MYLÈNE BISSON

RECONNAISSANCE MOLÉCULAIRE À L’INTERFACE AIR-EAU : UNE AVANCÉE VERS

LES POLYMÈRES « ADN-MIMÉTIQUES »

Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures de l’Université Laval

dans le cadre du programme de maîtrise en chimie pour l’obtention du grade de maître ès science (M.Sc.)

DÉPARTEMENT DE CHIMIE FACULTÉ DES SCIENCES ET DE GÉNIE

UNIVERSITÉ LAVAL QUÉBEC

2010 © Mylène Bisson, 2010

Résumé

La spécificité de la reconnaissance moléculaire démontrée par l’ADN est sans

parallèle dans le domaine des polymères synthétiques. Notre projet propose une nouvelle

méthode pour transcrire de l’information génétique d’un brin d’ADN dans un polymère

synthétique. Grâce à la reconnaissance moléculaire entre les paires de bases

complémentaires (A-T, G-C), nous visons l'assemblage de monomères dans l'ordre précis

dicté par la séquence de l'ADN. La polymérisation subséquente des monomères figera cette

séquence dans un nouveau polymère synthétique appelé ADN-mimétique.

Deux stratégies pour la préparation de polymères ADN-mimétiques seront

exposées. La première vise tout d’abord à déposer l'ADN de façon contrôlée sur un substrat

solide. Cette approche implique la formation d'un complexe électrostatique entre l'ADN et

un surfactant cationique à l’interface air-eau. L’interaction du surfactant avec l’ADN a été

démontrée par la balance de Langmuir et la microscopie à l'angle de Brewster. De plus, la

distribution des composants, l’orientation et la composition chimique des films transférés

sur un support solide ont été déterminées par des techniques de microscopie, de

spectroscopie infrarouge et d’analyse de surface.

La seconde approche devant mener aussi à la formation d’un polymère

d’ADN-mimétique implique l’assemblage de monomères à l’interface air-eau sur un simple

brin d’ADN dissous dans la phase aqueuse. Plusieurs monomères portant des bases azotées

ont été synthétisés par nos collaborateurs (équipe d’Hanadi Sleiman, Université McGill).

L'interaction entre ces molécules et l'ADN à l'interface air-eau a été étudiée avec une

balance de Langmuir et par microscopie à l'angle de Brewster. La première génération de

monomères étudiés ne forme malheureusement pas de film de Langmuir, et cela malgré la

modification de plusieurs paramètres expérimentaux. Ces premiers résultats ont mené à la

conception d'une seconde génération de molécules qui, dans ce cas, forment des

monocouches stables à l’interface. Certaines indications obtenues par spectroscopie

infrarouge laissent croire à une hybridation entre ces molécules et l’ADN. Enfin, une

troisième génération de monomères formant des films de Langmuir a également été étudiée

à l’interface air-eau et aussi sur des substrats solides. Nos travaux démontrent qu’il y a

appariement de bases entre ces monomères et des acides nucléiques.

Remerciements

Je tiens tout d’abord à remercier Anna Ritcey qui fut une directrice de recherche

exceptionnelle. Merci de m’avoir donné cette belle opportunité et de m’avoir fait confiance

pour amorcer ce nouveau projet ambitieux et fort intéressant. Votre grande disponibilité,

votre soutien et votre passion pour la recherche furent plus qu’appréciés. Vous êtes une

source inépuisable d’idées mais aussi de solutions, et ce, tout particulièrement lorsque des

moments de découragement se présentent.

Je remercie également notre collaboratrice, Hanadi Sleiman avec qui il fut

passionnant de discuter à chacune de nos rencontres. Un gros merci à Peggy Lo qui a créé

de toutes pièces les nucléolipides et monomères utilisés dans ce projet.

La réalisation de ce projet n’aurait jamais eu lieu sans l’aide de professionnels de

recherche. Travailler sous votre tutelle fut fort enrichissant. Merci à Patricia Basque à qui

j’ai posé plus d’un million de questions et qui a toujours pris le temps d’y répondre. Merci

pour ton soutien lorsque les appareils m’ont créé des ennuis. Merci aussi à Jean-François

Rioux-Dubé pour son aide et sa bonne humeur contagieuse.

Je tiens à remercier également Louis-André Lortie qui a su m’éclairer sur certains

concepts de la biologie moléculaire. Merci à Mario Méthot et Richard Janvier pour leur

aide plus que notable en microscopie à fluorescence. Je veux aussi mentionner ma grande

reconnaissance envers Alain Adnot pour son expertise mais aussi pour sa grande

accessibilité.

Je salue mes collègues avec qui j’ai partagé de formidables moments. Je m’ennuie

déjà du temps passé à vos côtés dans notre spacieux bureau du 4e étage. Un merci tout

spécial à Marie-Christine Dorais qui a contribué à ce projet de recherche pendant deux

trimestres.

De sincères remerciements à Jacques Turcotte, mon mentor, qui a su me guider

durant tout ce parcours universitaire. Vos nombreux conseils académiques, professionnels

ou personnels ont eu une importance inestimable.

iii

Pour leur appui inconditionnel, merci à ma famille et aux deux hommes de ma vie;

mon père Gaétan et mon frère Charles. Vos encouragements et votre affection sont la clé de

ma réussite. Merci à Marie-Michel, Marie-Pier et Marion…les 3M, à Valérie et à Stéphanie

pour votre fidèle amitié ainsi que votre intérêt pour mes travaux.

À la mémoire de ma mère, Johanne.

Table des matières

RÉSUMÉ.............................................................................................................................................I

REMERCIEMENTS ....................................................................................................................... II

TABLE DES MATIÈRES ................................................................................................................V

LISTE DES FIGURES ................................................................................................................. VII

LISTE DES TABLEAUX............................................................................................................. XII

LISTE DES ABRÉVIATIONS ET ACRONYMES..................................................................XIII

CHAPITRE 1 INTRODUCTION.................................................................................................... 1

1.1 L’ACIDE DÉSOXYRIBONUCLÉIQUE..................................................................................... 1 1.2 OBJECTIFS DU PROJET ........................................................................................................ 4 1.3 STRATÉGIES ....................................................................................................................... 6

1.3.1 Première stratégie – Surfactants cationiques................................................................ 6 1.3.2 Deuxième stratégie – Monomères ................................................................................. 7

1.4 APPLICATIONS ................................................................................................................... 9 1.4.1 Thérapie génique et approche antisens......................................................................... 9 1.4.2 Détection d’ADN ......................................................................................................... 12

CHAPITRE 2 INTRODUCTION AUX MÉTHODES EXPÉRIMENTALES.......................... 14

2.1 LES FILMS ET LA BALANCE DE LANGMUIR ...................................................................... 14 2.2 LES FILMS DE LANGMUIR-BLODGETT ............................................................................. 21 2.3 LA MICROSCOPIE À L’ANGLE DE BREWSTER ................................................................... 25 2.4 LA SPECTROSCOPIE INFRAROUGE DE RÉFLEXION TOTALE ATTÉNUÉE............................. 29 2.5 LA SPECTROSCOPIE DE PHOTOÉLECTRONS X................................................................... 34 2.6 LA MICROSCOPIE À FORCE ATOMIQUE ............................................................................. 37 2.7 LA MICROSCOPIE À FLUORESCENCE ................................................................................ 39

CHAPITRE 3 ÉTUDE IN SITU À L’INTERFACE AIR-EAU DES COMPLEXES SURFACTANT CATIONIQUE-ADN .......................................................................................... 43

3.1 DESCRIPTION ET PRÉPARATION DU MATÉRIEL................................................................. 43 3.2 PRÉPARATION DES FILMS DE LANGMUIR......................................................................... 46 3.3 BALANCE DE LANGMUIR ................................................................................................. 47

3.3.1 Isothermes de compression et de relaxation de l’ODA et du DODAB........................ 47 3.3.2 Isotherme de compression du complexe DODAB-ADN .............................................. 50

3.4 BAM ................................................................................................................................ 52 3.4.1 Monocouche de DODAB............................................................................................. 52 3.4.2 Monocouche du complexe DODAB-dA30 .................................................................... 53

CHAPITRE 4 ÉTUDE SUR SUPPORT SOLIDE DES COMPLEXES SURFACTANT CATIONIQUE-ADN .......................................................................................... 55

4.1 PRÉPARATION DES FILMS DE LANGMUIR-BLODGETT...................................................... 55 4.2 ATR ................................................................................................................................. 56

4.2.1 Étude qualitative de la composition des films ............................................................. 57 4.2.2 Étude de l’orientation moléculaire.............................................................................. 59

vi

4.2.3 Étude quantitative de la composition des films ........................................................... 61 4.3 XPS.................................................................................................................................. 67

4.3.1 Choix du substrat ........................................................................................................ 68 4.3.2 Préparation des échantillons....................................................................................... 70 4.3.3 Film ultramince de DODAB........................................................................................ 71 4.3.4 Film épais de dT30 ....................................................................................................... 74 4.3.5 Film ultramince de complexe DODAB-dT30................................................................ 77

4.4 MICROSCOPIE À FLUORESCENCE ..................................................................................... 81 4.4.1 Préparation des échantillons....................................................................................... 83 4.4.2 Étude par microscopie à fluorescence de films de complexe DODAB-ADNλ ............. 85

4.5 HYBRIDATION ENTRE MONOMÈRES ET ADN AYANT ÉTÉ DÉPOSÉ SUR UN SUBSTRAT PAR

TRANSFERT LB D’UN FILM DE COMPLEXE DODAB-ADN ........................................................... 87 4.5.1 Préparation des échantillons....................................................................................... 87 4.5.2 Étude ATR des monomères.......................................................................................... 89 4.5.3 Hybridation des monomères........................................................................................ 91

CHAPITRE 5 ÉTUDE DE LA RECONNAISSANCE MOLÉCULAIRE ENTRE MONOMÈRES/NUCLÉOLIPIDES ET L’ADN.......................................................................... 94

5.1 PREMIÈRE GÉNÉRATION DE MOLÉCULES SYNTHÉTIQUES ................................................ 94 5.1.1 Étude in situ à l’interface air-eau ............................................................................... 96

5.2 DEUXIÈME GÉNÉRATION DE MOLÉCULES SYNTHÉTIQUES ............................................... 98 5.2.1 C6-EG-THY.................................................................................................................. 98 5.2.2 C12-EG-THY .............................................................................................................. 101

5.3 TROISIÈME GÉNÉRATION DE MOLÉCULES SYNTHÉTIQUES............................................. 108 5.3.1 Étude in situ à l’interface air-eau ............................................................................. 108 5.3.2 Étude sur support solide............................................................................................ 113

CONCLUSION.............................................................................................................................. 136

BIBLIOGRAPHIE........................................................................................................................ 139

Liste des figures

Figure 1-1 Structure chimique d’un acide nucléique simple brin à quatre nucléotides..........2 Figure 1-2 Liaisons hydrogène entre les paires de bases A·T et C·G tel que décrites par

Watson et Crick. ...................................................................................................3 Figure 1-3 Représentation schématique de la dénaturation d’ADN natif (double hélice) et

de l’hybridation d’ADN dénaturé (simple brin). ..................................................4 Figure 1-4 Schémas (A) d’un polymère ADN-mimétique de séquence ACTG et (B) d’un

monomère fonctionnalisé......................................................................................5 Figure 1-5 Schémas représentant les différentes étapes de la première stratégie envisagée :

(A) formation d’un complexe électrostatique à l’interface air-eau entre un surfactant cationique et le patron d’ADN, (B) transfert sur support solide, (C) assemblage des monomères, (D) polymérisation et (E) obtention du polymère ADN-mimétique. ..................................................................................................6

Figure 1-6 Schémas représentant les différentes étapes de la deuxième stratégie envisagée : (A) hybridation à l’interface air-eau des monomères et du patron d’ADN, (B) transfert sur support solide, (C) polymérisation et (D) obtention du polymère d’ADN mimétique. ...............................................................................................8

Figure 1-7 Biosynthèse des protéines. ..................................................................................10 Figure 1-8 Principe d’action des oligonucléotides antisens..................................................11 Figure 1-9 Principe de détection d’ADN grâce à l’introduction dans le milieu d’un simple

brin marqué (sonde) de séquence complémentaire à la cible recherchée. L’hybridation mène à la production d’un signal détectable................................13

Figure 2-1 Représentation à deux dimensions des forces nettes qui agissent sur une unité (atomes ou molécules montrés en noir). (A) au cœur d’une phase liquide et (B) à la surface de cette phase liquide..........................................................................15

Figure 2-2 Compression de molécules amphiphiles à la surface de l’eau (A) monocouche expansée, (B) monocouche partiellement comprimée et (C) monocouche compacte. ............................................................................................................16

Figure 2-3 Illustration schématique d’une balance de Langmuir. ........................................17 Figure 2-4 Vue en perspective d’une plaque de Wilhelmy partiellement immergée dans

l’eau. ...................................................................................................................18 Figure 2-5 Isothermes caractéristiques pour une monocouche d’acide gras (gauche) et de

phospholipide (droite).........................................................................................19 Figure 2-6 Déposition Langmuir-Blodgett de type Y...........................................................22 Figure 2-7 Dépositions de types (A) X et (B) Z. ..................................................................22 Figure 2-8 Graphique de la position du substrat en fonction de la position des barrières lors

d’un transfert Langmuir-Blodgett. ......................................................................24 Figure 2-9 Lois de la réflexion et de la réfraction de la lumière. Les faisceaux incident et

réfléchi forment le même angle par rapport à la normale. Une partie de la lumière sera transmise. .......................................................................................25

Figure 2-10 Graphique présentant le pourcentage des coefficients de réflexion pour les deux polarisations du champ électrique en fonction de l’angle d’incidence pour l’interface air-eau. Rp est nulle à un angle d’incidence de 53,06°. .....................27

viii Figure 2-11 Logarithme de Rp en fonction de l’angle d’incidence permettant de voir le

déplacement de l’angle de Brewster pour l’interface air-eau (53,06°) et air-film organique (55,41°). .............................................................................................27

Figure 2-12 Une lumière polarisée parallèlement avec un angle d’incidence correspondant à l’angle de Brewster pour l’interface air-eau (53,06°) (A) ne subit aucune réflexion sur une sous-phase d’eau pure. Toutefois, (B) lorsqu’une monocouche est présente à cette interface, une partie de la lumière est réfléchie. ..................28

Figure 2-13 Schéma d’un microscope à l’angle de Brewster. ..............................................29 Figure 2-14 Schéma de la propagation de la radiation à l’intérieur d’un cristal ATR ainsi

que le système d’axes utilisé pour caractériser l’orientation moléculaire des films de symétrie uniaxe déposés. ......................................................................30

Figure 2-15 Vue de côté d’un cristal ATR à l’intérieur duquel on voit l’existence d’un champ électrique de la radiation électromagnétique au point de réflexion. À l’extérieur du cristal, l’onde évanescente décroit exponentiellement.................31

Figure 2-16 Principe de la spectroscopie de photoélectrons X.............................................34 Figure 2-17 Schéma des principales composantes d’un spectromètre de photoélectrons. ...36 Figure 2-18 Différents modes de travail de la pointe : mode non-contact, contact et contact

intermittent (tapping). .........................................................................................37 Figure 2-19 Principe du mode tapping en AFM...................................................................38 Figure 2-20 Spectre typique d’absorption et d’émission de fluorescence d’un fluorophore.

