l y e a r s o r w e r e p r o v i d e d b y D r . P . B a c h m a n n a n dc u l t u r e d a s d e s c r i b e d e l s e w h e r e ( 1 4 ) . A f t e r t h e p l a n t s w e r eh a r v e s t e d w i t h a s u c t i o n f i l t e r a t t h e l a t e g r o w t h p h a s e , t h er o o t s w e r e i m m e d i a t e l y f r o z e n w i t h l i q u i d n i t r o g e n a n d k e p ta t - 2 0 0 C u n t i l u s e .P l a n t s o f H . n i g e r , D . s t r a m o n i u m , a n d A t r o p a b e l l a d o n n aw e r e g r o w n i n a g r o w t h c h a m b e r a t 2 0 0 C a n d 8 0 % R H w i t ha 1 4 - h l i g h t p e r i o d a n d h a r v e s t e d f o r e n z y m e e x t r a c t i o n whenp l a n t s w e r e f l o w e r i n g a n d h a d a f e w y o u n g f r u i t s .C h e m i c a l s

f V - T r o p i n e , h y g r i n e , a n d T B O N w e r e , r e s p e c t i v e l y , g i f t sf r o m P r o f e s s o r G . G . G r o s s , U n i v e r s i t y o f U l m , U l m , W e s tG e r m a n y ; P r o f e s s o r S . Y a m a d a , J y o s a i U n i v e r s i t y , I t a d o ,J a p a n ; a n d D r . A . J . P a r r , I n s t i t u t e o f F o o d R e s e a r c h . 2 -C a r b o m e t h o x y - 3 - t r o p i n o n e a n d V / - p e l l e t i e r i n e w e r e g e n e r -o u s l y p r o v i d e d b y P r o f e s s o r E . L e e t e , U n i v e r s i t y o f M i n n e -s o t a , M i n n e a p o l i s , M N . T r o p i n o n e , t r o p i n e , a n d t h e o t h e rc o m p o u n d s u s e d f o r t h e s t u d y o f s u b s t r a t e s p e c i f i c i t y w e r e8 3 6


2/10


3/10

P l a n t P h y s i o l . V o l . 1 0 0 , 1 9 9 2

p a s s e d t h r o u gh a P D - 1 0 c o l u m n ( P h a r m a c i a ) , a n d t h i s d e -s a l t e d e l u a t e was s u b s e q u e n t l y r e f e r r e d t o a s c r u d e e x t r a c t .T h e T R s i n t h e supematant p r e c i p i t a t e d a t ammonium s u l f a t ec o n c e n t r a t i o n s b e t w e e n 4 5 a n d 75 % s a t u r a t e d . T h e p e l l e to b t a i n e d a f t e r a s e c o n d c e n t r i f u g a t i o n was d i s s o l v e d i n 4 4m L o f b u f f e r B c o n t a i n i n g 1 m i NADPH a n d d i a l y z e d f o r1 1 h a g a i n s t a t o t a l o f 9 L o f b u ff e r B w i t h two c h a n g e s o ft h e b u f f e r . T h e d i a l y z e d enzyme s o l u t i o n was l o a d e d o n t o aD E A E - S e p h a r o s e F a s t F l o w c o l u m n ( P h a r m a c i a ; 2 . 5 x 1 8c m ) p r e v i o u s l y e q u i l i b r a t e d w i t h b u f f e r C , a n d t h e c o l u m nwas w a s h e d w i t h 2 4 0 m L o f t h e same b u f f e r . T h e enzymeswere e l u t e d w i t h a l i n e a r g r a d i e n t ( 5 4 0 m L ) o f 0 t o 0 . 4 MK C Id i s s o l v e d i n b u f f e r C , a t a f l o w r a t e o f 1 m L / m i n . T R - I a n dT R - I I a c t i v i t i e s w ere e l u t e d i n d i f f e r e n t f r a c t i o n s . A c t i v ef r a c t i o n s f o r e a c h enzyme were p o o l e d a n d s e p a r a t e l y p u r i -f i e d i n s u b s e q u e n t s t e p s .

A c t i v e T R - I f r a c t i o n s were c o n c e n t r a t e d t o 1 5 mL b y a YM -1 0 m e m b r a n e f i l t e r ( A m i c o n ) . A f t e r s o l i d NADPHwas a d d e dt o a f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 1 mm, t h e c o n c e n t r a t e d enzymes o l u t i o n was d i a l y z e d a g a i n s t a t o t a l o f 6 L o f b u f f e r B f o r 9h w i t h one e x c h a n g e o f t h e b u f f e r a n d t h e n l o a d e d on ah y d r o x y l a p a t i t e c o l u m n ( B i o - g e l H T P , B i o - R a d ; 1 . 6 x 1 2 c m )p r e v i o u s l y e q u i l i b r a t e d w i t h b u f f e r C . T h e c o l u m n wasw a s h e d w i t h 2 5 m L o f t h e same b u f f e r , a n d t h e enzyme wase l u t e d w i t h a l i n e a r g r a d i e n t ( 1 4 0 m L ) o f 1 0 t o 1 0 0 mmp o t a s s i u m p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 . 0 ) c o n t a i n i n g 1 mm D T T ,0 . 1 mM NADPH, a n d 10% ( v / v ) g l y c e r o l , a t a f l o w r a t e o f0 . 2 5 m L / m i n . A c t i v e T R - I f r a c t i o n s were c o n c e n t r a t e d t o 1 . 3m L b y a YM-10 f i l t e r , a f t e r w h i c h t h e b u f f e r was c h a n g e d t ob u f f e r C c o n t a i n i n g ammonium s u l f a t e a t 25 % o f s a tu r at i onu s i n g a P D - 1 0 c o l u m n .

T R - I was s u b s e q u e n t l y p u r i f i e d b y two f a s t p r o t e i n l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y c o l u m n s ( P h a r m a c i a ) a t room t e m p e r a t u r e .T h e a b o v e enzyme s o l u t i o n was l o a d e d on a P h e n y l - S u p e r o s eH 1 0 / 1 0 c o l u m n p r e v i o u s l y e q u i l i b r a t e d w i t h b u f f e r C con-t a i n i n g ammonium s u l f a t e a t 25 % o f s a t u r a t i o n , and t h ec o l u m n was w a s h e d w i t h 2 4 mL o f t h e same b u f f e r . T R - Iwas e l u t e d w i t h a l i n e a r g r a d i e n t ( 9 6 m L ) o f ammoniums u l f a t e a t 2 5 t o 0 % o f s a t u r a t i o n i n b u f f e r C , a t a f l o w r a t eo f 1 m L / m i n . F r a c t i o n s c o n t a i n i n g h i g h T R - I a c t i v i t y werep o o l e d a n d d e s a l t e d u s i n g PD-10 c o l u m n s , and t h e b u f fe rwas c h a n g e d t o b u f f e r D a n d l o a d e d on a M o n o P H R 5 / 2 0c o l u m n p r e v i o u s l y e q u i l i b r a t e d w i t h b u f f e r D . A f t e r t h e f l o wo f 1 2 m L o f b u f f e r D , T R - I was e l u t e d w i t h b u f f e r E a t a f l o wr a t e o f 0 . 5 m L / m i n . T o e a c h f r a c t i o n ( 1 m L ) was a d d e d 5 0, u L o f 1 M p o t a s s i u m p h o s p h a t e ( p H 7 . 0 ) f o r n e u t r a l i z a t i o n .

T h e D E A E - S e p h a r o s e f r a c t i o n s o f T R - I I were f u r t h e r p u-r i f i e d b y s u c c e s s i v e c h r o m a t o g r a p h y on h y d r o x y l a p a t i t e ,P h e n y l - S u p e r o s e a n d M o no P c o l u m n s , b a s i c a l l y i n t h e sameway a s d e s c r i b e d f o r t h e p u r i f i c a t i o n o f T R - I .

