Synthesis and Deposition of Zein in Protein Bodies of Maize

8/2/2019 Synthesis and Deposition of Zein in Protein Bodies of Maize

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P l a n t P h y s i o l . ( 1 9 7 8 ) 6 2 , 2 5 6 - 2 6 3

S y n t h e s i s a n d D e p o s i t i o n o f Z e i n i n P r o t e i n B o d i e s o f MaizeEndosperm'

R e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n F e b r u a r y 6 , 1 9 7 8 an d i n r e v i s e d form A p r i l 8 , 1 9 7B R I A N A . L A R K I N S AND W I L L I A M J . HURKMAND e p a r t m e n t o f B o t a n y a n d P l a n t P a t h o l o g y , P u r d u e U n i v e r s i t y , West L a f a y e t t e , Indiana 47907

ABSTRACTT h e o r i g i n o f p r o t e i n b o d i e s i n m a i z e ( Z e n m a y s L . ) e n d o s p e r m w a si n v e s t i g a t e d t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e y a r e f o r m e d a s h i g h l y d i f f e r e n t i a t e do r g a n e f e s o r a s p r o t e i n d e p o s i t s w i t h i n t h e r o u g h e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m .E l e c t r o n m i c r o s c o p y o f d e v e l o p i n g m a i z e e n d o s p e r m c e l l s s h o w e d t h a tm e m b r a n e s s u r r o u n d i n g p r o t e i n b o d i e s w e r e c o n t i n u o u s w i t h r o u g h e n d o -p l a s m i c r e t i c u l u m m e m b r a n e s . M e m b r a n e s o f p r o t e i n b o d i e s a n d r o u g he n d o p l a s m i c r e t i c u l u m b o t h c o n t a i n e d c y t o c h r o m e c r e d u c t a s e a c t i v i t y

i n d i c a t i n g a s i m i l a r i t y b e t w e e n t h e s e m e m b r a n e s . F u r t h e r m o r e , t h e p r o -p o r t i o n o f a l c o h o l - s o l u b l e p r o t e i n s y n t h e s i z e d b y p o l y r i b o s o m e s i s o l a t e df r o m p r o t e i n b o d y o r r o u g h e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m m e m b r a n e s w a s s i m i l a r ,a n d t h e a l c o h o l - s o l u b l e o r - i n s o l u b l e p r o t e i n s s h o w e d i d e n t i c a l 1 1 4 C l l e u c i n el a b e l i n g . T h e s e r e s u l t s d e m o n s t r a t e d t h a t p r o t e i n b o d i e s f o r m s i m p l y a sd e p o s i t s w i t h i n t h e r o u g h e a d o p l a s m i c r e t i c u l u m .M e s s e n g e r RNA t h a t d i r e c t e d s y n t h e s i s o f o n l y t h e s m a l l e r m o l e c u l a rw e i g h t z e i n s u b u n i t w a s s e p a r a t e d f r o m mRNA t h a t s y n t h e s i z e d b o t hs u b u n i t s b y s u c r o s e g r a d i e n t c e n t r f u a t i o n . T h i s r e s u l t d e m o n s t r a t e d t h a ts e p a r a t e b u t s i m i l a r s i z e d mRNAs s y n t h e s i z e t h e m a j o r z e i n c o m p o n e n t s .I n v i t r o t r a n s l a t i o n p r o d u c t s o f p u r i f i e d mRNAs o r p o l y r i b o s o n e s w e r ea p p r o x i m a t e l y 2 , 0 0 0 d a l t o n s l a r g e r t h a n n a t i v e z e i n p r o t e i n s , s u g g e s t i n gt h a t t h e p r o t e i n s a r e s y n t h e s i z e d a s z e i n p r e c u r s o r s . When i n t a c t r o u g he n d o p l a s m i c r e t i c u l u m w a s p l a c e d i n t h e i n v i t r o p r o t e i n s y n t h e s i s s y s t e m ,p r o t e i n s c o r r e s p o n d i n g i n m o l e c u l a r w e i g h t t o t h e n a t i v e z e i n p r o t e i n s w e r eo b t a i n e d .

D u r i n g d e v e lo p m e n t o f c e r e a l s e e d s , s t o r a g e p r o t e i n s a r e s y n -t h e s i z e d i n t h e e n d o s p e r m a n d d e p o s i t e d i n p r o t e i n b o d i e s ( 5 , 9 ,1 9 ) . B a s e d o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h s o f d e v e l o p i n g w h e a t e n d o -s p e r m , M o r t o n a n d c o - w o r k e r s ( 2 0 ) c o n c l u d e d t h a t t h e s e p r o t e i nb o d i e s o r i g i n a t e d i n s p e c i a l i z e d p r o t e i n - f o r m i n g o r g a n e l l e s ( p l a s -t i d s ) w h i c h c o n t a i n e d p o l y r i b o s o m e s d i s t i n c t f r o m t h o s e o f t h eg e n e r a l E R . An u l t r a s t r u c t u r a l s t u d y o f d e v e l o p i n g m a i z e s e e d sl e d K h o o a n d W o l f ( 1 1 ) t o c o n c l u d e t h a t t h e e n d o s p e r m p r o t e i nb o d i e s o r i g i n a t e d i n v e s i c l e s p r o d u c e d b y RER o r f o r m e d a t t h ee n l a r g e d e n d s o f RE R c i s t e r n a .R e c e n t e x p e r i m e n t s h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t p r o t e i n b o d i e s i nm a i z e ( 3 , 1 3 ) a n d b a r l e y e n d o s p e r m ( 2 , 6 ) c o n t a i n t h e m a j o rp r o l a m i n e p r o t e i n s a n d t h a t t h e s e p r o t e i n s a r e s y n t h e s i z e d b ym e m b r a n e - b o u n d p o l y r i b o s o m e s . I n s o m e o f t h e s e s t u d i e s mem-b r a n e - b o u n d p o l y r i b o s o m e s w e r e i s o l a t e d f r o m t h e p a r t i c u l a t ef r a c t i o n t h a t p e l l e t e d b e t w e e n 5 0 0 a n d 3 7 , 0 0 0 g 2 ( 2 , 6 , 1 3 ) . I na n o t h e r s t u d y p o l y r i b o s o m e s w e r e i s o l a t e d f r o m a p r o t e i n b o d yf r a c t i o n o b t a i n e d b y c o n t i n u o u s s u c r o s e g r a d i e n t c e n t r i f u g a t i o n( 3 ) . B e c a u s e o f t h e a t t a c h m e n t o f r i b o s o m e s t o t h e m e m b r a n es u r r o u n d i n g p r o t e i n b o d i e s , s e v e r a l i n v e s t i g a t o r s c o n c l u d e d t h a t

' J o u r n a l P a p e r N o . 7 0 5 2 o f t h e P u r d u e U n i v e r s i t y E x p e r i m e n t S t a t i o n .2 A b b r e v i a t i o n : g g r a v i t a t i o n a l f o r c e d e t e r m i n e d a t R a y .

p r o t e i n b o d i e s a r e h i g h l y d i f f e r e n t i a t e d s i t e s o f s t o r a g e p r o t e i ns y n t h e s i s ( 3 , 2 0 , 2 7 ) , a n d f u r t h e r m o r e t h a t mRNAs i s o l a t e d f r o m" p r o t e i n b o d y " p o l y r i b o s o m e s r e p r e s e n t a h o m o g e n e o u s s o u r c e o fmRNAs ( 4 ) . S i n c e t h e p a r t i c u l a t e f r a c t i o n t h a t s e d i m e n t s b e t w e e n5 0 0 a n d 3 7 , 0 0 0 g c o n t a i n s a m i x t ur e o f RER, p r o t e i n b o d i e s , a n do t h e r m e m b r a n o u s i n c l u s i o n s , p o l y r i b o s o m e s o b t a i n e d f r o m t h i sf r a c t i o n may r e p r e s e n t a h e t e r o g e n e o u s s a m p l e o f mRNAs.T o d e t e r m i n e t h e o r i g i n o f m a i z e e n d o s p e r m p r o t e i n b o d i e s a n dt h e h e t e r o g e n e i t y o f mRNAs a s s o c i a t e d w i t h t h e m , we h a v e d o n eu l t r a s t r u c t u r a l a n d c e l l f r a c t i o n a t i o n s t u d i e s . R e s u l t s f r o m t h e s es t u d i e s a s w e l l a s e x p e r i m e n t s a n a l y z i n g i n v i t r o p r o d u c t s o fp u r i f i e d z e i n mRNAs a r e r e p o r t e d h e r e .

