Lisozima, Ribonucleasa A,

Carboxipeptidasa A,

Serinproteasas y Bioquímica del

ejercicio

ESTRATÉGIAS CATALÍTICAS DE LAS

ENZIMAS Y MECANISMO DE ACCIÓN

Universidad Nacional de TrujilloFacultad de Farmacia y Bioquímica

Bioquímica I

Seminario IVGrupo N° 06

Es la facilitación de la hidrolisis de una

molécula biológica, por la acción de una

enzima. Un ejemplo muy interesante es la

hidrolisis del glucógeno por la alfa amilasa,

esta actúa sobre los enlaces glucosídicos

alfa (1-4), y no afecta los enlaces alfa (1-

6), dando lugar a la ruptura de la molécula

de glucógeno en productos como: glucosa,

maltosa e isomaltosa.

CATÁLISIS ENZIMATICA

REACCIÓN NO CATALIZADA:

Los reactivos A y B se encuentran en una solución acuosa, rodeados por una capa de moléculas de agua (capa de hidrato).

Se produce una reacción si y solo si ambos reactivos chocan en la dirección adecuada y necesaria para generar una reacción.

Reacción catalizada mediante una enzima:

el posicionamiento y la orientación de los sustratos

incrementan drásticamente la probabilidad de que se

generen complejos A-B productivos.

Durante la unión de sustrato se eliminan asimismo sus capas

de hidrato. Al expulsar las moléculas de agua se modifican

completamente las condiciones dentro del centro activo de

la enzima durante la catálisis.

Otro factor importante es la estabilización del estado

intermedio a través de la interacción entre los aminoácidos

y los restos de proteína y sustratos

Las enzimas pueden unir los reactivos (específ icamente sus sustratos)

en el centro activo, proceso en el cual los sustratos se or ientan en una

posición que les permite alcanzar el estado intermedio.

ESTRATEGIAS CATALITICAS DE LAS

ENZIMAS

La catálisis enzimática comienza con la unión del sustrato.

Las interacciones solamente se forma cuando el sustrato se encuentra en el estado de transición.

Sólo el sustrato correcto puede participar en la mayor parte de las interacciones con la enzima (especificidad)

GENERALIDADES

• LIZOSIMAEs una enzima (glucosidasa) que destruye

paredes celulares bacterianas por

hidrólisis de los enlaces glucosídico ß (1-

4) de ácido n-acetilmurámico (NAM o

MurNAc) a n-acetilglucosamina (NAC o

GlcNAc) en los peptidoglucanos de la

pared celular .De modo similar, hidroliza

los enlaces ß (1-4) de poli (NAG) quitina,

un componente de la pared celular de la

mayoría de los hongos, además de un

componente importante de los

exoesqueletos de los insectos y los

crustáceos.

La forma de la molécula de proteína

es casi elipsoidal, y sus dimensiones

son 30x30x45A .Su característica

más notable es una hendidura

prominente, el sitio de fijación del

sustrato, que atraviesa una cara de

la molécula. La cadena poli peptídica

forma cinco segmentos helicoidales,

además una hoja B antiparalelas

tricatenaria que comprende una

pared de la hendidura de fijación.

Estructura de enzima:

• RIBONUCLEASA A

Las ribonucleasas están divididas en tres grandes

familias: la superfamilia RNasa A, la familia T1 y la

familia T2. La superfamilia Ribonucleasa A está

constituida por las RNasas de mamíferos y otros

vertebrados como aves, reptiles y anfibios

(Soochin et al., 2005). Este grupo de proteínas

presenta altas tasas de duplicación génica y pérdida

de genes de lo que ha resultado un número variable

de genes en diferentes especies (Soochin et

al., 2005). En el ser humano, los genes que las

codifican están ubicados en el brazo largo del

cromosoma 14

• CARBOXIPEPTIDASA A

Es una enzima proteolítica que cataliza la ruptura del enlace pepitico, denominada, proteinasas.

Es una enzima digestiva secretada en el jugo pancreático que hidroliza el enlace peptídico carboxiterminal en las cadenas polipeptídicas

La hidrólisis se produce más fácilmente en el residuo carboxiterminal que tiene una cadena lateral aromática o una cadena alifática. Esta enzima contiene regiones α y la hoja plegada β

GENERALIDADES

• constituye una exopeptidasa ya que cataliza la remoción del aminoácido situado en el extremo carbonilo del sustrato, siendo específica para aminoácidos voluminosos

SEGÚN SU FUNCION

• cataliza la hidrolisis del enlace peptídico carboxiloterminal de la cadena polipeptídica. con la ayuda de metales, generalmente Zn+2, unidos a su sitio activo, este ion actúa como una catalizador metálico para las reacciones hidrolíticas.