............................................................................................................................40 Figure 2-21 Schéma du principe d’un microscope à fluorescence. ......................................41 Figure 3-1 Structure moléculaire de l’octadécylamine (ODA); CH3(CH2)17NH2. ...............43 Figure 3-2 Structure moléculaire du bromure de diméthyldioctadécylammonium

(DODAB); [CH3(CH2)17]2NBr(CH3)2.................................................................44 Figure 3-3 Structure moléculaire du sel disodique de l’adénosine 5’-monophosphate

(AMP). ................................................................................................................45 Figure 3-4 (A) Isotherme de compression et (B) isothermes de relaxation à 7, 20 et

30 mN/m d’une monocouche d’ODA.................................................................48 Figure 3-5 (A) Isotherme de compression et (B) isothermes de relaxation à 7, 20 et

30 mN/m d’une monocouche de DODAB..........................................................48 Figure 3-6 Isothermes de compression d’une monocouche de DODAB sur une sous-phase

d’eau pure avec et sans dA30...............................................................................51 Figure 3-7 Images de microscopie à l’angle de Brewster d’une monocouche de DODAB sur

une sous-phase d’eau pure à des pressions de surface de (A) 5 mN/m, (B) 20 mN/m, (C) 31 mN/m et (D) 41 mN/m. ..........................................................52

Figure 3-8 Images de microscopie à l’angle de Brewster d’une monocouche de DODAB sur une sous-phase aqueuse de dA30 à des pressions de surface de (A) 5 mN/m, (B) 20 mN/m, (C) 30 mN/m et (D) 42 mN/m. ..........................................................53

Figure 4-1 Spectres ATR de films LB ultraminces de DODAB et du complexe de DODAB-dT30 dans (A) la région de 3050 à 2750 cm-1 et (B) la région de 1850 à 950 cm-1.............................................................................................................................58

Figure 4-2 Spectres ATR polarisés de bicouches transférées sur un substrat de germanium de (A) DODAB et de (B) complexe DODAB-ADN. .........................................60

ix Figure 4-3 Spectres ATR de films isotropes du complexe DODAB-AMP de rapport molaire

DODAB/AMP connu dans (A) la région des groupements méthylène et (B) la région du groupement phosphate. .......................................................................63

Figure 4-4 Courbe d’étalonnage du rapport molaire établie à partir des spectres ATR de complexes de DODAB-AMP. ............................................................................64

Figure 4-5 Spectres ATR d’une bicouche du complexe DODAB-dT30 de rapport molaire inconnu dans (A) la région des groupements méthylène et (B) la région du groupement phosphate. .......................................................................................65

Figure 4-6 Spectres ATR comparatifs de la région du groupement phosphate de films isotropes d’AMP et de dA30................................................................................67

Figure 4-7 Structures moléculaires (A) du surfactant DODAB et (B) de l’oligonucléotide dT30. ....................................................................................................................68

Figure 4-8 Spectre XPS de survol d’un film ultramince de DODAB. .................................71 Figure 4-9 Spectre XPS à haute résolution dans la région N 1s d’un film ultramince de

DODAB. .............................................................................................................73 Figure 4-10 Spectre XPS à haute résolution dans la région P 2p d’un film ultramince de

DODAB. .............................................................................................................73 Figure 4-11 Spectre XPS de survol d’un film épais de dT30 ................................................74 Figure 4-12 Spectre XPS à haute résolution dans la région N 1s d’un film épais de dT30. ..76 Figure 4-13 Formes tautomères de la thymine liée à un groupement R (pentose et

groupement phosphate).......................................................................................76 Figure 4-14 Spectre XPS à haute résolution dans la région P 2p d’un film épais de dT30. ..77 Figure 4-15 Spectre XPS de survol d’un film ultramince de complexe DODAB-dT30. ......78 Figure 4-16 Spectre XPS à haute résolution dans la région N 1s d’un film ultramince de

complexe DODAB-dT30. ....................................................................................79 Figure 4-17 Spectre XPS à haute résolution dans la région P 2p d’un film ultramince de

DODAB-dT30......................................................................................................80 Figure 4-18 (A) Illustration schématique du transfert d’un film de complexe polyionique

sur un substrat de verre et (B) image de fluorescence de l’ADN lambda marqué avec le YOYO-1. L’échelle est de 10 µm...........................................................83

Figure 4-19 Structure moléculaire du YOYO-1. ..................................................................84

Figure 4-20 Images de fluorescence de films LB de complexe DODAB-ADNλ; (A) d’une monocouche transférée sur une lame de verre à 5 mN/m, (B) à 20 mN/m et (C) d’une multicouche transférée sur une lame de verre à 20 mN/m. ......................86

Figure 4-21 Structures moléculaires des deux monomères de la troisième génération (A) M-C12-Adé et (B) M-C12-Thy. ............................................................................88

Figure 4-22 Spectre ATR d’un film épais de M-C12-Adé préparé sur un cristal de germanium. .........................................................................................................90

Figure 4-23 Spectre ATR d’un film épais de M-C12-Thy préparé sur un cristal de germanium. .........................................................................................................90

Figure 4-24 Évolution de la bande alcyne pour des spectres ATR d’un film LB ultramince de DODAB-dT30 seul (––), associé au monomère non complémentaire (---) et ensuite au complémentaire (····). .........................................................................91

x Figure 4-25 (A) Composition de chacune des couches des échantillons étudiés et (B)

composition envisagée pour de futures analyses afin de minimiser la perte de complexe lors du trempage dans l’hexane. .........................................................93

Figure 5-1 Structures moléculaires des monomères de la première génération (A) THY et (B) DAP. .............................................................................................................95

Figure 5-2 Structures moléculaires des nucléolipides de la première génération (A) C4-THY et (B) C6-THY.....................................................................................................95

Figure 5-3 Formes tautomères et forme déprotonée de la thymine. .....................................97 Figure 5-4 Structure moléculaire du nucléolipide C6-EG-THY. ..........................................98 Figure 5-5 Images de microscopie à l’angle de Brewster du nucléolipide C6-EG-THY sur

une sous-phase aqueuse d’oligonucléotides dA30 de rapports molaires adénine:thymine (A) 2:1, (B) 5:1 et (C) 14:1. ..................................................100

Figure 5-6 Images de microscopie à l’angle de Brewster d’une sous-phase aqueuse d’oligonucléotides dA30 pour des aires moléculaires correspondantes à (A) 9 et (B) 8 Å2/molécule s’il y avait présence d’une monocouche de C6-EG-THY...101

Figure 5-7 Structure moléculaire du nucléolipide C12-EG-THY........................................102 Figure 5-8 Isothermes de compression de monocouches de C12-EG-THY sur différentes

sous-phases. ......................................................................................................103 Figure 5-9 Isothermes de relaxation d’une monocouche de C12-EG-THY sur une sous-phase

d’eau pure. ........................................................................................................104 Figure 5-10 Images de microscopie à l’angle de Brewster d’une monocouche de

C12-EG-THY sur une sous-phase d’eau pure à des pressions de surface de (A) 5 mN/m, (B) 15 mN/m et (C) 35 mN/m. ..........................................................105

Figure 5-11 Spectres ATR de monocouches de C12-EG-THY transférées sur des substrats de germanium à partir de sous-phases d’eau pure contenant ou non différents acides nucléiques. .............................................................................................107

Figure 5-12 Isothermes de compression du M-C12-Thy étalé sur une sous-phase d’eau ultrapure (––); sur une sous-phase contenant le nucléotide complémentaire (---) et le nucléotide non complémentaire (····).........................................................109

Figure 5-13 Isothermes de compression du M-C12-Adé étalé sur une sous-phase d’eau ultrapure (––); sur une sous-phase contenant le nucléotide complémentaire (····) et le nucléotide non complémentaire (---).........................................................110

Figure 5-14 Images de microscopie à l’angle de Brewster d’une monocouche de M-C12-Adé sur une sous-phase d’eau pure à des aires moléculaires de (A) 129, (B) 97, (C) 78, (D) 53 et (E) 45 Å2/molécule. ..................................................111

Figure 5-15 Images de microscopie à l’angle de Brewster d’une monocouche de M-C12-Adé sur une sous-phase aqueuse de dT30 à des aires moléculaires de (A) 112, (B) 97, (C) 79, (D) 54 et (E) 46 Å2/molécule. ..........................................111

Figure 5-16 Variation du niveau de gris en fonction de l’aire moléculaire pour une monocouche de M-C12-Adé sur une sous-phase d’eau pure avec et sans dT30.112

Figure 5-17 Spectres ATR d’une monocouche de M-C12-Adé transférée sur un cristal de germanium à partir d’une sous-phase d’eau pure (––), d’une solution aqueuse d’oligonucléotides dA30 (---) et de dT30 (····).....................................................114

xi Figure 5-18 Images AFM d’une monocouche de M-C12-Adé transférée sur un substrat de

silicium à partir (A) d’une sous-phase d’eau pure, d’une sous-phase contenant des oligonucléotides (B) dA30 et (C) dT30. La zone de balayage en xy est de 0,5 µm. ..............................................................................................................115

Figure 5-19 Images AFM d’une monocouche de M-C12-Adé transférée sur un substrat de silicium à partir (A) d’une sous-phase d’eau pure, d’une sous-phase contenant des oligonucléotides (B) dA30 et (C) dT30. La zone de balayage en xy est de 5 µm. .................................................................................................................115

Figure 5-20 Spectre XPS à haute résolution dans la région N 1s d’un film épais de dA30.117 Figure 5-21 Spectre XPS à haute résolution dans la région P 2p d’un film épais de dA30.118 Figure 5-22 Spectre XPS de survol d’un film ultramince de M-C12-Adé. .........................119 Figure 5-23 Spectre XPS à haute résolution dans la région N 1s pour un film ultramince de

M-C12-Adé. .......................................................................................................120 Figure 5-24 Spectre XPS à haute résolution dans la région I 3d5/2 d’un film ultramince de

M-C12-Adé. .......................................................................................................121 Figure 5-25 Spectre XPS à haute résolution de la région I 3d5/2 pour un film ultramince de

M-C12-Adé montrant l’évolution des deux composantes en fonction du temps d’exposition aux rayons X. ...............................................................................122

Figure 5-26 Spectre XPS à haute résolution dans la région N 1s d’un film ultramince de M-C12-Adé et dT30. ...........................................................................................125

Figure 5-27 Spectre XPS à haute résolution dans la région I 3d5/2 d’un film ultramince de M-C12-Adé et dT30. ...........................................................................................126

Figure 5-28 Spectre XPS à haute résolution dans la région P 2p d’un substrat de silicium vierge à un angle d’analyse de 0°. ....................................................................126

Figure 5-29 Spectre XPS à haute résolution dans la région P 2p d’un film ultramince de M-C12-Adé et dT30. ...........................................................................................127

Figure 5-30 Spectre XPS à haute résolution dans la région N 1s d’un film ultramince de M-C12-Adé et dA30............................................................................................128

Figure 5-31 Spectre XPS à haute résolution dans la région I 3d5/2 d’un film ultramince de M-C12-Adé et dA30............................................................................................129

Figure 5-32 Spectre XPS à haute résolution dans la région P 2p d’un film ultramince de M-C12-Adé et dA30............................................................................................130

Figure 5-33 Quatre mésappariements possibles de deux bases azotées d’adénine.............131

Liste des tableaux

Tableau 4-1 Rapport dichroïque (RATR) et angle d’inclinaison (θATR) moléculaire calculés

pour les vibrations sélectionnées pour des bicouches de DODAB et de DODAB-ADN transférées sur un substrat de germanium. ................................................61

Tableau 4-2 Composition atomique relative des éléments dans un film ultramince de DODAB. .............................................................................................................72

Tableau 4-3 Composition atomique relative des éléments d’un film épais de dT30. ............75 Tableau 4-4 Composition atomique relative des éléments d’un film ultramince de

DODAB-dT30......................................................................................................78 Tableau 4-5 Paramètres expérimentaux des diverses composantes spectrales obtenues dans

les régions N 1s et P 2p des échantillons de DODAB, dT30 et du complexe DODAB-dT30......................................................................................................81

Tableau 4-6 Rapports d’intensité de la bande de l’élongation du lien alcyne à celle de l’élongation antisymétrique des méthylènes pour des films LB ultraminces de DODAB-dT30 seul ou hybridé à un monomère. .................................................92

Tableau 5-1 Composition atomique relative des éléments d’un film ultramince de M-C12-Adé. .......................................................................................................119

Tableau 5-2 Évolution des rapports des concentrations atomiques apparentes d’iode 3d5/2

selon différents temps d’exposition aux rayons X pour une même séquence d’enregistrement. ..............................................................................................123

Tableau 5-3 Évolution des rapports des concentrations atomiques apparentes d’iode 3d5/2

selon différents temps d’exposition aux rayons X pour des séquences d’enregistrement différentes. ............................................................................123

Tableau 5-4 Évolution des rapports des concentrations atomiques apparentes d’azote 1s selon différents temps d’exposition aux rayons X pour des séquences d’enregistrement différentes. ............................................................................124

Tableau 5-5 Paramètres expérimentaux des diverses composantes spectrales XPS obtenues dans les régions N 1s, P 2p et I 3d5/2 pour des échantillons de M-C12-Adé, dA30 et dT30. ..............................................................................................................132

Tableau 5-6 Paramètres expérimentaux des diverses composantes spectrales XPS obtenues dans les régions N 1s, P 2p et I 3d5/2 pour des échantillons de complexes M-C12-AdédT30 et M-C12-AdédA30............................................................................133

Tableau 5-7 Valeurs théoriques et expérimentales des rapports atomiques I/N et N/P obtenus par la spectroscopie de photoélectrons X pour des films ultraminces de M-C12-Adé seul, avec dT30 et dA30. Valeurs des rapports molaires monomère/nucléotide calculés à partir des rapports atomiques expérimentaux...........................................................................................................................134

Liste des abréviations et acronymes

A adénine ADN acide désoxyribonucléique AFM microscopie à force atomique ARN acide ribonucléique ARNm acide ribonucléique messager AS-ODN oligonucléotide antisens ATR réflexion totale atténuée BAM microscopie à l’angle de Brewster C cytosine CCD dispositif à couplage de charge AMP adénosine 5’-monophosphate DDDA bromure de didodécyldiméthylammonium DODAB bromure de diméthyldioctadécylammonium E. coli Escherichia coli EDTA acide éthylènediaminetétraacétique G guanine G phase gazeuse HPLC chromatographie liquide à haute performance IR infrarouge L1 phase liquide expansé L2 phase liquide condensé LB Langmuir-Blodgett LS Langmuir-Schaeffer MCT tellurure de mercure et de cadmium Nd-YAG grenat d’yttrium-aluminium dopé au néodyme ODA octadécylamine OGM organisme génétiquement modifié pb paire de bases PCR réaction en chaîne par polymérase RMN résonance magnétique nucléaire S phase solide SI système international d’unités SPM microscope à balayage par sonde STM microscope à balayage à effet tunnel T thymine VIH virus de l’immunodéficience humaine XPS spectroscopie de photoélectrons X YOYO-1 homodimère de jaune d’oxazole

Chapitre 1

Introduction

Dans ce premier chapitre, nous décrirons d’abord quelques propriétés et concepts de

base de l’acide désoxyribonucléique, un élément essentiel à la formation d’un polymère

ADN-mimétique. La section 1.2 présente concrètement les objectifs de ce projet tandis que

la section 1.3 détaille les deux stratégies envisagées pour obtenir ce matériau. Nous

discuterons à la section 1.4 de quelques applications possibles de ce type de polymère.

1.1 L’acide désoxyribonucléique

Il existe deux types d’acides nucléiques, l’acide désoxyribonucléique (ADN) et

l’acide ribonucléique (ARN). Ces biomolécules jouent un rôle crucial pour les organismes

vivants.1,2 Elles permettent le stockage, le transport et l’expression de l’information

génétique. Dans le cadre de ce projet de recherche, seul l’ADN a été utilisé, nous

discuterons donc uniquement de cet acide nucléique. On retrouve l’ADN dans le noyau

cellulaire où il assure la biosynthèse des protéines et des enzymes. Il y détermine aussi la

fonction et la division de la cellule. Ce sont James Watson et Francis Crick qui ont

découvert en 1953 la structure du sel de l’acide désoxyribonucléique.3 La forme native bien

connue de l’ADN est une double hélice formée de deux chaînes antiparallèles de séquence

nucléotidique complémentaire. L’unité monomérique des chaînes est le nucléotide qui est

composé de trois parties, soit d’une base azotée, d’un sucre (β-2-désoxy-D-ribose) et d’un

2 groupement phosphate. La Figure 1-1 montre un enchaînement de quatre nucléotides. Au

pH physiologique, le groupement phosphate est chargé négativement. Les acides

nucléiques simples brins ayant une courte séquence de nucléotides, moins de 50

nucléotides, sont appelés oligonucléotides.1 Ils sont habituellement obtenus par synthèse

chimique.

T

A

C

G

Figure 1-1 Structure chimique d’un acide nucléique simple brin à quatre nucléotides.

On trouve quatre bases azotées différentes dans l’ADN : l’adénine (A), la thymine

(T), la cytosine (C) et la guanine (G). Celles-ci ne participent pas à l’enchaînement mais

sont toutefois d’une très grande importance. Les chaînes d’ADN adoptent une structure de

double hélice par la formation de liaisons hydrogène entre les bases complémentaires de

deux simples brins. L’interaction entre ces bases est le meilleur mécanisme pour accumuler,

enregistrer, reproduire et élaborer l’information génétique. L’appariement est très

spécifique et répond à la règle de complémentarité suivante : l’adénine se lie avec la

3

4thymine tandis que la cytosine s’associe avec la guanine. C’est la formation de deux

liaisons hydrogène entre l’adénine et la thymine ainsi que les trois liaisons entre la cytosine

et la guanine qui permettent l’appariement. Cette interaction est présentée à la Figure 1-2.

La complémentarité découle de contraintes stériques et chimiques. Les bases sont des

molécules aromatiques hétérocycliques dont la structure découle de deux composés : les

purines (A et G) et les pyrimidines (T et C). Chacune des paires de bases a les mêmes

dimensions, elles sont composées à la fois d’une purine (deux cycles) et d’une pyrimidine

(un cycle). Alors que deux purines occuperaient trop d’espace, deux pyrimidines seraient

trop distancées pour former des liaisons stables. Les dimensions homogènes des paires

confèrent donc à la double hélice une structure régulière. Toutefois, une base purique ne

peut pas s’associer à n’importe laquelle des bases pyrimidiques en raison de contraintes

chimiques. Les liaisons hydrogène sont directionnelles. Ce caractère permet d’obtenir des

architectures moléculaires très bien définies. Les groupements des bases qui participent aux

liaisons hydrogène doivent donc être bien alignés. La règle de complémentarité entre les

paires de bases est fondamentale, il s’agit en fait de la reconnaissance moléculaire, un

principe à la base de plusieurs techniques de biologie moléculaire. C’est cette interaction

hautement sélective que nous voulons utiliser pour ce projet de recherche.

