S TEM C ELL D IVISION IS R EGULATED BY THE M ICRO R NA P ATHWAY MATHEUS ANDRADE RAJÃO S. D....
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STEM CELL DIVISION IS REGULATED BY THE
MICRORNA PATHWAY
MATHEUS ANDRADE RAJÃO
S. D. Hatfield, H. R. Shcherbata, K. A. Fischer, K. Nakahara, R. W. Carthew
and H. Ruohola-Baker
NATURE 2005
Introducão
Dicer
Silenciamento
MicroRNAs e siRNA
Introducão
- Repressão gênica via microRNA:
-Havia registros anteriores de miRNA diferencialmente expressos em células tronco
-Sugeriu-se então que miRNAs poderiam ter um papel na regulação
do caráter tronco
Experimento
Como testar ??? Inibir a via de miRNA
Drosophila melanogaster
dicer 1
dicer 2
Processamento de miRNA
Processamento de siRNA
Proposta: eliminar dicer 1 Elimina miRNA
Pouco efeito em siRNA
Experimento
Células tronco da linhagem
germinativa (GSC)
-Se renovam
-Divisões geram câmaras de células
-Que se diferenciam em blastocistos
Ovário de Drosophila
Experimento 1
- Analisar se a ausência de dcr 1 altera a taxa de divisões celulares
Wild Type
dcr 1 -
Experimento 1
- Vários estágios do desenvolvimento estão faltando nos mutantes em dcr 1
Wild type
dcr 1 -
Inferências obtidas com o experimento 1
-Dcr 1 mutante X heterozigoto
Pouco desenvolvimento das câmarasDicer 1 requerida para produção de linhagem germinativa
- Dcr 2 mutante X heterozigoto (data not shown)
Desenvolvimento normal das câmaras
Indica a participação de somente miRNA, e não siRNA
Experimento 2
A GSC está boa? Está ruim?
Manutenção
Identidade
Divisão
Experimento 2
Confirmar a identidade de GSC, e se ela está no lugar certo
Marcadores de localização e de padrões de expressão
Experimento 2
Presença de espectrassomo confirmada
dcr 1 -
(sem GFP)
Experimento 2
Marcadores de localização e de padrões de expressão
Mad fosforilada:
Indica que a sinalização por TGF-beta está funcionando
Experimento 2
dcr 1 -
(sem GFP)
dcr 1 -
Presença de P-Mad confirmada
Experimento 2
Marcadores de localização e de padrões de expressão
A ausência de BamC, causada pela sinalização
de TGF-beta
Experimento 2
dcr 1 -
(sem GFP)
Segundo os autores, a ausência de BamC foi confirmada
Experimento 3
A GSC está boa? Está ruim?
Manutenção
Identidade
Divisão
Experimento 3
Análise da distribuição dos estágios do ciclo celular nas GSCs mutantes
Corando o ovário com anticorpos específicos para diferentes marcadores celulares
Experimento 3
Os mutantes em dcr-1 apresentaram um acúmulo
de CycE
Porém apresentam os outros marcadores em concentrações
iguais ou reduzidas
Experimento 3
dcr 1 -
(sem GFP)
Isso sugere que os mutantes estão parando a divisão na transição entre G1 e S
Experimento 3
E em machos? Será que a ausência de dicer 1 provoca conseqüências similares?
Cada testículo contém aproximadamente 10 GSCs circundando uma estrutura chamada “hub”
Experimento 3
Hub
Esses dados mostram que em machos a dicer funciona semelhantemente, sugerindo que ela possui
um papel conservado, na evolução, na divisão de GSCs
Experimento 4
Será que a via de miRNA regula o ciclo celular de outros tipos celulares?
Em outros tipos celulares não se observou o acúmulo de CycE. (data not shown)
Dessa forma, a via de miRNA se mostra específica para células tronco
Experimento 5
Será que a parada em G1/S estaria ligada à Dacapo (homólogo de p21/p27, inibidores de CDKs)?
Dacapo sequestra CycE/CDK2 em um complexo estável e inativo, travando o ciclo em G1/S, com uma expressão prolongada de CycE
Mutantes apresentaram mais GSCs coradas para Dacapo
Experimento 5
E se diminuirmos a expressão de Dacapo? O que acontece?
Os níveis de CycE voltaram aos níveis normais
Experimento 5
- Ao que tudo indica, miRNA atua na célula tronco diminuindo os níveis de Dap
- Como isso é feito?
Conclusões
- Propôs-se então um mecanismo da via de miRNA que regula a divisão em células tronco