SOLUII MODERNE DE ANALIZ A MICROURMELOR N CHIMIA JUDICIAR

SOLUII MODERNE DE ANALIZ

A MICROURMELOR N CHIMIA JUDICIAR

cms. drd. ing. chim. MARIA GEORGETA STOIAN

insp. pr. drd. ing. chim. Galan Elena

I.G.P.R. Institutul de Criminalistic

ABSTRACT

The continuous improvement of equipments and analytical methods in chemistry field have positive influence on specific criminalistic activities, and allows the experts and specialists to exceed clasical area, analysing permanently the recent discoveries and adapt them for forensic chemistry field.

Recent years have seen the development of powerful technologies that have provided forensic scientists with new analytical capabilities, which were unimaginable few years ago. Gas chromatography coupled with mass spectrometry (GC-MS), liquid chromatography with mass spectrometry (LC-MS), inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS), scanning electron microscopy combined with X-ray fluorescence (SEM-EDS) have become invaluable tools to enable detection and characterization of minute quantities of analytes in very complex matrices.In this paper, the remarkable performance and advantages of liquid chromatography with mass spectrometry (LC-MS) and thermal desorbtion combined with gas chromatography/mass spectrometry will be presented. These new techniques can extend the area of forensic expertises regarding to both compound analysis and the level of detection.

These techniques may solve the identification, quantification and confirmation problems often encountered in case of volatiles and semivolatiles compounds or in case of non-volatile, labile and high molecular weight compounds, that cannot be analyzed by other methods or they have been analyzed with difficulties. They can be applied in various branches of forensic analyses: toxicology, biological and chemical warfare agents analysis, arson analysis, dyes, explosives and gunshot residue analysis.

Rezultatul final al muncii unui chimist judiciar, raportul de expertiz criminalistic, influeneaz ntotdeauna n mod direct destinul unor anumite persoane. Aceasta este o responsabilitate foarte important, care determin modul de gndire i de aciune n chimia judiciar, precum i n celelalte domenii ale tiinei criminalistice. De aceea, metodele aplicate n laboratoarele criminalistice trebuie s asigure un nivel foarte nalt de ncredere i trebuie s fie supuse unor programe de control al calitii extensive i riguroase. n acest sens, expertul criminalist trebuie s utilizeze metode tiinifice adecvate n examinarea cu minuiozitate a faptelor n cauze penale, civile, etc.

Capacitatea spectrometriei de mas de a extrage amprente chimice de la nivel microscopic al analitului are o valoare inestimabil n aceast examinare a faptelor, permind identificarea i cuantificarea legal a unui spectru larg de compui.

n ultimii ani, prin evoluia extrem de rapid a tiinei au fost dezvoltate noi tehnologii, foarte puternice i performante care furnizeaz experilor criminaliti capabiliti analitice inimaginabile n urm cu civa ani: cromatografia gazoas cu spectrometrie de mas (GC-MS), cromatografia lichid cuplat cu spectrometrie de mas (LC-MS), spectrometria de mas cu plasma cuplat inductiv (ICP-MS), microscopia electronic cu baleiaj. Aceste noi tehnici de analiz se fac utile n special n analiza unor cantiti infime de analii nglobai n majoritatea cazurilor n matrici complexe, dificil sau aproape imposibil de soluionat pn acum.

n aceast comunicare vom prezenta performanele deosebite i avantajele a dou tehnici n abordarea cazuisticii ntlnite n laboratoarele de chimie judiciar: lichid cromatografia cuplat cu spectrometria de mas i desorbia termic aplicat gazcromatografiei cuplate cu spectrometria de mas. Aceste noi tehnici permit extinderea spectrului expertizelor criminalistice, att n ceea ce privete compuii analizai, ct i nivelul pn la care acetia pot fi detectai; prin plusul de sensibilitate pe care aceste metode l aduc, permit analiza microurmelor, contribuind astfel la mrirea ncrederii n rezultatele expertizelor criminalistice i la oferirea unor rspunsuri adecvate i rapide adaptate necesitii procesului de investigare penal. Lichidcromatografia cuplat cu spectrometria de mas (LC-MS) poate soluiona probleme de identificare, cuantificare i confirmare n cazul compuilor non-volatili, a compuilor instabili termic sau a celor foarte polari ori cu mase moleculare mari, care nu pot fi analizai sau sunt analizai cu dificultate prin alte metode. n cadrul chimiei judiciare, exist muli compui care prezint una sau mai multe dintre aceste caracteristici i pentru a cror analiz LC-MS reprezint soluia ideal, i anume compui din categoria medicamentelor, drogurilor i metaboliilor n fluidele biologice, agenilor chimici (gaze toxice de lupt) i biologici (bacterii, virusuri, toxine proteice), din categoria explozivilor, coloranilor din fibrele textile i din materialele scripturale, din categoria reziduurilor organice rezultate n urma tragerilor cu arme de foc.