C r u d e enzyme e x t r a c t s f r o m v a r i o u s p l a n t organs a n d f r o mo t h e r r o o t c u l t u r e s were o b t a i n e d b y t h e p r o c e d u r e s u s e d f o rt h e H . n i g e r enzyme, on much s m a l l e r s c a l e s .A l k a l o i d A n a l y s i s

S a m p l e s ( 5 0 mg d r y w e i g h t ) were l y o p h i l i z e d , s o a k e d i n 4mL o f 0 . 1 N H 2 S O 4 , a n d h o m o g e n i z e d i n m o r t a r s . The h o -mogenates were s o n i c a t e d f o r 2 0 min a n d f i l t e r e d t h r o u g hN o . 2 f i l t e r p a p e r ( A d v a n t e c, T o k yo ). A f t e r t h e f i l t r a t e s were

m i x e d w i t h 0 . 4 m L o f 25 % NH40H, a 1 - m L p o r t i o n o f e a c hm i x t u r e w a s a p p l i e d t o a n E x t r e l u t - 1 c o l u m n ( M e r c k ) , a n da l k a l o i d s w e r e e l u t e d w i t h 6 m L o f d i c h l o ro m e th a n e . F o r t h ea n a l y s i s o f h y o s c y a m i n e , s c o p o l a m i n e , a n d 6 3 -h yd r o x yh yo s -c y a m i n e , t h e o r g a n i c e x t r a c t w a s d r i e d a t 3 5 0 C . T h e d r yr e s i d u e s w e r e d i s s o l v e d i n 2 0 u L o f N , O - b i s ( t r i m e t h y l -s i l y l ) a c e t a m i d e a n d 8 0 , u L o f a d i o x a n e s o l u t i o n c o n t a i n i n gt r i c o s a n e ( 6 2 5 , u g / m L ) a n d a n a l y z e d b y GL C ( S h i m a d z um o d e l G C - 7 A ) e q u i p p e d w i t h a c a p i l l a r y c o l u m n C B J - 1 ( 0 . 2 5mm i . d . x 3 0 m ; S h i m a d z u ) a t a c o l u m n t e m p e r a t u r e o f2 3 5 0 C . F o r t h e a n a l y s i s o f t r o p i n o n e , t r o p i n e , a n d 0 - t r o p i n e ,1 0 0 g L o f t h e a b o v e d i o x a n e s o l u t i o n c o n t a i n i n g t r i c o s a n ew a s a d d e d t o t h e d i c h l o r o m e t h a n e e x t r a c t , w h i c h w a s t h e ne v a p o r a t e d a t 3 0 0 C u n t i l t h e v o l u m e o f t h e s o l u t i o n w a sr e d u c e d t o a p p ro x i ma t e l y 1 0 0 , u L . T h e c o n c e n t r a t e d s o l u t i o nw a s d i r e c t l y a n a l y z e d b y G L C . T h e c o l u m n w a s h e l d a t1 2 0 0 C f o r 8 m i n , a n d t h e n t h e c o l u m n t e m p e r a t u r e w a si n c r e a s e d t o 2 5 0 0 C a t a r a t e o f 3 2 C / m i n .

F o r t h e a n a l y s i s o f a l k a l o i d s i n t h e c u l t u r e m e d i u m , 1 m Lo f t h e m e d i u m w a s m i x e d w i t h 1 0 0 , u L o f 25 % N H4 0 H a n dt h e n d i r e c t l y l o a d e d o n t h e E x t r e l u t - 1 c o l u m n . S u b s e q u e n tp r o c e d u r e s w e r e t h e s a m e a s d e s cr i b ed a b o v e . T h e a l k a l o i da m o u n t s s h o w n i n t h i s r e p o r t w e r e t h e sum o f t h e a l k a l o i d si n t h e c e l l s a n d t h e m e d i u m .D e t e r m i n a t i o n o f S t e r e o s p e c i f i c H y d r o g e n T r a n s f e r

P u r i f i e d T R - I a n d T R - I I w e r e s e p a r a t e l y i n c u b a t e d i n t h er e a c t i o n m i x t u r e ( 1 m L ) c o n t a i n i n g 1 0 0 mm p o t a s s i u m p h o s -p h a t e b u f f e r ( p H 5 . 9 ) , 0 . 1 6 u m o l o f ( 4 R ) - [ 4 - 2 H ] N A D P H o r0 . 1 8 , u m o l o f ( 4 S ) - [ 4 - 2 H ] N A D P H , a n d 4 , u m o l o f t r o p i n o n e ,f o r 2 h a t 3 7 0 C . T h e r e a c t i o n p r o d u c t s w e r e e x t r a c t e d a sd e s c r i b e d a b o v e a n d a n a l y z e d b y GC-MS a s d e s c r i b e d e l s e -w h e r e ( 1 3 ) . T h e e l e c t r o n i m p a c t i o n i z a t i o n mode w a s s e t a t7 0 e V .K i n e t i c A n a l y s i s

E n z y m e a c t i v i t i e s w e r e m e a s u r e d f o r m o r e t h a n f i v e c o n -c e n t r a t i o n s o f t h e g i v e n s u b s t r a t e s o r c o f a c t o r s , a n d t h ek i n e t i c p a r a m e t e r s ( S D ) w e r e c a l c u l a t e d b y W i l k i n s o n ' s s t a -t i s t i c a l a n a l y s i s m e t h o d ( 2 2 ) .R E S U L T S

TR A c t i v i t i e s i n V a r i o u s P l a n t O r g a n sT r o p i n e - f o r m i n g T R - I a c t i v i t y a n d , t - t r o p i n e - f o r m i n g T R -I I a c t i v i t y w e r e m e a s u r e d i n v a r i o u s p l a n t o r g a n s a n d c u l t u r e dt i s s u e s o f t h r e e s o l a n a c e o u s s p e c i e s t h a t s y n t h e s i z e e i t h e rh y o s c y a m i n e o r s c o p o l a m i n e a s t h e m a i n a l k a l o i d ( F i g . 2 ) .

S t r o n g T R - I a n d T R - I I a c t i v i t i e s w e r e f o u n d i n t h e r o o t t i s s u e so f t h e t h r e e p l a n t s . T R - I a c t i v i t i e s w e r e b y f a r t h e s t r o n g e s ti n d e v e l o p m e n t a l l y y o u n g r o o t t i s s u e s s u c h a s b r a n c h r o o t sa n d c u l t u r e d r o o t s , w h e r e a s s t r o n g T R - I I a c t i v i t i e s w e r e o b -s e r v e d n o t o n l y i n s u c h r o o t s b u t i n t h e s t e m o f D a t u r a a n dA t r o p a a s w e l l . I n a l l p l a n t o r g a n s a n a l y z e d , T R - I I a c t i v i t i e sw e r e h i g h e r t h a n T R - I a c t i v i t i e s i n H y o s c y a m u s a n d A t r o p a ,w h e r e a s t h e r e v e r s e r e l a t i o n w a s f o u n d i n m o s t o r g a n s o fD a t u r a . T h e h i g h a c t i v i t y o f t h e T R s i n t h e r o o t l e d u s t oi n v e s t i g a t e t h e e n z y m e a c t i v i t i e s i n v a r i o u s c u l t u r e d r o o t sf r o m s e v e r a l g e n e r a .

8 3 8 HASHIMOTO E T A L .


4/10

TWO TR O P I N O N E REDUCTASES WITH D I S T I N C T S T E R E O S P E C I F I C I T I E S

Hyoscyamus n i g e r D a t ur a s t r a m o n i u m A t r o p a b e l l a d on n aL e a fS t e mF r u i t N o t t e s t e d

F l o w e rM a i n r o o t T R - I I

B r a n c h r o o tC u l t u r e d r o o tC u l t u r e d c e l l N o t t e s t e d N o t t e s t e d

0 4 0 0 0 5 0 0 0 2 0 0S p e c i f i c a c t i v i t y ( p K a t m g p r o t e i n )F i g u r e 2 . T R a c t i v i t i e s i n v a r i o u s p l a n t o r g a n s o f t h r e e t r o p a n ea l k a l o i d - p r o d u c i n g s o l a n a c e o u s s p e c i e s . N o t e t h e d i f f e r e n t s c a l e sf o r e n z y m e a c t i v i t y ( p K a t / m g o f p r o t e i n ) i n e a c h s p e c i e s .

A l k a l o i d C o n t e n t s a n d TR A c t i v i t i e s i n V a r i o u s R o o tC u l t u r e sEnzyme a c t i v i t i e s o f b o t h T R s a n d t h e c o n t e n ts o f t h e i rs u b s t r a t e a n d p r o d u c t s ( t r o p i n o n e , t r o p i n e , a n d V t - t r o p i n e )a n d o f t h e m e t a b o l i t e s o f t r o p i n e ( h y o s c y a m i n e , 6 3 - h y d r o x y -

h y o s c y a m i n e , a n d s c o p o l a m i n e ) w e r e m e a s u r e d i n 2 0 r o o tc u l t u r e s f r o m 1 0 g e n e r a r e p r e s e n t i n g t h e f a m i l i e s S o l a n a c e a e( 1 7 s p e c i e s ) , C o n v o l v u l a c e a e ( 1 s p e c i e s ) , a n d C r u c i f e r a e ( 1s p e c i e s ) . A s s h o w n i n F i g u r e 3 , b o t h TR a c t i v i t i e s w e r ed e t e c t e d i n a l l c u l t u r e d r o o t s e x c e p t t h o s e o f B r o w a l l i a a m e r -i c a n a , N i c o t i a n a t a b a c u m , a n d B r a s s i c a c a m p e s t r i s f r o m w h i c hn o t r o p a n e - t y p e a l k a l o i d s h a v e b e e n s o f a r i s o l a t e d . T h eg e n e r a H y o s c y a m u s , P h y s o c h l a i n a , a n d A t r o p a s h o w e d h i g h e rT R - I I a c t i v i t y t h a n T R - I a c t i v i t y b u t g e n e r a l l y a c c u m u l a t e dm o r e t r o p i n e t h a n , - t r o p i n e . R o o t c u l t u r e s o f H y o s c y a m u sb o h e m i c u s a n d H y o s c y a m u s a l b u s a r e c h a r a c t e r i s t i c i n t h a to n l y t h e s e c u l t u r e s a c c u m u l a t e d h i g h a m o u n t s o f t r o p i n o n e ,p r e s u m a b l y b e c a u s e o f v e r y l o w e n z y m e a c t i v i t i e s o f b o t h