Adénine (A) Thymine (T) Guanine (G) Cytosine (C)

Figure 1-2 Liaisons hydrogène entre les paires de bases A·T et C·G tel que décrites par Watson et Crick.

Les liaisons hydrogène sont des liens de faible énergie, il est donc possible de

séparer deux brins d’ADN par chauffage ou par traitement chimique (formamide, urée).

4 Cette dénaturation de l’ADN n’est pas similaire à celle des protéines puisqu’il s’agit d’un

processus entièrement réversible. De plus, la dénaturation de l’ADN ne mène pas à une

perte d’activité. Un ADN natif en solution, soit une double hélice, soumis à un chauffage

doit donc être refroidi très rapidement pour éviter l’autoassociation des brins séparés.

L’association de deux simples brins d’ADN complémentaires est un phénomène nommé

hybridation. La Figure 1-3 présente le processus réversible de dénaturation/hybridation.

Figure 1-3 Représentation schématique de la dénaturation d’ADN natif (double hélice) et de l’hybridation d’ADN dénaturé (simple brin). (Adaptée de 2)

1.2 Objectifs du projet

L’objectif général de ce projet est d’assembler des monomères fonctionnalisés

synthétiques selon une séquence dictée par un brin d’ADN. Ce brin d’ADN constitue le

gabarit. En d’autres termes, nous voulons transcrire l’information génétique contenue dans

un brin d’ADN modèle dans un polymère entièrement synthétique. Ce nouveau matériau

est appelé polymère « ADN-mimétique » (Figure 1-4A). Les monomères synthétisés sont

composés de trois groupements aux caractéristiques propres. Les diverses parties de cette

molécule ont été schématisées à la Figure 1-4B. La première partie, la région permettant

l’assemblage du polymère, est une base azotée identique ou analogue à celle que l’on

retrouve dans l’ADN. C’est donc par reconnaissance moléculaire, ou plus précisément par

5 appariement entre les bases complémentaires, qu’il y aura association entre les monomères

et le gabarit d’ADN. Dans ce mémoire, nous utiliserons donc le terme hybridation pour

décrire cette association particulière qui conduit à la formation d’un polymère ADN-

mimétique. La deuxième section du monomère est une chaîne alkyle. Elle confère des

propriétés hydrophobes au monomère et lui permet de bien s’ancrer à l’interface air-eau. La

base azotée constitue la tête hydrophile. La dernière partie est une fonction polymérisable

qui permet de figer la séquence dictée par le gabarit d’ADN dans le polymère. La fonction

a été placée en bout de chaîne sur les schémas mais elle peut tout aussi bien être insérée

dans le squelette de la chaîne alkyle.

Fonction polymérisable Chaîne alkyle A B

A GC TT Base azotée (thymine)

Figure 1-4 Schémas (A) d’un polymère ADN-mimétique de séquence ACTG et (B) d’un monomère fonctionnalisé.

Outre les monomères, des nucléolipides ont aussi été utilisés. Leur structure est

semblable à celle des monomères sauf que la fonction polymérisable est absente. Ils sont

composés d’une base azotée et d’une chaîne hydrophobe. Si la fonction polymérisable est

manquante, c’est pour en simplifier la synthèse et permettre de faire des essais

préliminaires. Toutefois, si le nucléolipide forme un film stable à l’interface et s’hybride

avec l’ADN, la molécule complète comportant un groupement polymérisable devrait

ensuite être synthétisée.

Deux stratégies ont été envisagées pour obtenir un polymère ADN-mimétique. La

première utilise des surfactants cationiques pour amener les simples brins d’ADN sur un

support solide pour ensuite y faire l’assemblage des monomères fonctionnalisés selon

l’ordre dicté par la séquence d’ADN. La deuxième voie vise plutôt l’utilisation des

monomères fonctionnalisés directement.

6

1.3 Stratégies

1.3.1 Première stratégie – Surfactants cationiques

La première étape de cette approche vise une complexation électrostatique à

l’interface air-eau entre un surfactant cationique à choisir et le groupement anionique de

l’ADN, soit le groupe phosphate (Figure 1-5A). Tel qu’illustré à la Figure 1-5B, le film

mince du complexe surfactant-ADN sera transféré sur un support solide grâce à la

technique Langmuir-Blodgett.

Figure 1-5 Schémas représentant les différentes étapes de la première stratégie envisagée : (A) formation d’un complexe électrostatique à l’interface air-eau entre un surfactant cationique et le patron d’ADN, (B) transfert sur support solide, (C) assemblage des monomères, (D) polymérisation et (E) obtention du polymère ADN-mimétique.

7

Selon nous, on pourra ensuite effectuer la reconnaissance moléculaire entre les

monomères et le brin d’ADN servant de patron (Figure 1-5C). Après quoi, les monomères

pourront être polymérisés et menés ainsi à l’obtention du polymère ADN-mimétique

(Figure 1-5D et E), lequel contient la séquence complémentaire à celle du brin ayant servi

de gabarit. Les résultats présentés aux chapitres 3 et 4 décrivent en détail les trois premières

étapes de cette stratégie, soit l’étude in situ des films à l’interface air-eau, l’étude sur

support solide ainsi que l’assemblage des monomères.

1.3.2 Deuxième stratégie – Monomères

Cette deuxième stratégie implique l’utilisation des monomères directement à

l’interface air-eau. On réduit ainsi d’une étape le procédé d’obtention d’un polymère

ADN-mimétique. La première étape consiste ici à étaler les monomères fonctionnalisés,

molécules amphiphiles, à l’interface d’une solution aqueuse d’ADN (Figure 1-6A). Nous

espérons que les monomères s’ordonneront à l’interface selon la séquence dictée par le

simple brin d’ADN par appariement des bases complémentaires. Comme il est montré à la

Figure 1-6B et C, le film monomères-ADN ainsi formé pourra être transféré sur un substrat

solide pour y être ensuite polymérisé. Tout comme pour la première stratégie, on obtiendra

un polymère ADN-mimétique de séquence complémentaire au patron utilisé (Figure 1-6D).

Le chapitre 5 de ce mémoire présente les résultats concernant l’étude in situ des films

obtenus à l’interface par la deuxième stratégie et aussi leur caractérisation sur des supports

solides. Les travaux ont porté sur plusieurs monomères de structures différentes. Quant à la

polymérisation et à l’obtention du polymère ADN-mimétique lui-même, ces étapes feront

l’objet de travaux futurs.

8

Figure 1-6 Schémas représentant les différentes étapes de la deuxième stratégie envisagée : (A) hybridation à l’interface air-eau des monomères et du patron d’ADN, (B) transfert sur support solide, (C) polymérisation et (D) obtention du polymère d’ADN mimétique.

La reconnaissance moléculaire en solution est bien connue, la détection et le

séquençage d’ADN en sont des exemples. Suivant cette voie, nos collaborateurs du

Laboratoire de la professeure Sleiman, ont développé récemment plusieurs polymères

fonctionnalisés solubles dans l’eau.5,6 Ceux-ci peuvent donc s’hybrider par appariement de

bases à des oligonucléotides complémentaires. Dans ce cas, la polymérisation des

monomères a lieu avant l’hybridation à l’ADN et ainsi, contrairement à la stratégie

présentée dans ce mémoire, l’agencement ne peut pas être réalisé selon l’ordre dicté par le

brin d’acide nucléique. Kurihara7 8 et d’autres chercheurs ont avancé que la reconnaissance

moléculaire de petites molécules basée sur la formation de lien hydrogène ne peut avoir lieu

en solution aqueuse en raison de l’hydratation, mais peut cependant être observée à

l’interface d’une monocouche hydrophobe formée sur la surface de l’eau. On retrouve dans

la littérature plusieurs études qui portent sur l’appariement de bases entre nucléolipides et

nucléotides à l’interface air-eau.9,10,11 Toutefois, la reconnaissance moléculaire entre

nucléolipides et oligonucléotides ou chaînes d’ADN est un axe de recherche beaucoup

moins exploité. Certains groupes ont démontré une l’hybridation de bases complémentaires

9 entre nucléolipides et des oligomères.12,13 Aucun n’envisage néanmoins d’obtenir un

polymère à partir de ces films. Selon nous, l’approche considérée ici n’a jamais été

explorée dans la communauté scientifique.

Créer de toutes pièces un polymère ADN-mimétique en assemblant par hybridation

des monomères spécifiquement fonctionnalisés à des brins d’ADN choisis, laisse entrevoir

des applications de grand intérêt dans le domaine médical, judiciaire et aussi des matériaux

nanométriques structurés par exemple. Quelques-unes des applications envisagées seront

décrites sommairement à la section suivante.

1.4 Applications

1.4.1 Thérapie génique et approche antisens

Un nombre important de maladies sont liées à la mutation ou à l’absence d’un gène

dans l’organisme. Ces anomalies entraînent une altération, une surproduction ou encore un

déficit de protéines. Le traitement diffère dans chacune de ces trois situations. S’il y a

absence d’une protéine ou d’un gène, il faut entrevoir la possibilité de les introduire. S’il y

a altération ou surproduction, un effet thérapeutique sera obtenu si un composé agit sur la

biosynthèse de la protéine en cause dans la pathologie. Les divers processus de la

biosynthèse des protéines sont schématisés à la Figure 1-7. La première étape, qui a lieu à

l’intérieur du noyau d’une cellule eucaryote, est la transcription. Elle consiste à faire une

copie sélective d’un fragment d’ADN pour mener à la formation d’un brin d’ARN

messager (ARNm). Ce brin monocaténaire peut ensuite transporter l’information du noyau

au cytoplasme où se trouvent les ribosomes. Ce sont dans ces unités que la synthèse

protéique a lieu par le processus de traduction.

10

Figure 1-7 Biosynthèse des protéines. (Adaptée de 14)

Thérapie génique

La thérapie génique a comme objectif de produire une protéine aux effets

thérapeutiques dans un organisme cible. Ce traitement est composé de plusieurs méthodes

permettant le transfert de matériel génétique exogène, ADN ou ARN, à l’intérieur de

cellules somatiques d’un organisme vivant. Cette approche thérapeutique a été envisagée au

début des années soixante-dix pour le traitement de maladies héréditaires monogéniques

telles que la fibrose kystique. Elle a ensuite été considérée pour d’autres pathologies non

héréditaires ou polygéniques comme les cancers, les maladies infectieuses et

inflammatoires. D’un côté théorique, l’introduction de matériel génétique permettrait de

remédier à un déficit génétique ou bien de modifier le métabolisme cellulaire.15

Approche antisens

Une des alternatives possibles de la thérapie génique est l’approche antisens. Elle

vise à inhiber l’expression d’un gène par l’utilisation d’oligonucléotides antisens (antisense

oligodeoxynucleotides, AS-ODN).16 Ce sont des acides désoxynucléiques de courte chaîne,

entre 16 et 20 bases, dont la séquence est complémentaire à l’ARN messager cible. Le

terme « sens » fait référence à la séquence originale de la molécule de l’acide nucléique et

le terme « antisens » à la séquence complémentaire. Comme il est montré à la Figure 1-8,

les AS-ODN se fixent à l’ARNm et inhibent le phénomène de traduction. Les

11 oligonucléotides antisens vont rarement inhiber entièrement la production de protéines

puisqu’ils n’ont aucun effet sur la transcription. La production d’ARNm a toujours lieu à

l’intérieur du noyau cellulaire. Toutefois, il y a compétition entre les ARNm endogènes et

les AS-ODN introduits dans l’organisme. De cette façon, les AS-ODN ne causent pas de

mutation génétique et n’empêchent pas une protéine d’assumer son rôle physiologique

normal. L’efficacité se situe au niveau de la surproduction de protéines et c’est cette

production excessive qui est en cause dans plusieurs maladies.

Figure 1-8 Principe d’action des oligonucléotides antisens. (Adaptée de 14)

La plupart des oligonucléotides antisens utilisés sont des phosphorothioates où un

atome de soufre remplace l’atome d’oxygène au niveau des liens internucléotides. Cette

modification leur confère une plus grande stabilité et une meilleure résistance aux

nucléases, enzyme clivant les brins d’acides nucléiques au niveau de la liaison

phosphodiester. Toutefois, l’efficacité de ces AS-ODN est modérée et la synthèse de ce

type d’acides nucléiques s’avère coûteuse et nécessite plusieurs étapes.

Beaucoup d’espoir est porté vers la thérapie antisens même si les résultats obtenus à

ce jour ne sont pas aussi concluants que la théorie ne l’avait prédit. Il est donc important

d’apporter des modifications chimiques sur les oligonucléotides et également de créer

d’autres types de molécules. Nous croyons que le polymère ADN-mimétique s’avérerait

être un bon candidat pour l’approche antisens. Ce matériel se veut d’abord peu sensible à la

dégradation enzymatique puisqu’il ne possède aucun lien phosphodiester. Aussi, son

assemblage est réalisé par une technique facile d’utilisation ne nécessitant que très peu de

12 monomères, un aspect qui est à considérer lorsqu’une synthèse utilise des composés

coûteux.

1.4.2 Détection d’ADN

L’hybridation de brins complémentaires d’acides nucléiques est un principe déjà

grandement utilisé en biologie moléculaire. Cet appariement est à la base d’un grand

nombre de techniques comme la caractérisation de génome humain, viraux ou bactériens, le

clonage, les puces à ADN et également l’amplification en chaîne par polymérase

(Polymerase Chain Reaction, PCR). Cette méthode permet de copier en grand nombre une

séquence d’ADN connue présente qu’en très faible concentration. La détection d’acides

nucléiques est également basée sur le phénomène d’hybridation. C’est un autre domaine qui

connaît présentement un très grand essor et dont la contribution aux niveaux médical et

criminalistique est majeure. Par exemple, la reconnaissance d’ADN permet d’établir la

présence d’organismes génétiquement modifiés (OGM), permet le diagnostic rapide de

virus tels que le VIH, l’hépatite B et aussi de bactéries pathogènes. Dans le domaine

judiciaire, on utilise couramment la détection d’ADN pour confirmer ou infirmer

l’implication d’un individu dans un crime.

Comme il a déjà été mentionné à la section 1.1, l’ADN natif peut se dissocier en

simples brins dans des conditions dénaturantes et, les acides nucléiques monocaténaires

formés peuvent ensuite s’associer à nouveau sous la forme d’une double hélice en

respectant la règle de complémentarité A·T et C·G. Il est donc possible d’insérer un ADN

exogène dans le milieu d’association, lequel contient des millions de fragments dénaturés

par chauffage.15 Le fragment ajouté est un simple brin d’ADN qui aura préalablement été

marqué et que l’on l’appellera la sonde. Des composés radioactifs, fluorescents, des

enzymes ou encore des haptènes sont des types de marqueurs pouvant être utilisés. Les

haptènes sont des molécules antigéniques que le système immunitaire reconnaît sans

toutefois créer une réponse immunitaire. Si le milieu d’association contient la cible, c’est-à-

dire la séquence complémentaire à la sonde. La cible recherchée s’hybridera de façon

préférentielle à la sonde plutôt qu’à toute autre cible complémentaire puisque la sonde est

présente en large excès dans le milieu. La Figure 1-9 résume la détection d’ADN par

13 hybridation d’une sonde avec une cible choisie. Cet appariement avec une sonde marquée

crée un signal détectable et même quantifiable. Généralement, il s’agit d’un signal optique

(colorimétrique, fluorescent, luminescent, etc.) ou électrique (voltage, résistance).17

Figure 1-9 Principe de détection d’ADN grâce à l’introduction dans le milieu d’un simple brin marqué (sonde) de séquence complémentaire à la cible recherchée. L’hybridation mène à la production d’un signal détectable. (Adaptée de 2)

Le polymère ADN-mimétique anticipé est analogue à un simple brin d’acide

nucléique, on peut donc envisager son utilisation comme sonde dans les techniques de

détection d’ADN. Puisqu’on lui entrevoit une grande stabilité, on peut penser à une

meilleure résistance aux différentes techniques de marquage. Nous croyons également que

ce polymère synthétique offrira une très grande polyvalence chimique étant donné qu’il

sera possible lors de la synthèse des monomères d’ajouter ou de modifier certains

groupements pour en adapter les propriétés. Les monomères présenteront donc l’avantage

de pouvoir être marqués lors de leur synthèse. La flexibilité des synthèses donne aussi la

possibilité de faire une hybridation en phase solide, au même titre que les puces à ADN où

les sondes sont fixées sur un support solide. Nous croyons que le polymère ADN-

mimétique pourrait être muni d’un groupement fonctionnel qui permettrait son greffage sur

des surfaces.