MATERIALS AND METHODSE l e c t r o n M i c r o s c o p y . S e c t i o n s o f 1 9 - d a y p o s t p o l l i n a t i o n e n d o -s p e r m t i s s u e f r o m t h e m a i z e ( Z e a m a y s L . ) i n b r e d l i n e W64Aw e r e f i x e d 1 . 5 t o 2 h r a t r o o m t e m p e r a t u r e i n 2 . 5 % g l u t a r a l d e h y d ew i t h 0 . 1 M s o d i u m c a c o d y l a t e b u f f e r ( p H 7 . 2 ) . S a m p l e s w e r e r i n s e dw i t h b u f f e r a n d p o s t f i x e d 3 h r i n 2% o s m i u m t e t r o x i d e i n t h e d a r k .F i x e d s p e c i m e n s w e r e r i n s e d i n H 2 0 , s o a k e d 8 t o 1 2 h r i n 0 . 5 %a q u e o u s u r a n y l a c e t a t e , d e h y d r a t e d i n a c e t o n e , a n d e m b e d d e d iE p o n . T h i n s e c t i o n s w e r e s t a i n e d w i t h l e a d c i t r a t e a n d v i e w e d

w i t h a P h i l i p s EM 2 0 0 e l e c t r o n m i c r o s c o p e . I s o l a t e d c e l l f r a c t i o nw e r e p e l l e t e d a n d t r e a t e d s i m i l a r l y .C e i l F r a c t i o n a t i o n a n d P o l y r i b o s o m e I s o l a t i o n . D e v e l o p i n gm a i z e s e e d s w e r e f r o z e n i n l i q u i d N 2 2 2 d a y s a f t e r p o l l i n a t i o n a n ds t o r e d a t - 8 0 C ( 1 3 ) . A f t e r h o m o g e n i z a t i o n o f f r o z e n k e r n e l s i nv o l u m e s o f b u f f e r A ( 0 . 2 M T r i s - H C l [ p H 8 . 5 ] , 0 . 2 M s u c r o s e , 6 0m M K C I , 5 0 mM M g C l 2 , 1 m M D T T ) , t h e e x t r a c t w a s s t r a i n et h r o u g h c h e e s e c l o t h a n d c e n t r i f u g e d i n a S o r v a l l S S - 3 4 r o t o r a5 0 0 g f o r 5 m i n . T o t a l m e m b r a n e - b o u n d p o l y r i b o s o m e s i n t h e 5 0 0s u p e r n a t a n t ( w h i c h c o n t a i n e d a m i x t u r e o f p r o t e i n b o d i e s a n dRER) w e r e o b t a i n e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 3 7 , 0 0 0 g f o r 1 0 m i n . T h em e m b r a n o u s p e l l e t w a s s u s p e n d e d i n b u f f e r A c o n t a i n i n g 1 %T r i t o n X - 1 0 0 , a n d d e t e r g e n t - i n s o l u b l e m a t e r i a l w a s r e m o v e d bc e n t r i f u g a t i o n a t 3 7 , 0 0 0 g f o r 5 m i n . T h e s u p e r n a t a n t f r a c t i o n w a sl a y e r e d o v e r 4 m l o f 2 M s u c r o s e i n b u f f e r B ( 4 0 m M T r i s - H C l [ p H8 . 5 ] , 2 0 m m K C I , 1 0 m n m M g C l 2 ) a n d p o l y r i b o s o m e s w e r e p e l l e t eb y c e n t r i f u g a t i o n a t 2 3 0 , 0 0 0 g f o r 3 h r i n t h e 6 5 r o t o r o f a BeckmanL 5 - 6 5 u l t r a c e n t r i f u g e .A m o d i f i c a t i o n o f t h e p r o c e d u r e o f B u r r a n d B u r r ( 3 ) w a s u s et o i s o l a t e p o l y r i b o s o m e s a s s o c i a t e d w i t h p r o t e i n b o d i e s . S a m p l eo f 3 m l o f t h e 5 0 0 g s u p e r n a t a n t f r a c t i o n w e r e l a y e r e d o n 2 0 0 t8 0 0 m g / m l l i n e a r s u c r o s e g r a d i e n t s i n b u f f e r A a n d c e n t r i f u g e d a8 0 , 0 0 0 g f o r 3 0 m i n i n a B e c k m a n SW 2 7 r o t o r . A f t e r r e m o v i nt h e u p p e r p o r t i o n o f t h e g r a d i e n t b y a s p i r a t i o n , t h e l a y e r o f p r o t e ib o d i e s w a s r e c o v e r e d , d i l u t e d w i t h b u f f e r A m i n u s s u c r o s e , a np e l l e t e d a t 3 7 , 0 0 0 g . P o l y r i b o s o m e s w e r e t h e n i s o l a t e d b y t hm e t h o d s u s e d f o r t o t a l m e m b r a n e - b o u n d p o l y r i b o s o m e s .A l t e r n a t i v e l y , p r o t e i n b o d y p o l y r i b o s o m e s a n d p o l y r i b o s o m eo f t h e RER w e r e s e p a r a t e d u s i n g d i s c o n t i n u o u s s u c r o s e g r a d i e n t sS a m p l e s o f 2 0 m l o f t h e 5 0 0 g s u p e r n a t a n t w e r e l a y e r e d on g r a2 5 6


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SYNTHESIS AND DEPOSITION OF ZE INd i e n t s c o n s i s t i n g o f 3 m l o f 2 . 0 Ms u c r o s e , 7 . 5 m l o f 1 . 5 Ms u c r o s e ,an d 8 ml o f 0 . 5 M s u c r o s e i n b u f f e r B . A f t e r c e n t r i f u g a t i o n a t8 0 , 0 0 0 g f o r 2 h r i n a Beckman SW 2 7 r o t o r , t h e u p p e r p o r t i o n o ft h e g r a d i e n t w as r e m o v e d b y a s p i r a t i o n , a n d membranes b e t w e e nt h e 0 . 5 a n d 1 . 5 Ms u c r o s e l a y e r s a n d p r o t e i n b o d i e s b e t w e e n t h e1 . 5 Ma n d 2 Msucrose l a y e r s we re r e m o v e d . S a m p l e s w e r e d i l u t e d5 - f o l d w i t h b u f f e r A minus sucrose a n d p e l l e t e d b y c e n t r i f u g a t i o na t 3 7 , 0 0 0 g f o r I h r . P o l y r i b o s o m e s we re r e c o v e r e d f r o m t h e s ef r a c t i o n s b y t h e p r o c e d u r e u s e d f o r t o t a l m e m b r a n e - b o u n d p o l y -r i b o s o m e s .E n z y m e D e t e r m i n a t i o n s . M a i z e k e r n e l s f r o z e n 2 2 d a y s a f t e rp o l l i n a t i o n we re h o m o g e n i z e d i n 4 v o l u m e s o f b u f f e r C ( 0 . 2 5 MT r i s - M E S [ p H 7 . 2 ] , 0 . 2 5 m o l a r s u c r o s e , 3 mM EDTA, I mm DTT)an d c e n t r i f u g e d 5 min a t 5 0 0 g . S a m p l e s o f 2 m l w e r e l a y e r e d o n2 0 0 t o 8 0 0 m g / m l sucr o se g r a d i e n t s i n b u f f e r C a n d c e n t r i f u g e df o r 2 h r a t 8 0 , 0 0 0 g i n a Beckman SW 2 7 r o t o r . G r a d i e n t s w e r es c a n n e d c o n t i n u o u s l y a t 2 5 4 nm w i t h an ISCO m o d e l UA-5a b s o r b a n c e m o n i t o r a n d f r a c t i o n a t e d i n t o 0 . 4 - m l a l i q u o t s w i t h anISCO m o d e l 6 4 0 g r a d i e n t f r a c t i o n a t o r . NADH-Cyt c r e d u c t a s ewas a s s a y e d a t 2 5 C b y f o l l o w i n g t h e r e d u c t i o n o f C y t c a t 5 5 0n m . The 3 - m l r e a c t i o n m i x t u r e c o n t a i n e d 0 . 0 5 t o 0 . 2 5 m l o f t h eg r a d i e n t f r a c t i o n , 1 . 6 6 mM s o d i u m c y a n i d e , 1 2 0 / l M C y t c , 5 0 mmp h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 . 5 ) , a n d 2 3 0 j i M NADH. T h e r a t e o f C y t cr e d u c t i o n w as e s t i m a t e d w i t h an e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t f o r C y t c o f1 8 . 5 m m - ' c m - ' ( 8 ) .C y t c o x i d a s e w as a s s a y e d b y f o l l o w i n g t h e o x i d a t i o n o f C y t ca t 5 5 0 n m . E a c h 3 - m l r e a c t i o n v o l u m e c o n t a i n e d 0 . 0 5 t o 0 . 2 5 m lo f t h e g r a d i e n t f r a c t i o n , 6 0 fL M C y t c r e d u c e d w i t h N a - d i t h i o n i t e ,0 . 0 1 % d i g i t o n i n , a n d 5 0 m M p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 . 5 ) . T h e r a t eo f C y t c o x i d a t i o n w as c a l c u l a t e d a c c o r d i n g t o S m i t h ( 2 6 ) .I s o l a t i o n a n d F r a c t i o n at i o n o f P o l y ( A ) RNA f r o m M e m b r a n e -b o u n d P o l y r i b o s o m e s . Methods f o r p o l y ( A ) RNA i s o l a t i o n we rem o d i f i e d f r o m t h o s e p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( 1 4 ) . A f t e r e l u t i o n o fp o l y ( A ) - c o n t a i n i n g RNA i n 1 0 mm HE P E S ( p H 7 . 5 ) , t h e s a m p l ewas h e a t e d t o 6 0 C f o r 3 m i n a n d r a p i d l y c h i l l e d t o 4 C . S o l i dKC l w as a d d e d t o make t h e s a m p l e 0 . 3 M a n d t h e RNA wasr e h y b r i d i z e d t o o l i g o ( d T ) - c e l l u l o s e . T h i s p r o c e d u r e was r e p e a t e dt h r e e t i m e s , an d t h e RNA was p r e c i p i t a t e d w i t h 2 . 5 v o l u m e s o fa b s o l u t e e t h a n o l a f t e r a d d i n g 0 . 1 v o l u m e o f 3 MK - a c e t a t e .P o l y ( A ) RNA was a n a l y z e d on l i n e a r l o g sucrose g r a d i e n t ss i m i l a r t o t h o s e p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( 1 4 ) . T h e RNA was h e a t e dt o 60 C f o r 3 m i n , r a p i d l y c h i l l e d t o 4 C , a n d c e n t r i f u g e d a t1 2 0 , 0 0 0 g f o r 1 7 h r i n a Beckman SW 4 1 r o t o r . G r a d i e n t s weres c a n n e d p h o t o m e t r i c a l l y a t 2 5 4 nm a n d 0 . 4 - m l a l i q u o t s c o l l e c t e d .A f t e r a d d i n g 0 . 5 ml o f H 2 0 , 0 . 1 ml o f 3 M K - a c e t a t e , a n d 1 A 2 6 0 o ft R N A , t h e RNA was p r e c i p i t a t e d w i t h 2 . 5 v o l u m e s o f a b s o l u t ee t h a n o l .

