Review International Journal Isolasi

5/28/2018 Review International Journal Isolasi

1/19

Nama : Ulfa Hidayat

Kelas : Biologi Nondik B 2011

REVIEW INTERNATIONAL JOURNAL :

Judul Jurnal :

Isolation and characterization of a Lactobacillus plantarum bacteriophage, AJL-1, from a

cucumber fermentation

Z. Lu, F. Breidt Jr. *, H.P. Fleming, E. Altermann, T.R. Klaenhammer

US Department of Agriculture, Agricultural Research Service (USDA-ARS), NC State

University, Raleigh, NC 27695-7624, USA

Department of Food Science, North Carolina Agricultural Research Service, NC State

University, Box 7624, Raleigh, NC 27695-7624, USA

Accepted 14 February 2003

AbstrakSebuah virulen bakteriofag Lactobacillus plantarum , AJL - 1 , diisolasi dari fermentasi

mentimun komersial . fag itu khusus untuk dua strain terkait L. plantarum , BI7 dan mutan -nya (

kekurangan kemampuan fermentasi malolactate ) MU45 , yang telah dievaluasi sebagai kultur

starter untuk fermentasi mentimun dikendalikan dan mikroorganisme biokontrol untuk produk

nabati minimal diproses . Fag genom AJL - 1 dibariskan untuk mengungkapkan linear , untai

ganda DNA ( 36,7 kbp ) . Sodium dodecyl sulfat - gel elektroforesis polyacryamide ( SDS -

PAGE ) menunjukkan bahwa profil AJL 1 berisi enam protein struktural ( 28 , 34, 45, 50, 61,

dan 76 kDa ). Mikroskop elektron menunjukkan bahwa fag memiliki isometrik kepala ( 59 nm

diameter ) , panjang ekor non - kontraktil ( 182 nm panjang dan 11 nm lebar ) ,dan pelat dasar

kompleks. itufag milik kelompok Bradley B1 atau keluarga Siphoviridae . Kinetika pertumbuhan

satu langkah fag menunjukkan bahwa laten periode adalah 35 menit , periode kenaikan adalah 40

menit , dan ukuran rata-rata adalah 22 meledak partikel fag / sel yang terinfeksi partikel fag ( 90


2/19

% ) terserap ke sel inang 20 menit setelah infeksi. Suplementasi kalsium ( hingga 30 mM CaCl2

) dalam media MRS tidak mempengaruhi siklus pertama fag adsorpsi, tapi dipromosikan cepat

fag propagasi dan sel lisis dalam siklus infeksi berikutnya adsorpsi. Nilai D dari AJL - 1 pada pH

6,5 diperkirakan menjadi 2,7 menit pada 70 Jc dan 0,2 menit pada 80 jc oleh thermal

inaktivasi percobaan. Pengetahuan tentang sifat L. plantarum bakteriofag AJL - 1 mungkin

penting bagi pengembangan fermentasi sayuran dikendalikan.

D 2003 Elsevier Ilmu B.V. All rights reserved .

Landasan teori jurnal ini difokuskan pada bakteri Lactobacillus plantarum yang

melengkapi tahap akhir buah dan sayur fermentasi alami karena yang

toleransi asamnya lebih tinggi dari bakteri asam laktat lainnya. Pertumbuhan dan aktivitas

fermentasi L. plantarum dalam mentimun dan fermentasi kubis sangat mempengaruhi kualitas

dan stabilitas mikroba dari produk akhir. Banyak factor kimia, bilogi, faktor fisik,termasuk

bakteriofag ( fag ) , mempengaruhi fermentasi perilaku L. Plantarum, sementara sebagian besar

fermentasi mentimun komersial mengandalkan epifit LAB, penggunaan kultur starter penelitian (

Etchells et al . , 1973) . Pembuatan fermentasi mentimun dan penyimpanan komersial prosedur

dapat menggunakan 10-15 % NaCl . Meskipun air garam daur ulang adalah produksi praktek,

umumnya limbah klorida tetap menjadi masalah dalam industri ini. Penurunan konsentrasi garam

( sampai 4 % atau kurang ) mungkin dengan teknologi fermentasi dalam pengembangan ,

menggunakan mentimun pucat untuk mengurangi awal mikroflora hadir pada mentimun (HP

Fleming, tidak dipublikasikan ) . Dengan fermentasi ini, L.plantarum budaya pemula mungkin

diperlukan untuk memastikan kualitas. Oleh karena itu, potensi infeksi fag, menyebabkan

kegagalan budaya pemula, perlu diselidiki. Bakteriofag terdapat dimana-mana di alam . Tentang

96 % dari fag diselidiki dalam 45 tahun terakhir adalah ekor fag milik family Siphoviridae ,Myoviridae , atau Podoviridae. Siphoviridae adalah fag yang paling tinggi ( 61,7 % ) , diikuti

oleh Myoviridae ( 24,5 % ) dan Podoviridae ( 13,9 % ). Fag Lactobacillus , termasuk beberapa

dilaporkan L. plantarum fag , seperti fag B2 L. Plantarum ATCC 8014, ALP1 , dan ALP2 dan

fag SC921 milik famii Siphoviridae . mereka memiliki kepala isometrik dengan ekor non -

kontraktil. Untuk pengetahuan kita, fag fri adalah satu-satunya dilaporkan L. plantarum fag


3/19

memiliki ekor kontraktil dan milik family Myoviridae. L. plantarum fag telah diisolasi dari

berbagai sumber fermentasi : fag fri dari budaya daging pemula komersial. ALP - 1 dari silase

jagung. ; fag B2 dari anaerobik limbah sludge, fag ALP - 2 dari keju buatan sendiri whey, dan

fag SC921 dari Kimchi) .