Chapitre 2

Introduction aux méthodes expérimentales

Nous présentons dans ce chapitre les principales techniques utilisées au cours de ces

travaux, tant pour produire des monocouches organiques que pour leur transfert sur support

solide. On parle alors respectivement de films Langmuir et Langmuir-Blodgett. On y

énumère aussi les méthodes expérimentales qui ont servi à caractériser ces couches

ultraminces. On discutera donc des microscopies à l’angle de Brewster, à force atomique et

à fluorescence et également des spectroscopies infrarouge de réflexion totale atténuée et de

photoélectrons X. Nous ferons seulement quelques rappels théoriques pour mieux cerner

les éléments desquels nous tirons des informations utiles pour caractériser nos matériaux.

Quant aux conditions particulières et au matériel utilisé pour ces diverses techniques, ils

seront donnés aux chapitres suivants où sont présentées de façon détaillée les deux

stratégies adoptées pour la réalisation de ce projet.

2.1 Les films et la balance de Langmuir

Films de Langmuir

L’environnement des molécules à la surface d’un liquide est différent de celui au

cœur de la phase liquide. Dans le volume aqueux, une molécule subie des forces

d’attraction égales dans chacune des directions et elles s’annulent mutuellement. En

15 surface, les forces n’étant pas symétriques, la force nette résultante n’est donc pas nulle

(Figure 2-1). Les molécules se trouvant à l’interface gaz-liquide subissent ainsi une force

d’attraction plus grande vers la phase liquide que vers la phase gazeuse. Cette situation crée

un excès d’énergie libre à la surface du liquide.

Force apparente

Figure 2-1 Représentation à deux dimensions des forces nettes qui agissent sur une unité (atomes ou molécules montrés en noir). (A) au cœur d’une phase liquide et (B) à la surface de cette phase liquide. (Adaptée de 18)

La force résultante mène à l’apparition d’une tension à la surface. Cette tension de

surface peut être considérée comme l’énergie requise pour augmenter l’aire de la surface

d’un liquide ou d’un solide par une unité de surface. La tension de surface (γ) d’un plan est

donnée par l’équation 2.1 où G correspond à l’énergie libre de Gibbs, s à l’aire de la

surface. Les termes T, P et ni correspondent respectivement à la température, la pression et

le nombre de molécules. L’unité SI pour exprimer la tension de surface est le N/m, la

dyn/cm peut aussi être employée.

, ,

γiT P n

G

s

∂ = ∂ (2.1)

La présence d’un film à la surface d’un liquide ou d’un solide diminue sa tension de

surface. L’analogue à deux dimensions de la pression est appelé pression de surface (Π), et

est donné par la relation suivante :

Force nette = 0 Force nette

B A

16

0γ - γΠ = (2.2)

où γ0 est la tension de surface en absence d’une monocouche et γ la tension de surface

lorsque la monocouche est présente.

L’étude des films monomoléculaires à l’interface gaz-liquide se fait avec des

liquides ayant une tension de surface élevée tels que, l’eau, l’éthylène glycol, le glycérol et

le mercure. L’eau possède de très fortes interactions intermoléculaires et par conséquent

une valeur de tension de surface très élevée comparativement à la plupart des liquides, soit

73 mN/m à 20 °C et à pression atmosphérique. C’est pour cette raison que l’eau est la sous-

phase la plus utilisée pour ce type d’étude. Toutes les expérimentations présentées dans ce

mémoire ont été réalisées avec de l’eau ultrapure. Nous parlerons donc maintenant d’études

à l’interface air-eau. Il existe deux types de films monomoléculaires. Une de ces classes est

appelée les films de Gibbs. Ceux-ci sont formés par des molécules solubles qui se logent à

l’interface par adsorption. La deuxième famille de monocouches, les films de Langmuir, est

celle qui a été employée pour ce projet de recherche. Ces films sont formés par l’étalement

de molécules insolubles à l’interface des phases.

La formation d’une monocouche insoluble à l’interface air-eau a lieu par l’étalement

de molécules à caractère amphiphile (Figure 2-2A). Ces molécules sont constituées de deux

parties aux propriétés distinctes, soit d’une tête hydrophile, qui est soluble dans la phase

aqueuse et aussi d’une section hydrophobe qui consiste habituellement en une chaîne

alkyle. L’affinité d’un surfactant pour l’interface est déterminée par ses propriétés

chimiques et physiques. Les surfactants sont solubilisés dans un solvant volatil, qui s’étale

et qui est peu miscible avec la sous-phase, ici l’eau. Quelques gouttes de cette solution sont

déposées à l’interface. Après quelques minutes le solvant s’est évaporé et il est ensuite

possible de comprimer le film pour en étudier les propriétés (Figure 2-2B et C).

A B

C

Figure 2-2 Compression de molécules amphiphiles à la surface de l’eau (A) monocouche expansée, (B) monocouche partiellement comprimée et (C) monocouche compacte.

17 Balance de Langmuir

L’appareil utilisé pour caractériser les films de Langmuir s’appelle la balance de

Langmuir. La Figure 2-3 illustre schématiquement les principales composantes de cet

appareil. Il permet de mesurer la pression de surface en fonction de l’aire moléculaire. La

cuve qui contient la sous-phase est habituellement faite de Téflon®. Ce matériau inerte et

hydrophobe facilite le nettoyage et prévient les fuites de la sous-phase par-dessus le rebord

de la cuve. La température de la sous-phase est contrôlée et maintenue constante grâce à un

dispositif intégré à la cuve et relié à un bain thermostatique. L’appareil est muni de

barrières mobiles qui permettent de comprimer symétriquement le film et par le fait même

de modifier l’aire occupée par chacune des molécules étalées à l’interface. Les barrières

utilisées sont dans la plupart des cas faites de Delrin®, un matériau hydrophile qui empêche

la monocouche de fuir sous les barrières.

Balance avec plaque de Wilhelmy Barrière Barrière

Surface recouverte par la monocouche

Cuve contenant la sous-phase

19) Figure 2-3 Illustration schématique d’une balance de Langmuir. (Adaptée de

Il existe plusieurs techniques pour mesurer la pression de surface. La plus

couramment utilisée pour les films de Langmuir est la méthode de Wilhelmy.20 Cette

méthode consiste à déterminer les forces agissant sur une plaque suspendue et partiellement

immergée dans la sous-phase. Trois forces agissent sur la plaque : le poids de la plaque, la

poussée d’Archimède, qui consiste au poids du volume d’eau déplacé par la plaque et aussi

18 la force de surface qui est en fait le poids du ménisque. Les différents paramètres

dimensionnels d’une plaque de Wilhelmy sont illustrés à la Figure 2-4. La procédure

habituelle pour l’utilisation d’une balance de Wilhelmy exige de maintenir la plaque bien

mouillée par le liquide. L’angle de contact (θ) doit être inférieur à 90° et même se

rapprocher le plus possible vers 0°. La hauteur de la plaque (h), ou plutôt le niveau de la

sous-phase, doit aussi rester constante. Il est important que la plaque soit très mince, que

son épaisseur (t) soit négligeable par rapport à sa largeur (w). De cette façon, la force nette

résultante correspond à la réduction de la tension de surface du liquide pur par le film, ou

plus précisément à la pression de surface telle qu’exprimée par l’équation 2.2. Lorsque des

molécules s’adsorbent sur la plaque, celle-ci mouille moins bien, ce qui modifie l’angle θ.

Des plaques de platine, de quartz, de mica et de verre sont vendues commercialement à cet

effet. Des papiers filtres peuvent aussi être utilisés comme plaque de Wilhelmy. Ils ont

l’avantage de diminuer les risques de contamination puisqu’un nouveau papier filtre est

utilisé pour chaque essai.

t

Figure 2-4 Vue en perspective d’une plaque de Wilhelmy partiellement immergée dans l’eau.

θ

Air Eau

w

h

19 Isotherme

Les propriétés d’une monocouche insoluble à l’interface air-eau peuvent être mises

en évidence par un tracé appelé diagramme de phase isotherme. Afin d’alléger le texte et

d’être cohérent avec la terminologie utilisée dans la littérature, nous emploierons ici que le

mot isotherme. Un isotherme est obtenu par la compression du film, c’est-à-dire par la

diminution à vitesse constante de l’aire moléculaire par les barrières et par l’enregistrement

simultané de la pression de surface. L’acquisition se fait à température constante. Plusieurs

facteurs peuvent modifier l’aspect d’un isotherme, notons entre autres les propriétés

physiques et chimiques des molécules amphiphiles, la vitesse de compression, la

température et la composition de la sous-phase. Des isothermes typiques d’une

monocouche d’acide gras et de phospholipide sont présentés à la Figure 2-5.

Collapse

Pre

ssio

n de

sur

face

(m

N/m

)

S S

L2

L1-L2

L1L1

G-L1 G-L1

Aire moléculaire (Å2/molécule)

Figure 2-5 Isothermes caractéristiques pour une monocouche d’acide gras (gauche) et de phospholipide (droite).

Les isothermes renseignent sur la stabilité des monocouches à l’interface air-eau,

sur la réorientation moléculaire dans un système à deux dimensions et également sur les

20 changements de phases. Une transition de phase est marquée par une discontinuité de

l’isotherme. En 1952, W. D. Harkins21 a proposé une terminologie pour classifier les

différentes phases d’un film d’acide gras. Cette classification est toujours utilisée

aujourd’hui et peut être employée pour d’autres types de molécules que les acides gras.

Après l’étalement d’un film et au début de sa compression, les molécules se retrouvent à

l’équilibre entre deux phases, la phase gazeuse (G) et la phase liquide expansé (L1). Les

molécules sont alors très distancées les unes des autres. Dans cette phase, la diminution

importante de l’aire moléculaire ne crée qu’une faible augmentation de la pression de

surface, le film étant très compressible. La phase gazeuse n’est qu’un terme conceptuel.

Elle n’existe qu’à de très grandes aires moléculaires où il y a très peu d’interactions entre

les molécules étalées. La poursuite de la compression mène à l’atteinte de la phase L1, cette

dernière étant moins compressible que la précédente. Toutefois, les chaînes hydrophobes se

redressent ce qui entraîne une diminution importante de l’aire moléculaire. La phase solide

(S) quant à elle est peu compressible et la monocouche devient très dense. Si le film est

comprimé au-delà de la phase solide, le collapse sera atteint. La pression de collapse (πc)

est la pression de surface la plus élevée à laquelle le film peut être comprimé sans qu’il y ait

apparition de structures tridimensionnelles. Une fois πc atteinte, la pression de surface peut

chuter ou bien une cassure horizontale peut apparaître.

La courbe de droite de la Figure 2-5 présente l’isotherme d’une monocouche de

phospholipide. On remarque un plus grand nombre de phases et également la présence d’un

plateau où la pression de surface est constante. La phase identifiée L2 est appelée liquide

condensé. Les chaînes y sont très orientées et la densité du film est comparable à celle d’un

liquide en trois dimensions. La transition de phase L1-L2 est causée par la présence

simultanée de deux phases à l’équilibre dans le film, c’est-à-dire les phases liquide expansé

et liquide condensé. Cette transition est souvent visible par l’apparition d’un plateau sur la

courbe.

21

2.2 Les films de Langmuir-Blodgett

En 1919, sous la supervision d’Irving Langmuir, Katharine Blodgett a transféré une

monocouche d’acide gras d’une sous-phase d’eau sur une lame de verre. Le terme film de

Langmuir est réservé exclusivement pour les monocouches insolubles d’atomes ou de

molécules étalées à l’interface air-liquide. Lorsque ces films sont déposés sur un support

solide pour former un empilement régulier et très organisé de plusieurs couches, ils portent

le nom de films Langmuir-Blodgett (LB).

L’appareil utilisé pour effectuer un transfert Langmuir-Blodgett est très semblable à

celui employé pour l’étude des films de Langmuir. La cuve doit toutefois être munie d’un

puits rendant possible l’introduction d’un substrat dans la sous-phase et également posséder

un dispositif permettant de fixer et de varier la position du substrat. La pression de surface

est maintenue constante tout au long du transfert par une boucle de rétroaction entre

l’électrobalance qui mesure la pression de surface et le mécanisme de déplacement des

barrières mobiles. Le support solide est trempé verticalement dans la sous-phase comme le

montrent les figures 2-6 et 2-7. La technique Langmuir-Schaeffer (LS) permet aussi le

dépôt de monocouches. Cette seconde technique, moins couramment utilisée, diffère par

l’orientation du solide sur lequel est déposé le film. Habituellement, le substrat est placé

perpendiculairement à la surface de la sous-phase, mais pour la technique LS celui-ci est

plutôt parallèle à la surface.

Les films de Langmuir-Blodgett sont des monocouches ou des multicouches de

molécules amphiphiles hautement organisées. Pour obtenir ces structures, il faut insérer et

retirer de façon successive un substrat solide à travers une monocouche qui sera adsorbée

sur le support. Ce processus peut être répété jusqu’à une centaine de fois. Toutefois,

certains composés se prêtent mal à la formation de multicouches. Différents types de

multicouches LB peuvent être créées et obtenues par dépositions successives de

monocouches sur un substrat. Le plus commun est le type Y schématisé à la Figure 2-6.

Dans ce cas, la déposition a lieu dans les deux directions, les molécules de surfactant ont

une orientation opposée dans chacune des couches monomoléculaires. Lorsque le dépôt n’a

lieu que dans une seule direction, soit lors de l’immersion ou bien de l’émersion du

22 substrat, on appelle ces structures de multicouches, de type X et de type Z respectivement

(Figure 2-7).

Figure 2-6 Déposition Langmuir-Blodgett de type Y. (Adaptée de 23)

BA

23) Figure 2-7 Dépositions de types (A) X et (B) Z. (

Lors des transferts utilisant un substrat hydrophile, celui-ci peut être plongé dans la

sous-phase avant même de faire l’étalement des molécules de surfactant. Toutefois,

lorsqu’il y a présence d’un composé dissous dans la phase aqueuse, il est préférable

d’insérer le substrat seulement au moment de faire le dépôt pour éviter le phénomène

d’adsorption.

23

Il existe plusieurs types de substrat sur lesquels on peut effectuer un transfert en

fonction de l’analyse envisagée. Il est possible de déposer une monocouche sur un cristal de

germanium (Ge), de séléniure de zinc (ZnSe), de silicium (Si) ou encore sur des lames de

verre. Chaque matériau a des propriétés de mouillage différentes. Cependant, des

traitements chimiques appropriés peuvent accroître ou modifier le caractère hydrophile ou

hydrophobe de certains substrats. Une fine couche de métaux, par exemple d’or ou de

chrome, peut aussi être déposée sur le substrat par évaporation.

La qualité du dépôt d’un film sur un substrat peut-être évaluée grâce au taux de

transfert qui est donné par l’équation 2.322,23 où AL correspond à la variation de l’aire

occupée par la monocouche à l’interface air-eau durant le transfert et AS est l’aire du

substrat solide recouverte par le film. Un taux de transfert idéal se traduit par une valeur

près de l’unité. Le film se dépose alors sur le support solide sans modification par rapport à

son état à l’interface air-eau. Une valeur supérieure à 1 implique le dépôt d’une trop grande

quantité de molécules. Le film transféré n’est donc pas une monocouche. Dans le cas d’un

taux de transfert inférieur à l’unité, il n’y a pas assez de molécules pour recouvrir le support

de façon homogène. Pour calculer le terme TR, on doit porter en graphique la position des

barrières en fonction de celle du substrat. Ce type de graphique est montré à la Figure 2-8.

Il est possible de calculer l’aire perdue par la monocouche à la surface (AL) grâce au

déplacement des barrières et à la largeur de la cuve. Quant à l’aire du substrat recouverte

par le film (AS), elle est obtenue à partir de la variation de la position verticale du substrat

et de sa largeur.

R

AT

AL

S

= (2.3)

24

AirEau

Position des barrières (mm)

Pos

itio

n du

sub

stra

t (m

m)

Longueur du substrat sur lequel le film est présent

Déplacement des barrières

AirEau

Position des barrières (mm)

Pos

itio

n du

sub

stra

t (m

m)

Longueur du substrat sur lequel le film est présent

Déplacement des barrières

Figure 2-8 Graphique de la position du substrat en fonction de la position des barrières lors d’un transfert Langmuir-Blodgett.

Les monocouches à l’interface air-eau ont été étudiées avec une balance de

Langmuir dont le modèle est le KSV-3000 (KSV Instruments, Helsinki, Finlande). Une

cuve de téflon standard (150 x 500 mm) a été utilisée lors des analyses de surfactant

seulement. Dans le cas des essais où il y avait ajout d’acide nucléique dans la sous-phase,

une cuve de plus petite taille a été employée (80 x 500 mm) pour réduire le volume d’acide

nucléique utilisé. Les barrières qui assurent la compression du film sont faites de Delrin®.

