Response of Terrestrial Microorganisms to a Simulated Martian Environment

8/4/2019 Response of Terrestrial Microorganisms to a Simulated Martian Environment

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A P P L I E D AN D ENVIRONMENTAL M I C R O B I O L O G Y , A p r . 1 9 7 8 , p . 7 3 0 - 7 3 70 0 9 9 - 2 2 4 0 / 7 8 / 0 0 3 5 - 0 7 3 0 $ 0 2 . 0 0 / 0C o p y r i g h t i 1 9 7 8 A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g yV o l . 3 5 , N o . 4

P r i n t e d i n U . S . A .

R e s p o n s e o f T e r r e s t r i a l M i c r o o r g a n i s m s t o a S i m u l a t e dM a r t i a n E n v i r o n m e n tTERRY L . FOSTER,* L . WINANS, J R . , R . C . CASEY, AND L . E . KIR S CHNER

S c i e n c e R e s e a r c h C e n t e r , Hardin-Simmons U n i v e r s i t y , A b i l e n e , T e x a s 7 9 6 0 1R e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n 8 J a n u a r y 1 9 7 6

S o i l s a m p l e s f r o m C a p e C a n a v e r a l were s u b j e c t e d t o a s i m u l a t e d M a r t i a ne n v i r o n m e n t an d a s s a y e d p e r i o d i c a l l y over 4 5 d a y s t o d e t e r m i n e t h e e f f e c t o fv a r i o u s e n v i r o n m e n t a l p a r a m e t e r s on b a c t e r i a l p o p u l a t i o n s . The s i m u l a t e d e n v i -r o n m e n t was b a s e d o n t h e m o s t r e c e n t a v a i l a b l e d a t a , p r i o r t o t h e V i k i n gs p a c e c r a f t , d e s c r i b i n g M a r t i a n c o n d i t i o n s an d c o n s i s t e d o f a pressure o f 7 m i l l i -b a r s , an a t m o s p h e r e o f 9 9 . 9 % CO2 an d 0 . 1 % 0 2 , a f r e e z e - t h a w c y c l e o f -65C f o r1 6 h an d 2 4 C f o r 8 h , an d v a r i a b l e m o i s t u r e an d n u t r i e n t s . Reduced p r e s s u r e hada s i g n i f i c a n t e f f e c t , r e d u c i n g g r o w t h u n d e r t h e s e c o n d i t i o n s . S l i g h t v a r i a t i o n s i ngaseous c o m p o s i t i o n o f t h e s i m u l a t e d a t m o s p h e r e had n e g l i g i b l e e f f e c t o n g r o w t h .The f r e e z e - t h a w c y c l e d i d n o t i n h i b i t g r o w t h , b u t d i d r es u l t i n a s l o w e r r a t e o fd e c l i n e a f t e r g r o w t h had o c c u r r e d . Dr y s a m p l e s e x h i b i t e d n o c h a n g e d u r i n g t h e4 5 - d a y e x p e r i m e n t , i n d i c a t i n g t h a t t h e s i m u l a t e d M a r t i a n e n v i r o n m e n t was n o tt o x i c t o b a c t e r i al p o p u l a t i o n s . P s y c h r o t r o p h i c o r g a n i s m s r e s p o n d e d more f a v o r -a b l y t o t h i s e n v i r o n m e n t t h a n m e s o p h i l e s , a l t h o u g h b o t h t y p e s e x h i b i t e d i n c r e a s e so f a p p r o x i m a t e l y 3 l o g s i n 7 t o 1 4 d a y s when m o i s t u r e an d n u t r i e n t s werea v a i l a b l e .

As m an b e g a n t o e x p l o r e t h e p l a n e t s , i t wasr e c o g n i z e d t h a t t h e r e i s a n e e d t o p r e v e n t c o n -t a m i n a t i o n o f p l a n e t s u n d e r i n v e s t i g a t i o n ( 4 ) .O n e t y p e o f e x p e r i m e n t t h a t h a s p r o v e n u s e f u li n m e e t i n g p l a ne t ar y q u a r an t i ne c o n s t r a i n t s h a sb e e n t h e s t u d y o f v ar i o us m i c r o b e s i n s i m u l a t e dp l a n e t a r y e n v i r o n m e n t s . As e a r l y a s 1 9 5 3 , S t r u g -h o l d ( 1 5 ) p e r f o r m e d s u c h i n v e s t i g a t i o n s a s r e -l a t e d t o M a r s , a n d s i n c e t h a t t i m e numerousi n v e s t i g a t o r s h a v e p e r f o r m e d s u c h s t u d i e s , w i t ht h e s i m u l a t e d e n v i r o n m e n t s b e i n g u p d a t e d a snew i n f o r m a t i o n a b o u t M a r s b e c a m e a v a i l a b l e( 2 , 3 , 6 - 1 0 , 1 2 , 1 4 , 1 6 - 1 8 ) . M o s t o f t h e s e i n v e s t i -g a t i o n s d e m o n s t r a t e d t h a t m i c r o b e s c a n s ur v i v et h e s i m u l a t e d M a r t i a n e n v i r o n m e n t ( 3 , 7 , 1 8 ) ,a n d s o me d e m o n s t r a t e d t h a t a f e w m i c r o o r g a -n i s m s c a n g r o w i f m o i s t u r e i s p r e s e n t ( 2 , 8 - 1 0 ) .B e c a u s e o f t h e s e a n d o t h e r f i n d i n g s , t h e V i k i n gs p a c e c r a f t w e r e s u b j e c t e d t o d r y - h e a t d e c o n t a m -i n a t i o n p r i o r t o l a u n c h i n g i n t h e summer o f 1 9 7 5t o r e d u c e t h e p r o b a b i l i t y o f c o n t a m i n a t i o n o fM a r s .E v i d e n c e c o n c e r n i n g t h e e n v i r o n m e n t o f Marsh a s p r o g r e s s e d r a p i d l y d u r i n g t h e l a s t f e w y e a r s .A t o n e t i m e , a l l e v i d e n c e was b a s e d o n E a r t h -b a s e d e x p e r i m e n t s ( 1 3 ) , b u t a s t h e s p a c e p r o -g r a m d e v e l o p e d , m o re a c c u r a t e i n f o r m a t i o n w a sg a i n e d b y s e n d i n g s p a c e c r a f t i n t o t h e v i c i n i t y o fM a r s ( 5 , 1 1 ) . T h e r e a p p e a r s t o b e a v o i d o fr e s e a r c h d e a l i n g w i t h s i m u l a t e d M a r t i a n e n v i -r o n m e n t s s i n c e d a t a f r o m M a r i n e r 9 r e s u l t e d i n

r e v i s e d c o n c e p t s o f t h e M a r t i a n e n v i r o n m e n t ,i n c l u d i n g h i g h e r C O 2 c o n c e n t r a t i o n , l i t t l e o r n oN 2 , p o s s i b l y a v a i l a b l e l i q u i d w a t e r , a n d l o w e rp r e s s u r e ( 5 ) . A l s o , n o n e o f t h e p r e v i o u s i n v e s t i -g a t i o n s u s e d m i c r o b i a l s a m p l e s f r o m a c t u a ls p a c e c r a f t e n v i r o n m e n t s . B e c a u s e m i c r o b e sf r o m s p a c e c r a f t a r e a s h a v e t h e b e s t o p p o r t u n i t yt o c o n t a m i n a t e s p a c e c r a f t t o M a r s , i t s e e m e da p p r o p r i a t e t o i n c l u d e s u c h s a m p l e s i n t h i s i n -v e s t i g a t i o n . The o b j e c t i v e o f t h i s i n v e s t i g a t i o nw a s t o d e t e r m i n e t h e r e s p o n s e o f m i c r o o r g a -n i s m s i s o l a t e d f r o m s p a c e c r a f t a r e a s t o a s i m u -l a t e d M a r t i a n e n v i r o nm e n t , b a s e d o n t h e m o s tr e c e n t d a t a f r o m M a r s . To e x p a n d f i n d i n g s o ft h i s t y p e o f i n v e s t i g a t i o n t o s a y t h a t t e r r e s t r i a lo r g a n i s m s c a n o r c a n n o t g r o w o n M a r s i s i m p o s -s i b l e , b u t s u c h s t u d i e s c a n p r o v i d e s c i e n t i f i c d a t at o a s s i s t i n d e t e r m i n i n g t h e p r o b a b i l i t y o f c o n -t a m i n a t i o n o f M a r s . The V i k i n g s p a c e c r a f t ,w h i c h l a n d e d o n Mars o n 2 0 J u l y a n d 3 S e p t e m -b e r 1 9 7 6 , h a v e s u p p l i e d d a t a t o d e m o n s t r a t e t h a tr e s u l t s f r o m M a r i n e r 9 w e r e q u i t e a c c u r a t e ( S c i -e n c e , v o l . 1 9 4 , 1 9 7 6 ) . The e a r l y r e s u l t s a n d e n -v i r o n m e n t a l p a r a m e t e r s u s e d b y p r e v i o u s i n v e s -t i g a t o r s a r e s h o w n i n T a b l e 1 . I n v e s t i g a t o r s p r i o rt o t h i s u s e d p r i m a r i l y a N 2 a t m o s p h e r e a t a m -b i e n t p r e s s u r e i n a b r o t h medium ( 1 4 , 1 6 , 1 7 ) .The e n v i r o n m e n t a l p a r a m e t e r s u s e d i n t h e p r e s -e n t i n v e s t i g a t i o n m o s t c l o s e l y a p p r o x i m a t e t h ea c t u a l m e a s u r e m e n t s o b t a i n e d f r o m t h e s u r f a c eo f M a r s .