I n V i t r o P r o t e i n S y n t h e s i s . A s t a n d a r d c e l l - f r e e p r o t e i n s y n t h e -s i s s y s t e m ( 1 8 ) w as p r e p a r e d f r o m w h e a t e m b r y o s . T h e c o m p l e t es y s t e m i n a v o l u m e o f 5 0 u l c o n t a i n e d : 1 5 , i l o f w h e a t germs u p e r n a t a n t ( 1 A 2 6 0 u n i t ) , 2 0 nm t HEPES ( p H 7 . 4 ) , 2 mm DTT, 1mM A T P , 2 0 i L M G T P , 4 0 j i g / m l c r e a t i n e p h o s p h o k i n a s e , 8 mmc r e a t i n e p h o s p h a t e , 2 . 5 mm M g - a c e t a t e , 1 0 0 mm K C l , 0 . 2 5 , i C i o f[ 1 4 C ] l e u c i n e ( A m e r s h a m / S e a r l e ) a n d 2 5 uM 1 9 u n l a b e l e d a m i n oa c i d s . S a m p l e s we re i n c u b a t e d a t 2 5 C a f t e r o n e o f t h e f o l l o w i n gwas a d d e d : 0 . 7 5 t o 1 A 2 6 0 o f p o l y r i b o s o m e s s u s p e n d e d i n H20, 2t o 4 , u g o f p o l y ( A ) RNA i n H 2 0 , or 0 . 8 t o 0 . 9 A20 o f RERmembranes i n 1 0 i m i HEPES ( p H 7 . 5 ) , 2 0 mm K C I , an d 1 mMM g - a c e t a t e . R e a c t i o n s w i t h mRNA w e r e i n c u b a t e d f o r 6 0 min a t2 5 C an d t h o s e w i t h p u r i f i e d p o l y r i b o s o m e s o r RER were i n c u -b a t e d f o r 3 0 m i n . P r o t e i n s y n t h e s i s was t e r m i n a t e d b y t h e a d d i t i o no f 2 m l o f c o l d 5 % t r i c h l o r o a c e t i c a c i d o r s u f f i c i e n t a b s o l u t ee t h a n o l t o b r i n g t h e f i n a l c o n c e n t r a t i o n t o 7 0 % . Th e percentage ofe t h a n o l - s o l u b l e p r o t e i n s y n t h e s i z e d i n v i t r o was d e t e r m i n e d asp r e v i o u s l y described ( 1 3 , 1 4 ) . Hot 5 % t r i c h l o r o a c e t i c a c i d - i f A s o l u -ble, hot 70%o ethanol-soluble, or hot 70oethanol-insoluble p r o t e i nfrom the in vitro a s s a y s was d i a l y z e d in an SDS buffer ( 0 . 0 5 MTris-HCl [pH 6 . 9 1 , 0 . 5 % [ w / v J SDS, and 1% [ v / v ] 2 - m e r c a p t o e t h -

a n o l ) ( 1 6 ) . D r i e d e t h a n o l e x t r a c t s o f p r o t e i n s y n t h e s i s r e a c t i o n sc o n t a i n i n g RE R m e m b r a n e s w e r e w a s h e d w i t h c o l d a c e t o n e b e -f o r e d i a l y s i s i n SD S b u f f e r .S D S - P o l y a c r y l a m i d e G e l E l e c t r o p h o r e s i s a n d F l u o r o g r a p h y .R a d i o a c t i v e s a m p l e s w e r e a n a l y z e d o n s l a b g e l s w i t h a S D S -p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s s y s t e m s i m i l a r t o t h a t d e s c r i b e db y L a e m m l i ( 1 2 ) . G e l s w e r e 1 . 5 mm t h i c k a n d c o n s i s t e d o f a 9 - c mr u n n i n g g e l o f 1 2 . 5 % a c r y l a m i d e ( a c r y l a m i d e / b i s a c r y l a m i d e =7 5 / 1 ) i n 3 . 7 5 m m T r i s - H C l ( p H 8 . 9 ) , 0 . 0 5 8 m m TEMED, a n d0 . 0 7 5 % S D S . T h e r u n n i n g g e l w a s o v e r l a i d w i t h a 2 . 5 - c m s t a c k i n gg e l o f 5 % a c r y l a m i d e . F r e s h l y p r e p a r e d ammonium p e r s u l f a t es o l u t i o n w a s a d d e d t o a f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 0 3 5 % i m m e d i a t e l yb e f o r e e a c h g e l l a y e r w a s p o u r e d . S a m p l e s w e r e a p p l i e d i n s a m p l eb u f f e r ( 0 . 0 2 4 M T r i s - H C l [ p H 8 . 3 ] , 1 % S D S , 1 % 2 - m e r c a p t o e t h a n o l ,0 . 0 0 2 % b r o m o p h e n o l b l u e , a n d 1 0 % g l y c e r o l ) . E l e c t r o p h o r e s i s w a sc a r r i e d o u t a t r o o m t e m p e r a t u r e a t 1 5 - m a m p c o n s t a n t c u r r e n tt h r o u g h t h e s t a c k i n g g e l a n d 2 5 mamp c o n s t a n t c u r r e n t t h r o u g ht h e r u n n i n g g e l u n t i l t h e t r a c k i n g d y e r e a c h e d t h e b o t t o m o f t h eg e l . G e l s w e r e s t a i n e d o v e r n i g h t i n a s o l u t i o n o f 0 . 1% C o o m a s s i eb l u e , 4 3 % m e t h a n o l a n d 8 . 6 % a c e t i c a c i d a n d d e s t a i n e d i n 2 2 . 5 %m e t h a n o l - 7 % a c e t i c a c i d .Z e i n i s o l a t e d b y e t h a n o l e x t r a c t i o n o f p r o t e i n b o d i e s w a s u s e da s a m a r k e r f o r t h e n a t i v e p r o t e i n . R a d i o a c t i v e p r o t e i n s f r o mE s c h e r i c h i a c o l i i n f e c t e d w i t h 4 X - 1 7 4 w e r e k i n d l y p r o v i d e d b y T .P o l l o c k o f t h e D e p a r t m e n t o f B i o l o g y , P u r d u e U n i v e r s i t y , f o r u s ea s r a d i o a c t i v e m o l w t s t a n d a r d s .F l u o r o g r a p h y o f d r i e d g e l s w a s e s s e n t i a l l y a s d e s c r i b e d b yL a s k e y a n d M i l l s ( 1 5 ) .

RESULTSE n d o s p e r m c e l l s o f 1 9 - d a y - o l d m a i z e k e r n e l s w e r e c h a r a c t e r i z e db y a n e x t e n s i v e n e t w o r k o f R E R , s t a r c h g r a i n s , a n d b y t h ep r e s e n c e o f n u m e r o u s p r o t e i n b o d i e s . T h e i n t e r c o n n e c t i n g c i s t e r -n a e o f RE R a p p e a r e d d i s c o n t i n u o u s i n c r o s s - s e c t i o n ( F i g . I A ) , b u ts u r f a c e s e c t i o n s ( F i g s . l B a n d 2 A ) r e v e a l e d t h a t t h i s d i s c o n t i n u i t yw a s d u e t o t h e p r e s e n c e o f p o r e s . A s t r i k i n g f e a t u r e o f s u r f a c es e c t i o n s o f RER w a s t h e p r e s e n c e o f n u m e r o u s r i b o s o m e s i np o l y r i b o s o m e c o n f i g u r a t i o n ( F i g s . l B a n d 2 A ) . P r o t e i n b o d i e sw e r e p r o m i n e n t i n e n d o s p e r m c e l l s ( F i g . 1 A ) ; t h e y w e r e c i r c u l a rt o o v o i d i n p r o f i l e , h a d a f i n e l y g r a n u l a r , u n i f o r m l y s t a i n e d m a t r i x ,a n d w e r e b o u n d e d b y a m e m b r a n e . R i b o s o m e s a n d p o l y r i b o s o m e sw e r e a s s o c i a t e d w i t h p r o t e i n b o d y m e m b r a n e s a n d w e r e e s p e c i a l l yd i s t i n c t i n p r o t e i n b o d i e s s e c t i o n e d o b l i q u e l y ( F i g s . l B a n d 2 A ) .T h e p r o t e i n b o d i e s w e r e c l o s e l y a s s o c i a t e d w i t h RER ( F i g . I A ) ,a n d i n s o m e i n s t a n c e s p r o t e i n b o d y m e m b r a n e s w e r e d i r e c t l yc o n n e c t e d w i t h RE R ( F i g . 1 B ) .To d e t e r m i n e i f m e m b r a n e s a s s o c i a t e d w i t h p r o t e i n b o d i e s h a dp r o p e r t i e s o f E R , t h e 5 O O g s u p e r n a t a n t w a s a n a l y z e d o n a c o n t i n -u o u s s u c r o s e g r a d i e n t , a n d t h e d i s t r i b u t i o n o f C y t c r e d u c t a s e w a sm o n i t o r e d . T h i s e n z y m e i s c o m m o n l y u s e d a s a m a r k e r f o r E R( 7 , 1 7 , 2 3 ) . A s i n d i c a t e d i n F i g u r e 3 , t h e g r a d i e n t r e v e a l e d t h r e e