Les techniques de Langmuir, Langmuir-Blodgett et les isothermes de compression

sont des outils essentiels à la préparation ainsi qu’à la caractérisation des films de

polymères ADN-mimétiques. Quant à la compréhension de leur organisation, de l’état de

leur surface et de leur composition, des techniques microscopiques et spectroscopiques sont

bien adaptées à ces besoins.

25

2.3 La microscopie à l’angle de Brewster

Le microscope à l’angle de Brewster (Brewster angle microscopy, BAM) permet

l’étude de la morphologie des films de Langmuir in situ à l’interface air-eau. Cette

technique découle des lois de réflexion et réfraction de la lumière à une interface.

Lorsqu’un faisceau incident rencontre l’interface entre deux milieux, celui-ci est réfléchi

avec le même angle par rapport à la normale au point d’incidence. Une partie de la lumière

est également réfractée (transmise) dans le deuxième milieu (Figure 2-9). La direction du

faisceau transmis est donnée par la loi de Snell

ti nn θθ sinsin 21 = (2.4)

où θi est l’angle d’incidence, θt l’angle de réfraction et n1 et n2 les indices de réfraction des

deux médias de part et d’autre de l’interface.

θr θi

n1

Figure 2-9 Lois de la réflexion et de la réfraction de la lumière. Les faisceaux incident et réfléchi forment le même angle par rapport à la normale. Une partie de la lumière sera transmise.

L’intensité de la lumière réfléchie peut être calculée grâce aux équations de Fresnel.

Le coefficient de réflexion (R), que l’on appelle aussi réflectivité, dépend de la polarisation

θt

n2

26 du faisceau incident. Lorsque le vecteur du champ électrique de la lumière est polarisé

parallèlement au plan d’incidence, Rp est donné par l’équation suivante :

2

21

21p )cos()cos(

)cos()cos(R

+−=

it

it

nn

nn

θθθθ

(2.5)

Il existe un angle bien précis pour des indices de réfraction donnés où la valeur de

Rp sera nulle, c’est-à-dire que le faisceau incident ne subit aucune réflexion. La lumière est

alors complètement transmise dans le substrat. Cet angle, qui a été observé en 1815 par Sir

David Brewster, découle de la loi de Snell. L’angle de Brewster (θB) est défini par les

indices de réfraction des deux milieux (équation 2.6). À l’interface air-eau (n1 = 1;

n2 = 1,33), la lumière polarisée parallèlement est complètement réfractée pour un angle

d’incidence de 53,06°. La Figure 2-10 montre bien que la valeur de Rp est nulle à cet angle,

tandis que pour la polarisation perpendiculaire, le pourcentage de réflectivité (Rs) ne sera

jamais nul. Si un film mince est présent à l’interface air-eau, les conditions de l’angle de

Brewster pour ces deux milieux ne sont plus respectées. Une monocouche organique a un

indice de réfraction d’environ 1,45.24 L’angle de Brewster pour l’interface air-film est donc

déplacé à un angle d’incidence de 55,41° (Figure 2-11). La présence d’un film engendre

donc la réflexion de la lumière sur les deux interfaces (film/eau et air/film) et également à

l’intérieur même du film. Tous ces faisceaux se superposent et produisent un signal

pouvant être détecté (Figure 2-12).

1 2

1

tanB

n

nθ −

=

(2.6)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 900

10

20

30

40

Coe

ffic

ient

de

réfle

ctio

n (%

)

Angle d'incidence (°)

Rp

Rs

Ang

le d

e B

rew

ste

r (θ

B)

27

Figure 2-10 Graphique présentant le pourcentage des coefficients de réflexion pour les deux polarisations du champ électrique en fonction de l’angle d’incidence pour l’interface air-eau. Rp est nulle à un angle d’incidence de 53,06°.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

-10

-8

-6

-4

-2

0

Log

Rp

Angle d'incidence (°)

Eau pure Film

Figure 2-11 Logarithme de Rp en fonction de l’angle d’incidence permettant de voir le déplacement de l’angle de Brewster pour l’interface air-eau (53,06°) et air-film organique (55,41°).

28

B A

Figure 2-12 Une lumière polarisée parallèlement avec un angle d’incidence correspondant à l’angle de Brewster pour l’interface air-eau (53,06°) (A) ne subit aucune réflexion sur une sous-phase d’eau pure. Toutefois, (B) lorsqu’une monocouche est présente à cette interface, une partie de la lumière est réfléchie.

La Figure 2-13 est une représentation schématique d’un microscope à l’angle de

Brewster. Un laser émet la radiation incidente qui est polarisée parallèlement au plan

d’incidence. Avant de faire l’étalement du film organique, l’angle sous lequel aucune

réflexion n’est produite est ajusté grâce à un goniomètre. Lorsque le film est présent, la

radiation réfléchie est captée par un objectif et un scanneur. Ces deux éléments permettent

un grossissement de l’image et aussi qu’elle soit focalisée. Le faisceau traverse ensuite un

second polariseur (analyseur) qui permet de visualiser des domaines anisotropes. Par sa

rotation on peut inverser les contrastes. Il est donc possible de distinguer un contraste

produit par anisotropie de la monocouche plutôt que par une différence de densité ou

d’épaisseur dans un film isotrope. Le bras de l’analyseur contient une caméra CCD

permettant de détecter la radiation dont l’intensité réfléchie dépend de l’épaisseur du film et

de son indice de réfraction. Le signal de réflectivité provenant de l’échantillon étudié est

converti en image vidéo par la caméra CCD. Il est exprimé selon une intensité de niveau de

gris. La variation s’étale sur 256 paliers de niveaux de gris. Les valeurs varient entre 0 pour

une image complètement noire, et 255 pour une image très claire. Cette échelle est une

mesure relative de la réflectivité d’une monocouche par rapport à celle de la sous-phase en

absence d’un film. Par l’augmentation de la luminosité du signal, il est possible de suivre

l’épaississement et l’augmentation de la densité d’un film à une seule phase. Il est

également possible de visualiser la forme et la taille des domaines grâce à la différence de

Film Eau

Air θB

θB

29 contraste. La résolution latérale se situe entre 1 et 2 µm, en fonction du grossissement de

l’objectif du scanneur.

Figure 2-13 Schéma d’un microscope à l’angle de Brewster.

L’appareil utilisé provient de la compagnie Nanofilm Surface Analysis (Halcyonics

GmbH). La source laser émet à une longueur d’onde de 532 nm et est du type Nd-YAG.

Elle a été utilisée à une intensité de 50 %. L’objectif employé a un grossissement de 10X et

le pouvoir de résolution du microscope est de 2 µm. Après avoir fait une correction

géométrique, les images ont une largeur de 430 µm et une hauteur d’environ 537 µm. La

hauteur varie en fonction de l’angle de Brewster déterminé pour la sous-phase étudiée. La

cuve de Langmuir dont est muni le microscope est fournie par la compagnie Nima

Technology.

2.4 La spectroscopie infrarouge de réflexion totale atténuée

La spectroscopie infrarouge (IR) est une technique d’analyse largement employée.

Elle permet entre autres de confirmer la présence de groupements fonctionnels.

L’absorption de rayonnement infrarouge engendre une transition entre les différents

niveaux d’énergie moléculaire de vibration. Pour qu’une molécule puisse absorber cette

radiation, ses mouvements de vibration doivent modifier son moment dipolaire. La

variation du moment dipolaire est un phénomène qui peut interagir avec le champ

Analyseur

Goniomètre

Caméra Laser Polariseur

Objectif/Scanneur

Goniomètre

30 électrique incident. Si la fréquence de l’onde incidente est la même que celle de la vibration

moléculaire, un transfert d’énergie a lieu et l’amplitude du mouvement est modifiée, il y a

absorption de l’onde.

L’interaction de la radiation avec la matière peut être mesurée selon différentes

techniques de transmission ou de réflexion. Pour l’étude des films ultraminces, la

spectroscopie de réflexion totale atténuée (Attenuated Total Reflection, ATR) est l’une des

techniques les mieux adaptées.25 Avec seulement quelques microgrammes d’échantillon,

l’ATR permet d’obtenir des spectres avec un bon rapport signal sur bruit en raison des

réflexions multiples à l’intérieur du cristal (Figure 2-14). Le faisceau infrarouge doit entrer

dans le cristal d’indice de réfraction élevé et transparent aux rayons IR avec un angle

supérieur à l’angle critique. L’angle critique (αc), tel que présenté à l’équation 2.7, dépend

des indices de réfraction des deux milieux traversés par la radiation, soit l’élément de

réflexion interne (n1) et le milieu externe (n2).

Figure 2-14 Schéma de la propagation de la radiation à l’intérieur d’un cristal ATR ainsi que le système d’axes utilisé pour caractériser l’orientation moléculaire des films de symétrie uniaxe déposés.

2

1

sin c

n

nα = (2.7)

31

Lorsque le faisceau IR traverse le cristal, plusieurs réflexions internes ont lieu à

l’intérieur de celui-ci. Le signal détecté est amplifié grâce à une superposition des ondes

entrantes et réfléchies. L’amplitude du champ électrique subit une variation sinusoïdale à

l’intérieur du cristal. Lorsque cette onde traverse l’interface de réflexion vers le milieu le

moins dense, elle connait plutôt une décroissance exponentielle (Figure 2-15). Cette partie

de l’onde qui franchit la surface du cristal est appelée onde évanescente. L’échantillon

interagit avec la radiation infrarouge grâce à cette onde. À un angle d’incidence donné, la

profondeur de pénétration varie selon la longueur d’onde (équation 2.8). Plus la longueur

d’onde est élevée (plus faible nombre d’onde), plus importante est la pénétration de l’onde

dans l’échantillon déposé à la surface du cristal. C’est donc le phénomène d’onde

évanescente qui est exploité pour caractériser les films ultraminces.

Figure 2-15 Vue de côté d’un cristal ATR à l’intérieur duquel on voit l’existence d’un champ électrique de la radiation électromagnétique au point de réflexion. À l’extérieur du cristal, l’onde évanescente décroit exponentiellement.

2212 sin i

dpn

λπ θ

=−

2

(2.8)

32 Calcul de l’orientation moléculaire

La spectroscopie ATR permet également de caractériser l’orientation moléculaire

puisque la méthode est basée sur le fait que l’absorption maximale du faisceau IR a lieu

lorsque le moment de transition du dipôle est parallèle au champ électrique qui compose la

lumière incidente. Le système d’axes utilisé pour déterminer l’orientation moléculaire est

défini à la Figure 2-14 présentée précédemment. L’information sur l’orientation des dipôles

peut être obtenue grâce au rapport dichroïque (RATR)

ATR

AR

A⊥

= ll (2.9)

qui est, pour une bande sélectionnée, le rapport entre l’absorbance mesurée avec une

radiation polarisée parallèlement ( ) et perpendiculairement ( ) au plan d’incidence. À

partir du rapport dichroïque et du carré des amplitudes moyennes des champs électriques de

l’onde évanescente dans le film selon les trois dimensions (Ey2, Ex

2 et Ez2), on tire le

paramètre d’ordre

All A⊥

γ2P qui est la valeur moyenne de la distribution de l’orientation du

moment de transition étudié par rapport à la normale du film (axe z). Le moment de

transition est illustré sur le schéma de la Figure 2-14 par le vecteur bleu (M). Ce terme peut

être calculé par l’équation suivante26 :

2 2 2ATR y x z 2

2 2 2 2ATR y x z

R E E E 1P

R E E 2E 2γ γ− −

= =− +

(3cos 1)− (2.10)

Les champs électriques ne sont pas équivalents selon les trois directions et ils

peuvent être calculés en utilisant entre autres les équations approximatives des films

ultraminces de Harrick.27,28 Si le moment de transition du dipôle a une distribution

infiniment étroite par rapport à la normale, on peut calculer l’angle γ à partir de la valeur du

paramètre d’ordre donné. Ainsi, lorsque le terme γ2P est égal à l’unité, l’angle γ est nul.

Le moment de transition est donc parallèle à l’axe z. Au contraire, lorsque sa valeur est de

-0,5, le moment de transition est orienté perpendiculairement à la normale. Et lorsque γ2P

33 a une valeur de 0, le vecteur M est, soit orienté aléatoirement par rapport à la normale

indiquant donc que le film est isotrope, ou bien orienté à un angle de 54,7°.

Si l’on connait l’angle β, qui est l’angle entre le vecteur du moment de transition et

l’axe de la chaîne (C) et si l’on suppose une symétrie cylindrique de la molécule par rapport

à l’axe de la chaîne, il est possible d’obtenir le paramètre d’ordre de l’axe de la chaîne par

rapport à la normale du cristal, θ2P (équation 2.11). Et si l’on fait l’hypothèse que cette

distribution est étroite, on peut exprimer la valeur de l’angle d’inclinaison (θ) de la chaîne

par rapport à z en utilisant l’équation 2.12. Le système présenté à la Figure 2-14 est uniaxe,

l’axe C n’a aucune orientation dans le plan xy, son orientation est seulement définie par

rapport à l’axe z.

2

22

PP

P (cos )γ

θ β= (2.11)

2

2

2 P 1arcos

3P (cos ) 3γθβ

= + (2.12)

Deux spectromètres ont été utilisés pour cette étude, soit le Magna-IR 560 et le

Magna-IR 760 de la compagnie Thermo-Nicolet Instrument inc. (Madison, WI). Ces deux

appareils sont équipés d’un détecteur MCT (tellurure de mercure-cadmium). Les

spectromètres sont purgés en continu avec de l’air sec. Un accessoire ATR vertical (Harrick

Scientific, Ossining, NY) permet de placer les cristaux et leurs supports dans le bon angle

par rapport au faisceau incident (45°). Un polariseur rotatif de ZnSe (Specac, Orpington,

UK) a été placé devant l’échantillon dans le cas où des mesures de l’orientation ont été

effectuées. Les spectres ATR ont été enregistrés avec une résolution de 4 cm-1 et une

acquisition de 1000 interférogrammes a permis d’obtenir un bon rapport signal sur bruit.

Un spectre de référence du cristal sans dépôt est toujours enregistré après celui de

l’échantillon. Les cristaux ATR sont des parallélogrammes (50 x 20 x 2 mm) dont les deux

surfaces latérales sont taillées à un angle de 45°. Ils sont faits de germanium (n1 = 4,0) et

34 permettent 24 réflexions internes. Le traitement des données spectroscopiques a été réalisé

avec le logiciel Grams AI (Thermo Galactic Industries, Salem, NH). Les calculs de

l’orientation moléculaire ont été réalisés à partir d’un programme basé sur les équations de

Harrick et conçu au laboratoire du professeur Michel Pézolet de l’Université Laval.

2.5 La spectroscopie de photoélectrons X

Le principe de la spectroscopie de photoélectrons X (X-ray Photoelectron

spectroscopy, XPS) consiste à analyser en énergie cinétique les électrons photoémis par un

échantillon soumis à l’irradiation d’un faisceau monoénergétique de photons X. La Figure

2-16 illustre ce concept.

Figure 2-16 Principe de la spectroscopie de photoélectrons X. (29)

L’énergie de liaison El qui caractérise un électron d’un niveau électronique donné

est directement accessible par la relation de conservation de l’énergie suivante :

(2.13) lE hv E= − cin

où hv est l’énergie excitatrice fixée et Ecin est l’énergie cinétique mesurée. Les électrons des

couches électroniques de cœur ou de valence, dont l’énergie de liaison est inférieure à hv,

35 pourront être expulsés de l’orbitale. Cela permet d’obtenir le diagramme des énergies

électroniques. Le spectre des énergies de liaison des électrons de cœur est caractéristique de

l’atome et de l’orbitale d’où sont émis les électrons. Il est donc possible d’identifier et de

quantifier un atome dans un matériau. L’énergie de liaison d’un électron ne dépend pas

seulement du niveau d’où provient la photoémission. Il est bien connu qu’une modification

de l’état d’oxydation ou de l’environnement chimique et physique de l’atome provoque un

faible déplacement chimique des pics du spectre de l’ordre de l’électronvolt.

La spectroscopie de photoélectrons est une technique d’analyse qui permet

d’identifier tous les éléments chimiques à l’exception de l’hydrogène et de l’hélium qui

n’ont pas de niveaux de cœur. Puisque chaque élément a un nombre important de raies qui

lui sont associées, son identification est assez simple. Lors d’une analyse quantitative, ce

n’est pas le nombre absolu de photoélectrons qui est mesuré, mais plutôt la concentration

relative d’un élément par rapport aux autres constituants de l’échantillon dont

l’enregistrement a été fait simultanément. Une comparaison quantitative peut également

être faite entre des échantillons différents, mais ils doivent avoir été mesurés dans des

conditions expérimentales identiques. Pour la plupart des échantillons analysés, cette

technique n’est pas destructrice. Toutefois, certains matériaux comme les polymères se

dégradent sous l’effet du faisceau de rayons X. Le faible libre parcours moyen des électrons

dans la matière limite la profondeur analysée à une couche très mince dont l’épaisseur varie

de quelques angströms à une dizaine de nanomètres. Notons toutefois qu’il est possible de

faire varier la profondeur analysée grâce à des mesures angulaires qui consistent à faire

pivoter l’échantillon par rapport à la direction de détection (analyseur). Ce changement

d’angle permet entre autres d’établir un profil de concentration ou au contraire de confirmer

l’homogénéité de la section sondée. Pour une évaluation quantitative, l’homogénéité de

l’échantillon constitue une limitation pour cette technique, il faut donc toujours faire une

hypothèse sur la répartition des éléments dans l’échantillon.