Tujuan dari dilakukannya penelitian ini adalah untuk mengisolasi dan ciri fag khusus

untuk L. plantarum MU45, yang telah dievaluasi untuk digunakan dalam rendah garam ,

fermentasi sayuran dikendalikan. Hal ini juga telah dievaluasi untuk digunakan sebagai

organisme biokontrol untuk menghambat pertumbuhan organisme patogen

seperti Listeria monocytogenes dalam non - diasamkan , didinginkan produk acar dan dalam

kultur campuran fermentasi jus mentimun ( Romick , 1994). Ini adalah laporan pertama dari

isolasi dan karakterisasi L. plantarum fag dari fermentasi mentimun.

Adapun metode yang digunakan dilakukan dengan beberapa tahapan yakni :

2.1 . Strain bakteri dan media kultur L. plantarum regangan MU45 digunakan sebagai primary

bahan untuk isolasi , perbanyakan , dan karakterisasi dari bakteriofag bernama AJL - 1 . Strain (

32 ) LAB (Tabel 1 ) diuji untuk sensitivitas fag. Semua strain diperoleh dari Food USDA - ARS

Fermentasi Laboratorium Culture Collection. Semua bakteri disimpan pada 84

Jc di MRS broth ( Difco Laboratories , Detroit , MI ) mengandung 16 % ( v / v ) gliserol . Jika

diperlukan , beku. Kultur berlapis ke MRS agar ( Difco ) , dan segar budaya semalam dibuat dari

koloni terisolasi. Bakteri dan fag yang disebarkan di MRS kaldu ( de Man et al . , 1960) . Untuk

persiapan fag lisat , Kaldu MRS dilengkapi dengan 10 Mm CaCl2 ( Sigma - Aldrich , St Louis ,

MO ) kecuali menyatakan . Lembut agar siap dengan kaldu MRS dilengkapi dengan 0,7 % agar.

2.2 . Fag isolasi dan pengayaan

Sampel air garam diperoleh dari komersial fermentasi mentimun tangki berisi ukuran no . 1( Diameter 2,4-2,7 cm ) mentimun . sampel disesuaikan dengan pH 6,5 dengan NaOH 3 N dan

disentrifugasi (5000 g selama 15 menit) untuk menghilangkan bakteri sel dan puing-puing .

Supernatan disaring melalui 0.45 - Am ukuran pori saringan jarum suntik ( Pall Corporation,

Ann Arbor , MI ) . Filtrat ditambahkan untuk jumlah yang sama dari dua kekuatan kaldu MRS

ditambah dengan 10 mM CaCl2 dan diinokulasi dengan budaya awal log - fase tuan rumah .


4/19

setelah inkubasi pada 30 Jc selama 16-18 jam, media itu disentrifugasi pada 4000 g selama 10

menit . pengayaan ini Prosedur diulang dua kali. Supernatan diperoleh dari langkah pengayaan

final filtersterilized dan diuji untuk kehadiran fag aktif terhadap L. plantarum MU45 .


5/19

2.3. Deteksi fag dan kisaran inang

Metode uji spot (Chopin et al., 1976) adalah digunakan sebagai tes awal untuk kehadiran fag

oleh mengukur aktivitas litik . Agar lunak dalam 3 ml ( MRS broth dengan 0,7 % agar)

diunggulkan dengan 0,1 ml budaya ( 109 unit pembentuk koloni , cfu / ml ) , dicampur dengan

lembut , dan dituangkan ke piring MRS agar. Setelah pemadatan, 10 Al fag lisat terlihat di

halaman L. plantarum MU45. Setelah kering, piring diinkubasipada 30 Jc semalam . Sebuah

zona yang jelas dalam piring, yang dihasilkan dari lisis sel inang , menunjukkan kehadiran fag .

Tes Spot juga digunakan untuk tuan rumah berkisar studi , dan , dalam semua kasus , tes positif

dikonfirmasi oleh assay plak .

2.4 . Pemurnian plak, persiapan lisat , dan tittering bakteriofag

Fag AJL - 1 dimurnikan dengan singleplaque berturut-turut isolasi menggunakan MU45

menyebarkan ketegangan. plak tunggal dipetik dari halaman MU45 , diinokulasi menjadi awal

fase log budaya MU45 dan lisat yang plaqued lagi. Setelah mengulangi siklus tiga kali tambahan

, sebuah plakat tunggal diangkat dan ditransfer ke dalam tabung yang berisi 5 ml kaldu MRS ,

0,1 ml 1 M CaCl2 ( 108 cfu / ml ) . Tabung kemudian diinkubasi pada 30 Jc selama 7 jam. Fag

lisat disentrifugasi pada 4000 ? G selama 10 menit pada 4 Jc ( Sorvall RC - 5B centrifuge ,

Wilmington , DE ). PH supernatan iatur hingga 6,5 dengan 3 N NaOH dan disaring

menggunakan 0,45 - Am ukuran pori jarum suntik filter. Saham fag adalah disimpan dengan

kloroform ( 5 % volume ) pada 4 Jc , dan sebuah Alikuot dibekukan pada ? 84 Jc dalam kaldu

MRS mengandung 16 % gliserol. Fag titer ditentukan sebagai plak unit pembentuk ( PFU / ml )

menggunakan doublelayer yang metode lempeng agar mirip dengan Adams (1959). Setelah

pengenceran yang sesuai dengan saline , 0,1 ml fag yang mengandung sampel dan 0,1 ml secara

aktif budaya lokal yang berkembang ( 109 cfu / ml ) ditambahkan ke

tabung berisi 3 ml agar lunak ( dipertahankan pada 50 Jc dalam bak air ) dan 0,1 ml 0,3 M

CaCl2. Campuran ini dilapisi ke permukaan suatu agar MRS plate dan diinkubasi semalam pada30 Jc untuk menghitung plak .