7 3 0


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GROWTH I N A S I MUL AT E D MAR T IAN ENVIRONMENT 7 3 1TABLE 1 . C h r o n o l o g i c a l c o m p a r i s o n o f p a r a me t e r s u s e d i n i n v e s t i g a t i o n s o f s i m u l a t e d M a r t i a ne n v i r o n m e n t s a n d c u r r e n t d a t a o f t h e M a r t i a n e n v i r o n m e n t

F r e e z e - t h a w c y -R e f e r e n c e Y e a r G a s e o u s a t - (m m o f c e S u b s t r a t e M o i s t u r e

H g ) Temp Time( O C ) ( h )9 1 9 6 7 1 0 0 . 0 % a i r o r 1 0 - 9 8 2 5 8 4 9 . 5 % f e l s i t e 5% R H "3 7 - 1 0 0 % C O 2 - 6 5 1 6 4 9 . 5 % l i m o n i t e1 . 0 % AC medium

1 8 1 9 6 7 A i r 7 6 0 2 5 4 . 5 N a t i v e s o i l s u s p e n s i o n-75 1 9 . 5 i n b r o t h8 1 9 6 8 3 7 - 6 7 % C 0 2 1 0 - 9 8 2 5 1 6 4 9 . 5 % f e l s i t e 4 9% RH3 0 - 2 1 % A r - 6 5 8 4 9 . 5 % l i m o n i t e 9 4 %2 7 - 1 3 % N 2 1 . 0 % AC medium 95%o r 2 5 81 0 0 . 0 % C O 2 - 6 5 1 6

1 0 1 9 7 2 8 0 . 0 % C O 2 5 . 3 2 8 8 4 0 : 4 0 : 1 0 : 5 : 5 , f e l s i t e - l i - 3 . 8 % RH2 0 . 0 % Ar - 6 0 1 6 m o n i t e - g a r d e n s o i l -p e a t - v o l c a n i c r o c kC u r r e n t i n v e s t i g a t i o n 9 9 . 9 % CO2 5 . 3 2 4 8 N a t i v e t e r r e s t r i a l s o i l A i r d r i e d t o 1 0 %b a s e d o n M a r i n e r 9 0 . 1 % 0 2 -65 1 6 o r 4 0 : 4 0 : 1 0 : 5 : 5 , f e l - ( w t / w t )o r s i t e - l i m o n i t e - g a r d e n

9 9 . 0 % C 0 2 s o i l - p e a t - v o l c a n i c1 . 0 % O 2 r o c kV i k i n g 1 d a t a a t l a n d - 9 5 . 0 % C O 2 5 . 8 - 8 4 T e n t a t i v e l y : A l 2 - 7 % , < 0 . 1 % , a n d p r o b a -i n g s i t e 1 9 7 6 - 7 7 b 2 - 3 % N 2 -28 S i 1 5 - 3 0 % , C a 3 - 8 % , b l y a b u n d a n c e o f1 - 2 % Ar T i 0 . 2 5 - 1 . 5 % , F e h y d r a t e d m i n -0 . 1 % 0 2 1 2 - 1 6 % , o t h e r s e r a l so t h e r s - t r a c e

a ' R H , R e l a t i v e h u m i d i t y .6 S c i e n c e 1 9 4 : 5 7 - 1 0 5 ( 1 9 7 6 ) ; N a t i o n a l G e o g r a p h i c 1 5 1 : 3 - 3 1 ( 1 9 7 7 ) ; S c i e n t i f i cr e p o r t s r e l e a s e d p e r i o d i c a l l y .

MATERIALS AND METHODS u n d e r t h e d e s ig r o u p s were pS e l e c t i o n o f s o i l s a m p l e s . S o i l s a m p l e s were o b - v a r i o u s parant a i n e d f r o m numerous d i f f e r e n t s i t e s a t C a p e C a n a v - m e n t , s u c h ase r a l f r o m areas a s s o c i a t e d w i t h t h e V i k i n g s p a c e c r a f t . t u r e , n u t r i e n t .T h e s e s a m p l e s were o b t a i n e d b y s c r a p i n g away t h e s i s t e d o f d r i e df i r s t 0 . 5 i n c h ( c a . 1 2 . 7 m m ) o f s o i l , t h e n c o l l e c t i n g t h e o f w a t e r a d d en e x t 3 t o 4 i n c h e s ( c a . 7 6 t o 1 0 2 m m ) w i t h a s t e r i l e s i s t e d o f s t u w

scoop. S a m p l e s were p l a c e d i n t o a i r t i g h t , s t e r i l e , p l a s - ( n a t i v e o r g a nt i c c o n t a i n e r s , r e t u r n e d t o o u r l a b f o r s t u d y , a n d s t o r e d e x p e r i m e n t a la t r e f r i g e r a t o r t e m p e r a t u r e p r i o r t o use. F r e s h s a m p l e s s o i l m i x t u r e iwere o b t a i n e d p e r i o d i c a l l y , a n d a l l s a m p l e s c o n s i s t e d s o i l m i x t u r e Mp r i m a r i l y o f s a n d ( m a n y o f t h e s e s i t e s ar e b u i l t up t a i n e d 3% y ew i t h f i l l s a n d d r e d g e d f r o m t h e o c e a n ) . The o n l y m a j o r M a r t i a n s o i ld i f f e r e n c e between t h e s a m p l e s was t h e amount o f s o i l i s o l a t e s wo r g a n i c h u m u s . Many were w h i t e s a n d s , c o n t a i n i n g s e l e c t e d f o r ul i t t l e o r g a n i c h u m u s , w h i l e o t h e r s were d a r k s a n d . I n f a c u l t a t i v e l ysome i n v e s t i g a t i o n s , i n d i v i d u a l s o i l s a m p l e s were s u b - s e t o f e x p e r i mj e c t e d t o t h e a r t i f i c i a l M a r t i a n e n v i r o n m e n t , b u t i n ( l i g h t a n d d a it h e m a j o r i t y o f i n v e s t i g a t i o n s s o i l s a m p l e s were t h o r - 2 0 m i n b e f o ro u g h l y m i x e d , an d t h i s c o m p o s i t e was s u b j e c t e d t o e n v i r o n m e n t .v a r i o u s p a r a m e t e r s o f t h e a r t i f i c i a l M a r t i a n e n v i r o n - r e s p o n s e o f nim e n t . t i a n e n v i r o n n cSimulated Martian environment. N a t i v e C a p e f o r assays o fC a n a v e r a l s o i l s a m p l e s ( 1 . 0 g o r 0 . 1 g ) were p l a c e d i n t o s e a l e d u n d e rs t e r i l e 1 0 - m l V i r t i s screw-cap l y o p h i l i z e r v i a l s ( V i r t i s v e n t e d a d a p t AC o . , G a r d i n e r , N . Y . ) . These were s u b j e c t e d t o t h e s i d e an e n v is i m u l a t e d M a r t i a n e n v i r o n m e n t ( T a b l e 2 ) a n d s e a l e d K a n s a s C i t y ,