Un spectromètre de photoélectrons est constitué de différents éléments, soit d’une

source de photons X, d’un analyseur à électrons, d’un système de détection et de comptage

et également d’enceintes maintenues sous vide (Figure 2-17). Les appareils s’opèrent à des

pressions de l’ordre de 10-10 Torr pour éviter la diffusion des électrons et la contamination

36 de la surface par les gaz contenus dans l’air ambiant. Les sources X les plus courantes sont

des tubes à anode de magnésium ou d’aluminium. Pour atteindre une résolution de l’ordre

de 0,2–0,3 eV, on peut rendre ces sources de photons monochromatiques, généralement on

procède avec la raie AlKα. La sélection des photoélectrons selon leur énergie est réalisée

par un analyseur qui est dans la plus part des appareils un système dispersif du type

condensateur hémisphérique à double focalisation à 180°. La différence de potentiel

appliquée entre les deux électrodes hémisphériques définit l’énergie de passage des

électrons. Ainsi, seuls les électrons ayant une énergie cinétique comprise dans un certain

domaine par rapport à cette énergie de passage arrivent au détecteur positionné à la fente de

sortie du spectromètre. La détection est habituellement faite par un multiplicateur

d’électrons.

Figure 2-17 Schéma des principales composantes d’un spectromètre de photoélectrons. (Adaptée de 29)

Les mesures ont été effectuées au Laboratoire d’analyse de surface du département

de génie chimique de l’Université Laval par Monsieur Alain Adnot, Ph.D. Le spectromètre

à photoélectrons utilisé provient de la compagnie Kratos et le modèle est Axis Ultra. La

source de rayons X est une anode d’aluminium (AlKα) monochromatique avec un canon de

neutralisation pour l’analyse des échantillons électriquement isolants.

37

2.6 La microscopie à force atomique

Les microscopes à balayage par sonde (Scanning Probe Microscope, SPM)

permettent de mettre en évidence les détails du relief d’une surface à l’échelle atomique.

Les deux types de microscopes à balayage par sonde les plus utilisés sont le microscope à

balayage à effet tunnel (Scanning Tunneling Microscope, STM) et le microscope à force

atomique (Atomic Force Microscope, AFM). Le microscope AFM a été développé en 1986

par G. Binning, C. F. Quate et C. Gerber et contrairement à la STM, cette technique permet

d’imager des surfaces conductrices ainsi qu’isolantes.

En microscopie à force atomique, la surface de l’échantillon est balayée par une

pointe fixée sur un bras de levier flexible. Les forces d’attraction et de répulsion entre la

pointe et la surface de l’échantillon entraînent de faibles fléchissements du levier. Ces

variations sont détectées par un système optique et conduisent à fournir l’information

topographique de la surface à l’étude.

Il existe trois modes différents de travail de la pointe analytique du microscope, soit

le mode non-contact, le mode contact et le mode contact intermittent (Figure 2-18). Pour

définir ce dernier mode, on utilise habituellement le terme anglais tapping. Le mode

non-contact utilise les forces d’attraction entre la pointe et la surface, tandis que le mode

contact fait intervenir les forces de répulsion. Ce mode peut déformer l’échantillon en

raison du contact permanent de la pointe avec la surface et d’une force trop élevée

appliquée sur la pointe. Cela a pour effet de fournir une image distordue. Pour contrer ce

problème qui est particulièrement important pour les polymères, les films minces et les

échantillons biologiques, il est préférable d’utiliser le mode tapping.

Figure 2-18 Différents modes de travail de la pointe : mode non-contact, contact et contact intermittent (tapping). (30)

38

Ce mode nécessite la présence d’un deuxième piézoélectrique permettant un

déplacement selon l’axe z en plus de celui permettant un mouvement selon le plan xy. Il

peut être fixé au levier ou sous l’échantillon. Dans le type d’appareil utilisé pour nos

travaux, le levier est fixe et c’est l’échantillon qui se déplace sous la pointe pour analyser la

topographie (Figure 2-19). Ce mode se caractérise par l’oscillation du levier à une

fréquence de quelques centaines de kilohertz, cette valeur est suffisamment élevée pour

contrer les forces d’adhésion. Le levier oscille près de sa fréquence de résonance avec une

amplitude constante. C’est cette oscillation qui sera modifiée en réaction à la topographie

de la surface. L’image topographique est obtenue par le suivi de ces changements grâce à

une boucle de rétroaction. Un laser est réfléchi sur le levier et un détecteur photodiode

permet de déterminer si l’amplitude de l’oscillation du levier a changé par rapport à la

valeur fixée. Dans l’affirmative, un signal est envoyé au piézoélectrique (z) pour déplacer

l’échantillon afin de garder la déflexion du levier constante.

Figure 2-19 Principe du mode tapping en AFM. (Adaptée de 30)

Le mode tapping permet l’enregistrement simultané de trois types d’images. Dans le

premier type, le signal exprimé en tension électrique est converti en hauteur, on obtient

alors une image qui montre la hauteur des aspérités de la surface. On peut également

enregistrer des images en amplitude. Ce deuxième mode de visualisation consiste en la

39 dérivée du signal de hauteur, il introduit un plus grand contraste sur le rebord des structures

observées. Le dernier mode permet d’obtenir des images en phase. Il consiste à imager le

décalage de la phase de l’oscillation du levier par rapport à celle du signal périodique

envoyé pour créer cette oscillation. C’est le changement de propriétés dans l’échantillon qui

entraîne un déphasage. Par exemple, la variation de la viscoélasticité, de la composition, de

l’adhésion ou encore de la friction peuvent être mises en évidence dans une image en phase.

L’unité de hauteur dans ce cas-ci est exprimée en degrés.

Les images de microscopie à force atomique ont été obtenues avec l’appareil

MultiMode Scanning Probe Microscope de la compagnie Digital Instruments. Toutes les

images ont été enregistrées avec le scanneur E modèle AS-12V (Digital Instruments) dont

la zone de balayage maximale est de 10 x 10 µm. Les pointes utilisées (NSC15/AIBS) ont

été achetées chez MikroMasch. La surface supérieure de leur levier est recouverte

d’aluminium pour permettre une meilleure réflexion du laser vers le détecteur.

2.7 La microscopie à fluorescence

La fluorescence appartient aux phénomènes de luminescence, plus particulièrement

à la photoluminescence.31 Il s’agit d’un phénomène radiatif (émission de photons)

consécutif à une excitation lumineuse. La fluorescence est une propriété que possèdent

certaines substances chimiques que l’on appelle fluorophores. Lorsque ceux-ci sont irradiés

par une radiation de courte longueur d’onde, une partie des photons est absorbée et ensuite

réémise sous forme de lumière. Ce processus d’absorption et d’émission a été décrit par Sir

George Stokes en 1852.

Pour un fluorophore en solution, il est possible d’obtenir un spectre d’excitation et

d’émission de fluorescence. Ce type de spectre s’avère très utile pour choisir un

fluorophore ou pour déterminer les conditions expérimentales. Le maximum d’intensité de

fluorescence émise est indépendant de la longueur d’onde excitatrice. Toutefois, l’intensité

varie en fonction de l’intensité du spectre d’excitation pour la longueur d’onde donnée

(Figure 2-20). La symétrie des spectres d’excitation et d’émission de fluorescence est

expliquée par la relaxation vibrationnelle.

40

Figure 2-20 Spectre typique d’absorption et d’émission de fluorescence d’un fluorophore. (Adaptée de 32)

Un des appareils utilisés pour détecter la fluorescence est le microscope à

fluorescence. Un schéma simplifié de cet appareil est présenté à la Figure 2-21. Il s’agit ici

d’un microscope à épifluorescence puisque l’illumination est du même côté que l’objectif.

Dans d’autres instruments, la source lumineuse peut se trouver sous le spécimen. La

fonction de base du microscope à fluorescence est d’irradier un échantillon avec une bande

spécifique de longueurs d’onde puis de séparer le mieux possible l’émission de

fluorescence de la lumière d’excitation. La source de radiation excitatrice peut être par

exemple une lampe à filament de tungstène, un arc au xénon ou bien un laser. Une bande

étroite du spectre lumineux est sélectionnée grâce à un filtre d’excitation et le faisceau est

réfléchi vers l’échantillon grâce à un miroir dichroïque. Ce dernier est un filtre

d’interférence qui réfléchit la fenêtre de longueurs d’onde sélectionnées et laisse passer les

longueurs d’onde plus longues. Il est placé à 45° par rapport au faisceau d’excitation qu’il

renvoie par réflexion à 90° vers l’échantillon. Puisque la longueur d’onde d’émission est

supérieure à celle d’excitation, le rayonnement fluorescent pourra traverser le miroir

dichroïque pour être ensuite isolé par un filtre barrière. Les filtres d’excitation et d’arrêt

ainsi que le miroir dichroïque constituent une pièce interchangeable de l’appareil que l’on

appelle bloc et elle peut donc être choisie en fonction du fluorophore utilisé.

41

Figure 2-21 Schéma du principe d’un microscope à fluorescence.

Plusieurs plantes ou tissus animaux émettent de la fluorescence lorsqu’ils sont

irradiés par de courtes longueurs d’onde. Ce phénomène est appelé autofluorescence ou

bien fluorescence primaire. La fluorescence secondaire fait intervenir des fluorophores

extrinsèques. La plupart de ces composés fluorescents sont des molécules aromatiques.

Malgré le fait que l’ADN possède des bases puriques et pyrimidiques qui sont des

groupements aromatiques, cette molécule n’émet pas de fluorescence. Il existe toutefois

une variété de fluorophores pouvant se lier spontanément à l’ADN : l’acridine, le bromure

d’éthidium et les espèces cationiques planes. Ce sont des intercalants qui s’insèrent entre

deux plans de paires de bases. Il existe également des sondes fluorescentes qui peuvent

marquer les macromolécules.

Les observations de nos matériaux par microscopie à fluorescence ont été faites

avec deux appareils. Tout d’abord celui du Laboratoire de microscopie de l’Institut de

42 biologie intégrative et des systèmes de l’Université Laval, le microscope LSM 310 fabriqué

par Zeiss. Cet appareil permet des observations en modes fluorescence et confocal. Sa

source excitatrice est un laser d’une longueur d’onde de 488 nm et elle est munie de filtres

d’émission entre 515 et 565 nm pour le mode confocal et 485/535 nm pour le mode

fluorescence. Nous avons bénéficié de l’aide de Monsieur Richard Janvier pour ces

analyses. Le second microscope utilisé est celui du Laboratoire du professeur Christian

Salesse du département d’ophtalmologie de la Faculté de médecine de l’Université Laval.

Le modèle de l’appareil est le UM-2 de la compagnie Nikon. Le faisceau d’excitation est

produit par une lampe à arc au mercure (HBO 100 W/2, Osram). L’ensemble de filtres

choisi est le bloc filtre B2-A de Nikon. Son filtre d’excitation est une bande passante de

420 à 490 nm alors que son filtre d’émission est un filtre passe-haut à 520 nm. Ce

microscope est également muni d’un miroir dichroïque passe-haut à 500 nm et d’une

caméra CCD (C2400-09, Hamamatsu). Nous avons bénéficié cette fois de la collaboration

de Monsieur Mario Méthot.

Chapitre 3

Étude in situ à l’interface air-eau des complexes surfactant cationique-ADN

3.1 Description et préparation du matériel

La description et la préparation du matériel présentées ici s’appliquent pour les

chapitres 3, 4 et 5 de ce mémoire. Les nucléolipides et monomères seront décrits au

chapitre 5.

Surfactants

Les surfactants cationiques choisis pour la première stratégie de ce projet sont

l’octadécylamine (ODA) et le bromure de diméthyldioctadécylammonium (DODAB). Ce

sont tous deux des amines amphiphiles insolubles, une primaire et l’autre quaternaire.

Leurs structures sont montrées à la Figure 3-1 et 3-2. Ils ont été achetés chez Sigma Aldrich

(St-Louis, MO, USA) et ont été utilisés sans purification supplémentaire.

Figure 3-1 Structure moléculaire de l’octadécylamine (ODA); CH3(CH2)17NH2.

44

Figure 3-2 Structure moléculaire du bromure de diméthyldioctadécylammonium (DODAB); [CH3(CH2)17]2NBr(CH3)2.

Acides nucléiques

Différents types d’acides nucléiques ont été utilisés dans le cadre de nos travaux. La

majorité des essais ont été réalisés avec des oligonucléotides de 30 bases identiques, soit

d’adénine, dA30 ou bien de thymine, dT30. Nous avons préféré employer des brins

composés d’un seul type de base azotée afin de simplifier les résultats et de rendre plus

facile leur interprétation. Des oligomères dont la séquence est composée de 30 bases ont été

privilégiés puisque cette longueur est du même ordre de grandeur que celle déjà utilisée au

niveau de l’approche antisens. En ce qui concerne le domaine de la détection, la longueur

sélectionnée est supérieure à la longueur minimale nécessaire pour qu’une séquence de

nucléotides soit unique dans le génome de plusieurs organismes. Si la sonde est trop courte,

il est fort possible que sa séquence ne soit pas unique et qu’elle soit répétée à l’intérieur du

génome de l’organisme ou même qu’elle soit présente dans le génome d’un autre

organisme. Au contraire, si la séquence de la sonde est très longue, les chances sont

beaucoup plus élevées que celle-ci soit unique dans le génome donné. Cependant, lorsque

la séquence d’une sonde est longue, les mésappariements sont moins susceptibles de

déstabiliser la formation du double brin, ce qui peut conduire à la détection de faux positifs.

On peut aussi penser que dans le cas du polymère ADN-mimétique, puisque la technique

utilisée vise à hybrider chacun des monomères à un patron d’ADN simple brin pour en

obtenir la séquence complémentaire, la synthèse d’une longue séquence entraînerait un plus

grand risque d’erreur. Les oligonucléotides ont été synthétisés et purifiés par la compagnie

Integrated DNA technnologies-IDT (Coralville, IA, USA). L’échelle de synthèse est de

1 µmole d’oligonucléotide d’ADN et une purification standard a été réalisée. Les

oligonucléotides sont dessalés, déprotégés puis lyophilisés. Lors de leur réception, les tubes

ont été centrifugés pour éviter toute perte de matériel. La remise en suspension a ensuite été

45 effectuée dans de l’eau ultrapure stérile à une concentration au-delà de 100 µM. Pour

s’assurer que celle-ci soit complète, les tubes ont été chauffés à 50 °C dans un bloc

chauffant pendant 10 minutes.33

Le second type d’acide nucléique employé pour quelques expériences est le sel

disodique de l’adénosine 5’-monophosphate (AMP) dont la structure moléculaire est

montrée à la Figure 3-3. Le sel acheté chez Sigma-Aldrich a été tout simplement dissous

dans de l’eau nanopure à la concentration désirée.

Figure 3-3 Structure moléculaire du sel disodique de l’adénosine 5’-monophosphate (AMP).

La troisième classe d’ADN est de source naturelle. Puisque les oligonucléotides

synthétiques sont assez dispendieux, de l’ADN de sperme de saumon (Sigma-Aldrich) a été

employé afin de minimiser les coûts de certaines expérimentations. Ce type d’ADN est reçu

sous forme lyophilisée et ses fragments ont une longueur d’environ 2000 paires de bases. Il

a été remis en solution, fragmenté et dénaturé pour être sous forme monocaténaire et

obtenir des fragments courts de taille semblable à celle des oligonucléotides aussi utilisés.34

Avant utilisation, la fraction aliquote de 1 ml de la solution de stockage d’ADN de sperme

de saumon (10 mg/ml) est préalablement plongée pendant 5 minutes dans de l’eau

bouillante et ensuite directement placée sur un bain de glace pendant cette même période de

temps. Même si une dénaturation a été faite avant la congélation, il est préférable de répéter

cette étape avant l’utilisation. Après quoi, la portion est diluée dans un volume d’eau

46 nanopure ayant subi une stérilisation par autoclave pour obtenir une concentration finale de

5 µg/ml.

De l’ADN lambda (Promega, Madisson, WI, USA) a également été employé. Ce

dernier provient d’un virus appelé Phage Lambda qui infecte la bactérie E. coli. Il s’agit

d’un acide nucléique linéaire double brin formé de 48 502 paires de bases.35 La solution

tampon d’entreposage dans laquelle cet ADN est reçu est : 10 mM Tris-HCl (pH 7,8),

10 mM NaCl, 1 mM EDTA. Il n’a subi aucun traitement supplémentaire.

