Revista Cubana de Farmacia,1/2001

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VOLUMEN 35 No. 1 ENERO- ABRIL , 2001 SUMARIO . CONTENTS ARTÍCULOS ORIGINALES NUEVA TECNOLOGÍA PARA LA PRODUCCIÓN DE JARABE DE SALBUTAMOL New technology for the production of salbutamol syrup Iván G. Morales Lacarrere, Alfredo J. Fernández Serret, Gastón García Simón y Esther Alonso Jiménez 7 EVALUACIÓN COMPARATIVA DE LA LIBERACIÓN IN VITRO DE METILDOPA DE PRODUCCIÓN NACIONAL CONTRA ALDOMET ® Comparative evaluation of the in vitro release of methyldopa of national production against aldometâ Diana Pereda Rodríguez, Néstor Pérez Souto, Lisette Martínez Miranda y Aleyda Chang Valdés 13 ESTABILIDAD DE TABLETAS DE RIFAMPICINA 300 mg Stability of rifampicine tabs, 300 mg Lisette Martínez Miranda, Maricela Lara Castro y Matilde Torres García 18 COMPORTAMIENTO DE LA PENDIENTE EN EL ENSAYO DE LINEALIDAD DEL RAPIGLUCO-TEST Behavior of the slope in the lineality test of the RapiGluco-Test María Victoria Licea Tornés y Marcia Martínez de Santelices Cuervo 23

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VOLUMEN 35 No. 1 ENERO - ABRIL , 2001

SUMARIO . CONTENTS

ARTÍCULOS ORIGINALES

NUEVA TECNOLOGÍA PARA LA PRODUCCIÓNDE JARABE DE SALBUTAMOL

New technology for the production of salbutamol syrupIván G. Morales Lacarrere, Alfredo J. Fernández Serret, Gastón García Simón

y Esther Alonso Jiménez

7

EVALUACIÓN COMPARATIVA DE LA LIBERACIÓN IN VITRO DEMETILDOPA DE PRODUCCIÓN NACIONAL CONTRA ALDOMET®

Comparative evaluation of the in vitro release of methyldopaof national production against aldometâ

Diana Pereda Rodríguez, Néstor Pérez Souto, Lisette Martínez Miranda

y Aleyda Chang Valdés

13

ESTABILIDAD DE TABLETAS DE RIFAMPICINA 300 mgStability of rifampicine tabs, 300 mg

Lisette Martínez Miranda, Maricela Lara Castro y Matilde Torres García

18

COMPORTAMIENTO DE LA PENDIENTE EN EL ENSAYODE LINEALIDAD DEL RAPIGLUCO-TEST

Behavior of the slope in the lineality test of the RapiGluco-TestMaría Victoria Licea Tornés y Marcia Martínez de Santelices Cuervo

23

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TÉCNICA ANALÍTICA PARA EL ESTUDIO DE ESTABILIDADDEL CROMOGLICATO DE SODIO(CÁPSULAS PARA INHALACIÓN)

Analytical technique for the stability studyof sodium chromoglycate

Liana Liz Pérez Suárez, Alfredo Fernández Serret y Esther Alonso Jiménez28

VALIDACIÓN DE LA LIMPIEZA DEL REACTOR EMPLEADOEN LA PREPARACIÓN DE MEDICAMENTOS

Validation of the cleaning of the reactor used in thepreparation of drugs

Lisseux Castilla Valentín, Zulema Hevia Santamarina, Miriam Díaz de Armase Irene Walker Gómez

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EFICACIA CLÍNICA E INMUNOLÓGICA DEL IGEGAM ENPACIENTES ANCIANOS CON INFECCIONES RESPIRATORIASClinical and immunological efficiency of the IGEGAM in elderly

patients with respiratory infectionsLourdes Rodríguez Domínguez, Vicente R. Caro Machado, Reinaldo L. Rivero

Reyes y Florentina Azcuy Hernández 40

PRODUCTOS NATURALES

RENDIMIENTO DE ACEITE ESENCIAL EN PINUS CARIBAEAMORELET SEGÚN EL SECADO AL SOL Y A LA SOMBRA. III

Yield of essential oil in Pinus caribaea Morelet according to dryingin the sun and in the shadow

Rolando Quert Álvarez, Migdalia Miranda Martínez, Benito Leyva Córdova, Humberto GarcíaCorrales y Fisma Gelabert Ayón

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EXTRACTO ETÉREO DE FRUTOS DE BROMELIA PINGUIN L.(PIÑA DE RATÓN) POR EL SISTEMA ACOPLADO CG-EM

Ethereal extract from fruits of Bromelia pinguin L. (“piña de ratón”)by the CG-EM coupled system

Juan Abreu Payrol, Migdalia Miranda Martínez y Janet Lora García51

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ACTIVIDAD FARMACOLÓGICA PRELIMINAR DEL FRUTODE BROMELIA PINGUIN L. (PIÑA DE RATÓN)

Preliminary pharmacological activity of the fruitof Bromelia pinguin L. (“piña de ratón”)

Juan Abreu Payrol, Migdalia Miranda Martínez, Griset Toledo Carrabeoy Osmaida Castillo García

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ALCALOIDES EN LA ESPECIE CUBANA CROTONMICRADENUS URB.

Alkaloids in the Cuban species Croton micradenus Urb.Armando Payo Hill, Daisy Sandoval López, Hermán Vélez Castro

y Marledis Oquendo Suárez61

ARTÍCULO DE REVISIÓN

ENSAYOS FARMACOLÓGICOS IN VITRO PARA EVALUARACTIVIDAD ANTIGIARDIÁSICA

In vitro pharmacological tests to evaluatethe antigiardial activity

Marta Guerra Ordóñez66

FARMACODIVULGACIÓN

VITAMINAS Y MINERALES CONTRA EL ESTRÉSVitamins and minerals against stress

José Antonio Espinosa Hernández y Manuel Cué Brugueras74

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Rev Cubana Farm 2001;35(1):7-12

Artículos Originales

Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos

NUEVA TECNOLOGÍA PARA LA PRODUCCIÓN DE JARABEDE SALBUTAMOL

Iván G. Morales Lacarrere,1 Alfredo J. Fernández Serret,1 Gastón García Simón1 yEsther Alonso Jiménez2

RESUMEN

Se presenta una nueva tecnología para la producción del jarabe de salbutamol,con el propósito de eliminar los problemas de estabilidad químico-física quepresentaba la formulación anterior y, como consecuencia de esto, su vida útil norebasaba los 6 meses. Se logró obtener una nueva formulación que cumplió contodas las especificaciones de calidad exigidas para este medicamento. Se demostróque su vida útil se incrementó hasta 2 años almacenado a temperatura ambienteen su envase original.

DeCs: ESTABILIDAD DE MEDICAMENTOS; TECNOLOGIAFARMACEUTICA; QUIMICA FARMACEUTICA/métodos; COMPOSICION DEMEDICAMENTOS/métodos; ASMA/quimioterapia; ALBUTEROL/farmacología;ALBUTEROL/farmacocinética.

El salbutamol es una fenilalquilaminaque se utiliza ampliamente, en forma desulfato, como broncorrelajador en eltratamiento del asma y otras afeccionesagudas de los espasmos bronquiales. Esun agente simpaticomimético de accióndirecta, con actividad predominanteadrenérgica y selectiva sobre receptores β

2.

Su amplio uso se justifica por la menorincidencia de reacciones adversas que semanifiestan cuando se compara con elisoproterenol o la adrenalina. No obstante,la formulación actual presenta problemasde estabilidad químico-física que provocaque la vida útil del medicamento no rebaselos 6 meses.

1 Investigador Agregado.2 Técnica en Tecnología Farmaceútica.

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De la revisión bibliográfica realizadasobre el tema, se infiere que la estabilidadquímico-física del jarabe ha sido pocoestudiada y solo se encuentra escasaliteratura que aporta algunos datos sobrela cinética de descomposición del principioactivo mediante una vía oxidativa.

En 1976, Wall y Sunderland1 publicaronun estudio realizado en soluciones acuosasde sulfato de salbutamol, tamponada confosfatos a pH: 6,9; 7,1; 8,2 y 8,3 y en solucionesde dextrosa al 5 %; ellos encontraron que ladegradación del salbutamol seguía unacinética de seudo-primer orden y que latemperatura y el pH tenían un marcado efectoen la estabilidad de sus soluciones acuosas.También plantearon que las solucionesacuosas de salbutamol no debían formularsea pH aproximado al neutro.

Hakes, Corby y Meakin,2 en 1979,demostraron que el método colorimétrico deWall y Sunderland sobreestimaba elcontenido real de salbutamol en la muestra,al compararlo con el método de cromatografíalíquida de alta resolución (HPLC) quedesarrollaron para la determinación delprincipio activo y, por tanto, lo consideraroninadecuado para los estudios de estabilidad.

En 1980, Hakes, Meakin y Winterbon,3

demostraron los efectos que producen losazúcares sobre la estabilidad de lassoluciones de sulfato de salbutamol. Paraello realizaron un perfil de pH comprendidoentre 1 y 10, encontrando que entre 3 y 4era el intervalo de máxima estabilidad delprincipio activo. En relación con la sacarosa,que constituye un componente casi obligadode los jarabes, a pH 7,0 no afectó la estabilidaddel salbutamol, pero a pH 3,5 sufre hidrólisis,generando sus 2 unidades estructurales,glucosa y fructosa, que interactúan con elprincipio activo. Plantearon que para estainteracción se requiere que la molécula delazúcar se encuentre en forma acíclica conun grupo carbonilo libre.

El objetivo fundamental del presentetrabajo consistió en la obtención de una nuevatecnología para la elaboración del jarabe desalbutamol, con una vida útil mayor, es decir,

con la conservación de su actividad terapéuticadurante un período más prolongado.

MÉTODOS

Se realizaron los ensayos de prefor-mulación teniendo en cuenta el pH de mayorestabilidad del principio activo en el jarabe,la utilización de un antioxidante adecuadoy la sustitución de la sacarosa como agenteedulcorante. Todas las materias primasutilizadas cumplieron con las especi-ficaciones de calidad farmacéutica. De formaparalela se desarrolló la técnica de prepa-ración, haciéndose los ajustes necesarioscuando estos procedían. Del estudio depreformulación se seleccionó la formulaciónmás prometedora, ensayo No. 16, paracontinuar el nuevo diseño tecnológico.

Para el estudio de la estabilidad químicade la formulación seleccionada se desarrollóun método analítico, mediante la HPLC,debidamente validado; se empleó el métodode estabilidad acelerada a temperaturas de40, 50, 60 y 70 °C, con la aplicación de la leyde Arrhenius para la extrapolación y laconsiguiente predicción de la vida útil. Secorroboró esta predicción por el método devida de estante que se desarrollóparalelamente. Los valores obtenidos seprocesaron con la ayuda de un programacomputadorizado.

Se efectuó la comprobación de laefectividad antimicrobiana del agenteutilizado; primero se realizó un conteo demicroorganismos y luego se contaminó elproducto con 500 000 a 1 000 000 demicroorganismos por mililitros quecontenían cepas de B. subtilis, S. aureus, P.aeruginosa, E. coli, C. albicans y A. niger,las que se sembraron inmediatamente des-pués de la contaminación y a los 7, 14, 21 y 28 d.

Se realizó la comprobación del efectoterapéutico de la formulación seleccionadaen animales de experimentación. Para ellose utilizaron curieles albinos con masacorporal entre 250 y 350 g, que recibieronpor vía oral mediante cánula intragástrica

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2 y 4 mL del medicamento de acuerdo conel tratamiento a utilizar previamenteseleccionado. Para cada animal se midió eltiempo, en segundos, que demora en caerdesde la entrada a la cámara donde recibe elaerosol de histamina (0,1 %) hasta la caídade este, así como el tiempo que demora enmorir dentro de la mencionada cámara. Losresultados fueron procesados medianteANOVA, clasificación simple y la pruebade los intervalos múltiples de Duncan.

En el escalado industrial realizado secorroboró la factibilidad de la extrapolaciónde la nueva tecnología.

RESULTADOS

De los ensayos de preformulaciónrealizados se seleccionó el No. 16, cuya com-

posición es la siguiente: sulfato de salbu-tamol como principio activo y, comosustancias auxiliares, ácido benzoico, hidro-xipropilmetilcelulosa, alcohol etílico,hipofosfito sódico, ácido cítrico, citrato desodio, edetato de sodio, fresa sabor, rojoamaranto, talco, sacarina sódica y aguadesionizada. La técnica de preparación dela formulación seleccionada se mostróadecuada para lograr obtener el jarabe.

Los resultados del estudio de esta-bilidad acelerada se presentan en la tabla 1,en la que se observan los datos obtenidosen las diferentes temperaturas de estudio,el orden de la reacción de degradación, asícomo la ecuación de la ley de Arrhenius yla extrapolación del tiempo de vida útil parauna degradación límite del 90 % a latemperatura de 25 °C. La figura 1 representalas 4 isotermas utilizadas en el estudio y lafigura 2, la ecuación de Arrhenius.

TABLA 1. Análisis acelerado de estabilidad. Salbutamol jarabe, ensayo No. 16

40 °C 50 °C 60 °C 70 °C t Conc t Conc t Conc t Conc

0,0 100,00 0,0 100,00 0,0 100,00 0,0 100,0025,0 98,70 25,0 97,10 42,0 96,70 6,0 99,8042,0 98,40 42,0 96,80 55,0 92,30 25,0 95,8087,0 95,90 87,0 91,30 101,0 87,00 42,0 93,00

150,0 94,80 123,0 90,60 123,0 84,40 87,0 86,90150,0 88,90 150,0 84,00 101,0 86,30

150,0 82,60

Datos experimentales (días - %)Datos: salbutam. STB.

Orden de la reacción: 1

40 °C 50 °C 60 °C 70 °C

K 0,0004 0,0008 0,0013 0,0013log k + 4 0,5613 0,8958 1,1076 1,12741/T * 1 000 3,19 3,10 3,00 2,92

R = - 0,9469Ea = 9472,5 cal/molA = 1743,164

Ecuación de Arrhenius:1og k = 3,2413 - 2070,0020 * 1/T

Tiempo de estabilidad con límite de degradación 90,0 %Temperatura k Días Años

25,0 0,000197253 183-534 0,5 - 1,5

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FIG. 1. Representación de las4 isotermas empleadas. Jarabede salbutamol, ensayo No. 16.

FIG. 2. Representación de laecuación Arrhenius. Jarabe desalbutamol, ensayo No. 16.

El estudio de estabilidad por vida deestante, con vistas a precisar el tiempo devida útil del medicamento, se presenta en latabla 2, en la que se observan los resultadosobtenidos con el ensayo No. 16 y susréplicas 18 y 19, en relación con la valo-ración del principio activo expresada entanto por ciento y el pH, transcurridos

6, 12, 18 y 27 meses desde la elaboracióndel jarabe.

Los resultados de la comprobación dela efectividad antimicrobiana del agenteutilizado en el jarabe se indican en la tabla 3.

Los resultados del efecto terapéuticodel jarabe se indican en las tablas 4 y 5. Enla tabla 4 se presenta el tiempo que demoran

1,91

1,94

1,97

2,00

2,03

2,06

0Tiempo (días)

32 64 96 128 160

Conc

. (%

) -[L

og (

c)]

400

500

600

562,91

1/T X 1 000

Log

(k) +

4 x

100

2,97 3,03 3,09 3,15 3,21

68

80

92

104

116

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TABLA 2. Resultados analíticos del estudio de estabilidad por vida de estante

Tiempo (meses) 6 12 18 27 Ensayo Valoración Valoración Valoración Valoración No. (%) pH (%) pH (%) pH (%) pH

16 95,2 3,5 94,6 3,5 94,3 3,4 90,0 3,618 93,3 3,5 93,2 3,5 90,0 3,4 90,2 3,619 94,8 3,5 94,4 3,5 90,6 3,4 90,1 3,6

Límites: pH: 3,4 - 3,8; valoración: 90,0 - 110,0 %; tiempo de vida útil: 2 a.

TABLA 4. Tiempo medio en segundos que demoran en caerlos animales

II III I SB-16 SB-16

Grupo Control (4 mL) (2 mL)

Tiempomedio 45 171 145

en caer los animales desde la entrada a lacámara con un aerosol constante dehistamina al 0,1 %, y en la tabla 5, el tiempoque demoran en morirse en la mencionadacámara.

El escalado industrial se desarrollósatisfactoriamente, sin que se presentarandificultades tecnológicas en ninguno de lospasos de que consta la técnica de preparación.

DISCUSIÓN

La fórmula y técnica de preparacióndesarrolladas en el ensayo No. 16 demos-traron ser adecuadas para lograr una nuevatecnología en la elaboración del jarabe desalbutamol, ya que el producto terminadocumplió con todas las especificaciones decalidad exigidas para este medicamento.

El estudio de estabilidad aceleradamostró una cinética de degradación deprimer orden como puede ser observado enlas isotermas de la figura 1, que presentanuna tendencia lineal en la gráfica deconcentración vs. tiempo, con una altapotencia de correlación. La figura 2 nosmuestra la gráfica de Arrhenius, cuyaextrapolación a 25 °C, para un límite dedegradación del 90,0 %, es de 1,5 a de vidaútil del medicamento.

El estudio de estabilidad por vida deestante realizado con vistas a precisar eltiempo de vida útil del jarabe en los ensayos16, 18 y 19 (tabla 2), mostraron que tanto elpH como la valoración en tanto por cientodel principio activo se encontraron dentro delos límites establecidos para el medicamentodecursados 27 meses después de comenzadodicho estudio; de igual manera se comportaronsus características organolépticas, ya que

TABLA 5. Valor medio del tiempo de muerte en segundos

II IIII SB-16 SB-16

Grupo Control (4 mL) (2 mL)

Tiempomedio 201 402 341

TABLA 3. Resultados de la efectividad antimicrobiana delagente utilizado en el ensayo No. 16 de jarabe de salbutamol

Siembra (días)

Microorganismos θ 7, 14, 21 y 28contaminantes (m.o/mL) (m.o/mL)

B. subtilis 0S aureus 0 No se detectóS. aeruginosa 100 contaminaciónE. coli 10 000C. albicans 100 000A. niger 10 000

Conteo total de bacterias y hongos: 0 m.o./mL.

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se mantuvieron invariables durante todo eltiempo estudiado, por lo cual se propuso, almenos, 2 a de vida útil para el productoalmacenado a temperatura ambiente.

Se comprobó que la preservaciónantimicrobiana del jarabe es satisfactoria porla resistencia que presentó contra losmicroorganismos contaminantes (tabla 3), yaque a partir del séptimo día de siembra no sedetectó contaminación alguna en el producto,lo que implica una buena acción preservante delagente antimicrobiano utilizado en la fórmula.

Los resultados de la tabla 4 quecorresponden al tiempo promedio, medidoen segundos, que demoran en caer losanimales desde la entrada a la cámara dondereciben el aerosol de histamina al 0,1 %,indican que los grupos II y III que han sidotratados con 4 y 2 mL de salbutamolrespectivamente difieren significativamentedel grupo control I, siendo el grupo II el quemayor tiempo demoró en caer. Los resultadosde la tabla 5 que corresponden al tiempopromedio, medido en segundos, que

demoran en morir los animales después dela entrada a la cámara, demuestran que entrelos grupos II y III no existe diferenciaestadísticamente significativa y que ambossí difieren del grupo control I. Por todo loanterior se concluye que la nuevaformulación presenta buena actividadterapéutica.

El escalado industrial realizadodemostró la factibilidad de extrapolar latecnología a este nivel, ya que el productoterminado obtenido cumplió con todas lasespecificaciones de calidad exigidas para estemedicamento y después de transcurridos18 meses de su elaboración la valoración delprincipio activo estaba en una concen-tración del 94 %, o sea, dentro de los límitesterapéuticos establecidos para este jarabeque oscila en el intervalo comprendido entre90 y 110 %; de igual manera se comportaronel pH y sus características organolépticas,todo lo cual es un indicativo de la mayorestabilidad física y química que presenta lanueva formulación propuesta.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1 . Wall BP, Sunderland VB. A preliminary study in the stability of salbutamol in aqueous solution. Aust JHosp Pharm 1976;6(4):156-60.

2 . Hakes LB, Corby TC, Meakin BJ. The stability of salbutamol solution. J Pharm Pharmacol 1979;31:25.3 . Hakes LB, Meakin BJ, Winterborn IK. The effect of sugar on the stability of salbutamol sulphate

solution. J Pharm Pharmacol 1980;32:49.

Recibido: 18 de septiembre del 2000. Aprobado: 27 de octubre del 2000.Lic. Iván G. Morales Lacarrere. Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos. Ave 26 No. 1605entre Rancho Boyeros y Calzada del Cerro, Plaza de la Revolución, Ciudad de La Habana, Cuba.

SUMMARY

A new technology for the production of salbutamol syrup is presented aimed ateliminating the problems of chemical and physical stability of the previousformulation, which had a useful life of less than 6 months. It was possible toobtain a new formulation that met all the quality specifications required for thisdrug. It was proved that its useful life increased up to 2 years stored at roomtemperature in its original bottle.

Subject headings: DRUG STABILITY; TECHNOLOGY, PHARMACEUTICAL;CHEMISTRY, PHARMACEUTICAL/methods; DRUG COMPOUNDING//methods; ASTHMA/drug therapy; ALBUTEROL/pharmacology;ALBUTEROL/pharmacokinetics.

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Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos

EVALUACIÓN COMPARATIVA DE LA LIBERACIÓNIN VITRO DE METILDOPA DE PRODUCCIÓN NACIONALCONTRA ALDOMET®

Diana Pereda Rodríguez,1 Néstor Pérez Souto,2 Lisette Martínez Miranda3 y AleydaChang Valdés4

RESUMEN

Se realizó un estudio comparativo entre los perfiles de disolución de 3 lotes deAldomet® (Merck Sharp & Dohme), medicamento líder del principio activometildopa (DCI) y de 3 lotes de metildopa 250 mg de producción nacional. Seutilizó un método espectrofotométrico para la cuantificación del principio activoen los diferentes lotes, los cuales cumplieron con los criterios de la Food andDrug Administration (FDA) para los estudios de equivalencia in vitro, y a losdatos obtenidos se les determinó el mejor ajuste a modelos comunes para perfilesde disolución mediante el programa CurveExpert.