A m e r i c a n 2 3 7 : 5 2 - 6 1 ( 1 9 7 7 ) ; a n d o t h e r V i k i n g

; i r e d a t m o s p h e r e . D i f f e r e n t e x p e r i m e n t a lp r e p a r e d t o i n v e s t i g a t e t h e e f f e c t s o f t h en e t e r s o f t h e s i m u l a t e d M a r t i a n e n v i r o n -pressure, i n c u b a t i o n t e m p e r a t u r e , m o i s -t s , a n d gas m i x t u r e . M o i s t u r e l e v e l s c o n -i s o i l o r d r i e d s o i l w i t h 0 . 0 1 , 0 . 1 , o r 1 . 0 mla d p er g o f s o i l . The n u t r i e n t l e v e l s c o n -d i e s w i t h d a r k s a n d vers u s l i g h t s a n dk i c humus versus l i t t l e o r g a n i c h u m u s ) ,M a r t i a n s o i l m i x t u r e ( T a b l e 2 ) , M a r t i a nw i t h 1% p e p t o n e ( w t / w t ) , a n d M a r t i a nv i t h 1% T r y p t i c a s e s o y b r o t h w h i c h c o n -a a s t e x t r a c t . I n i n v e s t i g a t i o n s w i t h t h em i x t u r e , 2 4 - h c u l t u r e s o f C a p e C a n a v e r a lv e r e i n o c u l a t e d i n t o t h e v i a l . The i s o l a t es e was a g r a m - p o s i t i v e , p s y c h r o t r o p h i c ,a n a e r o b i c s p o r e f o r m i n g r o d . I n a n o t h e rn e n t s , n a t i v e C a p e C a n a v e r a l s o i l s a m p l e sr k s a n d ) were h e a t s h o c k e d a t 8 0 C f o rr e b e i n g s u b j e c t e d t o t h e e x p e r i m e n t a lT h i s was d o n e t o d e t e r m i n e t h e g r o w t ha t i v e s p o r e f o r m e r s i n t h e s i m u l a t e d Mar-n e n t . Numerous r e p l i c a t e s were p r e p a r e df e a c h e x p e r i m e n t a l group. V i a l s weret h e d e s i r e d c o n d i t i o n s b y u s e o f V i r t i s -t e r s a t t a c h e d t o a m u l t i p o r t m a n i f o l d i n -i r o n m e n t a l c h a m b e r ( L a b c o n c o C o r p . ,, M o . ) . S c r e w caps were a p p l i e d t o t h e

V O L . 3 5 , 1 9 7 8


3/8

A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .s t o p p e r e d v i a l s , a n d t h e c a p s w e r e s e c u r e d w i t h p l a s t i cs e a l i n g b a n d s . A l l v i a l s m a i n t a i n e d vacuum c o n d i t i o n sf o r t h e 4 5 - d a y d u r a t i o n o f t h e e x p e r i m e n t s . A f t e rs e a l i n g , t h e v i a l s w e r e i m m e d i a t e l y p l a c e d i n t o t h ed e s i r e d i n c u b a t o r t o b e g i n t h e a l t e r n a t e f r e e z e - t h a wc y c l e s h o w n i n T a b l e 2 . A f t e r b e i n g p r e p a r e d , 1 0 w e r er e m o v e d i m m e d i a t e l y t o a s s a y t h e o r i g i n a l p o p u l a t i o n .C o n t r o l v i a l s w e r e p r e p a r e d i n i d e n t i c a l f a s h i o n b u tw e r e u l t i m a t e l y s e a l e d t o c o n s i s t o f a m b i e n t p r e s s u r ea n d / o r a m b i e n t a t m o s p h e r e , s o me b e i n g i n c u b a t e d a t2 4 C , o t h e r s i n t h e f r ee ze -t h aw c y c l e . A p p r o p r i a t es o i l s u s e d i n t h e s e e x p e r i m e n t s w e r e s t o r e d i n t h es i m u l a t e d M a r t i a n a t m o s p h e r e a t r o o m t e m p e r a t u r ef o r 2 4 h b e f o r e u s e . The a t m o s p h e r e w a s c o n t i n u o u s l yc i r c u l a t e d t h r o u g h d r y i n g t o w e r s t o a s s u r e t h a t d r i e ds a m p l e s r e m a i n e d d r y . A l m o s t a l l p h a s e s o f t h i s i n v e s -t i g a t i o n w e r e p e r f o r m e d a t l e a s t t w i c e , w i t h manyb e i n g p e r f o r m e d t h r e e t o f o u r t i m e s t o v e r i f y r e p e a t -a b i l i t y .

P o p u l a t i o n a s s a y s . Ten s a m p l e s w e r e a s s a y e di m m e d i a t e l y f o r d e t e r m i n a t i o n o f o r i g i n a l p o p u l a t i o n ,f o l l o w e d b y a s s a y s o f t r i p l i c a t e v i a l s o n d a y s 1 , 2 , a n d4 a n d a p p r o x i m a t e l y e v e r y 3 d a y s f o r t h e d u r a t i o n o ft h e e x p e r i m e n t . S a m p l e s w e r e a s s a y e d 4 h a f t e r r e -m o v a l f r o m t h e - 6 5 C i n c u b a t o r . E a c h c o u n t c o n -s i s t e d o f a n a v e r a g e o f s i x p l a t e s ( t r i p l i c a t e v i a l s p l a t e di n d u p l i c a t e ) . S a m p l e s w e r e d i l u t e d i n 1 % p e p t o n e ,w i t h t h e o r i g i n a l d i l u t i o n b l a n k b e i n g s u b j e c t e d t os o n i c d i s r u p t i o n f o r 2 t o 4 m i n ( B r a n s o n i c m o d e l 3 2U l t r a s o n i c B a t h ) t o d i s r u p t c l u m p s . S u b s e q u e n t d i l u -t i o n s w e r e t h r o u g h l y m i x e d o n a V o r t e x m i x e r . S a m -p l e s w e r e p l a t e d b y t h e p o u r - p l a t e m e t h o d u s i n g T r y p -TABLE 2 . C o m p o s i t i o n o f t h e s i m u l a t e d M a r t i a ne n v i r o n m e n tC o m p o n e n t Am t

A t m o s p h e r e a V a r i a b l e : 8 0 % C 0 2 , 2 0 % A r o r 9 9 %C 0 2 , 1% 0 2 o r 9 9 . 9 % C 0 2 , 0 . 1 %0 2P r e s s u r e 7 m i l l i b a r s ( 5 . 3 mm o f H g )T e m p e r a t u r e 2 4 C d a y , - 6 5 o C b n i g h tT i m e 8 - h d a y , 1 6 - h n i g h tD u r a t i o nS o i l

M o i s t u r e

N u t r i e n t s

4 5 d a y sN a t i v e C a p e C a n a v e r a l s o i l o r s o i lm i x t u r e o f 4 0 : 4 0 : 1 0 : 5 : 5 , f e l s i t e -l i m o n i t e - g a r d e n s o i l - p e a t - v o l -c a n i c r o c kV a r i a b l e , r a n g i n g f r o m d r i e d s o i lt o e x c e s s m o i s t u r e ( 1 . 0 m l o fw a t e r p e r g o f s o i l )V a r i a b l e , f r o m n o a d d e d n u t r i e n t st o d e h y d r a t e d T r y p t i c a se s o y

b r o t h

t i c a s e s o y a g ar ( B B L ) . P r e l i m i n a r y i n v e s t i g a t i o n s o fp l a t i n g m e t h o d s s h o w e d n o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e a tt h e 0 . 0 5 p r o b a b i l i t y l e v e l b e t w e e n t h e s p r e a d - p l a t ea n d p o u r - p l a t e p r o c e d u r e s ( T . L . F o s t e r a n d L . W i n -a n s , J r . , 1 9 7 4 , S e m i a n n u a l P r o g r e s s R e p o r t n o . 4 ,NASA C R 1 3 9 3 9 0 ) . P l a t e s w e r e i n c u b a t e d a t 7 C f o r1 4 d a y s t o d e t e r m i n e t h e r e s p o n s e o f p s y c h r o t o l e r a n tp o p u l a t i o n s a n d / o r a t 3 2 C f o r 4 8 t o 7 2 h t o d e t e r m i n et h e r e s p o n s e o f t h e m e s o p h i l i c b a c t e r i a l p o p u l a t i o n .A l l p r o c e d u r e s i n p r e p a r i n g a n d a s s a y i n g s a m p l e s w e r ep e r f o r m e d i n l a m i n a r f l o w c a b i n e t s .

