Super‐Resolution Microscopy and its Applications in Fast and Complex Biological SystemsManasa V. Gudheti, Ph.D., Applications Scientist

Outline

• Introduction to Super‐Resolution Microscopy• Single Molecule Localization (SML)• Vutara 350  Design & Features• Biological Applications

Evolution of Super Resolution Microscopy

Z

X

100 nm

Resolutionxy‐20 nm; z‐50 nm

Single molecule Localization (SML)

Confocal                        SIM                        STED

250 nm

Principle of Single Molecule Localization (SML)

Principle of Single Molecule Localization (SML)

Images are captured from two focal planes simultaneously on the Vutara microscope

Super resolutionConventional

Alexa 647 labeled microtubules in a BSC1 cell

Comparison

2 um

Vutara 350: Video Rate Super‐Resolution Microscope

• Fastest 3D super‐resolution microscope on the market• Only 3D video‐rate super‐resolution microscope• Precise 3D super‐resolution (SML) : 20nm (x,y) & 50nm (z)• Designed by scientists for biologists • Easy to use, yet powerful software• Loaded with innovative and cutting edge features

• ResEnhanced Technology• 3D w/ Biplane• Quadfield• Parallel Processing

Innovative Design

Vutara 350

sCMOS

ResEnhanced

Pixel Specific Noise

ResEnhanced Technology for sCMOS

Adapted from Huang et al. Nat. Meth. 10, 653‐658 (2013)

Adapted from Juette et al. Nat. Methods. 5, 527‐529 (2008)

1

405

488

561

640

750*2

Vutara Laser Launch

EMCCD sCMOS

Lens

Beam splittermirror

Dichroic

*750 on Vutara 350 Video Rate Super‐Resolution Microscope

Cutting Edge 3D

x

z

camera camera

plane 2plane 1

0 nm

+125 nm

+250nm

‐125nm

‐250nm

1 µm

Joerg Bewersdorf

Biplane Approach

Biplane Offers Superior Localization Over Astigmatism

Average localization precision (sigma) vs background (beta) comparison for x,y,z (a,b,c) for N=6,000 (top panel) and N= 1,000 photons (bottom panel) for all signal to background levels the biplane shows superior results. (Adapted from Badierireostami et al. Applied Physics Letters 97, 161103 (2010))

Quadfield

Detector

Color1

Color2

Customized:• 2 Colors / 2 Planes• 4 colors

Vutara SRX Software

• Software uses parallel processing• GPU + Multi‐threaded CPU• Fast real‐time localization with acquisition• Advanced 3D visualization• Measured point spread function• Integrated drift correction• Open source data export

750

750 nm laser

Even illumination

3D particle tracking

Ease of use Multi‐color Custom design

Speed Live‐cell High power lasers

Vutara 350 Cutting Edge Features

Speed

800fps 800fps 2500fps

Alexafluor‐647 labeled alpha‐tubulin (Red) and Cy3B labeled TOM20 (Green)in BSC1 cells

Speed Comparison

Betzig2006

2 hr‐12 hr

20 min

SRsystems

Vutara200

Vutara350

1‐15 sec10 min

Faster Imaging:1. More accurate data

• Lower drift• Better colocalization

2. Higher throughput• More experiments in less time

Betzig et al. Science. 313, 1642‐1645 (2006)

Live‐cell Imaging

• Biological System: Live HeLa Cell• Label: mEos3.2‐clathrin light chain• Imaged at 600 fps  for 58 s• 2 seconds per SR image

Adapted from Huang et al. Nat. Meth. 10, 653‐658 (2013)

Live‐cell Fast Imaging using Organic Dyes

• Biological System: LiveEA.Hy926 Cell• Label: AlexaFluor 647 labeled transferrin• Imaged at 1600 fps • Super‐resolution images were reconstructed 

from sequential sets of 50 frames  (31‐ms acquisition time or 32 super‐resolution images per second )

Adapted from Huang et al. Nat. Meth. 2013

Adapted from Huang et al. Nat. Meth. 10, 653‐658 (2013)