DeCs: ESTUDIO COMPARATIVO; SELECCION DE MEDICAMENTOS;METILDOPA/farmacocinética; QUIMICA FARMACEUTICA/métodos;TECNOLOGIA FARMACEUTICA; ESPECTROFOTOMETRIA/métodos;EQUIVALENCIA TERAPÉUTICA.

La absorción de un fármaco en formasólida tras su administración oral dependede la naturaleza del principio activo, ladisolución o solubilización bajo condicionesfisiológicas y la permeabilidad a través deltracto gastrointestinal (FDA. Center forDrugs Evaluation and Research, Guidance

for Industry: Dissolution Testing ofImmediate Release Solid Oral DosageForms, 1997). Basado en estas conside-raciones el ensayo de disolución in vitropara formas orales de liberación inmediatacomo tabletas y cápsulas, se usan parachequear la calidad lote a lote, como guía

Rev Cubana Farm 2001;35(1):13-7

1 Licenciada en Ciencias Farmacéuticas.2 Doctor en Ciencias. Licenciado en Ciencias Farmacéuticas. Investigador Auxiliar. Profesor

Asistente.3 Licenciada en Bioquímica. Investigadora Agregada.4 Técnica en Tecnología Farmacéutica.

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en el desarrollo de nuevas formulaciones(FIP. Guidelines for dissolution testing ofsolid oral products 1995); chequear lacalidad y eficacia de las formulacionesdespués de cambios de formulación en elproceso de manufactura, en el sitio demanufactura y durante el escalado.1

Como guía para la bioequivalencia deformulaciones diferentes del mismo fármacoa la misma dosis, la Food and Drug Adminis-tration (FDA) plantea para los estudios deliberación in vitro que al menos el 60 % delfármaco este solubilizado en 30 min y por lomenos el 85 % en una hora.2

A fin de conseguir una interpretaciónobjetiva y fiable del proceso de disolución,el procedimiento más operativo es laparametrización de las curvas disolución//tiempo representativas del proceso. Existenmultiplicidad de modelos matemáticos parala búsqueda de la ecuación de velocidadque mejor defina el proceso, entre ellos seencuentran los que poseen un fondo físico-químico (orden cero, uno y raíz cúbica) ylos que carecen de esta premisa (funciónde Weibull),2 que además suministraninformaciones suplementarias acerca de laspropiedades físicoquímicas del sistema quefacilitan la optimización de la formulación.1

El objetivo de este trabajo es lacomparación de los perfiles de disoluciónde 3 lotes de Aldomet®, medicamento líder,con 3 lotes de metildopa de producciónnacional, el cual es un medicamento amplia-mente utilizado en el tratamiento de lahipertensión arterial.3,4 Se realizan losajustes a modelos de disolución medianteel programa CurveExpert según el criteriode los mínimos cuadrados de ecuacionessuministradas por el usuario con el conjuntode pares de datos.

MÉTODOS

En la realización de los perfiles dedisolución se utilizó un disolutor Erweka

DT-6 con aparato 2 (paleta) y 900 mL deHC1 0,1N a 37 ± 0,5 °C como medio dedisolución y con una velocidad deagitación de 50 r.p.m. 5 Se realizaronmuestreos a los 5, 10, 20, 30, 45 y 60 min.

Para el ensayo de disolución se empleóel método descrito en la USP 23, el cual cuantificala cantidad de principio activo disuelto medianteun método espectrofotométrico a una longitudde onda de 280 nm, midiendo las dilucionescorrespondientes disueltas en medio dedisolución,5 contra una curva de calibracióndel material de referencia nacional demetildopa elaborado en el Departamento dePatrones del Centro de Investigación yDesarrollo de Medicamentos (CIDEM).

Se utilizaron 3 lotes (9034, 9040, 9043)de producción nacional elaborados en elLaboratorio Farmacéutico "ReinaldoGutiérrez" y 3 lotes (L1, L2, L3) de Aldomet®

de la firma Merck Sharp & Dohme comomedicamento líder.

A todos los lotes sometidos al estudiode liberación in vitro se le realizaron losajustes a 4 modelos (orden cero, primerorden, raíz cúbica y función de Weibull)comunes a perfiles de disolución, medianteel programa CurveExpert que se basa en unacombinación de los métodos no lineales demáximo gradiente y de Newton; se obtieneun coeficiente de correlación r y un errorestándar de estimación s como parámetrospara evaluar la bondad de ajuste. Elprocesamiento estadístico se realizómediante el programa Microcal Origin(Versión 5,0), y se utilizó para el análisis delas medias la prueba de 2 poblaciones, conun nivel de significación de 0,05.

RESULTADOS

En las tablas 1 y 2 se reportan losresultados de las medias de 12 tabletas ylas desviaciones estándar de los porcen-tajes de metildopa disuelta con respecto altiempo para cada lote del producto líder

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TABLA 3. Resultados del ajuste a modelos mediante el programa CurveExpert

Líder Aldomet (mejor ajuste) Metildopa nacional (mejor ajuste)

Ecuación Orden Uno: Ecuación Orden Uno:

Q=Qi*(1,0-exp (Kd*(t-t0))) Q=Qi*(1,0-exp (Kd*(t-t0)))

Q∞= 118,18461 Q∞ = 115,43472

Kd= -0,36534879 Kd= -0,27784067

t0= -1,9825999 t0= 0,59831024

Error estándar: 1,9323504 Error estándar: 3,3679318

Coeficiente de correlación: 0,8856937 Coeficiente de correlación: 0,9704800

Q∞: valor asintótico de disolución; Kd: constante de disolución; t0: tiempo de latencia.

TABLA 1. Resultados del porcentaje de disolución de metildopa con respecto al tiempo. Aldomet® (Merck Sharp & Dohme)

Tiempo Lote 1 Lote 2 Lote 3

(min) Media DE Media DE Media DE

5 103,3 2,8 96,1 3,2 97,5 4,5

10 109,5 3,7 104,9 1,9 105,7 3,9

20 109,8 2,3 107,7 1,5 107,0 3,9

30 109,3 2,8 108,0 1,6 106,8 4,1

45 110,0 2,9 107,8 1,6 106,8 4,0

60 109,4 2,9 108,0 1,5 107,5 4,1

TABLA 2. Resultados del porcentaje de disolución de metildopa con respecto al tiempo. Medicamento de producción nacional

Tiempo Lote 9034 Lote 9040 Lote 9043

(min) Media DE Media DE Media DE

5 61,8 16,7 74,2 15,5 78,3 7,8

10 94,8 8,0 96,8 8,8 99,7 3,9

20 102,8 4,1 105,0 2,4 104,8 5,3

30 104,7 2,6 104,6 1,6 106,4 5,0

45 105,8 2,9 104,6 1,9 106,0 5,0

60 106,1 3,2 105,5 1,7 106,9 6,3

Aldomet® y de fabricación nacional,respectivamente.

Los resultados de los mejores ajustesa modelos se indican en tabla 3.

En la figura se presentan los gráficos delos valores medios de porcentaje de metildopadisuelta en función del tiempo para los 3 lotesdel líder y del producto nacional.

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16

FIG. Valores medios dedisolución Aldomet® y metildopade producción nacional.

DISCUSIÓN

La comparación estadística entre losporcentajes de liberación de la Aldomet®

(Merck Sharp & Dohme) y la metildopa deproducción nacional para cada uno de lostiempos muestreados demostró que existendiferencias significativas para unaprobabilidad de 0,05, lo cual significa que laformulación nacional se diferencia delproducto líder; en todos los casos a los20 min se disuelve no menos del 80 % deprincipio activo declarado en lasformulaciones. Como se puede observar enla tabla 3, los lotes de Aldomet® y los demetildopa de producción nacional tienenun mejor ajuste con el modelo de orden 1, elcual es un caso de función exponencial yse corresponde con el objetivo para lo cuales diseñada una formulación de liberación

convencional, o sea, se disuelve, en cadaunidad de tiempo, una cantidad variable ydecreciente de fármaco.

Podemos concluir que los lotesestudiados de Aldomet® y los de metildopade producción nacional cumplen con loscriterios establecidos para los estudios deequivalencia in vitro,2 y con el criterio deensayo de disolución;5 según lo obtenidode los ajustes, ambas formulaciones estánrelacionadas con los procesos físico-químicosque ocurren en una tableta en el proceso dedisolución con superficie variable en eltiempo.2 Estos resultados constituyen elprimer paso necesario en los estudios debiodisponibilidad; la demostración de laeficacia terapéutica lleva implícito estudiosclínicos y de bioequivalencia querecomendamos sean realizados.

SUMMARY

A comparative study was made between the dissolution profiles of 3 lots ofAldometâ (Merck, Sharp & Dohme), a leading drug of the methyldopa activeprinciple (DCI), and of 3 batches of methyldopa 250 mg of national production.The spectrophotometric method was used for the quantification of the activeprinciple in the different batches, which fulfilled the criteria of the Food andDrug Administration (FDA) for the in vitro equivalency studies. The best

0

20

10

40

20 30 40 50 60Tiempo (min)

60

80

100

120

Medias nacionales Medias aldomet

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17

adjustment to common models for dissolution profiles was determined amongthe data obtained by using the CurveExpert program.

Subjec t headings: COMPA R ATIVE STUDY; DRUG SCREENING;METHYILDOPA/pharmacokinetics; CHEMISTRY, PHARMACEUTICAL//methods; TECHNOLOGY, PHARMACEUTICAL; SPECTROPHOTOMETRY//methods; THERAPEUTIC EQUIVALENCY.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1 . Hanson WA. Handbook of dissolution testing. 2 ed. Eugene: Aster Publishing, 1991:1;2,5,12,21-4.2 . Domenech J, Mariño E. III Curso de biofarmacia y farmacocinética experimental y clínica. Barcelona:

Universidad, Facultad de Farmacia, 1991:1-15.3 . Martindale W. The extra Pharmacopoeia. MicroMedex Inc. Versión Electrónica, 1997.4 . Compendium of Pharmaceuticals and Specialties. 31 ed. Ottrawa: Canadian Pharmaceutical Association,

1996:42-6.5 . United States Pharmacopoeia 23 and National Formulary 18. Rockville: United States Pharmacopeial

Convention, 1995:995,1791-3.

Recibido: 2 de octubre del 2000. Aprobado: 17 de noviembre del 2000.Lic. Diana Pereda Rodríguez. Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos. Ave 26 No. 1605entre Rancho Boyeros y Calzada del Cerro, Plaza de la Revolución, Ciudad de La Habana, Cuba.

Page 16: Revista Cubana de Farmacia,1/2001

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Rev Cubana Farm 2001;35(1):18-22

Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos

ESTABILIDAD DE TABLETAS DE RIFAMPICINA 300 mg

Lisette Martínez Miranda,1 Maricela Lara Castro2 y Matilde Torres García3

RESUMEN

Se realizó el estudio de estabilidad de las tabletas de rifampicina 300 mg. Se utilizópara la cuantificación del principio activo un método analítico desarrollado yvalidado por cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa y detecciónultravioleta. El estudio de estabilidad de las tabletas se efectuó mediante losmétodos de vida útil y acelerado en condiciones isotérmicas; no se obtuvo unavariación notable de la concentración en el tiempo de estudio y se demostró asíla estabilidad química y térmica del principio activo, por lo que se proponen2 años como fecha de vencimiento. La humedad relativa de 75, 84 y 92 % tuvoinfluencia en la estabilidad de la formulación en el período analizado.

DeCs: RIFAMPIN/farmacocinética; ESTABILIDAD DE MEDICAMENTOS/métodos;CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA PRESION; CALIDAD DE LOSMEDICAMENTOS; QUIMICA FARMACEUTICA/métodos; TECNOLOGIAFARMACEUTICA; COMPRIMIDOS/análisis.

1 Licenciada en Bioquímica. Investigadora Agregada.2 Licenciada en Ciencias Farmacéuticas.3 Técnica en Tecnología Farmacéutica.

La rifampicina pertenece a un grupo deantibióticos macrocíclicos complejosestructuralmente similares, producidos porStreptomyces mediterranei. Este fármacoes un antibiótico bactericida de amplioespectro usado en el tratamiento de infeccio-nes causadas por micobacterias, fundamen-talmente M. tuberculae y M. leprae, eindicado además en el tratamiento deinfecciones por Neisseria meningitidis.1

Este medicamento se comercializageneralmente en forma de cápsulas de 150 y300 mg con una dosis máxima de 600 mg,aunque también puede presentarse en otrasformas farmacéuticas, como por ejemplo,rifampicina suspensión oral al 1 % y enforma de supositorios de 300 mg.2-4

Han sido reportado numerosostrabajos para la determinación de rifampicinaen fluidos biológicos y producto

Page 17: Revista Cubana de Farmacia,1/2001

19

terminado,5-9 mediante el método decromatografía líquida de alta resolución. Seha reportado un estudio donde se utilizadicho método para la determinación de lacinética y el mecanismo de degradación, asícomo la estabilidad en diferentes zonas depH y temperaturas por 3 meses de larifampicina; se obtuvo como resultado queel pH = 5 fue el de máxima estabilidad. En laregión más ácida se obtuvo la mayordegradación por hidrólisis y a pH de 7,5 a9 sufrió degradación oxidativa. Además sedemostró que la formulación fue estable a40 °C durante 3 meses.10 La degradación dela rifamicina en soluciones acuosas es unproceso pH dependiente. A pH bajos sufrehidrólisis específica y se obtiene comoproductos de degradación el 3 formilrifampicina y el 1 amino-4-metil piperazina.La rifamicina puede sufrir oxidación bajocondiciones alcalinas en presencia deoxígeno atmosférico; el producto dedegradación en este caso es la rifampicinaquinona.10,11

La rifampicina de 300 mg es una formafarmacéutica que se incluye en el programade sustitución de importación y constituyela formulación en estudio. Controlar lacalidad del medicamento, predecir la fechade vencimiento y proponer las condicionesde almacenamiento adecuadas, son losobjetivos del presente trabajo.

MÉTODOS

Las muestras analizadas para eldesarrollo de este trabajo fueron identifi-cadas según los lotes 5001, 5002 y 5003 yfabricadas en el Departamento de FormasTerminadas de los laboratorios del Centrode Investigación y Desarrollo deMedicamentos (CIDEM).

Se realizó el estudio de estabilidad porel método acelerado a tabletas de rifampicina

correspondientes al ensayo 5001. Paradicho estudio se confeccionó un programade muestreo periódico, con el fin de evaluarlas muestras sometidas a diferentestemperaturas: 40, 50, 60, 70 y 80 ± 1 °C.Paralelamente, se estudió un grupo detabletas colocadas a temperatura ambientecorrespondiente al mismo ensayo.

Se determinó la concentración deprincipio activo en las muestras medianteel mismo método analítico desarrollado parael control de calidad,9 el cual consta con laespecificidad requerida para determinar ladegradación del producto.

Los ensayos 5001, 5002 y 5003 fueronevaluados de forma periódica con el objetivode seguir su comportamiento en el estudiode vida de estante.

Se sometieron un grupo de tabletascorrespondientes al ensayo 5001 alestudio de la influencia de la humedad(75, 84 y 92 %) durante 2 meses; poste-riormente se evaluaron los parámetros decalidad.

RESULTADOS

Los resultados analíticos del estudiode vida de estante para los 3 lotes sereportan en la tabla 1; como se observadurante el tiempo de análisis la formulacióntuvo un comportamiento estable ya que nohubo una variación notable entre lavaloración, la disolución inicial y losresultados obtenidos a los 24 meses, a pesarde que los valores obtenidos al final delestudio se encuentran cercanos al límiteinferior de la valoración (90-110 %); ademásno fueron apreciados cambios organo-lépticos en la formulación.

En la tabla 2 aparecen los resultadoscorrespondientes al estudio de estabilidadacelerada para el lote 5001. Teniendo encuenta la valoración inicial (106,37), al cabo

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20

TABLA 1. Resultados analíticos del estudio de vida estante

Lote Tiempo Valoración (%) Disolución %

5001 Inicial 106,37 x1 = 95,5 x

2 = 94,7 x

3 = 97,3

x4 = 94,4 x

5 = 95,7 x

6 = 97,6

6 meses 103,90 x1 = 94,6 x

2 = 95,3 x

3 = 96,3

x4 = 94,3 x5 = 95,3 x6 = 94,812 meses 101,53 x1 = 91,8 x2 = 93,4 x3 = 92,8

x4 = 92,8 x

5 = 93,4 x

6 = 90,5

24 meses 91,35 x1 = 78,8 x

2 = 79,2 x

3 = 79,7

x4 = 81,8 x

5 = 83,8 x

6 = 79,2

5002 Inicial 101,33 x1 = 86,7 x2 = 89,7 x3 = 90,8x4 = 88,6 x5 = 92,2 x6 = 88,9

6 meses 98,13 x1 = 89,1 x

2 = 86,6 x

3 = 90,1

x4 = 87,8 x

5 = 88,3 x

6 = 85,4

12 meses 94,44 x1 = 90,5 x

2 = 79,5 x

3 = 92,3

x4 = 88,5 x5 = 90,8 x6 = 90,524 meses 91,27 x1 = 78,8 x2 = 87,6 x3 = 82,3

x4 = 88,4 x

5 = 87,4 x

6 = 87,4

5003 Inicial 104,60 x1 =101,4 x

2 = 101,1 x

3 = 97,9

x4 = 98,2 x

5 = 101,6 x

6 = 101,7

6 meses 101,24 x1 = 91,3 x2 = 93,5 x3 = 95,4x4 = 94,6 x5 = 93,8 x6 = 91,6

12 meses 99,18 x1 = 85,8 x

2 = 81,5 x

3 = 84,8

x4 = 84,5 x

5 = 88,8 x

6 = 86,1

24 meses 94,02 x1 = 82,5 x

2 = 84,3 x

3 = 84,5

x4 = 87,3 x5 = 87,3 x6 = 87,3

TABLA 2. Estudio de estabilidad acelerada correspondiente al lote 5001

Valoración (%)Tiempo TA 40 °C 50 °C 60 °C 70 °C 80 °C

Inicial 106,37 106,37 106,37 106,37 106,37 106,3715 d - 100,31 100,66 100,67 102,15 98,1130 d 105,60 102,88 100,35 100,45 103,13 101,58120 d 104,54 95,44 95,61 91,63 91,86 92,92180 d 103,89 - - - - 89,08

de los 180 días a una temperatura de 80 °Cla valoración del principio activo sólo habíadisminuido a 89,08 %.

En la figura se representan las curvascorrespondientes a los 3 niveles deporcentajes de humedad estudiados. Seobserva un comportamiento similar ycreciente con respecto a la ganancia en pesoen el tiempo para 75, 84 y 92 % de humedad,con una mayor absorción de agua para esteúltimo si se compara con los niveles másbajos de humedad. Los resultados analíticos

de dicho estudio (tabla 3) aunque se en-contraron dentro de los límites esta-blecidos para este producto, presentaronvariaciones con respecto a la valoracióninicial.

TABLA 3. Resultados analíticos a los dos meses del estudiode la humedad del lote 5001

Humedad Valoración Disolución Características (%) (%) (%) organolépticas

75 95,05 90,80 Responde84 96,54 93,38 Responde92 93,96 90,69 Responde

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DISCUSIÓN

La estabilidad de la formulación quedademostrada en el estudio de estabilidadacelerada (tabla 2) y se reafirma con losresultados obtenidos a los 2 a de fabricada(tabla 1). Debido a esto no fue posible aplicarla ecuación de Arrhenius para predecir lafecha de vencimiento, ya que para ello esnecesario que el nivel de degradación delprincipio activo se encuentre en un valorentre 50 ó 60 %. En los casos donde no secumple esta ecuación es imposible realizaruna predicción, pues la constante develocidad extrapolada a la temperatura dealmacenamiento deseada para el fármaco,estaría bastante alejada de la realidad y lapredicción diferiría mucho de la hallada enla vida de estante del medicamento. Ademásen las soluciones es posible el estudio deestabilidad mediante métodos cinéticos

isotérmicos con mayor facilidad que en lasformulaciones sólidas, debido a que es unsistema homogéneo donde la reacción ocurrecon igual intensidad en todos los puntos.

La formulación estudiada al ser unaforma sólida resultó ser estable por unperíodo de 24 meses a temperatura ambientey protegida de la luz, por lo que se estable-cieron 2 a como fecha de vencimiento.

El estudio de la influencia de lahumedad demostró afectación de esteparámetro en la calidad de las tabletas, apesar de que los resultados analíticos seencontraban dentro de los límites estable-cidos de calidad; pero si tenemos en cuentala variación de estos con respecto a losresultados iniciales en los análisisrealizados, se recomienda conservarse elmedicamento en frascos herméticos con elfin de evitar cualquier tipo de afectación enla calidad de las tabletas.

SUMMARY

The stability study of rifampicin 300 mg was conducted. An analytical methoddeveloped and validated by high pressure liquid chromatography in reversephase and ultraviolet detection was used for the quantification of the active

FIG. Curvas del estudio de lahumedad del lote 5001.

75 % de humedad 84 % de humedad

92 % de humedad

0,442

0,444

0,446

0,448

0,450

0,452

0,454

Tiempo (días)0 10 20 30 40 50 60

Gan

anci

a en

pes

o (g

)

0,456

0,458

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principle. The stability study of the tablets was conducted by the method ofuseful life and the accelerated method under isothermic conditions. There wasno significant variation of the concentration during the time of study and, thus,the chemical and thermal stability of the active principle was proved. A periodof 2 years was proposed as expiration date. A relative humidity of 75, 84 and92% influenced on the stability of the formulation in the analyzed period.

Subject headings: RIFAMPIN/pharmacokinetics; DRUG STABILITY/methods;CHROMATOGRAPHY, HIGH PRESSURE LIQUID; DRUG QUALITY;CHEMISTRY, PHARMACEUTICAL/me thods ; TECHNOLOGY,PHARMACEUTICAL; TABLETS/analysis.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Goodman A, Gilman A. Las bases farmacológicas de la terapéutica. 7 ed. 1988:1145 (EdiciónRevolucionaria).

2. Susuki R. Enhancement of rectal absortion of rifampicin by sodium para-aminosalicilate dihydrate inhuman subjects. Yakugaku Zasshi 1994;114(11):894-900.

3. Nahata MC. Effect of preparation method and estorage of Rifampin concentration in suspension.ASHP Annu Meet 1993;50:138.

4. Lecaillon JB. Quantitative assay of rifampicin and three of its metabolites in human plasma, urine andsaliva by HPLC. J Chomatogr 1978;145:319-24.