Desorbia termic (TD) este o tehnic de extracie n faz gazoas indicat pentru analiza compuilor volatili i semivolatili n urme (sunt necesare probe de numai 50-100 mg, sau respective 5-10 ul). n expertiza criminalistic desorbia termic poate fi utilizat cu succes pentru analiza a diverse urme materie, att n stare solid: pulberi (droguri, cafea, pudr de cacao), fibre textile, fragmente de vopsea, de piele, fragmente de materiale plastice etc., ct i n stare lichid: solveni, uleiuri, sucuri, ampon etc. sau sub form de rini, creme, substane grase.

n timpul procesului de desorbie, probele de analizat sunt nclzite sub un curent de gaz inert (gaz purttor) astfel nct analiii sunt transferai de pe suportul adsorbant sau din matrice direct n portul de injecie al gazcromatografului i ulterior spre detector (FID sau MS). Tehnologia de desorbie termic este extrem de versatil, sensibil i rapid comparativ cu sistemele de extracie n faz lichid. Cele mai importante avantaje aduse de metoda de desorbie termic sunt: mrirea limitei de detecie de 1000 ori; eliminarea etapei de preparare a probelor; eliminarea interferenelor cu solventul de extracie; selectivitatea extraciei compuilor de interes; creterea randamentului de extracie, desorbia fiind un proces cu o eficien mai mare de 99%. Produii volatili pot fi transferai n portul de injecie al GC fie ntr-o singur etap de desorbie, fie dup un prealabil proces de concentrare la un volum ct mai mic posibil i numai dup aceea transferai prin coloan, spre analizor. Concentrarea compuilor desorbii se poate face fie prin rcirea capilarelor de conexiune cu azot lichid - un procedeu costisitor, care poate fi nsoit de blocarea sistemului n timpul desorbiei probelor umede, fie, mai eficient, prin concentrarea vaporilor pe o trap adsorbant, rcit electric, urmat apoi de desorbia acestora prin nclzirea rapid a trapei n curent invers de gaz purttor. Astfel, se poate obine un factor de concentrare de pn la 106.

Aportul deosebit de important adus de aceste dou tehnici n finalizarea ideii de adevr deriv din profunzimea i acurateea examinrilor probelor n diverse domenii de expertiz criminalistic:

Toxicologie

n cazul abuzului de medicamente sau a consumului de droguri, n mod tradiional n laboratoarele de chimie judiciar este utilizat pentru confirmare tehnica GC-MS. n multe situaii aceast metod necesit o preparare mai laborioas, n care extracia n faz solid (SPE) i derivatizarea sunt inevitabile. Prin LC-MS, compuii non-volatili pot fi determinai utiliznd o tehnic de preparare mult mai simpl: extracie ntr-o singur etap fr hidroliz sau derivatizare, cu o sensibilitate cel puin identic cu cea a GC-MS-ului. Prin LC-MS (sau LC-MS-MS) se pot analiza majoritatea drogurilor: cocaina, derivai ai opiului, amfetamine, canabinoizi, halucinogene, benzodiazepine.