2.5. Penentuan banyaknya optimal infeksi ( MOI ) Multiplisitas infeksi didefinisikan sebagai

rasio


6/19

partikel virus ke sel inang potensial ( Birge , 2000) MU45 ditumbuhkan dalam kaldu MRS pada

30 jc ke absorbansi pada 630 nm dari 0,08 , diukur dalam spektrofotometer ( Novaspec II ,

Pharmacia LKB , Piscataway , NJ ). Ini sesuai dengan jumlah sel sekitar 1 ? 108 cfu / ml . Fase

log awal. Sel-sel yang terinfeksi dengan AJL - 1 pada empat rasio yang berbeda ( 0,01 , 0,1 , 1 ,

dan 10 PFU / cfu ). Setelah inkubasi selama 3,5h pada 30 JC, yang lisat fag disentrifugasi pada

9000 ? G selama 3 menit . Supernatan disaring ( 0.45 - Am ukuran pori jarum suntik filter) dan

diuji untuk menentukan titer fag . Jumlah sel hidup yang ditentukan dengan menggunakan spiral

plater ( Autoplate 4000 ; Spiral Biotech , Bethesda , MD ) untuk plating sampel pada

MRS agar dan counter otomatis ( Protos Ditambah : Bioscience International , Rockville , MD )

untuk koloni pencacahan . Budaya fag - bebas ( yang hanya berisi bakteri ) dan kultur sel - bebas

( yang hanya berisi fag ) digunakan sebagai kontrol dalam semua percobaan. Semua tes

dilakukan dalam rangkap dua . The MOI dihasilkan dalam fag tertinggi titer dalam waktu 3,5

jam dianggap sebagai MOI optimal dan digunakan dalam skala besar selanjutnya

produksi fag .

2.6 . Produksi fag skala besar

Satu liter pre - warmed ( 30 Jc ) kaldu MRS adalah diinokulasi dengan semalam L. plantarum

MU45 budaya ke tingkat sel awal sekitar 8 ? 107 cfu / ml . Sel-sel berkembang menjadi sekitar

2 ? 108 cfu / ml pada 30 jc sebelum 10 ml 1 M CaCl2 ditambahkan ke dalam kaldu . Sel-selinang yang kemudian terinfeksi dengan fag pada optimum yang telah ditentukan

MOI dari 0,01-0,02 . Inkubasi dilanjutkan sampai lisis lengkap diamati ( sekitar 4,5 jam setelah

infeksi) .

2.7 . Konsentrasi dan pemurnian lisat fag

A 1 - l fag lisat disentrifugasi pada 8000 ? G untuk 20 menit dan supernatan disaring melalui

0.45. Ukuran pori Am , botol - top filter. Filtrat diperlakukan dengan 0,5 ml larutan nuklease

mengandung DNAse I , 3 mg / ml dan RNase A , 3 mg / ml ( Sigma - Aldrich ) , di 30 Jc selama2 jam. Fag kemudian diendapkan dengan menggunakan modifikasi dari metode yang dijelaskan

oleh Yamamoto et al . (1970 ) . Polyethylene glycol ( Sigma - Aldrich ) 8000 an NaCl

ditambahkan ke konsentrasi akhir 10 % ( b / v ) dan 0,5 M , masing-masing. Setelah

pencampuran lembut, persiapan fag diinkubasi semalam pada 4 Jc. Fag yang pellet dengan

sentrifugasi pada 10.000 ? G selama 20 menit, kemudian disuspensi kembali dalam 6 ml 10 mM


7/19

Tris - HCl (pH 7,4 , Sigma - Aldrich ). Persiapan phage overlay pada CsCl ( Sigma - Aldrich )

langkah gradien ( d = 1,7 , 1,5 , 1,4 g / ml , 1 ml setiap langkah ) dalam tabung centrifuge 5 - ml (

tabung # 45248 , Sorvall , Newtown , CT ) dan disentrifugasi pada

600.000 ? G selama 6 jam pada 15 Jc ( Sorvall mikro ultracentrifuge dengan rotor S100AT6 ,

RC - M150 GX ) . itu fag band ( antara d = 1,7 dan d = 1.5 ) digambar

melalui dinding tabung centrifuge menggunakan jarum suntik. Persiapan fag dimurnikan

didialisis terhadap 2 l 10 mM Tris penyangga selama 24 jam dengan 3-4 perubahan

dari buffer dengan membran ukuran pori 6000-8000 Da ( Spectrum , Houston , TX ) .

