RotorGene™ 3000/6000 (Corbett Research), SmartCycler...

Sacace™ HSV I/II Real-TM March 16, 2009

REF TV8-100FRT

IVD in Vitro Diagnostik kullanım için

RotorGene™ 3000/6000 (Corbett Research), SmartCycler® (Cepheid),

iQ iCycler™ and iQ5™ (Biorad), Applied Biosystems® 7300/7500 Real Time PCR Systems (Applera), MX3000P® and MX3005P®

(Stratagene) ile kullanılan Real Time Kit HSV I/II Real-TM

Kullanılan Semboller

RREEFF

Liste Numarası 2-8°C/ -20°C de saklayın

IVD in Vitro Diagnostik kullanım için

Dikkat!

LLOOTT

Lot Numarası

VVEERR

Versiyon

Son Kullanma Tarihi

Kullanım Bilgileri

Reaktif İçerir

Üretici

İSİM HSV I/II Real-TM GİRİŞ Herpes simpleks virüs-1 ve -2, Herpesviridae ailesinden Alpha-herpesvirinae aittir. Genomları çift-sarmal DNA lardan oluşur. HSV % 95 yayılma oranında en yaygın virüslerden biridir ve insan nufüsünün 30 – 50 % de HSV-2 virüsü bulunur. Oral gerginlik olarak adlandırılan HSV-1 herpes labialis, herpetik stomatit ve keratitlere neden olur. HSV-2'ye genital gerilim denir ve ağırlıklı olarak genital herpese neden olur. Herpes lezyonları iki farklı formda lokalize şekilde bulunurlar bunlar: vücudun üst kısmında bulunan (dudak, yüz, ağız içinde) herpes lezyonlu labial herpes ve vücudun alt kısmında bulunan (genital, kalça, bacakların mukoz membranlarında) herpes lezyonlu genital herpesdir. Geçmişte, HSV-I sadece labial herpese ve HSV-II sadece genital herpese neden olduğuna inanılırdı. Virüslerin her iki türü için bu mevcut veriler çürütülmüştür. HSV teşhisinin laboratuvar yöntemleri, kan serumunda antikor tespiti için kültürel yöntem, sitolojik yöntem, bağışıklık-enzim testinden ve yayılmada HSV antijeni tespiti için immunoflorasan testten oluşur. Kültür yöntemi, hastadan alınan klinik materyalleri elde etmeyi, izli kültürleri kontamine etmeyi (ökaryotik hücrelerin transplantasyon yapabilen kültürleri, tavuk embriyoları ve benzeri ) ve ya ökaryotik hücrelerde sitopatik etkiyi yada immunofluoresans sonuçları dikkate alınarak kontaminasyon sonuçlarını analiz etmeyi sağlar. Kültür yöntemi, geçmişte HSV tanısında altın bir standart olmuştur. Yöntemin hassasiyeti ve özgüllüğü % 80-100 ve % 100 dir. Doğal olarak zahmetli, kalıcı ve standart-olmadığı için, yöntem rutin teşhis pratiklerinde uygulanmaz. Sitolojik yöntem başka virüslerden ve HSV kaynaklanan


değişiklikleri ayırt etmeye izin vermediği için düşük özgüllüğe sahip hastanın hücrelerinde virüsün sitopatojenik etkisini belirlemek için tasarlanmıştır. Doğrudan immunoflorasan yöntemi ürogenital yayılmalarda HSV tespiti için kullanılır çünkü uygulama kolaydır ve özel ekipman ve fazla para gerektirmez. Ancak, yöntem uçuk enfeksiyonunun subklinik formlarını tespit etmek için yeterli duyarlılığa sahip değildir. Serolojik analiz hamile kadınların muayenesi sırasında seronegatif kadınların tespitinde önemlidir, çünkü bu durumda, özellikle, enfeksiyon fetüs için son derece tehlikelidir. Çoğu sağlıklı insan klinik olarak HSV antikoruna sahiptir. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) methodu HSV diagnosisde yüksek derecede hassas, spesifik ve az çalışır ve HSV’in laboratuar teşhisinde çok önemlidir. KULLANIM AMACI Kit HSV I/II Real-TM tam kan, likör, ürogenital swablar, idrar, prastatik sıvı ve diğer biyolojik materyallerde Herpes Simplex Virüsün kalitatif tespiti için bir testtir. TEST PRENSİBİ Kit HSV I/II Real-TM iki temel aşamaya dayanır: örneklerden DNA izolasyonu ve Real Time amplifikasyon. HSV DNA örneklerden ekstre edilir, Real-Time kullanılarak amplifiye edilir ve HSV DNA ve Internal Kontrol için floresan reporter spesifik boya probları ile tespit edilir. İnternal Kontrol (IC) her biri tek tek işlenen örneğin amplifikasyon kontrolünü ve olası reaksiyon inhibisyonu tanımlanmasını sağlar.IC , HSV dan başka bir kanalda tespit edilir. KİT İÇERİĞİ Part N° 1 – “DNA-Sorb-B”: örnek hazırlama; Part N° 2 – “HSV I/II TM”: Real Time amplifikasyon. Part N° 1 – “DNA-sorb-B”: • Lizis Solüsyonu, 2 x 15 ml; • Yıkama Solüsyonu 1, 2 x 15 ml; • Yıkama Solüsyonu 2, 2 x 50 ml; • Sorbent, 2 x 1,25 ml; • DNA-eluent, 2 x 5,0 ml. 100 test için gerekli reaktifler içerir. Part N° 2 – “HSV I/II TM”: • PCR-mix-1-FRT, 1,2 ml; • PCR-Buffer-FRT, 2 x 0,35 ml; • TaqF Polimeraz, 0,06 ml; • HSV C+, 0,2 ml; • Negatif Kontrol C-, 1,2 ml;* • Internal Kontrol IC, 1,0 ml;** • DNA-buffer, 0,5 ml; 110 test için gerekli reaktifler içerir. KİT İÇERİĞİNDE BULUNMAYAN GEREKLİ MATERYALLER Zone 1: örnek hazırlama: • Biyolojik kabin • “eppendorf” tipi tüpler için masa mikrosantrifüj (RCF max. 16,000 x g); Eppendorf 5415D ya da