LC-MS face posibil analiza metaboliilor polari ai drogurilor i medicamentelor, analiz care pn acum reprezenta un exerciiu extrem de dificil prin utilizarea tehnicii GC-MS, aducnd informaii suplimentare i o interpretare complet a rezultatelor analitice. n plus, n situaiile n care colectarea i analiza specimenelor biologice are loc dup cteva ore (zile) dup administrarea drogului, doar metaboliii acestuia mai pot fi detectai. Recent, Boguzs i colaboratorii au elaborat o metod de analiz simultan a diacetilmorfinei, morfinei i 6-acetilcodeinei i a metaboliilor lor (monoacetilmorfin, glucuronidele morfinei, codeina), metod care permite diferenierea ntre heroina prescris i cea neprescris.

n mod curent pentru detecia drogurilor sunt investigate matricile biologice pe baz de plasm i urin. n ultimii ani un interes crescnd l prezint analiza fluidelor orale, o alternativ mai puin invaziv i mai atractiv din punctul de vedere al colectrii rapide a probelor fr utilizrea unui echipament special. ns, n acest caz, deoarece volumul fluidelor orale este limitat, este necesar o metoda foarte sensibil de analiz. Wood i colaboratorii au validat o metod de analiz cantitativ simultan a MDMA, MDA, MDEA, amfetamin, etamfetamin, efedrin, analiz care necesit doar 50 (L plasm sau fluid oral pentru a atinge o limit de detecie LOD de 2 (g/L (Fig.1).

n cazul unor instrumente al cror spectrometru de mas deine analizoare de tip cuadrupol Q i cu msurarea timpului de zbor (TOF), care au posibilitatea realizrii de fragmentri repetate, precizia determinrilor este foarte mare. n timpul unui analize, cuadrupolul este setat s transmit iniial toate masele pn cnd ionii ating un anumit nivel. Instrumentul trece apoi automat n modul MS-MS, n care ionii selectai sunt fragmentai, iar fragmentele rezultate sunt analizate ulterior de ctre analizorul de tip TOF (Fig.2).

Fig.1 Cromatogramele unor amfetamine n fluid oral la o concentraie de 5 (g/l. Intensitatea picului este indicat n colul din stnga sus al fiecrei cromatograme.Fig.2 (a) Cocaina n modul MS, (b) Ion specific cu masa 304 al cocainei, (c) Spectrul MS al cocainei, (d) Spectrul MS MS al cocainei

Pe de alt parte, dei prezint o volatilitate sczut, anumite droguri i precursorii lor pot fi detectai i n faz de vapori, prin prelevarea unor probe de aer din apropierea fabricilor de medicamente sau din containere suspecte. Probele sunt colectate pe tuburi de adsorbie i analizate prin desorbie termic cuplat cu GC-MS. Analiza prin TD-GS permite i analiza prin desorbie termic direct a unor probe "reale", cum ar fi diverse pulberi ridicate de la locul faptei de ctre criminaliti (Fig.3). Ele sunt transferate direct n tuburile de desorbie i nclzite la temperaturi moderate pentru a evita descompunerea compuilor de interes.

Fig.3 Desorbia direct a unei pulberi: Amestec de cocain i heroin - impure

Ageni chimici i biologici

Substanele toxice de lupt (SARIN (GB), TABUN (GA), SOMAN (GD), VX, RVX) sunt compui chimici extrem de toxici, care pot provoca pierderi mari de viei omeneti ntr-un interval redus de timp. Au fost folosite n mai multe conflicte militare i ncepnd din anul 1995 i mpotriva populaiei civile de ctre organizaii teroriste. Agentul neuroleptic sarin (GB) a fost utilizat n atacul terorist din metroul din Tokio, nanul1995, producnd rnirea grav a mai mult de 5000 de persoane. Toxicitatea lor impune monitorizarea continu a depozitelor sau a instalaiilor de distrugere a acestora pentru protecia personalului militar/operaional sau pentru aprarea zonelor civile mpotriva atacurilor teroriste.Astfel, n cazul incidentelor chimice este necesar monitorizarea locaiei n vederea identificrii agentului chimic astfel nct s se poat lua msuri rapide pentru decontaminarea zonei. Se tie c toxicitatea agenilor neurotoxici de lupt este foarte mare, chiar la concentraii joase. Limita admis pentru VX de exemplu este de 0,001 (gm-3(~ 0.1ppt), limita de expunere n zone publice fiind de 0,0006 (gm-3. Aceste concentraii sunt att de mici nct sistemele analitice convenionale precum GC i GC-MS nu le pot detecta cu certitudine. n schimb, tehnica de analiz bazat pe desorbie termic combinat cu spectrometrie de mas permite analiza substanelor toxice de lupt n form liber (nederivatizat), la nivel de microurme (sub ppt). Pentru situaii de securitate se pot utiliza instrumente de monitorizare on-line alctuite dintr-un sistem de prelevare continu a probelor, conectat la un dispozitiv de desorbie termic cuplat cu un GC-MS. n acest caz, se folosesc dou trape de desorbie care acioneaz reciproc, astfel nct prelevarea s se produc pe un canal, iar desorbia i analiza pe cellalt.

