Seed Dormancy in Red Rice' Plant Physiol. 1992 Footitt 1196 202

8/2/2019 Seed Dormancy in Red Rice' Plant Physiol. 1992 Footitt 1196 202

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P l a n t P h y s i o l . ( 1 9 9 2 ) 1 0 0 , 1 1 9 6 - 1 2 0 20 0 3 2 - 0 8 8 9 / 9 2 / 1 0 0 / 1 1 9 6 / 0 7 / $ 0 1 . 0 0 / 0 R e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n A p r i l 1 0 ,

1 9 9 2A c c e p t e d J u n e 2 0 , 1 9 9 2

S e e d Dormancy i n R e d R i c e ' 2V i l . E m b r y o A c i d i f i c a t i o n d u r i n g D o r m a n c y - B r e a k i n g a n d S u b s e q u e n t G e r m i n a t i o n

S t e v e n F o o t i t t a n d Marc A l a n C o h n *D e p a r t m e n t o f P l a n t P a t h o l o g y a n d C r o p P h y s i o l o g y , L o u i s i a n a A g r i c u l t u r a l E x p e r i m e n t S t a t i o n , L o u i s i a n a S t a t eU n i v e r s i t y A g r i c u l t u r a l C e n t e r , B a t o n R o u g e , L o u i s i a n a 7 0 8 0 3

ABSTRACTE x p o s u r e o f d e h u l l e d , d o r m a n t r e d r i c e ( O r y z a s a t i v a ) s e e d s t od o r m a n c y - b r e a k i n g t r e a t m e n t s ( 1 0 mm s o d i u m n i t r i t e , 2 0 mm pro-p i o n i c a c i d , 3 0 mm m e t h y l p r o p i o n a t e , 4 0 mm p r o p i o n a l d e h y d e , o r

7 0 mm n - p r o p a n o l ) i n d u c e d t i s s u e pH a c i d i f i c a t i o n d u r i n g c h e m i c a lc o n t a c t a t l e a s t 1 2 h b e f o r e v i s i b l e g e r m i n a t i o n . D u r i n g c h e m i c a lc o n t a c t , t h e o n s e t o f e m b r y o a c i d i f i c a t i o n o c c u r r e d b e f o r e orc o i n c i d e n t w i t h t h e c h e m i c a l c o n t a c t i n t e r v a l necessary f o r s u b s e -q u e n t g e r m i n a t i o n . Upon s e e d t r a n s f e r t o H20 f o l l o w i n g c h e m i c a lc o n t a c t , e m b r y o pH a l s o d e c r e a s e d c o i n c i d e n t w i t h v i s i b l e g e r m i -n a t i o n . D u r i n g t h i s p e r i o d , t h e p e r c e n t a g e o f g e r m i n a t i o n a n de m b r y o pH were c l o s e l y l i n k e d i r r e s p e c t i v e o f t h e d o r m a n c y -b r e a k i n g c o m p o u n d u s e d . T h e r e f o r e , t i s s u e a c i d i f i c a t i o n d u r i n g t h eb r e a k i n g o f s e e d d o r m a n c y a n d t h e g e r m i n a t i o n process may b ea n a l o g o u s t o s i m i l a r t i s s u e pH c h a n g e s a s s o c i a t e d w i t h t h e t e r m i -n a t i o n o f d e v e l o p m e n t a l a r r e s t i n o t h e r m u l t i c e l l u l a r s y s t e m s , s u c has b r i n e s h r i m p c y s t s a n d n e m a t o d e l a r v a e .

D o r m a n c y - b r e a k i n g c h e m i c a l s o f s e e d s ar e p r e d o m i n a n t l yw e a k a c i d s or t h e i r d e r i v a t i v e s ( 1 , 4 , 6 ) . Weak a c i d s a l s ot e r m i n a t e d e v e l o p m e n t a l a r r e s t i n o t h e r m o d e l s y s t e m s , s u c has s t a r f i s h eggs ( A s t e r i a s f o r b e s i i ) ( 1 6 ) , P h y c o m y c e s b l a k e s -l e e a n u s spores ( 2 8 ) , a n d j u v e n i l e n e m a t o d e s ( 2 0 ) . T h e m e c h -a n i s m b y w h i c h t h e s e c o m p o u n d s a c t i s u n c l e a r . H o w e v e r ,w e a k a c i d s h a v e b e e n d e m o n s t r a t e d t o i n d u c e c e l l a c i d i f i c a -t i o n ( 1 1 , 1 9 ) .I n t h e a n i m a l k i n g d o m , many d e v e l o p m e n t a l l y a r r e s t e ds y s t e m s e x h i b i t a c h a n g e i n i n t e m a l p H upon a c t i v a t i o n . I nu n i c e l l u l a r s y s t e m s s u c h as t h e se a u r c h i n egg, i n t e r n a l pHi n c r e a s e s d u r i n g f e r t i l i z a t i o n a n d a r t i f i c i a l a c t i v a t i o n ( 1 0 , 2 3 ) .I n m u l t i c e l l u l a r s y s t e m s , i n t e r n a l p H d e c r e a s e s as a r e s u l t o fa c t i v a t i o n i n e m b r y o s o f t h e b r i n e s h r i m p A r t e m i a ( 8 ) , as w e l las i n l a r v a e a n d j u v e n i l e s o f t h e n e m a t o d e s C a e n o r h a b d i t i se l e g a n s ( 2 9 ) a n d H a e m o n c h u s c o n t o r t u s ( 1 9 ) .C h a n g e s i n i n t e r n a l p H upon a c t i v a t i o n o f d e v e l o p m e n t a l l ya r r e s t e d s y s t e m s i n t h e p l a n t k i n g d o m h a v e b e e n n e g l e c t e d ,i n c o m p a r i s o n t o t h o s e i n a n i m a l s y s t e m s . I n t h e o l d e r l i t e r -

' A p p r o v e d f o r p u b l i c a t i o n b y t h e d i r e c t o r o f t h e L o u i s i a n a A g r i -c u l t u r a l E x p e r i m e n t S t a t i o n a s m a n u s c r i p t N o . 9 2 - 3 8 - 6 2 1 0 .2 T h i s work i s p a r t o f t h e d o c t o r a l r e s e a r c h o f S . F . , s u p p o r t e d b y

a g r a d u a t e a s s i s t a n t s h i p f r o m t h e D e p a r t m e n t o f P l a n t P a t h o l o g yand C r o p P h y s i o l o g y a n d t h e A m e r i c a n S e e d R e s e a r c h F o u n d a t i o n .

a t u r e c o n c e r n i n g s e e d s , t h e r e a r e s e v e r a l r e p o r t s o f c h a n g e si n s e e d t i s s u e pH d u r i n g t h e d o r m a n c y - b r e a k i n g p r o c e s s a n dg e r m i n a t i o n . D u r i n g c o l d s t r a t i f i c a t i o n , e m b r y o p H d e c r e a s e di n d o r m a n t s e e d s o f C r a t a e g u s g l o r i o s a ( 9 ) , A c e r s a c c h a r i n u m( 1 4 ) , a n d J u n i p e r u s v i r g i n i a n a ( 1 8 ) a n d i n w h o l e s e e d s o f T i l i aa m e r i c a n a ( 2 2 ) . E m b r y o p H a l s o d e c r e a s e d d u r i n g g e r m i n a -t i o n ( 9 , 1 8 , 2 2 ) . T h e r o l e o f i n t e m a l p H , w i t h r e g a r d t o t h et r a n s i t i o n f r o m t h e d o r m a n t t o t h e n o n d o r m a n t s t a t e , h a s n o tb e e n r i g o r o u s l y a d d r e s s e d i n s e e d s s i n c e t h e s e e a r l y s t u d i e s .M o r e r e c e n t l y , i n J e r u s a l e m a r t i c h o k e t u b e r s , t h e i n t e m a l p Hw a s f o u n d t o b e h i g h e r i n d o r m a n t v e r s u s n o n d o r m a n t b u d s( 1 3 ) . A common t h e m e b e t w e e n d e v e l o p m e n t a l l y a r r e s t e d ,m u l t i c e l l u l a r s y s t e m s o f t h e p l a n t a n d a n i m a l k i n g d o m ss e e m s t o b e a d e c r e a s e i n i n t e m a l pH u p o n a c t i v a t i o n . H e r e ,we r e p o r t t h e e f f e c t o f d o r m a n c y - b r e a k i n g c o m p o u n d s o ne m b r y o p H . I t w a s d e m o n s t r a t e d t h a t e m b r y o pH i s h i g h e ri n d o r m a n t t h a n i n n o n d o r m a n t s e e d s . E v i d e n c e i s a l s op r e s e n t e d t h a t e m b r y o a c i d i f i c a t i o n i s a p r e r e q u i s i t e f o r t h et e r m i n a t i o n o f d o r m a n c y . P a r t o f t h i s w o r k w a s p r e v i o u s l yp r e s e n t e d i n a b s t r a c t f o r m ( 1 2 ) .