5. Ratti B. Quantitative assay of Rifampicin and its main metabolite 25-desacetyl-rifampicin in humanplasma by Hight-Performance Liquid Chromatography. J Chromatogr 1981;225:526-31.

6. Codony SR, Martí P. Métodos analíticos para la determinación de agentes antibuberculosos en líquidosbiológicos. Circular Farm 1982;40(277):431-40.

7. Shah. Determination of Rifampicin and Isoniazida in farmaceutical formulation by HPLC. Drug DevInd Pharm 1980;18(14):1589-96.

8. Mika I. Determination de Rifampicin and its main metabolities in human plasma by HPLC. J ChromatogrBiomed Appl 1988;426:412-6.

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11. Connors KA. Chemical stability of pharmaceuticals. A hand book for pharmacists. 2 ed. New York:John Wiley, 1986:728-32.

Recibido: 6 de octubre del 2000. Aprobado: 17 de noviembre del 2000.Lic. Lisette Martínez Miranda. Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos. Ave 26 No. 1605entre Rancho Boyeros y Calzada del Cerro, Plaza de la Revolución, Ciudad de La Habana, Cuba.

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Rev Cubana Farm 2001; 35(1):23-7

Empresa de Productos Biológicos "Carlos J. Finlay"

COMPORTAMIENTO DE LA PENDIENTE EN EL ENSAYODE LINEALIDAD DEL RAPIGLUCO-TEST

María Victoria Licea Tornés1 y Marcia Martínez de Santelices Cuervo

RESUMEN

Se estudió el comportamiento de la pendiente y el coeficiente de determinaciónen el ensayo de linealidad del RapiGluco-Test, a partir del análisis de los lotesproducidos en 1998. Se examinaron las curvas de calibración mediante un análisisde regresión lineal simple; además, se aplicaron otras herramientas de estadísticadescriptiva para el análisis de los resultados. Para la evaluación de ensayo delinealidad además del coeficiente de determinación (r2≥0,98), se propuso incluirla pendiente de la curva y se estableció para la aprobación del RapiGluco-Test unrango de 0,058 a 0,064.

DeCs: QUIMICA FARMACEUTICA/métodos; TECNOLOGIA FARMACEUTICA;CALIDAD DE LOS MEDICAMENTOS; GLUCOSA DE LA SANGRE/análisis;MODELOS LINEALES; REACTIVADORES ENZIMATICOS; ESTADISTICASNO PARAMETRICAS.

1 Licenciada en Química. Investigadora Agregada.2 Licenciada en Química. Investigadora Agregada. Especialista en Control de Medicamentos.

La enfermedad más común relacionadacon el metabolismo de los carbohidratos esla diabetes mellitus, síndrome caracterizadopor una secreción anormal de insulina quese refleja en una tendencia a la hiperglicemia,por lo que la determinación de glucosasanguínea es de vital importancia para ladetección y seguimiento de los pacientesdiabéticos.1

La historia recoge numerosos métodosdesarrollados para la determinación deglucosa. Actualmente se considera como

método rutinario el desarrollado porTrinder2 que sigue siendo el mejor métodoenzimático colorimétrico para este analito,por ser el sistema cromogénico altamenteespecífico y libre de interferenciassignificativas y utilizarse para un ampliorango de concentraciones de glucosa. Seha demostrado la correlación de dichométodo con el de la hexoquinasa, métodode referencia para este analito.

Desde 1996 en nuestra Empresa seprodujo un reactivo único en forma líquida

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24

basado en el método enzimático desarro-llado por Trinder, el cual fue registrado porel CECMED y ha sido ampliamente utilizadoen toda la red hospitalaria de nuestro país,con buenos resultados.

Para garantizar la calidad del reactivose establecieron las especificaciones decalidad para el envase, materias primas,parámetros del proceso tecnológico, asícomo los métodos de control de proceso ypara el producto envasado.

Es requisito para la aprobación de losreactivos que el resultado de cada ensayoesté comprendido dentro de los límites deaceptación.

Para la aprobación del reactivo serealizan diferentes ensayos; uno de los másimportantes lo constituye la evaluación dela linealidad analítica. Con el objetivo deevaluar de manera más rigurosa el ensayo,se establecieron los límites de aceptaciónde la pendiente.

MÉTODOS

La determinación de la linealidadanalítica del RapiGluco-Test se realizósegún lo establecido en el ProcedimientoNormalizado de Operación 3.02.093.95 de laEmpresa de Productos Biológicos “Carlos J.Finlay”, el cual se describe a continuación:

- Se adicionó 4 mL de RapiGluco-Test acada tubo de ensayo.

- Se añadió 40 µL de cada una de lassoluciones de referencia.

- Se preparó de igual forma un blanco con40 µL de agua destilada.

- Se mezclaron suavemente y se incubarondurante 10 min a 37 °C.

- Se retiraron los tubos del baño deincubación.

- Se leyó la absorbancia de cada una delas soluciones de referencia contrablanco a 505 nm.

Para cada concentración se realizarontres réplicas.

Se seleccionaron 30 lotes deRapiGluco-Test elaborados durante 1998.

Se utilizó para la evaluación de lalinealidad analítica del RapiGluco-Test unjuego de soluciones de referencia PrecisetGlucosa de la firma comercial BoehringerMannheim, con un rango de concentra-ciones desde 2,78 hasta 16,7 mmol/L.

Se calculó para cada lote el coeficientede determinación así como la pendiente(coeficiente de regresión).3,4 Como criterioadicional para la evaluación del coeficientede regresión se determinó el factor deproporcionalidad P (relación entre el valorde absorbancia correspondiente a cada unade las réplicas de las soluciones dereferencia y su concentración) y elcoeficiente de variación. Las expresionesutilizadas para el cálculo de estosparámetros fueron:

Yin

Pin =

Xi

DECV = • 100 P

donde:

Y: absorbancia de cada réplica de lassoluciones de referencia.X: concentración de cada una de lassoluciones de referencia.i: de 1 a 5.n = 15P: promedio del factor de proporcionalidad.DE: desviación estándar.

Para la evaluación estadística de estosresultados se utilizaron el método deregresión lineal simple, la prueba deKolmogorov-Smirnov y el gráfico de controlpor variable de elementos individuales.5

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25

RESULTADOS

En la tabla 1 se presentan los resultadosdel coeficiente de determinación (r2) ycoeficiente de regresión obtenidos paracada lote del producto.

En la figura se observa el compor-tamiento del coeficiente de determinación enlos 30 lotes analizados. Los límites de controlestán comprendidos entre 0,058 y 0,064.

En la tabla 2 se ofrecen los valores delfactor de proporcionalidad P, así como elcoeficiente de variación (CV) calculado paracada lote.

DISCUSIÓN

Los valores obtenidos del coeficientede determinación para cada lote analizado(tabla 1) cumplieron con el criterio delinealidad establecido r2 ≥ 0,98, es decir, encada lote la relación lineal simple esaltamente significativa.

TABLA 1. Resultados del ensayo de linealidad

Coeficiente Coeficiente Lote de regresión de determinación

1 ,061 ,99832 ,061 ,99743 ,067 ,99524 ,064 ,99775 ,061 ,99706 ,062 ,99737 ,063 ,99888 ,060 ,99529 ,062 ,9985

10 ,063 ,998311 ,063 ,998812 ,063 ,995813 ,063 ,999314 ,059 ,996315 ,059 ,998016 ,059 ,994117 ,060 ,997318 ,061 ,998619 ,061 ,999620 ,061 ,999621 ,062 ,999322 ,060 ,999223 ,060 ,997524 ,062 ,999125 ,061 ,999326 ,063 ,999227 ,060 ,999128 ,062 ,999029 ,063 ,998630 ,061 ,9986

Prueba Kolmogorov-Smirnov: estimated Kolmogorovstatistic DPLUS = ,145955; estimated Kolmogorovstatistic DMINUS = ,120712; estimated overall stastisticDN = ,145955; approximate significance level = ,545075.

FIG. Gráfico control del RapiGluco-Test. Límites de la pendiente.

0,052

0,054

0,056

0,060

0,062

0,064

0,066

Lotes analizados

Análisis estadístico de los límites de la pendiente:L S + 3,0 sigma = 0,0644 30 subgrupos analizadosL S = 0,0614 1 subgrupo excluidoL S - 3,0 sigma = 0,0584

0,068

0,058

Linealidad Límites de control superior e inferior

Límites de control

Page 24: Revista Cubana de Farmacia,1/2001

26

TABLA 2. Factor de proporcionalidad y coeficiente devariación calculado para cada lote

Factor de Coeficiente Lote proporcionalidad de variación (%)

1 ,060 1,82 ,061 2,93 ,062 2,14 ,064 2,35 ,064 2,56 ,063 2,17 ,062 3,08 ,064 2,09 ,062 3,0

10 ,061 2,911 ,063 1,912 ,063 2,013 ,063 3,014 ,064 1,515 ,064 3,016 ,062 2,517 ,062 2,118 ,063 2,319 ,064 2,620 ,062 1,521 ,062 1,322 ,063 2,023 ,061 1,524 ,063 2,125 ,064 1,326 ,064 2,027 ,063 2,228 ,063 1,729 ,063 2,630 ,062 2,3

Mediante la prueba de Kolmogorov--Smirnov se comprobó que los coeficientesde regresión obtenidos siguen una distribu-ción normal, ya que el nivel de significaciónes mayor que 0,05.

El gráfico de control por variables nospermite conocer la tendencia de lacaracterística analizada. En la figura seobserva que los coeficientes de regresión,excepto uno, se encuentran dentro de loslímites de control determinados para 3 sigma,con un nivel de confianza del 99,73 %.

El valor promedio del factor deproporcionalidad para cada lote (tabla 2) seencuentra dentro de los límites de controlestablecidos para el coeficiente de regre-sión. De igual forma el coeficiente devariación fue menor o igual que el 3 %. Estos2 parámetros sirven para la evaluación delos límites de control del coeficiente deregresión del RapiGluco-Test.

Este estudio propone incluir en elensayo de linealidad analítica del reactivoúnico para la determinación de glucosa ensuero (RapiGluco-Test) el cálculo de lapendiente de la curva de calibración y loslímites de aceptación de ésta, lo cual permiteevaluar de manera más rigurosa dicho ensayoen el Laboratorio de Control de nuestraEmpresa, para la aprobación de este reactivo.

El intervalo de pendiente establecidoes válido cuando se realiza el ensayo delinealidad en un intervalo de concentraciónde 2,78 a 16,7 mmol/L.

El intervalo de la pendiente establecidopara el RapiGluco-Test está comprendidoentre 0,058 y 0,064.

SUMMARY

The behavior of the slope and the coefficient of determination in the linealitytest of the RapiGluco-Test were studied by analyzing those batches produced in1998. The calibration curves were examined by simple linear regression analysis.Other tools of descriptive statistics were applied to anlyze the results. Besidesthe coefficient of determination for the evaluation of the lineality test(r2 ³0.98), the slope of the curve was also included and a range from 0.058 to0.064 was established for the approval of the RapiGluco-Test.

Subject headings: CHEMISTRY, PHARMACEUTICAL; TECHNOLOGY,PHARMACEUTICAL; DRUG QUALITY; BLOOD GLUCOSE/analysis; LINEARMODELS; ENZYME REACTIVATORS; STATISTICS, NONPARAMETRIC.

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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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1988;44(11):2340-6.5. Grisell JR. Los gráficos de control. Una herramienta en el control de la calidad. Quality Prog 1990;2:1-5.

Recibido: 11 de septiembre del 2000. Aprobado: 28 de octubre del 2000.Lic. María Victoria Licea Tornés. Empresa de Productos Biológicos. "Carlos J. Finlay". Infanta No. 1162esquina Manglar, Centro Habana, Ciudad de La Habana, Cuba.

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Rev Cubana Farm 2001;35(1):28-33

Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos

TÉCNICA ANALÍTICA PARA EL ESTUDIO DE ESTABILIDADDEL CROMOGLICATO DE SODIO(CÁPSULAS PARA INHALACIÓN)

Liana Liz Pérez Suárez,1 Alfredo Fernández Serret2 y Esther Alonso Jiménez3

RESUMEN

Se desarrolló un método analítico por cromatografía líquida de alta eficienciapara la determinación del contenido de cromoglicato de sodio en las cápsulas. Latécnica desarrollada resultó ser lineal, precisa, exacta y específica, la cual fueaplicada para realizar el estudio de estabilidad acelerada y el de vida de estante.Se comprobó la estabilidad química del medicamento por un período de 2 años.

DeCs: ESTABILIDAD DE MEDICAMENTOS/métodos; CROMOLINSODICO/farmacocinética; CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTAPRESION/métodos; CALIDAD DE LOS MEDICAMENTOS; QUIMICAFARMACEUTICA; CAPSULAS/análisis.

1 Licenciada en Ciencias Farmacéuticas. Hospital Clinicoquirúrgico Docente "Dr. SalvadorAllende".

2 Master en Ciencias. Licenciado en Química. Investigador Auxiliar.3 Técnica en Tecnología Farmacéutica.

El cromoglicato de sodio es el principioactivo obtenido a partir de sucesivas modifi-caciones estructurales de una benzopironade origen vegetal extraída de la planta Khe-llin (Ammi Viznaga). Este compuesto no seabsorbe en el tracto gastrointestinal, por loque se administra mediante inhalacióndurante el tratamiento profiláctico del asmabronquial. Por ello, se comercializa en formade aerosoles y cápsulas para inhalaciones;estas últimas son seleccionadas para elaborardicho medicamento en dosis de 22,5 mg.1-3

La Farmacopea de los Estados Unidos(USP), edición 23, reporta la técnica oficialpara el control de calidad de las cápsulasde cromoglicato de sodio por espectro-fotometría ultravioleta y se hallaron reportessobre su detección en orina humana porcromatografía líquida de alta eficiencia(CLAE), con el empleo de columnas deintercambio iónico y como fase móvil el usode buffer de clorhidrato de glicina 1 mol/L apH 3,5.4,5

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Los métodos espectrofotométricostienen el inconveniente de la falta deespecificidad debido a la interferencia posiblede los productos de degradación, quepueden presentar en ocasiones un espectroidéntico al componente sin degradar y a suvez como su concentración es muy pequeñaqueda por debajo del límite de deteccióndel método. En la actualidad, el indiscutibledesarrollo de la cromatografía aporta alanalista una herramienta no solo de altasensibilidad y exactitud, sino que es enesencia un método separativo, que le permitemedir con una gran especificidad elcompuesto deseado siempre que seencuentre en el sistema de separaciónadecuado.6

Para los estudios de estabilidad un puntode capital importancia es el método analíticoque se emplee, el cual debe tener comorequisito fundamental la especificidad, yaque debe ser lo suficientemente selectivopara ser capaz de medir el compuesto deelección en el proceso cinético, teniendo encuenta además los parámetros de precisión,exactitud y linealidad.4

El presente trabajo tuvo como objetivoel desarrollo de un método analítico quecumpliera con los requisitos fundamentalesde validación para su empleo en el estudiode estabilidad del medicamento.

MÉTODOS

Todos los reactivos empleados fueronde calidad analítica. Se empleó comosustancia de referencia cromoglicato desodio preparado en el Departamento dePatrones del Centro de Investigación yDesarrollo de Medicamento (CIDEM) y parael desarrollo de la formulación, cromoglicatode sodio (materia prima) del fabricanteCHEMO S.A. de Suiza, con la calidad demicronizado de partículas según lasexigencias.

Las muestras analizadas para eldesarrollo de este trabajo fueron identifi-cadas según los ensayos 3002, 3003 y 3004,fabricadas en el Departamento de FormasTerminadas de los Laboratorios del CIDEMy envasadas en frascos de vidrio con tapade polipropileno.

El control de calidad se efectuó con latécnica analítica descrita en la monografíasegún la USP 23.

Método analítico. Para la preparaciónde la fase móvil se mezcló 900 mL desolución de dihidrógeno fosfato de potasio0,05 mol/L con 200 mL de metanol. Se ajustóel pH de la solución a 7,4 ± 0,1. La detecciónse efectuó a 238 nm y se empleó una columnaLiChrosorb RP-18 de 5 µm y 100 x 4 mm con unflujo de 1,2 mL/min. Para el registro de loscromatogramas se utilizó un procesador dedatos Shimadzu CR6A.

En la preparación de la solución dereferencia, se pesó el equivalente a 22,5 mgde muestra de referencia y se transfirió a unmatraz aforado de 100 mL. Se disolvió y sellevó a volumen con agua destilada.Posteriormente, se tomó una alícuota de 5 mL,se trasvasó a un matraz aforado de 100 mL y sellevó a volumen con fase móvil. Para lapreparación de la solución de ensayo secolocaron 5 cápsulas en un matraz aforado de500 mL, se añadió aproximadamente 250 mL deagua destilada, se agitó en baño de aguatermostatado a 37 ± 1 °C durante 20 min hastalograr la disolución. Se enfrió y se llevó avolumen con agua destilada. Se filtró lasolución anterior y se tomó una alícuota de5 mL, la que se trasvasó a un matraz aforadode 100 mL y se llevó a volumen con fasemóvil. Seguidamente se inyectaron ambassoluciones en el cromatógrafo y se realizóla cuantificación mediante el método delpatrón externo.

Validación del método analítico. Elestudio de la linealidad de la respuesta deldetector (linealidad del sistema) se realizó

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mediante la preparación de una curva decalibración en un rango de concentracióndesde 4,5 hasta 30,0 µg/mL.

Para el cálculo de la precisión delmétodo, se estudió la repetibilidad sobre labase de 6 determinaciones y para comprobarla reproducibilidad, se efectuaron valora-ciones por 2 analistas en 2 d diferentes.

El estudio de exactitud se realizó por elmétodo de recuperación, mediante lapreparación de muestras con diferentesniveles de cromoglicato de sodio querepresentan el 40, 60, 80, 100 y 120 % de laconcentración teórica del principio activoen la cápsula, según la formulaciónpropuesta. Simultáneamente se analizó lalinealidad del método.

Con el objetivo de evaluar la especifi-cidad del método cromatográfico sesometió la muestra a hidrólisis ácida,hidrólisis alcalina y oxidación con peróxidode hidrógeno a temperatura de 80 °C.Además, se estudió la posible interferenciade los componentes de la cápsula en elanálisis cromatográfico.

Todo el estudio de validación seefectuó con muestras del lote 3003.

Estudio de estabilidad. El estudiode estabilidad se realizó por los métodosde estabilidad acelerada y vida de estante.Para realizar la valoración periódica de lasmuestras sometidas a condiciones acele-radas, las cápsulas del ensayo 3003 sedistribuyeron y almacenaron en hornos a40, 50, 60 y 70 ° C. Las muestras de los3 lotes en estudio fueron almacenadas atemperatura ambiente y protegidas de lahumedad y la luz, las que se valoraron alinicio y transcurridos 12 y 24 meses defabricadas.

También se realizó el estudio de lahumedad absorbida por las cápsulas delensayo 3003, las que se colocaron enhidrostatos con humedades controladas de84, 92 y 98 % y se valoraron a los 32 d.

RESULTADOS

En la tabla 1 se reportan los resultadosanalíticos de control de calidad de los lotesestudiados.

La curva de calibración a 238 nmresultó ser lineal en el rango de con-centraciones comprendido entre 4,5 y30,0 µg/mL. La ecuación de la recta seexpresó según y = 4 168,76 x - 271,195.

El coeficiente de correlación linealfue de 0,99991. Al aplicar la prueba designificación del intercepto, la t calculadafue menor que la t tabulada (0,82 < 2,57).

En la prueba de repetibilidad el CVfue 0,32 % y en el estudio de lareproducibilidad realizado por 2 analistaspara el 95 % de probabilidad, el valorhallado en la prueba de Fisher fue menorque el tabulado (5,28 < 19,0). Para laprueba de la t de Student, el valorcalculado resultó ser menor que eltabulado para 4 g.l., con el 95 % deprobabilidad (1,56 < 2,78).

Los resultados del estudio de laexactitud mostraron un recobradopromedio del 98,8 % y un CV de 0,67 %,donde la pendiente de la curva derecuperación (y = 0,9939 x + 0,1012) indicóun valor de 0,9939. Al aplicar la pruebade significación de la pendiente, lat calculada fue menor que la tabulada(1,37 < 3,18). El intercepto del gráfico fueevaluado y la prueba de significaciónmostró que la t calculada fue menor quela tabulada (0,73 < 2,78).

Los cromatogramas obtenidos co-rrespondientes al análisis de la especificidadse presentan en las figuras 1 y 2.

Los resultados de las valoracionesperiódicas de las muestras sometidas alestudio de estabilidad acelerada se reportanen la tabla 2. A su vez la tabla 3 presentatambién los resultados obtenidos delestudio de estabilidad por vida de estante.

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TABLA 1. Resultados analíticos del control de calidad de los lotes estudiados

Ensayo Lote 3002 Lote 3003 Lote 3004 Límites

Características Responde Responde Responde Cápsulas duras de gelatinaorganolépticas rojas y negras, con polvo

blanco en su interior Identificación A. Responde A. Responde A. Responde A. El espectro UV de la

muestra y la referenciacoinciden

B. Responde B. Responde B. responde B. Precipitado rojoUniformidad de 3002- 93,1-125,9 %dosis* Xmedia = 109,5 % Xmedia = 113,4 % Xmedia = 105,4% 3003- 93,5-126,5 %

3004- 89,6-121,2 %

DSR = 1,8 % DSR = 0,9 % DSR = 1,4 % DSR ≤ 6,0 %

Valoración UV 105,6 % 112,2 % 105,5 % 95,0-125,0 %

* Intervalo ajustado para límite de aceptación asimétrico.

FIG. 1. Cromatogramas de las soluciones de cromoglicato desodio sometidas a hidrólisis ácida (B); hidrólisis básica (C);peróxido de hidrógeno (D) y la solución de referencia (A).

TABLA 2. Resultados de la valoración periódica del ensayo3003 sometido a diferentes temperaturas

Tiempo Temperatura (días) 40 °C 50 °C 60 °C 70 °C

0 113,0 113,0 113,0 113,03 113,9 114,2 116,1 115,87 115,5 113,5 112,4 113,7

25 113,7 113,6 117,9 114,4104 115,1 114,2 114,5 113,7119 115,9 113,1 112,9 111,5175 109,7 111,1 110,7 107,0

Datos de concentración en %

El estudio de humedad controlada paralas muestras del lote 3003 a 84, 92 y 98 % dehumedad mostró valores de 116,5; 115,7 y115,8 % respectivamente; además seobservó el incremento en peso característicoy el reblandecimiento de las cápsulas.