Analiza unor probe de aer n vederea punerii n eviden a agenilor chimici de lupt este uneori dificil de realizat la nivel de microurme datorit prezenei altor vapori organici (hidrocarburi, solveni). Unul dintre cei mai dificil de analizat din categoria gazelor toxice de lupt este agentul neurotoxic VX, care are o presiune de vapori sczut, punct de fierbere ridicat i este foarte reactiv, reacionnd foarte uor cu orice zon activ de pe traseul parcurs. n mod curent este analizat prin GC-MS, dup derivatizare la analogul mai stabil "G". ns prin utilizarea desorbiei termice se pot observa cantiti reduse de VX, de pn la 9 pg. (Fig.4,5). Fig.4 Curba de calibrare pentru VX Fig.5 VX la o concentraie de 9 pg ntre 9 pg i 1,5 ng (cu TD)

Pe de alt parte, agenii neuoroleptici pot fii prin analizai i prin LC-MS, care permite o identificare mai sigur a acestora prin achiziia ionului molecular.

Organizaiile teroriste arat de asemenea un interes deosebit n utilizarea armelor biologice, deoarece acestea sunt fabricate cu costuri minime, sunt dificil de de monitorizat i pot produce moartea sau vtmarea unui numr mare de persoane. Pe lng identificarea viruilor i a bacteriilor, identificarea toxinelor proteice a devenit tot mai important. Prin utilizarea biomarkerilor proteici, toate cele trei clase de ageni de origine biologic (bacterii, virui, toxine proteice) pot fi detectai prin LC-MS, pe baza identificrii proteinelor sau peptidelor. Probele sunt supuse ultrasonrii pentru a elibera celulele proteice, sunt filtrate i apoi sunt injectate ntr-o succesiune de coloane capilare: o coloan schimbtoare de ioni pentru concentrarea proteinelor, una de enzim imobilizat pentru digestia proteinelor, o precoloan cu faz invers pentru concentrarea proteinelor, i o coloan capilar pentru maparea peptidelor. Biomarkerii proteici sunt detectai ntr-un spectrometru de mas cu trap ionic. Aceasta este o metod rapid i foarte sensibil de detecie, care permite o vitez de reacie rapid n cazul unui dezastru biologic.

Analiza produselor de iniiere a incendiilor

n general, decelarea n micromatrice a primerilor care prin specificitate definesc natura i tipul de produs petrolier utilizat la incendiere reprezint o problem, deoarece cantitatea de primer care rmne dup producerea incendiului este foarte redus. De aceea, pentru analiz sunt necesare tehnici foarte sensibile n vederea evidenierii acestora. Pentru aceasta, se colecteaz probe din reziduurile rmase n urma incendiului n recipieni de aluminiu sau n pungi speciale de nylon. Pentru prepararea probelor exist mai multe modaliti:

- se purjeaz recipientul cu un gaz inert i se colecteaz volatilele purjate pe un material adsorbant solid. Volatilele adsorbite sunt eluate cu un solvent organic (de ex. sulfur de carbon) sau sunt desorbite termic direct n portul de injecie al GC-MS;

- punga i coninutul ei este uor nclzite i cu ajutorul unei seringi pentru gaze se msoar un volum care se transfer n tubul de desorbie, pentru a fi analizat direct prin TD-GC-MS;

Captare: pe Tenax TA, mesh 60/80,

50 mg., 3 mm I.D. GLT

Purjarea tuburilor de desorbie pentru colectare prob:20mL/min./100(C/10 min.