M A T E R I A L S AND METHODSM a t u r e , d o r m a n t r e d r i c e ( O r y z a s a t i v a ) s e e d s ( s t r a w h u l l e d ,

a w n l e s s ) w e r e o b t a i n e d f r o m t h e S o u t h F a r m , R i c e R e s e a r c hS t a t i o n , C r o w l e y , L A , i n 1 9 8 7 . S e e d s w e r e h a rv e s t e d b yh a n d - s h a t t e r i n g o f i n d i v i d u a l p l a n t s . M o i s t u r e c o n t e n t a t t h et i m e o f h a r v e s t w a s 1 7 . 8 % . A f t e r t h e s e e d s w e r e d r i e d f o r 2d i n o p e n t r a y s a t 2 2 0 C , t h e m oi s t u r e c o n t e n t w a s 1 2 . 6 % .S e e d s w e r e s t o r e d i n Mason j a r s a t - 1 5 0 C . N o n d o r m a n t r e dr i c e w a s o b t a i n e d b y a f t e r r i p e n i n g d o r m a n t s e e d s a t 2 2 0 C f o r6 0 d , a f t e r w h i c h t h e y w e r e s t o r e d a t - 1 5 0 C . S e e d m o i s t u r ec o n t e n t d i d n o t c h a n g e a s a r e s u l t o f d r y a f t e r r i p e n i n g .F r e s h l y p r e p a r e d s o l u t i o n s w e r e u s e d f o r e a c h e x p e r i m e n t .A l l e x p e r i m e n t s w e r e r e p e a t e d f o u r t i m e s .Homogenate pH M e a s u r e m e n tOn e h u n d r e d d e h u l l e d s e e d s w e r e sown o n 9 - c m P e t r ip l a t e s c o n t a i n i n g t h r e e s h e e t s o f g e r m i n a t i o n p a p e r a n d 1 0m L o f H 2 0 . S e e d s w e r e c o v e r e d w i t h a d o u b l e l a y e r o f t i s s u e

p a p e r ( K i m w i p e ) t o e n s u r e e v e n h y d r a t i o n d u r i n g i n c u b a t i o na t 3 0 0 C i n d a r k n e s s . N o n d o r m a n t a n d d o r m a n t s e e d s w e r es a m p l e d d u r i n g h y d r a t i o n . G e r m i n a t i o n w a s a l s o r e c o r d e d .I n s t u d i e s w i t h d o r m a n c y - b r e a k i n g c h e m i c a l s , d e h u l l e d

s e e d s w e r e i n c u b a t e d a s a b o v e f o r 2 4 h , r i n s e d f r o m t h e1 1 9 6


2/7

SEED DORMANCY-BREAKING I N RED R I C E

g e r m i n a t i o n p a p e r , w a s h e d t h o r o u g h l y w i t h H 2 0 , a n d b r i e f l yb l o t t e d w i t h t i s s u e p a p e r . G e r m i n a t e d s e e d s ( a p p r o x i m a t e l y5 % ) w e r e r e p l a c e d w i t h s i m i l a r l y h y d r a t e d d o r m a n t o n e s .S e e d s w e r e t h e n t r a n s f e r r e d t o 2 5 0 - m L w i r e c l a s p s t o r a g ej a r s ( H e r i t a g e I n d u s t r i e s , M i l l v i l l e , N J ) c o n t a i n i n g t w o s h e e t so f Whatman N o . 1 f i l t e r p a p e r a n d 1 0 m L o f t e s t s o l u t i o n .T h e s e e d s w e r e c o v e r e d w i t h t i s s u e p a p e r , a n d t h e j a r s w e r es e a l e d . D o r m a n c y - b r e a k i n g c o m p o u n d s w e r e a p p l i e d a se i t h e r a 4 - h / 3 0 0 C ( n i t r i t e ) o r a 2 4 - h / 3 0 0 C ( a l l o t h e r s ) p u l s ei n 2 5 m m c i t r a t e / p h o s p h a t e b u f f e r . D o r m a n c y - b r e a k i n gc h e m i c a l s w e r e u s e d a t c o n c e n t r a t i o n s g i v i n g a s a t u r a t i n gr e s p o n s e , i . e . d o r m a n c y w a s b r o k e n i n 90% o f t h e p o pu l a t i on ,a s d e t e r m i n e d b y g e r m i n a t i o n a f t e r a s u b s e q u e n t 7 - d H20i n c u b a t i o n a t 3 0 0 C . S o d i u m n i t r i t e ( 1 0 m M ) w a s a p p l i e d a tp H 3 . 0 ( p K 3 . 3 ) . P r o p i o n i c a c i d ( 2 0 mM) w a s a p p l i e d a t i t s pKo f 4 . 9 . P r o p a n o l ( 7 0 m M ) , p r o p i o n a l d e h y d e ( 4 0 m M ) , a n dm e t h y l p r o p i o n a t e ( 3 0 mm) w e r e a p p l i e d a t p H 7 . 0 . A t t h ee n d o f t h e c h e m i c a l p u l s e , s e e d s w e r e t r a n s f e r r e d a s a b o v et o P e t r i p l a t e s c o n t a i n i n g H20 ( a s d e s c r i b e d a b o v e ) f o r u p t o1 2 h / 3 0 0 C ( n i t r i t e ) o r 2 4 h / 3 0 0 C ( a l l o t h e r s ) . S a m p l e s w e r et a k e n a t i n t e r v a l s t h r o u g h o u t t h e c h e m i c a l p u l s e a n d p o s t -p u l s e p h a s e s .