Live Cell Imaging of BSC1 cells Labeled with AF647 Transferrin

Plane 1 Plane 2

Model: Live A431 CellsLabel: QDot655‐EGFRSpeed: 50 frames/s

3D Particle Tracking

Model: Live BSC1 cellsLabel: Cy3B labeled mRNA Speed: 200 frames/s

Membrane TargetIntracellular Target

High Power Lasers

Jones et al. Nat. Meth. 8, 499‐505  (2011)

405

488

561

640

750

488 – 1000mw561 – 1000mw640 – 1000mw750 – 1000mw

750 nm Excitation

Biological System:  BSC1 cellsGreen: AF647 TOM20 mitochondriaRed: AF750 Tubulin

Vutara’s Edge to Edge Illumination

Good data region

Bad data region Whole region of interest is usable

Image from Vutara Image from other SML scope

Ease of Use‐System Demo

Multi‐color Imaging

Biological System: Vero CellGreen: Cy3B TOM20 mitochondriaRed: AF647 Tubulin

Biological System: Vero CellGreen: Cage fluorescent dye 505clathrinRed:  Rhodamine spiroamide 565tubulin

Biological System:  BSC1 cellsGreen: AF647 TOM20 mitochondriaRed: AF750 Tubulin

*750 on  Vutara 350 Video Rate Super‐Resolution Microscope

Biological Applications

Infectious Diseases Reproduction

Developmental Biology Cell Biology and Cancer Neuroscience

Cardiology

Coverslip

Biological System: E.ColiTarget: Outer MembraneDye: Cy5

Color coded for depth

Courtesy of Dr. Tomasz Zal – MD Anderson Cancer Center, Texas

Single E. Coli standing on coverslip

3D  Image with Single Z Plane Acquisition

Biological System:  hRSVGreen: Cy3B RNA antisense probeRed: Alexa 647 F‐protein

Human Respiratory Syncytial Virus (hRSV)

Alonas  et al. ACS Nano 8, 302‐315 (2014)

Biological System:  Canine cardiomyocyteRed:  Alexa 647 alpha‐actinin

Imaging in Cardiomyocytes

Lichter et al. Journal  of Cellular and Molecular Cardiology 72, 186‐195 (2014)

3D Super‐Resolution z‐stack in Mouse Spermatocyte

AF 647 labeled synaptonemal complex protein 3 (SYCP3)

Sample courtesy of Mark Lessard, The Jackson Laboratory

3.2 µm 600 nm

Z slice

3D Super‐Resolution Accuracy and Validation

Biological System: DrosophilaGreen: Alexa 488 Frizzled ReceptorRed: DyLight 649 Lamin C

Developmental Biology‐Thick Samples

Images courtesy of Dr. Chris German, University of Utah

Biological System: 30 µm Striatal Rat Brain SlicesGreen: Cy3B SNAP‐25Red: Alexa 647 Vesicular Monoamine Transporter‐2 (VMAT2) 

Super‐Resolution Imaging in TissueSaline

Drug

‐Treated

Multi‐color Imaging in Cell Biology

Biological System: Cos 7 CellGreen: Alexa 568 Complex IVRed: Alexa 647 TOM 20

Image courtesy of Dr. Cliff Guy, St. Judes

Biological System: HeLa cellGreen: ATTO 488 tubulinRed: Alexa 647 midbody proteinBlue: Cy3B midbody protein

Biological System: HeLa cellGreen: Alexa 488 tubulinRed: Alexa 647 midbody protein

Multi‐color Imaging in Neurons

Images courtesy of Andrew Taibi,    Dr. Jason Shepherd, University of 

Utah 

Biological System:  Rat Cortical NeuronsGreen:  Alexa 488 MAP2 (dendritic/axonal marker)Magenta:  alexa555 Arc (postsynaptic ‐associates with endocytic  machinery to get rid of surface AMPA Receptors)Cyan:  Alexa 647 GluR1 (live and surface labeled only)

Biological System: Vero CellGreen: Cage fluorescent dye 505clathrinRed:  Rhodamine spiroamide 565tubulin

Imaging without Switching Buffer

Summary

• Enhanced Resolution: x,y‐20 nm, z‐50 nm• Speed: enables live cell imaging• Versatility: various biological applications• Ease of use: results

www.bruker.com