DISCUSIÓN

Los resultados de las pruebas de controlnos indican que cumplen con los requisitosde calidad establecidos para este producto,reportados en la monografía de la USP 23.

Etart A

5,01

8

5,02

7

0,58

3

Etart B Etart C Etart D

FIG. 2. Cromatogramas de muestras preparadas según:cápsula vacía (A); contenido de la cápsula (B) y cápsulaíntegra (C).

5,07

3

5,06

2

Etart BEtart A Etart C

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TABLA 3. Resultados analíticos del estudio de estabilidad por vida de estante

Ensayo 3002 3003 3004 Límites

Características Responde Responde Responde Cápsulas duras deorganolépticas gelatina rojas y

negras, con polvoblanco en su interior

Valoración inicial 107,6 % 113,0 % 102,1 % 95,0-125,0 %(HPLC)Valoración 12 meses 105,0 % 115,8 % 104,3 % 95,0-125,0 %(HPLC)Valoración 24 meses 104,6 % 115,2 % 102,8 % 95,0-125,0 %(HPLC)

Se demostró el cumplimiento de lalinealidad de la respuesta del detector en elrango de concentraciones estudiado, porel alto valor de coeficiente de correlaciónalcanzado, así como la no significación delintercepto de la curva.

El estudio de la repetibilidad del métodofue positivo, ya que el coeficiente devariabilidad es menor que el 2 %, límitemáximo que se permite para métodoscromatográficos. Los valores de reprodu-cibilidad indican que no existe diferenciasignificativa entre las precisiones y lasmedias alcanzadas por los 2 analistas. Todoesto nos permite concluir que el métodopropuesto ofrece una precisión adecuada.

La curva de recuperación mostró uncomportamiento lineal debido al valor delcoeficiente de correlación cercano a launidad. Las pruebas estadísticas aplicadas ala pendiente y al intercepto aseguran laexactitud y linealidad del método, pues elvalor de la pendiente no difiere signifi-cativamente del valor unitario y el valor delintercepto no difiere significativamente de cero.

Se comprobó que el principio activosufre degradación en medio básico y frenteal peróxido de hidrógeno; en este caso nose observó una señal aguda en 0,582 mindebido probablemente a un producto dedegradación. En medio ácido no se detectódescomposición del principio activo. No seobservó la interferencia de los productosde degradación, ya que no se registraronpicos en la zona de elución perteneciente alcromoglicato de sodio (fig. 1).

De la figura 2 se concluye que no hayinfluencia de los componentes de la cápsuladebido a que no se detecta señal en la zonade elución del fármaco al inyectar la muestraque contiene la cápsula vacía.

Todo este estudio nos permite asegurarque el método analítico desarrollado porCLAE para el estudio de estabilidad resultólineal, preciso, exacto y específico.

El producto presentó una granestabilidad, ya que después de transcurridos175 d mantuvo el contenido de principioactivo conforme a los límites establecidos(tabla 2). Dado este comportamiento no fueposible el empleo de la ecuación de Ahrrenius,ya que el nivel de degradación no alcanzóun valor entre el 50 ó 60 %.

Los resultados de las valoraciones semantienen durante el período evaluado, sinpresentar cambios en el aspecto organo-léptico, lo cual indica la estabilidad de laformulación (tabla 3).

Los resultados de la valoración de lasmuestras sometidas al estudio de humedadcontrolada prueban que el tratamiento noalteró el contenido de principio activo enlas cápsulas; pero el incremento en pesoobservado y el reblandecimiento de lascápsulas nos indica la necesidad deprotegerlas de la humedad.

Se proponen 2 a como fecha de venci-miento a temperatura ambiente para el me-dicamento, protegido de la humedad y la luz.

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SUMMARY

An analytical method was developed by high pressure liquid chromatography todetermine the content of sodium cromoglicate in capsules. The techniquedeveloped proved to be linear, precise, accurate and specific and it was used toconduct the study of accelerated stability and that of shelf life. The chemicalstability of the drug was verified for a period of 2 years.

Subject headings: DRUG STABILITY/methods; CROMOLYN SODIUM/pharmacokinetics; CHROMATOGRAPHY, HIGH PRESSURE LIQUID/methods;DRUG QUALITY; CHEMISTRY, PHARMACEUTICAL; CAPSULES/analysis.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Recibido: 23 de septiembre del 2000. Aprobado: 27 de octubre del 2000.Lic. Liliana Liz Pérez Suárez. Hospital Clinicoquirúrgico Docente "Dr. Salvador Allende". Calzada del CerroNo. 1551, Cerro, Ciudad de La Habana, Cuba.

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Empresa de Productos Biológicos "Carlos J. Finlay"

VALIDACIÓN DE LA LIMPIEZA DEL REACTOR EMPLEADO EN LAPREPARACIÓN DE MEDICAMENTOS

Lisseux Castilla Valentín,1 Zulema Hevia Santamarina,2 Miriam Díaz de Armas3 e IreneWalker Gómez2

RESUMEN

En la actualidad, la validación de los procesos se ha convertido en una imperiosanecesidad de la Industria Médico-Farmacéutica, para garantizar la calidad de susproductos y lograr la comercialización de estos. En esta dirección se comenzaronlos trabajos de validación de la limpieza de los equipos y se realizó la validaciónde la limpieza del reactor SEN, que se utiliza para la preparación de los inyectables.Para lograr este objetivo, se elaboró una metodología de trabajo, se seleccionaronlos métodos analíticos más apropiados, se establecieron los criterios de aceptacióny se escribió un protocolo de validación, que constituyó la herramientafundamental de trabajo. Posteriormente se realizó la validación de la limpiezadel reactor, y se concluyó que el procedimiento de limpieza, aunque no garantizatotal eliminación de los residuos del producto, sí cumple con los criterios deaceptación establecidos.

DeCs: EQUIPOS Y SUMINISTROS; CALIDAD DE LOS MEDICAMENTOS;TECNOLOGIA FARMACEUTICA; CONTAMINACION DE EQUIPOS;CONTAMINACION DE MEDICAMENTOS; COMPOSICION DE MEDICA-MENTOS; AMICACINA

1 Ingeniera Química. Aspirante a Investigadora.2 Licenciada en Ciencias Farmacéuticas.3 Master en Tecnología y Control de Medicamentos. Licenciada en Ciencias Farmacéuticas. Investigadora Auxiliar.

La validación consiste en “establecerevidencia documentada que proporcione unalto grado de seguridad de que un procesoespecífico producirá consistentemente unproducto que cumpla con sus especi-ficaciones predeterminadas y con suscaracterísticas de calidad”, y se ha

demostrado internacionalmente que estaconstituye un elemento clave para garantizarque los objetivos del aseguramiento de lacalidad sean alcanzados.

En el caso de la Industria Médico--Farmacéutica la validación cobra mayorimportancia, ya que de la calidad de los

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productos depende en muchas ocasionesla salud o incluso la vida de un ser humano.Es por eso que en el mundo actual se exigecada vez con mayor fuerza que se realice lavalidación de los procesos farmacéuticos.

En la Empresa de Productos Biológicos(EPB) “ Carlos J. Finlay” se ha comenzado atrabajar en la validación de limpieza de losequipos, debido a que en ellos se preparanproductos diferentes en forma consecutiva,y la efectiva limpieza resulta muy importantepara impedir la contaminación del productosiguiente con el anterior procesado en elequipo.

El objetivo de este trabajo fue realizarla validación del procedimiento de limpiezadel reactor SEN de 133 L de capacidad,donde se preparan los productos inyecta-bles en la EPB “Carlos J. Finlay”, por sereste el primer punto a partir del cual puedeproducirse la contaminación cruzada.

MÉTODOS

Para desarrollar la validación de esteprocedimiento se adoptó una metodologíaformada por 4 interrogantes, a las cuales seles dio respuesta para la confección delProtocolo de Validación.

Los 4 aspectos que se dilucidaronfueron:

- Producto con el que se realizaría laevaluación.

- Método analítico que se utilizaría. - Procedimiento para la validación de la

limpieza. - Determinación de los límites de

aceptación.

Producto con el que se realizaría laevaluación. Para seleccionar el de referenciase buscó el “ peor caso”, o sea, el productomás difícil de limpiar. Se confeccionó un

listado de los productos que se preparanen el reactor y se compararon suspropiedades físico-químicas. También serealizaron entrevistas a los técnicos yespecialistas del área. En esta etapa seseleccionó como peor caso el productoamikacina inyectable 250 mg/mL, ya queresulta ser el más denso de todos los quese preparan en el reactor y se adhiere a lasparedes, por lo que fue consideradounánimemente como el que más dificultadespresenta para la limpieza.

Método analítico que se utilizaría.Una vez seleccionado el producto, sedesarrolló una búsqueda bibliográfica,acerca de él, con vistas a conocer suspropiedades y los métodos analíticosutilizados para su determinación.

Como resultado se escogieron 5métodos analíticos y se realizaron ensayosde laboratorio con la finalidad de conocersu capacidad para detectar el producto amuy bajas concentraciones.

Los métodos escogidos fueron:

• Identificación de amikacina por reaccióncon ninhidrina, descrito en la NESP1752-168:87.1

• Identificación de amikacina por cromato-grafía de capa delgada, descrito en laUSP XXIII.2

• Determinación de materias orgánicas,descrito en la USP XXII.3

• Determinación de pH.• Determinación de conductividad.

Los 2 últimos métodos son inespe-cíficos, pero se ha reportado que puedenutilizarse, siempre que se demuestre queson capaces de establecer diferencias entrelas condiciones anteriores y posteriores ala limpieza.4

Los ensayos se realizaron de la formasiguiente:

• Se partió de una muestra de productoterminado de concentración 250 g/L y

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36

se le realizaron 3 diluciones: 10-3, 10-6

y 10-9, lo que correspondió a concen-traciones de amikacina de 250; 0,25 y0,00025 mg/L.

• A cada una de estas diluciones se leaplicaron los 5 métodos escogidos, y seefectuaron 9 réplicas para cada dilución.A partir de los resultados, debido a quese encontraron grandes diferencias entrelos valores correspondientes a laamikacina sin diluir, la dilución 10-3 y ladilución 10-6, se prepararon las diluciones10-1, 10-2, 10-4 y 10-5, correspondientes aconcentraciones de amikacina de 25 000;2 500; 25; 2,5 mg/L. Las diluciones 10-7 y10-8 no fueron analizadas, por no existirdiferencias significativas entre lasdiluciones 10-6 y 10-9.

Procedimiento para la validación de lalimpieza. Se estudiaron las metodologíasde análisis propuestas en la bibliografíaconsultada: hisopado, análisis de un loteplacebo, enjuague con disolvente y análisisdel agua destilada del último enjuague; esteúltimo se escogió debido a que la amikacinano es soluble en alcohol, cloroformo niacetona y es libremente soluble en agua.2

Además, los métodos de enjuague son losrecomendados para los equipos degeometría simple, fundamentalmenterecipientes, en los que el residuo sedistribuye uniformemente en la superficieinterna del equipo.5

Se realizó primeramente la inspecciónvisual del reactor, una vez terminado elprocedimiento de limpieza, y el chequeo delolor, ya que estas operaciones debenrealizarse como paso previo a cualquierevaluación de la limpieza.6

El paso siguiente consistió en enjuagarel reactor con 3 L de agua destilada, demanera que el agua recorriera toda lasuperficie interna del reactor. Esta agua serecogió en un recipiente de vidrio y se tomóademás una muestra del agua destiladautilizada para el enjuague.

A las muestras tomadas se lesdeterminó el pH en un medidor de pHmodelo PHM-83 AUTOCAL, con electrodocombinado y la conductividad en unconductímetro METROHM, con electrodode platino y constante de la celda igual a0,74. Ambos equipos fueron calibradospreviamente para garantizar la veracidad delas mediciones.

Además se enjuagó el reactor con 3 Lde agua destilada antes de realizar lalimpieza, con vistas a conocer si la metodo-logía propuesta era capaz de detectar ladiferencia entre el reactor sucio y el reactorlimpio. Esta comprobación se bebe realizaren este caso porque el método de análisisseleccionado es inespecífico.6

Esta operación se realizó después dela fabricación de 5 lotes consecutivos deamikacina (lotes 6020 al 6024) y secompararon las diferencias de pH yconductividad obtenidas en cada caso conlos límites establecidos.

Todo el procedimiento que se siguiófue establecido minuciosamente en unProtocolo de Validación, elaborado segúnlo establecido en el Sistema de Documen-tación de la Empresa.

Determinación de los límites deaceptación. En el caso de la inspecciónvisual el criterio fue que no se apreciaraningún tipo de residuo u olor, una vezconcluida la limpieza.6

El otro criterio seguido fue que lacantidad de residuo en el reactor sea tal quesu concentración en el producto siguienteesté por debajo del nivel de no efecto.6

Siguiendo esta metodología se calculóla cantidad máxima de producto que podíaquedar en el reactor, según la expresiónsiguiente:

DTFMin

*TLMin

CMR= FS*D

Máx

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donde:

DTFMin

: dosis farmacológica mínima al día.TL

Min: tamaño de lote mínimo que se fabrica

en el reactor.FS: factor de seguridad.D

Máx: dosis máxima del producto que tenga

mayor dosis diaria, de todos los que sefabrican en el reactor.

Posteriormente se calculó la concen-tración máxima permitida de amikacina en elagua de enjuague, según la expresiónsiguiente:

CMRCon

Máx=

FS*V

donde:

ConcMáx

: concentración máxima permitidade amikacina en el agua de enjuague.FS: factor de seguridad.V: volumen de agua utilizada para elenjuague.Se obtuvo una concentración máximapermitida de 27,1 mg/L, la que se tomócomo límite de aceptación.

RESULTADOS

Los resultados de los ensayos realiza-dos para seleccionar el método analítico sepresentan en la tabla1.

En el caso de la conductividad y el pH,se consignaron las diferencias de conduc-tividad y pH entre el agua destilada utilizadapara diluir y la dilución preparada delmedicamento.

De la tabla 1, buscando siempre la situa-ción de “peor caso”, se obtuvo que una con-centración de amikacina de 25 mg/Lrepresentaba una variación de pH de0,82 y una variación de conductividad de

23,458 µS/cm. Por tanto, se estableció comocriterio de aceptación que las variacionesde pH y conductividad que se obtuvierandebían estar por debajo de estos valores.

Los resultados obtenidos en la evaluacióndel procedimiento se indican en la tabla 2.

DISCUSIÓN

La identificación de amikacina por lareacción con ninhidrina, la cromatografía decapa delgada y la determinación de materiasorgánicas solo fueron capaces de detectarconcentraciones de 250 mg/L; por debajode este valor no respondieron (tabla 1). Portanto, estos métodos fueron desechados,ya que no son adecuados para las bajasconcentraciones de trabajo.

En el caso del pH y la conductividad,las mediciones realizadas indicaron que alagregar la amikacina al agua destilada seproduce una disminución del pH y unaumento de la conductividad. Esto secorresponde con lo esperado, debido a lanaturaleza iónica del principio activo sulfatode amikacina y a su pH ácido.

Al disminuir la concentración deamikacina, las variaciones de pH y conduc-tividad se hacen más pequeñas (tabla 1), loque corrobora que las variaciones de pH yconductividad son directamente propor-cionales a la concentración de amikacinaen la solución. Además, aún a bajas con-centraciones estos métodos son capacesde detectar la presencia de la amikacina, porlo que pueden utilizarse para la validaciónde la limpieza del reactor.

Todas las veces que se repitió elprocedimiento se obtuvo un aumento de laconductividad y una disminución del pH(tabla 2), lo que coincide con los resultadosobtenidos en el laboratorio e indica que aundespués de la limpieza existían restos deamikacina en el reactor.

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Sin embargo, al comparar las varia-ciones obtenidas con los límites esta-blecidos previamente, se observa que seencuentran muy por debajo de aquellos, loque nos indica que la concentración deresiduo en el reactor es aproximadamente10 veces inferior al límite establecido.

Por tanto, se puede afirmar que aunqueexisten restos de amikacina en el reactor,estos son totalmente inocuos para elpaciente.

Existen grandes diferencias entre lasvariaciones de pH y conductividaddetectadas antes y después de la limpiezadel reactor (tabla 2), lo que corrobora que elmétodo seleccionado resulta apropiado parala comprobación de la limpieza.

TABLA 1. Comparación entre los métodos analíticos

Conc identificación Materias Cromatografía Variación VariaciónDilución (mg/mL) con ninhidrina orgánicas en placa de pH de cond.

10-1 25 000 Contiene Contiene Contiene - 1,78 7 103,0410-2 2 500 Contiene Contiene Contiene -1,39 1 104,3410-3 250 Contiene Contiene Contiene - 0,86 142, 2310-4 25 No contiene No contiene No contiene -0,82 23,4610-5 2,5 No contiene No contiene No contiene -0,35 2,8810-6 0,25 No contiene No contiene No contiene -0,09 0,5910-9 0,00025 No contiene No contiene No contiene -0,07 0,25

TABLA 2. Resultados de la evaluación de la limpieza

Inspección Variación de pH Variación de conductividadLote visual Antes Después Antes Después

6020 Conforme -1,04 -0,34 1 146,56 0,576021 Conforme -1,15 -0,35 1 120,48 0,656022 Conforme -1,08 -0,32 1 109,48 0,536023 Conforme - 0,97 -0,23 1 079, 56 0,466024 Conforme -0,95 -0,14 1 331,56 0,50

Se pudo concluir que los métodos deidentificación con ninhidrina, cromatografíade placa delgada y determinación dematerias orgánicas no son apropiados paraevaluar la limpieza del reactor, ya que sulímite de detección está muy por encima dela concentración de trabajo; mientras quelos métodos de determinación de laconductividad y el pH del agua de enjuaguesí lo son , ya que son capaces de detectarlas pequeñas concentraciones y ademásresultan rápidos, sencillos y baratos.

El trabajo realizado permitió establecerevidencias documentadas de que elprocedimiento de limpieza del reactor esadecuado para evitar la contaminacióncruzada entre los inyectables

SUMMARY

At present, the validation of the processes is an imperative necessity of theMedicopharmaceutical Industry to guarantee the quality of its products and tocommercialize them. To this end, the cleaning of the equipment began to bevalidated and the validation of the cleaning of the SEN reactor that is used for

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the preparation of injections was carried out. To attain this goal, a workingmethodology was designed, the most appropiate analytical methods were selected,the acceptance criteria were established and a validation protocol was writtenthat was the fundamental working tool. Later on, the validation of the cleaningof the reactor was made and it was concluded that although the cleaning proceduredoes not guarantee the total elimination of the residuals of the product, it fulfillsthe established acceptance criteria.

Subjectheadings: EQUIPMENT AND SUPPLIES; DRUG QUALITY;TECHNOLOGY, PHARMACEUTICAL; EQUIPMENT CONTAMINATION;DRUG CONTAMINATION; DRUG COMPOUNDING, AMIKACIN.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Recibido: 21 de agosto del 2000. Aprobado: 25 de septiembre del 2000.Ing. Lisseux Castilla Valentín. Empresa de Productos Biológicos "Carlos J. Finlay". Infanta No. 1162 entreManglar y Línea del Ferrocarril. Centro Habana, Ciudad de La Habana, Cuba.

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Rev Cubana Farm 2001;35(1):40-6

Policlínico Docente "Nguyen Van Troi"

EFICACIA CLÍNICA E INMUNOLÓGICA DEL IGEGAMEN PACIENTES ANCIANOS CON INFECCIONESRESPIRATORIAS

Lourdes Rodríguez Domínguez,1 Vicente R. Caro Machado,2 Reinaldo L. Rivero Reyes3

y Florentina Azcuy Hernández4

RESUMEN

Se estudió una población genética del Policlínico Docente "Nguyen Van Troi" enedades comprendidas entre 60 y 90 años, con diagnósticos de enfermedad pulmonarobstructiva crónica e infecciones respiratorias frecuentes, correspondientes a2 consultorios del médico de la familia, con el objetivo de determinar laeficacia del IGEGAM frente a las afecciones respiratorias descritas. Se presentaronlas infecciones en el 60 % de los ancianos; de ellos el 75 % mostró mejoría clínicaevidente con el uso del IGEGAM y desde el punto de vista humoral lasinmunoglobulinas (A, G y M) elevaron sus valores de forma significativa despuésde 6 meses de tratamiento.

DeCs: ANCIANO; ANCIANO DE 80 AÑOS Y MAS; INMUNOGLOBULINAS//inmunología; INMUNOGLOBULINAS/uso terapéutico; INFECCIONES DELTRACTO RESPIRATORIO/quimioterapia; NEUMOPATIAS OBSTRUCTIVAS//quimioterapia; COMPOSICION DE MEDICAMENTOS; IGA/uso terapéutico;IGG/uso terapéutico; IGM/uso terapéutico

1 Especialista de I Grado en Medicina Interna. Profesora Asistente.2 Licenciado en Bioquímica. Especialista A en Producciones Farmacéuticas. Planta de Sueros

y Hemoderivados.3 Especialista de I Grado en Oftalmología. Instructor Docente. Hospital Oftalmológico Docente

"Rolando Pando Ferrer".4 Especialista de I Grado en Medicina General Integral. Especialista de I Grado en Ginecología

y Obstetricia.

El envejecimiento constituye unproceso dinámico y continuo de la materiaen función del tiempo, en la cualdeterminadas manifestaciones externasocasionan cambios internos. Es un

fenómeno universal y natural. No solo delhombre, en el caso del humano, este procesoes irreversible y está representado por unaserie de modificaciones, que en el tiempose produce en los seres vivos. Consiste en

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la pérdida paulatina de la capacidad deadaptación del organismo, debido a lainteracción de factores intrínsecos (genéti-cos) y extrínsecos (ambientales).

En 1980, la población de mayores de60 a de los países desarrollados constituíael 15 %, mientras que en los países subde-sarrollados era solo el 6,2 %.

En el 2000, se calcula que la poblaciónanciana se incrementará al 91 % en relacióncon la de 1970 y 230 millones en los subde-sarrollados.