benzeri • 60°C ± 2°C kuru ısı bloğu • Vorteks mikser • Aerosol bariyerli pipetörler ( 5-40 µl; 40-200 µl; 200-1000 µl) • 1,5 ml polipropilen steril tüpler (Sarstedt, QSP, Eppendorf) • Tek kullanımlık eldiven, pudrasız • Tüp raklar • Biyo tehlikeli atık konteynarı • Buzdolabı


• Dondurucu Zone 2: Real Time amplifikasyon: • Real Time Thermalcycler • Reaksiyon Tüpleri • Workstation • Pipetler (ayarlı) • Filtreli steril pipet uçları • 1,5/2,0 ml tüpler için rotorlu masa santrifüjü • Vorteks mikser • Buzdolabı, Dondurucu UYARILAR VE ÖNLEMLER

1. Lizis Solusyonu, guanidine tiyosiyanat içerir. Guanidine tiyosiyanat solunursa, deri ile temas ederse ya da yutulursa zararlıdır. Asitler ile teması toksik gaz oluşumuna neden olur. (Xn; R: 20/21/22-36/37/38; S: 36/37/39). 2. Örnekler ve reaktifler ile çalışırken tek kullanımlık eldivenler, laboratuar giysisi ve göz koruyucu kullanın. Çalışmalardan sonra ellerinizi yıkayın. 3. Ağızla pipetleme yapmayın. 4. Laboratuar çalışma alanında yemek yemeyin, bir şey içmeyin, kozmetik uygulamayın ya da kontak lenslerini ellemeyin. 5. Son kullanma tarihi geçmiş kitleri kullanmayın. 6. Tüm örnekleri ve kullanılmayan reaktifleri yasal düzenlemelere göre yok edin. 7. Örnekler potansiyel enfeksiyon faktörü olarak kabul edilmeli ve biyolojik kabinlerde Biyo güvenlik Seviye 2 ya da diğer uygun biyo güvenlik pratiklerine göre çalışılmalıdır. 8. Dökülen tüm örnekler ya da reaktifleri 0,5% sodyum hipoklorit ya da uygun diğer dezenfektanlar ile temizleyin. 9. Örnekler ve reaktiflerin deri, gözler ve mukoz membranlar ile temasından kaçının. Eğer bu solüsyonlar ile temas ederse bol su ile yıkayın ve doktorunuza başvurun. 10. Material Safety Data Sheets (MSDS) istenildiğinde verilebilir. 11. Bu kit “DNA-Sorb” ekstraksiyon kiti ile kullanılmak için dizayn edilmiştir. Eğer “DNA-Sorb” dan başka bir kit ile DNA ekstraksiyonu yapılıyorsa bu kullanıcı sorumluluğundadır. 12. Bu kiti ancak DNA amplifikasyon tekniği bilgisi olan kişiler kullanmalıdır. 13. Laboratuardaki iş akışı Ekstraksiyon alanından başlayıp Amplifikasyon ve Belirleme alanlarına doğru tek bir kişinin yönetiminde olmalıdır. Örnekleri, ekipmanları ve reaktifleri bir önceki çalışma alanına geri götürmeyin. SAKLAMA KOŞULLARI HSV I/II Real-TM +2-8°C de saklanabilir. TaqF Polimeraz -20°C de saklanmalıdır. Bu kit 2-8°C de taşınır fakat -8°C ve -20°C’de saklanmalıdır. KARARLILIK HSV I/II Real-TM etiketi üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabil kalır. Ürünün performansı etiket üzerinde yazılı kontrol tarihi ile sağlanacaktır. Işık, ısı ya da neme maruz kalmak bazı kit bileşenlerin raf ömrünü etkileyebilir. Tekrarlanan çözdürme ve bu reaktiflerin dondurulması duyarlılığı azaltabildiği için bu durumdan kaçınılmalıdır. ÖRNEK SAKLAMA, TOPLAMA VE TRANSPORT HSV I/II Real-TM aşağıdaki materyallerden ekstre edilmiş DNA’lar ile analiz edilebilir:

• tam kan ACD veya EDTA tüplerinde toplanan; • likör “Eppendorf” tüpte saklanan; • doku (≈1,0 gr) cam çubuklar, teflon tokmak, skalpel ya da mekanik homojenizör ile homojenize

edilmiş ve 1,0 ml tuzlu su ya da PBS sterilde çözülmüş 1,0 gr. Kuvvetlice vorteksleyin ve oda ısısında 30 dakika inkübe edin. Supernatantı yeni 1,5 ml tüpe aktarın;

• prostatik sıvı “Eppendorf” tüpte saklanan;


• seminal sıvı: yaklaşık 30 μl seminal sıvıyı polipropilen tüplere (1,5 ml) aktarın ve 70 μl steril tuz solusyonu ekleyin;

• servikal, üretral, konjonktival swablar*: nükleaz-free 1,5 ml tüpe swabı ekleyin ve 0,2 mL Transport medyum ekleyin. 15- 20 saniye boyunca ortamda swabı yavaşça sallayın.

* DNA ekstraksiyonu için DNA-Sorb-A (REF K-1-1/A) kit kullanılmalıdır. 48 saatten daha uzun olmamak kaydıyla örnekleri 2–8 °C de ya da daha uzun saklamak için –20/80°C de saklayın. Klinik örneklerin transportu, etiyolojik ajanların transportu için ülkesel, federal, lokal ve yasal düzenlemelere göre yapılmalıdır

ÖRNEK VE REAKTİF HAZIRLAMA 1. Lizis Solüsyonu ve Yıkama Solüsyonu (diğerleri +2-8°C de saklanmasına rağmen) buz kristalleri çözülene kadar 60–65°C ye kadar ısıtılır. Negatif Kontrol Ekstraksiyonu için bir tüp içeren 1,5 ml polipropilen tüplere gerekli miktarda hazırlayın. 2. Her bir tüpe 300 μl Lizis Solüsyonu ve 10 µl Internal Kontrol ekleyin. 3. Uygun tüplere 100 μl örnek ekleyin. 4. Aşağıdaki gibi Kontrolleri hazırlayın: • Cneg işaretli tüpüne 100 μl C– Negatif Kontrol ekleyin. 5.Tüpleri vorteksleyin ve 65°C de 5 dakika inkübe edin. 7-10 saniye santrifüj edin. Eğer örnek tamamen çözülmezse, maksimum hızda (12000-16000 g.) 5 dakika tüpleri tekrar santirifüj edin ve DNA ekstraksiyonu için yeni bir tüp içine supernatantı aktarın. 6. Sorbenti şiddetlice vorteksleyin ve her bir tüpe 25 μl ekleyin. 7. 5-7 saniye vorteksleyin ve tüm tüpleri oda ısısında 3 dakika inkübe edin. Bu adımı tekrar edin. 8. Tüm tüpleri 8000g de 30 sn santrifüj edin ve aerosol bariyerli mikropipet kullanarak pellete zarar vermeden her bir tüpten dikkatlice supernatantı atın. Yeni bir tüpe geçerken pipet ucunu değiştirin. 9. Her bir tüpe 300 μl Yıkama Solüsyonu 1 ekleyin. Şiddetlice vorteksleyin ve 8000g de 30 saniye santrifüjleyin. Her bir tüp için alın ve supernatantı atın. Tüpler arası geçişte pipet uçlarını değiştirin. 10.Her bir tüpe 500 μl Yıkama Solüsyonu 2 ekleyin. Şiddetlice vorteksleyin ve 8000g de 30 saniye santrifüjleyin. Her bir tüp için alın ve supernatantı atın. Tüpler arası geçişte pipet uçlarını değiştirin. 11. Adım 10 tekrar edin ve 65°C de 5 dakika açık kapakla bütün tüpleri inkübe edin. 12.Pelleti 50 μl DNA-eluent içinde yeniden suspense edin. 65°C de 5 dakika inkübe edin ve periyodik olarak vorteksleyin. 13. Maksimum hızda (12000-16000 g) 1 dakika boyunca tüpleri santrifüjleyin. Supernatant amplifikasyon için hazır DNA içerir. Eğer amplifikasyon aynı gün çalışılmayacaksa, işlenen örnekler 2-8°C’de 5 güne kadar yada –20°/-80°C’de dondurularak saklanabilir.