F o r e a c h p H d e t e r m i n a t i o n , 1 0 0 s e e d s w e r e w a s h e d t h o r -o u g h l y i n H20 a n d p l a c e d o n m o i s t t i s s u e p a p e r . E m b r y o sw e r e e x c i s e d w i t h a s c a l p e l , w e i g h e d , a n d i m m e d i a t e l yg r o u n d t o a p o w d e r i n l i q u i d N 2 . T h i s p o w d e r w a s h o m o g e -n i z e d i n a c o l d g l a s s t i s s u e h o m o g e n i z e r w i t h 1 m L o f i c e -c o l d H20 t h a t h a d b e e n p u r g e d w i t h N 2 t o r e m o v e C O 2 . T h eh o m o g e n a t e w a s t r a n s f e r r e d t o a m i c r o c e n t r i f u g e t u b e a n dc e n t r i f u g e d ( 1 6 , 0 0 0 g f o r 5 m i n ) , a n d t h e s u p e m a t a n t wasf i l t e r e d ( 0 . 2 2 - , u m f i l t e r , M i l l i p o r e G S WP 0 1 3 0 0 ) a t 4 0 C . T h ef i l t r a t e w a s c o l l e c t e d i n a m i c r o c e n t r i f u g e t u b e a n d p l a c e d i na n i c e b a t h . T h e p H was m e a s u r e d u s i n g a c o l d ( 1 - 3 0 C ) R o s s8 1 0 3 p H e l e c t r o d e ( O r i o n ) i n c o n j u n c t i o n w i t h a n O r i o n EA9 2 0 I o n a l y z e r a n d c h a r t r e c o r d e r ( C o l e P a l m e r 8 3 7 3 - 2 0 ) . T h ep H w a s r e c o r d e d when t h e e l e c t r o d e r e g i s t e r e d a s t a b l e pH( < 0 . 0 1 u n i t s m i n - ' ) ; t h i s w a s g e n e r a l l y a c h i e v e d b e t w e e n 2a n d 3 m i n . T h e p r o c e d u r e was r e p e a t e d u s i n g t h e samew e i g h t o f e n d o s p e r m t i s s u e . A t t h e e n d o f e a c h d a y , t h ee l e c t r o d e was c l e a n s e d o f l i p i d a n d p r o t e i n c o n t a m i n a n t s b yr i n s i n g w i t h 1% d e t e r g e n t a n d s o a k i n g i n 1% p e p s i n / 1 0 0 mmH C l f o r 1 5 m i n ; t h e r e f e r e n c e e l e c t r o d e s o l u t i o n was t h e nr e p l a c e d . T h e p H d a t a w e r e a n a l y z e d a c c o r d i n g t o t h em e t h o d o f S t e v e n s ( 2 4 ) . E m b r y o p H m e a s u r e m e n t was h i g h l yr e p r o d u c i b l e : f o r a l l t i m e p o i n t s ( n = 1 5 0 ) , t h e mean S E was0 . 0 2 0 0 . 0 0 1 .B u f f e r C a p a c i t yOn e h u n d r e d d e h u l l e d d o r m a n t s e e d s w e r e h y d r a t e d o nH 2 0 i n P e t r i p l a t e s f o r 2 4 h / 3 0 0 C a s a b o v e . A f t e r 2 4 h ,

g e r m i n a t e d s e e d s w e r e r e p l a c e d a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y . F i l -t e r e d e m b r y o a n d e n d o s p e r m h o m o g e n a t e s w e r e p r e p a r e d a sa b o v e , a n d 4 0 0 , u L was t a k e n f o r pH d e t e r m i n a t i o n s . Whena s t a b l e p H was o b t a i n e d , 2 . 5 g L o f i c e - c o l d NaOH o r H C l( 0 . 0 5 N ) was a d d e d a n d t h e s a m p l e m i x e d b e f o r e t h e pH wasr e m e a s u r e d . T h i s was r e p e a t e d u p t o pH 9 . 0 f o r a l k a l i t i t r a -t i o n s a n d p H 5 . 0 f o r a c i d t i t r a t i o n s u s i n g f r e s h f i l t r a t e s i ne a c h c a s e . T h e e l e c t r o d e w as n o t r i n s e d b e t w e e n a d d i t i o n s .

E m b r y o b u f f e r c a p a c i t y w a s d e t e r m i n e d f r o m t h e s l o p e b e -t w e e n a d j a c e n t p o i n t s o n t h e t i t r a t i o n c u r v e ( A H + / A p H ) ( 2 5 ) .G e r m i n a t i o n T e s t s

F o r e a c h t r e a t m e n t , f i v e r e p l i c a t e s o f 2 0 d e h u l l e d s e e d s i n5 0 - m L E r l e n m e y e r f l a s k s w i t h t w o s h e e t s o f Whatman N o . 1f i l t e r p a p e r a n d 2 m L o f t e s t s o l u t i o n w e r e u s e d . F l a s k s w e r es e a l e d w i t h r u b b e r s e p t u m c a p s . N o n d o r m a n t s e e d s w e r ei n c u b a t e d f o r 7 d / 3 0 0 C . F o r s t u d i e s i n w h i c h d o r m a n c y -b r e a k i n g c h e m i c a l s w e r e u s e d , s e e d s w e r e i n c u b a t e d i n E r -l e n m e y e r f l a s k s w i t h c h e m i c a l s a s f o r p H d e t e r m i n a t i o n s a n dt r a n s f e r r e d t o H20 f o r 7 d / 3 0 0 C , a f t e r w h i c h p e r c e n t a g e o fg e r m i n a t i o n w a s d e t e r m i n e d . G e r m i n a t i o n w a s m e a s u r e d a sr u p t u r e o f t h e p e r i c a r p a n d a l e u r o n e o v e r t h e e m b r y o ( c r i t e -r i o n u s e d i n t i m e - c o u r s e e x p e r i m e n t s ) o r r a d i c l e p r o t r u s i o n .V i a b i l i t y o f u n g e r m i n a t e d s e e d s w a s t e s t e d b y i n c u b a t i o n o fe x c i s e d e m b r y o s o n H20 a t 3 0 0 C ( 4 , 6 ) . V i a b i l i t y w a s 297%f o r a l l e x p e r i m e n t s . G e r m i n a t i o n a n d v i a b i l i t y t e s t s w e r ep e r f o r m e d i n e a c h e x p e r i m e n t ( b u f f e r c a p a c i t y d e t e r m i n a -t i o n s e x c e p t e d ) . G e r m i n a t i o n d a t a a r e p r e s e n t e d i n t h e a p -p r o p r i a t e f i g u r e l e g e n d s .M o i s t u r e C o n t e n t

T h e m o i s t u r e c o n t e n t o f f o u r r e p l i c a t e s o f 1 0 0 i n t a c t s e e d st h a t h a d n o t i m b i b e d a n d s e e d c o m p o n e n t s ( e m b r y o a n de n d o s p e r m ) w a s d e t e r m i n e d . T h e m o i s t u r e c o n t e n t o f s e e dc o m p o n e n t s d u r i n g t h e h y d r a t i o n o f d e h u l l e d d o r m a n t a n dn o n d o r m a n t s e e d s w a s d e t e r m i n e d i n f o u r r e p l i c a t e s o f 5 0s e e d s a t e a c h t i m e . S e e d s w e r e i n c u ba t e d i n 9 - c m P e t r i p l a t e sc o n t a i n i n g t h r e e s h e e t s o f g e r m i n a t i o n p a p e r a n d 1 0 m L o fH 2 0 . Tw o s a m p l e s o f 5 0 s e e d s w e r e sown i n e a c h p l a t e .S a m p l e s w e r e p h y s i c a l l y s e p a r a t e d , a n d e a c h was c o v e r e d b ya d o u b l e l a y e r o f t i s s u e p a p e r . S e e d s a n d c o m p o n e n t s w e r ed r i e d f o r 7 d a t 1 0 0 0 C . P e r c e n t a g e o f m o i s t u r e c o n t e n t wasd e t e r m i n e d b a s e d o n t h e f r e s h w e i g h t a t t h e t i m e o f s a m p l i n g .

R E S U L T ST i s s u e pH a n d M o i s t u r e C o n t e n t d u r i n g I m b i b i t i o n

E m b r y o m o i s t u r e c o n t e n t w a s t h e s a m e i n b o t h d o r m a n ta n d n o n d o r m a n t s e e d s u n t i l t h e o n s e t o f g e r m i n a t i o n . E n -d o s p e r m m o i s t u r e c o n t e n t was t h e s a m e i n d o r m a n t a n dn o n d o r m a n t s e e d s ( F i g . 1 A ) . T h e p H o f d o r m a n t e m b r y o st h a t h a d n o t i m b i b e d a n d o f n o n d o r m a n t e m b r y o s was 7 . 3 7a n d 7 . 2 5 , r e s p e c t i v e l y ( F i g . 1 B ) . D u r i n g i m b i b i t i o n , e m b r y op H b e c a m e s t a b l e a f t e r 2 h i n d o r m a n t ( p H 7 . 2 8 ) a n d a f t e r 4h i n n o n d o r m a n t ( p H 7 . 1 6 ) s e e d s . When i m b i b i t i o n wasc o m p l e t e ( 4 h ) , t h e i n c r e a s e i n e m b r y o [ H + ] o v e r t h a t m e a s -u r e d a t 0 h i n t h e r e s p e c t i v e e m b r y o s w a s 1 3 . 4 ( d o r m a n t )a n d 1 4 . 4 nm ( n o n d o r m a n t ) . A f t e r 6 h , n o n d o r m a n t e m b r y op H s t a r t e d t o d e c r e a s e . G e r m i n a t i o n c o m m e n c e d a f t e r 1 2 h .E n d o s p e r m p H d e c l i n e d d u r i n g i m b i b i t i o n i n b o t h c a s e s , a f t e rw h i c h n o n d o r m a n t e n d o s p e r m e x h i b i t e d a s l o w d e c l i n e ( F i g .1 C ) .E f f e c t o f N i t r i t e o n T i s s u e pH