p e a k s o f C y t c r e d u c t a s e a c t i v i t y . T h e r e g i o n o f h i g h e s t a c t i v i t yh a d t h e g r e a t e s t UV a b s o r b a n c e a n d r e m a i n e d n e a r t h e t o p o f t h eg r a d i e n t . T h i s r e g i o n c o r r e s p o n d e d t o s t r i p p e d R E R , s i n c e i t w a sd i s p l a c e d t o a g r e a t e r d e n s i t y w h e n Mg w a s i n c l u d e d i n t h eg r a d i e n t ( d a t a n o t s h o w n ) . T h e s e c o n d z o n e o f C y t c r e d u c t a s ea c t i v i t y h a d l i t t l e UV a b s o r b a n c e a n d c o r r e s p o n d e d t o m i t o c h o n -d r i a , s i n c e i t a l s o h a d C y t c o x i d a s e a c t i v i t y . T h e t h i r d p e a k o f C y tc r e d u c t a s e a c t i v i t y c o r r e s p o n d e d t o a z o n e o f h i g h UV a b s o r b a n c e( l i g h t s c a t t e r i n g ) . When a s a m p l e f r o m t h i s r e g i o n o f t h e g r a d i e n tw a s e x a m i n e d w i t h t h e e l e c t r o n m i c r o s c o p e i t w a s f o u n d t o c o n t a i np r o t e i n b o d i e s ( F i g . 2 B ) , i n d i c a t i n g t h a t t h e e n z y m e a c t i v i t y w a sa s s o c i a t e d w i t h p r o t e i n b o d y m e m b r a n e s .When t h e 5 O O g s u p e r n a t a n t w a s c e n t r i f u g e d o n d i s c o n t i n u o u ss u c r o s e g r a d i e n t s c o n s i s t i n g o f l a y e r s o f 0 . 5 , 1 . 5 , a n d 2 . 0 M s u c r o s ei n b u f f e r B , t w o p r o m i n e n t l i g h t s c a t t e r i n g z o n e s w e r e f o r m e d .One b a n d , b e t w e e n 0 . 5 a n d 1 . 5 M s u c r o s e w a s y e l l o w , a n d e x a m -

2 5 7l a n t P h y s i o l . V o l . 6 2 , 1 9 7 8


3/8

'

tt'V

Ii~~~~~~~~~~~~~~1tP . ~ f t r

-V A p

A L , ~ ~ ~ ~ ~ 4

At.~~~~~~~~~~~~1.

AN4 'S' * 1 ~ ~ r4:

F I G . 1 . E l e c t r o n m i c r o g r a p h s o f 1 9 - d a y m a i z e e n d o s p e r m c e l l s . A : p r o n o u n c e d f e a t u r e s o f t h e e n d o s p e r m c e l l w e r e r o u g h e n d o p l a s m i c r e t i c u l( R E R ) , p r o t e i n b o d i e s ( P B ) , a n d m i t o c h o n d r i a ( M ) . RE R i s d i s c o n t i n u o u s i n c r o s s - s e c t i o n ( s m a l l a r r o w s ) b u t i s c o n t i n u o u s i n s u r f a c e s e c t i o n s ( l aa r r o w s ) ( x 1 7 , 8 0 0 ) . B : c r o s s - a n d o b l i q u e s e c t i o n s o f p r o t e i n b o d i e s s h o w c o n t i n u i t y b e t w e e n p r o t e i n b o d y m e m b r a n e s a n d e x t e n d e d RE R c i s t e r( a r r o w s ) . M e m b r a n e - b o u n d p o l y r i b o s o m e s ( M B P ) a r e e v i d e n t i n s u r f a c e s e c t i o n s o f RE R a n d m e m b r a n e s o f p r o t e i n b o d i e s ( s e e a l s o F i g . 2 A ) . CW : cw a l l ; PM: p l a s m a m e m b r a n e ; V : v a c u o l e ( x 3 3 , 5 0 0 ) .

2 5 8


4/8

2 . E l e c t r o n m i c r o g r a p h s o f m a i z e e n d o s p e r m . A : r o u g h e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m ( R E R ) i n s u r f a c e s e c t i o n w a s c h a r a c t e r i z e d b y m e m b r a n e -p o l y r i b o s o m e s ( M B P ) a n d n u m e r o u s p o r e s ( P ) ( x 3 9 , 0 0 0 ) ; B r e p r e s e n t a t i v e s a m p l e o f p r o t e i n b o d i e s ( P B ) f r o m a l i n e a r s u c r o s e g r a d i e n t a s s a y e dC y t c r e d u c t a s e ( r i b o s o m e s a r e n o t a s s o c i a t e d w i t h m e m b r a n e s b e c a u s e o f E D TA i n t h e g r i n d i n g b u f f e r ) ( x 2 0 , 0 0 0 ) C : f r a c t i o n e n r i c h e d i n RE Rb e t w e e n 0 . 5 a n d 1 . 5 M s u c r o s e i n d i s c o n t i n u o u s s u c r o s e g r a d i e n t ( x 2 5 , 0 0 0 ) . D : p r o t e i n b o d y f r a c t i o n s e d i m e n t i n g b e t w e e n 1 . 5 a n d 2 . 0 Mf r o m a d i s c o n t i n u o u s s u c r o s e g r a d i e n t ( x 2 0 , 0 0 0 ) .2 5 9


5/8

LARKINS AND HURKMAN

0 1 0 2 0 3 0 4 0% SUCROSE (W/W)

. 1 4E

. 1 2 EE0E. 1 0 40w2

. 0 8 *' a

. 0 600U

.0

0. 0 2

P l a n t P h y s i o l . V o l . 6 2 , 1 9c o m p a r i n g p o l y r i b o s o m e s f r o m RE R w i t h t h o s e f r o m p r o t eb o d i e s , 4 5 a n d 5 0 % o , r e s p e c t i v e l y , o f t h e p r o d u c t s w e r e e t h a n os o l u b l e .No d i f f e r e n c e s i n t h e e t h a n o l - s o l u b l e p r o t e i n s s y n t h e s i z e dt h e s e i s o l a t e s c o u l d b e d e t e c t e d b y f l u o r o g r a p h y a f t e r S D S - p o la c r y l a m i d e g e l a n a l y s i s . W e t h e r e f o r e a n a l y z e d t h e e t h a n o l - i n s ou b l e r a d i o a c t i v e p r o t e i n s . T h e e t h a n o l - i n s o l u b l e p r o t e i n s s y n t hs i z e d b y p o l y r i b o s o m e s f r o m RE R ( F i g . 4 A ) o r p r o t e i n b o d i( F i g . 4 B , 4 P B ) a p p e a r e d t o b e i d e n t i c a l . T h e s i z e d i s t r i b u t i o np r o t e i n s i n t h e s e s a m p l e s w a s h e t e r o g e n e o u s , a l t h o u g h t h e r e w ed i s t i n c t b a n d s w h o s e m o l w t c o r r e s p o n d e d t o t h e m a j o r e t h a n os o l u b l e p r o t e i n s . N e i t h e r t h e s o u r c e n o r t h e m e t h o d b y w h i c h tm e m b r a n e - b o u n d p o l y r i b o s o m e s w e r e i s o l a t e d q u a l i t a t i v e l y at e r e d t h e p a t t e r n o f l a b e l i n g .A s u c r o s e g r a d i e n t a n a l y s i s o f t h e mRNA i s o l a t e d f r o m a m i xm e m b r a n e f r a c t i o n i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 5 . T h e mRNA, w h is e d i m e n t e d a t a p p r o x i m at e l y 1 3 S u n d e r t h e s e c o n d i t i o n s ( 1 4 ) , ws e p a r a t e d i n t o s m a l l f r a c t i o n s a n d t r a n s l a t e d i n v i t r o . An a n a l y so f h o t a c i d - i n s o l u b l e p r o d u c t s s y n t h e s i z e d b y t h e f r a c t i o n a tmRNA i s s h o w n i n F i g u r e 6 . T h e s y n t h e s i s o f n e i t h e r o f t h e m a jz e i n c o m p o n e n t s w a s d i r e c t e d b y mRNA i n f r a c t i o n 1 0 . T h

50 6 0

F I G . 3 . D i s t r i b u t i o n o f C y t c r e d u c t a s e a n d C y t c o x i d a s e a c t i v i t y a f t e rsucrose g r a d i e n t c e n t r i f u a t i o n o f m a i z e e n d o s p e r m e x t r a c t . M e t h o d s f o rg r a d i e n t f r a c t i o n a t i o n a n d a s s a y o f en z y m e a c t i v i t y a r e d e s c r i b e d u n d e r" M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . " (-): a b s o r b a n c e a t 2 6 0 n m ; ( - -- ) : C y t creductase a c t i v i t y ; ( . . . . .): Cy t c oxidase a c t i v i t y .