PCR PROTOKOLU:

1. Örnekler(N) ve kontroller (+2) için gerekli miktarlarda reaksiyon tüpleri hazırlayın. 2. 10*(N+1) µl PCR-mix-1-FRT, 5,0*(N+1) PCR-Buffer-FRT ve 0,5*(N+1) of TaqF DNA

Polymerase her örnek için steril yeni tüpte hazırlayın. Vokteksleyin ve 2-3 saniye santrifüjleyin. 3. Uygun tüplere 15 μl Reaction Mix ve 10 µl extracted DNA örneği ekleyin. Pipetleyerek karıştırın. 4. Her bir panel için 2 kontrol hazırlayın:

• Amplifikasyon Negatif Kontrol işaretli tüpe 10 µl DNA-buffer ekleyin; ● Amplification Pozitif Kontrol işaretli tüpe 10 µl Positive Control C+ ekleyin;

5. Termacycler içine tüpleri ekleyin. HSV, FAM (Green) kanalında ve IC DNA, JOE(Yellow)/HEX/Cy3 kanalında tespit edilir. SmartCycler aşağıdaki gibi programlayın: 1. Ana menüde Define Protocols (Protokoller tanımla) seçin ve sol alt köşedeki New Protocol (Yeni

protokol) seçeneğini seçin. Protokol için bir isim belirleyin ve aşağıdaki parametreleri ayarlayın:


2. Save Protocol (Protokol kaydet) seçin. 3. Ana menüden Create Run (Çalışma Oluştur) seçeneğini seçin ve Run Name (Çalışma ismi)

penceresinde deney için bir isim girin. 4. Dye Set (Boya Ayarı) düğmesini tıklayın ve FCTC25 seçin. 5. Add/Remove Sites (Ekle/Çıkar Site) seçin ve analiz için yeni bir pencerede Protokol ve Sites seçin.

OK tıklayın. 6. SmartCycler içine reaksiyon tüplerini koyun ve Start Run (Çalışmayı başlat) düğmesine basarak

deneyi başlatın. 7. View Results (Sonuçları gör) menüsünde Results Table (Sonuç tablosu) basın ve Sample ID (örnek

ID) kolonuna örnek isimlerini ekleyin. SONUÇ ANALİZİ 1. Analysis settings (Analiz ayarları) basın ve Manual Thresh Fluor Units kolonunda Fam ve Cy3

kanalları için 30’a threshold (eşik) çizgisinin değerini ayarlayın. Update Analysis (Analiz güncelleme) tıklayın.

2. Results Table (Sonuç Tablosu) menüsünde Save Run (Çalışmayı Kaydet) tıklayın. 3. Eğer FAM Std/Res kolonunda sonuçlar POZ (FAM Ct değeri sıfırdan farklıdır) olarak görünürse,

örnek Pozitif olarak düşünülür. Eğer IC’in Ct değeri 40 dan yüksekse, numunenin tekrar test edilmesi gerekir.

4. Eğer FAM Std/Res kolonundaki sonuçlar NEG (FAM Ct’in değeri=sıfır ) olarak ve СY3 Std/Res kolonundaki sonuçlar POZ olarak görünürse, örnek Negatif olarak düşünülür. Cy3 kanalda negatif örnek Ct değeri 40-42 döngü aralığında verimsiz bir DNA ekstraksiyonunu gösterir. (Eğer Ct > 40 se, örnek yeniden test edilmelidir).

5. Eğer FAM Std/Res kolonunda ve СY3 Std/Res kolondaki sonuçlar NEG (Ct = 0) olarak görünürse, sonuçlar geçersizdir. Örnek hazırlama ve amplifikasyona sahip test girişini tekrar edin.

6. Amplifikasyonun Pozitif ve Negatif Kontrolleri ve DNA izolasyonunun geçerli olduğunda, sonuç kabul edilir.

Tablo 2. Kontroller için sonuçlar Kontrol Kontrol adımı Ct kanal Fam(Yeşil) Ct kanal Cy3 Yorumlama NCS DNA izolasyonu NEG POZ Geçerli sonuç DNA-buffer Amplifikasyon NEG NEG Geçerli sonuç C+ Amplifikasyon POZ NEG Geçerli sonuç Örnek: FAM Kanal –HSV I/II DNA tespit (Pozitif Kontrol ve C+):


Cy3 Kanal– Internal Kontrol DNA tespit:

Rotor-Gene™ 3000/6000 ile Real Time Amplifikasyonu 1. Advanced sistemini programlayıp New Run penceresinde etkinleştirerek “Urogenital Assays” için bir

şablon oluşturun. Dual Labeled Probe/Hydrolysis probes seçin ve New düğmesini tıklayın. 2. Yeni bir pencerede karusel tipi 36-Well Rotor ya da 72-Well Rotor ve Reaction Volume (μL) 25 seçin. 3. Edit Profile penceresinde program “STD 65-60-45 RG-TaqF” ayarlayın (bu program bütün

Sacace™ Urogenital testleri için evrenseldir):

1. Bekleme: 95°С - 15 dk. 2. Döngü: 95°С - 20 sn.

65 °С - 20 sn. 72°С - 20 sn.

Döngü tekrarı – 10 kez 3.Döngü 2: 95°С - 20 sn.