I n i n i t i a l e x p e r i m e n t s o n t h e e f f e c t s o f d o r m a n c y - b r e a k i n gc o m p o u n d s , t h e w e a k a c i d n i t r i t e was u t i l i z e d . A t a n i n c u -

1 1 9 7


3/7

P l a n t P h y s i o l . V o l . 1 0 0 , 1 9 9 26 0 0 . -5

0)- O ac 4003

2

N 1 1

0 ~-0

ELu

A 0i o . 0 - ; | e |

0 . 0 - -0 o . 0

E m b r y o0-0ondormant0.0 0-*-* DormantE n d o s p e r m E-0o n d o r m a n tD o r m a n t0 . 0 l l l l l l7 . 4 B - 4 (7 . 3)*b~/*I7 . 2 - O/N007.1 \0 .217.0 06.9

6 . 8 . A i. _ 07 . 7 -I 7

E 7U )07l l J 7 . 27 . 1 0 2 4 6 8 10 1 2H o u r s 1 4

on e m b r y o pH c o m p a r e d w i t h i t s b u f f e r c o n t r o l a n d d i d n o tb r e a k d o r m a n c y .

E f f e c t o f P r o p i o n a t e a n d I t s D e r i v a t i v e s o n T i s s u e pHd u r i n g t h e C h e m i c a l P u l s e

0

o ' E0

o WcI0Cz

' 1

F i g u r e 1 . A , M o i s t u r e c o n t e n t ( f r e s h w e i g h t b a s i s ) o f e m b r y o a n de n d o s p e r m t i s s u e f r o m d e h u l l e d r e d r i c e s e e d s d u r i n g h y d r a t i o n a t3 0 ' C . B , E m b r y o pH o f d e h u l l e d r e d r i c e s e e d s d u r i n g h y d r a t i o na n d g e r m i n a t i o n ( p e r c e n t a g e ) o f n o n d o r m a n t s e e d s . G e r m i n a t i o na f t e r 7 d / 3 0 ' C on H20 was 8% f o r d o r m a n t a n d 9 8 1 % f o rn o n d o r m a n t s e e d s . C , E n d o s p e r m pH o f t h e same s e e d s . E r r o r b a r sr e p r e s e n t 1 S E ; no error b a r i n d i c a t e s t h a t t h e s y m b o l i s l a r g e r t h a nt h e e r r o r .

b a t i o n medium p H o f 3 . 0 , t h e pH o f d o r m a n t e m b r y o sd e c r e a s e d more r a p i d l y a n d t o a g r e a t e r e x t e n t i n n i t r i t es o l u t i o n t h a n i n t he b u f f e r c o n t r o l ( F i g . 2 ) . The o v e r a l ld e c r e a s e s i n p H f o r n i t r i t e a n d t h e c o n t r o l were 0 . 4 7 a n d 0 . 1 2p H u n i t s , r e s p e c t i v e l y , d u r i n g c h e m i c a l c o n t a c t b e t w e e n -4a n d 0 h . When t r a n s f e r r e d t o w a t e r a t 0 h , e m b r y o p H o f t h ec o n t r o l r e c o v e r e d t o t h a t f o u n d a t -4 h . D u r i n g t h e p o s t -p u l s e p h a s e a f t e r n i t r i t e t r e a t m e n t , a s l i g h t d e c l i n e i n e m b r y op H o c c u r r e d as g e r m i n a t i o n c o m m e n c e d . E n d o s p e r m p H wash i g h e r t h a n e m b r y o p H a n d f o l l o w e d a s i m i l a r p a t t e r n , b u tno d e c r e a s e i n p H was seen c o i n c i d e n t w i t h g e r m i n a t i o n( d a t a n o t s h o w n ) . N i t r i t e a p p l i e d a t pH 7 . 0 h a d l i t t l e e f f e c t

U s e o f t h e p r o p i o n i c a c i d s e r i e s a l l o w e d t h e c o m p a r i s o n o fc o m p o u n d s w i t h a n d w i t h o u t a d i s s o c i a b l e p r o t o n t h a t h a v es i m i l a r p a r t i t i o n c o e f f i c i e n t s ( 4 , 6 ) . P r o p i o n a t e d e c r e a s e d em-b r y o p H b y 0 . 2 7 u n i t s b y 1 2 h c o m p a r e d w i t h t h e d o r m a n tc o n t r o l , a f t e r w h i c h t h e p H r e m a i n e d s t a b l e . T h e e m b r y o p Hi n t h e c o n t r o l d e c r e a s e d b y 0 . 0 8 u n i t s a f t e r 2 h a n d t h e nr e m a i n e d s t a b l e ( F i g . 3 A ) . A t p H 7 . 0 , p r o p a n o l s i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e d e m b r y o p H b y 0 . 1 5 d u r i n g 2 4 h c o m p a r e d w i t ht h e d o r m a n t c o n t r o l ( F i g . 3 B ) . P r o p i o n a l d e h y d e d e c r e a s e de m b r y o p H b y 0 . 1 4 d u r i n g t h e f i r s t 8 h c o m p a r e d w i t h t h ed o r m a n t c o n t r o l ( F i g . 3 C ) . P r o p i o n a l d e h y d e e l i c i t e d i n i t i a lg e r m i n a t i o n 1 6 h i n t o t h e p u l s e ( d a t a n o t s h o w n ) . No o t h e rc o m p o u n d u s e d e l i c i t e d g e r m i n a t i o n d u r i n g c h e mi c a l c o n t a c t .M e t h y l p r o p i o n a t e d e c r e a s e d e m b r y o p H b y 0 . 1 8 d u r i n g t h ef i r s t 8 h c o m p a r e d w i t h t h e d o r m a n t c o n t r o l ( F i g . 3 D ) . E n -d o s p e r m p H d e c r e a s e d g r a d u a l l y i n response t o a l l d o r m a n c y -b r e a k i n g t r e a t m e n t s ( d a t a n o t s h o w n ) .

T o e v a l u a t e w h e t h e r or n o t e m b r y o a c i d i f i c a t i o n was t e m -p o r a l l y r e l a t e d t o t h e d o r m a n c y - b r e a k i n g process, d o r m a n tr e d r i c e s e e d s were e x p o s e d t o e a c h c h e m i c a l f o r i n c r e a s i n gc o n t a c t p e ri o d s ( u p t o 2 4 h ) a n d t r a n s f e r r e d t o H20 f o r 7 dt o assess t h e e x t e n t o f g e r m i n a t i o n . A c i d i f i c a t i o n a l w a y so c c u r r e d b e f o r e or c o i n c i d e n t w i t h c h e m i c a l c o n t a c t t i m e snecessary t o e l i c i t a s u b s e q u e n t g e r m i n a t i o n response( F i g . 3 ) .

r. )

7 . 5 2 0 . 0 mA-A C o n t r o l p H 7 . 07 . 4 A-Ai t r i t e p H 7 . 0 Q0-0 C o n t r o l p H 3 . 07 . 3 ; T N i t r i t e p H 3 . 0C L 7 . 20 T7 . 1 10.0 2

- 4 - 2-0 2 4 68001E 7.0

6.9

6.80

6.7 0.0-4 -2 0 2 4 8 10 12H o u r s

.F i g u r e 2 . R e s p o n s e o f e m b r y o pH a n d g e r m i n a t i o n o f d o r m a n td e h u l l e d r e d r i c e s e e d s t o 1 0 mm n i t r i t e f o r 4 h / 3 0 C f o l l o w e d b yt r a n s f e r t o H20 f o r 1 2 h / 3 0 C . G e r m i n a t i o n i n e a c h t r e a t m e n t a f t e r7 d / 3 0 C on H20 w a s : pH 3 . 0 c o n t r o l , 5 + 1 % ; pH 7 . 0 c o n t r o l , 4+ 1 % ; n i t r i t e a t pH 3 . 0 , 9 8 % ; n i t r i t e a t pH 7 . 0 , 5 + 1 % . E r r o r b a r sr e p r e s e n t 1 S E ; no error b a r i n d i c a t e s t h a t t h e s y m b o l i s l a r g e r t h a nt h e e r r o r .

