1

UNIVERSITEdeTOURSFACULTEDESSCIENCESETTECHNIQUES

TOURS

LicenceL1SciencesdelaVie

MentionSciencesduVivant

TRAVAUXPRATIQUESdeBIOCHIMIESTRUCTURALE

Spectrophotométrieappliquéeauxbiomolécules

NB:BLOUSEOBLIGATOIREpourentrerensalledeT.P.

Matérielsindispensables:Calculatrice+marqueurindélébile

SALLES070(sous-solbâtL)

2

Utilisationdesmicropipettes

Les3micropipetteslespluscourantesenlaboratoire:

Micropipette volumespossiblesàprélever

P1000 100-1000µl

P200 20-200µl

P20 2-20µl

Commentpipeter:

1)Réglerlapipetteauvolumedésiré

2)Mettreuncône

3)Préleverleliquide 4)transférerleliquide

Illustrationsextraitesdehttp://bioutils.unige.ch/experiences/info_pipettes.php

3

61

2. Spectrophotométrie moléculaire appliquée aux biomolécules

� Spectrophotométrie d’absorption UV-vis

� Fluorimétrie

� Spectroscopie infrarouge

62

2.1 Principes de la spectrophotométrie d’absorption UV-vis

� La spectrophotométrie d’absorption consiste à mesurer l’atténuation de la lumière traversant un milieu pour en tirer les concentrations dessubstances absorbantes (chromophores).

� Longueurs d’onde balayées: ~200 à 800 nm (UV-vis)

Intensité de la lumière

incidente

Io (�)

Intensité de la lumière

transmise

I (�)

échantillon

bE0

E1

E2

Éne

rgie 1er état

excité

2è état excité

h�

h�

état initial

Niveaux d’énergie plus élevée

63

Schéma d’un spectrophotomètre UV/vis à double faisceau

A

��(nm)

�max

400 700

Spectre absorption: A = f(�)

(www.chez.com/dalmeyda/cours/spectro/UV-spectro.htm)

64

Loi de Beer-Lambert

� Loi de Beer-Lambert:

� Si c est exprimée en concentration molaire, � est l’absorptivité molaire (en M-1cm-1).

� Si c est exprimée en mg/mL, � est l’absorptivité massique(en mL/(mg·cm)).

bcII

A o )()()(

log)( �����

��A (�max)

c (mol/L)0

Ainconnu

cinconnu

Courbe d’étalonnage

I. INTRODUCTION

Principedelaspectrophotométrie

La spectrophotométrie est uneméthode analytique quantitative, rapide et non dénaturante, quipermetdemesurerl'absorbance(A)d'unesubstancechimiquedonnéeensolution.L'absorbancedesolutionsestdéterminéeparunspectrophotomètrepréalablementétalonnésurlalongueurd'onde(λ)del'espèceàétudier.

La spectrophotométrie consiste à mesurer la lumière traversant un milieu contenant une ouplusieurs substances absorbantes (chromophores). Lorsqu'un faisceau d'intensité Io traverse unesolutioncontenantunesubstancedissoute (échantillon) ilestpartiellementabsorbéet le faisceauémergeantIpossèdeuneintensitéinférieure.PluslasubstanceabsorbanteestconcentréepluselleabsorbelalumièredansleslimitesdeproportionnalitéénoncéesparlaloideBeer-Lambert.

REMARQUE:Lavaleuraffichéeparlespectrophotomètreestl'absorbance(A)àlalongueurd'onde

étudiée (λ). A est une valeur sans unité. La spectrophotométrie UV-visible emploie le spectre

comprisentre200et800nm.

Application

La spectrophotométrie est utilisée dans beaucoup de domaines: chimie, pharmacie,environnement,agroalimentaire,biologieetc.,aussibienaulaboratoirequesursiteindustriel.

Exemples d'applications: Dosage (détermination d'une concentration inconnue d'une substancechimique),suividelacinétiqued'uneréactionchimique,analysesstructurales(spectresUV),etc.Dans l’analysedesprotéines, ilestsoitnécessaired’identifier les fractionscontenantdesprotéines(ex:présenced'acidesaminésaromatiques:Phe, Tyret Trp)oudedéterminer la concentrationdeprotéinesdansunéchantillonpurifié.

l ε(λ) = coefficientd'extinctionmolaire

dusoluté(M-1.cm-1)ou(mol-1.L.cm-1)

l =longueurdutrajetparcouruparlalumièredanslasolution(cm)

c=concentrationdusoluté(Moumol.L-1)

ε.l.c

4

II. PARTIEEXPERIMENTALE

1. Préparationd'untamponphosphatedesodium0,1M,pH7,4

EnBiologie,l’étudedesprotéinesnécessitedetravaillerdansunmilieutamponnéafindeminimiserlesvariationsdepH.Pour lesmêmesraisons, lesmesuresd’activitéenzymatiquese fontenmilieutamponné,àunpHcorrespondantaumaximumdel’activitédel’enzymeétudiée.

Un des systèmes tampon les plus utilisés dans les laboratoires de recherche est le systèmephosphateparcequ’ilpermetd’obtenirdesconditionsprochesdesconditionsphysiologiques(forceioniqueetpH).

Au cours de la première partie de la séance de TP, vous préparerez un tampon phosphate desodium 0,1 M, pH 7,4, à partir d’une solution d’acide faible (NaH2PO4, 0,1 M) et de sa baseconjuguée(Na2HPO4,0,1M).