T R s i n t h e s e r o o t s . T r o p a n e a l k a l o i d s d e r i v e d f r o m h y o s c y -a m i n e w e r e , n e v e r t h e l e s s , m o s t a b u n d a n t i n t h e s e H y o s c y -a m u s c u l t u r e s . R o o t c u l t u r e s o f P h y s a l i s a n d C a l y s t e g i a d i dn o t c o n t a i n h y o s c y a m i n e - d e r i v e d a l k a l o i d s b u t s h o w e d r e l -a t i v e l y h i g h l e v e l s o f T R - I o r T R - I I a c t i v i t y a n d , i n t w o s p e c i e s ,a c c u m u l a t e d l o w l e v e l s o f t - t r o p i n e . T h e g e n u s P h y s a l i s i sknown t o c o n t a i n t i g l o y l o x y e s t e r s o f t r o p i n e a n d V - t r o p i n e( 2 ) , a n d c a l y s t e g i n s , p o l y h y d r o x y l a t e d d e r i v a t i v e s o f i / - t r o -p i n e , w e r e r e c e n t l y d i s c o v e r e d i n C . s e p i u m ( 8 ) .Among t h e r o o t c u l t u r e s t e s t e d , t h e r o o t c u l t u r e o f H . n i g e rt h a t s h o w e d r e l a t i v e l y h i g h a c t i v i t i e s o f b o t h T R s a n d g o o dr o o t g r o w t h w a s c h o s e n f o r f u r t h e r s t u d i e s .T i m e C o u r s e s o f A l k a l o i d F o r m a t i o n a n d T R A c t i v i t i e s

When c u l t u r e d r o o t s o f H . n i g e r w e r e t r a n s f e r r e d t o a f r e s hm e d i u m , t h e c o n t e n t s o f t h r e e a l k a m i n e i n t e r m e d i a t e s p e a k e da t d a y 3 ( F i g . 4 A ) , w h e r e a s t h e s c o p o l a m i n e c o n t e n t i n c r e a s e da t a l a t e r s t a g e o f r o o t g r o w t h ( F i g . 4 B ) . I n t h i s c u l t u r e , t h ec o n t e n t s o f h y o s c y a m i n e a n d 6 3 - h y d r o x y h yo s c ya m i n e w e r el o w a n d r e m a i n e d r e l a t i v e l y c o n s t a n t d u r i n g r o o t g r o w t h .T h e T R - I a c t i v i t y w a s h i g h e s t a t d a y 3 , b u t n o a p p a r e n t p e a ko f T R - I I a c t i v i t y w a s o b s e r v e d d u r i n g t h e c u l t u r e p e r i o d o f1 5 d ( F i g . 4 C ) . T o o b t ai n t he h ig h e s t e n z y m e a c t i v i t i e s f o rp u r i f i c a t i o n , t h e c u l t u r e d r o o t s w e r e h a r v e s t e d o n t h e t h i r dd a y a f t e r s u b c u l t u r e .E n z y m e P u r i f i c a t i o nWe f o u n d t h a t TR a c t i v i t i e s , e s p e c i a l l y T R - I a c t i v i t y , w e r er a p i d l y l o s t d u r i n g p u r i f i c a t i o n u s i n g a s i m p l e b u f f e r w i t h o u ts t a b i l i z i n g a g e n t s . A s e r i e s o f e x p e r i m e n t s ( n o t s h o w n ) , h o w -e v e r , r e v e a l e d t h a t NADPH, N A D P ' , a n d g l y c e r o l w e r ee f f e c t i v e i n p r e s e r v i n g TR a c t i v i t i e s ( e s p e c i a l l y T R - I ) d u r i n gs t o r a g e a t 4 0 C . T h e r e f o r e , 0 . 1 mmNADPH a n d 1 0 % g l y c e r o lw e r e i n c l u d e d i n a l l b u f f e r s u s e d f o r c o l u m n c h r o m a t o g r a -

p h y . T h e c r u d e e n z y m e p r e p a r a t i o n f r o m c u l t u r e d H . n i g e rr o o t s h a d T R - I I a c t i v i t y a b o u t 2 - f o l d h i g h e r t h a n T R - I a c t i v i t y .T h e t w o a c t i v i t i e s , p a r t i a l l y p u r i f i e d b y ammonium s u l f a t e

Hyoscyamus n i g e r , HnlH. n i g e r , HnH. m u t i c u sH. p u s i l l u s

H. c a n a r i e n s i sH. b o h e m i c u s

H . a l b u sP h y s o c h l a i n a o r i e n t a l i s

A t r o p a b e l l a d o n n aA . a c u m i n a t a

P h y s a l i s p h i l a d e l p h i c aP . e d u l i s

P . a l k e k e n g iD a t u r a stramoniumN i c o t i a n a t a b a c u m

D u b o i s i a l e i c h h a r d t i iD . h o p w o o d i i

B r o w a l l i a a m e r i c a n aC a l y s t e g i a s e p i u m

B r a s s i c a c a m p e s t r i s

T R -T R - T R -i _

_top in ev - t r o p i n e

h y o s c y a m i n eI / 6 ) - h y d r o x y -

h y o s c y a m i n e

s c o p o l a m i n e

0 . 4 0 . 0500 1 0 0 0 0 . 0s p e c i f i c a c t i v i t y(pKatmg p r o t e i n )

0 . 3 0a l k a l o i d c o n t e n t(%DW)

1 2

F i g u r e 3 . A l k a l o i d c o n t e n t s a n d T R a c t i v i t i e s i nv a r i o u s r o o t c u l t u r e s f r o m 1 9 s p e c i e s . N o t e t h ed i f f e r e n t s c a l e s f o r a l k a l o i d c o n t e n t s ( % d r yw e i g h t [ D W ] ) i n e a c h g r o u p o f m e t a b o l i t e s .

I .h.i

839

t r o p i n o n e


5/10


C )z.1

. . . .

ma s

. 6- I s

A .. ;Z . _i,

4 i

- i w d or R - 1 _-ONI ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ 2 III__ _

a0

vp . 4 f . . . . -- - .8 .

0 3 6 9 1 2 1 5c u l t u r e d p e r i o d ( d a y s )F i g u r e 4 . T i m e c o u r s e s o f a l k a l o i d c o n t e n t s , r o o t g r o w t h , a n d T Ra c t i v i t i e s i n a r o o t c u l t u r e o f H . n i g e r . DW, D r y w e i g h t .

p r e c i p i t a t i o n , w e r e r e p r o d u c i b l y a n d a l m o s t c o m p l e t e l :a r a t e d f r o m e a c h o t h e r b y c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y o n ES e p h a r o s e ( F i g . 5 ) . T h e r e a f t e r , T R - I a n d T R - I I w e r e s e p ap u r i f i e d b y s u c c e s s i v e c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y o n h yy l a p a t i t e , P h e n y l - S u p e r o s e , a n d Mono P . SDS-PAGE zs i s o f t h e a c t i v e f r a c t i o n s a f t e r M o no P c h r o m a t o gs h o w e d s i n g l e m a j o r p r o t e i n b a n d s ( 3 0 kD f o r T R - I akD f o r T R - I I ) , w h i c h c l o s e l y c o r r e s p o n d e d w i t h t h e ep a t t e r n s o f t h e r e s p e c t i v e TR a c t i v i t i e s ( F i g . 6 ) . O v e r a l lw a s p u r i f i e d 1 8 2 0 - f o l d t o 1 3 1 n K a t / m g o f p r o t e i n , a n d

4 0 0E l u t i o n v o l u m e ( m L )

y s e p -) E A E -i r a t e l yr d r o x -a n a l y -, r a p h y F i g u r e 6 . S D S - P A G E a n a l y s i s o f a c t i v e T R - I a n d T R - 1 1 f r a c t i o n sn d 2 9 d u r i n g p u r i f i c a t i o n . T h e t w o T R a c t i v i t i e s were s e p a r a t e d o n a D E A E -l u t i o n S e p h a r o s e c o l u m n a n d t h e r e a f t e r p u r i f i e d s e p a r a t e l y b y t h e s e -

T R - I q u e n t i a l c h r om a t og r a p h y o n h y d r o x y l a p a t i t e , P h e n y l - S u p e r o s e , a n dIT R - I I M on o P c o l u m n s . P o o l e d a c t i v e f r a c t i o n s b e f o r e Mo no P c o l u m na n d s e v e r a l Mo no P f r a c t i o n s c o r r e s p o n d i n g t o t h e T R a c t i v i t i e sw e r e a n a l y z e d o n S D S - P A G E w i t h 1 2 . 5 % T - s e p a r a t i n g g e l s , f o l l o w e d

0 . 5 b y s i l v e r s t a i n i n g . A n o p e n a r r o w h e a d i n d i c a t e s b a n d s c o r r e s p o n d -i n g t o T R - 1 , a n d a c l o s e d a r r o w h e a d i n d i c a t e s b a n d s c o r r e s p o n d i n gt o T R - I I . G h o s t b a n d s a r e a l s o s e e n a t a b o u t 6 5 a n d 5 7 k D o n t h e0 . 4 g e l s o f Mono P f r a c t i o n s .0 . 3 a

C8 was p u r i f i e d 2 5 6 0 - f o l d t o 3 8 7 n K a t / m g o f p r o t e i n . T h e s e0 . 2 o f i n a l s p e c i f i c a c t i v i t i e s w e r e s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h o s er e p o r t e d p r e v i o u s l y f o r T R - I ( 0 . 1 5 n K a t / m g o f p r o t e i n ; r e f .