R E S U L T SP r e s s u r e . The e f f e c t o f r e d u c e d p r e s s u r e o ng r o w t h o f o r g a n i s m s i n m i x e d C a p e C a n a v e r a ls o i l s i s shown i n F i g . 1 . T h e s e s a m p l e s c o n t a i n e dm o i s t u r e a n d a d d e d n u t r i e n t s t o i n s u r e t h a tp r e s s u r e w a s t h e l i m i t i n g g r o w t h f a c t o r . The

2 4 C i n c u b a t i o n w a s t o s e r v e a s a c o n t r o l f o rv i a b i l i t y o f o r g a n i s m s i n t h e s a m p l e ; t h e g r a p hs h o w s a s l o w e r a n d s m a l l e r p o p u l a t i o n i n c r e a s ei n t h e s a m p l e s u n d e r r e d u c e d p r e s s u r e u n t i l d a y1 4 , a f t e r w h i c h t h e r e w a s n o s i g n i f i c a n t d i f f e r -e n c e . The s a m p l e s i n c u b a t e d i n t h e M a r t i a nf r e e z e - t h a w c y c l e e x h i b i t e d i n c r e a s e s i n p o p u l a -t i o n , w i t h t h e s a m p l e s u n d e r r e d u c e d p r e s s u r ea g a i n s h o w i n g a s l o w e r a n d s m a l l e r i n c r e a s e . Ap o i n t - b y - p o i n t t t e s t c o m p a r i s o n o f t h e f r e e z e -t h a w e x p e r i m e n t a l s a m p l e s s h o w s a s i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ( 0 . 0 5 p r o b a b i l i t y l e v e l ) b e g i n n i n g o nd a y 4 , w i t h t h e r e d u c e d p r e s s u r e r e s u l t i n g i ns i g n i f i c a n t l y l o w e r p o p u l a t i o n s . B e c a u s e o f t h e s er e s u l t s , a l l f u t u r e e x p e r i m e n t s i n c l u d e d a p r e s -s u r e o f 7 m i l l i b a r s a s o n e o f t h e p a r a m e t e r s o ft h e s i m u l a t e d M a r t i a n e n v i r o n m e n t .A t m o s p h e r e . A c o m p a r i s o n o f a m b i e n t a t -m o s p h e r e a n d s i m u l a t e d M a r t i a n a t m o s p h e r e o f9 9 . 9 % C O 2 p l u s 0 . 1 % 0 2 i s s h o w n i n F i g . 2 . T h e s es a m p l e s c o n t a i n e d e x c e s s n u t r i e n t s a n d m o i s t u r et o i n s u r e t h a t t h e a t m o s p h e r e was t h e l i m i t i n gg r o w t h f a c t o r . P o p u l a t i o n s u n d e r b o t h a t m o s -p h e r e s g r e w v e r y w e l l , s h o w i n g s i m i l a r r a t e s o fi n c r e a s e f o r t h e f i r s t 1 1 d a y s . A f t e r t h i s t i m e , t h es a m p l e s i n t h e a m b i e n t a t m o s p h e r e s h o w e d b e t -t e r g r o w t h u n t i l d a y 4 2 , a t w h i c h t i m e t h e p o p -u l a t i o n s i n t h e s i m u l a t e d a t m o s p h e r e a p p e a r e dt o r e c o v e r a n d a g a i n s t a r t i n c r e a s i n g . B o t h e x -p e r i m e n t a l g r o u p s s h o w e d a p p r o x i m a t e l y a 3 - l o gi n c r e a s e i n p o p u l a t i o n d u r i n g t h e 4 5 d a y s o f t h ee x p e r i m e n t . C o n t r o l g r o u p s i n c u b a t e d a t a c o n -s t a n t 2 4 C ( F i g . 2 ) s h o w e d a f a s t e r i n i t i a l i n -c r e a s e , a s l i g h t l y h i g h e r p o p u l a t i o n ( a p p r o x i -m a t e l y 0 . 5 l o g ) , a n d a f a s t e r r a t e o f d e c l i n e .A c o m p a r i s o n o f a m b i e n t a n d s i m u l a t e d M a r -t i a n a t m o s p h e r e s u s i n g d r y s o i l s w a s a l s o p e r -f o r m e d . The r e s u l t s s h o w e d s t a t i c p o p u l a t i o n sf o r t h e , 4 5 - d a y d u r a t i o n o f t h e e x p e r i m e n t , a n da t t e s t c o m p a r i s o n o f t h e f i n a l p o p u l a t i o n s a n dt h e i n i t i a l p o p u l a t i o n s s h o w e d n o s i g n i f i c a n t d i f -f e r e n c e ( 0 . 0 5 p r o b a b i l i t y l e v e l ) .

a O b t a i n e d a s a n a l y z e d m i x t u r e s i n s i n g l e c y l i n d e r sf r o m C a r r o l l C h e m i ca l a n d C r y o g e n i c s , A b i l e n e , T e x .' R e v c o UL T 1 1 7 5 , W e s t C o l u m b i a , S . C .

7 3 2 F O S T E R E T A L .


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GROWTH I N A S I MU LATED MAR T IAN EN V I R ON M ENTC O R S T A N T 2 4 ' C

0--oE D U C E D PRESSURE* .-- 0 ANRIERT P R E S S U R I E

F R E E ZE-TNAW

0-.o R E D U C E R P R E S S U R E

* . S A N R E R T C PRESSURE

SI 1 4 ; I R 11 14 U oRAYS IRCURATIOR

FIG. 1. Effect ofreducedpressure (7 m i l l i b a r s ) ongrowth of soil microorganisms incubated at240Cand inaf r - e e z e - t h a w c y c l e (-650C fo r 16 h; 240Cfo r 8 h) inasimulatedMartian environment c o n s i s t i n g of99.9% CO2plus 0.1% 02 with supplemental moisture and nutrients.

PIRIEZE-THAW CONSTANT24 C

0~~~~~~~~

~ ~ ~~~~~~~03..04-.0brinamshr09.%C2puand~

Because of q u e s t i o n s concerning the proposedMartian atmnosphere, numerousearlier experi-ments wereperformed u s i n g two other experi-mental atmospheres, onec o n s i s t i n g of 80% 002p l u s 20% argon, the other c o n s i s t i n g of 99% 002plUS 1% 02 . The population changes observed inthose earlier experiments followed identicaltrends to those shown in this i n ve s t i ga t i o n .These results demonstrate that the growth re-sponse i s v i r t u a l l y thesamein the three gaseousatmospheres used in these i n ve s t i ga t i o n s .Incubation temperature. The effect of in-

cubation temperatures of the samples i s also

shown in Fig. 2 . The population changes shownonthe left arearesult of incubation of thesamples under the simulated Martian freeze-thaw c y c l e of 8 h at 2400 followed by 16 h at- 6 5 0 C . Thecurveonthe r i g h t shows identicalconditions except with incubation at constant2400. As should be expected, the i n i t i a l popula-tion increases occurredmorer a p i d l y in thesam-p l e s incubated at 2400; however, thepopulationsincreased by approximnately the sameamount.The s i g n ifi c a n t observations arethat the sam-p l e s under the ambient atmosphere maintainedtheir high populations l o n g e r in the freeze-thaw

V O L . 3 5 , 1 9 7 8 7 3 3

- U.

a 7 'a

4 . ~

1 0 -


5/8

A P P L . E N V I R O N . M I C R O B IO L .i n c u b a t i o n , a n d t h e s a m p l e s u n d e r t h e s i m u l a t e dM a r t i a n a t m o s p h e r e a p p e a r e d t o r e c o v e r i n t h ef i n a l d a y s i n t h e f r ee z e- t h a w i n c u b a t i o n . T h i si n d i c a t e s t h a t i n cu b at i o n o f s a m p l e s a t c o n s t a n t2 4 C r e s u l t s i n a f a s t e r r a t e o f d e c l i n e o n c emaximum p o p u l a t i o n s h a v e b e e n a c h i e v e d . Ther e s u l t s s h o w n i n F i g . 1 a l s o t e n d t o v e r i f y t h ep o p u l a t i o n c h a n g e s s h o w n i n F i g . 2 , i . e . , p o p u -l a t i o n i n c r e a s e i s m o r e r a p i d a t 2 4 C , a p p r o x i -m a t e l y t h e s a m e p o p u l a t i o n i s a c h i e v e d , a n d t h er a t e o f d e c l i n e i s m o r e r a p i d a t 2 4 C .M o i s t u r e an d n u t r i e n t s . D e t a i l e d i n v e s t i -g a t i o n s c o n c e r n i n g t h e e f f e c t o f m o i s t u r e o nr e s p o n s e o f b a c t e r i a l p o p u l a t i o n s t o t h e s i m u -l a t e d M a r t i a n e n v i r o n m en t h a v e n o t b e e n c o m -p l e t e d s u f f i c i e n t l y t o e s t i m a t e t h e m i n i m u ma m o u n t o f w a t e r r e q u i r e d f o r g r o w t h . H o w e v e r ,a l l e x p e r i m e n t s p e r f o r m e d t h u s f a r i n c l u d e d as e t o f s o i l s a m p l e s t h a t h a d b e e n d r i e d a n ds t o r e d u n d e r a d r y a t m o s p h e r e a n d a s e t c o n -t a i n i n g a d d e d m o i s t u r e ( 0 . 1 m l / g o f s o i l ) . Ane x a m p l e o f s u c h a c o m p a r i s o n i s s h o w n i n F i g .3 . I t c a n b e s e e n t h a t t h e d r y s a m p l e s s h o w e d n oc h a n g e i n p o p u l a t i o n s , w h e r e a s t h e s a m p l e s w i t he x c e s s m o i s t u r e s h o w e d a 1 - l o g i n c r e a s e w h i c hw a s m a i n t a i n e d f o r t h e d u r a t i o n o f t h e e x p e r i -m e n t . The p o p u l a t i o n i n c r e a s e w i t h a d d e d m o i s -t u r e i n F i g . 3 w a s n o t a s g r e a t a s t h a t s h o w n i nF i g . 2 , b u t t h e s a m p l e s i n F i g . 2 a l s o c o n t a i n e da d d e d n u t r i e n t s . T h i s c o m p a r i s o n , t h e n , s h o w st h a t a v a i l a b l e n u t r i e n t s w i l l h a v e a d e f i n i t e e f f e c to n g r o w t h o f o r g a n i s m s i n t h e s i m u l a t e d M a r t i a ne n v i r o n m e n t .I n o t h e r e x p e r i m e n t s , p u r e c u l t u r e s o f C a p eC a n a v e r a l s o i l i s o l a t e s w e r e i n o c u l a t e d i n t o a r -t i f i c i a l M a r t i a n s o i l ( T a b l e 2 ) w i t h v a r y i n g