I

i i I A

F O O T I T T A ND C O H N1 9 8

F . 3 -


4/7

S E E D DORMANCY-BREAKING I N RED R I C E

F i g u r e 3 . E m b r y o pH o f d o r m a n t d e h u l l e d r e dr i c e d u r i n g c o n t a c t w i t h : A , 2 0 m i m p r o p i o n i ca c i d ( p H 4 . 9 ) ; B , 7 0 mm n - p r o p a n o l ( p H 7 . 0 ) ;C , 4 0 mm p r o p i o n a l d e h y d e ( p H 7 . 0 ) ; a n d D , 3 0mm m e t h y l p r o p i o n a t e ( p H 7 . 0 ) f o r 2 4 h / 3 0 C .T r e a t m e n t a n d c o n t r o l m e d i a w e r e b u f f e r e d a tpH 4 . 9 ( A ) o r a t pH 7 . 0 ( B , C , a n d D ) w i t h 2 5mm c i t r a t e / p h o s p h a t e . G e r m i n a t i o n p e r c e n t -a g e s s h o w n a r e a f t e r 7 d / 3 0 C o n H20 f o l l o w -i n g i n c r e a s i n g p e r i o d s o f c o n t a c t w i t h e a c hd o r m a n c y - b r e a k i n g c o m p o u n d u n d e r t h e samec o n d i t i o n s . G e r m i n a t i o n o f c o n t r o l t r e a t m e n t sa f t e r 7 d / 3 0 ' C o n H20 was 2 t o 3 % . E r r o r b a r sr e p r e s e n t 1 S E ; n o e r r o r b a r i n d i c a t e s t h a t t h es y m b o l i s l a r g e r t h a n t h e e r r o r .

C o n t a c t t i m e i n h o u r sE f f e c t o f P r o p i o n a t e a n d I t s D e r i v a t i v e s on T i s s u e pH a f t e rt h e C h e m i c a l P u l s e

D u r i n g t h e p o s t - p u l s e p h a s e , e m b r y o a c i d i f i c a t i o n o c c u r r e dc o i n c i d e n t w i t h t h e o n s e t o f g e r m i n a t i o n f o r a l l m e m b e r s o ft h e p r o p i o n i c a c i d s e r i e s e x c e p t f o r p r o p i o n a l d e h y d e ( F i g . 4 ) .P r o p i o n a l d e h y d e e l i c i t e d g e r m i n a t i o n ( 9 % a t 2 4 h ) d u r i n gt h e p u l s e p h a s e , a n d g e r m i n a t i o n i n c r e a s e d r a p i d l y i n t h ep o s t - p u l s e p h a s e . I n t h e p o s t - p u l s e p h a s e , e m b r y o pH a n dp e r c e n t a g e o f g e r m i n a t i o n were s i g n i f i c a n t l y c o r r e l a t e d , i r -r e s p e c t i v e o f t h e d o r m a n c y - b r e a k i n g compound u s e d ( y =- 0 . 0 0 5 3 x + 7 . 0 4 ; r = - 0 . 6 3 ; P < 0 . 0 0 1 ) . E n d o s p e r m p Hshowed l i t t l e or no response t o g e r m i n a t i o n i n t h e p o s t - p u l s ep h a s e ( d a t a n o t s h o w n ) .I n t h e p o s t - p u l s e p h a s e , c o n t r o l g e r m i n a t i o n commenceda f t e r 2 0 h a n d was 4 % ( p H 4 . 9 ) a n d 3% ( p H 7 . 0 ) a f t e r 2 4 h .As a r e s u l t , e m b r y o p H d e c r e a s e d t o 7 . 0 4 a n d 7 . 1 2 , respec-t i v e l y . Wh en g e r m i n a t e d s e e d s were r e p l a c e d b y i d e n t i c a l l yt r e a t e d d o r m a n t o n e s a t 2 4 h , e m b r y o p H was 7 . 1 6 a n d 7 . 1 8 ,r e s p e c t i v e l y ( F i g . 4 ) . T h e e f f e c t o f 3 t o 4 % g e r m i n a t i o n one m b r y o p H i s as g r e a t as some o f t h e c h a n g e s seen d u r i n gt h e p u l s e p e r i o d . T h u s , i t i s i m p o r t a n t t o u se p o p u l a t i o n s i nw h i c h a l l g e r m i n a t i n g s e e d s / s e e d l i n g s h a v e b e e n r e m o v e df r o m t h e c o n t r o l s .B u f f e r C a p a c i t y o f E m b r y o a n d E n d o s p e r m

T h e e n d o s p e r m t i t r a t i o n c u rve ( F i g . 5 A ) i n d i c a t e s a l o wb u f f e r c a p a c i t y . T h e e m b r y o t i t r a t i o n r e v e a l s a s h a l l o w s i g -m o i d a l curve. I t was a s s u m e d t h a t t he b u f f e r c a p a c i t y o f t heo r i g i n a l 1 m L o f f i l t e r e d h o m o g e n a t e was t h e same a s t h a t o fe m b r y o s b e f o r e e x t r a c t i o n . On t h i s b a s i s , e m b r y o b u f f e rc a p a c i t y was d e t e r m i n e d b a s e d on t h e a qu e o u s v o l u m e o f1 0 0 h y d r a t e d e m b r y o s ( 3 6 , u L ) , i n c l u d i n g b o t h a p o p l a s t i c a n ds y m p l a s t i c c o n t r i b u t i o n s . E m b r y o b u f f e r c a p a c i t y i s l o w e s t i nt h e p H r a n g e f o u n d d u r i n g e m b r y o p H measurements( F i g . 5 B ) .

DISCUSSIONI n t h i s s t u d y , e m b r y o a c i d i f i c a t i o n was o b s e r v e d d u r i n gt h e a c t i v a t i o n process s t i m u l a t e d b y d o r m a n c y - b r e a k i n gc h e m i c a l s a p p l i e d t o d o r m a n t s e e d s . O u r h o m o g e n a t em e t h o d gave h i g h l y r e p r o d u c i b l e p H v a l u e s c o m p a r a b l e w i t h

c y t o p l a s m i c p H d e t e r m i n a t i o n s o bt a i n e d w i t h o t h e r t e c h -n i q u e s ( 1 5 ) t h a t are n o t r e a d i l y a d a p t a b l e t o d e n s e s e e d t i s s u e sa t p r e s e n t . T h e b u f f e r c a p a c i t y o f o u r h o m o g e n a t e s wasc o n s i s t e n t w i t h v a l u e s r e p o r t e d f o r t h e c y t o p l a s m o f C h a r ac o r a l l i n a a n d N e u r o s p o r a ( r e f . 2 5 a n d r e f e r e n c e s t h e r e i n ) . I nd o r m a n t s e e d s , t he b u f f e r c a p a c i t y o f e m b r y o h o m o g e n a t e si s l o w nea r n e u t r a l i t y . T h i s i n d i c a t e d t h a t i n d o r m a n t e m b r y o st i s s u e pH may r e q u i r e a c t i v e c o n t r o l i f p e r t u r b e d b y d o r -m a n c y - b r e a k i n g c o m p o u n d s .E m b r y o A c i d i f i c a t i o n d u r i n g C h e m i c a l C o n t a c t

E m b r y o a c i d i f i c a t i o n was e l i c i t e d v i a d i r e c t l o a d i n g o f weaka c i d s . T h e t i s s u e p H c h a n g e i n d u c e d b y n i t r i t e c o n t a c t wasmore r a p i d t h a n t h a t b y p r o p i o n i c a c i d , a n d t h i s may b e af u n c t i o n o f m o l e c u l a r s i z e , r e l a t e d t o s p e e d o f a c i d u p t a k e( 4 , 6 ) .