0 . 1 1 5 ) a n d f o r T R - I I ( 1 8 n K a t / m g o f p r o t e i n ; r e f . 5 ) . E n z y m ep r e p a r a t i o n s a f t e r P h e n y l - S u p e r o s e c h r o m a t o g r a p h y w e r eu s e d f o r c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e e n z y m e s r e p o r t e d b e l o w .0 . 080 0

F i g u r e 5 . S e p a r a t i o n o f T R - I a n d T R - I I b y D E A E - S e p h a r o s e c o l u m nc h r o m a t o g r a p h y . Two TR a c t i v i t i e s were e l u t e d f r o m t h e c o l u m nb y a l i n e a r g r a d i e n t o f 0 t o 0 . 4 M K C I as d e s c r i b e d i n d e t a i l i n" M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . "

M o l Wt a n d E f f e c t s o f pH on F o r w a r d a n d R e v e r s eR e a c t i o n sT h e m o l wt o f H . n i g e r T R s , as d e t e r m i n e d b y g e l f i l t r a t i o n

on TSK-GEL G300 0 S W ( 7 . 5 mmx 6 0 cm ; TOSOH, T o k y o ) ,were 1 1 5 , 0 0 0 2 , 0 0 0 f o r T R - I ( m e a n o f f i v e measurements

8 0

6 0x

4 0U

L U 2 0

0

2 0

2I L 1 0

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8 4 0 H A S H I M O T O E T A L .

w_s

3 0 r

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_ : V &4 1 44 ' . . - ' . . .. tL _ . O . , W I - ,. 1


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TWO TR OP I NO N E REDUCTASES WITH D I S T I N C T S T E R E O S P E C I F I C I T I E S

+ S D ) a n d 1 0 3 , 0 0 0 3 , 0 0 0 ( ma j o r p e a k ) a n d 6 9 , 0 0 0 1 , 0 0 0( m i n o r p e a k ) f o r T R - I I ( m e a n s o f f o u r m e a s u r e m e n t s S D ) .T h e s u b u n i t m o l w t o f 3 0 , 0 0 0 f o r T R - I a n d 2 9 , 0 0 0 f o r T R - I I( F i g . 6 ) i n d i c a t e t h a t T R - I may b e a h o m o t e t r a m e r a n d T R - I I ,a h o m o t r i m e r o r a h o m o t e t r a m e r .T h e TR a c t i v i t i e s t h a t r e d u c e t r o p i n o n e t o e i t h e r t r o p i n e o r4 6 - t r o p i n e ( f o r w a r d r e a c t i o n ) a n d t h e r e v e r s e o x i d a t i v e a c t i v i -t i e s w e r e m e a s u r e d o v e r t h e p H r a n g e o f 4 . 0 t o 1 1 . 0 . T h ep u r i f i e d T R - I p r e p a r a t i o n r e d u c e d t r o p i n o n e o n l y t o t r o p i n ea n d o x i d i z e d t r o p i n e , b u t n o t t - t r o p i n e , t o t r o p i n o n e ,w h e r e a s t h e p u r i f i e d T R - I I p r e p a r a t i o n c a t a l y z e d t h e c o n v e r -s i o n s b e t w e e n t r o p i n o n e a n d 4 - t r o p i n e . T h e f o r w a r d r e a c -t i o n s c a t a l y z e d b y t h e t w o T R s w e r e e f f i c i e n t a t a s o m e w h a ta c i d i c p H ; T R - I h a d a r e l a t i v e l y n a r r o w p H r a n g e , o p t i m u ma t 6 . 1 , w h e r e a s T R - I I h a d a b r o a d p H r a n g e , o p t i m u m f r o m5 . 3 t o 6 . 5 . T h e r e v e r s e r e a c t i o n s w e r e c a t a l y z e d e f f i c i e n t l y b yT R - I w i t h i n a n a r r o w p H r a n g e , o p t i m u m a t 7 . 6 , a n d v e r yi n e f f i c i e n t l y ( a b o u t 1 . 3 % o f t h e f o r w a r d a c t i v i t y , a t m o s t ) b yT R - I I . T h e p H o p t i m a o f T R - I f r o m D a t u r a s t r a m o n i u m h a v eb e e n r e p o r t e d t o b e 6 . 8 f o r t h e f o r w a r d r e a c t i o n a n d 9 . 5 f o rt h e r e v e r s e r e a c t i o n ( 1 5 ) . We ( 5 ) p r e v i o u s l y r e p o r t e d t h e pHo p t i m u m f o r t h e f o r w a r d r e a c t i o n o f H . n i g e r T R - I I t o b e 5 . 8 .S u b s t r a t e and C o f a c t o r S p e c i f i c i t i e s

B o t h T R s h a d a much h i g h e r a f f i n i t y f o r NADPH t h a n f o rNADH; t h e r e s p e c t i v e K m v a l u e s f o r NADPH, NADP+, a n dNADH w e r e 1 1 . 3 1 . 7 , 4 1 . 5 3 . 7 , a n d > 1 0 , 0 0 0 $ M f o r T R -I a n d 6 . 1 1 . 0 , 2 5 1 6 8 , a n d 7 , 6 0 0 1 , 4 0 0 u M f o r T R - I I .T R - I h a d K m v a l u e s o f 1 0 1 0 1 8 0 j L M f o r t r o p i n o n e a n d 2 6 0 0+ 1 3 0 t i M f o r t r o p i n e , w h e r e a s T R - I I h a d much l o w e r K mv a l u e s o f 3 4 . 0 8 . 6 g M f o r t r o p i n o n e a n d 6 8 7 4 7 l t M f o r, 6 - t r o p i n e .V a r i o u s c o m p o u n d s , m o s t l y c y c l i c k e t o n e s , w e r e t e s t e d a t4 mm t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e y c a n b e r e d u c e d b y T R - I a n dT R - I I ( F i g . 7 ) . T h e t w o T R s s h o w e d r e l a t i v e l y b r o a d s u b s t r a t es p e c i f i c i t i e s , i n w h i c h s o m e k e t o n e s w e r e r e d u c e d b y b o t hT R s a n d o t h e r k e t o n e s p r e f e r e n t i a l l y b y o n e T R . T h e t w or e d u c t a s e s d i d n o t r e d u c e t h e c y c l i c k e t o n e s c o n t a i n i n g n i t r o -g e n n e x t t o a k e t o g r o u p , s u c h a s 2 - p i p e r i d o n e , N - m e t h y l - 2 -p i p e r i d o n e , 2 - p y r r o l i d o n e , a n d N - m e t h y l - 2 - p y r r o l i d o n e o rt h e k e t o n e s t h a t a r e l a r g e r t h a n t h e t r o p a n e r i n g , s u c h a s V / -p e l l e t i e r i n e a n d 2 - c a r b o m e t h o x y - 3 - t r o p i n o n e , a p o s s i b l e b i o -s y n t h e t i c p r e c u r s o r o f c o c a i n e ( 1 7 ) . E v e n t h e a d d i t i o n o f a 6 -h y d r o x y l g r o u p t o t h e t r o p a n e r i n g s i g n i f i c a n t l y l o w e r e d t h er e a c t i v i t y o f t h e s u b s t r a t e , 6 - h y d r o x y t r o p i n o n e . C o n v e r s e l y ,t h e C 6 - C 7 b r i d g e o f t r o p i n o n e w e r e n o t e s s e n t i a l f o r a c t i v i t y ,a n d many m o n o c y c l i c k e t o n e s w a s r e d u c e d t o v a r i o u s d e g r e e sb y t h e T R s . H y g r i n e , a p o s t u l a t e d b i o s y n t h e t i c p r e c u r s o r o ft r o p i n o n e ( 1 7 ) , wa s n o t a s u b s t r a t e f o r e i t h e r T R .K i n e t i c p a r a m e t e r s ( K m a n d r e l a t i v e V m a x ) w e r e o b ta i n e d f o rs e v e r a l s u b s t r a t e s ( T a b l e I ) . C o m p a r i s o n o f t h e K m v a l u e s f o rp i p e r i d o n e s a n d c y c l o h e x a n o n e s s u g g e s t s t h a t t h e C 6 - C 7b r i d g e a n d t h e n i t r o g e n a t o m o f t r o p i n o n e s e r v e t o d e c r e a s et h e a f f i n i t y o f t r o p i n o n e f o r T R - I b u t t o i n c r e a s e t h e a f f i n i t yf o r T R - I I . S i m i l a r e x p e r i m e n t s p e r f o r m e d w i t h e s s e n t i a l l yh o m o g e n e o u s T R - I a l s o r e s u l t e d i n t h e same r e a c t i v i t i e s f o rN - m e t h y l - 4 - p i p e r i d o n e a n d 4 - m e t h y l c y c l o h e x a n o n e a s d e -s c r i b e d i n F i g u r e 7 , t h u s e x c l u d i n g t h e p o s s i b i l i t y t h a t o t h e rn o n s p e c i f i c r e d u c t a s e s c o n t a m i n a t e d t h e T R - I p r e p a r a t i o n