HIDRÓLISIS

• como intermediario de la hidrólisis de una forma muy similar a la acción de la serina en la quimiotripsina.

ESTABILIZACION

ESTRUCTURA DE SITIO ACTIVO DE LA CARBOXIPEPTIDASA A

Sitio Activo

• consta de un surco poco profundo en la superficie de la enzima que conduce a una bolsa profunda, forrada con cadenas laterales alifáticas y polares

Cadena Lateral

• La cadena lateral de este residuo es conformacionalmente muy móvil

Cadena Lateral Aromática

• se fija en la bolsa de fijación• el ion carboxilato del C-terminal forma un

enlace salino con la Arg-145• el oxígeno carbonílico del enlace

escindible se constituye en el cuarto ligando del ion zinc.

La Cadena Lateral Fenólica

• puede rotar alrededor del enlace Cα-Cβ y un 80%

• su densidad electrónica en el mapa de la estructura cristalina se encuentra en una orientación en la superficie de la molécula apuntando hacia la solución

• SERINPROTEASASEstas enzimas emplean las siguientes estrategias:

Catálisis covalente. El centro activo contiene un

grupo reactivo, habitualmente un nucleófilo

potente, un residuo de serina que en el

transcurso de la catálisis llega a ser modificado

covalentemente de forma temporal.

Catálisis general acido-base. Una molécula

diferente al agua desempeña el papel de dador

o aceptor de un protón. Ej. La Quimotripsina

utiliza un residuo de histidina como un

catalizador básico para incrementar el poder

nucleófilo de la serina.

La Quimotripsina rompe selectivamente los enlaces peptídicos

contiguos al extremo carboxílico de aminoácidos hidrofóbicos

voluminosos, como triptófano, tirosina, fenilalanina y metionina.

La tripsina corta en el lado carboxilato de los residuos básicos

como la lisina o la arginina.

Reacción de la Quimotripsina

Quimotripsina

Quimotripsina

MECANISMO DE ACCION ENZIMATICA DE LAS LISOZIMAS

Los únicos grupos funcionales en la vecindad inmediata del centro react ivo de la

l isoz ima que t ienen las propiedades catal í t icas requer idas son las cadenas

laterales de Glu 35 y Asp 52.estas cadenas laterales ,d ispuestas a ambos lados

del enlace glucosídico que se desea escindir , t ienen entornos con di ferencias

marcadas.asp 52 esta rodeado por var ios residuos polares conservados, con los

que forma una red compleja unidas por puentes de hidrogeno.

En consecuencia se prevé que Asp 52 t iene un pk normal , esto es , no deber ía estar

protonado, y por lo tanto tener carga negat iva en el rango de pH de 3 a 8 para el

cual la l i soz ima t iene act iv idad enzimát ica. Por ende, Asp 52 puede actuar en la

estabi l i zación electrostát ica de un ion oxonio. Por e l contrar io , e l grupo carboxi lo

de Glu 35 se anida en un bols i l lo con predominio no polar , donde es probable que

se mantenga protonado con valores de pH inusualmente elevados de los grupos

carboxi lo. Por lo tanto, este res iduo puede actuar como catal izador acido.

Glu 35 y Asp 52 son los residuos catalíticos de la lisozima:

LA REACCIÓN DE LA LISOZIMA PROCEDE POR MEDIO DE UN INTERMEDIARIO COVALENTE:

Según Phi l l ips, en el mecanismo de l isozima se incluye la catál is is acida por

Glu 35 y la estabi l ización de un intermediario de ion oxonio por el grupo

carboxi lato de Asp 52. La formación de 1 enlace covalente entre el O2 de

carboxi lato de Asp 52 y C1 del residuo D del sustrato no parecía posible,

debido a que estos átomos están separados por -3 Å(la longitud del enlace

covalente C-O es de -1,4 Å ) .

En investigaciones más reciente se reveló que, de hecho, la reacción de

l isozima t iene lugar a través de un intermediario covalente. La reacción

comienza cuando la l isozima se une a una pared celular bacteriana, por unión

a una unidad de hexasacárido. Esto distorsiona al residuo D para adoptar la

conformación de semisi l la. El resto del mecanismo catal í t ico se produce como

se sigue.

1.-Glu 35 transfiere su protón a O1 del anil lo D (un ejemplo de catál isis ácida).este paso comprende un estado de transición de ion oxonio estabil izado por resonancia, cuya formación se faci l ita por la tensión en el anil lo D que lo distorsiona para dar la forma de semisi l la en la que C1, C2, C5 y O5 son coplanares (catálisis por el enlace preferencial del estado de transición)

• 2.-El grupo carboxilato de Asp 52 que actúa como un nucleófilo ataca el C1 ahora reducido del anillo D para formar un intermediario glucosilo-emzima (catálisis covalente)

• 3.-Después de la extracción del grupo que se elimina, que contiene el anillo E, entra agua en el sitio activo para hidrolizar el enlace covalente y generar los grupos del sitio activo con la ayuda de Glu 35(catálisis general básica).