M e t h y l p r o p i o n a t e , n - p r o p a n o l , a n d p r o p i o n a l d e h y d et r e a t m e n t s a l s o c a u s e d e m b r y o a c i d i f i c a t i o n . T h e s e d e r i v a -t i v e s c o u l d b e i n t e r n a l l y c o n v e r t e d e n z y m i c a l l y t o p r o p i o n i ca c i d w i t h s u b s e q u e n t weak a c i d d i s s o c i a t i o n s u f f i c i e n t t or e d u c e e m b r y o p H , a s h a s a l r e a d y b e e n d e m o n s t r a t e d i ny e a s t ( 1 7 ) . C i r c u ms t a n t i al e v i d e n c e f r o m s t r u c t u r e - a c t i v i t ys t u d i e s i n d i c a t e s a r e q u i r e m e n t f o r o r g a n i c a c i d a n a l o g s ,w h i c h c a n b e c o n v e r t e d t o t h e p a r e n t a c i d t o e x e r t t h e i rd o r m a n c y - b r e a k i n g e f f e c t ( 5 ) . S u c h a p r o p o s a l may e x p l a i n( a ) t h e i n h i b i t i o n o f t h e d o r m a n c y - b r e a k i n g a c t i o n o f e t h a n o lb y 4 - m e t h y l p y r a z o l e ( a n a l c o h o l d e h y d r o g e n a s e i n h i b i t o r ) i nA v e n a s a t i v a ( 7 ) a n d ( b ) t h e i n e f f e c t i v e n e s s o f some s e c o n d a r ya l c o h o l s as d o r m a n c y - b r e a k i n g c h e m i c a l s o f r e d r i c e ( 5 ) .N e i t h e r o f t he s e o b s e r v a t i o n s , o r t h e c o n f l i c t i n g e f f e c t s o f

a0.0Ew i

C - )00r e )00

4 - ,c i0c0

* _

a )C DCh

1 1 9 9


5/7

P l a n t P h y s i o l . V o l . 1 0 0 , 1 9 9 2

F i g u r e 4 . E m b r y o pH o f d o r m a n t d e h u l l e d r e dr i c e a n d p e r c e n t a g e o f g e r m i n a t i o n d u r i n g 2 4h / 3 0 C o n H20 f o l l o w i n g a 2 4 - h / 3 0 ' C p u l s ew i t h e a c h o f t h e d o r m a n c y - b r e a k i n g c o m -p o u n d s i n F i g u r e 3 . E r r o r b a r s r e p r e s e n t 1 S E ;n o e r r o r b a r i n d i c a t e s t h a t t h e s y m b o l i s l a r g e rt h a n t h e e r r o r .

Q-0

Ew i

a4 . ,

a )C D

H o u r s p o s t c o n t a c ti n c r e a s e d a i r p r e s s u r e ( 2 7 ) , i s c o n s i s t e n t w i t h t h e a n e s t h e s i a -l i k e ( p r e s s u r e s e n s i t i v e ) m o d e l p r o p o s e d f o r t h e d o r m a n c y -b r e a k i n g a c t i o n o f a l c o h o l s ( 2 6 ) .

D u r i n g c h e m i c a l c o n t a c t , t h e o n s e t o f e m b r y o a c i d i f i c a t i o no c c u r r e d b e f o r e o r c o i n c i d e n t w i t h t h e c o n t a c t i n t e r v a l n e c -e s s a r y f o r s u b s e q u e n t g e r m i n a t i o n . T h i s c h a n g e i n e m b r y op H may r e p r e s e n t a n e a r l y s t a g e o f a s i g n a l t r a n s d u c t i o nc h a i n l e a d i n g t o a n a l t e r a t i o n o f t h e d e v e l o p m e n t a l p a t t e m( g e r m i n a t i o n ) . C h a n g e s i n b o t h i n t e r n a l p H a n d f r e e i n t r a -c e l l u l a r C a 2 " a r e a s s o c i a t e d w i t h c e l l / t i s s u e a c t i v a t i o n i n s e au r c h i n ( 1 0 ) a n d X e n o p u s l a e v i s e g g s ( 2 ) . A l t h o u g h i t i s p r e -m a t u r e t o s p e c u l a t e e x t e n s i v e l y r e g a r d i n g o u r o b s e r v a t i o n s ,t h e o b s e r v e d p H c h a n g e i n d o r m a n t r e d r i c e s e e d s may b ep a r t o f a s e c o n d a r y m e s s e n g e r s y s t e m ( 1 1 ) i n v o l v i n g c a l c i u m( 2 , 1 0 , 2 1 , 3 0 ) .A l t h o u g h c o n t r o l s a t p H 3 . 0 a n d 4 . 9 d i d n o t b r e a k d o r -m a n c y , e m b r y o p H d e c l i n e d t o a s i m i l a r o r g r e a t e r e x t e n tt h a n d i d t h e p r o p i o n i c a c i d d e r i v a t i v e s a n d t h e p H 7 . 0c o n t r o l . A n a l o g o u s , s t i l l i n c o m p l e t e l y e x p l a i n e d o b s e r v a t i o n sa r e s e e n d u r i n g e g g a c t i v a t i o n ( 1 0 ) . T h e r e f o r e , h o m o g e n a t epH v a l u e s o b t a i n e d f r o m c h e m i c a l l y t r e a t e d s e e d s s h o u l d n o tb e r e g a r d e d a s a b s o l u t e a n d c a n o n l y b e m e a n i n g f u l l y v i e w e da s i n d i c a t o r s o f c h a n g e i n r e l a t i o n t o r e s p e c t i v e b u f f e r c o n t r o l sa t t h e s a m e p H .E m b r y o A c i d i f i c a t i o n d u r i n g G e r m i n a t i o n

D u r i n g h y d r a t i o n , d i f f e r i n g c h a n g e s i n t h e e m b r y o p H o fd o r m a n t a n d n o n d o r m a n t s e e d s r e f l e c t e d t h e i r d i f f e r e n t d e -v e l op m e n t a l p a t t e m s ( F i g . 1 ) . D u r i n g i m b i b i t i o n , i d e n t i c a lh y d r a t i o n - d e p e n d e n t i n c r e a s e s i n e m b r y o [ H + ] o c c u r r e d . F o l -l o w i n g i m b i b i t i o n ( > 4 h ) , t h e e m b r y o p H o f d o r m a n t a n dn o n d o r m a n t s e e d s w a s s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t . I n n o n d o r m a n ts e e d s , m e t a b o l i c a c t i v a t i o n o c c u r s i n p h a s e 2 ( 1 ) , a n d e m b r y op H a l s o d e c r e a s e d . T h i s w a s i n t e r p r e t e d a s a p h y s i o l o g i c a le v e n t : a m a r k e r f o r t h e o n s e t o f t h e g e r m i n a t i o n p r o c e s s