T r o p i n o n e C H 3 > 06 - H y d r o x y t r o p i n o n e H O f I >

N - M e t h y l - 4 - p i p e r i d o n e C H 3 0 t ON- P r o p y l - 4 - p i p e r i d o n e CH3CH2CH2&O

4 - P i p e r i d o n e H C J OT e t r a h y d r o t h i o p y r a n - 4 - o n e 5 C 0 ON- M e t h y l - 2 - p i p e r i d o n e C N C O 3N C H 34 - M e t h y l c y c l o h e x a n o n e c H l c e o3 - M e t h y l c y c l o h e x a n o n e C H C o 02 - M e t h y l c y c l o h e x a n o n e CH 34 - E t h y l c y c l o h e x a n o n e CH3CH200o

2 - P y r r o l i d o n e 0N- M e t h y l - 2 - p y r r o l i d o n e C N ) C H OC H 3

3 - Q u i n u c l i d i n o n e }H y g r i n e 4 O 2 C H 32 - C a r b o m e t h o x y - 02CH33 - t r o p i n o n e 0TBON i o

W - P e l l e t i e r i n e


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P l a n t P h y s i o l . V o l . 100, 1 9 9 2

T a b l e I . K m a n d R e l a t i v e V m a x f o r T r o p i n o n e a n d O t h e r S u b s t r a t e sT R - I T R - 1 1

S u b s t r a t e R e l a t i v e R e l a t i v eK m V m . x K m V m a xMM % MM %

T r o p i n o n e 1 0 1 0 1 0 0 3 4 1 0 0N - M e t h y l - 4 - p i p e r i d o n e 2 3 1 1 3 7 7 0 5 1 2N - P r o p y l - 4 - p i p e r i d o n e No a c t i v i t y No a c t i v i t y 2 6 5 5 3 04 - P i p e r i d o n e > 1 x 1 0 4 N . D . a 2 1 6 0 0 1 0 9 04 - M e t h y l c y c l o h e x a n o n e 1 2 6 4 2 0 3 0 1 1 34 - E t h y l c y c l o h e x a n o n e 3 0 1 0 7 5 3 4 1 0 83 - M e t h y l c y c l o h e x a n o n e 4 1 8 5 7 5 8 0 1 7 23 - Q u i n u c l i d i n o n e 1 8 1 0 1 3 6 >1 x 1 0 5 N . D .TBON 3 3 4 0 >4000 N . D .

a N o t d e t e r m i n e d .

t e s t e d , p - c h l o r o m e r c u r i b e n z o i c a c i d i n h i b i t e d b o t h T R s mosts t r o n g l y ( T a b l e I I ) . T R - I I s e e m e d t o b e more s u s c e p t i b l e t ot h i s r e a g e n t , w h i c h c a u s e d a 76% i n h i b i t i o n o f T R - I I a c t i v i t yeven a t 0 . 0 1 mm . D i e t h y l p y r o c a r b o n a t e , w h i c h p r e f e r e n t i a l l ym o d i f i e s t h e i m i d a z o l e group o f h i s t i d i n e r e s i d u e s a t n e u t r a lt o s l i g h t l y a c i d i c p H , a b o l i s h e d t h e T R - I a c t i v i t y a t 0 . 1 m m ,w h e r e a s much h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s were r e q u i r e d t o s i g n i f -i c a n t l y i n h i b i t t h e T R - I I a c t i v i t y . EDTA a t 1 mt d i d n o ti n h i b i t e i t h e r TR a c t i v i t y , i n d i c a t i n g t h a t m e t a l i o n s are n o tr e q u i r e d f o r c a t a l y s i s .TBON e f f e c t i v e l y i n h i b i t e d t h e r e d u c t i o n o f t r o p i n o n e b yT R - I a t c o nc e n tr a ti o n s o f 0 . 1 mm or h i g h e r b u t had no e f f e c ton t h e t r o p i n o n e r e d u c t i o n b y T R - I I e v e n a t 4 mm ( T a b l e I I ) .S t e r e o s p e c i f i c i t y o f H y d r o g e n T r a n s f e r

T h e r e a c t i o n p r o d u c t s f o r m e d a f t e r p a r a l l e l i n c u b a t i o n s o f( 4 R ) - [ 4 - 2 H ] N A D P H a n d ( 4 S ) - [ 4 - 2 H ] N A D P H w i t h t r o p i n o n ea n d e i t h e r TR were a n a l y z e d b y GC-M S ( F i g . 8 ) . B o t h t r o p i n ea n d { - t r o p i n e , p r o d u c e d , r e s p e c t i v e l y , b y T R - I a n d T R - I I i nt h e presence o f ( 4 S ) - [ 4 - 2 H ] N A D P H , h a d t h e m o l e c u l a r i on o f

m / z 1 4 2 , w h e r e a s t h e c o r r e s p o n d i n g a l c o h o l s , p r o d u c e d i nt h e presence o f ( 4 R ) - [ 4 - 2 H ] N A D P H , h a d t h e i o n o f m / z 1 4 1 .T h e r e s u l t s s h o w t h a t b o t h T R s t r a n s f e r e x c l u s i v e l y t h e pro-S h y d r o g e n a t C - 4 o f NADPH t o t r o p i n o n e . A c c o r d i n g l y , T R -I a n d T R - I I are c l a s s i f i e d as B - s p e c i f i c o x i d o r e d u c t a s e s .

D I S C U S S I O NT r o p i n o n e h a s b e e n f o u n d i n s e v e r a l t r o p a n e a l k a l o i d -

p r o d u c i n g p l a n t s ( s e e r e f e r e n c e s c i t e d i n r e f . 1 6 ) a n d s h o w nt o b e m e t a b o l i z e d t o t h e t r o p i n e m o i e t y o f h y o s c y a m i n e a n ds c o p o l a m i n e when f e d t o i n t a c t D a t u r a i n n o x i a p l a n t s ( 1 6 ) .A l t h o u g h t h e i n v i v o m e t a b o l i s m o f t r o p i n o n e t o + - t r o p i n eor i t s d e r i v a t i v e s h a s n o t b e e n r e p o r t e d , i t i s r e a s o n a b l e t osu p p o se t h a t many e s t e r s w i t h 6 - t r o p i n e i s o l a t e d f r o m p l a n t s( 2 0 ) are a l s o d e r i v e d f r o m t r o p i n o n e . A c c o r d i n g l y , two r e -d u c t a s e a c t i v i t i e s t h a t d i f f e r i n s t e r e o s p e c i f i c i t y h a v e b e e nc o n s i d e r e d r e s p o n s i b l e f o r t h e r e d u c t i o n o f t r o p i n o n e t ot r o p i n e a n d / o r t - t r o p i n e . T h e t r o p i n e - f o r m i n g a c t i v i t y wasf i r s t f o u n d i n a r o o t c u l t u r e o f D . s t r a m o n i u m ( 1 5 ) , a n d t h e 4 v -t r o p i n e - f o r m i n g a c t i v i t y was l a t e r f o u n d i n a r o o t c u l t u r e o f

T a b l e I I . E f f e c t o f I n h i b i t o r s o n T R A c t i v i t i e sR e l a t i v e A c t i v i t yI n h i b i t o r C o n c e n t r a t i o n T R - I T R - I I

mM %None 1 0 0 1 0 0p - C h l o r o m e r c u r i b e n z o i c a c i d 1 0 0

0 . 1 0 1 30 . 0 1 9 9 2 4N - E t h y l m a l e i m i d e 1 8 0 8 8l o d o a c e t a m i d e 1 1 0 3 9 0D i e t h y l p y r o c a r b o n a t e 1 0 N o t t e s t e d 1 4

1 N o t t e s t e d 8 10 . 1 0 8 30 . 0 1 6 7 N o t t e s t e dEDTA 1 9 7 1 0 8TB O N 4 0 1 0 21 2 . 8 1 0 10 . 5 8 . 8 1 0 80 . 1 3 5 9 9

8 4 2 HASHIMOTO E T A L .


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TWO TROPINONE REDUCTASES W ITH D I S T I N C T S T E R E O S P E C I F I C I T I E S

E n z y m e T R - I T R - I IP r o d u c t T r o p i n e | y - T r o p i n e

, 9 3 C H 3 , C H 3| 4 1, | H r 1 4 1 H | OH/| r

OH HI ~ ~ ~ ~ ~ I 1 J I , I L ; k 1 .1 IIL~c a 4 0 0 6 7 0 8 0 9 0 l 0 0 1 1 0 - 1 2 0 3 0 4 0 s o 6 7 0 8 s o 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 1 4 004 0 5060 70680 9 0 1 00 1 10 1 20 1 30 1 40 40 5060 7080000 1 00 1 10 1 20 1 30 1 40

Z I CH x 3 IC3x3lOH 1 4 2 1 4 2

A ihIII. i k . l 101021 1 4 0. . . . . . . . _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ I__4_000 809 0 1 2 3 4 0 0 40000000 110120 130 140

F i g u r e 8 . M a s s s p e c t r a o f t h e r e a c t i o n p r o d u c t sf o r m e d a f t e r i n c u b a t i o n o f T R , t r o p i n o n e , a n dNADPH s t e r e o s p e c i f i c a l l y l a b e l e d w i t h 2 H . T r o -p i n e o r V , - t r o p i n e t h a t c o n t a i n s o n e 2 H i n t h em o l e c u l e w o u l d g i v e a m o l e c u l a r i o n o f 1 4 2m / z .