• 4.- La enzima luego libera el producto del anillo D, para completar la reacción catalítica. En principio la enzima se une a la molécula de glúcido en conformación "silla" (a), que luego pasa a otra forma (b) al formar el complejo ES. En el estado de transición, actúa un resto glutámico del Sitio Activo de la enzima, que genera un carbocatión en el anillo D, provocando el colapso del enlace.

FIGURA: La enzima se une a la molécula de glúcido en conformación "silla" (a), que luego pasa a otra forma (b) al formar el complejo ES. En el estado de transición, actúa un resto glutámico del Sitio Activo de la enzima, que genera un carbocatión en el anillo D, provocando el colapso del enlace.

MECANISMO DE ACCIÓN ENZIMATICA

DE LA RIBONUCLEASA A

La acción catalítica de la Ribonucleasa pancreática se debe a tres aminoácidos absolutamente conservados: His 12, His 119 y Lys 41. No está aún bien determinado el papel de esta última, pero la acción de los dos residuos de histidina ilustra cómo este aminoácido se comporta a la vez como ácido y como base. Así, en el estado basal de la enzima, el Centro Activo consta de esos tres aminoácidos, de tal manera que la His 12 aparece como base y la His 119 como ácido (protonada, imidazolio)

A esta configuración se une el substrato que sería un polirribonucleótido; en este caso se representa únicamente el dinucleótido UA. La RNAasa pancreática hidroliza enlaces en los que del lado 3' hay un nucleótido pirimidínico (U o C) dando lugar a una rotura tipo b, es decir, dejando el fosfato unido al 3' del enlace escindido. Cuándo se forma el Complejo Enzima-Substrato el polinucleótido se aloja en un surco de la molécula, según vimos anteriormente, el cual está flanqueado por los tres aminoácidos del centro activo, según se indica en el modelo.

A continuación la His 12 captura un protón del grupo 2'OH del nucleótido pirimidínico, el cual lleva a cabo un ataque nucleofílico sobre el substrato de manera que se forma el Estado de transición inestable (con P pentavalente), al tiempo que la His 119 cede su protón al oxígeno en 5' del enlace atacado; el estado de ionización de las histidinas es justo el contrario que el visto en el estado basal de la enzima.

Este estado de transición se resuelve con la Liberación del primer producto (3'-AMP)  quedando unido a la enzima el nucleótido cícl ico 3',5' UMP.

Entra entonces al centro activo una molécula de agua , que es el segundo substrato de la reacción.

La histidina 119 sustrae uno de los dos protones del agua, que queda convertida en un ion hidroxilo,

que a su vez ataca al fosfato cíclico, dando lugar al Estado de transición 2.

Éste se resuelve rompiéndose el enlace entre el fosfato y el oxígeno que sustituye al carbono 2' de la ribosa, el cual recibe a su vez el protón de la histidina 12, para dar lugar a la liberación del segundo producto, que es el nucleótido 3',5' uridin bisfosfato.

MECANISMO DE ACCIÓN ENZIMATICA

DE LA CARBOXIPEPTIDASA

A

La carboxipeptidasa A cataliza la hidrolisis del enlace peptídico carboxilo terminal de la cadena polipeptídica.

La hidrolisis es más fácil si el residuo carboxílico terminal tiene una cadena lateral aromática o una

cadena lateral alifática voluminosa

Hay una adaptación inducida del centro activo cuando se une el substrato. La enzima es una cadena polipeptídica de 307 aminoácidos.

Tiene un ion Zn2+ fuertemente unido, que es esencial para la actividad enzimática y que está localizado en un surco de la superficie de la molécula donde coordina a dos cadenas laterales de histidina, a una cadena lateral de glutamato y a una molécula de agua

La cadena lateral del residuo terminal del substrato se acomoda en un gran bolsillo cerca de un ion Zn2+.

La molécula de agua altamente polarizada transfiere un protón al grupo NH escindiendo el enlace. Alternativamente, la molécula de agua puede atacar directamente el carbono carbonílico del enlace.

La polarización del grupo carbonílico por el Zn2+ facilita el ataque, sea por el glutamato 270 o la molécula activada de agua. La inducción de un dipolo es impulsada por el ambiente no polar del ion Zn, el que incrementa su carga.

Reacción catalizada por la carboxipeptidasa A

Carboxipeptidasa A

COMPLEJO: EZIMA -

SUSTRATO

INTERMEDIARIO ANHIDRO

CARBOXILICOPRODUCTOS

MECANISMO DE ACCIÓN ENZIMÁTICA

DE LA SERINPROTEASAS A

Las Serinproteasas son hidrolasas que degradan enlaces peptídicos de péptidos y proteínas y que poseen en su centro activo un aminoácido de serina esencial para la catálisis enzimática

la tripsina es específica para un residuo con carga positiva y la elastasa lo es para un residuo neutro pequeño. En conjunto formaron un equipo digestivo muy potente.