Cuba ha sobrepasado ya la cifra de 74 acomo expectativa de vida al nacer, lo quedemuestra un patrón de país desarrolladoen este indicador.1

Durante el proceso de envejecimientosurgen cambios anatómicos y fisiológicosen los diferentes sistemas y órganos delhombre.2 El aparato respiratorio no escapade ello; aunque no existe enfermedad delaparato respiratorio relacionada específi-camente con la edad, pero esta modifica enmuchos aspectos determinadas afeccionesbroncopulmonares.

En el mundo entero hoy se conoce, queaun cuando la salud no lo es todo, no haynada sin salud, porque esta constituye uncomponente fundamental de la calidad devida del hombre.

Nos motivó en la realización de estetrabajo disponer del IGEGAM, medica-mento de tecnología avanzada, con altaspotencialidades, cuyo objetivo es mejorarel estado inmunológico de los ancianos, loque favorece una mejor evolución clínicafrente a enfermedades respiratorias o unaislamiento en la frecuencia en que sepresentaban estas; pues de la prevenciónoportuna dependerá en gran medida, laesperanza de mejorar la situación de losancianos.

El IGEGAM (nombre comercial), es unmedicamento nuevo, derivado del plasmasanguíneo humano, obtenido a partir de

sangre de donantes debidamentecontrolados y con certificación sobre el noriesgo de transmisión viral a través de unproceso biotecnológico que utiliza comoprecipitante de proteínas, el alcohol etílicoobteniéndose una fracción proteica con altaactividad de anticuerpos contra virus,bacterias y sus toxinas, donde prevalecenlas clases de inmunoglobulinas (Ig) IgA,IgG e IgM. Es producido en la Planta deSueros y Hemoderivados de la Ciudad deLa Habana y su uso clínico ha sidodemostrado por el licenciado Vicente Caro(Caro Machado R. Elaboración deinmunoglobulinas enriquecidas en IgA,IgM (IGEGAM). Uso clínico. La Habana,Nov., 1992).

El IGEGAM ha demostrado eficacia enpacientes inmunodeficientes e inmuno-deprimidos y tiene registro sanitario número370 de 1992. Fue utilizado en la inves-tigación el lote 02052 de la EmpresaProductora de Sueros y Hemoderivados“Albero Pesant”. Por esta razón nospropusimos determinar la eficacia clínica einmunológica del IGEGAM en afeccionesrespiratorias en pacientes mayores de 60 a.

MÉTODOS

Fue escogido aleatoriamente un grupode 40 pacientes comprendidos entre lasedades de 60 a 90 a, de 2 consultoriosmédicos del Policlínico Docente “NguyenVan Troi”, que estaban dispensarizados porenfermedad pulmonar obstructiva crónicae infecciones respiratorias frecuentes,desde enero de 1994 a abril de 1995.

El grupo control lo constituyeron lospacientes antes de iniciar el tratamiento.

Los pacientes seleccionados fueroncitados al consultorio médico y se lesexplicó el objetivo de la investigaciónsiguiendo los principios bioéticos. Todos

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decidieron participar según el criterio devoluntariedad.

A toda la muestra se le realizó elinterrogatorio y el examen físico, antes ydespués del tratamiento; se revisaron lashistorias clínicas individuales y se citarona los pacientes a consulta semanalmentepara valorar evolución clínica y administrarel medicamento. En todas las historiasclínicas se recogían los síntomas referidosy los medicamentos utilizados.

Al grupo estudio, antes de comenzarel tratamiento con IGEGAM, se le indicaronestudios paraclínicos que comprendían:hemoglobina, hematócrito, eritrosedimen-tación, creatinina (esta última con el objetivode detectar una insuficiencia renal y excluiral paciente del estudio), proteínas totales,dosificación de inmunoglobulinas (IgA, IgGe IgM) y 3 esputos bacilo ácido alcoholresistente y un cultivo para descartar unatuberculosis pulmonar. En esta etapa lospacientes se mantenían con sus trata-mientos convencionales (broncodilatadoro antibiótico, o ambos si era necesario).

Se calculó el IGEGAM a una dosis de0,6 mL/kg de peso y se administró ensubdosis de 2 mL semanales según seutilizó la vía subcutánea en regióninterescapular.

Mejoría evidente: paciente con dis-minución evidente de los síntomasrespiratorios y ausencia de infeccionesrespiratorias, no se utilizan medicamentosconvencionales broncodilatadores oantibióticos o ambos.

Mejoría ligera: paciente con dis-minución de los síntomas respiratorios,pero fue necesario utilizar medicamentosconvencionales (broncodilatadores oantibióticos, o ambos).

Sin mejoría: paciente que mantieneinvariables los síntomas respiratorios oprocesos infecciosos respiratorios, o ambosy usan medicamentos convencionales(broncodilatadores o antibióticos o ambos).

Peor: paciente que empeora su cuadrorespiratorio y requiere hospitalización.

Al término del tratamiento, es decir, alos 6 meses, a los criterios de evaluaciónclínica se sumaron la evaluación de losexámenes paraclínicos orientados al inicio,ya descritos anteriormente.

Los exámenes paraclínicos del labo-ratorio fueron coordinados por el labora-torio del Policlínico Docente “Nguyen VanTroi” y el Banco de Sangre del municipioMarianao; en este último se dosificaronlas inmunoglobulinas (IgG, IgM e IgA).

Los datos tomados de la HistoriaClínica se procesaron en computadorapersonal y fueron reflejados en tablas ygráficos para posteriormente llegar aconclusiones.

Se emplea como método estadísticopara comparar las variables del grupo controly el grupo IGEGAM la prueba de t pareada,con un nivel de alfa 0,05.

Los valores normales de variablesutilizados fueron los siguientes:

- Hemoglobina 11,5-15,5 g/L- Hematócrito 0,37 vol/L- Eritrosedimentación: 3-10 mm/h

(hombre); 5-20 mm/h (mujer)- Creatinina 53-132 mmol/L- Proteínas totales 60-80 g/L- Inmunoglobulina G 10,00-1500 Ul- Inmunoglobulina A 1,711-3,5 Ul- Inmunoglobulina M 0,6-2,5 Ul

RESULTADOS

En el grupo estudio encontramos quelos ancianos presentaban enfisema pul-monar, bronquitis crónica y con gran fre-cuencia padecían infecciones respiratorias.De ellos, 32 pacientes (80 %) eran fuma-dores, con mayor incidencia de hábito en elsexo masculino.

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Los síntomas encontrados antes deltratamiento con IGEGAM fueron cansan-cio al esfuerzo en 29 pacientes (72,5 %),tos productiva en 28 pacientes (70 %),expectoración matinal en 23 pacientes(57,5 %) y disnea en 19 pacientes (47,5 %).Posterior al tratamiento refirieron cansan-cio de esfuerzo 19 pacientes (48,7 %), tosproductiva 16 pacientes (40 %), expec-toración 20 pacientes (50 %) y disnea11 pacientes (27,5 %) . Observamos quedespués del tratamiento los síntomasreferidos disminuyeron, por lo que lospacientes presentaron una mejoría(tabla 1). Las infecciones respiratoriasfueron frecuentes en 24 pacientes (60 %)de la muestra; de ellos a las 4 semanas deltratamiento, 7 pacientes (29 %) presentabanuna mejoría evidente y a las 24 semanas(6 meses) se incrementó a 18 pacientes querepresentaban el 75 % del total de ancianos.Al término del estudio, 3 pacientes tuvieronuna mejoría ligera y 3 pacientes semantuvieron sin mejoría, para el 12,5 %.

La tabla 2 muestra el comportamientode la IgG; en el grupo control se presentacon un media de 13,19 y una desviaciónestándar de 2,27. En el grupo IGEGAMdespués del tratamiento sus valores seacercan al límite máximo de 14,61 y unadesviación estándar de 2,5. La prueba tpareada con un nivel alfa 0,05 es de -2,63con probabilidad de 0,05, por lo que esmuy significativa.

TABLA 1. Evolución de los síntomas de los ancianos antes ydespués del tratamiento con IGEGAM

Antes del Después del tratamiento tratamiento No. % No. %

SíntomasCansancio al esfuerzo 29 72,5 19 48,7Tos productiva 28 70 16 40Expectoración matinal 23 57,5 20 50Disnea 19 47,5 11 27,5

Fuente: Historia Clínica.

El comportamiento de la IgA sepresentó de forma individual disminuido en

TABLA 2. Comportamiento de las inmunoglobulinas despuésdel tratamiento con IGEGAM en los ancianos

Inmunoglobulinas Grupo control IGEGAM X DE X DE

IgG 13,19 2,27 14,61 2,50IgA 2,56 1,33 3,14 0,83IgM 1,88 0,09 2,61 0,74

Fuente: Historia Clínica.

La IgM en el grupo control seencuentra dentro de los límites normales,los cuales tienen una media de sus valoresde 1, 88 UI con una desviación estándar de0,09. El grupo IGEGAM presenta sus valoresmedios con una cifra de 2,61 UI y ladesviación estándar de 0,74. Al aplicar laprueba t pareada con un nivel de alfa de0,05, los valores de esta son –3,9132 conprobabilidad del 9,67 X 105, por lo que elaumento posterior al tratamiento se cosiderasignificativo.

La tabla 3 muestra el comportamientodel resto de las variables en los ancianosantes y después del tratamiento.

En el grupo control no encontramosalteración con respecto a los valores dehemoglobina. La media de esta fue 12,56 g/Lcon una desviación estándar de 1,16.Teniendo en cuenta la prueba t pareada noes significativo el aumento de la hemo-globina ya que su valor fue de –0,69 conprobabilidad de 0,24.

7 pacientes, lo cual representa el 18 %;pero esto no afecta la media de valores deIgA ya que el grupo control fue de 2,56 UIcon una desviación estándar de 1,33.Después del tratamiento los valores tienenun promedio de 3,14 con desviaciónestándar de 0,83. Cuando se aplica laprueba t pareada para un nivel alfa de0,05 los valores de ella son de –2,32 conprobabilidad de 0,01, por lo que elaumento de la IgA es significativo. Unavez concluido el tratamiento quedaronnormalizados sus valores.

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TABLA 3. Comportamiento humoral después del tratamiento con IGEGAM en los ancianos

Control IGEGAMVariables X DE X DE t p

Hemoglobina 12,5 g/L 1,16 12,67 g/L 0,97 -0,69 0,24Hematócrito 0,39 vol/L 0,04 0,40 vol/L 0,02 -0,70 0,24Eritrosedimentación 17,55 mm/h 9,53 14,27 mm/h 7,09 1,74 0,04Creatinina 94,84 mmol/L 18,77 95,62 mmol/L 23,79 -0,16 0,43Proteínas 70,91 g/L 14,08 78,35 g/L 5,87 -3,04 0,00154

Fuente: Historia Clínica.

fueron negativos, ya que ningún caso eraportador de tuberculosis pulmonar, enfer-medad infecto-contagiosa que encuentra unterreno propicio en los pacientes bronquí-ticos o enfisematosos.

DISCUSIÓN

Como conocemos la muestra estudiotuvo semejanzas con respecto al sexo. Lasafecciones que con mayor frecuencia seencontraron fueron el enfisema pulmonar,la bronquitis crónica y las infeccionesrespiratorias recurrentes; afectaciones quetienen una alta frecuencia en los ancianos.3

La bronquitis crónica y el enfisema pulmo-nar a menudo coinciden en el mismopaciente, igualmente sucede que aparezcanepisodios infecciosos .respiratorias.4

El hábito de fumar frecuente en losancianos favorece una serie de síntomascomo la expectoración y la disnea; ya queproduce un aumento de la capa mucíparade los bronquios y esa acumulación desecreciones obstruye las vías aéreaspequeñas, se produce una hipoventilaciónalveolar y se incrementa el desequilibrioentre perfusión y ventilación, con el tiempose produce hipoxia e hipercapnia.5

Al tabaquismo se le atribuye el 90 %de los cánceres del pulmón, el 80 % de labronquitis crónica y entre el 20 y el 25 % delos casos de enfermedad isquémica delcorazón.5,6

El cansancio al esfuerzo presente enlos pacientes de la muestra se relaciona

La eritrosedimentación en el grupocontrol tiene un promedio de 17,55 mm parauno y otro sexos con una desviaciónestándar de 9,53. Al aplicar la prueba tpareada con un nivel alfa de 0,05 el resul-tado fue de 1,74 con una probabilidad de0,04, por lo que la disminución fue estadís-ticamente significativa. La creatininapresentó un valor promedio de 94,84 mmol/Lcon una desviación estándar de 18,77. Elgrupo IGEGAM tiene como valor promedio95,62 mmol/L con una desviación estándarde 23,97.

Al aplicar la prueba t pareada el valorfue de –0,16 con una probabilidad de 0,43.Este valor no fue significativo.

El valor medio de las proteínas totalesen el grupo control fue de 70,91 g/L con unadesviación estándar de 14,08. El grupoIGEGAM presentó una media de 78,35 g/Lcon una desviación estándar de 5,87. Alaplicar la prueba t pareada con un nivel alfade 0,05 el valor obtenido es de –3,04 conuna probabilidad de 1,59 x 10-3, por lo que elaumento de las cifras resulta significativocon una probabilidad de 0,0015.

Los resultados de los esputos baciloácido alcohol resistentes directos y cultivos

El hematócrito en el grupo controlpara ambos sexos tuvo un promedio de0,39 vol/L con una desviación estándarde 0,04. El grupo IGEGAM tiene unpromedio de 0,40 vol/L con una desvia-ción estándar de 0,02. La prueba t pareadafue de –0,70 con una probabilidad de0,24, por lo que el aumento que se produjono fue significativo.

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con las alteraciones alveolares conrespecto a la capacidad de difusión o nivelde este, a medida que el ser humanoenvejece, disminuye la superficie alveolary por ende, el área disponible para elintercambio gaseoso; este hecho, juntocon las modificaciones del lecho capilarpulmonar que acompañan a la edad, sonfactores que determinan la reducciónpulmonar y el volumen sanguíneo en loscapilares pulmonares.

La tos productiva y la expectoraciónen los ancianos está relacionada con laatrofia de la mucosa de todo el tacto respi-ratorio y la submucosa fibrosa. La actividadciliar esencial para el transporte del moco ysecreciones se hace más lenta y las célulasmucíparas se multiplican incluso en losfumadores.

La disnea observada en el 48 % delos ancianos está relacionada con losefectos que sobre el sistema respiratorioproduce el envejecimiento, no afectasolamente el parénquima pulmonar,músculos respiratorios y la pared torácica;sino también, el control neurológicoresponsable de la coordinación y laregulación de la ventilación y el conjuntode estos elementos determinan unareducción de la reserva funcional delparénquima y la alteración de los meca-nismos de control ventilatorio, lo quepredispone a los pacientes geriátricos a lainsuficiencia respiratoria, además deintervenir en la vulnerabilidad del ancianoante cualquier agresión.1,7

Es importante destacar que en elanciano hay menor resistencia ante lasinfecciones por el debilitamiento de losmecanismos de defensa del organismo.6,8,9

Uno de los factores cardinales en laaparición de las infecciones en lospacientes geriátricos lo constituye elpadecer de enfermedades crónicas odebilitantes que comprometen la defensay coordinan más hospitalización.

Al analizar el estudio inmunológico seconoce que puede haber alteración en las

inmunoglobulinas, sobre todo en la IgG, quees la única que al parecer aumenta la fago-citosis de los macrófagos alveolares.10,11

Con respecto a la IgA se plantea, porScorell Gómez, que los valores de esta paralas personas sanas de 60 a 65 a se encuen-tran anormales.11-13

Otros estudios hacen referencia a ladisminución de los valores de IgA enpersonas de edad con neumopatías.9

La IgM es la primera en intervenir enprocesos infecciosos,10,14,15 aunque no seencontró alteración de esta en relación conla edad como otros autores.13 Otros refierenalteraciones de IgM en los ancianos, la cualresulta imprescindible para la opsonizacióny destrucción de los gérmenes gram-negativos como: Pseudomonas, KlebsiellaSerratia y otros.1,12 Esto explica la respuestafavorable frente a infecciones en el presenteestudio después de la administración deIGEGAM por la elevación de estainmunoglobulina.

Con respecto a los valores de la hemo-globina se plantea que en el anciano sepresentan escasas modificaciones desde elpunto de vista cuantitativo, ya que laporción residual de la médula ósea que nose encuentra ocupada por tejido adiposologra cumplir sus funciones.8 El hematócritoexpresa el volumen de los hematíes, por loque posee estrecha relación con los valoresde hemoglobina.

La velocidad de sedimentaciónglobular refleja la composición del plasma,una vez concluido el tratamiento estadisminuye significativamente lo que está enrelación con la disminución de la sepsisrespiratoria.13

Hay autores que plantean que alavanzar la edad se produce incrementocontinuo de la creatinina.9 En el estudiolos pacientes mantuvieron antes y despuésdel tratamiento cifras dentro de límitesnormales.

Referente a los valores de las proteínasse plantea que existe poca alteración de susvalores en el anciano.7

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SUMMARY

A genetical population aged 60-90 with diagnoses of chronic obstructivepulmonary disease and frequent respiratory infections that receive attention at2 family physcian’s offices corresponding to “Nguyen Van Troi” TeachingPolyclinic was studied aimed at determining the efficiency of IGEGAM inrelation to the described respiratory infections. The infections appeared in 60 %of the elderly. 75 % of them had an evident clinical improvement with the useof IGEGAM and from the humoral point of view the immunoglobulins (A, G yM) elevated their values significantly after 6 months of treatment.

Subject headings: AGED; AGED, 80 AND OVER; IMMUNOGLOBULINS//immunology; IMMUNOGLOBULINS/therapeutic use; RESPIRATORY TRACTINFECTIONS/drug therapy; LUNG DISEASES, OBSTRUCTIVE/drug therapy; DRUG,COMPOUNDING; IGA/therapeutic use; IGG/therapeutic use; IGM/therapeutic use.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Recibido: 30 de septiembre del 2000. Aprobado: 31 de octubre del 2000.Dra. Lourdes Rodríguez Domínguez. Policlínico Docente "Nguyen Van Troi". Reina No. 313 altos entreLealtad y Campanario, Centro Habana, Cuba.

El resultado encontrado en la investi-gación puede estar relacionado con unaumento de la estimulación de las célulashepáticas, lo que favorece una elevaciónde los valores sanguíneos.13

Se demostró la eficiencia del IGEGAMpor mejoría clínica que mostraron lospacientes, y desde el punto de vistainmunológico se normalizaron los valoresde IgA y se incrementaron los valores deIgG e IgM de forma significativa.

De las otras variables estudiadas, laeritrosedimentación disminuyó y las

proteínas totales incrementaron sus valoressignificativamente.

Las cifras de hemoglobina, hematócritoy creatinina no mostraron variaciónposterior al tratamiento con IGEGAM.

Se recomienda promover el uso de lainmunoterapia con IGEGAM en el área deatención primaria en aquellos pacientesgeriátricos que requieren su administración,así como ampliar la muestra de estudio eincorporar en la esfera investigativa elproducto frente a otras afecciones.

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Rev Cubana Farm 2001;35(1):47-50

Productos Naturales

Instituto de Farmacia y AlimentosUniversidad de La Habana

RENDIMIENTO DE ACEITE ESENCIAL EN PINUS CARIBAEAMORELET SEGÚN EL SECADO AL SOL Y A LA SOMBRA. III

Rolando Quert Álvarez,1 Migdalia Miranda Martínez,2 Benito Leyva Córdova,3 HumbertoGarcía Corrales4 y Fisma Gelabert Ayón5

RESUMEN

Se presentan los resultados obtenidos en la determinación del rendimiento deaceite esencial Pinus caribaea Moralet (pino macho), en función de lascondiciones y tiempo de exposición al sol y a la sombra del follaje de dichaespecie endémica de Cuba. El estudio se realizó con árboles existentes en áreas dela Estación Experimental Forestal de Viñales, provincia de Pinar del Río conedad de 30 a. El tamaño de muestra fue de 3 árboles y el tiempo de destilaciónpara la extracción del aceite esencial de 3 h. Se tomaron muestra del follaje entre1 y 20 d expuesto a las condiciones de secado, en intervalos de 1, 3, 6, 10 y 20 d.Los resultados obtenidos demostraron que el follaje expuesto a la sombra contieneun mayor porcentaje de aceite esencial que el follaje expuesto al sol, y que eltiempo de exposición al sol, influye significativamente sobre el rendimiento apartir del tercer día, mientras que en el follaje expuesto a la sombra, las diferenciasse hacen significativas a partir de los 6 d.

Descriptores DeCS: PLANTAS MEDICINALES; ACEITES VOLATILES.

1 Investigador Auxiliar.2 Doctora en Ciencias Químicas.3 Investigador Agregado. Instituto de Investigaciones Forestales.4 Aspirante a Investigador. Instituto de Investigaciones Forestales.5 Técnico. Instituto de Investigaciones Forestales.

En un trabajo publicado en la RevistaCubana de Farmacia de 1997,1 nosreferimos a la variación del contenido decarotenos en el follaje de Pinus caribaeaMorelet, especie objeto de estudio,considerando la extracción del aceite

esencial y las condiciones y tiempo deexposición del follaje.

Tomando en cuenta que para losespecialistas encargados de desarrollar latecnología de aprovechamiento del follajeforestal, resulta de gran utilidad conocer

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cuál es el tiempo máximo que puede estarexpuesto este al sol, a la sombra y/o alsereno, sin que se afecte significativamenteel rendimiento de aceite esencial, el presentetrabajo tiene como objetivo dar respuesta aesta interrogante.

MÉTODOS

El follaje utilizado para determinar elrendimiento de aceite esencial se muestreóen un sitio forestal III en árboles de 30 a. Setomaron muestra de 3 árboles al azar,2

existentes en áreas de la EstaciónExperimental Forestal de Viñales, Pinar delRío. El material vegetal se tomó de las ramasubicadas entre 6-7 m de altura, tratando entodos los casos que estas estuvieran a lamisma altura, las acículas se separaron dela parte maderable manualmente, lasmuestras se colocaron al sol y a la sombra,en partidas de 1 kg cada una para cadaexposición, con un tiempo de 1-20 d. El

aceite esencial se obtuvo por el método dehidrodestilación, en un equipo dedestilación con capacidad de 1 L, enintervalos de 1, 3, 6, 10 y 20 d, tanto para lasmuestras extendidas a la sombra como al sol.

El rendimiento de aceite esencial sedeterminó mediante la expresión:

M1P = M2

donde:

M1: masa final de aceite esencial.

M2: masa inicial de follaje

100 = factor matemático.