2.8 . Mikroskop elektron

Contoh fag CsCl - dimurnikan dan terkonsentrasi negatif diwarnai dengan 2 % ( b / v ) uranil

berair asetat ( pH 4,0 ) pada grid - karbon dilapisi dan diperiksa oleh elektron mikroskop

transmisi ( JEOL JEM - 100S , Jepang Elektronik dan Optik Laboratorium, Tokyo, Jepang ) pada

tegangan percepatan 80 kV . Mikrograf elektron diambil pada perbesaran 50.000 ? Dan dicetak

pada 85.000 ? ( V. Knowlton , Pusat untuk Electron Microscopy , NC State University , Raleigh,

NC ) . Ukuran fag ditentukan dari rata-rata dari lima pengukuran independen .

2.9 Ekstraksi DNA fag , sequencing , dan pembatasan analisis

Fag DNA diekstraksi dasarnya seperti yang dijelaskan oleh Durmaz dan Klaenhammer (2000) .

Secara singkat , 3 ml Suspensi fag CsCl - dimurnikan diekstraksi dua kali

dengan 3 ml fenol dan 200 Al kloroform isoamil alkohol ( 23:01 , vol / vol , Sigma - Aldrich ) .

ini adalah diikuti oleh tiga ekstraksi dengan 1,5 ml fenol ( pH 8,0 , Sigma - Aldrich ) dan 1,5 ml

chloroformisoamyl alkohol , dan dua ekstraksi dengan 3 ml kloroform - isoamil alkohol . Asam

nukleat yang diendapkan dengan 0,1 volume 3 M natrium asetat dan 3 volume etanol 95% dingin

( ? 20jC ) dan pellet dengan microcentrifuge ( 13.000 ? g ) . itu pelet akhir dicuci dua kali dengan

10 ml dari 70 % etanol , udara kering , dan kemudian disuspensi dalam 400 Al dari E buffer yang

mengandung 10 mM Tris - HCl dan 0,1 Mm EDTA ( pH 7,6 ) . Sekuensing DNA dilakukan pada

Departemen Energi Joint Genome Institute ( JGI ) fasilitas sequencing ( Walnut Creek , CA ) .

Buka membaca frame ( ORFs ) diidentifikasi menggunakan urutan perangkat lunak analisis (

Clone Manajer 6 dan Plasmid Peta Enhancer v 3 , Scientific Software Pendidikan , Durham ,


8/19

NC ) . Untuk pembatasan analisis , DNA fag dicerna dengan endonuklease restriksi ( Avai ,

BamHI , BglI , BglII , EcoRI , EcoRV , dan XbaI ) sesuai untuk rekomendasi pemasok (

Promega , Madison, WI ) . Fragmen DNA dipisahkan oleh agarose ( 0,8 % ) elektroforesis gel di

Tris - acetate - Penyangga EDTA pada tegangan konstan ( 150 V ) selama 3 jam

dan divisualisasikan dengan sinar UV ( 300 nm ) setelah pewarnaan dengan etidium bromida ( 1

Ag / ml ) .

2.10 . fag adsorpsi

Percobaan adsorpsi dilakukan sebagai dijelaskan oleh Foschino et al. ( 1995) dan Ellis dan

Delbruck ( 1939), kecuali bahwa fag unadsorbed diperoleh dengan filtrasi bukan sentrifugasi.

Sebuah budaya lokal regangan ( C108 cfu / ml ) dalam kaldu MRS dilengkapi dengan 0 , 5, 10,

15, 20, 25, atau 30 mM CaCl2 terinfeksi oleh suspensi fag untuk memberikan

MOI 0,01 , dan diinkubasi pada 30 Jc . aliquot 0,6 ml diambil pada 0 , 3 , 6 , 10 , 15 , 20 , 25 ,

dan 30 min setelah infeksi dan segera disaring melalui 0,45 - Am ukuran pori jarum suntik filter.

filtrat yang terkikik untuk fag unadsorbed oleh double-layer metode lempeng agar. MRS kaldu

yang hanya berisi fag digunakan sebagai kontrol. Adsorpsi persen dari fag dihitung sebagai [

(kontrol titer ? residual titer ) / control titer ] ? 100 % ( Durmaz , 1992). A terpisah

Percobaan dilakukan di N , N , -bis ( 2 - Hidroksietil ) - 2 - aminoethanesulfonic acid ( BES )

penyangga bukannya kaldu MRS untuk mempelajari efek kalsium pada fag adsorpsi . BESpenyangga disiapkan pada konsentrasi 50 mM dan pH 7,2. Setelah filtersterilization,

buffer dilengkapi dengan CaCl2 untuk konsentrasi akhir 0-20 mM. ionik The

kekuatan BES penyangga telah disesuaikan dengan NaCl jadi bahwa kekuatan ion yang

dihasilkan dari CaCl2 ditambah NaCl adalah 0,145. Salah satu mililiter fase log awal budaya sel

inang (2 108 cfu / ml ) dipanen dengan sentrifugasi (12.000 g selama 4 menit) dan dicuci dua

kali dengan saline (0,85 % NaCl). sel pelet diresuspensi dengan 1 ml BES penyangga

mengandung CaCl2 ( 0 , 0,01 , 0,1 , 1 , 2 , 5 , 10 , atau 20 mM ). Suspensi sel terinfeksi fag

saham ( 1 ? 109 PFU / ml ) pada MOI sekitar 0,02 . Setelah inkubasi pada 30 JC selama 30 menit

, campuran disaring melalui 0.45 -Am ukuran pori jarum suntik menyaring. Filtrat diuji untuk

fag unadsorbed dengan teknik double-layer.