60°С -30 sn.-Fam (Yeşil), Joe (Sarı) da tespit* 72°С - 15 sn. Döngü tekrarı – 35 kez

4. Floresan kanal duyarlılık düzenlemesi yapın: Channel Setup (Kanal Kurulum) →Calibrate (Kalibrasyon) (RG6000 için optimizasyon sağlayın) → Auto Gain Calibration (Otomatik Kalibrasyon Ayarı) (Optimizasyon) Setup (Kurulum) →Calibrate Acquiring (Kalibrasyon Elde edilmesi) (Optimizasyon Elde edilmesi) ve Perform Calibration (Perform Kalibrasyon) (Optimizasyon) 1. devralmadan önce seçin. Fam/Sybr (Yeşil) kanal için Min Okuma 5, Max Okuma 10 ve Joe (Sarı) kanalı için Min Okuma 4, Max Okuma 8 görünür. Tüp pozisyon kolonunda Rotor-Gene 2000/3000/6000 karuselinde tüp pozisyonunu programlayın (1ci pozisyon reaktifli reaksiyon tüpü içerir) Auto Gain Calibration Setup (Otomatik Kalibrasyon Ayarı Kurulumu) penceresini kapatın.

5. Program dosyaları / RotorGene 6 / Şablonları (RG6000 Program dosyası / RotorGene 6000 Software / Şablonlar için ) klosör içine kaydedin ve New Run Wizard penceresini kapatın. Yeni şablon New Run penceresinde şablon listesinde görünür ve tüm Sacace™ Real-TM Urogenital Testleri için kullanılabilir.

AMPLİFİKASYON VE TESPİTE BAŞLAMA 1. New Run penceresinde Quick Start (Advanced Start for RG6000) seçin ve “STD 65-60-45 RG-

TaqF”şablonlarından seçin. 2. Karusel tip seçin ve 36-Well Rotor için No Domed 0,2 Tüpler ya da 72-Well Rotor için Locking Ring

Attached işaretleyin. Next tıklayın. 3. Sample Setup penceresinde tüplerin pozisyonlarını programlayın. 4. Deneye başlamak için Next ve Start Run tıklayın.


ANALİZ SONUÇLARI: 1. Sonuçlar, threshold line (eşik çizgisi) ile flüoresan eğrisinin kesiştiği noktada Rotor-Gene 3000/6000

software ile yorumlanır. HSV I/II, FAM (Yeşil) kanalında, İnternal Kontrol, JOE (Sarı) kanalında tespit edilir.

2. Analysis bastıktan sonra Quantitation (Kantitasyon) düğmesini seçin. Fam(yeşil) kanalı (Cycling A FAM or Cycling A. Green for RG6000) için ve sonra JOE (Sarı) kanalı (Cycling A JOE or Cycling A. Yellow) için işlemi gerçekleştirin.

3. Fam(Yeşil) kanalı (HSV I/II ) için Dynamic Tube, More Setting (Outlier Removal for RG6000) 0%, and Threshold: 0,05 seçin.

4. JOE (Sarı) kanalı (IC) için Dynamic Tube, More Setting (Outlier Removal for RG6000) 5%, Threshold: 0,1 seçin.

5. Fam (Yeşil) kanalında (Quant. Resultes – Cycling A. FAM/Green) Ct < 33 değerli örnekler pozitif olarak yorumlanır.

6. JOE (Sarı) kanalında (Quant. Resultes – Cycling A.JOE/Yellow) Ct < 30 değerli örnekler ve Fam (Yeşil) kanalında flüoresan sinyal yoksa negatif olarak yorumlanır.

7. FAM (Yeşil) ve JOE (Sarı) (ya da Ct > 30) de sinyal bulunmayan örnekler geçersiz olarak yorumlanır.

Tablo 2. Kontroller için sonuçlar Kontrol Kontrol adımı Ct kanal Fam(Yeşil) Ct kanal Joe(Sarı) Yorumlama NCS DNA izolasyonu Sinyal yok < 30 Geçerli sonuç DNA-buffer Amplifikasyon Sinyal yok Sinyal yok Geçerli sonuç C+ Amplifikasyon < 30 Yok Geçerli sonuç Örnek

1, 4, 6, 9, 14 – pozitif örnek 2, 3, 5, 7, 8, 10-13 – negatif örnek


iQ iCycler™ ve iQ5 (Bio-Rad) ile Real Time Amplifikasyonu 1. Workshop’ün Edit Plate Setup modül penceresinde Fam ve Hex kanallarında bütün tüplerdeki

flüoresans sinyal tespitini ve tüp pozisyonlarını programlayın. Run with selected protocol (Seçilmiş protokol ile çalışma) düğmesini etkinleştirerek bu şemayı kullanın ve kaydedin. • iQ5 cihazı için Whole Plate loading (Tüm plakaları yükleme) sisteminde şemayı düzenleyin. Sample

Volume 25: μl, Seal Type: Domed Cap, Vessel Type: Tubes seçin. Save &Exit Plate Editing (Kayıt ve çıkış plaka düzenleme) düğmesini tıklayın.