Se empleó un diseño experimentalcompletamente aleatorizado con 3 réplicaspara cada variante estudiada. La evaluaciónestadística se realizó mediante un análisisde varianza de clasificación doble; comofactor A se utilizó las condiciones de

FIG. Rendimiento de aceiteesencial en función del secadoal sol y a la sombra.

• 100

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

SombraSol

% de aceite esencial

0,21

0,21

0,20

0,19

0,16

0,12

0,13

0,11

0,10

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exposición a la sombra y al sol, y como B eltiempo de exposición. Se empleó la pruebade rango múltiple de Duncan para lacomparación de medias, a un nivel designificación del 5 %.

RESULTADOS

En la figura se presenta el resultadoobtenido en la determinación del rendimientode aceite esencial en el follaje de la especie,según las condiciones y tiempo deexposición al sol y a la sombra. Como seaprecia existen diferencias significativas enel rendimiento de aceite esencial entre lasmuestras sometidas a las condiciones desecado al sol y a la sombra. El rendimientode aceite esencial difiere significativamenteen el follaje expuesto al sol con respecto alque ha sido expuesto a la sombra, a partir deltercer día. Para el expuesto a la sombra, hasta3 d, las diferencias no son significativas,mientras que para el follaje expuesto al sol sí.Cuando el follaje está expuesto a la sombra,la disminución se hace significativa a partirde los 6 d con una pérdida del 23 % y a los20 d del 48 %. Mientras que en el follajeexpuesto al sol a los 6 d la disminución deaceite esencial es del 43 % y a los 20 d del 52 %.

DISCUSIÓN

De los resultados obtenidos se infiereque el rendimiento de aceite esencial se veafectado por las condiciones y tiempo deexposición al sol y sombra, siendo mayoresen el expuesto al sol. Esto puede deberse aque durante la exposición del follaje al sol,este recibe mayor calor y como los aceitesesenciales son compuestos volátiles, esteproceso se favorece, produciéndose una

pérdida del 10 % en peso del total de aceite,mientras que para el expuesto a la sombrasolo se produce una pérdida del 5 %.

Resultados similares son discutidos porYagodin,3 referido al Pinus silvestris L. deSiberia, quien plantea que una vez taladoslos árboles, el rendimiento de aceite esencialvarió significativamente a partir de los 3 dde exposición en las condiciones naturalesde la región. De igual forma Sandret4

publica que en las especies Eucalyptusglobulus y Eucalyptus maideni elrendimiento de aceite esencial del follajeexpuesto al sol y sombra se afectasignificativamente a partir de los 10 d, loque fue corroborado por Miranda, para laespecie Eucalyptus citriodora Hook(Contribución al estudio del Eucalyptuscitriodora Hook de Cuba. Tesis doctoralpara optar por el grado científico de Doctoren Ciencias Químicas, 1989). Aunque estasespecies no pertenecen al mismo género,consideramos oportuno referirlas, ya queson especies forestales (plantas superiores)y productoras de aceite esencial.

De los resultados discutidos se deduceque la exposición prolongada del follaje encondiciones naturales influye significa-tivamente en el rendimiento de aceiteesencial y que es independiente de lasespecies y del género.

El resultado relacionado con el tiempode exposición al sol y a la sombra defineque el tiempo máximo que puede estarexpuesto el follaje de la especie es de 6 d,cuando el tamaño de la muestra es de 1 kg,y da criterios a los especialistas en aprove-chamiento forestal para la elaboración de lacarta tecnológica en la tala de los árboles yla utilización del follaje para la producciónde aceite esencial.

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50

SUMMARY

The results obtained in the determination of the yield of the essential oil fromPinus caribaea Moralet (male pine) according to the conditions and time ofexposure to the sun and to the shade of the foliage of this Cuban endemicspecies are presented. Trees of 30 years old located in the areas of theExperimental Forestal Station of Viñales, Pinar del Río province, were used inthe study. The size of the sample was of 3 trees and the time of distillation forthe extraction of the essential oil was of 3 hours. Specimens of the foliage weretaken at intervals of 1, 3, 6, 10 and 20 days. The results obtained showed thatthe foliage exposed to the shade has a higher percentage of essential oil that thefoliage exposed to the sun, and that the time of exposure to the sun influencessignificantly on the yield starting from the third day on, whereas in the foliageexposed to the shade the differences are remarkable from the sixth day on.

Subject headings: PLANTS, MEDICINAL: OIL, VOLATILE.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Recibido: 4 de abril del 2000. Aprobado: 16 de junio del 2000.Lic. Rolando Quert Álvarez. Instituto de Farmacia y Alimentos. Universidad de La Habana. Ave 23No. 21422 entre 214 y 222, La Coronela, municipio La Lisa, Ciudad de La Habana, Cuba.

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Rev Cubana Farm 2001;35(1):51-5

Instituto de Farmacia y AlimentosUniversidad de La Habana

EXTRACTO ETÉREO DE FRUTOS DE BROMELIA PINGUIN L.(PIÑA DE RATÓN) POR EL SISTEMA ACOPLADO CG-EM

Juan Abreu Payrol,1 Migdalia Miranda Martínez2 y Janet Lora García3

RESUMEN

Se realizó el estudio del extracto etéreo de frutos de Bromelia pinguin L.(piña de ratón) mediante el sistema acoplado CG-EM. Se detectó lapresencia de los ácidos 2-pentenodioico, octanodioico, ftálico, cítrico,nonanodioico, 12-metil tetradecanoico, palmítico, oleico, l inolénico,e s t e á r i c o , 1 1 , 1 4 , 1 7 -eicosatrienoico y 11,14-eicosadienoico. Laidentificación fue realizada sobre la base de los tiempos de retención yfue confirmada por comparación de los espectros de masas con los de patrones.Por primera vez es informada la presencia de estos compuestos en los frutosde B. pinguin L.

DeCS: PLANTAS MEDICINALES; ESPECTROMETRIA DE MASA/métodos;CROMATOGRAFIA DE GASES/métodos; ESTERES; ACIDOS GRASOS.

1 Profesor Auxiliar.2 Profesora Titular.3 Licenciada en Ciencias Farmacéuticas. Centro de Química Farmacéutica.

Rafauff y otros, en 1981, al caracterizaralgunos componentes de la raíz y tallo basalde Bromelia pinguin L. (piña de ratón)habían detectado la presencia de 1-mono-araquidina y de los ácidos esteárico,palmítico y aráquico.1

Los ácidos se encuentran en todos losorganismos vivos, presentándose conelevada frecuencia ellos mismos o susderivados.2 Los lípidos o ésteres grasos seobtienen por expresión o extracción con

solventes, luego se someten a saponi-ficación y por cambio de solventes seseparan las sales de los ácidos grasos.3

Con frecuencia se preparan los ésteresde metilo para efectuar comparacionescromatográficas en fase de vapor de lostiempos de retención de compuestosconocidos con otros desconocidos. Losésteres de metilo tienen la ventaja de queson más volátiles, se separan más fácil-mente y para cromatografía gaseosa eluyen

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de la columna dando picos más agudos quelos ácidos correspondientes4 (Miranda M.Contribución al estudio farmacológico delEucalyptus citriodora Hook que crece enCuba. Universidad de La Habana, Facultadde Farmacia y Alimentos. Ciudad de LaHabana, 1989).

El acoplamiento de la cromatografíagaseosa con la espectrometría de masas(CG-EM) es reconocido en el mundo porsus grandes posibilidades de identificacióny se utiliza ampliamente en los estudiosestructurales y en el análisis de mezclascomplejas de compuestos orgánicos.

Las bases de datos de espectros sonde gran utilidad para caracterizar, de formarápida y eficiente, compuestos orgánicoscon estructuras muy diversas.5,6

MÉTODOS

Se procedió a la extracción yaislamiento de compuestos del frutomediante el procedimiento expuesto en lafigura 1. Los ésteres metílicos se prepararonsegún Miranda (1989).

El análisis de los ésteres metílicos delos ácidos grasos por el sistema acopladoCG-EM se realizó en un equipo TRIO-1 000con impacto electrónico a 70 eV, bajo lassiguientes condiciones:

− Columna capilar de 25 m de largo y0,25 mm de diámetro interno, impregnadacon OV-1701 como fase estacionaria.

− Volumen inyectado: 1 µL (splitless 15 s).

FIG. 1. Diagrama de extracción y obtención de la fracción para CG-EM.

Extracto A

Pulpa del fruto

Extracto A

Extracto etéreo

EtOH 96 %

EtOH 45 %

EtOH 95 %KOH / etanol 4 mol / L

Saponificación (3 h) Concentración

H O2 Éter etílico

Extraer 3 veces

Fase etérea(material insaponificable)

Fase acuosa(sales de ácidos grasos)

Fase acuosa(sales de ácidos grasos)

DiluirDisolver

Maceración

Concentrar a 200 mLen rotoevaporador

Extraer con éter etílico (3 veces)

Extracto etéreo

Decantar Centrifugar 1 800 r.p.m. 10 min Filtrar

Sodio

Extracto B

HCI 1 mol / L

Extracto pH 3

Éter etílico

Extraer 3 veces

Fase acuosa (desechar)

Fase etérea ( ácidos grasos)

Diazometano

Éteres metílicosExtracto para CG-EM

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− Temperatura de inyección: 270 °C.− Temperatura de la fuente y la interfase:

270 °C.− Temperatura inicial del horno: 100 °C

por 1 min.− Programación de temperatura: 10 °C por

minuto hasta temperatura final de 270 °Cpor 15 min.

RESULTADOS

El cromatograma gaseoso obtenidomuestra la composición compleja delextracto analizado (fig. 2). Está dividido en2 partes, de tiempo de retención 0 a12,00 min la primera parte y de tiempo deretención 12,00 a 22,00 min la segunda parte,para tener una ampliación que nos permitieraestudiarlo mejor.

La fracción de ácidos grasos obtenidasegún el procedimiento descrito, se analizó

por el sistema acoplado CG-EM y se compa-raron los valores de tiempo de retención yespectros de los diferentes picos cromato-gráficos con los de patrones auténticos.

En la tabla se indican los picos cromato-gráficos que pudieron ser asignadossiguiendo estos criterios.

DISCUSIÓN

El cromatograma gaseoso de los éste-res metílicos de los ácidos grasos (fig. 2)presentó aproximadamente 35 picos croma-tográficos, de ellos 2 mayoritarios, detec-tados por ampliación de las zonas croma-tográficas.

El análisis de los expectros de masaspermitió confirmar la identificación de12 componentes (tabla).

Puede apreciarse que el componentemayoritario es el ácido linolénico, seguidopor el ácido esteárico y luego por el ácido

FIG. 2. Cromatograma gaseoso de la fracción de ésteres metílicos de los ácidos grasos.

0

0

min

min

13,00

3,00

14,00

1

15,00

5,004,00

16,00

6,00

17,00

7,00

18,00

8,00

19,00

9,00

20,00

10,00

21,00

11,00

22,00

12,00

%FS

%FS

100

100

25

27

28

29

32

6

26

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palmítico. Se observa la presencia de ácidosdicarboxílicos y tricarboxílicos, así como deácidos aromáticos. La composición deácidos grasos de este fruto no se ha repor-tado con anterioridad en la literatura.

La mayoría de los compuestosquedaron sin identificar. Con tiempos deretención entre 8-10 min, los compuestosparecen ser ácidos aromáticos y dicarbo-xílicos, según los patrones de fragmentación

TABLA . Compuestos identificados en la fracción de ácidos grasos

Pico No. Tiempo de retención (min) Compuesto

1 3,70 Ácido 2-pentenodioico, dimetil éster6 7,78 Ácido octanodioico, dimetil éster11 8,52 Ácido ftálico, dimetil éster13 8,88 Ácido 2-hidroxi-1,2,3-tricarboxipropano, trimetil

éster (ácido cítrico)14 8,97 Ácido nonanodioico, dimetil éster21 11,13 Ácido 12-metiltetradecanoico, metil éster25 12,23 Ácido hexadecanoico, metil éster (ácido palmítico)26 14,00 Ácido 9-octadecenoico, metil éster (ácido oleico)27 14,15 Ácido 9,12-octadecadienoico, metil éster (ácido

linolénico)28 14,16 Ácido octadecanoico, metil éster (ácido esteárico)29 14,25 Ácido 11,14,17-eicosatrienoico, metil éster32 15,45 Ácido 11,14-eicosadienoico, metil éster

observados. Alrededor de los 18 min, lospatrones de fragmentación apuntan aácidos triinsaturados isoméricos.

El estudio del extracto etéreo de frutosde B. pinguin L. determinó la composicióncompleja de la porción apolar de este fruto.Quedan por identificar un buen número deotros compuestos ácidos, que parecen seraromáticos, dicarboxílicos y poliinsatu-rados principalmente.

SUMMARY

The study of the ethereal extract from fruits of Bromelia pinguin L. (“piña deratón”) was conducted by the CG-EM coupled system. The following acids weredetected: 2-pentanedioic, octanedioic, phthalic, ci tr ic, nonanodioic,12-methyltetradecanoic, palmitic, oleic, linoleic, stearic, 11,14,17-eicosatrie-noic and 11,14-eicosadienoic. Their identification was based on the times ofretention and it was confirmed by comparing the spectra of masses with thoseof patterns. The presence of these compounds in the fruits of B. pinguin L. isreported for the first time.

Subject headings: PLANTS, MEDICINAL; SPECTRUM ANALYSIS/methods;CHROMATOGRAPHY, GAS/methods; ESTERS; FATTY ACIDS.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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1988:235.

Recibido: 11 de agosto del 2000. Aprobado: 12 de septiembre del 2000.M. Sc. Juan Abreu Payrol. Instituto de Farmacia y Alimentos. Universidad de La Habana. Ave 23 No.21422 entre 214 y 222, La Coronela, municipio La Lisa, Ciudad de La Habana, Cuba.

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Rev Cubana Farm 2001;35(1):56-60

Instituto de Farmacia y AlimentosUniversidad de La Habana

ACTIVIDAD FARMACOLÓGICA PRELIMINAR DEL FRUTODE BROMELIA PINGUIN L. (PIÑA DE RATÓN)

Juan Abreu Payrol,1 Migdalia Miranda Martínez,2 Griset Toledo Carrabeo3 y OsmaidaCastillo García4

RESUMEN

Se presentan los resultados del estudio farmacológico preliminar de un extractohidroalcohólico concentrado de los frutos de Bromelia pinguin L. (piña deratón) mediante bioensayos sencillos y confiables. Se determinó la toxicidadfrente a Artemia salina Leach, que resultó muy baja. Se probó la actividadantihelmíntica contra Lombricus terrestri, con resultados relevantes. El extractono mostró actividad contra diversas cepas de hongos y bacterias.

DeCS: PLANTAS MEDICINALES; EXTRACTOS VEGETALES/toxicidad;EXTRACTOS VEGETALES/farmacología; BROMELAINAS/farmacología;ARTEMIA; ANTIHELMINTICOS; QUIMICA FARMACEUTICA;BIOENSAYO/métodos

1 Máster en Ciencias Química Farmacéutica. Profesor Auxiliar.2 Doctora en Ciencias Farmacéuticas. Profesora Titular.3 Master en Ciencias en Tecnología Farmacéutica.4 Licenciada en Ciencias Farmacéuticas.

En Bromelia pinguin L. han sidorealizados escasos ensayos farmacoló-gicos. Sus raíces y tallos han mostradoactividad citotóxica y sus frutos actividadanticoagulante y antiinflamatoria.1,2

En 1982, Meyer y otros reportaron unéxito notable mediante un bioensayo simplecon la utilización de camarones de mar(Artemia salina Leach). El método es rápido,confiable, barato, y puede ser convenien-temente aplicado por químicos, botánicos,

u otros que carecen de recursos o lacapacidad técnica requerida para realizarbioensayos estándar. 3-5 El ensayo hamostrado buena correlación con lacitotoxicidad P-388,6 y se confirmó suutilidad para la determinación preliminar dela actividad antitumoral.

Kaushik y otros (1981) describieronun ensayo simple para determinar laactividad antihelmíntica.7 El método se hasimplificado con el empleo de Lumbricus

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terrestris , de más fácil adquisición ymanejo.8 Ha sido empleado con éxito porvarios autores en el estudio de la actividadantihelmíntica de extractos vegetales9

(Iyarreta M. Estudio preliminar de Por-tulaca oleracea L. como droga antihel-míntica. Tesis. Universidad de La Habana,Instituto de Farmacia y Alimentos. 1996).

La actividad antimicrobiana de lasplantas puede detectarse mediante laobservación de la respuesta al crecimientode varios microorganismos a tejidos oextractos de plantas puestos en contactocon ellos. En una investigación de caráctergeneral debe seleccionarse la mayordiversidad de microorganismos posible,10

solo para tener conocimiento de la presenciao ausencia de sustancias con actividadantimicrobiana en el extracto.

Dado que el uso tradicional de los frutosde esta especie es como antipara-sitario,ingeridos al natural, en nuestro trabajoevaluamos de modo preliminar su actividadfarmacológica, incluyendo su actividadcitotóxica, antimicrobiana y antihelmíntica.

FIG. Procedimiento para la obtención del extracto hidroalcohólico evaluado.

MÉTODOS

El extracto hidroalcohólico estudiado,con consistencia de sirope, se obtuvosegún el procedimiento expuesto en la fig.

Toxicidad contra Artemia salinaLeach: se procede según Meyer y otros.5

Los huevos de Artemia salina Leach seobtienen del Centro de Reproducción deLarvas de Camarón de Yaguanabo(Cienfuegos). Se evalúan concentracionesde 10, 100 y 1 000 µg/mL, a las cuales esposible determinar la concentración letalmedia (LC

50) en extractos activos.

Actividad antihelmíntica: se procedesegún la técnica in vitro descrita,7 con elempleo del anélido L. terrestris9 (Iyarreta M.Estudio preliminar de Portulaca oleracea L.como droga antihelmíntica. Tesis. Univer-sidad de La Habana, Instituto de Farmaciay Alimentos. 1996). El extracto hidroalco-hólico que se evalúa se diluye al 1 y 10 %con agua y se ensayan los extractosacuosos así obtenidos. Como referencia seemplean soluciones de hexahidrato depiperazina, fabricado por la Empresa

Pulpa del fruto 1,3 kg

EtOH 96 % EtOH 85 % 10:1

EtOH 85 % 10:1

Maceración 21 días

Reposo hasta obtener líquido sobrenadante claro

Decantar

Suspensión turbia

Sobrenadante

Centrifugar 1 800 r.p.m., 10 min

Reunir Sólido

Extracto A Concentración a 200 mL en retoevaporador

Extracto hidroalcohólico evaluado

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58

Los resultados del ensayo de actividadantihelmíntica se resume en la tabla 2. Semuestran los tiempos de parálisis y muerteen los casos en que esto ocurrió. Sevaloraron otras manifestaciones que sediscuten más adelante.

En el ensayo de actividad antimicro-biana no se detectó inhibición en elcrecimiento de ninguno de los microor-ganimos evaluados.

DISCUSIÓN

La actividad biológica del extractohidroalcohólico frente a A. salina Leach esbaja (tabla 1), ya que a la concentración másalta, 1 000 ug/mL, no se alcanza la LC

50;

mientras que con estas concentraciones(las normadas en el ensayo), ya es posibledeterminarla en extractos activos.5,6

Es posible plantear entonces que, dadala correlación entre este ensayo y la

TABLA 2. Experimento de actividad biológica contraLumbricus terrestris

Tiempo de Tiempo de parálisis (h) muerte (h)

Control de agua destilada - -Control de suero salino - -fisiológicoReferencia de piperazina 6 240,06 %Referencia de piperazina 2 % 0,5 2Solución de muestra al 1 % - -Solución de muestra al 10 % - 0,5

Laboratorio Farmacéutico “Saúl Delgado”,Ciudad de La Habana, al 0,06 y al 2 %,preparadas con agua destilada. Se evalúael tiempo de parálisis y muerte de los vermes,considerado este último cuando no sonestimulados al introducirlos en baño deagua a 50 °C durante 10 s.

Estudio para determinar la actividadantimicrobiana de la muestra: se procedesegún el método de difusión en agar,11 conel uso de discos de papel. El medio decultivo que se emplea es agar Mueller--Hinton; se utiliza como control aguadestilada. Se evalúa una solución delextracto hidroalcohólico diluido en agua al10 %. Los microorganismos tomados comocontrol son: Bacillus subtilis ATCC 6633,Bacillus turingiensis, Escherichia coliATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC25923, Candida s.p.p.

RESULTADOS

Los resultados del ensayo de toxicidadcontra A. salina Leach se muestran en latabla 1. A la mayor concentración empleada(1 000 µg/mL) solo se alcanzó el 30 % demortalidad como valor medio. Por otra parte,el análisis de regresión indicó que no existeuna relación importante entre laconcentración y la actividad biológica, puesr y F no tuvieron valores significativos, paraun nivel de significación del 95 % (r = 0,536;F = 2,826).

TABLA 1. Experimento de actividad biológica contra Artemia salina Leach

Concentración % de Concentración % de Concentra ción % de (µg/mL) muertes (µg/mL) muertes (µg/mL) muertes

10 0 100 10 1 000 3010 10 100 30 1 000 1010 20 100 16,7 1 000 50

Media 10 Media 18,9 Media 30

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59

citotoxicidad, el extracto hidroalcohólicoparece tener baja citotoxicidad.

En el ensayo de determinación de laactividad antihelmíntica (tabla 2), en loscontroles de agua destilada y soluciónsalina fisiológica no hubo muerte niparálisis, e incluso los vermes no sufrieronalteración.

En la solución de piperazina al 0,06 %,a los 15 min se produjo sangramiento,disminución de la motilidad; a los 2 hmostraron afectación en el tegumento;parálisis a las 6 h y muerte al cumplirse las24 h del estudio.

Los vermes expuestos a la solución depiperazina al 2 % mostraron a los 15 mindisminución de la motilidad, afectación deltegumento, sangre, presencia de excremen-tos, o sea, daño general, para sufrir a los30 min parálisis general. La muerte ocurrióa las 2 h.

En la solución al 1 %, a los 15 min seobservó sangre y excrementos, este estadose mantuvo las 24 h que duró el experimento,pero no ocurrió parálisis ni muerte.

En la solución al 10 % casi inmedia-tamente se evidenció relajación, flaccidez,

falta de tegumento, y sangre; la muerte delos vermes ocurrió en 30 min.