2. Déterminationdelaconcentrationd’uneprotéineensolution

La concentration d’une protéine dans un échantillon inconnu peut être déterminée à partir de savaleurdeε(danslarégiondelinéaritédelaloiBeer-Lambert)ouàpartird'unecourbed’étalonnagepréparéeavecdeséchantillonscontenantdifférentesconcentrationsdelaprotéineenquestion.

AucoursdeladeuxièmepartieduTP,vouscalculerezlaconcentrationdevotreprotéinepurifiée,aprèsavoirdéterminésoncoefficientd’extinctionmolaire.

III. MANIPULATIONS

1. Préparationd'untamponphosphatedesodium0,1M,pH7,4(Volumefinal=50mL)

- MesurerlepHdesdeuxsolutionsNaH2PO4(0,1M)etNa2HPO4(0,1M).- Lasolutionbasique(40mL)estplacéedansunbéchercontenantunbarreauaimanté.L’autresolution(NaH2PO4,0,1M)vaserviràajusterlepH.- Placer lebécher sur l’agitateurmagnétiqueaupostepH-mètre.Avec la solutionacideet àl’aidedelapipetteP1000,ajusterd’abordjusqu’àpH8,puisaveclaP200jusqu’àpH7,4.

2. Déterminationdelaconcentrationenprotéined'unéchantillonparspectrophotométrie

*Préparationdelagammed'étalonnage

Vousdisposezd'untamponphosphatedesodium0,1M,pH7,4(prêtàl'emploi)etd’unesolutiondeprotéinenotéeHouA,correspondantàl'unedes2protéinessuivantesdeconcentrationconnue:

Hémoglobine(H)d’érythrocytesbovins:solutionà1,5mg/mL,MM=67000g/mole(67kDa)

Albumine(A)sériquebovine:solutionà10mg/mL,MM=69000g/mole(69kDa)

5

A l’aide des pipettes, P1000 et P200, distribuer, comme indiqué dans le tableau ci-dessous, lesvolumesdetamponphosphateà0,1M,pH7,4,dans7tubesàhémolyseidentifiésde1à7.

Ajoutezensuitelesvolumesnécessairesdesolutiondeprotéinepréalablementhomogénéisée.

N°tube 1 2 3 4 5 6 7

Solutiontampon(µL) 1000 950 900 850 800 750 700

Solutiondeprotéine(HouA)(µL) 0 50 100 150 200 250 300

Lorsquelagammepourlacourbed'étalonnageestprête,veillezàbienagiterlestubesauvortex.

*Préparationdel’échantillondeconcentrationinconnue

Vous disposez également d’une solution de votre protéine (échantillon) à une concentrationinconnue,notée:(H1,H2,H3,H4,H5ouH6)ou(A1,A2,A3,A4,A5ouA6).

A l’aide des pipettes, P1000 et P200, distribuez, comme indiqué dans le tableau ci-dessous, lesvolumesdetamponphosphateà0,1M,pH7,4,dans3tubesàhémolyseidentifiésdeE1àE3.

Ajoutezensuitelesvolumesnécessairesd’échantillon(protéinedeconcentrationinconnue).

N°tube E1 E2 E3Solutiontampon(µL) 925 875 775

Echantillon(µL) 75 125 225

Lorsquelesdilutionssontprêtes,veillezàbienagiterlestubesauvortex.

1. Fairelespectred’absorptiondel’échantillon

Aupréalable,effectuez(enprésenceduresponsabledelaséancedeTP)lacalibrationdelalignedebaseduspectrophotomètreaveclasolutiontamponuniquementdansunecuvette(volumefinal=1mL).Mettezdansl'autrecuvettevotreéchantillonE2etfairesonspectred'absorptionentre250et500nm.Choisissezlalongueurd'ondecorrespondantaumaximumd'absorbanceetàlaquellevousréaliserezensuitelesmesuresd'absorbance.

2. Mesuredel’absorbancedevosdifférentessolutions

Mesurerl’absorbanceàlalongueurd’ondeadéquate:

-devotregammedesolutionsétalon(tubes1-7)

-del’échantillondeconcentrationinconnue(E1,E2etE3)

3. Calculdelaconcentrationdevotreéchantillon

Calculer la concentration molaire et massique des solutions étalon (tubes 1-7) et de votreéchantillon.

6

IV.COMPTE-RENDU

N’oublierpasd’indiqueravecquelleprotéinevousaveztravaillé.

- Expliquer,defaçonconcise, lebutdeceTPet leprincipede ladéterminationde la

concentrationenprotéined’unesolutionparspectrophotométrie.

- Identifier à quel spectre d'absorption de protéine (X ou Y) correspond votre

échantillon(HémoglobineouAlbumine).

- Remplirletableaudel’absorbance(enindiquantàquellelongueurvoustravaillez)en

fonctiondelaconcentrationmolaireenprotéinedelagammed’étalonnage.

- Tracersurpapiermillimétréladroited’étalonnagedel’absorbance=f(concentration

molaire).Calculergraphiquementlaconcentrationmolaire,massiqueainsiquelecoefficient

d’extinctionmolaire:ε(λ)devotreprotéine.

- Détaillervoscalculs.

-Exerciced'application:voirleCR