T a b l e I . C o m p a r i s o n o f 1 4 C - l e u c i n e i n c o r p o r a t i o n i n t o t ot al a n d e t h a n o l - s o l u b l e p r o t e i ns y n t h e s i z e d b y m b r a n e - b o u n d p o l y r i b o s o m e sP r o c e d u r e s f o r p o l y r i b o s o m e i s o l a t i o n a n d i n v i t r o p r o t e i n s y n t h e s i s a r e d e s c r i b e di n ' K a t e r i a l s a n d M e t h o d s . " F r a c t i o n s A a n d B c o r r e s p o n d t o p o l y r i b o o m s e d e r i v - d f r o ar o u g h endoplamic r e t i c u l u m a n d p r o t e i n b o d i e s , r e s p e c t i v el y , f r om d i s c o n t i n u o u s s u c r o s e

g ra d i e n t s . A m i x t u r e o f A a n d B w a s o b t a i n e d b y i s o l a t i n g p o l y r i b o s o m e s f r o m e m b r a n e sp e l l e t e d b e t w e e n 5 00 a n d 3 7 , 0 0 0 j . P o l y r i b o s o m a s i n f r a c t i o n P B w e r e o b t a i n e d f r o m p r o t e i nb o d i e s r e c o v e r ed f r o m a c o n t i n u o u s s u c r o s e g r a d i e n t . E a c h 5 0 i i a s s a y c o n t a i n e d a p p r o x i m a t e l y0 . 8 5 A 26 0 o f p o l y r i b o s o m e s i n E x p e r i m e n t 1 , a n d 0 . 6 2 A 2 6 0 i n E x p e r i m e n t 2 . T h e r a d i o a c t i v ec o u n t s w e r e t h e a v e r a g e o f t r i p l i c a t e a s b a y s a n d a r e e x p r e s s e d a s c p m / 5 0 u 1 r e a c t i o n .T o t a l 2 e t h a n o l T o t a l 2 e t h a n o lcp m s o l u b l e cp m soluble

E x p . 1 1 1 6 , 0 0 0 5 8 1 0 6 , 0 0 0 6 1Exp. 2 7 4 , 0 0 0 4 5 5 8 , 0 0 0 5 0

Total z e t h a n o l Total 2 ethanolcp s soluble cp m soluble

9 2 , 0 0 0 7 0- 5 3 , 0 0 0 5 2-a. * . !W

i n a t i o n w i t h t h e e l e c t r o n m i c r o s c o p e showed i t t o b e e n r i c h e d i nRE R w i t h n o v i s i b l e e v i d e n c e o f p r o t e i n b o d i e s ( F i g . 2 C ) . Th ea b s e n c e o f p r o t e i n b o d i e s w as a l s o c o n f i r m e d b y i n a b i l i t y t o d e t e c tz e i n p r o t e i n s i n e t h a n o l e x t r a c t s o f t h i s f r a c t i o n . Th e s e c o n d b a n d ,w h i c h w a s b e t w e e n 1 . 5 a n d 2 . 0 Msucrose l a y e r s , c o n s i s t e d p r i -m a r i l y o f p r o t e i n b o d i e s . B o t h r i b o s o m e s an d p o l y r i b o s o m e s w e r eb o u n d t o t h e membranes s u r r o u n d i n g p r o t e i n b o d i e s ( F i g . 2 D ) .S e v e r a l e x p e r i m e n t s w e r e c a r r i e d o u t t o d e t e r m i n e i f t h e r e w e r ed i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e s e two p o p u l a t i o n s o f membrane-boundp o l y r i b o s o m e s . G r o u p s o f 5 0 kernels w e r e h o m o g e n i z e d i n b u f f e rA , a n d m e m b r a n e - b o u n d p o l y r i b o s o m e s r e c o v e r e d f r o m d i s c o n -t i n u o u s sucrose g r a d i e n t s . Th e a v e r a g e r e c o v e r y o f p o l y r i b o s o m e sf r o m b o t h f r a c t i o n s w as 3 2 A 2 6 0 u n i t s w hen 1 2 s a m p l e s ( 1 0 . 5 gt i s s u e ) w e r e e x t r a c t e d . Of t h i s t o t a l , 2 0 A 2 m u n i t s w e r e i s o l a t e df r o m t h e RER an d 1 2 Am u n i t s w e r e f r o m p r o t e i n b o d i e s .P o l y r i b o s o m e p r o f i l s o f t h e t w o f r a c t i o n s w e r e i d e n t i c a l , w i t hp o l y r i b o s o m e s containing 8 t o 9 r i b o s o m e s as t h e m o s t abundants i z e - c l a s s .A c o m p a r i s o n o f t h e amount o f e t h a n o l - s o l u b l e p r o t e i n s y n t h e -s i z e d i n v i t r o b y t h e s e p o l y r i b o s o m e s i s p r e s e n t e d i n T a b l e I . I no n e e x p e r i m e n t t h e p r o t e i n s y n t h e s i z e d b y p o l y r i b o s o m e s f r o mRER, p r o t e i n b o d y m e m b r a n e s , or a m i x t u r e o f b o t h , w as 5 8 , 6 1 ,a n d 70o e t h a n o l - s o l u b l e , r e s p e c t i v e l y . I n a n o t h e r e x p e r i m e n t

F I G . 4 . S D S - p o l y a c r y l a m i d e g e l a n a l y s i s o f a l c o h o l - i n s o l u b l e p r o t es y n t h e s i z e d b y membrane-bound p o l y r i b o s o m e s f r o m ( A ) R E R ; ( B ) p rt e i n b o d i e s f r o m d i s c o n t i n u o u s sucrose g r a d i e n t s ; an d ( P B ) p r o t e n b o d if r o m c o n t i n u o u s sucrose g r a d i e n t s . M e t h o d s f o r p o l y r i b o s o m e i s o l a t i o n ,v i t r o p r o t e i n s y n t h e s i s , a n d f l u o r o g r a p h y o f S D S - p o l y a c r y l a m i d e g e l sd e s c r i b e d u n d e r " a M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . " S a m p l e s c o n t a i n e d a p p r om a t e l y e q u a l amounts o f r a d i o a c t i v i t y . A r r o w s i n d i c a t e p o s i t i o n o f m a je t h a n o l - s o l u b l e r a d i o a c t i v e p r o t e i n s .

2 6 0

2 . 0 1 .Ec"5i N

L Uz0n o ,< 1 . 0

J F r S C C I U U D r r a c t 2 o n s A & a i r r a c t i L o n r i s--l . . . .F r a c t i o n A lPretian R n & R P r a o r t l a PR-k l

IfksA

. . . . I

A

1: 7


6/8

2 6 1SYNTHESIS AND DEPOSITION O F ZE IN1 . 0

Ec

0 0 . 5 1

0

T O P BOTTOMF I G . 5 . S u c r o s e g r a d i e n t a n a l y s i s o f p o l y ( A ) - c o n t a i n i n g RNA i s o l a t e df r o m t o t a l m e m b r a n e - b o u n d p o l y r i b o s o m e s . RNA was h e a t e d t o 6 0 C f o r3 m i n a n d r a p i d l y c h i l l e d b e f o r e l a y e r i n g on l i n e a r l o g s u c r o s e g r a d i e n t s .A f t e r c e n t r i f u g a t i o n a t 1 2 0 , 0 0 0 g f o r 1 7 h r g r a d i e n t s w e r e f r a c t i o n a t e d i n t o0 . 4 - m l a l i q u o t s a n d t h e RNA p r e c i p i t a t e d .

o t 0 1 2 3 ) 4 261 7

-mm

p r o t e i n s i z e , we c o m p a r e d t h e a l c o h o l - s o l u b l e p r o t e i n s s y n t h e s i z e db y p o l y r i b o s o m e s a t t a c h e d o r s t r i p p e d f r o m RE R m e m b r a n e s .T h e a l c o h o l - s o l u b l e p r o t e i n s s y n t h e s i z e d b y p u r i f i e d p o l y r i b o -s o m e s ( F i g . 8 A ) w e r e s l i g h t l y l a r g e r t h a n t h o s e s y n t h e s i z e d b yp o l y r i b o s o m e s a t t a c h e d t o E R m e m b r a n e s ( F i g . 8 B ) .DISCUSSION