0> 72

St

00S .

a m o u n t s o f m o i s t u r e a n d n u t r i e n t s . G r o w t h i nn a t i v e C a p e C a n a v e r a l l i g h t s a n d ( l i t t l e o r g a n i ch u m u s ) w a s a l s o c o m p a r e d w i t h t h a t i n d a r ks a n d . B e c a u s e o f t h e l a r g e n u m b e r o f g r o w t hc u r v e s g e n e r a t e d i n t h i s b r o a d s t u d y , t h e r e s u l t sa r e t a b u l a t e d a n d p r e s e n t e d i n T a b l e 3 . E a c hn u m b e r i s a n a v e r a g e o f s i x p l a t e c o u n t s , a n d a l le x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d a t l e a s t t w i c e t ov e r i f y r e s u l t s . A s c a n b e s e e n , p o p u l a t i o n i n -c r e a s e s w e r e g r e a t e r i n t h e d a r k s a n d , w h i c hc o n t a i n e d more n u t r i e n t s . I n t h e p r e s e n c e o f t h ea r t i f i c i a l M a r t i a n s o i l , p o p u l a t i o n i n c r e a s e s w e r ei n s i g n i f i c a n t u n t i l n u t r i e n t s w e r e a d d e d , a n d i n -c r e a s e s w e r e g r e a t e r w i t h a r i c h e r s u p p l y o fa d d e d n u t r i e n t s .None o f t h e e x p e r i m e n t s d e m o n s t r a t e dg r o w t h when t h e s o i l s a m p l e s w e r e d r i e d . On t h eo t h e r h a n d , n o n e s h o w e d a d e c l i n e i n t h e p o p u -l a t i o n s o f t h e d r y s a m p l e s , i n d i c a t i n g t h a t t h es i m u l a t e d M a r t i a n a t m o s p h e r e i s n o t t o x i c t oo r g a n i s m s i n t h e s a m p l e s . T h e r e was l i t t l eg r o w t h w h e n 0 . 0 1 m l o f w a t e r p e r g w a s a d d e d ,m o r e o f a n i n c r e a s e w i t h 0 . 1 m l o f w a t e r . O ft h e s e c o m b i n e d r e s u l t s , t h e g r e a t e s t p o p u l a t i o ni n c r e a s e s o c c u r r e d w i t h t h e r i c h e s t n u t r i t i o n a ls u p p l y a n d g r e a t e s t amount o f w a t e r . I t a l s oa p p e a r e d t h a t l e s s w a t e r was r e q u i r e d w h e n an a t i v e s o i l s a m p l e was u s e d t h a n when t h e a r t i -f i c i a l M a r t i a n s o i l w a s u s e d . F o r t h i s r e a s o n ,m o s t e x p e r i m e n t s w i t h n a t i v e s o i l w h e r e m o i s -t u r e w a s n o t t o b e a l i m i t i n g f a c t o r h a d 0 . 1 m l o fw a t e r a d d e d p e r g o f s o i l .S i m i l a r r e s u l t s w e r e d e m o n s t r a t e d f o r a g r a m -p o s i t i v e , n o n - s p o r e f o r m i n g i s o l a t e f r o m C a p eC a n a v e r a l s o i l ( d a t a n o t s h o w n ) . The m a j o rd i f f e r e n c e w a s t h a t t h i s i s o l a t e d e m o n s t r a t e d a

-~~~. . . . . . . . . .0 S 10 15 20 25 30 35 40 45DAYS INCUBATION

F I G . 3 . E f f e c t o f s o i l m o i s t u r e on g r o w t h o f m i c r o o r g a n i s m s i n c u b a t e d i n a f r e e z e - t h a w c y c l e ( - 6 5 C f o r 1 6h ; 2 4 C f o r 8 h ) i n a s i m u l a t e d Martian e n v i r o n m e n t ( 9 9 . 9 % CO2 p l u s 0 . 1 % 0 2 a t 7 m i l l i b a r s pressure). Excessm o i s t u r e i n d i c a t e s 0 . 1 m l o f water added perg o f s o i l .

0 - ---* 0i o---0-

0 ov~ ~ ~0 00 0a0 0ooDR Y S O I L*---------XCESS M O I S T U R E

9 ,

7 3 4 F O S T E R E T A L .

- ,

I


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GROWTH I N A S I MU LATED MARTIAN ENVI R ONMENT 7 3 5TABLE 3 . R e s p o n s e o f b a c t e r i a l p o p u l a t i o n s i n e x p e r i m e n t a l s o i l s g r o w n i n a s i m u l a t e dM a r t i a n e n v i r o n m e n t a

M o i s t u r e Days t oS o i l ( ml o f w a - A d d i t i o n a l n u t r i - O r i g i n a l c o u n t h b Max i m u m T o t a l l o g m a x i -t e r p e r g o f e n t s ( w t / w t ) c o u n t i n c r e a s e mum

s o i l ) c o u n tC a p e C a n a v e r a l , l i g h t s a n d D r i e d 3 . 1 x 1 0 4 3 . 1 x 1 0 4 2 1C a p e C a n a v e r a l , l i g h t s a n d 0 . 1 3 . 1 x 1 0 4 2 . 3 x 1 0 5 0 . 8 7 2 1C a p e C a n a v e r a l , d a r k s a n d D r i e d 5 . 8 x 1 0 4 5 . 9 X 1 0 4 0 . 0 1 2 1C a p e C a n a v e r a l , d a r k s a n d 0 . 1 5 . 8 x 1 0 4 3 . 0 x 1 0 7 2 . 7 1 4A r t i f i c i a l M a r t i a n s o i l D r i e d 3 . 0 x 1 0 4 3 . 0 x 1 i 0 2 1A r t i f i c i a l M a r t i a n s o i l 0 . 0 1 3 . 0 x 1 0 4 5 . 5 X 1 0 4 0 . 2 6 7A r t i f i c i a l M a r t i a n s o i l 0 . 1 3 . 0 x 1 0 4 9 . 0 x 1 i 0 0 . 4 8 4A r t i f i c i a l M a r t i a n s o i l 1 . 0 3 . 0 x l 0 4 3 . 3 X 1 0 4 0 . 0 4 1 4A r t i f i c i a l M a r t i a n s o i l D r i e d 1 % p e p t o n e 3 . 0 x 1 0 4 3 . 1 x 1 0 4 1 4A r t i f i c i a l M a r t i a n s o i l 0 . 0 1 1 % p e p t o n e 3 . 0 x 1 0 W 9 . 0 x 1 0 4 0 . 4 8 2 1A r t i f i c i a l M a r t i a n s o i l 0 . 1 1 % p e p t o n e 3 . 0 x 1 0 4 2 . 0 x 1 0 5 0 . 8 2 4A r t i f i c i a l M a r t i a n s o i l 1 . 0 1 % p e p t o n e 3 . 0 X 1 0 4 1 . 4 x 1 0 6 1 . 6 7 1 4A r t i f i c i a l M a r t i a n s o i l D r i e d 1 % TSBc 3 . 0 x 1 0 4 2 . 9 x 1 0 4 2 1A r t i f i c i a l M a r t i a n s o i l 0 . 0 1 1 % TS B 3 . 0 X 1 0 4 9 . 3 x 1 0 5 1 . 4 9 4A r t i f i c i a l M a r t i a n s o i l 0 . 1 1 % T S B 3 . 0 x 1 0 4 7 . 3 X 1 0 6 1 . 3 9 2A r t i f i c i a l M a r t i a n s o i l 1 . 0 1 % T S B 3 . 0 x 1 0 4 1 . 7 x 1 0 8 3 . 7 5 2 1H e a t - s h o c k e d l i g h t s a n d D r i e d 6 . 6 x 1 0 3 6 . 6 x 1 0 3 2 1H e a t - s h o c k e d l i g h t s a n d 0 . 1 6 . 6 x 1 0 3 3 . 1 x 1 0 6 2 . 6 8 7H e a t - s h o c k e d d a r k s a n d D r i e d 2 . 7 x 1 0 4 2 . 8 x 1 0 4 2 1H e a t - s h o c k e d d a r k s a n d 0 . 1 2 . 7 x 1 0 4 1 . 4 x i 0 W 3 . 7 1 7

a N a t i v e C a p e C a n a v e r a l s o i l , w i t h d a r k s a n d a n d w i t h l i t t l e ( l i g h t s a n d ) n a t i v e o r g a n i c h u m u s , a n d a r t i f i c i a lM a r t i a n s o i l ( 4 0 : 4 0 : 1 0 : 5 : 5 , f e l s i t e - l i m o n i t e - g a r d e n s o i l - p e a t - v o l c a n i c r o c k ) , g r o w n w i t h v a r i o u s m o i s t u r e a n dn u t r i e n t l e v e l s i n a s i m u l a t e d M a r t i a n e n v i r o n m e n t ( 9 9 . 9 % C O 2 p l u s 0 . 1 % 0 2 a t 7 m i l l i b a r s a t - 6 5 C f o r 1 6 h a n d2 4 C f o r 8 h ) .b C o l o n y - f o r m i n g u n i t s p e r g r a m o f s a m p l e ; e a c h c o u n t i s a n a v e r a g e o f s i x p l a t e s .c T r y p t i c a s e s o y b r o t h s u p p l e m e n t e d w i t h 3% y e a s t e x t r a c t .