2. iQiCycler ya da iQ5 da program “STD 65-60-45 iQ-TaqF” başlatın, View Protocols (protokol

görüntüleme) modülünde programı seçin veya oluşturun ve Run with selected plate setup (Seçilen plaka ayarı ile çalıştırma) düğmesini etkinleştirerek başlatın.

95°C – 13 dakika 30 sn. 10 Döngü: 95°C – 10 sn, 65°C – 20 sn, 72°C – 20 sn 35 Döngü: 95°C – 10 sn, 60°C – 30 sn, 72°C – 20 sn 2ci adımda (60°C) Fam ve HEX kanallarında flüoresans tespiti 3. Dynamicwf için aşağıdaki iQ iCycler ayarlarının seçili olduğundan emin olun:

4. Önceden oluşturulmuş modele göre termalcycler içine tüpleri transfer edin. 5. Select well factor source çizgisi altında Experimental Plate seçin ve reaksiyon hacmini 25 µl olarak

tercih edin (iQ iCycler için) 6. Run düğmesine basın. ANALİZ VERİLERİ Sonuçlar, eşik çizgisi ile flüoresan eğrisinin kesiştiği noktada “iQ iCycler” ya da “iQ5”software ile yorumlanır. HSV I/II , FAM kanalında ve IC DNA, HEX kanalında tespit edilir. Fam ve Hex kanalları için “Log View” düğmesi etkinleşir. Flüoresans eğrisinin doğrusal olduğu düzeylerde eşik çizgisine (farenin sol tuşu ile) yerleştirin.

• Fam (Select a Reporter penceresinde FAM-490 ) kanalında Ct değeri (Ct < 33) sıfırdan farklı ise, örnekler HSV I/II için pozitif olarak yorumlanır.

• HEX (Select a Reporter penceresinde HEX-530 ) kanalında Ct ≤ 33 ise ve FAM kanalında flüoresans sinyali yoksa örnekler negatif olarak yorumlanır.

• FAM ve HEX kanalında örneklerin Ct değeri yoksa ya da > 33 ise geçersiz olarak yorumlanır.

Tablo 2. Kontroller için sonuçlar Kontrol Kontrol adımı Ct kanal Fam Ct kanal HEX Yorumlama NCS DNA izolasyonu Sinyal yok ≤ 33 Geçerli sonuç (negatif) DNA-buffer Amplifikasyon Sinyal yok Sinyal yok Geçerli sonuç (negatif) C+ Amplifikasyon ≤ 33 Yok Geçerli sonuç (pozitif)


FAM Kanal– HSV DNA tespit

HEX Kanal – Internal Kontrol DNA tespit

B3, B4, B7 = Pozitif örnek; E2-E5 = Negatif örnek; D5 = Pozitif Kontrol; F4 = Negatif Kontrol Applied Biosystems® 7300/7500 Real Time PCR System Programı aşağıdaki gibidir: 1. Ana menü seçeneğinde “New” (Yeni) seçeneğini seçin ve yeni belgenin verilerini ayarlayın:

Assay (Test) penceresinde Absolute Quantitation (Mutlak kantitasyonu) seçeneğini, Template (Kalıp) penceresinde Blank Document (Boş Belge) seçeneğini seçin. OK tuşuna basın.

2. Tools (Araçlar) menüsündeki yeni pencerede Detector Manager (Dedektör Yöneticisi) düğmesini

tıklayın. 3. Pencerenin sol alt köşesindeki File (Dosya) tıklayın ve New (yeni) seçin. New detector (Yeni

dedektör) penceresinde probların özelliklerini ayarlayın: • “POZ” tespit: Name (isim) ve Description (açıklama) çizgileri POZ gösterir; Reporter

Dye – Fam ve Quencher Dye – None çizgisinde. Color (renk) (örneğin kırmızı) seçin. Create Another (Başka oluşturma) düğmesini tıklayın.

• New detector (Yeni dedektör) penceresine karşı açıldı. İnternal Kontrol için aşağıdaki parametreleri ayarlayın: Name (isim) ve Description (açıklama) çizgileri IC gösterir; Reporter Dye – Joe ve Quencher Dye – None çizgisinde. Color (renk) (örneğin mavi) seçin.

4. Prob bilgileri ile Detector manager (Dedektör yöneticisi) penceresini kapatın. 5. Instrument (Cihaz) penceresini seçin. 6. Thermal profile (Termal profil) aktif edin ve aşağıdaki amplifikasyon programını ayarlayın:


Aşama Profile Replikasyon

1 95°C – 15:00 1

95°C – 0:20

65°C – 0:20

2

72°C – 0:20

10

95°C – 0:25

60°C – 0:50*

3

72°C – 0:15

35

*Fam, Joe kanalında flüoresans belirlenir.