2.11 . Efek kalsium pada propagasi fag


9/19

Efek kalsium pada propagasi fag ditentukan dalam lima tabung 15 - ml . Sepuluh mililiter awal

budaya lokal log - fase ( c1 ? 108 cfu / ml ) di MRS kaldu dipindahkan ke masing-masing dari

lima 15 ml tabung yang mengandung 0, 1, 10, 20, atau 30 mM dilengkapi CaCl2. Setelah

volume akhir telah disesuaikan dengan air suling , setiap tabung terinfeksi dengan fag pada MOI

dari sekitar 0,03 . Semua tabung yang diinkubasi pada 30 Jc. Sebuah alikuot ( 0,5 ml ) diambil

dari masing-masing tabung pada interval yang dipilih dan disaring segera. PFU ditentukan oleh

double-layer metode lempeng agar.

2.12 . Pertumbuhan satu langkah

Untuk percobaan pertumbuhan satu langkah , modifikasi metode Leuschner et al . ( 1993) dan

Foschino

et al . ( 1995) digunakan dengan 10 - min adsorpsi . Setelah sentrifugasi pada 13.000 ? G selama

30 s ( Model Fisher 16km Marathon microcentrifuge , Fisher Scientific , Pittsburgh , PA ) , pelet

yang mengandung (sebagian) sel yang terinfeksi itu resuspended dalam 1 ml pra - hangat kaldu

MRS . Sampel diambil pada 5 atau 10 menit - interval ( hingga 2 jam) dan segera terkikik

dengan metode double-layer lempeng agar. Tes yang dilakukan dalam tiga rangkap. Periode

laten didefinisikan sebagai interval waktu antara adsorpsi (tidak termasuk 10 menit pra -

inkubasi) dan awal pertama meledak , seperti yang ditunjukkan oleh kenaikan awal di fag titer (

Adams , 1959 ; Ellis dan Delbruck , 1939). Ukuran Burst dihitung sebagai rasio dari jumlahakhir dari partikel fag dibebaskan hitungan awal terinfeksi sel bakteri selama periode laten (

Adams , 1959) . Sebuah model sigmoidal empat parameter yang cocok untuk onestep yang kurva

pertumbuhan. The NLIN prosedur SAS ( SAS Institute , Cary , NC ) digunakan untuk

memperkirakan parameter model .


10/19

Gambar. 1.

Elektron mikrograf dari L. plantarum fag AJL-1. Persiapan bakteriofag CsCl-dimurnikan negatif

diwarnai dengan 2% uranil asetat (pH 4.0). Pembesaran: 85,000?. Bar: 100 nm.

2.13 Sebuah alikuot (26 Al) dari CsCl-dimurnikan AJL-1 sampel dicampur dengan 10 Al buffer

dan 4 Al mengurangi agent (sistem NuPAGE LDS, Novex, San Diego, CA). Campuran

dipanaskan dalam air mendidih selama 10 menit dan kemudian dilakukan elektroforesis pada 4 -

12% Bis-Tris gel pada 200 V dan 120 mA selama 35 menit. Band protein diwarnai dengan

Coomassie biru G-250 (Pharmacia), diikuti oleh destaining dengan larutan yang mengandung

50% metanol dan 10% asetat asam. Nilai berat molekul yang dilaporkan adalah diperoleh

dengan menggunakan standar berat molekul (Mark 12, Novex), dan rata-rata hasil dari tiga

elektroforesis berjalan.


11/19

Gambar. 2.

Kurva adsorpsi L. plantarum fag AJL-1 di MRS media tanpa suplemen kalsium (.) atau dengan

20 mM kalsium suplemen (5).

2.14. inaktivasi termal

Mandi air temperatur terkendali (M3 Lauda, Brinkman Instrument, Westbury, NY) digunakan

untuk menentukan nilai D fag AJL-1. 1,5-ml tabung microcentrifuge mengandung 900 Al steril,

deionisasi air dipanaskan sampai suhu yang diinginkan, mulai 70-100 Jc. Solusi fag di 100 Al(106 PFU / ml dalam air) ditambahkan ke dalam tabung.

Gambar. 3.


12/19

Pengaruh kalsium pada fag AJL-1 propagasi di MRS Media pada 30 jc tanpa suplemen

kalsium (.), dan dengan 1 (q), 10 (E), 20 (5), atau 30 mM (o) mM suplemen kalsium.

Gambar. 4.

Kurva pertumbuhan satu langkah dari L. plantarum fag AJL-1 di Siphoviridae, menurut

International Komit-MRS broth pada 30 Jc. Tiga ulangan dari kurva pertumbuhan yang

dilakukan. Root mean square adalah 0,106 dengan R2 nilai 0,998.

Setelah pemanasan pada interval antara 15 s sampai 3 menit, tabung ditempatkan

dalam penangas es-air. sampel yang diuji untuk menentukan hidup PFU. Nilai D adalah

dihitung sebagai waktu yang dibutuhkan untuk satu pengurangan log in PFU / ml.

3. Hasil

3.1. Fag isolasi dan karakterisasi

Sampel air garam dari minggu pertama fermentasi disaring untuk kehadiran fag aktif terhadap L.

plantarum MU45. Fag dari plat positif (mengandung zona yang jelas) dari menjalani tes tempat

pemurnian plak. Fag AJL-1 dibentuk kecil, jelas, plak bulat (sekitar 1,7 mm) pada

halaman MU45. Tinggi titer fag saham terkandung 109 PFU / ml. Ultrastruktur dari fag

diperiksa dengan mikroskop elektron, seperti yang terlihat pada Gambar. 1. Fag

memiliki kepala isometrik dari 59 nm diameter dan panjang, fleksibel, non-kontraktil, dan

secara teratur lurik ekor (182 nm panjang dan 11 nm lebar). Sebuah basis kompleks

plate (sekitar 25 nm diameter) pada ekor juga hadir. Fitur struktural fag ini

konsisten dengan morphotype B1 menurut Ackermann (1996), dan mengklasifikasikan ke


13/19

family Siphoviridae, menurut International Komit-tee Taksonomi Virus ( Mathews , 1982).