Parametrii de desorbie:

Timp de desorbie: 4 min.

Temperatura de desorbie: 250(C

Debit de desorbie: 10 mL/min.

Condiii cromatografice:

Coloan GC: 30 m X 0,75 mm sticl SPB-1 (grosime film 1,0 um)

Gaz purttor: Heliu 6 mL/min.

Temp. Cuptor: -10 (C (5 min.); -10 (C - 250 (C (12 (C/min.); 250 (C (10 min.)

Temp. detector (FID): 250 (C Fig.6 Cromatograma unei haine

mbibate cu petrol

- analiza termic direct : probele ca atare, fibre, lemn, materiale de construcii, sunt plasate direct n tubul de prelevare, iar volatilele sunt purjate direct n portul de injecie la GC. Prin acest mod se pot analiza probe cu masa cuprins ntre 1 - 500 mg. Tehnica este foarte sensibil deoarece proba nu se pierde prin preparare sau n timpul colectrii, ntreaga cantitate fiind purjat direct n sistemul de injecie.Colorani

n chimia judiciar analiza coloranilor prezint o deosebit importan n examinarea, mai ales comparativ, a fibrelor textile i a materialelor scripturale. n general, analiza fibrelor textile implic o serie de analize morfologice prin microscopie comparativ, microscopie n lumin polarizat, microspectrofotometrie, analize de compoziie prin spectrometrie FTIR, analiza coloranilor organici prin cromatografie n strat subire, analiza nuanei de culoare n lumin vizibil i prin absorbie n UV. Metodele spectroscopice nu sunt suficiente pentru identificarea fr ambiguitate a coloranilor, deoarece exist colorani care au aceeai culoare, dar au structuri moleculare diferite, identificabile doar prin LC-MS (Fig. 7).

Fig. 7 Colorani cu aceeai culoare, dar cu structuri moleculare diferite

Pn n prezent, analiza microfibrelor dup nuana de culoare era limitat de cantitatea redus de colorant impregnat n microfibra textil. Prin reducerea limitei de detecie LOD, tehnica LC-MS intensific discriminarea fibrelor textile prin compararea la nivel molecular a coloranilor, astfel nct analiza colorantului s fie realizat pe o singur fibr.

Pe de alt parte, caracterizarea materialelor scripturale constitue un element de baz n datarea i compararea documentelor pentru stabilirea autenticitii lor. Materialele scripturale sunt, n general, compuse din colorani, pigmeni, solveni, rini i alte materiale cu caracteristici speciale. Analiza cernelurilor, spre exemplu, se limiteaz n mod curent la compararea profilului coloranilor organici. Totui aceasta nu permite diferenierea ntre cerneluri cu formule similare i nu permite experilor criminaliti s precizeze de ct timp a fost aplicat cerneala pe un document. Pentru a diferenia cernelurile este necesar analiza componenilor necolorai ai acestora i anume: solveni, aditivi, materiale de umplutur. Ei pot fi analizai prin desorbia termic direct a probelor de hrtie, urmat de analiza chimic a compuilor volatili desorbii prin gazcromatografie cu spectrometrie de mas. (Fig.8)

Fig.8 Comparaie ntre o cerneal neagr proaspt (sus) i nvechit (jos), cu albastru hrtie martor fr nscrisuriFig.9 Cromatogramele unui material scriptural (a) la timp t = 0, (b) la timpul t =10 zile dup aplicare pe hrtie. E - etoxietoxietanol, P- 2-fenoxietanol, PE- fenoxietoxietanol

Mai mult, vechimea materialelor scripturale, aplicate pe acelai tip de hrtie, cu acelai material scriptural poate fi investigat cu ajutorul tehnicii LC-MS prin identificarea cantitativ a componentelor cernelurilor i prin investigarea produilor de degradare ai acestora (Fig.9)

Explozivi

Explozivii sunt compui care au o presiune de vapori sczut, ceea ce complic colectarea i analiza acestor materiale n faz de vapori.