d e c r e a s e i n p o p u l a t i o n i n t h e d r y s a m p l e s , b u tr e q u i r e d l e s s n u t r i e n t s t o g r o w w e l l ( g r e a t e r t h a n3 l o g i n c r e a s e s ) when m o i s t u r e w a s p r e s e n t a tmaximum c o n c e n t r a t i o n .T a b l e 3 a l s o s h o w s t h e r e s u l t s o b t a i n e d whent h e l i g h t a n d d a r k C a p e C a n a v e r a l s o i l s a m p l e sw e r e h e a t s h o c k e d b e f o r e u s e t o e l i m i n a t e t h en o n - s p o r e f o r m i n g p o p u l a t i o n s . B y c o m p a r i n gt h e i n c r e a s e s i n p o p u l a t i o n s o f t h e s e s a m p l e sa n d o f t h e n o n - h e a t - s h o c k e d s a m p l e s , i t c a n b es e e n t h a t t h e s p o r e f o r m i n g p o p u l a t i o n a p p e a r st o r e s p o n d m o re f a v o r a b l y t o t h e s i m u l a t e d e n -v i r o n m e n t t h a n d o e s t h e t o t a l p o p u l a t i o n . A g a i n ,t h e p o p u l a t i o n s d i d n o t c h a n g e o v e r 2 1 d a y s i nt h e d r i e d s a m p l e s , b u t s h o w e d - s i g n i f i c a n t i n -c r e a s e s w i t h i n 7 d a y s w i t h a d d e d m o i s t u r e .A s s a y i n c u b a t i o n t e m p e r a t u r e . I n a s s a y -i n g f o r p o p u l a t i o n c h a n g e s i n t h e s e e x p e r i m e n t s ,p l a t e s w e r e i n c u b a t e d a t b o t h 7 a n d 2 4 C . Thec h a n g e s i n p o p u l a t i o n s s h o w e d t h e same t r e n d su n d e r b o t h i n c u b a t i o n c o n d i t i o n s , e x c e p t t h a tt h e p s y c h r o t o l e r a n t p o p u l a t i o n s i n c r e a s e ds l i g h t l y f a s t e r , b y c o m p a r i s o n , t h a n t h e m e s o -p h i l i c p o p u l a t i o n s . C o n t r o l s u s e d t h r o u g h o u tt h e s e i n v e s t i g a t i o n s i n c l u d e d s a m p l e s p e r f o r m e da s d e s c r i b e d f o r t h e e x p e r i m e n t a l s e t s , b u t i n -c u b a t e d u n d e r a m b i e n t p r e s s u r e , t e m p e r a t u r e ,

a n d / o r a t m o s p h e r e . T h e s e w e r e p e r f o r m e d a sv i a b i l i t y c o n t r o l s , a n d i n n o c a s e d i d p o p u l a t i o nd e c r e a s e s o c c u r .DISCUSSION

I t i s r e c o g n i z e d t h a t s i m u l a t e d e n v i r o n m e n t a ls t u d i e s c a n n o t d u p l i c a t e a l l p h y s i c a l , c h e m i c a l ,a n d a t m o s p h e r i c p a r a m e t e r s t h a t c o n s t i t u t e ag i v en p l a ne t ar y e n v i r o n m e n t . E v e n t h o u g h t h ep a r a m e t e r s u s e d i n t h i s i n v e s t i g a t i o n w e r e b a s e du p o n t h e m o s t c u r r e n t a v a i l a b l e d a t a , a p p r o x i -m a t e t h e e n v i r o n m e n t a l c o n d i t i o n s o f Marsm o r e c l o s e l y t h a n e a r l i e r i n v e s t i g a t i o n s , a n d a r es i m i l a r t o a c t u a l r e s u l t s o b t a i n e d f r o m t h e V i -k i n g p r o g r a m , i t i s u n d e r s t o o d t h a t t h e r e a r el i m i t s t o s u c h a s t u d y . N e v e r t h e l e s s , s u c h a ni n v e s t i g a t i o n c a n p r o v i d e r e s u l t s b a s e d u p o n s c i -e n t i f i c e v i d e n c e a b o u t c e r t a i n f a c t o r s w h i c h m ayi n f l u e n c e o r l i m i t g r o w t h i n a g i v e n e n v i r o n m e n t .As i n d i c a t e d e a r l i e r , t h e s e e x p e r i m e n t s w e r e p e r -f o r m e d a m i n i m u m o f t w o t i m e s , m o s t o f thema t l e a s t f o u r t o f i v e t i m e s , w i t h t h e r e s u l t s b e i n gr e p e a t e d i n e a c h i n s t a n c e . I t i s f e l t t h a t t h er e s u l t s i n d i c a t e d e f i n i t e t r en d s o f b a c t e r i a l p o p -u l a t i o n r e s p o n s e t o v a r i o u s p a r a m e t e r s o f t h es i m u l a t e d M a r t i a n e n v i r o n m e n t .

V O L . 3 5 , 1 9 7 8


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A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .A l t h o u g h t h e c o n d i t i o n s o f t h i s s i m u l a t e dM a r t i a n e n v i r o n m e n t w e r e d i f f e r e n t f r o m t h o s eo f e a r l i e r i n v e s t i g a t o r s , s o m e o f t h e r e s u l t s p r e -s e n t e d h e r e a r e c o n s i s t e n t w i t h r e s u l t s p r e s e n t e db y s e v e r a l e a r l i e r i n v e s t i g a t o r s . F o r e x a m p l e ,Y o u n g e t a l . ( 1 6 - 1 8 ) d e m o n s t r a t e d t h a t o r g a -n i s m s g r o w w e l l i n t h e M a r t i a n f r e e z e - t h a w c y -c l e , a n d t h i s w a s s h o w n i n o u r r e s u l t s .A l t h o u g h t h e V i k i n g s p a c e c r a f t s h o w a c o l d e rt e m p e r a t u r e t h a n t h o s e u s e d i n t h i s i n v e s t i g a -t i o n , t h e l a n d i n g s i t e s f o r t h e V i k i n g l a n d e r sw e r e s e l e c t e d o n t h e b a s i s o f f a c t o r s o t h e r t h a nt e m p e r a t u r e . The f r e e z e - t h a w c y c l e o f t h i s s t u d yr e p r e s e n t s a n o p t i m u m t e m p e r a t u r e o f M a r sw i t h r e f e r e n c e t o t e r r e s t r i a l o r g a n i s m s . B e c a u s el o w t e m p e r a t u r e a n d t h e f r e e z e - t h a w c y c l e w e r en o t l e t h a l t o t h e b a c t e r i a l p o p u l a t i o n s , i t i s f e a -