MOI optimal AJL - 1 bertekad untuk menjadi 0,01 - 0,03 ( data tidak ditampilkan ).

Gambar. 5.

Fag AJL-1 populasi dari waktu ke waktu pada 70 dan 80 Jc dalam air.

PH awal adalah 6,5.

Gambar. 6.


14/19

SDS-PAGE dari L. plantarum fag AJL-1 protein struktural (jalur 2 dan 3) dan spidol

massa molekul (jalur 1). Mark 12 standar dicemarkan digunakan sebagai standar berat

molekul

3.2 . Efek kalsium pada adsorpsi fag dan propagasi

Tingkat adsorpsi AJL - 1 di MRS kaldu dengan 0 dan 20 mM CaCl2 suplemen ditunjukkan pada

Gambar .

2. Dalam MRS broth tanpa CaCl2 suplementasi , sekitar 75 % dari AJL - 1 partikel fag terserap

untuk menjadi tuan rumah sel dalam 10 menit , 90 % dalam 20 menit , dan 96 % di 30 min .

Hasil yang sama diperoleh dalam media MRS dilengkapi dengan 5, 10, 15, 25, dan 30 mM

kalsium klorida. Adsorpsi AJL - 1 kalsium - gratis BES penyangga kemudian diselidiki , dan

persen adsorpsi yang serupa dengan yang di MRS Media dengan atau tanpa suplementasi

kalsium . Namun, tingkat pertumbuhan fag yang lebih cepat di calcium supplemented. Media

pada MOI 0,02 (Gambar 3). Sel lisis diamati dalam media MRS yang mengandung 10, 20, atau

30 mM CaCl2 menambahkan dalam waktu 2 jam, sedangkan izin dibutuhkan 3 atau 4 jam dalam

media yang mengandung 1 atau 0 Mm ditambah CaCl2 . Tidak ada perbedaan dalam tarif

propagasi fag dengan media MRS dilengkapi dengan konsentrasi CaCl2 di kisaran 10-30 mM .

Titer fag akhir di semua media , dengan atau tanpa suplementasi kalsium , mencapai level sama

dalam 4 jam.

3.3 Dari jangkauan , kinetika , dan labilitas termal.

Kisaran inang dari AJL - 1 ditentukan dengan 32 dipilih strain dari 4 genera LAB . AJL - 1

adalah litik terhadap kedua L. plantarum B17 dan mutan yang MU45 , yang kekurangan

fermentasi malolactate kemampuan . Dari 31 yang tersisa strain LAB diuji , tidak ada sensitif

terhadap AJL - 1 ( Tabel 1 ). Sebuah satu langkah Pertumbuhan kurva untuk AJL - 1 ditentukan

dalam kaldu MRS pada 30 Jc . Gambar . 4 menunjukkan bahwa periode laten sekitar 35 min,

periode kenaikan adalah 40 menit, dan rata-rata burst ukuran adalah 22 PFU / sel . Labil Termal

AJL - 1 adalah diselidiki oleh perlakuan termal pada 70, 80, 90, dan 100 Jc. Kurva Survivor fag

pada 70 dan 80 Jc ditunjukkan pada Gambar . 5 . Nilai D dihitung sebagai 2,7 menit pada 70 Jc


15/19

dan 0,2 menit pada 80 Jc. titer fag menurun di bawah batas deteksi ( 20 PFU / ml ) setelah

pemanasan selama lebih dari 60 s pada 80 JC, atau 15 s pada 90 atau 100 Jc .

3.4. Protein dan analisis urutanProtein struktural fag AJL - 1 dianalisis dengan SDS -PAGE (Gambar 6 ) . Enam protein

struktural terungkap dengan massa molekul diperkirakan mencapai 76, 61, 50, 45, 34, dan 28

kDa. DNA kromosom adalah disampaikan kepada Departemen Energi Joint Genome

Institute (Walnut Creek, CA). urutan awal data (http://www.jgi.doe.gov) menunjukkan dua

bersebelahan utama urutan, contigs 1 dan 2. Contig 2 adalah dibangun dari 1216 membaca dan

terdiri dari 35.701 bps dengan 46 kemungkinan frame baca terbuka (ORFs, Gambar.

7). Contig 1 terdiri dari 831 bps. Sebuah pembatasan peta contig 2 dari AJL-1 (Gambar 7)

dibangun berdasarkan ini urutan data primer dan dikonfirmasi oleh kami

pembatasan analisis (data tidak ditampilkan).

Gambar. 7.Pembatasan dan ORF peta Contig 2 fag AJL-1 DNA. Lokasi (di bp) dari endonuklease restriksi

(Avai, BamHI, BglI, BglII, EcoRI, EcoRV, dan XbaI) situs yang sesuai indikasi. Orientasi dari

ORFs ditunjukkan dengan panah. Jumlah di bawah setiap panah mewakilijumlah asam amino yang dikodekan oleh setiap ORF.