I n a n e a r l y s t u d y o f s t o r a g e p r o t e i n s y n t h e s i s i n w h e a t e n d o -s p e r m , M o r t o n a n d c o - w o r k e r s ( 2 0 ) c o n c l u d e d t h a t p r o t e i n b o d i e so r i g i n a t e d i n s p e c i a l i z e d p r o t e i n - f o r m i n g o r g a n e l l e s ( p l a s t i d s ) . As i m i l a r s i t u a t i o n h a s b e e n s u g g e s t e d f o r m a i z e e n d o s p e r m ( 3 ) , a n dt h a t i s o l a t i o n o f p o l y r i b o s o m e s a s s o c i a t e d w i t h p r o t e i n b o d i e sp e r m i t s i s o l a t i o n o f h o m o g e n e o u s p r e p a r a t i o n s o f z e i n mRNA ( 4 ) .O u r r e s u l t s f a v o r t h e i n t e r p r e t a t i o n o f K h o o a n d W o l f ( 1 ) , whop o s t u l a t e d t h a t m a i z e p r o t e i n b o d i e s a r e f o r m e d a s p r o l a m i n ed e p o s i t s w i t h i n t h e E R . T h i s c o n c l u s i o n i s b a s e d on o b s e r v a t i o no f c o n t i n u i t y b e t w e e n p r o t e i n b o d y m e m b r a n e s a n d R E R , l o c a l i -z a t i o n o f C y t c r e d u c t a s e a c t i v i t y i n p r o t e i n b o d y a n d RE Rm e m b r a n e s , s i m i l a r i t y i n t h e p r o p o r t i o n o f a l c o h o l - s o l u b l e p r o t e i ns y n t h e s i z e d , a n d i d e n t i c a l l a b e l i n g o f p r o t e i n s i n v i t r o b y p r o t e i nb o d y a n d RE R p o l y r i b o s o m e s .A l t h o u g h i t m u s t b e p o i n t e d o u t t h a t i n c r o s s - s e c t i o n d i r e c tm e m b r a n e c o n t i n u i t y b e t w e e n p r o t e i n b o d y a n d RE R m e m b r a n e si s n o t co m m o n ( F i g . 1 ) , s u c h o b s e r v a t i o n i s h i n d e r e d b y t h ep r e s e n c e o f p o r e s i n t h e RE R ( F i g s . l B a n d 2 A ) . I f p r o t e i n b o d i e so r i g i n a t e a s l o c a l i z e d d i l a t i o n s a l o n g t h e RE R ( l 1 ) , t h e n u m b e r o fo b s e r v e d c o n t i n u i t i e s w o u l d b e s t a t i s t i c a l l y s m a l l .W e o b s e r v e d t w o p e a k s o f C y t c r e d u c t a s e a c t i v i t y i n s u c r o s eg r a d i e n t s c o r r e s p o n d i n g t o RE R a n d p r o t e i n b o d y m e m b r a n e s .A l t h o u g h t h i s f i n d i n g i n d i c a t e d t h a t m e m b r a n e s s u r r o u n d i n gp r o t e i n b o d i e s a r e c l o s e l y r e l a t e d t o E R , i t d o e s n o t p r o v e t h a tp o l y r i b o s o m e s o n p r o t e i n b o d y m e m b r a n e s a r e i d e n t i c a l t o t h o s eo n RER. A s y m m e t r i c d i s t r i b u t i o n o f RE R e x i s t s i n t h e p a n c r e a t i ce x o c r i n e c e l l ( 2 1 ) , a s w e l l a s p l a n t c e l l s d u r i n g c e l l p l a t e f o r m a t i o n( 2 2 ) . S u c h s e g r e g a t i o n h a s b e e n c i t e d a s a p o s s i b l e i n d i c a t i o n o fh e t e r o g e n e i t y i n p o l y r i b o s o m e b i n d i n g s i t e s o n t h e RE R ( 2 5 ) .W e t e s t e d f o r v a r i a t i o n a m o n g m e m b r a n e - b o u n d p o l y r i b o s o m ep o p u l a t i o n s b y c o m p a r i n g t h e a m o u n t o f a l c o h o l - s o l u b l e p r o t e i ns y n t h e s i z e d . W h i l e t h i s p r o p o r t i o n v a r i e d among e x p e r i m e n t s , t h ep r o p o r t i o n s w e r e s i m i l a r w i t h i n a n y s i n g l e e x p e r i m e n t . I n a n

Fx I 1 % I I t 3

F I G . 6 . S D S - p o l y a c r y l a m i d e g e l a n a l y s i s o f t h e h o t 5 % t r i c h l o r o a c e t i ca c i d - i n s o l u b l e p r o t e i n s s y n t h e s i z e d b y f r a c t i o n a t e d mRNA. S a m p l e n u m -b e r s c o r r e s p o n d t o t h e g r a d i e n t f r a c t i o n s d e s i g n a t e d i n F i g u r e 5 . S a m p l e sc o n t a i n e d a p p r o x i m a t e l y e q u a l a m o u n t s o f r a d i o a c t i v i t y e x c e p t f o r r e a c -t i o n s t h a t h a d l i t t l e [ ' 4 C ] l e u c i n e i n c o r p o r a t i o n i n t o p r o t e i n . T h e x - r a yn e g a t i v e w a s e x p o s e d f o r 2 0 h r a t - 8 0 C .mRNA i n f r a c t i o n 1 1 d i r e c t e d s y n t h e s i s o f o n l y t h e s m a l l e r z e i nc o m p o n e n t , w h i l e t h a t i n f r a c t i o n 1 2 ( a n d s e v e r a l s u b s e q u e n tf r a c t i o n s ) d i r e c t e d s y n t h e s i s o f b o t h z e i n c o m p o n e n t s . T h e s e p r o -t e i n s c o r r e s p o n d e d t o t h e m a j o r z e i n c o m p o n e n t s a s p r e v i o u s l yr e p o r t e d ( 1 3 , 1 4 ) ; h o w e v e r , t h e y m i g r a t e d m o r e s l o w l y i n t h e g e lt h a n t h e n a t i v e p r o t e i n s . C o m p a r e d t o l a b e l e d O X - 1 7 4 p r o t e i n s( F i g . 7 ) , t h e m o l w t o f t h e n a t i v e p r o t e i n s ( i n d i c a t e d b y t h e a r r o w s )w e r e 1 9 , 0 0 0 a n d 2 2 , 0 0 0 d a l t o n s a n d t h e p r o t e i n s s y n t h e s i z e d i nv i t r o w e r e 2 1 , 0 0 0 a n d 2 4 , 0 0 0 d a l t o n s .S l i g h t l y l a r g e r t r a n s c r i p t s o f t h e t w o m a j o r z e i n c o m p o n e n t sw e r e s y n t h e s i z e d w h e n e i t h e r mRNA o r p o l y r i b o s o m e s s t r i p p e df r o m t h e E R w e r e a d d e d t o t h e i n v i t r o p r o t e i n - s y n t h e s i z i n gs y s t e m . To d e t e r m i n e i f E R w a s i n v o l v e d i n t h e r e d u c t i o n i n

A 5 6 0 0 0_ 4 6 4 0 0

G 1 ___ 1 9 05 0

1 6 8 0 0

F I G . 7 . C o m p a r a t i v e m i g r a t i o n o f p r o t e i n s s y n t h e s i z e d b y f r a c t i o n a t e dmRNA a n d X 1 7 4 p r o t e i n s . S a m p l e s 1 1 a n d 1 3 c o n t a i n e d a p p r o x i m a t e l y3 0 , 0 0 0 cpm [ 1 4 C l l e u c i n e , a n d s a m p l e 1 2 c o n t a i n e d a p p r o x i m a t e l y 4 0 , 0 0 0c p m . H o r i z o n t a l a r r o w s i n d i c a t e t h e l o c a t i o n o f s t a i n e d n a t i v e z e i n p r o -t e i n s . M o l w t o f t h e -X 1 7 4 p r o t e i n s , A , F , H , G , B , a n d D w e r e b a s e du p o n n u c l e o t i d e s e q u e n c e c a l c u l a t i o n s o f S a n g e r e t a l . ( 2 4 ) .

P l a n t P h y s i o l . V o l . 6 2 , 1 9 7 8


7/8

LARKINS AND HURKMAN

AB

F I G . 8 . S D S - p o l y a c r y l a m i d e g e l a n a l y s i s o f a l c o h o l - s o l u b l e p r o t e i n ss y n t h e s i z e d i n v i t r o b y m e m b r a n e - b o u n d p o l y r i b o s o m e s i s o l a t e d f r o mRER ( A ) or a t t a c h e d t o RER ( B ) . E t h a n o l e x t r a c t s o f in v i t r o p r o t e i ns y n t h e s i s r e a c t i o n s were d r i e d a n d w a s h e d w i t h c o l d a c e t o n e b e f o r e b e i n gs o l u b i l i z e d a n d d i a l y z e d i n SDS b u f f e r . S a m p l e s c o n t a i n e d a p p r o x i m a t e l ye q u a l a m o u n t s o f r a d i o a c t i v i t y .e x p e r i m e n t c o m p a r i n g p o l y r i b o s o m e s f r o m RER, p r o t e i n b o d i e s ,or a m i x t u r e o f t h e tw o , t h e percentage o f a l c o h o l - s o l u b l e c o u n t swas s l i g h t l y greater f o r t h e m i x e d s a m p l e . To i n s u r e t h a t t h i ss i m i l a r i t y was not a r e s u l t o f i n c o m p l e t e s e p a r a t i o n o f RER a n dp r o t e i n b o d i e s w i t h d i s c o n t i n u o u s s u c r o s e g r a d i e n t s , we a l s o com-p a r e d t h e s e f ra c t i o n s w i t h p o l y r i b o s o m e s f r o m p r o t e i n b o d i e s