b e f o r e i t w a s p h y s i c a l l y e x p r e s s e d . I n p h a s e 3 , c e l l e x p a n s i o no f t h e r a d i c l e l e a d s t o g e r m i n a t i o n ( 1 ) . N o n d o r m a n t e m b r y om o i s t u r e c o n t e n t i n c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y ( 1 2 h ) w i t h s p l i t t i n go f t h e p e r i c a r p a n d a l e u r o n e b u t b e f o r e r a d i c l e e m e r g e n c e .E m b r y o p H c o n t i n u e d t o d e c r e a s e a s g e r m i n a t i o n c o m -m e n c e d . I n d o r m a n t s e e d s , e m b r y o m o i s t u r e c o n t e n t r e -m a i n e d c o n s t a n t i n p h a s e 2 , a n d e m b r y o p H r e m a i n e d s t a b l e .D o r m a n t s e e d s i n c o n t a c t w i t h p r o p i o n a l d e h y d e e n t e r e dt h e g e r m i n a t i o n p h a s e b e f o r e t r a n s f e r t o H 2 0 . I n t h e c a s e o ft h e r e m a i n i n g c o m p o u n d s , t h e o n s e t o f g e r m i n a t i o n i s d e -l a y e d d u r i n g c o n t a c t . S u c h a d e l a y w a s a l s o o b s e r v e d i nP h a c e l i a t a n a c e t i f o l i a s e e d s a f t e r c o n t a c t w i t h b u t y r i c a c i d ( 3 ) .S o m e r e c o v e r y f r o m a c i d l o a d i n g was s e e n i n e m b r y o s f r o mp r o p i o n a t e - t r e a t e d s e e d s ( F i g . 4 A ) . When t h e s e e d s w e r et r a n s f e r r e d t o H 2 0 , t h e o n s e t o f g e r m i n a t i o n was c o i n c i d e n tw i t h e m b r y o a c i d i f i c a t i o n ( F i g . 4 ) . When F i g u r e 4 w a s r e -p l o t t e d a s e m b r y o pH v e r s u s p e r c e n t a g e o f g e r m i n a t i o n f o rt h e c o m b i n e d d a t a , e m b r y o p H a n d g e r m i n a t i o n w e r e s i g n i f -i c a n t l y c o r r e l a t e d ( r = - 0 . 6 3 ; P < 0 . 0 0 1 ) . T h i s i n d i c a t e s t h a tc h a n g e s i n e m b r y o pH a r e a c o m p o n e n t o f t h e g e r m i n a t i o np r o c e s s . C h a n g e s i n e n d o s p e r m pH c o u l d n o t b e r e l a t e d t od o r m a n c y - b r e a k i n g o r g e r m i n a t i o n .I n s u m m a r y , i t w a s f o u n d t h a t ( a ) e m b r y o p H was h i g h e ri n d o r m a n t t h a n i n n o n d o r m a n t r e d r i c e s e e d s , c o n s i s t e n tw i t h t h e v a l u e s f o u n d i n d i c o t s e e d s a n d t h e p a r e n c h y m ac e l l s o f d o r m a n t a n d n o n d o r m a n t b u d s o f J e r u s a l e m a r t i c h o k et u b e r s ; ( b ) i n h y d r a t i n g n o n d o r m a n t s e e d s , e m b r y o pH d e -c r e a s e d b e f o r e v i s i b l e g e r m i n a t i o n . I n d o r m a n t s e e d s a f t e rt h e c h e m i c a l p u l s e , e m b r y o p H d e c r e a s e d c o i n c i d e n t w i t hg e r m i n a t i o n ; ( c ) d o r m a n c y - b r e a k i n g c o m p o u n d s i n d u c e d ad e c r e a s e i n e m b r y o p H ; a n d ( d ) e m b r y o a c i d i f i c a t i o n d u r i n gd o r m a n c y - b r e a k i n g w a s c o n s i s t e n t w i t h t h a t s e e n i n t h ea c t i v a t i o n o f d e v e l o p m e n t a l l y a r r e s t e d , m u l t i c e l l u l a r s y s t e m si n t h e a n i m a l k i n g d o m . I t i s p r o p o s e d t h a t e m b r y o a c i d i f i c a -t i o n i s a n i n d i c a t o r o f t h e t e r m i n a t i o n o f d e v e l o p m e n t a l a r r e s t

F O O T I T T A ND COHN2 0 0


6/7

S E E D DORMANCY-BREAKING I N RED R I C E

U.5U

n 0 . 2 5

I- 0 - 0 . 2 5])o-0.50

E - 0 . 7 5-1.00o

- 1 . 2 5

p H

Co00EG)-J

4 - ,*

0-

EE

50 -

4 0 .

30

20

1 0

0-_5 . 0 6 . 0 7.0 8 . 0 9 . 0pH

F i g u r e 5. A , pH t i t r a t i o n curves o f f i l t e r e d e m b r y o a n d e n d o s p e r mh o m o g e n a t e s o f d o r m a n t r e d r i c e . B , B u f f e r c a p a c i t y o f e m b r y o" s a p " c a l c u l a t e d f r o m A . E r r o r b a r s r e p r e s e n t 1 S E ; no error b a ri n d i c a t e s t h a t t h e s y m b o l i s l a r g e r t h a n t h e e r r o r .i n d o r m a n t s e e d s a n d may p l a y a f u n d a m e n t a l r o l e i n t h i sprocess.

ACKNOWLEDGMENTSR e d r i c e was o b t a i n e d t h r o u g h t h e c o o p e r a t i o n o f R . D u n a n d and

J . M u s i c k , L o u i s i a n a R i c e E x p e r i m e n t S t a t i o n , C r o w l e y , L A . We w i s ht o t h a n k W . J . B l a c k m o n , M . E . M u s g r a v e , and J . W . L y n n , w h o t o o kt i m e t o r e v i e w t h e m a n u s c r i p t . We are a l s o i n d e b t e d t o C . C . B a s k i n ,U n i v e r s i t y o f K e n t u c k y , f o r l e a d i n g u s t o t h e e a r l y s e e d l i t e r a t u r e .

LITERATURE CITED1 . B e w l e y J D , B l a c k M ( 1 9 8 2 ) P h y s i o l o g y a n d B i o c h e m i s t r y o f

S e e d s . S p r i n g e r - V e r l a g , B e r l i n , FR G2 . Charbonneau M, G r a n d i n N ( 1 9 8 9 ) T h e egg o f X e n o p u s l a e v i s :a m o d e l s y s t e m f o r s t u d y i n g c e l l a c t i v a t i o n . C e l l D i f f e r Dev2 8 : 7 1 - 9 43 . C o c u c c i SM, M o r g u t t i S , R a n i e r i AM ( 1 9 8 9 ) E f f e c t o f b u t y r i ca c i d on t h e g e r m i n a t i o n o f t h e s e e d s o f P h a c e l i a t a n a c e t i f o l i a .

P h y s i o l P l a n t 7 6 : 1 7 - 2 34 . Cohn MA ( 1 9 8 9 ) F a c t o r s i n f l u e n ci n g t he e f f i c a c y o f d o r m a n c y -b r e a k i n g c h e m i c a l s . I n RB T a y l o r s o n , e d , R e c e n t A d v a n c e s i nt h e D e v e l o p m e n t a n d G e r m i n a t i o n o f S e e d s. P l e n u m P r e s s ,New Y o r k , p p 2 6 1 - 2 6 75 . Cohn M A, C h u r c h D F , Ranken J , S a n c h e z V ( 1 9 9 1 ) H y d r o x y lg r o u p p o s i t i o n g o v e r n s a c t i v i t y o f d o r m a n c y - b r e a k i n g c h e m i -c a l s ( a b s t r a c t N o . 4 1 1 ) . P l a n t P h y s i o l 9 6 : S - 6 36 . Cohn M A, J o n e s K L , C h i l e s L A , C h u r c h D F ( 1 9 8 9 ) S e e dd o r m a n c y i n r e d r i c e . V I I . S t r u c t u r e - a c t i v i t y s t u d i e s o f g e r m i -n a t i o n s t i m u l a n t s . P l a n t P h y s i o l 8 9 : 8 7 9 - 8 8 2

7 . Come D , C o r b i n e a u F ( 1 9 8 9 ) Some a s p e c t s o f m e t a b o l i c r e g u -l a t i o n o f s e e d g e r m i n a t i o n a n d d o r m a n c y . I n RB T a y l o r s o n ,e d , R e c e n t A d v a n c e s i n t h e D e v e l o p m e n t a n d G e r m i n a t i o n o fS e e d s . P l e n u m P r e s s , New Y o r k , p p 1 6 5 - 1 7 98 . Crowe J H , Crowe LM, D r i n k w a t e r L , B u s a WB ( 1 9 8 7 ) I n t r a -c e l l u l a r p H a n d a n h y d r o b i o s i s i n A r t e m i a c y s t s . I n W D e c l e i r ,