Diskusi


16/19

Adsorpsi partikel fag ke sel-sel bakteri adalaangkah awal infeksi fag . Sementara 75 % adsorpsi

terjadi dalam 10 menit , 96 % adsorpsi terjadi pada 30 menit . Caso et al . ( 1995) melaporkan

bahwa 92 % dari fag ALP1 -A diserap ke L. plantarum ATCC 8014 dalam 45 menit . Adsorpsi

tidak hanya tergantung pada kehadiran reseptor spesifik pada permukaan sel

( Topley dan Wilson , 1990) , tetapi juga dapat bergantung pada kehadiran kation tertentu di

media . bakteriofagbiasanya membutuhkan konsentrasi yang lebih tinggi dari

kation divalen , seperti kalsium atau magnesium , dibeberapa tahap siklus infeksi mereka

daripada konsentrasi diperlukan untuk pertumbuhan sel inang ( Watanabe dan Takesue , 1972) .

Dalam studi ini , lebih dari Ca2 + ( 5 - 30 mM ) dalam media MRS tidak mempengaruhi adsorpsi

tingkat di 30 menit pertama , tapi mempromosikan fag cepat propagasi dan lisis sel . Hasil ini

menunjukkan bahwa kadar kalsium dan / atau kation lainnya di MRS. Media yang cukup untuk

langkah awal infeksi tetapi bukan untuk siklus berikutnya . Watanabe dan Takesue ( 1972)

melaporkan bahwa ion kalsium yang diperlukan untuk penetrasi genom fag ke dalam sel host

Lactobacillus casei . Kalsium tampaknya diperlukan untuk lainnya AJL - 1 proses . Adsorpsi

persen BES kalsium bebas penyangga hampir sama dengan yang kalsium mengandung BES

penyangga atau media MRS, menunjukkan bahwa kalsium tidak diperlukan untuk fag adsorpsi .

Hal ini mungkin karena ion natrium yang hadir di BES kalsium bebas buffer dan ini

kation monovalen yang sama efektifnya dengan Ca2 + dalam memfasilitasi adsorpsi fag .Dilaporkan bahwa di air suling murni atau pada konsentrasi rendah monovalenon ( V0.01 mM ) ,

sebagian fag tidak menyerap bakteri ( Luria et al . , 1978) . Konsentrasi natrium dalam 50 mM

BES (pH 7,2 ) yang digunakan dalam penelitian jauh lebih tinggi dari 0,01 mM dan mungkin

memiliki sudah cukup untuk memfasilitasi adsorpsi fag . Watanabe dan Takesue ( 1972)

mempelajari adsorpsi penyangga fag PL - 1 L. casei di Tris - maleat dalam ada atau tidak adanya

kalsium . Mereka menyimpulkan bahwa kalsium tidak diperlukan dalam Tris - maleat buffer

adsorpsi fag . Hal ini tidak diketahui apa Ca2 + - Faktor-faktor independen yang terlibat dalam

adsorpsi fag .

Morfologi AJL - 1 mirip dengan kebanyakan fag Lactobacillus lainnya ( sekitar 50 nm

diameter, 170-180 nm panjang , Jarvis , 1989) . AJL - 1 memiliki ukuran meledak dari 22 PFU /

sel , yang lebih besar dari itu untuk L. plantarum 8014 fag B2 ( 12-14 PFU / sel ; Nes et

al . , 1988) , tapi hampir 10 kali lebih kecil dari itu untuk L. fag plantarum fri ( 200 PFU / sel ; .


17/19

Trevors et al ,1983) . Fag B2 memiliki kepala yang lebih besar ( 110 nm

diameter ) dan ekor yang lebih panjang ( 500 nm) dari AJL - 1 ( 59 dan 182 nm, masing-masing)

. Kedua B2 fag dan fri memiliki jangka waktu lebih lama laten ( 75 min ) dibandingkan AJL - 1 (

35 min ) . AJL - 1 adalah litik hanya terhadap dua erat terkait strain L. plantarum , BI7 dan

mutan isogenic MU45 . AJL - 1 adalah berbeda dari fag SC921 terisolasi dari Kimchi ( Yoon et

al . , 2001) karena AJL 1 tidak litik untuk host SC921 , L. plantarum ATCC

14.917 . Spesifisitas regangan tinggi juga diamati pada L. plantarum fag lain seperti L. plantarum

fag B2 dan Jumat ( Douglas dan Wolin , 1971; . Trevors et al ,

1983). Seperti kebanyakan fag ekor , AJL - 1 memiliki genom terdiri dari linier , DNA beruntai

ganda. itu estimasi ukuran genom AJL - 1 ( 36,7 kbp ) adalah lebih kecil daripada dikenal L.

plantarum fag lainnya ( Tabel 2 ) , termasuk : ALP2 ( 47 kbp ) , SC921 ( 66,5 kbp ) , B2 ( 73 kbp

) , ALP1 ( 80 kbp ) , dan Jumat ( 133 kbp ). The AJL - 1 ukuran genom adalah mirip dengan

Demi lactobacillus fag PWH2 ( 35 kbp ) , Lactobacillus bulgaricus fag ch2 ( 35 kbp ) , dan L.