Probele de explozivi pot consta att n probe de aer prelevate din dispozitive sau obiecte suspectate c ar transporta explozivi, ct i n particule minuscule ale compuilor de amorsare a armelor de foc. Desorbia termic este o soluie ideal de analiz pentru astfel de probe.

Datorit naturii probelor, trapa de concentrare trebuie setat astfel nct compuii de interes s nu se descompun n timpul procesului analitic. Datorit faptului c explozivii au puncte de fierbere ridicate i sunt labili termic, se folosesc tuburi de adsorbie inerte (sticl sau Silco Steel) avnd ca material adsorbant vat de sticl. Caracteristica acestor tuburi este c elibereaz compuii de interes, fr artefacte sau alte interferene provenite de la matrice. Compoziia unor microparticule suspectate c ar proveni de la materialul de amorsare al unei arme de foc poate fi analizat de asemenea prin desorbie direct dintr-un tub de desorbie tip Silco Steel.

Pe de alt parte, ntruct tipul i originea explozivului sunt dou din cele mai importante ntrebri n cazul investigrii unui atac cu bomb, analiza explozivilor a avansat de la faza identificrii materialului exploziv la individualizarea impuritilor de fabricaie n vederea stabilirii amprentei i a profilului explozivului. Din aceste semnturi unice ale explozivilor, investigatorii pot identifica productorul i ara de origine.

Una dintre metodele moderne care faciliteaz astfel de studii o reprezint lichidcromatografia cuplat cu spectrometria de mas (LC-MS), metod cu ajutorul creia se pot obine informaii de compoziie pentru toate tipurile de explozivi (Fig.10).

Nitroglicerin (NG)Dinitrobenzen (DNB)Dinitrotoluen (DNT)Trinitrotoluen (TNT)Trinitrobenzen (TNB)PETNRDXAminodinitrotoluen (x-A-y,z-DNT)Dinitronaftalin (DNN) Fig.10 Lichidcromatograma unui amestec

complex de explozivi

Reziduurile de tragere

Reziduurile de tragere pot fi gsite att pe pielea sau pe hainele persoanei care a tras, ct i n jurul orificiului de intrare a glonului sau pe alte materiale de la locul faptei i sunt formate dintr-o varietate de substane organice i anorganice.

Reziduurile de tragere de natur anorganic sunt detectate prin absorbie atomic, prin spectrometrie de raze X i n special prin microscopie electronic de baleiaj.

Reziduurile de tragere de natur organic, reprezentate n principal de pulberile fr fum, pot conine fie numai nitroceluloz, fie combinaii de pulberi, precum: nitroceluloz cu nitroglicerin sau nitroceluloz cu nitroglicerin i nitroguanidin. Dup un studiu efectuat de FBI, pulberile fr fum moderne mai pot conine ali 23 de compui care pot fi analizai doar prin LC-MS.

Aadar, perfecionarea continu a metodelor i echipamentelor tehnice din domeniul chimiei influeneaz n mod pozitiv activitile specifice de criminalistic, fapt ce permite specialitilor i experilor din acest domeniu s depeasc sfera clasic prin prelucrarea n mod continuu a noilor descoperiri i adaptarea acestora metodelor i mijloacelor specifice chimiei judiciare.

Bibliografie

1. M.J. Boguzs, J. Cromatogr.B. Biomed.Sci. Appl., 748, 3-19,2000.

2. M. Wood i colaboratorii, J.Anal. Toxicol., 2002.P>A.

3. DAgustino, C.L.Chenier, J.R. Hancock, J. Chromatogr.A, 950, 149-156, 2002.

4. M.R.B. Heramb, Forensic Science Communications, 4, 2002.

5. Joseph A. Crifasi, Michael F. Bruder, Christopher W. Long, and Kimberly Janssen, Journal of Analytical Toxicology, Volume 30, Number 8, pp.581-592.

6. Gapeev, A., Sigman, M. and Yinon, J. Rapid Comm Mass Spectrom., 2003, 17, 943-948.7. A.C. Mitchell, I .Tebbet, A.R.Yost, Abstracts of ASMS, 2002

PAGE 277