H . n i g e r ( 5 ) . H o w e v e r , a n e n z y m e a s s a y t h a t m e a s u r e d t h eo x i d a t i o n o f NADPH i n t h e p r e s e n c e o f t r o p i n o n e wa s u s e da n d , t h u s , t h e s e s t u d i e s d i d n o t d i s t i n g u i s h t h e a l k a m i n ep r o d u c t i n t h e c r u d e e n z y m e e x t r a c t s a n d d u r i n g e n z y m ep u r i f i c a t i o n . R e c e n t l y , N - [ m e t h y l - ' 4 C ] t r o p i n o n e w a s u s e d a sa s u b s t r a t e i n t h e e n z y m e a s s a y , a n d t h e r a d i o a c t i v e r e a c t i o np r o d u c t w a s s e p a r a t e d o n a s i l i c a g e l c o l u m n u s i n g HPLC t od i s t i n g u i s h t h e t w o r e d u c t a s e a c t i v i t i e s ( 4 ) . W i t h t h a t m e t h o d ,t r o p i n e - f o r m i n g T R - I a c t i v i t y a n d t - t r o p i n e - f o r m i n g T R - I Ia c t i v i t y w e r e p a r t i a l l y s e p a r a t e d , b u t t h e t w o r e d u c t a s e s w e r en o t f u r t h e r p u r i f i e d . F o r t h i s s t u d y r e p o r t e d i n t h i s p a p e r , wed e v e l o p e d a s i m p l e a s s a y m e t h o d t h a t d i s t i n g u i s h e s t r o p i n ea n d t - t r o p i n e b y GL C a n d u s e d t h i s GL C m e t h o d t o m e a s u r et h e t w o TR a c t i v i t i e s s i m u l t a n e o u s l y i n c r u d e e n z y m e e x t r a c t sa n d d u r i n g t h e i n i t i a l s t a g e s o f e n z y m e p u r i f i c a t i o n . O u rs t u d i e s a n d o t h e r s ( 4 ) d e m o n s t r a t e d t h a t t w o d i s t i n c t T R sc a t a l y z e h i g h l y s t e r e o s p e c i f i c r e d u c t i o n o f t r o p i n o n e t o e i t h e rt r o p i n e o r # - t r o p i n e , b u t n o t t o b o t h , a n d t h a t t h e t w o T R su s u a l l y c o e x i s t i n a g i v e n a l k a l o i d - p r o d u c i n g s p e c i e s , e s p e -c i a l l y i n t h e r o o t .D i r e c t c o m p a r i s o n s b e t w e e n h i g h l y p u r i f i e d T R - I a n d T R -I I r e v e a l e d b o t h common a n d d i f f e r e n t p r o p e r t i e s i n t h e s er e d u c t a s e s . B o t h T R s b e l o n g t o t h e N A D P H - d e p e n d e n t , c l a s sB o x i d o r e d u c t a s e s , o f w h i c h t h e c i n n a m o y l - C o A r e d u c t a s ef r o m F o r s y t h i a s u s p e n s a ( 9 ) i s known t o b e a n o t h e r memberf r o m p l a n t s . T h e i n a b i l i t y o f EDTA t o i n h i b i t e i t h e r o f t h eT R s may i n d i c a t e t h a t n e i t h e r o f t h e T R s c o n t a i n s z i n c , w h i c hi s e s s e n t i a l f o r c a t a l y s i s i n some o x i d o r e d u c t a s e s . I n h i b i t i o np a t t e r n s b y v a r i o u s m e t a l s w e r e e s s e n t i a l l y t h e s a m e f o r t h et w o T R s . B o t h T R s r e d u c e d s e v e r a l common c y c l i c k e t o n e s ,i n c l u d i n g t r o p i n o n e . I n c o n t r a s t , t h e r e w e r e s e v e r a l n o t a b l ed i f f e r e n c e s b e t w e e n T R - I a n d T R - I I i n t h e r e v e r s i b i l i t y o ft h e i r r e a c t i o n s , i n h i b i t i o n b y t h e p r o t e i n m o d i f i c a t i o nr e a g e n t s , a n d t h e i r r e a c t i v i t y w i t h s e v e r a l k e t o n e s , s u c h a sN - p r o p y l - 4 - p i p e r i d o n e , 3 - q u i n u c l i d i n o n e , a n d TBON. Someo f t h e s e p r o p e r t i e s h a v e b e e n r e p o r t e d f o r t h e r e l a t i v e l y c r u d eT R - I f r o m D . s t r a m o n i u m ( 1 5 ) a n d f o r t h e p a r t l y p u r i f i e d T R -I I f r o m H . n i g e r ( 5 ) a n d w e r e b a s i c a l l y c o m f i r m e d i n t h i sr e p o r t .T h e s e o b s e r v e d s i m i l a r i t i e s a n d d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h et w o T R s i n e v i t a b l y l e a d t o t h e q u e s t i o n : h ow d i d t h e s e t w oe n z y m e s e v o l v e ? T h e t w o T R s may h a v e e v o l v e d d i v e r g e n t l y

f r o m a common a n c e s t o r o r c o n v e r g e n t l y t o a c c e p t t h e c o m -mon s u b s t r a t e t r o p i n o n e . S t u d i e s o f m u t u a l c r o s s - r e a c t i v i t yt o a n t i b o d i e s r a i s e d a g a i n s t t h e s e T R s a n d i n f o r m a t i o n c o n -c e r n i n g t h e p r i m a r y a m i n o a c i d s e q u e n c e s a n d t h e o r g a n i -z a t i o n o f t h e g e n e s w i l l g i v e u s a b e t t e r u n d e r s t a n d i n g o f t h ee v o l u t i o n a r y o r i g i n o f T R s a n d , p e r h a p s , o f t h e e v o l u t i o n o fd i a s t e r e o i s o m e r s o c c a s i o n a l l y f o u n d i n s e c o n d a r y p r o d u c t s ,i n g e n e r a l . I n t h i s r e s p e c t , i t s h o u l d b e n o t e d t h a t a p o l y c l o n a la n t i s e r u m r a i s e d a g a i n s t a p e a i s o f l a v o n e r e d u c t a s e t h a ti n t r o d u c e s a 3 S c h i r a l c e n t e r r e c o g n i z e d a s t e r e o -s p e c i f i c a l l y d i s t i n c t a l f a l f a i s o f l a v o n e r e d u c t a s e t h a t i n t r o -d u c e s a n o p p o s i t e 3 R c h i r a l c e n t e r ( 1 8 ) .O u r d a t a c o n c e r n i n g H . n i g e r e n z y m e s s h o w t h a t t h es p e c i f i c i t y c o n s t a n t f o r T B O N , e x p r e s s e d a s V m a x / K m , i s m o r et h a n 1 0 - f o l d h i g h e r i n T R - I , b u t i s much l o w e r i n T R - I I , t h a nt h a t f o r t r o p i n o n e . I f T R - I a n d T R - I I e x i s t i n t h e s a m e c e l la n d c o m p e t e f o r t r o p i n o n e , TBON a d m i n i s t e r e d t o a r o o tc u l t u r e w o u l d b e p r e f e r e n t i a l l y r e d u c e d b y T R - I a n d c o m p e t -i t i v e l y i n h i b i t t h e f o r m a t i o n o f t r o p i n e , w h e r e a s T R - I I w o u l db e l i t t l e a f f e c t e d b y t h e a n a l o g a n d w o u l d r e d u c e a c c u m u l a t -i n g t r o p i n o n e t o a n i n c r e a s i n g a m o u n t o f { - t r o p i n e . T h i s i se x a c t l y w h a t wa s o b s e r v e d w i t h a r o ot c u l t u r e o f D . s t r a m o n -i u m t h a t h a d b e e n f e d w i t h 4 . 2 mm TBON f o r 1 4 d . T h et r e a t e d D a t u r a c u l t u r e s h o w e d a n i n c r e a s e i n t h e { - t r o p i n ep o o l a n d a d e c r e a s e i n t h e p o o l s o f t r o p i n e , 3 a - a c e t o x y t r o -p a n e , a n d h y o s c y a m i n e ( 1 9 ) . A r e d u c t i o n p r o d u c t o f TBON,p r e s u m a b l y 8 - t h i a b i c y c l o [ 3 . 2 . 1 ] o c t a n - 3 a - o l , w a s a l s o i s o l a t e df r o m t h e c u l t u r e . T h e s e r e s u l t s f u r t h e r i n d i c a t e t h a t b o t h T R sa r e p r e s e n t i n t h e s a m e c e l l s o f t h e c u l t u r e d r o o t s .