La quimiotripsina, tripsina y elastasa son enzimas digestivas sintetizadas por las células de los acinos pancreáticos y segregados por el conducto pancreático en el interior del duodeno (asa superior del intestino delgado).

Las mediciones cinéticas realizadas

por Brian Hartley de la hidrólisis

catalizada por la quimiotripsina del p-

nitrofenilacetato indicaron que la

reacción se produce en dos pasos:

La enzima reacciona con rapidez

con el p-nitrofenilacetato para

liberar el ión p-nitrofenolato que

forma un intermediario acilo-

enzima covalente.

 

El intermediario acilo-enzima

covalente se hidroliza despacio

para liberar al acetato.

IDENTIFICACIÓN DE RESIDUOS CATALÍTICOS

• Ser 195. Una prueba diagnóstica para la presencia de la ser activa de las serina proteasa es su reacción con diisopropilfosfofluoridato (DIPF): Que inactiva en forma irreversible a la enzima.

• His 57. Un segundo residuo importante por su actividad catalítica se descubrió por medio de la marcación por afinidad, para formar un enlace covalente estable con un grupo susceptible cercano.

BIOQUÍMICA DEL EJERCICIO

El funcionamiento del organismo humano depende de una variedad de procesos bioquímicos que en conjunto representan el metabolismo de las células corporales

Para el atleta, los procesos liberadores y de síntesis de energía que constituyen el metabolismo facilita la ejecutoria deportiva con dietas efectivas

BIOENERGÉTICAEs el conjunto de procesos celulares por medio del cual se transforma la energía de las sustancias nutritivas ( carbohidratos, lipidos,proteinas )

BIOQUIMICA Son los patrones y principios moleculares que contribuyen al movimiento y fenómeno metabólico relacionado

TERMODINAMICA Es el Campo de las Ciencias Físicas que Estudia los Intercambios de Energía entre conjuntos de materia, los cambios asociados con el paso de un sistema desde un estado inicial a otro final

METABOLISMOEs la suma total de los procesos químicos involucrados en la liberación y utilización de energía dentro de la célula VIVIENTE

Metabolismo celular

Catabolismo

Procesos de descomposición

Fragmentos de moléculas grandes

a pequeñas

Anabolismo

procesos de síntesis

Requiere de energía para elaborara

moléculas mayores a partir de las

pequeñas

Homeostasis

Es el equilibrio del medio interno del

organismo.

Energía

potencial eléctrica Nuclear Radiante solar cineteca

Capacidad para efectuar

trabajo

Clases de energía

Química Osmótica Mecánica

Formas

Ciclo biológico de la energía

ENZIMAS

Son catalizadores biológicos Aceleran reacciones

bioquímicas Dirigen y seleccionas vías

metabólicas

No cambian la naturaleza de la reacción ni su resultado .

Son proteínas No sufren ningún cambio

general

Ejemplos , poseen sufijo

«asa»

Quinasa

Deshidrogenasa

• Añaden fosfatos a los sustratos con las que reaccionan.

• Remueven a los hidrógenos de sus sustratos

Combustibles Metabólicos para el Ejercicio

Carbohidratos Estructu

ra química

• Átomos de C, H,y O

Función • Provee energía • 4 Kcal / g de R-CHO

Clasificación

• Monosacárido: glucosa ( sangre), galactosa( Glandulas

mamarias),fructosa (frutas y miel de abeja)

• Disacárido: sacarosa( caña de

azúcar),lactosa(leche),maltosa( digestión)• Polisacárido: almidón( tubérculos), celulosa (fibra),glucógeno( reservorio)

Lípidos

Características

No son solubles en agua

Función

9 Kcal de energía por gramo de lípido

Tipos

-Simples: triglicéridos-Compuestas: fosfolípidos y lipoproteínas-Derivadas: colesterol

Estructura química

Función

Clasificación

• Aminoácidos • Enlaces

peptídicos

• Componentes estructurales

• Fuente de potencial de energía ( 4 K cal)

• Esencial (9): no sintetizan

• No esencial (11): si sintetizan

Proteínas

El ATP

Adenosina trifosfato (ATP). La hidrolisis de un enlace de anhídrido de ácido fosfórico en el ATP libera energía libre para las reacciones biosinteticas, el movimiento o transporte de materia (derecha). El ATP se regenera a través de la destrucción exergonica de los nutriente o a través dela fotosíntesis (izquierda). A diferencia de ADP, pobre en energía.

GRACIAS

!!!