7. Reaksiyon hacmini 25 μl olarak seçin. 9600 Emulation seçin. 8. Oluşturulmuş dokümanı kaydedin: File menüsünde Save as... seçin, File type çizgisinde SDS Templates (*.sdt) seçin ve Save tıklayın. 9. Pencerenin sağ üst köşesinde Set up (Kur) seçin. Açılan Plate penceresinde planlanmış amplifikasyon hücreleri mouse ile seçin. View (Görüntüle) menüsünde Well inspector (Kuyu kontrolör) düğmesini tıklayın. 10. Add Detector (Dedektör ekle) düğmesini tıklayın ve Detector manager penceresinden POS ve IC probları seçin. Bunu yapmak için, mouse ile çizgileri seçin ve Add to Plate Document (Plaka dokümanı ekle) ve Done (Bitti) düğmesini tıklayın. 11. Well inspector (Kuyu kontrolör) penceresinin kullanılan sütununda POS ve IC probları seçin. 12. Passive Reference (Pasif Referans) çizgisinde pencerenin sağ alt köşesinde none (hiçbiri) ayarlayın. 13. Sample Name (Örnek ismi) alanına örneklerin isimlerini ekleyin.

ANALİZ SONUÇLARI 1. Sonuçlar, eşik çizgisi ile flüoresan eğrisinin kesiştiği noktada Applied Biosystems® 7300/7500 Real

Time PCR Systems software ile yorumlanır. Poz sonuç, FAM kanalında ve İnternal Kontrol , JOE kanalında tespit edilir.

a. Fam kanalında CT değeri Ct < 40 ise örnekler, Joe (IC) kanal sonuçlarına bakmaksızın Pozitif olarak yorumlanır.

b. Fam kanalında Ct (“Undet.”) yoksa ve Joe kanalında Ct < 40 ise örnekler Negatif olarak yorumlanır.

c. Eğer Fam kolonunda ve Joe kolonunda sonuçlar “Undet.” ya da Ct >40 olarak görünürse, sonuçlar geçersizdir. Örnek hazırlama ve amplifikasyonu içeren test girişini tekrarlayın.

2. Amplifikasyonun Pozitif ve Negatif Kontrolleri ve DNA izolasyonu geçerli olduğunda sonuçlar sadece önemli olarak kabul edilir.

MX3000P® ve MX3005P® (Stratagene) programı aşağıdaki gibidir:

1. Programı açın, “Quantitative PCR (Multiple Standarts)” seçin ve ‘OK’ tıklayın.

2. Pencerenin üst kısmındaki “Plate Setup”seçin.


3. “Well type” penceresinde örnekler için “Unknown” ayarlayın. 4. Pencerede “Collect fluorescence data” Fam ve Joe kanalında tüm örnekler için seçin. 5. Pencerenin sağ üst kısmındaki “Thermal Profile Setup” düğmesini seçin. 6. Amplifikasyonun aşağıdaki parametrelerini ayarlayın:

Bekleme 95°C – 15 dk Döngü 1 95°C – 20 sn 65°C – 30 sn 72°C – 20 sn Döngü Tekrarı– 10 kez Döngü 2 95°C – 25 sn 65°C – 50 sn* 72°C – 20 sn Döngü Tekrarı – 35 kez

*Flüoresans 2ci döngüde 65°C’de ölçülür. 7. “Run” düğmesini tıklayın, deney için bir isim girin ve kaydedin. ANALİZ SONUÇLARI 1. Ampifikasyon bittikten sonra, pencerenin sol üst kısmındaki “Analysis” düğmesini seçin. 2. “Results” düğmesini seçin. 3. “Area to analyze” penceresinin sağ açı kısmında “Amplification plots” seçin. 4. Sonuçlar, eşik çizgisi ile flüoresan eğrisinin kesiştiği noktada cihazın software ile yorumlanır. HSV ,

FAM kanalında ve Internal Control, JOE kanalında tespit edilir. 5. IC inhibisyonu, HSV ilk yüksek konsantrasyonlu örneklerde oluşabilir. 6. Fam kanalında Ct<40 değerli örnekler, Joe (IC) kanal sonuçlarına bakmaksızın HSV için pozitif

olarak yorumlanır. 7. Fam kanalında Ct değerli örnekler yoksa veya Ct>40 değerli örnekler HSV için negatif olarak

yorumlanır. 8. FAM ve JOE kanallarda sinyal veren örnek yoksa geçersiz olarak yorumlanır. Tablo 2. Kontroller için sonuçlar Kontrol Kontrol adımı Ct kanal Fam Ct kanal Joe Yorumlama NCS DNA izolasyonu NEG POZ Geçerli sonuç DNA-buffer Amplifikasyon NEG NEG Geçerli sonuç C+ Amplifikasyon POZ NEG Geçerli sonuç ÖZELLİKLER Analitik özgüllük Primerler ve probların analitik özgüllüğünü 100 negatif örnek ile doğrulanmıştır. Bu örnekler spesifik HSV 1/2 primerler ve problar ile sinyal vermezler. Kit HSV 1/2 Real-TM ’ın potansiyel çapraz-reaktivitesi kontrol grubuna karşı aşağıdaki tabloda test edilmiştir. IC sonuçlar, Joe kanalında yorumlandığında HSV 1/2 sonucu Fam kanalında yorumlandı. Diğer patojenler ile herhangi bir çapraz-reaktivite gözlenmedi. Tablo 1: Başka patojenler ile kitin özgüllük testi: Kontrol Grubu HSV