L M o e n s , H S l e g e r s , E J a s p e r s , P S o r g e l o o s , e d s , A r t e m i aR e s e a r c h a n d I t s A p p l i c a t i o n s , V o l 2 : P h y s i o l o g y , B i o c h e m i s -t r y , M o l e c u l a r B i o l o g y . U n i v e r s a P r e s s , W e t t e r e n , B e l g i u m , p p1 9 - 4 09 . E c k e r s o n S ( 1 9 1 3 ) A p h y s i o l o g i c a l a n d c h e m i c a l s t u d y o f a f t e r -r i p e n i n g . B o t G a z 5 5 : 2 8 6 - 2 9 91 0 . E p e l D ( 1 9 9 0 ) T h e i n i t i a t i o n o f d e v e l o p m e n t a t f e r t i l i z a t i o n . C e l lD i f f e r Dev 2 9 : 1 - 1 21 1 . F e l l e H ( 1 9 8 9 ) p H a s a s e c o n d m e s s e n g e r i n p l a n t s . I n WF B o s s ,D J M o r r e , e d s , S e c o n d M e s s e n g e r s i n P l a n t G r o w t h a n d D e -v e l o p m e n t . A l a n R . L i s s , New Y o r k , p p 1 4 5 - 1 6 61 2 . F o o t i t t S , Cohn MA ( 1 9 9 0 ) p H t r a n s i e n t s i n t h e d o r m a n c y -b r e a k i n g p r o c e s s o f s e e d s ( a b s t r a c t N o . 7 8 9 ) . P l a n t P h y s i o l 9 3 :S - 1 3 41 3 . G e n d r a u d M , L a f l e u r i e l J ( 1 9 8 3 ) C a r a c t e r i s t i q u e s d e l ' a b s o r p -t i o n d u s a c c h a r o s e e t d u t e t r a p h e n y l p h o s p h o n i u m p a r l e sp a r e n c h y m e s d e t u b e r c u l e s d e T o p i n a m b o u r , d o r m a n t s e t n o nd o r m a n t s , c u l t i v e s i n v i t r o . P h y s i o l V e g 2 1 : 1 1 2 5 - 1 1 3 31 4 . J o n e s HA ( 1 9 2 0 ) P h y s i o l o g i c a l s t u d y o f m a p l e s e e d s . B o t G a z6 9 : 1 2 7 - 1 5 2

1 5 . K u r k d j i a n A , G u e r n J ( 1 9 8 9 ) I n t r a c e l l u l a r p H : m e a s u r e m e n ta n d i m p o r t a n c e i n c e l l a c t i v i t y . Annu R e v P h y s i o l P l a n t M o lB i o l 4 0 : 2 7 1 - 3 0 31 6 . L i l l i e R S ( 1 9 2 6 ) T h e a c t i v a t i o n o f s t a r f i s h e g g s b y a c i d s . J GenP h y s i o l 8 : 3 3 9 - 3 6 71 7 . L o u r e i r o - D i a s M C, S a n t o s H ( 1 9 9 0 ) E f f e c t s o f e t h a n o l o n S a c -c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e a s m o n i t o r e d b y i n v i v o 3 1 P a n d 1 3 Cn u c l e a r m a g n e t i c r e s o n a n c e . A r c h M i c r o b i o l 1 5 3 : 3 8 4 - 3 9 11 8 . P a c k DA ( 1 9 2 1 ) A f t e r - r i p e n i n g a n d g e r m i n a t i o n o f J u n i p e r u ss e e d s . B o t G a z 7 1 : 3 2 - 6 01 9 . P e t r o n i j e v i c T , R o g e r s WP ( 1 9 8 7 ) T h e p h y s i o l o g y o f i n f e c t i o nw i t h n e m a t o d e s : t h e r o l e o f i n t r a c e l l u l a r pH i n t h e d e v e l o p -m e n t o f t h e e a r l y p a r a s i t i c s t a g e . Co m p B i o c h e m P h y s i o l ( A )8 8 : 2 0 7 - 2 1 22 0 . P e t r o n i j e v i c T , R o g e r s WP, S o m m e r v i l l e R I ( 1 9 8 6 ) O r g a n i ca n d i n o r g a n i c a c i d s a s t h e s t i m u l u s f o r e x s h e a t h m e n t o f i n f e c -t i v e j u v e n i l e s o f n e m a t o d e s . I n t J P a r a s i t o l 1 6 : 1 6 3 - 1 6 82 1 . R i n k T J , T s i e n R Y , Warner A E ( 1 9 8 0 ) F r e e c a l c i u m i n X e n o p u se m b r y o s m e a s u r e d w i t h i o n - s e l e c t i v e m i c r o e l e c t r o d e s . N a t u r e2 8 3 : 6 5 8 - 6 6 02 2 . R o s e R C ( 1 9 1 9 ) A f t e r - r i p e n i n g a n d g e r m i n a t i o n o f s e e d s o f T i l i a ,S a m b u c u s , a n d R u b u s . B o t G a z 6 7 : 2 8 1 - 3 0 82 3 . S h e n S S ( 1 9 8 2 ) T h e e f f e c t o f e x t e r n a l i o n s o n p H i i n s e a u r c h i ne g g s . I n R N u c c i t e l l i , DW D e a m e r , e d s . I n t r a c e l l u l a r pH I t sM e a s u r e m e n t , R e g u l a t i o n , a n d U t i l i z a t i o n i n C e l l u l a r F u n c -t i o n s . A l a n R . L i s s , I n c . , New Y o r k , p p 2 6 9 - 2 8 22 4 . S t e v e n s S S ( 1 9 5 5 ) On t h e a v e r a g i n g o f d a t a . S c i e n c e 1 2 1 :1 1 3 - 1 1 62 5 . T a k e s h i g e K , Tazawa M ( 1 9 8 9 ) M e a s u r e m e n t o f t h e c y t o p l a s m i c

1 2 0 1


7/7

1 2 0 2 FOOTITT AND COHN

a n d v a c u o l a r b u f f e r c a p a c i t i e s i n C h a r a c o r a l l i n a . P l a n t P h y s i o l8 9 : 1 0 4 9 - 1 0 5 22 6 . T a y l o r s o n R B ( 1 9 8 8) A n a e s t he t i c e n h a n c e m e n t o f E c h i n o c h l o ac r u s - g a l l i ( L . ) B e a u v . s e e d g e r m i n a t i o n : p o s s i b l e m e m b r a n ei n v o l v e m e n t . J E x p B o t 3 9 : 5 0 - 5 82 7 . T a y l o r s o n R B ( 1 9 9 1 ) I n t e r a c t i o n o f a l c o h o l s a n d i n c r e a s e d a i rp r e s s u r e o n E c h i n o c h l o a c r u s - g a l l i ( L ) B e a u v . s e e d g e r m i n a t i o n .Ann B o t 6 8 : 3 3 7 - 3 4 02 8 . Van M u l d e r s RM , Van L a e r e A J , V e r b e k e MN ( 1 9 8 6 ) E f f e c t s

P l a n t P h y s i o l . V o l . 1 0 0 , 1 9 9 2

o f pH a n d c a t i o n s o n t h e g e r m i n a t i o n i n d u c t i o n o f P h y c o m y c e ss p o r e s w i t h c a r b o x y l i c a c i d s . B i o c h e m P h y s i o l P f l a n z 1 8 1 :1 0 3 - 1 1 52 9 . W a d s w o r t h WG, R i d d l e D L ( 1 9 8 8 ) A c i d i c i n t r a c e l l u l a r pH s h i f td u r i n g C a e n o r h a b d i t i s e l e g a n s l a r v a l d e v e l o p m e n t . P r o c N a t lA c a d S c i U SA 8 5 : 8 4 3 5 - 8 4 3 8

3 0 . Wayne R , H e p l e r PK ( 1 9 8 5 ) R e d l i g h t s t i m u l a t e s a n i n c r e a s e i ni n t r a c e l l u l a r c a l c i u m i n t h e s p o r e s o f O n o c l e a s e n s i b i l i s . P l a n tP h y s i o l 7 7 : 8 - 1 1

Seed Dormancy in Red Rice' Plant Physiol. 1992 Footitt 1196 202

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