Casei fag J - 1 ( 37 kb ) , tetapi lebih kecil dari Lactobacillus gasseri fag phi adh ( 43,8 kbp ) .

pembatasan ukuran pencernaan fragmen dilaporkan untuk fag menunjukkan tidak ada kemiripan

dengan AJL - 1 . Berdasarkan Data primer sequencing , 46 ORFs diidentifikasi. ORFs tambahan

dapat diidentifikasi setelah genom sequencing selesai . Enam protein struktural dengan berat

molekul berkisar 28-76 kDa yang diidentifikasi oleh SDS -PAGE . Suatu analisa rangkaian rinci

dan identifikasi ORFs sesuai dengan protein struktural diamati akan menjadi subjek penelitianmasa depan . AJL - 1 dengan cepat tidak aktif pada suhu di atas 70 Jc . Sensitivitas panas ini

dapat dimanfaatkan dalam merancang proses panas untuk mempersiapkan sayuran sebelum

ke starter budaya inokulasi . Breidt et al . (2000) melaporkan bahwa blanching seluruh mentimun

acar selama 15 s ( 0,25 menit) pada 80 Jc mengurangi sel mikrobamjumlah 2-3 siklus log dari

populasi awal biasanya 106 cfu / g . Pengobatan blanching ini cukup untuk menghilangkan 1 log

siklus AJL - 1 dari segar mentimun dan , akibatnya , akan diprediksi mengurangi risiko masalah

infeksi fag potensial dengan budaya MU45 starter untuk dikendalikan rendah garam

mentimun fermentasi .

Hasil dari penelitian ini menunjukkan bahwa AJL 1 aktif terhadap potensi budaya

pemula ( MU45 ) untuk fermentasi mentimun komersial . infeksi fag dapat mempengaruhi proses

fermentasi dengan menunda pengasaman air garam , sehingga memungkinkan pembusukan atau

organisme patogen untuk tumbuh dan mempengaruhi kualitas atau keamanan produk fermentasi.


18/19

Sebuah studi dengan fag B2 dan inangnya L. Plantarum ATCC 8014 sebagai budaya daging

pemula menunjukkan bahwa infeksi fag signifikan tertunda ( 8-10 hari ) produksi asam laktat

dan seiring penurunan pH selama produksi salami sosis kering ( Nes dan Sorheim , 1984).

Infeksi fag juga bisa menghancurkan Biocontrol organisme , memberikan jaminan keselamatan

palsu . AJL - 1 adalah yang pertama dilaporkan L. plantarum fag diisolasi dari fermentasi

mentimun. penemuan fag ini memberikan informasi berharga yang harus dipertimbangkan

selama pengembangan prosedur apapun untuk dikendalikan mentimun fermentasi atau

biokontrol sistem yang menggunakan L. plantarum MU45 . penelitian lebih lanjut diperlukan

untuk mengevaluasi dampak dari AJL - 1 pada ini sistem .

Tabel 2

Ukuran genom dari beberapa bakteriofag Lactobacillus

Menurut saya kelebihan dri jurnal ini adalah Salah satu kriteria jurnal ilmiah bertaraf

internasional adalah bahwa jurnal ilmiah tersebut haruslah diminati oleh dunia internasional. Jadi

sifatnya universal. Kriteria utama jurnal berskala internasional adalah bahwa jurnal tersebut

diakui mutunya dan menjadi referensi para ilmuwan internasional. Semakin banyak dan sering

ilmuwan internasional menyitasi isi jurnal bagi keperluan tulisan ilmiah internasional maka


19/19

semakin baik mutu jurnal yang bersangkutan. Dan jurnal ini jurnal internasional. Jurnal ini

berkala semi ilmiah yang memuat tulisan teknis dengan cakupan yang bersifat siklopedia dan

ditujukan buat kalangan terpelajar yang buka ahli dalam bidang termaksud, Abstrak ditulis dalam

satu paragraf yang berisi tujuan penelitian, materi dan metodologi penelitian, hasil utama

penelitian, kesimpulan dan kata kunci (key words). Introduction atau pendahuluan berisi tentang

tinjauan pustaka, justifikasi penelitian, dan tujuan penelitian.

Di dalam isi jurnal ini penulis menulis secara lengkap jenis materi dan metodologi

yang kita lakukan dalam penelitian, sehingga reviewer bisa memahami prosedur yang digunakan

dalam penelitian. Dalam bagian tersebut penulis menyajikan tabel, gambar, kurva untuk

memperjelas dan meringkas informasi yang akan ditulis. Setiap jurnal mempunyai pola yang

baku atau yang fleksibel dalam bagian ini. Ada jurnal yang memisahkan Results dari Discussion,

atau menyatukannya, dan ada pula yang menyerahkannya kepada penulis sesuai dengan

kenyamanan dalam penyajiannya.

Dan di jurnal ini result dan discussion terpisah. Keuntungan cara ini adalah

pembahasan bisa lebih terarah dan menyeluruh karena bisa membahas variabel atau parameter

yang saling berhubungan sekaligus. Keburukannya adalah bahwa dalam membahas kita

cenderung memulai lagi sedikit dengan hasil, sehingga akan mengulang lagi apa yang sudah

disajikan dalam hasil. Penulis juga mengggunakan gambar. Dengan adanya gambar maka jurnalyang dibuatnya menjadi lebih menarik, sehingga pembaca lebih mengetahu hasil dari penelitian

yang telah ia lakukan. Penulisan daftar pustakanya disusun secara alfabetis.

Menurut saya jurnal ini baik, karena sudah memenuhi syarat-syarat atau format

penyusunan atau pembuatan jurnal yang baik. Dengan kelebihan-kelebihan di atas maka sudah

sangat jelas bahwasanya jurnal ini baik.

Review International Journal Isolasi

Documents

Transcript of Review International Journal Isolasi