s i b l e t o a s s u m e t h a t t e r r e s t r i a l c o n t a m i n a n t sc o u l d b e i n t r o d u c e d o n t o t h e M a r t i a n s u r f a c e i na l e s s t h a n f a v o r a b l e t e m p e r a t u r e e n v i r o n m e n t ,s u r v i v e , a n d l a t e r b e b l o w n b y s t r o n g M a r t i a nw i n d s t o a m o r e o p t i m a l t e m p e r a t u r e e n v i r o n -m e n t . To make f u r t h e r e x t r a p o l a t i o n s o f t h i st y p e , a t l e a s t t w o o t h e r q u e s t i o n s w o u l d h a v e t ob e a n s w e r e d . F i r s t , how l o n g c o u l d t e r r e s t r i a lc o n t a m i n a n t s ( e s p e c i a l l y s p o r e f o r m e r s ) s u r v i v et h e e x t r e m e c o l d o f a n o n o p t i m u m s i t e ? S e c -o n d l y , w h a t i s t h e m i n i m u m h i g h t e m p e r a t u r eo f t h e f r e e ze - t h aw c y c l e r e q u i r e d f o r g r o w t h t oo c c u r , a n d f o r w h a t p e r i o d o f t i m e m u s t t h i st e m p e r a t u r e b e m a i n t a i n e d t o a c t u a l l y r e s u l t i ni n c r e a s e s i n t h e b a c t e r i a l p o p u l a t i o n ? A l t h o u g ht h e s e q u e s t i o n s a r e n o t a n s w e r e d b y t h e p r e s e n ti n v e s t i g a t i o n , i t i s a p p a r e n t t h a t a c o n t i n u e de x t r e m e l y l o w t e m p e r a t u r e w i l l r e t a r d g r o w t h ,a n d t h a t a f a v o r a b l e t e m p e r a t u r e must b er e a c h e d b e f o r e g r o w t h c a n o c c u r .T h i s i n v e s t i g a t i o n a l s o a g r e e s w i t h t h e w o r ko f t h o s e who f o u n d g r o w t h i n a s i m u l a t e d M a r -t i a n e n v i r o n m e n t ( 2 , 8 - 1 0 , 1 6 ) , t h o s e who s t a t et h a t m o i s t u r e a n d n u t r i e n t s a r e t h e m o s t l i k e l yl i m i t i n g f a c t o r s o f g r o w t h ( 2 , 8 - 1 0 ) , a n d t h o s ewho s t a t e t h a t a d r y M a r t i a n e n v i r o n m e n t w i l lr e s u l t i n s u r v i v a l o f t e r r e s t r i a l m i c r o o r g a n i s m s( 2 , 6 , 7 , 1 2 , 1 4 ) . The d i v e r s i t y o f s i m u l a t e d M a r -t i a n e n v i r o n m e n t s u s e d i n t h e s e t y p e s o f e x p e r -i m e n t p l a c e s e m p h a s i s o n t h e t r e m e n d o u s a d a p -t i b i l i t y o f m i c r o o r g a n i s m s .P r o b a b l y t h e m o s t o f t e n m e n t i o n e d f a c t o r r e -s p o n s i b l e f o r r e s t r i c t i n g g r o w t h o f t e r r e s t r i a l o r -g a n i s m s i n t h e M a r t i a n e v n i r o n m e n t i s t h e a v a i l -a b i l i t y o f l i q u i d w a t e r . H o w e v e r , t h e r e s u l t s o ft h e V i k i n g p r o g r a m c i t e t h e p r e s e n c e o f m o r ew a t e r o n Mars t h a n p r e d i c t e d ( V i k i n g 1 , E a r l yr e s u l t s , 1 9 7 6 , NASA S P - 4 0 8 , N a t i o n a l A e r o n a u -t i c s a n d S p a c e A d m i n i s t r a t i o n ) , a n d a m o d e l i sp r o p o s e d w h e r e l i q u i d w a t e r may b e a v a i l a b l e a tp r e s s u r e s b e l o w 6 m i l l i b a r s when t h e t e m p e r a -t u r e r e a c h e s 0 0 C . The r e s u l t s o f t h i s i n v e s t i g a -

t i o n d e m o n s t r a t e t h a t g r o w t h c a n o c c u r i n w a t e rl e v e l s a s l o w a s 1 % ( w t / w t ) i f n u t r i e n t s a r ea v a i l a b l e . A l t h o u g h t h i s i s a m u ch h i g h e r w a t e rl e v e l t h a n m e a s u r e d o n M a r s , i t i s e m p h a s i z e dt h a t t h e p r o p o s e d l i q u i d w a t e r m o d e l w o u l dmake w a t e r a v a i l a b l e i n m i c r o e n v i r o n m e n t s , a n dt h e w a t e r c o n c e n t r a t i o n c o u l d r e a c h a l e v e l a p -p r o x i m a t i n g t h i s .The f a c t o r t h a t i s p o s s i b l y t h e m o s t i m p o r t a n tf o r r e s t r i c t i n g g r o w t h o f t e r r e s t r i a l o r g a n i s m s i nt h e M a r t i a n e n v i r o n m e n t i s a v a i l a b l e n u t r i e n t s .A l t h o u g h r e s u l t s a r e n o t c o m p l e t e , t h e V i k i n gl a n d e r s h a v e n o t y e t d e t e c t e d o r g a n i c c o m -p o u n d s i n t h e M a r t i a n s o i l . B e c a u s e t h e m o s tl i k e l y c o n t a m i n a n t s o n s u c h a s p a c e c r a f t w o u l db e h e t e r o t r o p h i c s p o r e f o r m i n g o r g a n i s m s , t h e yw o u l d r eq u i r e o r g a ni c n u t r i e n t s o u r c e s . A l s o ,e l e m e n t s r e q u i r e d i n t r a c e a m o u n t s f o r g r o w t ho f o t h e r t y p e s o f m i c r o o g a n i s m s may n o t b ef o u n d ; i f s o , t h i s w o u l d p r e c l u d e g r o w t h o f t e r -r e s t r i a l o r g a n i s m s .S e v e r a l s i g n i f i c a n t c o n c l u s i o n s c a n b e d r a w nf r o m t h i s i n v e s t i g a t i o n . The r e d u c e d p r e s s u r e o ft h e M a r t i a n e n v i r o n m e n t d o e s h a v e a n e f f e c t o ng r o w t h o f m i c r o o r g a n i s m s . The p o p u l a t i o nc h a n g e s w e r e a p p r o x i m a t e l y t h e s a m e i n a l lt h r e e o f t h e e x p e r i m e n t a l M a r t i a n a t m o s p h e r e s ,a n d g r o w t h o c c u r r e d i n a l l t h r e e when m o i s t u r ew a s a d d e d . I n d r y s a m p l e s , t h e p o p u l a t i o n s w e r eu n c h a n g e d f o r t h e d u r a t i o n o f t h e e x p e r i m e n t s ,d e m o n s t r a t i n g t h a t t h e s i m u l a t e d M a r t i a n e n -v i r o n m e n t w a s n o t t o x i c t o t h e o r g a n i s m s . T h i si n d i c a t e s t h a t t h e l a c k o f m o i s t u r e s h o u l d n o tp r e v e n t p r o l o n g e d s u r v i v a l o f t e r r e s t r i a l o r g a -n i s m s . The f r e e z e - t h a w c y c l e o f t h i s i n v e s t i g a -t i o n a l l o w e d g r o w t h o f m i c r o o r g a n i s m s a n d u s u -a l l y r e s u l t e d i n a s l o w e r r a t e o f d e c l i n e t h a ni n c u b a t i o n a t 2 4 C . O r g a n i s m s c a p a b l e o f g r o w t ha t l o w t e m p e r a t u r e s a p p e a r e d t o r e s p o n ds l i g h t l y m o r e f a v o r a b l y t o t h e s i m u l a t e d M a r t i a ne nv i r o n me nt . T h i s i s o f s i g n i f i c a n c e b e c a u s e o ft h e r e c e n t d a t a d e m o n s t r a t i n g t h e p r e s e n c e o fp s y c h r o t r o p h i c o r g a n i s m s i n C a p e C a n a v e r a ls o i l s ( 1 ) . P o p u l a t i o n s i n h e a t - s h o c k e d s o i l s a m -p l e s a p p e a r e d t o r e s p o n d m o r e f a v o r a b l y i n t h ee x p e r i m e n t a l M a r t i a n e n v i r o n m e n t t h a n n o n -h e a t - s h o c k e d p o p u l a t i o n s . The s p o r e f o r m e ru s e d i n t h i s i n v e s t i g a t i o n w a s m o r e r e s i s t a n t t ot h e d r y e n v i r o n m e n t a n d r e q u i r e d l e s s w a t e r t og r o w t h a n t h e n o n - s p o r e f o r m e r . T h e s e l a s t t w or e s u l t s a r e o f s i g n i f i c a n c e b e c a u s e o f d r y - h e a ts t e r i l i z a t i o n o f t h e l a n d e r s p a c e c r a f t . B e c a u s e o ft h e r e s u l t s f r o m t h e V i k i n g l a n d e r s i n d i c a t i n gn o o r g a n i c c o m p o u n d s i n t h e s o i l , a n d t h e p r e s -e n t r e s u l t s d e m o n s t r a t i n g t h e r e q u i r e m e n t o fo r g a n i c c o m p o u n d s a s a n u t r i e n t s o u r c e , l a c k o fn u t r i e n t s i s p o s s i b l y t h e l i m i t i n g g r o w t h f a c t o ro n M a r s .B y t e r r e s t r i a l s t a n d a r d s t h e e n v i r o n m e n t o f

7 3 6 F O S T E R E T A L .