Este ensayo evidencia que la actividadantihelmíntica de la solución al 10 % delextracto hidroalcohólico es superior a la deuna solución de piperazina al 2 %; sinembargo, su solución al 1 % es menos activaque una solución de piperazina al 0,6 %.Esta actividad puede ser de interésfarmacológico.

En el estudio de la actividad antimicro-biana no se produjo inhibición delcrecimiento de los microorganismoscontroles. Luego, el extracto hidroalcohólicono muestra actividad antimicrobiana en unasolución al 10 %, que es alta, ya que elextracto hidroalcohólico inicial se obtuvopor concentración hasta sirope de más de10 L de extracto (fig).

La fracción soluble en etanol del frutono muestra baja citotoxicidad contra A,salina Leach y posee al 10 % considerableactividad antihelmíntica, por lo que quedademostrada la actividad atribuida. Puede serentonces un extracto útil para emplearsecomo antihelmíntico, y deben continuarselos estudios en esta dirección.

SUMMARY

The results of the preliminary pharmacological study of a concentratedhydroalcoholic extract from the fruits of Bromelia pinguin L. (“piña de ratón”)by simple and reliable bioassays are presented. The toxicity against Artemiasalina Leach, which was very low, was determined. The anthelmintic activityagainst Lombricus terrestri was proved with remarkable results. No activity ofthe extract against the strains of fungi and bacteria was observed.

Subject headings: PLANTS, MEDICINAL; PLANT EXTRACTS/toxicity;PLANT EXTRACTS/pharmacology; BROMELAINS/pharmacology;ARTEMIA; ANTHELMINTICS; CHEMISTRY, PHARMACEUTICAL,BIOLOGICAL ASSAY/methods.

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60

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Aust J Chem 1966;19(12):2331-8. 9. Sánchez V, Sandoval D. Alcaloides en especies cubanas del género Croton L. II. Contribución al estudio

químico del C. stenophyllus Griseb. Rev Cubana Farm 1982;(16):45-55.

Recibido: 19 de septiembre del 2000. Aprobado: 30 de octubre del 2000.Lic. Armando Payo Hill. Instituto de Ecología y Sistemática. Carretera de Varona km 3½ Capdevila,municipio Rancho Boyeros, Ciudad de La Habana, Cuba.

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Rev Cubana Farm 2001;35(1):61-5

Instituto de Ecología y Sistemática

ALCALOIDES EN LA ESPECIE CUBANA CROTON MICRADENUSURB

Armando Payo Hill,1 Daisy Sandoval López,2 Hermán Vélez Castro3 y Marledis OquendoSuárez4

RESUMEN

Se emprendió el estudio del contenido de alcaloides en las hojas y tallos de laespecie endémica cubana, potencialmente medicinal, Crotón micradenus Urb.Para la extracción y purificación de dichos metabolitos se utilizaron solventesorgánicos y métodos cromatográficos de separación por columna y placa.Mediante métodos espectroscópicos de UV, IR, Masa y RMN 1H y 13C, así comopor la medición de sus constantes físicas, se caracterizaron 4 de los 6 alcaloidesaislados, de ellos 3 morfinandienonas: ocobotrina, sinoacutina y 8,14 dihi-drosalutaridina y una aporfina: isoboldina.

DeCs: ALCALOIDES/química; PLANTAS MEDICINALES; EXTRACTOSVEGETALES/química; QUIMICA FARMACEUTICA; CROMATOGRAFIA ENCAPA DELGADA; ALCALOIDES/aislamiento & purificación; ESPEC-TROMETRIA DE MASA/métodos.

1 Licenciado en Bioquímica. Investigador Agregado.2 Licenciada en Química. Investigadora Agregada.3 Doctor en Química. Investigador Titular. Centro de Química Farmacéutica.4 Auxiliar Técnico para Investigaciones Científicas.

El estudio acerca de la composiciónquímica y en particular de alcaloides ennuestra flora, es aún insuficiente, debidoentre otras causas a su abundancia enespecies (alrededor de 7 000) y su elevadoporcentaje de endemismos (aproxima-damente 49,3 %).1

El género Croton, perteneciente a unade las familias más numerosas de la floracubana, Euphorbiaceae, cuenta con un

total de 45 especies, 28 de ellas ende-mismos.2 Según resultados preliminares enla detección de alcaloides en especiescubanas de este género,3 el contenido deeste metabolito en la especie endémicacubana Croton micradenus Urb. fue de0,41 % en las hojas y de 0,05 % en los tallos.A la especie se le atribuyen propiedadesmedicinales como son diuréticas, diaforé-ticas, detersivas, antiespasmódicas yantimaláricas.4

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Atendiendo a las premisas expuestasanteriormente, emprendimos el tamizaje dealcaloides en dicha especie, con el objetivode caracterizar este tipo de metabolitopresente en esta planta potencialmentemedicinal (Fuentes V. Las plantas medicinalesen Cuba. Tesis de Candidato a Doctor enCiencias Biológicas. La Habana. 1987).

MÉTODOS

El material vegetal fue colectado el10 de febrero de 1986, en la localidad deBuena Vista, San Antonio del Sur, provinciade Guantánamo, Cuba, por la ingenieraRamona Oviedo Prieto, quien además loidentificó. Un ejemplar de la especie seencuentra depositado en el HerbarioHAC, del Insti tuto de Ecología ySistemática (IES), Ministerio de Ciencia,Tecnología y Medio Ambiente (CITMA)catalogado como HAC 41194.

Las hojas y tallos de la planta fueronsecados a temperatura ambiente por espaciode 5 d y posteriormente se colocaron enuna estufa con recirculación de aire, atemperatura entre 40-50 °C. Ambas partes delvegetal fueron molidas y se obtuvo un totalde 7,5 kg de polvo.

La extracción del material vegetal serealizó con etanol (EtOH) al 98 % durante24 h, se filtró y se repitió la operación 4 veces,hasta ensayo negativo al reactivo de Mayer.

El extracto etanólico se llevó a sequedaden un evaporador rotatorio a presiónreducida, seguidamente fue tratado conmezcla éter de petróleo (EtPt) : benceno(C

6H

6) (1:1) y ácido tartárico al 5 %. La fase

acuosa ácida fue separada y alcalinizadahasta pH 9 con bicarbonato de potasio(KHCO

3) y extraída 4 veces con mezcla

cloroformo (CHCl3) : EtOH (2:1). La fase

orgánica fue concentrada y llevada asequedad; se obtuvo un crudo total dealcaloides con un peso de 30,5345 g.

Se realizó cromatografía de capadelgada al crudo de alcaloides totales sobresilicagel Merck GF 254 como absorbentemezcla CHCl

3: metanol (MeOH) (95:5) como

eluyente y reactivo de Dragendorff comorevelador.

El fraccionamiento del crudo dealcaloides se realizó mediante cromatografíaen columna sobre silicagel 60 (0,2-0,5 mm)(35-70 Mesh ASTM) y como fase móvilsistema CHCl

3 : MeOH de polaridad

creciente.La determinación del punto de fusión

y rotación específica se realizó en unmicroscopio modelo MHK y un equipoPolartronic (Universal) respectivamente.

Los datos espectroscópicos seobtuvieron en equipos Specord (UV), PyeUnican SP 1100 (IR), Jeol DX-300 (Masa) yJeol FX-90Q-90 MHz (RMN-1H)-22,53 MHz(RMN-13C).

RESULTADOS

Se obtuvo un cromatograma corres-pondiente a un total de 8 manchas dealcaloides con los valores de Rf siguientes:

Rf – 0,67 (CM0)Rf – 0,53 (CM1)Rf – 0,43 (CM2)Rf – 0,37 (CM3)Rf – 0,29 (CM4)Rf – 0,18 (CM5)Rf – 0,09 (CM6)Rf – 0,07 (CM7)

Los componentes CM0 y CM7resultaron ser mezclas de varios alcaloidesimposibles de aislar por las cantidades tanpequeñas en que se encontraban.

En el caso de los alcaloides CM5 y CM6,eluyeron con las mezclas de solvente CHCl

3

5 % MeOH y CHCl3 10 % MeOH

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63

respectivamente; no se cuenta con losdatos físicos y espectroscópicos sufi-cientes para llegar a su caracterizaciónestructural.

Alcaloide CM1:

- Eluyó: CHCl3

- Cristalizó: CHCl3

- Fórmula general: C19 H23 O4N- Peso molecular: 329- Punto de fusión: 111 – 118 °C- Rotación específica: [α]

D = -91,30°

(c = 0,46; MeOH)- IR: (KBr) νmáx [cm-1]: 3540; 1685; 1625; 1485- UV: (EtOH) λ

máx [nm; log ε]: 236 (3,89);

266 (3,95)- EM [m/z] (int. rel. %): 329 (M+, 59 %); 314

(100); 286 (19); 270 (2); 244 (2); 192 (28)178 (3); 115 (16); 84 (15); 42 (47).

- RMN 1 H: [90 MNz, CDC13, TMS, ε

(p.p.m.)]: 2,34 (s, NMe); 3,63 (s, O-Me);3,89 (s, O-Me); 6,30 (s, OH); 6,71 (2H,Sist. AB, J=7,5 Hz); 7,77 (1 H, s).

- RMN 13C: [22,5 Mhz, CDC13, TMS,δ(p.p.m.)]: 194,5 (C-7); 150,9 (C-6); 144,8(C-3); 143,2 (C-4); 131,3 (C-11); 126,3(C-12); 123,7 (C-5); 119,5 (C-1); 109,2(C-2); 56,7 (C-9); 56,3 (O-Me); 54,8(O-Me); 46,8 (C-16); 42,7 (N-Me);41,9 (C-14); 39,4 (C-8); 37,9 (C-13);32,2 (C-15); 27,8 (C-10).

Alcaloide CM2:

- Eluyó: CHCl3 1 % MeOH

- Cristalizó: MeOH- Fórmula general: C

19H

21O

4N

- Peso molecular: 327- Punto de fusión: 191-195 °C- Rotación específica: [α ]

D = -95,23 °

(c = 0,32; EtOH)- IR: (KBr)ν

máx [cm-1]: 3500 – 3400; 2959;

1670; 1640; 1613; 1480- UV: (EtOH)λ

máx [nm; log ε]: 243 (4,28);

279 (3,79)- EM [m/z] (int. rel. %): 327 (M+, 100 %);

312 (42); 299 (55); 284 (86); 268 (22);256 (17); 242 (27); 226 (20); 42 (32).

- RMN 1H: [200 MHz, CDCl3, TMS, δ(p.p.m.)] ; 2,45 (s, NMe); 3,75 (s, O-Me);3,89 (s, O-Me); 6,32 (s); 6,65 (ddd, J = 8,2;1,2; 0,7 Hz); 6,75 (d, J = 8,2); 7,54 (1 H, s).

Alcaloide CM3:

- Eluyó: CHCl3 1 % MeOH

- Cristalizó: MeOH- Fórmula general: C

19H

21O

4N

- Peso molecular: 327- Punto de fusión: 120-122 °C- IR: (KBr) ν

máx [cm-1]: 3550-3300; 1595; 1505;

1400; 1330; 1280; 1243; 1110; 1080- EM [m/z] (int. rel. %): 327 (M+, 90 %); 326

(100); 312 (27); 296 (8); 284 (40); 269 (11);253 ( 19)

- RMN 1H: [200 MHz, CDCl3, TMS,δ

(p.p.m.)]: 2,53 (s, NMe); 3,90 (s, O-Me);3,91 (s, O-Me); 6,13 (s, OH); 6,53 (1H, s);6,79 (1H, d, J = 1,0 Hz); 8,00 (1H, s)

Alcaloide CM4:

- Eluyó: CHCl3 1 % MeOH- Cristalizó: N-hexano/MeOH- Fórmula general: C19H23O4N- Peso molecular: 329- Punto de fusión: 196 –198 °C- Rotación específica: [α]D = -69,56° (c = 0,35;

EtOH)- IR: (KBr) νmáx [cm -1]: 3350; 2900-2860;

1679;1610; 1570; 1480; 1430- UV: (EtOH) λmáx [nm; log ε]: 235(3,25);

268 (3,32)- EM [m/z] (int. rel. %): 329 (M+, 76 %); 314

(100); 286 (10); 243 (14); 192 (18); 146 (13);115 (11); 42 (30)

- RMN 1H: [90 MHz, CDCl3, TMS, δ(p.p.m.)]: 2,41 (s, NMe); 3,68 (s, O-Me);3,86 (s, O-Me); 6,68 (2H, Sist. AB, J = 7,5Hz); 6,74 (1H, s).

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- RMN 13C: [22,5 MHz, CDC13, TMS, δ(p.p.m)]: 193,7 (C-7); 148,8 (C-6); 145,2 (C-3);144,0 (C-4); 129,4 (C-11); 126,3 (C-5); 124,1(C_12); 118,5 (C-1); 109,3 (C-2); 56,7 (C-9);56,1 (O-Me); 54,8 (O-Me); 47,5 (C-16); 43,8(C-14); 42,5 (N-Me); 39,5 (C-8); 37,5(C-13); 36,8 (C-15); 23,5 (C-10).

DISCUSIÓN

El análisis de los datos espectros-cópicos y el valor de las constantes físicasde 4 de los 6 componentes aislados de laespecie endémica cubana Crotonmicradenus Urb. (CM1, CM2, CM4 y CM3),y compararlos con los reportados en laliteratura 5-9 para los alcaloides ocobotrina(fig. 1), sinoacutina (fig. 2), y 8,14dihidrosalutaridina (fig. 3) (morfinan-dienónicos), así como con isoboldina (fig.4) (aporfina), muestran coincidencias queconfirman la similitud estructural condichos alcaloides respectivamente.

FIG. 1. Ocobotrina.

FIG. 2. Sinoacutina.

FIG.3. 8,14-dihidrosalutaridina.

SUMMARY

The study of the content of alkaloids in the leaves and stems of the Crotonmicradenus Urb Cuban endemic species, which is potentially medicinal, wasconducted. Organic solvents and chromatographic methods of separation by

FIG. 4. Isoboldina.

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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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derivatives from Croton linearis Jacq. J Chem Soc 1968;(C):951-7. 8. Johns SR, Lamberton JA, Sioumis AA. Cassytha alkaloids II. Alkaloids of Cassytha pubescens R. Br

Aust J Chem 1966;19(12):2331-8. 9. Sánchez V, Sandoval D. Alcaloides en especies cubanas del género Croton L. II. Contribución al estudio

químico del C. stenophyllus Griseb. Rev Cubana Farm 1982;(16):45-55.

Recibido: 19 de septiembre del 2000. Aprobado: 30 de octubre del 2000.Lic. Armando Payo Hill. Instituto de Ecología y Sistemática. Carretera de Varona km 3½ Capdevila,municipio Rancho Boyeros, Ciudad de La Habana, Cuba.

column and plate were used for the extraction and purification of thesemetabolites. 4 of the 6 isolated alkaloids, 3 of them morphinandienones:ocobotrine, sinoacutine and 8,14-dihydrosalutaridine and an aporphine (Isobol-dine) were characterized by spectroscopic methods of UV, IR, Mass and NMR 1Hand 13C, as well as by the measurement of their physical constants.

Subject headings: ALKALOIDS/chemistry; PLANTS, MEDICINAL; PLANTEXTRACTS/chemistry; CHEMISTRY, PHARMACEUTICAL; CHROMA-TOGRAPHY, THIN LAYER; ALKALOIDS/isolation & purification;SPECTRUM ANALYSIS, MASS/methods.

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Artículo de Revisión

Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos

ENSAYOS FARMACOLÓGICOS IN VITRO PARA EVALUARACTIVIDAD ANTIGIARDIÁSICA

Marta Guerra Ordóñez1

RESUMEN

Se realizó una revisión sobre los ensayos farmacológicos in vitro más empleadospara evaluar la actividad antigiardiásica. Los primeros ensayos de susceptibilidada drogas conllevaban a una tediosa observación microscópica del efecto de ladroga sobre la motilidad y la morfología del parásito; tradicionalmente se haempleado el método de inhibición de crecimiento mediante conteo visual. Unensayo posterior de crecimiento clonal elimina este inconveniente pero estécnicamente demandado. Mas recientemente se destacan el ensayo radiométrico,basado en la incorporación de la timidina titriada, el de inhibición de adherenciade los trofozoítos y un ensayo colorimétrico que emplea sales de tetrazolio, lascuales son metabólicamente reducidas en las células vivas para dar lugar a unproducto coloreado. Cada uno de estos ensayos posee ventajas y desventajas; latendencia actual está en desarrollar y combinar métodos que posibiliten obtenerinformación acerca del mecanismo de acción de las drogas.

DeCs: RESISTENCIA A LAS DROGAS; GIARDIASIS/quimioterapia; GIARDIALAMBLIA/efectos de drogas; GIARDIA LAMBLIA/aislamiento & purificación;AGENTES ANTIPARASITARIOS; "IN VITRO"; TEST DE SENSIBILIDADMICROBIANA.

1 Licenciada en Microbiología. Investigadora Auxiliar.

Diversos factores pueden contribuir ala ineficiencia de un tratamiento, entre ellosla existencia de cepas resistentes. Algunosestudios indican que la resistencia a drogasen Giardia lamblia puede ser responsablede la recurrencia de esta parasitosis, por

ello es necesaria la búsqueda de nuevoscompuestos o la introducción de otros yaexistentes.

El uso de técnicas in vitro para elestudio de la sensibilidad de G. lamblia alas drogas ofrece ciertas ventajas. Primero,

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67

puede ser evaluada la actividad antigiar-diósica de gran número de muestras,segundo, un mejor entendimiento del modode acción de las drogas en condicionescontroladas de ensayos. Finalmente,pueden ser monitoreados de formaemergente aislamientos clínicos depacientes que no responden al tratamiento.

MÉTODOS PARA EVALUARACTIVIDAD ANTIGIARDIÓSICAIN VITRO

El desarrollo de un medio de cultivoapropiado para Giardia intestinalis abriólas posibilidades del estudio de la respuestade los parásitos a las drogas. Entre losprimeros reportes, Diamond y Bartgisdescriben un ensayo semicuantitativo deviabilidad para evaluar el efecto de drogas,por conteo de parásitos sobrevivientes insitu. Cuando se observaban al microscopioinvertido (x 100) 50 parásitos por campo,eran contados 5 campos, si se observabanmenos, 10 campos. Era calculado elporcentaje de viabilidad si la morfología,adherencia y motilidad eran normales. Estemétodo se propuso adecuado para unaselección inicial de drogas, sin embargo, nopresentó diferencias cuantitativas (menoresque 20 %) en el efecto de varios antibióticossobre el crecimiento.1 Catorce añosdespués, se procede de forma similar paraevaluar la tolerancia de un cultivo axénicode G. lamblia a diferentes agentesantimicrobianos y se alcanzan resultadosde susceptibilidad similares a los obtenidoscon ensayos posteriores de microscopia oformación de colonias.2

Era necesario eliminar el empleo demétodos laboriosos o subcultivos.3 Dosacercamientos a los ensayos in vitro dedrogas contra G. lamblia incluyen a JokipiiL y Jokipii AM en 1980, los cuales incuban

trofozoítos directamente extraídos deduodeno. La viabilidad fue determinada porexamen microscópico de los organismos,por el movimiento flagelar.4 Al menos100 trofozoítos son examinados micros-cópicamente (x 400) para evidenciarmotilidad, el movimiento es observadodurante 10 s, especialmente el del flageloventral, clasificándose no mótil aun cuandomorfológicamente pudiera parecer normal.Claro que esta técnica no tenía en cuentaque los organismos podían ser repro-ductivamente no viables aunque mostraranactividad flagelar. Se mostró la actividadin vitro del metronidazol y el tinidazol, peroel método resultó confiable porque nofueron utilizados cultivos axénicos yalgunos cultivos controles murieron espon-táneamente. El otro, Gillin y Diamond(1981) los que emplean el criterio deconcentración mínima letal, mediante unensayo de crecimiento clonal.5 Estosautores habían desarrollado en 1980 esteensayo en medio semisólido. Las coloniaseran contadas visualmente para evaluar laactividad antigiardiósica in vitro, elimi-nando la necesidad de métodos laboriososde microscopia o subcultivo.6,7 En contrastecon las técnicas que empleaban mediolíquido, se plantea que no es posible unsobrecrecimiento de un simple trofozoíto,cada colonia es formada originalmente porun organismo. Sin embargo, este ensayo estécnicamente demandado, pues los datosde susceptibilidad no estaban disponibleshasta 6-7 d, cuando los clones eranclaramente visibles. No fue recomendadopara el trabajo de rutina pues la eficienciadel conteo fue sólo del 25 %. Lacombinación de las técnicas descritasposibilitaba evaluar susceptibilidad ybrindaba una mayor información de lasdrogas comúnmente usadas en eltratamiento de la giardiasis.

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Tradicionalmente se ha empleado elensayo de inhibición de crecimientomediante conteo visual de parásitos, el cualutiliza cultivos de 72 h en fase logarítmica.Los trofozoítos están en contacto con elagente quimioterapéutico durante 48 h,pasadas las cuales son despegados enbaño de hielo y realizado el conteo en cámarade Neubauer, calculándose la IC

50:

concentración que inhibe el crecimiento del50 % de la población de parásitos y enocasiones la MLC: concentración mínimaletal, para la cual no son observadosparásitos (menos de 1 %) y la HNC: mayorconcentración no inhibitoria. Para calcularel porcentaje de inhibición de crecimientose emplea la expresión siguiente:

Concentración de Giardia

en cultivo tratado con la drogaIC=100 - × 100 Concentración de Giardia

en cultivo no tratado

Este método ha sido muy utilizado paraevaluar la sensibilidad in vitro de G.intestinalis a diferentes agentes quimiotera-péuticos, sus combinaciones, incluso paravalidar otras técnicas.8-12

Inicialmente fueron empleadosaislamientos de origen no humano.7

Posteriormente fue descrita una técnica parael cultivo de rutina de trofozoítos de G.lamblia a partir de las aspiracionesduodenales humanas.13,14

Hasta ese momento ningún métodobrindaba información rápida al médico y noresultaba fácil seleccionar nuevas drogas.Aunque fue importante el desarrollo ymejoramiento del cultivo de G.intestinalis,15-18 la falta de una técnica demicrocultivo impedía un estudio detalladode la respuesta de los organismos a losagentes quimioterapéuticos y ya eraimpracticable el empleo de grandesvolúmenes.