i s o l a t e d f r o m c o n t i n u o u s g r a d i e n t s . A l t h o u g h t h e p r o p o r t i o ne t h a n o l - s o l u b l e p r o t e i n w a s l e s s i n t h i s e x p e r i m e n t ( T a b l e I ) , t h ew a s n o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e r e s u l t i n g f r o m t h e m e t h o d b y w h i cp r o t e i n b o d i e s w e r e i s o l a t e d .S i n c e t h e s i m i l a r i t y b e t w e e n a l c o h o l - s o l u b l e p r o t e i n s s y n t hs i z e d b y d i f f e r e n t p o l y r i b o s o m e p r e p a r a t i o n s m a y r e s u l t f r os e l e c t i o n f o r z e i n p r o t e i n s b y t h e e x t r a c t i o n p r o c e d u r e , w e a la n a l y z e d t h e a l c o h o l - i n s o l u b l e p r o t e i n s o n S D S - p o l y a c r y l a m i dg e l s . S a m p l e s f ro m e i t h e r t h e RER ( F i g . 4 A ) o r p r o t e i n b o dp o l y r i b o s o m e s ( F i g . 4 , B a n d C ) c o n t a i n e d a h e t e r o g e n e o u s d it r i b u t i o n o f [ 1 4 C j l e u c i n e - l a b e l e d p r o t e i n s . T h e p a t t e r n o f l a b e l ib e t w e e n t h e s e f r a c t i o n s w a s i d e n t i c a l , a n d w a s i n d e p e n d e n tw h e t h e r p o l y r i b s o m e s w e r e f r o m p r o t e i n b o d i e s i s o l a t e d b y c o nt i n u o u s o r d i s c o n t i n u o u s g r a d i e n t c e n t r i f u g a t i o n . T h e p r e s e n c el a b e l e d p r o t e i n s i n t h e s e s a m p l e s o f s i m i l a r m o l w t t o t h e m a j oz e i n p r o t e i n s m a y r e f l e c t i n c o m p l e t e e x t r a c t i o n o f z e i n b y e t h a n oO u r r e s u l t s s u g g e s t t h a t h o m o g e n i z a t i o n o f d e v e l o p i n g e n d os p e r m r e s u l t s i n f r a g m e n t a t i o n o f R E R , a n d b e c a u s e o f t h e g r e a td e n s i t y o f p r o t e i n b o d i e s , t w o f r a c t i o n s o f m e m b r a n e - b o u n d p o lr i b o s o m e s a r e r e c o v e r e d . T h e 6 0 t o 4 0 % d i s t r i b u t i o n o f p o l y r i bs o m e s b e t w e e n RER a n d p r o t e i n b o d i e s i s t h e r e f o r e p r o b a b l y aa r t i f a c t o f t i s s u e h o m o g e n i z a t i o n . A s i m i l a r p o p u l a t i o n o f p o l y rb o s o m e s , h e n c e m R N A s , e x i s t s i n b o t h f r a c t i o n s . A l t h o u g h z emRNAs a r e p r e d o m i n a n t i n t h e s e p o l y r i b o s o m e s , o t h e r mRNAa r e a l s o p r e s e n t . Q u a n t i t a t i v e r e c o v e r y o f t h e s e mRNAs r e q u i ri s o l a t i o n o f t h e t o t a l m e m b r a n e - b o u n d p o l y r i b o s o m e s .T h e mRNA f r o m t o t a l m e m b r a n e - b o u n d p o l y r i b o s o ms h o w e d a h o m o g e n e o u s s i z e d i s t r i b u t i o n i n s u c r o s e g r a d i e n t s ( F i5 ) . When t h i s mRNA w a s f r a c t i o n a t e d a n d t r a n s l a t e d i n v i t ro n l y t h e m a j o r z e i n s u b u n i t s w e r e e v i d e n t ( F i g . 6 ) . W e p r e v i o u sr e p o r t e d t h a t a p p r o x i m a t e l y 9 0 % o f t h e l a b e l e d p r o t e i n s y n t h e s i zb y t h e p o l y ( A ) RNA w i t h [ 4 C J l e u c i n e w a s s o l u b l e i n e t h a n o l ( 1 4A s y e t w e h a v e i n s u f f i c i e n t d a t a t o d e t e r m i n e i f t h e p r e d o m i n a n co f z e i n p r o t e i n s i n t h e s e p r o d u c t s r e s u l t s f r o m p r e f e r e n t i a l t r a nl a t i o n o f z e i n mRNAs i n t h e w h e a t g e r m c e l l - f r e e s y s t e m , o r l oo f mRNAs c o d i n g f o r t h e a l c o h o l - i n s o l u b l e p r o t e i n s d u r ip o l y ( A ) RNA i s o l a t i o n .R e s u l t s f r o m e x p e r i m e n t s i n w h i c h mRNA f r o m m e m b r a n eb o u n d p o l y r i b o s o m e s w a s f r a c t i o n a t e d a n d t r a n s l a t e d i n v i td e m o n s t r a t e t h a t s e p a r a t e , b u t s i m i l a r s i z e d , mRNAs c o d e f o r tm a j o r z e i n s u b u n i t s . T h i s c o n c l u s i o n i s a l s o s u p p o r t e d b y e v i d e nt h a t mRNA f r o m t h e o p a q u e - 2 m u t a n t , w h i c h s y n t h e s i z e s o n l y ts m a l l e r z e i n c o m p o n e n t , h a s t h e s a m e m o l w t a s n o r m a l mRN( 1 0 ) .B e c a u s e o f t h e i n c r e a s e d r e s o l u t i o n o b t a i n e d b y f l u o r o g r a po f S D S - s l a b g e l s , w e w e r e a b l e t o d e t e r m i n e t h a t i n v i t r o t r a n s l a t ip r o d u c t s o f z e i n mRNAs w e r e a p p r o x i m a t e l y 2 , 0 0 0 d a l t o n s l a r gt h a n t h e n a t i v e p r o t e i n s . T h i s r e s u l t , w h i c h i s i n a g r e e m e n t w it h e p r e l i m i n a r y r e p o r t o f B u r r e t a l . ( 4 ) , s u g g e s t s t h a t t h e s t o r ap r o t e i n s a r e s y n t h e s i z e d a s p r e c u r s o r s , s i m i l a r t o p r o t e i n s o f a n i mmRNAs d e r i v e d f r o m RER ( 2 5 ) . I t h a s b e e n s h o w n i n s e v e ri n s t a n c e s ( 2 5 ) t h a t s u c h p r e c u r s o r s c o n t a i n a n e x t r a N - t e r m i na m i n o a c i d s e q u e n c e . T h i s s e q u e n c e i s p o s t u l a t e d t o i n i t i ap o l y r i b o s o m e a t t a c h m e n t t o R E R , a n d i s s u b s e q u e n t l y r e m o vb y p r o t e o l y t i c c l e a v a g e ( 1 , 2 5 ) . When s u c h mRNAs a r e t r a n s l a ti n v i t r o i n t h e p r e s e n c e o f RER m e m b r a n e s , p r o t e o l y t i c c l e a v ao c c u r s a n d p r o t e i n s o f c o r r e c t m o l w t a r e o b t a i n e d ( 1 ) .I n o r d e r t o d e t e r m i n e i f RER m e m b r a n e s w e r e i n v o l v e dp r o c e s s i n g z e i n p r o t e i n s , w e c o m p a r e d a l c o h o l - s o l u b l e p r o d u cf r o m r e a c t i o n s c o n t a i n i n g RE R a n d d e t e r g e n t - s o l u b i l i z e d p o l y rb o s o m e s ( F i g . 8 ) . A l t h o u g h r e a c t i o n s c o n t a i n i n g RE R g a v e lt o t a l [ 1 4 C J l e u c i n e i n c o r p o r a t i o n t h a n t h o s e c o n t a i n i n g p u r i f ip o l y r i b o s o m e s , s u f f i c i e n t p r o d u c t w a s o b t a i n e d f o r a n a l y s i sc o n c e n t r a t i o n o f a l c o h o l - s o l u b l e p r o t e i n . A c o m p a r i s o n o f p r o t e if r o m t h e s e r e a c t i o n s o n S D S - p o l y a c r y l a m i d e g e l s i n d i c a t e d t hp r o d u c t s o f RER w e r e o f s m a l l e r m o l w t . A l t h o u g h t h e r e d u c t ii n s i z e o f t h e l a r g e r z e i n c o m p o n e n t i n F i g u r e 8 B w a s m oa p p a r e n t t h a n t h a t o f t h e s m a l l e r c o m p o n e n t , b o t h r a d i o a c t i

2 6 2 P l a n t P h y s i o l . V o l . 6 2 , 1 9


8/8

P l a n t P h y s i o l . V o l . 6 2 , 1 9 7 8 SYNTHESIS AND DEPOSITION OF ZEIN 2 6 3b a n d s c o i n c i d e d w i t h t h e n a t i v e p r o t e i n s . T h e r e d u c t i o n i n s i z e o ft h e s m a l l e r z e i n c o m p o n e n t w a s l e s s a p p a r e n t a s a r e s u l t o f morei n t e n s e l a b e l i n g o f t h i s p r o t e i n b y t h e p u r i f i e d p o l y r i b o s o m ef r a c t i o n ( F i g . 8 A ) . T h e a l t e r a t i o n i n p r o t e i n s i z e d i d n o t a p p e a r t or e s u l t f r o m n o n s p e c i f i c p r o t e o l y t i c a c t i v i t y o r i n c o m p l e t e mRNAt r a n s l a t i o n s i n c e p r o t e i n s o f d i s t i n c t m o l w t w e r e s y n t h e s i z e d , a n dt h e s e r e s u l t s w e r e v e r y r e p r o d u c i b l e . A l t h o u g h we h a v e i n s u f f i c i e n td a t a t o c o n c l u d e t h a t a p o r t i o n o f t h e N - t e r m i n a l a m i n o a c i ds e q u e n c e w a s r e m o v e d , t h i s s e e m s a r e a s o n a b l e e x p l a n a t i o n .