8/8

GROWTH I N A SI MULA T ED M A R T I AN ENVIRONMENT 7 37M a r s i s h o s t i l e , a n d d a t a f r o m t h e V i k i n g l a n d e r sw i l l l i k e l y s u p p o r t t h i s c o n c e p t . H o w e v e r , t h er e s u l t s o f t h i s a n d numerous o t h e r i n v e s t i g a t i o n se m p h a s i z e t h e a d a p t a b i l i t y o f m i c r o o r g a n i s m s .T h e r e f o r e , b a s e d upon c u r r e n t i n f o r m a t i o n , noe n v i r o n m e n t a l m o d e l o f M a r s h a s b e e n p r o p o s e dt h a t w o u l d p r e c l u d e g r o w t h o f t e r r e s t r i a l o rga-n i s m s on t h e s u r f a c e o f M a r s , a l t h o u g h t h e p r o b -a b i l i t y o f s u c h g r o w t h i s a d m i t t e d l y s m a l l .

ACKNOWLEDGMENTST h i s i n v e s t i g a t i o n was s u p p o r t e d b y t h e N a t i o n a l A e r o n a u -t i c s a n d S p a c e A d m i n i s t r a t i o n u n d e r g r a n t N G R - 4 4 - 0 9 5 - 0 0 1 .

L I T E R A T U R E C I T E D1 . F o s t e r , T . L . , an d L . W i n a n s , J r . 1 9 7 5 . P s y c h r o p h i l i cm i c r o o r g a n i s m s f r o m areas a s s o c i a t e d w i t h t h e V i k i n g

s p a c e c r a f t . A p p l . M i c r o b i o l . 3 0 : 5 4 6 - 5 5 0 .2 . F u l t o n , J . D . 1 9 6 0 . S u r v i v a l o f t e r r e s t r i a l m i c r o o r g a n i s m su n d e r s i m u l a t e d M a r t i a n c o n d i t i o n s , p . 6 0 6 - 6 1 3 . I n 0 .0. B e n s o n , J r . a n d H . S t r u g h o l d ( e d . ) , P h y s i c s a n dm e d i c i n e o f t h e a t m o s p h e r e a n d space. J o h n W i l e y &S o n s , I n c . , Ne w Y o r k .3 . H a g e n , C . A . , E . J . H a w r y l e w i c z , an d R . E h r l i c h .1 9 6 7 . S u r v i v a l o f m i c r o o r g a n i s m s i n a s i m u l a t e d M a r -t i a n e n v i r o n m e n t . A p p l . M i c r o b i o l . 1 5 : 2 8 5 - 2 9 1 .4 . H a l l , L . B . , an d R . G . L y l e . 1 9 7 1 . F o u n d a t i o n s o f p l a n e -t a r y q u a r a n t i n e . E n v i r o n . B i o l . M e d . 1 : 5 - 8 .5 . Hartmann, W. K . , an d 0. R a p e r . 1 9 7 4 . The new M a r s ,t h e d i s c o v e r i e s o f M a r i n e r 9 . NASA S P - 3 3 7 . N a t i o n a lA e r o n a u t i c s a n d S p a c e A d m i n i s t r a t i o n , W a s h i n g t o n ,D . C .6 . H a w r y l e w i c z , E . , B . Gowdy, an d R . E h r l i c h . 1 9 6 2 .M i c r o o r g a n i s m s u n d e r a s i m u l a t e d M a r t i a n e n v i r o n -m e n t . N a t u r e ( L o n d o n ) 1 9 3 : 4 9 7 .7 . H a w r y l e w i c z , E . , C . H a g e n , an d R . E h r l i c h . 1 9 6 5 .R e s p o n s e o f m i c r o o r g a n i s m s t o a s i m u l a t e d M a r t i a ne n v i r o n m e n t , p . 6 4 - 7 3 . I n M. F l o r k i n ( e d . ) , L i f e s c i e n c e sa n d s pace r e s e a r c h , v o l . 3 . N o r t h - H o l l a n d P u b l i s h i n gC o . , A m s t e r d a m .8 . H a w r y l e w i c z , E . , C . H a g e n , V . T o l k a c z , B . Ander-

s o n , an d M. E w i n g . 1 9 6 8 . P r o b ab i l i t y o f g r o w t h o fv i a b l e m i c r o o r g a n i s m s i n M a r t i a n e n v i r o n m e n t s , p .1 4 6 - 1 5 6 . I n A . H . Brown a n d F . C . F a v o r i t e ( e d . ) , L i f es c i e n c e s a n d s pace r e s e a r c h . N o r t h - H o l l a n d P u b l i s h i n gC o . , A m s t e r d a m .9 . H a w r y l e w i c z , E . , C . H a g e n , V . T o l k a c z , an d R . E h r -l i c h . 1 9 6 7 . E f f e c t o f r e d u c e d b a r o m e t r i c p re ssu re onw a t e r a v a i l a b i l i t y r e l a t e d t o m i c r o b i a l g r o w t h , p .1 7 4 - 1 8 6 . I n A . H . Brown a n d F . G . F a v o r i t e ( e d . ) , L i f es c i e n c e s a n d space r e s e a r c h , v o l . 4 . N o r t h - H o l l a n d P u b -l i s h i n g C o . , A m s t e r d a m .1 0 . I m s h e n e t s k y , A . A . , L. K o u z j u r i n a , an d V . J a k s h i n a .1 9 7 2 . On t h e m u l t i p l i c a t i o n o f x e r o p h i l i c m i c r o o r g a -n i s m s u n d e r s i m u l a t e d M a r t i a n c o n d i t i o n s , p . 6 3 - 6 6 . I nP . H . A . S n e a t h ( e d . ) , L i f e s c i e n c e s a n d s pace r e s e a r c h ,v o l . 1 1 . A k a d e m i e - V e r l a g , B e r l i n .1 1 . J a m e s , J . N . 1 9 6 6 . The voyage o f M a r i n e r I V . S c i . Am .2 1 4 : 4 2 - 5 2 .1 2 . K o o i s t r a , J . A . , J r . , R . B . M i t c h e l l , an d H . S t r u g h o l d .1 9 5 8 . The b e h a v i o r o f m i c r o o r g a n i s m s u n d e r s i m u l a t e dM a r t i a n e n v i r o n m e n t a l c o n d i t i o n s . P u b l . A s t r o n . S o c .P a c . 7 0 : 6 4 - 6 9 .1 3 . M i c h a u x , C . M. 1 9 6 7 . Handbook o f t h e p h y s i c a l p r o p e r -t i e s o f t h e p l a n e t M a r s . N A S A - S P - 3 0 3 0 . N a t i o n a l A e r -o n a u t i c s a n d S p a c e A d m i n i s t r a t i o n , W a s h i n g t o n , D . C .1 4 . S c h e r , S . , E . P a c k e r , an d C . S a g a n . 1 9 6 4 . B i o l o g i c a lc o n t a m i n a t i o n o f M a r s . I . S u r v i v a l o f t e r r e s t r i a l m i c r o -o r g a n i s m s i n s i m u l a t e d M a r t i a n e n v i r o n m e n t s , p .3 5 2 - 3 5 6 . I n M. F l o r k i n a n d A . D o i l f u s ( e d . ) , L i f e s c i -ences a n d spa ce r e s e a r c h , v o l . 2 . N o r t h - H o l l a n d P u b -l i s h i n g C o . , A m s t e r d a m .1 5 . S t r u g h o l d , H . 1 9 5 3 . The r e d a n d green p l a n e t . U n i v e r s i t yo f New M e x i c o P r e s s , A l b u q u e r q u e .1 6 . Young, R . S . , P . D e a l , J . B e l l , an d J . A l l e n . 1 9 6 4 .B a c t e r i a u n d e r s i m u l a t e d M a r t i a n c o n d i t i o n s , p .1 0 5 - 1 1 1 . I n M. F l o r k i n a n d A . D o l l f u s ( e d . ) , L i f e s c i -en ces a n d spa ce r e s e a r c h , v o l . 2 . N o r t h - H o l l a n d P u b -l i s h i n g C o . , A m s t e r d a m .1 7 . Young, R . S . , P . D e a l , S . B e l l , an d J . A l l e n . 1 9 6 3 . E f f e c to f d i u r n a l f r e e z e - t h a w i n g on s u r v i v a l a n d g r o w t h o fs e l e c t e d b a c t e r i a . N a t u r e ( L o n d o n ) 1 9 9 : 1 0 7 8 - 1 0 7 9 .1 8 . Young, R . S . , P . H . D e a l , an d 0. W h i t f i e l d . 1 9 6 7 .R e s p o n s e o f s o i l b a c t e r i a t o h i g h t e m p e r a t u r e s a n dd i u r n a l f r e e z i n g a n d t h a w i n g . N a t u r e ( L o n d o n )2 1 6 : 3 5 5 - 3 5 6 .

V O L . 3 5 , 1 9 7 8

Response of Terrestrial Microorganisms to a Simulated Martian Environment

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