Es descrito un microensayo queaventaja este problema y da una medida másreal de la viabilidad que la de muerte porexclusión o motilidad, este método evalúala inhibición de la incorporación de unsustrato radiomarcado.19 El cultivo fueadaptado a una placa de microtitulación yel método comparado con microensayos deviabilidad por motilidad y exclusión, con elempleo en este último caso de una soluciónacuosa de tripán azul. Las tincionesdesarrolladas con los denominadoscolorantes vitales han sido utilizadas paradiscriminar entre células vivas y muertas.20

El ensayo de crecimiento con timidinatitriada ([3H] timidina) resultó sermarcadamente más sensible. Dicho ensayoconsistió en poner en contacto trofozoítosen fase logarítmica con diferentesconcentraciones de la droga yposteriormente con 50 µL de [3H] timidina(12 µCi/mL) durante 4 h. Fue estimada latimidina incorporada en un lector decentelleo y se calculó la ID50; dosis de ladroga que inhibe la incorporación detimidina en el 50 % de la población deparásitos. Este ensayo permite de formarápida y sencilla determinar la sensibilidada drogas de diferentes aislamientos de G.lamblia y denota cambios inmediatos queafectan la división.21-23 Adjunto a esteensayo fueron realizados estudiosautorradiográficos que indicaron que latimidina es incorporada solo en el núcleode Giardia, lo que demuestra que no hayDNA extra nuclear. La incorporación de [3H]timidina al DNA refleja la replicación y enmenor medida la reparación. Tres de cuatrodrogas estudiadas actúan sobre el DNA yson notados cambios que afectan ladivisión.

En 1985, Seow adapta la técnica descritapor Thong y Currel para ensayar adherenciade neutrófilos. El ensayo empleómicrocolumnas de fibra de nylon y fue

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recomendado para los estudios desensibilidad a drogas in vitro;24,25 losresultados preliminares indicaron que elefecto inhibitorio del metronidazol en G.lamblia fue dosis dependiente. Trabajarontambién en esta dirección otros autores,26,27

algunos comparan los resultados obtenidosempleando el ensayo de inhibición deadherencia con el de inhibición decrecimiento.9-11,28 Refiriéndonos brevemente,se emplean microcolumnas en ocasionespreparadas con fibra de nylon, las cualesaceptan fácilmente 130 µL de la suspensiónde G. lamblia. Después de la preincubaciónde la suspensión de trofozoítos condiferentes concentraciones del agentequimioterapéutico, es retirado un volumendefinido y colocado en una incubadora dealta humedad a 37 °C. Transcurridos 30 minlas columnas son removidas y colocadasen un aparato diseñado especialmente y enel cual se aplica una presión de succión.Los efluentes son depositados en tubosque a su vez se colocan en baño de hielo.La concentración de trofozoítos sedetermina mediante el conteo en cámara deNeubauer; los resultados son calculadosmediante la fórmula siguiente:

Porcentaje de adherencia = 100 –

donde:

Ce: concentración de Giardia en el efluenteCo: concentración en la suspensión originalFinalmente es calculado el porcentaje deinhibición de adherencia:

Porcentaje de inhibición de adherencia (IA)

La adherencia a la mucosa intestinalocurre por medio del disco ventral.29 Han

sido identificadas proteínas contráctiles30

y se conoce que la presión de succión,energía dependiente, es generada por elconstante movimiento del flagelo ventral.28

La adherencia parece ser un requisitoimportante en la patogenicidad de G.intestinalis.10 Al respecto se plantea laimportancia de combinar ensayos paralograr penetrar en el mecanismo de acciónde las drogas.

Los métodos anteriores consumíantiempo y algunos requerían el uso dereactivos radiomarcados. El más reciente,basado en la adherencia de los trofozoítos,era dependiente de la estimación visual delporcentaje de trofozoítos adheridos y asumeque solo se adhieren los trofozoítos viables.Como señalan los propios autores, losorganismos viables no se adhieren si ocurreun sobrecrecimiento. De esta forma enalgunos casos la IC

50 puede parecer

superior a lo que es realmente.31 No obstantese plantearon como ventajas su rapidez,simpleza y resultados confiables en pocotiempo, así como la posibilidad de medireventos tempranos asociados con elmetabolismo energético e integridad de lamembrana antes de la etapa final delcrecimiento, lo que posibilita penetrar enlos mecanismos de acción de las drogas.

En 1994, se evaluó la actividad dediferentes drogas sobre la adherencia a unalínea celular de intestino humano; losresultados se compararon con la capacidadde inhibición del crecimiento de Giardia,mediante el ensayo de incorporación detimidina.32

La ruptura de la sal de tetrazolium (3-(4,5dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) en un productocoloreado azul (formazán) por la enzimamitocondrial succinato-deshidrogenasa, espotencialmente muy útil para ensayar lasupervivencia y proliferación celular. Laconversión solo se realiza en células vivas

(Ce x 100)

Co

x 100=

Adherencia en suspensióntratada c/droga

Adherencia en suspensiónno tratada

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70

y la cantidad de formazán producido esproporcional al número de célulaspresentes. De hecho esta enzima no estápresente en el suero (en contraste con lahexaminidasa), lo que permitió el desarrollopor Mosmann en 1983 de un ensayo rápidoy simple, el cual ha sido usado para detectarfactores de crecimiento de células T ylinfotoxinas.

En 1986, Francois Denizot y Rita Langintrodujeron modificaciones al ensayocolorimétrico desarrollado por Mosmann,conveniente para estimar el crecimiento decélulas viables, el cual empleaba unespectrofotómetro scanning paramicroplacas automático y dependía de lareducción por las células vivas de la sal detetrazolium: MTT, para formar el productoformazán azul.33 La técnica original teníavarias limitaciones: una baja sensibilidad,resultados variables debido a laprecipitación de proteínas en el momentode la adición del solvente orgánico paradisolver el producto formazán azul, y unabaja solubilidad del producto. Al respecto,los autores señalan que la aplicación directadel procedimiento tenía una sensibilidadmenor que el ensayo con [3H] timidina yque los resultados fueron muchas vecesirreales debido a la precipitación de lasproteínas.

Los problemas fueron superados conlas modificaciones siguientes: evitar el sueroen el medio de incubación, así se eliminabanlos problemas de precipitación con elsolvente orgánico; evitar el fenol rojo en elmedio, así se eliminaba el uso de ácido en elsolvente final, el cual alteraba laspropiedades del espectro del formazán;eliminación del medio que contenía MTTdespués de la reacción y posterior uso depropanol o etanol para solubilizarrápidamente el formazán; uso de una mayorconcentración de MTT; uso de la mitad delárea de la placa para incrementar la longitudde onda de referencia en un espectro-fotómetro de longitud de onda dual. Con

estas modificaciones fue lograda una mayorconfiabilidad y sensibilidad del ensayo,hasta el punto donde en muchos casos sepudo remplazar el ensayo de la timidinatitriada como medida de la proliferacióncelular o supervivencia en ensayos decitotoxicidad.

Posteriormente, Collin Wright y otrosdesarrollan un nuevo método con el usodel reactivo XTT, (2,3-bis(2-methoxy-4--nitro-5-sulphophenyl)-5[(phenylamino)carbonyl]-2H) tetrazolium hydroxide) paradeterminar la viabilidad de una cepa de G.lamblia.34 Esta sal de tetrazolio esmetabólicamente reducida en las célulasviables para formar un producto naranjasoluble en agua,35 el cual puede ser medidodirectamente por absorción a 450 nm sinnecesidad de estabilización, un paso quees necesario con otro cualquier reactivo detetrazolio. Los autores concluyen que elmétodo es selectivo para determinar laactividad antigiardiósica in vitro deconocidos agentes antimicrobianos y quefacilitaría la investigación de nuevas drogaspara uso clínico.

Para evaluar la sensibilidad in vitro deG. lamblia a diferentes extractos de plantas,se reporta el empleo de la sal MTT.36 Seemplean tubos de microcentrífuga y secalcula el porcentaje de mortalidad. Nuestraexperiencia en ensayos realizados encolaboración con el Instituto de MedicinaTropical “Pedro Kourí” confirma estaposibilidad (Guerra Ordóñez M. Tesis deMaestría en Parasitología, 1998).

Otras sales de tetrazolio como el TTC(2,3,5-trifenil tetrazolio cloruro) han sidoutilizadas como marcadores del crecimientoexponencial de cultivo de células,37 las quebien pueden ser potencialmente empleadaspara evaluar actividad antigiardiósica.

Mas recientemente, un nuevo ensayocolorimétrico se basa en la actividad de lanucléosido hidrolasa de G. intestinalis,sobre el sustrato análogo 4-nitrofenilbeta-D-ribofuranósido.38 Otro ensayo

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utiliza la capacidad de los trofozoítossobrevivientes para tomar oxígeno, despuésde expuestos al metronidazol, y se haencontrado una buena correlación con elefecto inhibitorio según determinación deviabilidad celular.39

CONCLUSIONES

Evaluar la susceptibilidad no es elprincipal problema de las investigacionesen Giardia s.p.p. Para realizar estudios invitro de sensibilidad a drogas se hanempleado diferentes ensayos y criterios deviabilidad como morfología, motilidad,exclusión por colorante vital, adherencia eincorporación de un sustrato radiomarcado.Los primeros, eran métodos de microscopialaboriosos o conllevaban a subcultivosposteriores, planteaban como inconve-niente el sobrecrecimiento o consumíantiempo y materiales radiomarcados. Lo másreciente que hemos podido encontrar en laliteratura, refiere el empleo de ensayoscolorimétricos, basados en la actividadenzimática de G. intestinalis sobre sustratosespecíficos y un ensayo que evalúa lacapacidad de los trofozoítos para tomar

oxígeno, lo que se correlaciona en todoslos casos con la viabilidad celular.

Cada uno de los ensayos descritosposee ventajas y desventajas. Una limitantecomún a todos ellos es la solubilidad delcompuesto evaluado. La tendencia actualestá en desarrollar y combinar métodos queposibiliten obtener información acerca delmecanismo de acción de las drogas, lograrresultados en el menor tiempo posible, conla mayor reproducibilidad, confiabilidad ycon el menor gasto de recursos.

Debe quedar claro, que la informaciónsobre sensibilidad debe incrementarse yganar en importancia para esclarecer lasfallas medicamentosas, que aunquerelacionadas con muchos más factores,algunas veces con los diferentesaislamientos de G. lamblia y otras con laposible resistencia a los medicamentos. Porello se hace indispensable conocer ladisponibilidad de ensayos farmacológicosin vitro para su utilización con estos fines.

No obstante, las conclusiones clínicasdeben manejarse cuidadosamente a partirde un resultado in vitro, puede ocurrir porejemplo, que una concentración menor a lamínima inhibitoria pueda ser suficiente paraeliminar el parásito in vivo, si existesinergismo de la droga con los mecanismosde defensa del hospedero.

SUMMARY

A review of the most used in vitro pharmacologic assays to evaluate the antigiardialactivity was made. The first tests of susceptibility to drugs lead to a tediousmicroscopic observation of the effect of the drug on the motility and morphologyof the parasite. The method of growth inhibition by visual count has beentraditionally used. A further assay of clonal growth eliminates this inconvenient,but it is technically demanded. The radiometric assay, based on the incorporationof titriated thymidine, that of adherence inhibition of the trophozoites and acolorimetric test using tetrazolium salts, which are metabolically reduced in theliving cells to give rise to a colored product, are stressed at present. Each ofthese assays has advantages and disadvantages. The current trend is to developand combine methods that make possible the obtention of information aboutthe mechanism of action of the drugs.

Subject headings: DRUG RESISTANCE; GIARDIASIS/drug therapy; GIARDIALAMBLIA/drug effects; GIARDIA LAMBLIA/isolation & purification;ANTIPARASITIC AGENT; “IN VITRO”; MICROBIAL SENSITIVITY TESTS.

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Recibido: 10 de agosto del 2000. Aprobado: 26 de septiembre del 2000.M.Sc. Marta Guerra Ordóñez. Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos. Ave. 26 No. 1605entre Rancho Boyeros y Calzada del Cerro, Plaza de la Revolución, Ciudad de La Habana, Cuba.

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Farmacodivulgación

Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos

VITAMINAS Y MINERALES CONTRA EL ESTRÉS

Jose Antonio Espinosa Hernández1 y Manuel Cué Brugueras2

RESUMEN

Se define el estrés como tal, así como los tipos de tratamientos para este. Seexpresan las relaciones entre las multivitaminas y minerales y el estrés y se dancriterios sobre su uso. Se concluye que los principales medicamentos antiestrésencontrados contienen las vitaminas E, B1, B2, B3, B5, B6, B12,C, ácido fólico yminerales cinc y hierro; entre los principales fabricantes se encuentran: Lederle,Rugby, Ayerst, Scherin, Vicks Health Care, Goldline, Squibbs, Miles Inc. y NaturalLife.

DeCs: ESTRES/quimioterapia; ESTRES PSICOLOGICO/quimioterapia;ANTIOXIDANTES/uso terapéutico; MINERALES/uso terapéutico;VITAMINAS/uso terapéutico.

1 Especialista en Información Científica.2 Licenciado en Ciencias Farmacéuticas. Especialista en Información Científico-Técnica. Centro

Nacional de Información de Ciencias Médicas.

El término estrés ha entrado a formarparte del lenguaje popular. Para algunaspersonas es la sensación de verseapremiado y contraído porque tiene quehacer muchas cosas en un corto período, ola irritación que se siente cuando chocamoscon dificultades de la vida diaria; tambiénpudiera ser la inquietud como consecuenciade un examen, la preocupación por unfamiliar enfermo o las molestias porproblemas de viviendas.

El estrés constituye una respuesta delorganismo humano ante situaciones quesignifican algo importante para él y queposeen el carácter de amenaza, desafío osobrecarga. Estas situaciones son llamadasestresores o agentes estresantes; larespuesta del estrés se expresa al nivelpsicológico (se acelera el pulso, se eleva latensión arterial) y al nivel bioquímico(algunas sustancias del organismo puedensufrir alteraciones).1

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TRATAMIENTO DEL ESTRÉS

Partiendo de la idea de que lasconsecuencias negativas del estrés tienenun “gatillo” psicológico y una manifestaciónfísica, el tratamiento de este tiene queconllevar acciones sobre la psiquis y sobreel organismo, puesto que ambos se afectan,y debe contener los elementos siguientes:2

- Cognoscitivo o educación del sujetoestresado para que conozca las causas,el mecanismo y las consecuencias delestrés.

- Determinación de los agentes causalesdel estrés.

- Aumento de la resistencia y la salud delindividuo.

- Condicionamiento o base para elestablecimiento y la modificación dehábitos.

- Relajación o aumento de la resistenciapsicológica ante situaciones de estrés.

- Seguridad de que el tratamiento no causedaño y que sea agradable.

- Buen trato al sujeto estresado para quefuncione el tratamiento.

Utilizar medicamentos para combatir elestrés se identifica con el aumento de laresistencia y la salud del individuo, al utilizarmultivitaminas y minerales.

MULTIVITAMINASY MINERALES Y SU RELACIÓNCON EL ESTRÉS

El nombre de vitaminas fue propuestopor el bioquímico polaco Casamir Funk,después de que investigadores como elbritánico Hopkins y el holandésPekelharing demostrarán medianteestudios experimentales que estas

sustancias eran indispensables para lanutrición. Aunque, como sostiene F.Grande Govian en su libro Nutrición ySalud, "la persona normal que come unadieta suficiente para satisfacer susnecesidades de energía y que contienealimentos corrientes, debe recibir todas lasvitaminas y no es de esperar en estascondiciones que el aumento en el consumode estas tenga efecto-beneficio alguno";está demostrado que grupos de poblacióncomo los adolescentes, ancianos,embarazadas, fumadores, bebedores y engeneral, las personas que siguen regímenesdietéticos deficientes precisan de un mayoraporte de estas sustancias, sin valorenergético pero dotadas de una granactividad biológica.3,4

Las vitaminas son sustancias químicasesenciales para el mantenimiento de lasfunciones metabólicas normales y, por lotanto imprescindibles para la salud. Dadoque el organismo es incapaz de sintetizarlas(excepto la D y la K), es necesario su aprovi-sionamiento desde el exterior.4,5

En los países desarrollados son pocofrecuentes las deficiencias importantes devitaminas, pero existen muchas circuns-tancias en las que con la ingesta habitualde alimentos no se alcanzan los nivelesóptimos de estas sustancias. En realidad, elrégimen alimentario en los paísesindustrializados no siempre está tan bienequilibrado como se creía desde hacemuchos años. De hecho, si se divide lacantidad de alimentos consumidos por elnúmero total de una población, puedeconocerse el valor de un régimen medio.No obstante, dicho valor no tiene en cuentaque los hábitos alimentarios varíanconsiderablemente de un grupo deindividuos a otro, por lo que al llevar lasinvestigaciones a escala individual, secomprueba que algunas personas tienen un

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régimen alimentario muy inferior a la mediatanto en calidad como en cantidad.5,6

La agencia norteamericana Foods andDrugs Administration (FDA), es elorganismo que ha elaborado el estudio másimportante sobre los requerimientosvitamínicos, de modo que las dosisrecomendadas por dicho organismo son lasque se toman como base por muchos paísesdesarrollados. Estas dosis diarias recomen-dadas se denominan Recommended DietaryAllowance (RDA) y cada vitamina tiene suRDA correspondiente. Todos los productoscomerciales incluidos dentro del grupoterapéutico de vitaminas y minerales estáncompuestos por la mayoría de las vitaminas,los minerales y los oligoelementos másimportantes, a una dosis que van desde½ RDA hasta 2 RDA.5

Con el énfasis de la medicina modernaen la prevención de enfermedades, cada díason mayores los esfuerzos dirigidos haciala prevención de todo tipo de afecciones yes precisamente por esto que las vitaminasy los minerales han adquirido unaimportancia tan considerable entre loscientíficos, los médicos y la población engeneral, que ha visto en estos nutrientes laposibilidad hecha realidad de utilizarlos, nosolo como instrumentos para prevenirenfermedades y para prolongar la vida. Dehecho, las nuevas aplicaciones terapéuticasy profilácticas de muchas vitaminas yminerales están basadas en recientesdescubrimientos de propiedades benéficashasta hace poco insospechadas.6-10

De especial interés entre las vitaminasy minerales son las que tienen propiedadesantioxidantes. Entre las más conocidas seencuentran las vitaminas C y E, la coenzimaQ y el betacaroteno. Otros antioxidantesimportantes son el ácido glutámico entre

los aminoácidos, el selenio entre losminerales, y el glutatión.7-16

Lo beneficioso de los antioxidantes sederiva, precisamente de su capacidad parainterferir con el efecto nocivo de los llamadosradicales libres, partículas químicas muyinestables cuya acción oxidante inducecambios dañinos en las células alterandosu estructura y comportamiento. Se cree queesta es la base del proceso de la arterios-clerosis, de la formación de tumores y delenvejecimiento en general. De ahí laimportancia de que los antioxidantesactúen como antídotos contra losradicales libres.17-20

Ya sea por un mayor requerimiento denuestro organismo o debido a que losalimentos que consumimos son deficientesen muchos nutrientes o porque la mayorexposición a sustancias tóxicas en el medioambiente nos hacen más vulnerables amuchas enfermedades, la ingestiónsuplementaria de vitaminas y minerales haadquirido una importancia vital, y entreestos los antioxidantes están demostrandoser un instrumento cada día más eficaz en laprevención y tratamiento de diversasenfermedades.21-33

Resumiendo, en relación con laimportancia de los radicales libres y lasvitaminas antioxidantes, podemos decir quelos radicales libres son moléculas quereaccionan fácilmente con algunassustancias que forman parte de la membranacelular, destruyéndolas, y provocando deeste modo el envejecimiento prematuro delas estructuras esenciales de los tejidos.Este mecanismo relacionado con el estrés,con la contaminación del aire querespiramos y con el humo del tabaco,entre otros, propicia la aparición delfenómeno técnicamente denominado“estrés oxida-tivo”, proceso que puedeproducir arterios-clerosis, enfermedadescardiacas y otras. 34-38

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Los radicales libres por otra parte,reaccionan fácilmente con los ácidosnucleicos del núcleo de las célulasalterando el código genético. En virtud aesto último las células afectadas puedencambiar, morir, o eventualmente mutargenerando una nueva estirpe celular quepuede desencadenar enfermedades comoel cáncer. El organismo posee un sistemaque barre los radicales libres o los neutralizaligándose a ellos, que incluye enzimas yvitaminas antioxidantes.39,40

Según el doctor Linus Pauling (2 vecesPremio Novel de Química), las cantidadesóptimas de consumo de vitaminas sonmucho mayores que las que proporcionanlos alimentos, aún seleccionando losmejores. Las pérdidas de vitaminas en frutasy verduras son enormes debido a las

fumigaciones contra insectos y plagas y eltiempo que transcurre desde que se cortanlas plantas hasta su consumo. Además delos que son cocinados, ya que las mayoríade las vitaminas son afectadas por el calor.Por ello, la única forma de conseguir lascantidades de vitaminas necesarias paragozar de la mejor salud es tomandosuplementos vitamínicos.41

Las recomendaciones del doctor LinusPauling para una mejor salud son tomar adiario:

- Vitamina C, 2 gramos (2 000 mg) comomínimo.

- Vitamina E, 400 UI.- Vitamina A o betacaroteno, 25 000 UI.- Complejo de vitaminas B.- Minerales (cálcio, magnesio, selenio,

hierro, yodo, cobre, manganeso, zinc,cromo y molibdeno).

SUMMARY

The stress as such, as well as the types of treatment are defined. The relationsbetween the multivitamins and minerals and the stress are described and criteriaabout their use are given. It is concluded that the main antistress drugs foundcontain vitamins E, B1, B2, B3, B5, B6, B12, C, folic acid and the minerals zinc andiron. Lederle, Rugny, Ayerst, Scherin, Vicks Health Care, Goldline, Squibbs, MilesInc. and Natural Life are among the main manufacturers.

Subject headings: STRESS/drug therapy; STRESS, PSYCHOLOGICAL/drugtherapy; ANTIOXIDANTS/therapeutic use; MINERALS/therapeutic use;VITAMINS/therapeutic use.

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Recibido: 30 de septiembre del 2000. Aprobado: 2 de noviembre del 2000.Lic. José Antonio Espinosa Hernández. Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos. 19 deMayo No. 21 esquina a Amézaga, Plaza de la Revolución, Ciudad de La Habana, Cuba.