Pour éviter les cycles gel-dégel répétés, des parties aliquotes ont été préparées pour

tous les types d’acides nucléiques, à l’exception de l’AMP dont une solution fraîche est

préparée pour chaque essai. La température de conservation est de -20 °C pour le stockage

à long terme et de 4 °C pour une période d’au maximum deux semaines.

Les sous-phases sont préparées à partir d’eau purifiée par un appareil Barnstead

Nanopur II (Boston, MA), d’où le terme nanopure employé pour définir ce type d’eau. Le

terme ultrapure sera également utilisé. La résistivité est de 18,2 MΩ/cm et le pH est

d’environ 6,5.

3.2 Préparation des films de Langmuir

Les solutions diluées de surfactant sont préparées à une concentration s’approchant

de 1 mg/ml et le solvant est du chloroforme de qualité HPLC (Laboratoire Mat, QC). Plus

précisément, pour les isothermes de compression et l’étude de stabilité, le volume d’ODA

étalé est de 28 µl pour une solution ayant une concentration de 1,03 mg/ml et celui du

DODAB est de 45 µl (0,89 mg/ml). Pour les études effectuées au BAM, 13 µl (1,23 mg/ml)

de DODAB ont été étalés.

Les sous-phases d’acides nucléiques peuvent être préparées de deux façons

différentes, soit les acides nucléiques sont ajoutés à l’eau nanopure directement dans la

cuve à l’aide d’une seringue, soit la sous-phase contenant l’ADN à une concentration

connue est préparée avant même d’être versée dans la cuve. Les résultats présentés dans ce

chapitre font référence à la première méthode. Celle-ci a été utilisée lorsque des

47 oligonucléotides ou de l’AMP étaient ajoutés. Le volume était prélevé à l’aide d’une

microseringue de 100 µl et injecté à quelques millimètres de la surface de l’eau. La quantité

ajoutée dépend du nombre de molécules de surfactant qui sera étalé, il s’agit d’un ratio de

charge d’environ 15 (ρ−/+). Ce ratio est du même ordre de grandeur que ce qu’on retrouve

dans la littérature.36 La température de la sous-phase est maintenue à 20 ± 1 °C pour

chaque isotherme.

Suite à l’étalement de la solution de surfactant sur la sous-phase, une période

d’attente de 10 à 15 minutes permet l’évaporation du solvant. Pour les isothermes montrés à

la section 3.3.1, le film a été comprimé à un taux de 7,68 x 10-2 nm2/molécule/min dans une

cuve de 100 x 700 mm. Pour les sections 3.3.2 et 3.4, le taux de compression est de

1,25 x 10-1 nm2/molécule/min et les dimensions de la cuve sont de 60 x 500 mm.

L’évolution de la pression de surface est suivie grâce à la méthode de Wilhelmy avec un

papier-filtre.

3.3 Balance de Langmuir

3.3.1 Isothermes de compression et de relaxation de l’ODA et du DODAB

Isothermes de compression

On remarque que les isothermes de compression de ces deux surfactants sont très

différents (Figure 3-4A et Figure 3-5A). L’ODA est très peu compressible et son aire

moléculaire minimale est d’environ 20 Å2/molécule, ce qui correspond bien à la valeur de

l’aire occupée par une chaîne alkyle. Le film de DODAB quant à lui est beaucoup plus

compressible et présente des changements de pente en raison de transitions de phase. L’aire

minimale occupée par une de ces molécules est supérieure à la valeur attendue pour deux

chaînes hydrophobes. Les caractéristiques de cet isotherme seront détaillées un peu plus

loin.

48

20 40 60 80 100 120 140 160 180

0

10

20

30

40

50

0 1000 2000 3000 4000 5000 60000,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

7 mN/m 20 mN/m 30 mN/m

A/A

0

Temps (s)0 20 40 60 80 100

0

10

20

30

40

50

60

X

X

Figure 3-4 (A) Isotherme de compression et (B) isothermes de relaxation à 7, 20 et 30 mN/m d’une monocouche d’ODA.

Figure 3-5 (A) Isotherme de compression et (B) isothermes de relaxation à 7, 20 et 30 mN/m d’une monocouche de DODAB.

Isothermes de relaxation

Avant même de procéder à d’autres analyses, nous nous sommes intéressés à la

stabilité de chacun de ces surfactants. Ce paramètre est très important lorsqu’on procède au

transfert des films sur des supports solides. Il aide entre autres à déterminer la pression de

X

Pre

ssio

n de

sur

face

(m

N/m

)

Aire moléculaire (Å2/molécule)

X

X

0 1000 2000 3000 4000 5000 60000,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

7 mN/m 20 mN/m 30 mN/m

A/A

0

Temps (s)

X

Pre

ssio

n de

sur

face

(m

N/m

)

Aire moléculaire (Å2/molécule)

B A

A B

49 surface à choisir pour le transfert des films. La stabilité peut être évaluée grâce à

l’enregistrement d’isothermes de relaxation. Il s’agit ici de comprimer le film jusqu’à une

pression de surface cible et de suivre la variation de l’aire moléculaire par rapport à la

valeur initiale pour cette pression (A/A0) en fonction du temps. Moins une monocouche est

stable, plus les barrières doivent compresser le film pour maintenir la pression de surface

donnée. Il en résulte donc une diminution de l’aire moléculaire. Le rapport A/A0 a des

valeurs se situant entre 1,00 et 0. La monocouche est renouvelée pour chacune des

pressions de surface ciblée.

Le comportement des isothermes de relaxation des films de surfactants est

directement en lien avec les isothermes de compression et l’on observe qu’il est très

différent pour chaque composé. La Figure 3-4B présente l’isotherme de relaxation d’un

film d’ODA, où l’on voit que plus la pression de surface cible est élevée, plus la

décroissance de l’aire moléculaire est rapide. Ceci est tout à fait normal puisque plus on

approche du collapse, plus le film est instable. Toutefois, si l’on compare la chute de l’aire

moléculaire pour un film d’ODA avec celle du DODAB présentée à la Figure 3-5B, on

constate que la monocouche de DODAB est nettement plus stable. Pour une pression de

surface cible de 30 mN/m après 6000 secondes, le film d’ODA affiche un rapport A/A0 de

0,62 tandis que celui du DODAB est à une valeur de 0,97. Les isothermes de relaxation du

DODAB montrent deux phénomènes. D’abord, entre 0 et 3000 secondes environ il y a

décroissance du rapport A/A0, ce qui peut être causé par une dissolution des molécules dans

la sous-phase ou encore par la formation de couches multiples. La deuxième portion de

l’échelle de temps, de 3000 à 6000 secondes, montre une pente positive pour les pressions

de 7 et 20 mN/m. On peut ainsi penser qu’il y a une diminution des forces de cohésion et

par conséquent une expansion de la monocouche. Ce phénomène n’est pas observé pour

une pression cible de 30 mN/m. Ainsi, en raison de la meilleure stabilité de ses films de

Langmuir, le DODAB a été privilégié pour les analyses subséquentes.

Analyse détaillée de l’isotherme de compression du DODAB

L’isotherme de compression du DODAB présenté précédemment à la Figure 3-5A

peut être analysé par section. Tout d’abord, la première montée de pression de surface est

50 observée à une aire moléculaire d’environ 122 Å2/molécule. Au-delà de cette valeur, le film

se trouve à l’équilibre entre la phase gazeuse et la phase liquide expansé. À une pression de

surface d’environ 16 mN/m, un léger changement de pente est visible dû à une transition de

phase vers l’état condensé. Cette région est beaucoup moins compressible. L’aire minimale

occupée par une molécule est obtenue en extrapolant la pente de la phase solide pour une

pression de surface nulle, ce qui correspond à une aire moléculaire de 75 Å2 par molécule

de DODAB. Cette valeur de l’état le plus comprimé est supérieure à l’aire occupée par

deux chaînes aliphatiques qui est approximativement de 40 Å2. Ceci est une indication qu’il

y a de fortes répulsions entre les têtes cationiques du surfactant. On peut donc en déduire

que les molécules de DODAB sont dissociées et chargées positivement. Ainsi dans ces

conditions, l’association avec un polyélectrolyte négatif est possible. Plusieurs études ont

rapporté des valeurs d’aires moléculaires aussi grandes. 37-40 De plus, aucun plateau

indiquant un changement de la phase liquide expansé vers liquide condensé n’est visible sur

l’isotherme. Quelques isothermes présentés dans la littérature montrent toutefois la

présence d’un plateau de 15 à 20 Å2/molécule de largueur. Il a été démontré que l’existence

et l’étendue de ce plateau dépendent de la température, de la vitesse de compression et aussi

de la composition en sel de la sous-phase.38,39 La présence d’une phase condensée sera

montrée et discutée plus loin grâce à nos travaux en microscopie à l’angle de Brewster. La

pression de surface où a lieu le collapse est identique à celle obtenue par Sun et al.40, soit

43 mN/m.

3.3.2 Isotherme de compression du complexe DODAB-ADN

Avant toute chose, il est important de mentionner ici que l’ADN présente des

propriétés tensioactives très faibles et qu’il s’adsorbe à l’interface air-eau seulement lorsque

la force ionique du milieu est élevée.41 Les isothermes de DODAB étalés sur une sous-

phase d’eau pure et sur une solution aqueuse d’ADN sont montrés à la Figure 3-6. Aucune

incubation n’est nécessaire, la compression du film a donc lieu directement après

l’évaporation du solvant, soit 15 minutes après l’étalement du surfactant.

51

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

0

10

20

30

40

50

60

Pre

ssio

n de

sur

face

(m

N/m

)

Aire moléculaire (Å2/molécule)

eau pure oligonucléotides

Figure 3-6 Isothermes de compression d’une monocouche de DODAB sur une sous-phase d’eau pure avec et sans dA30.

La présence d’oligonucléotides dans la sous-phase modifie l’isotherme de

compression du DODAB. Celui-ci est déplacé vers des aires moléculaires plus grandes.

L’ADN étant un biopolyélectrolyte chargé négativement, il peut donc s’adsorber à

l’interface air-eau à un surfactant cationique et former ainsi un complexe électrostatique.

Puisqu’il y a diminution de l’effet de répulsion des charges, on s’attend à une diminution de

l’aire occupée par les molécules de DODAB. Toutefois, on observe que l’interaction avec

l’ADN entraîne une augmentation de l’aire moléculaire. Les charges négatives de l’ADN

sont positionnées sur le squelette à une certaine distance, elles forcent par conséquent les

molécules cationiques à être plus distancées que lorsque celles-ci sont sur une sous-phase

d’eau pure. Il en découle des changements dans la densité de la monocouche de surfactant.

Le comportement observé ici, c’est-à-dire le déplacement de l’isotherme vers de plus

grandes aires moléculaires, concorde avec ce qui est rapporté dans littérature pour des

études semblables visant la complexation d’une monocouche cationique et de l’ADN.42,43

On note également une modification d’inclinaison de la courbe vers 91 Å2/molécule. De

plus, la présence d’ADN dans la sous-phase semble augmenter la stabilité du film puisque

la pression de surface du collapse est passée de 43 à 58 mN/m. Il faut toutefois se garder

52 une réserve quant à ce dernier résultat puisque la pression de surface d’un collapse n’est pas

toujours reproductible.

3.4 BAM

Les isothermes de compression ont révélé une adsorption non spécifique entre le

surfactant cationique et l’ADN, ce qui est noté par un décalage de l’aire moléculaire. Pour

visualiser maintenant cet effet de l’ADN sur la monocouche de DODAB, la microscopie à

l’angle de Brewster a été utilisée.

3.4.1 Monocouche de DODAB

Les images BAM sont obtenues simultanément à l’enregistrement d’un isotherme.

Les images présentées à la Figure 3-7 font référence aux pressions de surface et aux aires

moléculaires de l’isotherme de compression du DODAB de la Figure 3-5A. Une

monocouche de ce surfactant a d’abord été caractérisée sur une sous-phase d’eau nanopure

dans le but d’établir une référence.

B A

C D

Figure 3-7 Images de microscopie à l’angle de Brewster d’une monocouche de DODAB sur une sous-phase d’eau pure à des pressions de surface de (A) 5 mN/m, (B) 20 mN/m, (C) 31 mN/m et (D) 41 mN/m.

53

À basse pression de surface (Figure 3-7A), on peut observer sur les images BAM de

petits domaines circulaires clairs. Plus la monocouche est comprimée, plus la taille et le

nombre de domaines augmentent. Leur aspect prend de plus en plus celui d’une fleur. On

voit aussi à la Figure 3-7C, que la phase entourant les domaines devient plus dense, puisque

le niveau de gris augmente. Il s’agit ici de la phase liquide condensé. Malgré le fait qu’il

n’y a pas de plateau visible dans l’isotherme présenté, il y a bien coexistence des phases

liquide expansé et liquide condensé. Ce phénomène a d’ailleurs déjà été rapporté.40,44

3.4.2 Monocouche du complexe DODAB-dA30

La morphologie du film du complexe DODAB-ADN est très différente de celle du

surfactant seul comme le laisse voir la Figure 3-8. À basse pression de surface, on

n’observe qu’une seule phase homogène. Il y a ensuite apparition de petits domaines

circulaires lorsque la pression de surface augmente. La compression entraîne la formation

d’un film très dense et homogène d’après le niveau de gris qui s’accroît fortement. Les

agrégats à l’aspect de fleur observés pour la monocouche de DODAB sont dans cas-ci

totalement absents.

BA

DC

Figure 3-8 Images de microscopie à l’angle de Brewster d’une monocouche de DODAB sur une sous-phase aqueuse de dA30 à des pressions de surface de (A) 5 mN/m, (B) 20 mN/m, (C) 30 mN/m et (D) 42 mN/m.

54

La technique de la balance de Langmuir ainsi que la microscopie à l’angle de

Brewster ont permis de démontrer qu’il y a bien formation d’un complexe électrostatique

entre le DODAB et des acides nucléiques à l’interface air-eau. Les deux principaux

éléments sont qu’en présence d’ADN dans la sous-phase, l’isotherme de compression est

déplacé vers des aires moléculaires plus grandes et la morphologie du film est changée.

Chapitre 4

Étude sur support solide des complexes surfactant cationique-ADN

Puisque l’association des monomères et la réaction de polymérisation souhaitées

pour la formation de polymères ADN-mimétiques auront lieu sur un support solide, il est

primordial de connaître la composition, l’orientation et la morphologie du film transféré sur

un support solide grâce à la technique Langmuir-Blodgett. Peu d’études à ce jour portent

sur l’analyse des films de DODAB et d’ADN sur support solide puisque leur principale

application est la formation de liposomes pour le transport de médicament in vitro.36,40,45

Donc les études précédentes portaient majoritairement sur la complexation de surfactants

cationiques et d’ADN en solution. La spectroscopie infrarouge de réflexion totale atténuée,

la spectroscopie de photoélectrons X et la microscopie à fluorescence sont les techniques

qui nous semblaient les mieux adaptées et que nous avons privilégiées pour nos travaux

portant sur l’étude du complexe surfactant-ADN sur support solide.

4.1 Préparation des films de Langmuir-Blodgett

Dans un premier temps, les monocouches sont préparées selon la méthode de

Langmuir qui a été décrite précédemment (section 3.2). Les divers paramètres propres au

transfert Langmuir-Blodgett, soit la vitesse de compression, la pression de surface cible, la

56 vitesse de transfert ainsi que le type de substrat employé pour les dépôts présentés dans ce

chapitre seront détaillés à chacune des sections.

Lors des transferts Langmuir-Blodgett comportant des acides nucléiques, certaines

précautions ont dû être prises. L’adsorption des biopolymères aux interfaces solide-liquide

est un phénomène bien connu. Il a été démontré par Gani et al.46 que l’ADN a de l’affinité

pour les surfaces tant hydrophiles qu’hydrophobes selon différents facteurs. Nous avons

donc effectué quelques essais afin de vérifier l’adsorption en fonction du temps

d’incubation. Le temps d’incubation est la période d’attente entre l’étalement du surfactant

sur la sous-phase et la compression du film. La spectroscopie ATR a été la technique la

plus simple et rapide pour fournir l’information recherchée. La sous-phase utilisée a une

concentration de 5 µg/ml d’ADN. Nous avons noté que pour une incubation de

10-15 minutes, en ayant préalablement positionné le substrat dans la sous-phase avant

l’étalement, l’adsorption non spécifique est faible et le rapport d’intensité des bandes

choisies est comparable à celui obtenu pour un substrat inséré dans la sous-phase seulement

au moment du transfert. Pour des périodes d’incubation de plus d’une heure, une quantité

notable d’ADN s’est fixée sur le support de germanium. Il est donc important de limiter le

plus possible le temps d’immersion des substrats dans une sous-phase contenant des acides

nucléiques ou encore d’effectuer des transferts par immersion.