A c k n o w l e d g m e n t s - T h e a u t h o r s w i s h t o e x p r e s s t h e i r t h a n k s t o C . E . B r a c k e r f o r t e c h n i c a la d v i c e a n d u s e o f e l e c t r o n m i c r o s c o p y f a c i l i t i e s . W e a l s o w i s h t o t h a n k L . B e e v e r s f o r h i s h e l p f u lc o m m e n t s a n d c r i t i c i s m o f t h e m a n u s c r i p t .

LITERATURE CITED1 . B L O B E L G , B D O B B E R S T E I N 1 9 7 5 T r a n s f e r o f p r o t e i n s a c r o s s m e m b r a n e s . I I . R e c o n s t r u c t i o n o ff u n c t i o n a l r o u g h m i c r os o m e s f r o m h e t e r o g e n e o u s c o m p o n e n t s . J C e l l B i o l 6 7 : 8 5 2 - 8 6 22 . B R A N D T A , J I N G V E R S E N 1 9 7 7 I n v i t r o s y n t h e s i s o f b a r l e y e n d o s p e r m p r o t e i n s o n w i l d t y p e a n d

m u t a n t t e m p l a t e s . C a r l s b e r g R e s Co m 4 1 : 3 1 1 - 3 2 03 . BURR B , FA B U R R 1 9 7 6 Z e i n s y n t h e s t s i n m a i z e e n d o s p e r m b y p o l y r i b o s o m e s a t t a c h e d t op r o t e i n b o d i e s . P r o c N a t A c a d S c i USA 7 3 : 5 1 5 - 5 1 94 . BURR B , FA B U R R , LC HANNAH 1 9 7 7 L o c a l i z e d s y n t h e s i s o f z e i n i n m a i z e e n d o s p e r m . C e r e a l

F o o d s W o r l d 2 2 : 4 6 95 . D U V I C K DN 1 9 6 1 P r o t e i n g r a n u l e s o f m a i z e e n d o s p e r m c e l l s . C e r e a l Chem 3 8 : 3 7 4 - 3 8 56 . Fox J E , HM P R A T T , PR S H E W R Y , B J M I F L I N 1 9 7 7 I n A c i d e s N u c l e i q u e s e t S y n t h e s e D e s

P r o t e i n e s C h e z L e s V e g e t a u x . C e n t r e N a t i o n a l d e l a R e c h e r c h e S c i e n t i f i q u e , P a r i s , p p5 0 1 - 5 0 97 . G O N Z A L E Z E , H B E E V E R S 1 9 7 6 R o l e o f t h e e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m i n g l y o x y s o m e f o r m a t i o n i nc a s t o r b e a n e n d o s p e r m . P l a n t P h y s i o l 5 7 : 4 0 6 - 4 0 98 . H A T E F I Y , J S R IE S K E 1 9 6 7 T h e p r e p a r a t i o n a n d p r o p e r t i e s o f D P N H - c y t o c h r o m e c r e d u c t a s e

( c o m p l e x I - I I I o f t h e r e s p i r a t o r y c h a i n ) . M e t h o d s E n z y m o l 1 0 : 2 2 5 - 2 3 19 . I N G V E R S E N J 1 9 7 5 S t r u c t u r e a n d c o m p o s i t i o n o f p r o t e i n b o d i e s f r o m w i l d t y p e a n d h i g h l y s i n eb a r l e y e n d o s p e r m . H e r e d i t a s 8 1 : 6 9 - 7 6

1 0 . J O N E S RA 1 9 7 6 G e n e t i c r e g u l a t i o n o f s t o r a g e p r o t e i n b i o s y n t h e s i s i n d e v e l o p i n g m a i z ee n d o s p e r m . D o c t o r a l d i s s e r t a t i o n . P u r d u e U n i v e r s i t y , W e s t L a f a y e t t e I n d i a n a

I 1 . KHOO U , MJ WOLF 1 9 7 0 O r i g i n a n d d e v e l o p m e n t o f p r o t e i n g r a n u l e s i n m a i z e e n d o s p e r m .Am J B o t 5 7 : 1 0 4 2 - 1 0 5 0

1 2 . L A E M M L I UK 1 9 7 0 C l e a v a g e o f s t r u c t u r a l p r o t e i n s d u r i n g t h e a s s e m b l y o f t h e h e a d o fb a c t e r i o p h a g e T 4 . N a t u r e 2 2 7 : 6 8 0 6 8 41 3 . L A R K I N S B A , CE B R A C K E R , CY T S A I 1 9 7 6 S t o r a g e p r o t e i n s y n t h e s i s i n m a i z e . I s o l a t i o n o f z e i n -s y n t h e s i z i n g p o l y r i b o s o m e s . P l a n t P h y s i o l 5 7 : 7 4 0 - 7 4 51 4 . L A R K I N S B A , RA J O N E S , C Y T S A I 1 9 7 6 I s o l a t i o n a n d i n v i t r o t r a n s l a t i o n o f z e i n m e s s e n g e rr i b o n u c l e i c a c i d . B i o c h e m i s t r y 1 5 : 5 5 0 6 - 5 5 1 11 5 . L A S K E Y R A , AD M I L L s 1 9 7 5 Q u a n t i t a t i v e f i l m d e t e c t i o n o f ' H a n d " 4 C i n p o l y a c r y l a m i d e g e l s

b y f l u o r o g r a p h y . E u r J B i o c h e m 5 6 : 3 3 5 - 3 4 11 6 . L E E KH, RA J O N E s , A D A L B Y , CY T S A I 1 9 7 6 G e n e t i c r e g u l a t i o n o f s t o r a g e p r o t e i n c o n t e n t i nm a i z e e n d o sp e r m. B i o c h e m G e n e t 1 4 : 6 4 1 - 6 5 0

1 7 . L E O N A R D R T , D H A N S E N , TK H O D G E S 1 9 7 3 M e m b r a n e - b o u n d a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t a s ea c t i v i t i e s o f o a t r o o t s . P l a n t P h y s i o l 5 1 : 7 4 9 - 7 5 41 8 . M A R C U K , B DUDOCK 1 9 7 4 C h a r a c t e r i z a t i o n o f a h i g h l y e f f i c i e n t p r o t e i n s y n t h e s i z i n g s y s t e md e r i v e d f r o m c o m m e r c i a l w h e a t g e r m . N u c l e i c A c i d s R e s 1 : 1 3 8 5 - 1 3 9 71 9 . MORTON R K , BA P A L K , JK R A I S O N 1 9 6 4 I n t r a c e l u l a r c o m p o n e n t s a s s o c i a t e d w i t h p r o t e i ns y n t h e s i s i n d e v e l o p i n g w h e a t e n d o s p e r m . B i o c h e m J 9 1 : 5 2 2 - 5 2 82 0 . MORTON R K , JK R A I S O N 1 9 6 4 T h e s e p a r a t e i n c o r p o r a t i o n o f a m i n o a c i d s i n t o s t o r a g e a n ds o l u b l e p r o t e i n s c a t a l y s e d b y t w o i n d e p e n d e n t s y s t e m s i s o l a t e d f r o m d e v e l o p i n g w h e a t

e n d o s p e r m . B i o c h e m J 9 1 : 5 2 8 - 5 3 92 1 . P A L A D E G 1 9 7 5 I n t r a c e l l u l a r a s p e c t s o f t h e p r o c e s s o f p r o t e i n s y n t h e s i s . S c i e n c e 1 8 9 : 3 4 7 - 3 5 82 2 . P O R T E R K R , RD MACHADO 1 9 6 0 S t u d i e s on t h e e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m . I V . I t s f o r m a n dd i s t r i b u t i o n d u r i n g m i t o s i s i n c e l l s o f o n i o n r o o t t i p . J B i o p h y s B i o c h e m C y t o l 7 : 1 6 7 - 1 8 02 3 . RAY PM 1 9 7 7 A u x i n - b i n d i n g s i t e s o f m a i z e c o l e o p t i l e s a r e l o c a l i z e d o n m e m b r a n e s o fe n d o p l a s m i c r e t i c u l u m . P l a n t P h y s i o l 5 9 : 5 9 4 - 5 9 92 4 . S A N G E R F , GM A I R , BG B A R R E L L , NL B R O W N , AR C A U L S O N, J C F I D D E S , CA H U T C H I S O N I I I ,P M S L O C O M B E , M S M I T H 1 9 7 7 N uc le o t id e s e q u en c e o f b a c t e r i o p h a g e - O X 1 7 4 DNA. N a t u r e2 6 5 : 6 8 7 - 6 9 52 5 . S H O R E G C , JR T A T A 1 9 7 7 F u n c t i o n s f o r p o l y r i b o s o m e - m e m b r a n e i n t e r a c t i o n s i n p r o t e i ns y n t h e s i s . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 4 7 2 : 1 9 7 - 2 3 62 6 . S M I T H L 1 9 5 5 S p e c t r o p h o t o m e t r i c a s s a y o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e . M e t h o d s B i o c h e m A n a l 2 :4 2 7 - 4 3 4

2 7 . WALK R A , B HOCK 1 9 7 7 G l y o x y s o m a l m a l a t e d e h y d r o g e n a s e o f w a t e r m e l o n c o t y l e d o n s : d en o v o s y n t h e s i s o n c y t o p l a s m i c r i b o s o m e s . P l a n t a 1 3 4 : 2 7 7 - 2 8 5

Synthesis and Deposition of Zein in Protein Bodies of Maize

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