T R - I a c t i v i t y i s m o s t l y r e s t r i c t e d t o b r a n c h r o o t s a n d c u l -t u r e d r o o t s . T h e s e t i s s u e s a r e d e v e l o p m e n t a l l y y o u n g r o o tt i s s u e s w i t h o u t s e c o n d a r y g r o w t h ( 1 2 ) . P u t r e s c i n e N - m e t h -y l t r a n s f e r a s e ( 1 4 ) a n d h y o s c y a m i n e 6 # - h y d r o x y l a s e ( 1 1 ) ,o t h e r e n z y m e s i n v o l v e d i n t h e b i o s y n t h e s i s o f h y o s c y a m i n ea n d s c o p o l a m i n e , a r e a l s o h i g h l y a c t i v e i n t h e y o u n g r o o tt i s s u e s . T o g e t h e r w i t h t h e c l a s s i c a l g r a f t i n g e x p e r i m e n t s b e -t w e e n a l k a l o i d - p r o d u c i n g a n d n o n p r o d u c i n g p l a n t s ( 2 1 ) , a n da l k a l o i d f o r m a t i o n i n o r g a n c u l t u r e s ( 1 3 ) , t h e s e r e s u l t s s u g g e s tt h a t h y o s c y a m i n e a n d s c o p o l a m i n e a r e m o s t l y s y n t h e s i z e di n t h e y o u n g r o o t c e l l s a n d t r a n s l o c a t e d t o t h e a e r i a l p a r t s o ft h e p l a n t . R e c e n t i m m u n o h i s t o c h e m i c a l l o c a l i z a t i o n o f h y o s -c y a m i n e 6 , B - h y d r o x y l a s e t o t h e p e r i c y c l e c e l l s o f t h e r o o t ( 1 0 )

8 4 3


9/10


f u r t h e r s u p p o r t s t h i s c o n c l u s i o n . I t w i l l b e s t u d i e d w h e t h e rT R - I i s a l s o e x p r e s s e d i n t h e p e r i c y c l e c e l l s t h e m s e l v e s whens p e c i f i c a n t i b o d i e s o r g e n e p r o b e s b e c o m e a v a i l a b l e .T h e r o l e o f T R - I I i n a l k a l o i d b i o s y n t h e s i s i s n o t c l e a r .A l t h o u g h T R - I I a c t i v i t y i s p r e d o m i n a n t o v e r T R - I a c t i v i t y i nH y o s c y a m u s a n d A t r o p a , i t i s t h e d e r i v a t i v e s o f t r o p i n e t h a ta c c u m u l a t e i n t h e s e g e n e r a . I t may b e t h a t s o m e , i - t r o p i n em e t a b o l i t e s h a v e e s c a p e d d e t e c t i o n b y c o n v e n t i o n a l e x t r a c -t i o n a n d a n a l y s i s m e t h o d s o f t y p i c a l t r o p a n e a l k a l o i d s . C a l -y s t e g i n s r e c e n t l y d i s c o v e r e d i n C a l y s t e g i a a n d A t r o p a a r ep o l y h y d r o x y l a t e d V / - t r o p i n e s t h a t b e c a u s e o f t h e i r h i g h l yh y d r o p h i l i c n a t u r e a r e n o t r e c o v e r e d i n c o n v e n t i o n a l a l k a l o i df r a c t i o n s ( 6 , 8 ) . I t s h o u l d b e i n t e r e s t i n g t o e x a m i n e w h e t h e rc a l y s t e g i n s o r s i m i l a r h y d r o p h i l i c ' - t r o p i n e d e r i v a t i v e s a c -c u m u l a t e i n t h e r o o t c u l t u r e s w i t h h i g h T R - I I a c t i v i t y .W h a t e v e r t h e p o t e n t i a l m e t a b o l i t e s o f , / - t r o p i n e may b e ,t h e f a c t t h a t T R - I I a c t i v i t y i s h i g h i n b r a n c h r o o t s a n d c u l t u r e dr o o t s may i n d i c a t e a s i t u a t i o n i n w h i c h T R - I a n d T R - I Ic o m p e t e f o r t r o p i n o n e i n t h e a l k a l o i d - s y n t h e s i z i n g c e l l s i nt h e r o o t . T h e f e e d i n g e x p e r i m e n t w i t h T B O N a s d e s c r i b e da b o v e ( 1 9 ) i s s u g g e s t i v e o f s u c h c o m p e t i t i o n . T h e n , d o e s t h el e v e l o f T R - I I a c t i v i t y c o n t r o l t h e b i o s y n t h e s i s o f t r o p i n e -d e r i v e d a l k a l o i d s ? T R - I I h a s a much h i g h e r a f f i n i t y f o r t r o -p i n o n e t h a n d o e s T R - I , a n d t h e r e d u c t i o n o f t r o p i n o n e i sh i g h l y f a v o r e d o v e r t h e o x i d a t i o n o f 4 - t r o p i n e i n t h e T R - I Ir e a c t i o n . T h e s e i n v i t r o d a t a s u g g e s t t h a t T R - I I d e c r e a s e s t h em e t a b o l i t e f l o w t o t r o p i n e b y e f f i c i e n t l y r e m o v i n g t r o p i n o n ef r o m t h e p a t h w a y , w i t h a n u l t i m a t e d e c r e a s e i n t h e c o n t e n t so f h y o s c y a m i n e a n d s c o p o l a m i n e . We c o u l d n o t , h o w e v e r ,f i n d a n y c o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e r a t i o o f T R - I a c t i v i t y t o T R -I I a c t i v i t y a n d t h e c o n t e n t s o f h y o s c y a m i n e a n d s c o p o l a m i n ei n v a r i o u s r o o t c u l t u r e s . F u r t h e r m o r e , c u l t u r e d r o o t s o f H .a l b u s a n d H . b o h e m i c u s , w h i c h h a v e v e r y l o w a c t i v i t i e s o fb o t h T R s , a c c u m u l a t e t r o p i n o n e , b u t t h e c o n t e n t s o f t r o p i n e -d e r i v e d a l k a l o i d s a r e , n e v e r t h e l e s s , v e r y h i g h i n t h e s e c u l -t u r e s . T h e s e o b s e r v a t i o n s s u g g e s t t h a t t h e s y n t h e s i s o f t r o -p i n e - d e r i v e d a l k a l o i d s i s u s u a l l y n o t r a t e l i m i t e d b y T R - Ia c t i v i t y a n d t h a t p o t e n t i a l c o m p e t i t i o n b e t w e e n t h e t w o T R si n v i v o d o e s n o t n o t a b l y i n f l u e n c e t h e a c c u m u l a t i o n o f h y o s -c y a m i n e a n d i t s d e r i v a t i v e s i n n o r m a l r o o t t i s s u e s . I t s h o u l db e n ot e d t h a t i n m o s t r o o t c u l t u r e s t h e a c t i v i t i e s o f t h e T R sa r e g e n e r a l l y much h i g h e r t h a n t h o s e o f o t h e r e n z y m e s i nt h e p a t h w a y : t h e s p e c i f i c a c t i v i t i e s o f t h e T R s a r e i n t h e r a n g eo f 1 t o 1 2 0 0 p K a t / m g o f p r o t e i n , w h e r e a s t h o s e o f p u t r e s c i n eN - m e t h y l t r a n s f e r a s e ( r e f . 1 4 a n d o u r u n p u b l i s h e d r e s u l t s )a n d h y o s c y a m i n e 6 f - h y d r o x y l a s e ( 1 1 ) a r e i n t h e r a n g e o f 1t o 7 0 a n d 1 t o 3 0 p K a t / m g o f p r o t e i n , r e s p e c t i v e l y . I t mayt h u s f o l l o w t h a t r e i n f o r c e m e n t o f T R - I a c t i v i t y o r r e d u c t i o no f T R - I I a c t i v i t y b y m e a n s o f g e n e t i c e n g i n e e r i n g w o u l d n o th a v e m a j o r i m p a c t o n t h e p r o d u c t i v i t y o f h y o s c y a m i n e a n ds c o p o l a m i n e i n t r a n s g e n i c m e d i c i n a l p l a n t s .

NOTE ADDED I N PR O OFP a r t i a l p u r i f i c a t i o n o f T R s f r o m a D a t u r a r o o t c u l t u r e wasr e p o r t e d r e c e n t l y : A . P o r t s t e f f e n , B . D r a g e r , A . N a h r s t e d t( 1 9 9 2 ) Two t r o p i n o n e r e d u c i n g e n z y m e s f r o m D a t u r a s t r a -m o n i u m t r a n s f o r m e d r o o t c u l t u r e s . P h y t o c h e m i s t r y 3 1 :1 1 3 5 - 1 1 3 8 .

A C K N O W L E D G M E N T SWe w i s h t o t h a n k D r s . G . G . G r o s s , S . Y a m a d a , E . L e e t e , a n d A . J .

P a r r f o r p r o v i d i n g u s w i t h a l k a l o i d s a m p l e s , a n d D r s . P . B a c h m a n na n d R . J . R o b i n s f o r s u p p l y i n g s o m e o f t h e r o o t c u l t u r e s u s e d i n t h i ss t u d y . G . O . j o i n e d t h i s p r o j e c t d u r i n g h e r s t a y i n K y o t o , w h i c h w a ss u p p o r t e d b y t h e E u r o p e a n C o m m u n i t i e s S c i e n t i f i c T r a i n i n gP r o g r a m m e .

