RNA silencing:

Small RNAs as Ubiquitous Regulators of Gene Expression

Skematisk opdeling af små RNAer

• Box 1. A guide to 21–25nt RNAs.• Short interfering (si)RNA• Double stranded with 3 overhangs of two nucleotides• Perfectly complementary to target RNA• Directs endonucleolytic cleavage• Precursor:• Perfect or nearly perfect RNA duplex• Chromosomal or cytoplasmic• 25 base pairs in length• Micro (mi)RNA• Single stranded• Partially complementary to target RNA• Unknown mechanism of action• Often conserved between species or even across phyla• Precursor:• Bulged, partially double-stranded RNA• Chromosomal (IGR)• 70 nucleotides in length

Skematisk opdeling af små RNAer fortsat

•Short temporal (st)RNA

•Single stranded

•Partially complementary to target RNA

•Inhibits translation initiation

•Highly conserved between species and across phyla

•Precursor:

•Bulged, partially double-stranded RNA

•Chromosomal (IGR)

•70 nucleotides in length

Biologiske effekter af små ikke-kodende RNAers silencing

aktivitet:• Beskyttelse af genomet mod mobile DNA

elementer

• Antiviralt forsvar; mange hvilke producerer dsRNAer i replikationsprocessen

• Regulering af eget genom

• Formation af konstitutivt heterokromatin fx set i centromer- og telomer-regioner

Short temporal RNAs (stRNA) i C.elegans

• Eksempler: lin-4 og let-7• De koder ikke for proteiner og udtrykkes i specifikke

larvestadier• Deres sekvenser complementerer 3’ UTRs af flere

target mRNAer involveret i ”developmental-timing pathways” kendte for effekt på translationseffektivitet og transkriptstabilitet

• Ekspression af lin-4 og let-7 sammenfalder med repression af disse mRNAer

• og Repressionen menes at igangsættes af base-parring mellem stRNA dens target-mRNA

stRNAer i C. elegans fortsat

• Effekt af loss-off-function mutationer: ændret celledeling og ”cell-fate determinering”

• 22 nt lange• Dannet udfra ca. 70 nt lange, delvist ds, bulede hårnåle-

strukturerede precursor RNAer• DCR-1aktivitets-knockout resulterer i samme

fænotyper som lin-4 og let-7-mutanter. RNAi er sandsynligvis krævet for modning af stRNA-precursoren

• lin-4 og let-7 loci er placeret ”intergenic regions” (IGR) og har ingen ORFs (dette gælder alle små RNAers loci)

stRNAer i C. elegans fortsat

• Eksempler på target er regioner med retrotransposon LTRs, hvor flere nærliggende meiotiske gener represseres.

• LTRs har derfor muligvis en regulerende effekt på gen-ekspression ved cellulær differentiering

• Typisk karaktertræk i de represserede områder er hypermethylering og hypoacethylering af DNA i specifikke mønstre

• Ødelæggelse af mønsteret sammenfalder med mobilisering af transposons. Bekræfter transposons represserende rolle.

RNAi (interference)-systemet

• RISC: RNA-induced silencing complex, afgørende rolle i modning af små ikke-kodende RNAer

• Tre vigtige og evolutionært konserverede gener er (navnene er fra S. pombe):

1. ago1, som er en del af RISC (Argonaute) 2. Dcr1, en RNAaseIII helicase (Dicer)3. Rdp1, RNA-directed RNA polymerase (RdRP)• Analoger af disse gener er fundet i bl.a.

Arabidopsis, ris, C. elegans og Drosophila

stRNA pathway i C. elegans

Micro RNAs (miRNA) i dyr

• miRNAer danner ikke perfekte Watson-Crick-hybrider med deres target mRNAer

• miRNA er kodet af egne gener og regulerer gener forskellige fra disse

• Mange targets er faktorer, der kontrollerer processer involveret i developmentale og fysiologiske processer og er ofte transkriptionsfaktorer

• RNAi og Dicer-analoger er krævet for modning af miRNA fra ca. 70 nt precursor med hårnåle-struktur

miRNAer i dyr (fortsat)

• Precursor dannes fra et længere transcript kaldet pri-miRNA.Dette sker i nucleus.

• Pre-miRNA fungerer så som substrat for nuclear transport, og i cytoplasma dannes mi-RNA fra pre-miRNA

• Nogle miRNA-gener ligger tæt sammen, hvilket foreslår, de er transkriberede som et polycistronisk transkript, der potentielt tillader deres koordinerede regulering og effekt

• Størstedel af locierne er placeret i IGR eller introns og udtrykkes som uafhængige transkripter

miRNAer i dyr (fortsat)

• targets findes som ved stRNAer bla. i regioner med retrotransposon LTRs hvor flere nærliggende meiotiske gener represseres og i UTR-motiver som har effekt på translationseffektivitet og transkriptstabilitet.