Fam Internal Kontrol

Joe/Cy3 Neisseria gonorrhoeae - + Ureaplasma urealyticum - + Gardnerella vaginalis - + Cytomegalovirus - + Epstein Barr virus - +


Mycoplasma hominis - + Candida albicans - + Streptococcus pyogenus - + Treponema pallidum - + Listeria monocytogenes - + Chlamydia trachomatis - + HPV (11, 16, 18, 31,33) - + Mycoplasma genitalium - + Analitik duyarlılığı ve tekrarlanabilirliği . HSV 1/2 Real-TM kitin analitik duyarlılığı HSV ½’in Standart DNA kullanılarak tespit edildi. Bu standart DNA-buffer da seri şekilde dilüe edildi. Bu deneyin sonuçları aşağıdaki tabloda özetlenmiştir. Tablo 2: Kit HSV 1/2 Real-TM’in analitik duyarlığı

Kit HSV 1/2 Real-TM analitik duyarlılığı, 500 kopya/ml daha azdır. Hedef bölge: glikooprotein SORUN GİDERME

1. Ekstraksiyonun Negatif Kontrolu için IC (Joe/Hex/Cy3 kanal) sinyal vermez ya da zayıf verir. • PCR inhibe olur.

⇒ Size önerilen DNA ekstraksiyon yöntemini kullandığınızdan ve üreticinin talimatlarını izlediğinizden emin olun.

⇒ Ekstre edilmiş DNA pipetlenmeden önce maksimum hızda (12000-16000 g) 2 dakika boyunca bütün tüpleri tekrar santrifüj edin ve dikkatlice süpernatantı alın. Reaksiyonda inhibe olan sorbent pellete dokunmayın.

• Reaktif saklama koşulları talimatlara uygun değildir. ⇒ Saklama koşullarını kontrol edin.

• PCR koşulları talimatlara uygun değildir. ⇒ PCR şartlarını ve protokolde rapor edilmiş flüoresans kanalını IC tespit için

seçin. • Reaktifleri pipetleme işlemi sırasında örneğe IC eklenmedi.

⇒ DNA ekstraksiyon prosedürü sırasında dikkat edin.

2. Pozitif control sinyal vermez ya da zayıf verir. • PCR koşulları talimatlara uygun değildi.

⇒ Amplifikasyon protokolunu kontrol edin ve manuel’de rapor edilmiş fluoresans kanalını seçin.

3. Negatif Kontrol ekstraksiyonu ile Fam sinyal verir. • DNA ekstraksiyon prosedürü sırasında kontaminasyon olabilir. Tüm örneklerin sonuçları

geçersizdir. ⇒ Sodyum hipoklorit ve etanol ile cihazın tüm yüzeyleri dekontamine edin. ⇒ Ekstraksiyon prosedürü sırasında sadece filtre uçları kullanın. Tüpler arası

geçişte uçları değiştirin. ⇒ Reaktiflerin yeni bir seti ile DNA ekstraksiyonunu tekrar edin.

4. PCR Negatif Kontrolu (DNA-buffer) ile herhangi bir sinyal verir.

Konsantrasyon (kopya/ml) Test sayısı Pozitif sonuç sayısı 5x103 5 5 103 5 5

5x102 5 5 2,5 x 102 5 1

0 5 0


• PCR hazırlık işlemi sırasında kontaminasyon olabilir. Tüm örneklerin sonuçları geçersizdir.

⇒ Sodyum hipoklorit ve etanol veya özel DNA dekontaminasyon reaktifleri ile cihazın tüm yüzeyleri dekontamine edin.

⇒ Sonunda Pozitif kontrolü pipetleyin. ⇒ Reaktiflerin yeni bir seti ile PCR hazırlanmasını tekrar edin.

*iCycler and iQ5 are trademarks of Bio-Rad Laboratories * The Rotor-Gene™ Technology is a registered trademark of Corbett Research * SmartCycler® is a registered trademark of Cepheid * Applied Biosystems® is trademarks of Applera Corporation

Sacace Biotechnologies Srl 18 San Carlo str., 81100 Caserta, Italy

*PCR: The Polymerase Chain Reaction (PCR) process is covered by patents owned by Hoffmann-La Roche and applicable in certain countries. Sacace does not encourage or support the unauthorized or unlicensed use of the PCR process. Use of this kit is recommended for persons that either have a license to perform PCR or are not required to obtain a license

RotorGene™ 3000/6000 (Corbett Research), SmartCycler...

Documents

Transcript of RotorGene™ 3000/6000 (Corbett Research), SmartCycler...