L I T E R A T U R E C I T E D1 . A l l e m a n n R K , Hung R , B e n n e r S A ( 1 9 8 8 ) S t e r e o c h e m i c a lp r o f i l e o f t h e d e h y d r o g e n a s e s o f D r o s o p h i l a m e l a n o g a s t e r . JAm C he m S o c 1 1 0 : 5 5 5 5 - 5 5 6 02 . B a s e y K , W o o l l e y J G ( 1 9 7 3 ) A l k a l o i d s o f P h y s a l i s a l k e k e n g i .

P h y t o c h e m i s t r y 1 2 : 2 5 5 7 - 2 5 5 93 . B r a d f o r d MM ( 1 9 7 6 ) A r a p i d a n d s e n s i t i v e m e t h o d f o r t h eq u a n t i f i c a t i o n o f m i c r o g r a m q u a n t i t i e s o f p r o t e i n u t i l i z i n g t h ep r i n c i p l e o f p r o t e i n - d y e b i n d i n g . A n a l B i o c h e m 7 2 : 2 4 8 - 2 5 44 . C o u l a d i s M M , F r i e s e n J B , L a n d g r e b e ME , L e e t e E ( 1 9 9 1 )E n z y m e s c a t a l y s i n g t h e r e d u c t i o n o f t r o p i n o n e t o t r o p i n e a n d{ - t r o p i n e i s o l a t e d f r o m t h e r o o t s o f D a t u r a i n n o x i a . P h y t o -c h e m i s t r y 3 0 : 8 0 1 - 8 0 55 . D r a g e r B , H a s h i m o t o T , Yamada Y ( 1 9 8 8 ) P u r i f i c a t i o n a n dc h a r a c t e r i z a t i o n o f p s e u d o t r o p i n e f o r m i n g t r o p i n o n e r e d u c t a s ef r o m H y o s c y a m u s n i g e r r o o t c u l t u r e s . A g r i c B i o l C h em 5 2 :2 6 6 3 - 2 6 6 7

6 . D u c r o t P H , L a l l e m a n d J Y ( 1 9 9 0 ) S t r u c t u r e o f t h e C a l y s t e g i n e s :new a l k a l o i d s o f t h e n o r t r o p a n e f a m i l y . T e t r a h e d r o n L e t t 3 1 :3 8 7 9 - 3 8 8 27 . G a m b o r g O L , M i l l e r R A , O j i m a K ( 1 9 6 8 ) N u t r i e n t r e q u i r e m e n t so f s u s p e n s i o n c u l t u r e s o f s o y b e a n r o o t c e l l s . E x p C e l l R e s 5 0 :1 5 1 - 1 5 8

8 . Goldmann A , M i l a t ML, D u c r o t P H , L a l l e m a n d J Y , M a i l l e M,L e p i n g l e A , C h a r p i n I , T e p f e r D ( 1 9 9 0 ) T r o p a n e d e r i v a t i v e sf r o m C a l y s t e g i a s e p i u m . P h y t o c h e m i s t r y 2 9 : 2 1 2 5 - 2 1 2 7

9 . G r o s s G G , K r e i t e n W ( 1 9 7 5 ) R e d u c t i o n o f c o e n z y m e A t h i o e s -t e r s o f c i n n a m i c a c i d s w i t h a n e n z y m e p r e p a r a t i o n f r o ml i g n i f y i n g t i s s u e o f F o r s y t h i a . F E B S L e t t 5 4 : 2 5 9 - 2 6 21 0 . H a s h i m o t o T , H a y a s h i A , Am a no Y , Kohno J , I w a n a r i H ,U s u d a S , Yamada Y ( 1 9 9 1 ) H y o s c y a m i n e 6 , B - h y d r o x y l a s e , a ne n z y m e i n v o l v e d i n t r o p a n e a l k a l o i d b i o s y n t h e s i s , i s l o c a l i z e da t t h e p e r i c y c l e o f t h e r o o t . J B i o l C he m 2 6 6 : 4 6 4 8 - 4 6 5 31 1 . H a s h i m o t o T , Yamada Y ( 1 9 8 6 ) H y o s c y a m i n e 6 0 - h y d r o x y l a s e ,a 2 - o x o g l u t a r a t e - d e p e n d e n t d i o x y g e n a s e , i n a l k a l o i d - p r o d u c -i n g r o o t c u l t u r e s . P l a n t P h y s i o l 8 1 : 6 1 9 - 6 2 51 2 . H a s h i m o t o T , Yamada Y ( 1 9 9 1 ) O r g a n c u l t u r e a n d m a n i p u l a -t i o n . I n K H o s t e t t m a n n , e d , M e t h o d s i n P l a n t B i o c h e m i s t r y ,V o l . 6 . A c a d e m i c P r e s s , L o n d o n , U K , p p 3 2 3 - 3 5 01 3 . H a s h i m o t o T , Yukimune Y , Yamada Y ( 1 9 8 6 ) T r o p a n e a l k a l o i dp r o d u c t i o n i n H y o s c y a m u s r o o t c u l t u r e s . J P l a n t P h y s i o l 1 2 4 :6 1 - 7 51 4 . H a s h i m o t o T , Yukimune Y , Yamada Y ( 1 9 8 9 ) P u t r e s c i n e a n dp u t r e s c i n e N - m e t h y l t r a n s f e r a s e i n t h e b i o s y n t h e s i s o f t r o p a n ea l k a l o i d s i n c u l t u r e d r o o t s o f H y o s c y a m u s a l b u s . I . B i o c h e m i c a ls t u d i e s . P l a n t a 1 7 8 : 1 2 3 - 1 3 01 5 . K o e l e n K J , G r o s s GG ( 1 9 8 2 ) P a r t i a l p u r i f i c a t i o n a n d p r o p e r t i e so f t r o p i n e d e hy d r o g e n a s e f r o m r o o t c u l t u r e s o f D a t u r a s t r a -m o n i u m . P l a n t a M e d 4 4 : 2 2 7 - 2 3 01 6 . L a n d g r e b e ME , L e e t e E ( 1 9 9 0 ) T h e m e t a b o l i s m o f t r o p i n o n e i ni n t a c t D a t u r a i n n o x i a p l a n t s . P h y t o c h e m i s t r y 2 9 : 2 5 2 1 - 2 5 2 41 7 . L e e t e E ( 1 9 9 0 ) R e c e n t d e v e l o p m e n t s i n t h e b i o s y n t h e s i s o f t h et r o p a n e a l k a l o i d s . P l a n t a M e d 5 6 : 3 3 9 - 3 5 21 8 . P a i v a N L , Edward R , Sun Y , H r a z d i n a G , D i x o n RA ( 1 9 9 1 )S t r e s s r e s p o n s e s i n a l f a l f a ( M e d i c a g o s a t i v a L . ) 1 1 . M o l e c u l a r

HASHIMOTO E T A L .4 4


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TWO TR OP I NO N E REDUCTASES WITH D I S T I N C T S T E R E O S P E C I F I C I T I E S

c l o n i n g a n d e x p r e s s i o n o f a l f a l f a i s o f l a v o n e r e d u c t a s e , a k e yenzyme o f i s o f l a v o n o i d p h y t o a l e x i n b i o s y n t h e s i s . P l a n t M o lB i o l 1 7 : 6 5 3 - 6 6 71 9 . P a r r A J , W a l t o n N J , B e n s a l e m S , McCabe P H , R o u t l e d g e W( 1 9 9 1 ) 8 - T h i a b i c y c l o [ 3 . 2 . 1 ] o c t a n e - 3 - o n e a s a b i o c h e m i c a l t o o li n t h e s t u d y o f t r o p a n e a l k a l o i d b i o s y n t h e s i s . P h y t o c h e m i s t r y3 0 : 2 6 0 7 - 2 6 0 92 0 . R o m e i k e A ( 1 9 7 8 ) T r o p a n e a l k a l o i d s - o c c u r r e n c e a n d system-a t i c i m p o r t a n c e i n a n g i os p e r ms . B ot N o t 1 3 1 : 8 5 - 9 6

2 1 . W a l l e r G R , N o w a c k i E K ( 1 9 7 8 ) A l k a l o i d B i o l o g y a n d M e t a b o -l i s m i n P l a n t s . P l e n u m P r e s s , N ew Y o r k , pp 1 2 1 - 1 4 12 2 . W i l k i n s o n GN ( 1 9 6 1 ) S t a t i s t i c a l e s t i m a t i o n s i n enzyme k i n e t i c s .B i o c h e m J 8 0 : 3 2 4 - 3 3 22 3 . Yamada Y , H a s h i m o t o T , Endo T , Yukimune Y , Kohno J ,H a m a g u c h i N , D r a g e r B ( 1 9 9 0 ) B i o c h e m i s t r y o f a l k a l o i dp r o d u c t i o n i n v i t r o . I n BV C h a r l w o o d , M JC R h o d e s , e d s ,S e c o n d a r y P r o d u c t s f r o m P l a n t T is s u e C u l t u r e . C l a r e n d o nP r e s s , O x f o r d , U K , pp 2 2 7 - 2 4 2

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Takashi Hashimoto et al- Two Tropinone Reductases with Distinct Stereospecificities from Cultured...

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