• LTRs har derfor muligvis en regulerende effekt på gen-ekspression ved cellulær differentiering

• Typisk karaktertræk i de represserede områder er hypermethylering og hypoacethylering af DNA i specifikke mønstre (TGS)

miRNAer i dyr (fortsat)

• Ødelæggelse af mønsteret sammenfalder med mobilisering af transposons. Bekræfter transposons represserende rolle.

• Pga. effekten af LTR synes det muligt at effekten af miRNA og RNAi ikke kun er target mRNA-degradering (PTGS) men også også TGS via fx DNA- eller histon-modifikationer som det ses ved siRNAer

Short interfering RNAs (siRNA) i S. pombe

• siRNAer medierer silencing i trans af de samme (eller meget lig) gener, som de oprinder fra. Dvs. de laver perfekt (eller næsten) baseparring med target

• Dannes udfra > 25 nt precursor-mRNA. I hårnålestruktur eller som ds RNA dannet fra transkription af både sense og antisense-streng

• RISC og en histon methyltransferase (CLR4) er krævet for dannelse af i hvert tilfælde nogle af siRNAer

• De er dobbeltstrengede indtil de bliver delt i RISC

SiRNA i S.pombe fortsat

• Generne (og derfor også targets) er fundet i områder med repetitivt satellit-DNA og transposable elementer med LTRs i fx telomerer, centromerer og Mating type-region; regioner med konstitutivt heterokromatin

siRNAer i S.pombe fortsat

• Typisk karaktertræk i de represserede områder er hypermethylering og hypoacethylering af histoner i specifikke mønstre (histone code). Ødelæggelse af mønsteret sammenfalder med mobilisering af transposons. Bekræfter transposons represserende rolle.

SiRNA i S.pombe fortsat

• Fra generne dannes overlappende transkripter • siRNA kan kun dirigere og initiere silencing ikke

sprede denne. Til dette kræves andre faktorer bla. Swi6, Clr3-6 og igen Clr4

• Der er fundet lignende sammenhænge mellem gen-silencing-mekanismer, retrotransposon-silencing og centromerisk satellit-repeat heterokromatin i pattedyr. Om RNAi er involveret vides ikke

siRNA pathway i S.pombe

Endogene små RNAer i planter der ligner dyrs siRNAer mest

• Mange og diverse former i forhold til små RNAer i dyr

• En lille RNA kan have flere targets = Potentiel regulering af flere gener samtidigt via simpelt system

• Langt størstedelen af de små RNA-gener er fundet i IGR og transkriberes uafhængigt

• De små RNA udviser vævsspecifik akkumulering, hvilket tyder på kompositionen af disse er unik i forskellige celle- og vævstyper

Endogene små RNAer i planter der ligner dyrs siRNAer mest

• Fra generne sker en overlappende transkiption (små RNA-sekvenser overlapper). Dette ses kun hos siRNA hos dyr

• De små RNAer forkommer i både sense- og antisense-orientering (også kun hos siRNA hos dyr). Andre små RNAer forkommer kun i sense-orientering

• Der er perfekt baseparing mellem RNA og target og har derfor effekt på eget eller meget nært beslægtede gener (også kun hos siRNA hos dyr)

Endogene små RNAer i planter der ligner dyrs siRNAer mest

• Plante-RNAers precursors er mere heterogene end dyrs men har også hårnåle-strukturer

• Targets er både i nontransposon proteinkodende gener og

• Proteinkodende gener fra LTR, non-LTR retrotransposons og transposons

Små RNAer i planter med fællestræk til dyre-miRNAer

• Gener fundet i IGR og protein-kodende gener • De udtrykkes i forskellige udviklingsstadier • Dicer-analog (CAF) fundet værende nødvendig

for miRNAs effekt. Tilhørende familie af fire proteiner, som alle har a.a. domæner karakteristiske for Drosophila-DICER.

Små RNAer i planter med fællestræk til dyre-miRNAer

• CAF er impliceret i stamcelle-skæbne

• Analogien antyder en lignende mekanisme i planter

• Targets er UTR, splice sites, regioner af kodende mRNAer og promoter-regioner

Små RNAers regulering af gen-ekspression hos planter

Yderligere kompleksitet:små RNAer i forskellige str.klasser

• To str.klasser af siRNAer fundet i Arabidopsis.

• Lange (24-26 nt). Behøves for systemisk (celle-celle) silencing i Nicotiana benthamiana og methylering af retroelement i Arabidopsis

• Lange siRNAer er unødvendige for mRNA-degradering

Yderligere kompleksitet:små RNAer i forskellige str.klasser

• Korte (21-22 nt) siRNAer behøves for mRNA- degradering

• Korte siRNA er unødvendige for effekterne set for de lange siRNAer

• Forskellige str. foreslår forskellige Dicer-analoger med fx specifikke subcellulære lokaliseringer. Forskellige str. siRNA deltager i forskellige grene af RNA-silencing pathway

Yderligere kompleksitet: epigenetisk kontrol

• Lange siRNAer involveret i retrotransposon-methylering kan blive produceret af en nuclear Dicer-homolog

Konklusion

• Som Peter sagde…

Amerikanernes definition af ikke-kodende RNA som værende noget ”junk” har intet på sig!