4.2 ATR

La spectroscopie infrarouge de réflexion totale atténuée nous a permis d’obtenir de

nouvelles informations sur les films de complexes déposés sur supports solides. Des études

qualitatives et quantitatives réalisées par cette technique ont démontré la formation du

complexe ainsi que la proportion de chacun de ses composants. L’ATR nous a permis

également de mesurer l’orientation moléculaire d’un film de surfactant et de complexe.

57 4.2.1 Étude qualitative de la composition des films

Préparation des échantillons

Dans un premier temps, il était important de confirmer que le complexe était bel et

bien transféré sur le support solide par la technique Langmuir-Blodgett. Un film de

DODAB et un film du complexe DODAB-ADN sur un cristal de germanium ont donc été

préparés par cette technique. Pour s’assurer d’obtenir un bon signal d’absorbance, des

couches multiples ont été déposées. Le film de DODAB a été comprimé à une vitesse de

10 mm/min, une fois la pression de surface de 30 mN/m atteinte, une période d’attente de

quelques minutes a été laissée pour permettre au film de se stabiliser. Ensuite, cinq

monocouches ont été déposées successivement à une vitesse de transfert de 2 mm/min. Le

substrat était immergé dans la sous-phase d’eau pure dès le début. Ces paramètres de

transfert sont identiques pour le film du complexe, toutefois la façon de procéder est

légèrement différente. Tout d'abord, une monocouche de DODAB est déposée par émersion

du substrat préalablement présent dans la sous-phase. Cette étape rend la surface du cristal

de germanium hydrophobe. Elle permet donc par la suite le transfert par immersion et

éloigne tout risque d’adsorption non spécifique des acides nucléiques. Puis, dans une

seconde expérimentation, quatre couches de complexe DODAB-dT30 sont transférées. Les

films sont ainsi tous composés de cinq couches, toutefois la première couche du film de

complexe n’est formée que du surfactant.

Résultats et discussion

La Figure 4-1 présente les spectres ATR obtenus à partir de ces films et l’attribution

des principales bandes dans les domaines spectraux de 2750 à 3050 cm-1 et de 950 à

1850 cm-1. Dans la région des hautes fréquences, on retrouve pour les deux films les

vibrations d’élongation antisymétrique (νas CH2) et symétrique (νs CH2) des méthylènes à

2918 et 2950 cm-1. Une bande de plus faible intensité présente à 2958 cm-1 est attribuée aux

élongations antisymétriques des groupements méthyle (νas CH3) de la chaîne alkyle. La

région à basse fréquence montre clairement la présence du complexe avec l’ADN. Le

surfactant n’affiche qu’une seule bande caractéristique dans cette région à 1468 cm-1 et elle

58 est associée au mouvement de cisaillement des groupes méthylène (δ CH2). Le spectre du

complexe à la Figure 4-1B (en trait pointillé) montre quant à lui trois bandes spécifiques à

la présence d’oligonucléotides, soit la bande amide I à 1694 cm-1 et les vibrations

d’élongation symétrique (νs PO2-) et antisymétrique (νas PO2

-) des groupements phosphate,

respectivement à 1063 et 1259 cm-1. La bande amide I est causée principalement par la

vibration d’élongation du lien carbonyle (80 %), par la vibration d’élongation du lien C-N

et également par le mode de déformation angulaire du lien N-H de la pyrimidine.

3050 3000 2950 2900 2850 2800 2750

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

νs CH

2

νas

CH2

DODAB DODAB-dT

30

Abs

orba

nce

Nombre d'onde (cm-1)

νas

CH3

1800 1600 1400 1200 1000

0,000

0,004

0,008

0,012

νs PO

2

-ν

as PO

2

-

DODAB DODAB-dT

30

Abs

orba

nce

Nombre d'onde (cm-1)

Amide I

δ CH2

A

B

Figure 4-1 Spectres ATR de films LB ultraminces de DODAB et du complexe de DODAB-dT30 dans (A) la région de 3050 à 2750 cm-1 et (B) la région de 1850 à 950 cm-1.

59

Malgré le même nombre de couches déposées sur les substrats, on peut remarquer

que l’intensité des bandes des vibrations des méthyles et méthylènes sur les deux spectres

n’est pas la même. Cette différence d’intensité est causée par des taux de transfert non

équivalents. Il est évident que plus de matière a été déposée lors du transfert du film du

complexe que dans le cas du dépôt du surfactant. Pour l’étude qualitative en ATR, il ne

s’agissait pas d’optimiser les paramètres de transfert pour obtenir des taux de transfert près

de l’unité. Le travail avait plutôt pour but de démontrer dans un premier temps la présence

d’ADN dans les films du complexe une fois transférés sur un support solide.

4.2.2 Étude de l’orientation moléculaire

Préparation des échantillons

Ces films ont été préparés dans une cuve dont les dimensions sont 80 x 500 mm.

Lorsque le DODAB a été étalé sur l’eau pure une période de 15 minutes a été allouée avant

de débuter la compression tandis que lorsqu’il y avait présence d’ADN dans la sous-phase,

l’attente a été d’une heure. Les films ont été comprimés à une vitesse de 10 mm/min

jusqu’à l’atteinte de la pression de surface cible (30 mN/m). Deux monocouches ont été

transférées à une vitesse constante de 2 mm/min ainsi des taux de transfert d’environ 0,9

ont été obtenus. Les bicouches ont été déposées grâce à l’émersion du substrat de la sous-

phase et ensuite à sa réinsertion. Une fois le substrat de germanium revenu à sa position

initiale dans la sous-phase, la surface entre les barrières a été aspirée à l’aide d’une trompe

à vide. Les barrières ont été ouvertes pour ensuite procéder à la remontée du substrat à

l’extérieur de l’eau et permettre son séchage. La sous-phase d’acides nucléiques a été

produite ici selon le deuxième mode de préparation, c’est-à-dire à partir d’ADN de sperme

de saumon d’une concentration de 5 µg/ml.

Résultats et discussion

Puisqu’il a été démontré que le film de complexe est bien transféré sur le substrat de

germanium, nous avons cherché à savoir si la présence d’ADN modifie l’orientation des

60 chaînes de surfactant. Les calculs de l’orientation ont été faits à partir des spectres ATR

polarisés exposés à la Figure 4-2. Les spectres de la région des vibrations symétriques et

antisymétriques des méthylènes pour un film de DODAB sont montrés à la Figure 4-2A

alors que la Figure 4-2B présente cette même région pour un film de complexe

DODAB-ADN.

3050 3000 2950 2900 2850 2800 2750

0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

0,025 p s

Abs

orba

nce

Nombre d'onde (cm-1)

A

3050 3000 2950 2900 2850 2800 2750

0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

0,025

0,030

0,035

0,040

0,045

p s

Abs

orba

nce

Nombre d'onde (cm-1)

B

Figure 4-2 Spectres ATR polarisés de bicouches transférées sur un substrat de germanium de (A) DODAB et de (B) complexe DODAB-ADN.

61

On note très peu d’écart entre l’intensité des bandes pour la polarisation parallèle et

celle pour la polarisation perpendiculaire, il en découle donc un rapport dichroïque près de

l’unité. Le Tableau 4-1 détaille ces rapports dichroïques et aussi les angles d’inclinaison

moléculaire pour les deux échantillons. L’angle d’inclinaison de la chaîne alkyle de la

molécule n’est pas modifié en présence d’ADN. Comme les résultats obtenus par la balance

de Langmuir et le BAM l’ont démontré, seule la densité du film varie par la présence

d’acides nucléiques, l’orientation du surfactant reste quant à elle inchangée.

Tableau 4-1 Rapport dichroïque (RATR) et angle d’inclinaison (θATR) moléculaire calculés pour les vibrations sélectionnées pour des bicouches de DODAB et de DODAB-ADN transférées sur un substrat de germanium.

Composés Vibration Bande (cm-1) RATR θATR (°)

νs CH2 2850 0,96 18 DODAB

νas CH2 2920 0,99 19

νs CH2 2850 0,98 19 DODAB-ADN

νas CH2 2919 0,96 18

4.2.3 Étude quantitative de la composition des films

Préparation des étalons et des échantillons

Pour cette méthode d’évaluation quantitative, nous avons tout d’abord établi une

courbe d’étalonnage. Cette courbe d’étalonnage a été tracée à partir de films de mélanges

de surfactant cationique (DODAB) et de nucléotide (AMP) de rapport molaire connu. Cinq

solutions ayant des rapports DODAB/AMP de 0,38; 0,50; 1,06; 2,18 et 3,86 ont été

préparées. Les étalons sont constitués d’adénosine monophosphate, un nucléotide, en raison

d’une incompatibilité de solubilité du surfactant et des oligomères ou polymères d’ADN.

Le DODAB et l’AMP sont tous deux solubles dans l’éthanol. Les solutions étalons ont

donc été préparées dans un mélange éthanol/eau comme solvant. Les films ont ensuite été

obtenus par évaporation du solvant sur un cristal de germanium. Il s’agit ici d’une analyse

62 de films épais. Le terme film épais est utilisé dans ce mémoire en opposition au film

Langmuir-Blodgett. La quantité de matière déposée sur le cristal n’a pas d’importance

puisque c’est l’intensité relative et non pas l’intensité absolue qui est considérée. L’analyse

des spectres ATR ainsi obtenus permet de calculer le rapport d’intensité de la bande de la

vibration d’élongation symétrique des méthylènes et de la bande attribuée à la vibration

d’élongation symétrique des groupements phosphate.

L’échantillon a quant à lui été préparé de façon différente. Le film a été déposé sur

le cristal par la technique Langmuir-Blodgett. Pour nous assurer que l’ADN déposé

provienne bien de la complexation avec le surfactant cationique et non d’adhésion, nous

avons tout d’abord déposé une première couche de DODAB pour rendre le cristal

hydrophobe. Nous avons ensuite déposé par immersion et par émersion du substrat deux

couches de complexe DODAB-dT30. Pour que le rapport d’intensité des bandes IR ne soit

pas affecté par le dépôt de la couche de DODAB, nous avons premièrement fait

l’enregistrement d’un spectre de référence avant le premier dépôt. Ensuite, un

enregistrement d’échantillon a été fait à la suite de chacun des dépôts, soit de la

monocouche et de la bicouche, pour terminer avec un second spectre de référence. Grâce à

cette séquence d’enregistrement, le spectre de DODAB a pu être soustrait du spectre global.

Les paramètres de préparation des monocouches de DODAB et de DODAB-dT30 sont les

mêmes. La vitesse de compression des films est de 10 mm/min et la vitesse de transfert est

de 2 mm/min. Un volume de 17 µl de DODAB à une concentration de 1,30 mg/ml à été

déposé et un rapport de charge -/+ (nucléotide/surfactant) de 15 est calculé pour déterminer

le volume d’oligonucléotide à injecter.

Résultats et discussion

L’étude qualitative ayant démontré que le complexe électrostatique DODAB-ADN

pouvait être transféré sur un cristal de germanium, l’étude quantitative vise, quant à elle

maintenant, à déterminer dans quel rapport molaire le surfactant cationique et le nucléotide

anionique sont déposés sur le support solide. Nous souhaitons pour le moins connaître

l’ordre de grandeur du rapport molaire, est-il de 1:1 ou de 1000:1? Les spectres ATR des

régions d’intérêt sont présentés à la Figure 4-3. La courbe d’étalonnage a été établie en

63 portant en graphique le rapport d’intensité d’absorbance des bandes νs CH2 et νs PO2

- en

fonction du rapport molaire DODAB/AMP (Figure 4-4). La courbe obtenue est une relation

linéaire dont l’équation est donnée sur la figure et celle-ci permet de calculer le rapport

d’intensité de ces deux mêmes bandes pour un échantillon préparé par transfert

Langmuir-Blodgett.

3050 3000 2950 2900 2850 2800 2750

0,00

0,06

0,12

0,18

νs CH

2

Abs

orba

nce

Nombre d'onde (cm-1)

0,4 0,5 1,1 2,2 3,9

A

1300 1250 1200 1150 1100 1050 1000 950

0,000

0,002

0,004

0,006

0,008

0,010 νs PO

2

-

1082

Abs

orba

nce

Nombre d'onde (cm-1)

0,4 0,5 1,1 2,2 3,9

B

Figure 4-3 Spectres ATR de films isotropes du complexe DODAB-AMP de rapport molaire DODAB/AMP connu dans (A) la région des groupements méthylène et (B) la région du groupement phosphate.

64

0 1 2 3 4 50

5

10

15

20

25

y = 5,36x-0,63

R2=0,997

Rap

port

d'in

tens

ité (

ν s CH

2/νs P

O2- )

Rapport molaire (DODAB/AMP)

Figure 4-4 Courbe d’étalonnage du rapport molaire établie à partir des spectres ATR de complexes de DODAB-AMP.

On obtient ainsi le rapport molaire DODAB/thymine (surfactant/nucléotide) pour

l’échantillon analysé (Figure 4-5). Le rapport molaire DODAB/thymine obtenu pour

l’échantillon décrit est 2:1. Par contre, il est raisonnable de penser que les complexes

électrostatiques se forment selon un rapport molaire de 1:1 étant donné la nature

cation/anion des composants et cela, malgré le fait que le ratio utilisé dans la cuve du bain

Langmuir est 1:15. Dans chacun des essais, les acides nucléiques sont toujours ajoutés en

large excès par rapport aux molécules amphiphiles. Hou et ses collaborateurs47 ont

quantifié en solution le complexe de didodécyldiméthylammonium (DDDA), un surfactant

du même type que le DODAB mais qui possède deux chaînes de douze carbones, et d’ADN

grâce à la résonance magnétique nucléaire du proton (1H RMN) avec le toluène comme

référence interne. Le rapport qu’ils ont obtenu est 1:1. Le complexe DODAB-ADN que

nous étudions possède donc un rapport molaire qui est du même ordre de grandeur, qu’il

soit en solution ou fixé sur un support solide. Ce ratio molaire calculé de 2:1 laisse

logiquement supposer pour l’instant que la moitié de la surface recouverte par le DODAB

contient des nucléotides. Toutefois, la répartition des acides nucléiques sur le support sera

discutée plus en détail à la section 4.4.

65

3050 3000 2950 2900 2850 2800 2750

0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

Abs

orba

nce

nombre d'onde (cm-1)

νs CH

2

A

1300 1250 1200 1150 1100 1050 1000 950

0,000

0,001

0,002

0,003

0,004

0,005

0,006

Abs

orba

nce

nombre d'onde (cm-1)

νs PO

2

-

1065B

Figure 4-5 Spectres ATR d’une bicouche du complexe DODAB-dT30 de rapport molaire inconnu dans (A) la région des groupements méthylène et (B) la région du groupement phosphate.

Il faut cependant penser que le rapport obtenu par ATR peut être partiellement en

erreur en raison d’une différence de composition entre les échantillons et les étalons, et

également en raison de différences d’orientation moléculaire. Les étalons ont été préparés

66 avec le sel de l’AMP, ce sont donc des solutions de nucléotides. Quant aux échantillons, ils

ont été préparés avec les composés habituels, c’est-à-dire avec une sous-phase contenant

des 30-mers de thymine. Donc, puisque le groupement phosphate des nucléotides n’est pas

dans un environnement identique dans l’AMP et dans le dT30, on observe un décalage de la

bande attribuée aux vibrations d’élongation symétrique de ce groupement fonctionnel. Sur

le spectre des étalons, la bande se situe à 1082 cm-1 alors que sur le spectre de l’échantillon

on l’observe à 1065 cm-1. Pour vérifier que ce décalage n’est pas causé par la différence de

préparation des films (film épais-film ultramince) mais plutôt de composition (AMP-dA30),

les spectres ATR de deux films préparés par évaporation de solvant ont été obtenus (Figure

4-6). Les fréquences sont toutefois un peu différentes, 1072 cm-1 pour le film dA30 au lieu

de 1065 cm-1 pour le film de DODAB-dT30, et 1090 cm-1 pour le film d’AMP au lieu de

1082 cm-1 pour le film DODAB-AMP. Les deux bandes sont à plus basse fréquence

lorsqu’il y a présence de surfactant. On peut donc penser que l’interaction électrostatique

avec le DODAB diminue la fréquence. Notons cependant que le décalage entre les deux

bandes est de 18 cm-1 dans les deux cas. Un autre facteur qui peut avoir contribué à l’erreur

d’appréciation du rapport obtenu est la profondeur de pénétration de l’onde évanescente.

Celle-ci varie comme on le sait en fonction de l’indice de réfraction des deux milieux, de

l’angle d’incidence et aussi de la longueur d’onde. Les vibrations à basse fréquence

absorbent donc plus fortement la radiation. Pour un film épais, la bande caractéristique du

phosphate est donc plus intense qu’elle ne le devrait. Pour les films minces, nous n’avons

pas à nous soucier de la profondeur de pénétration car l’onde évanescente traverse

complètement l’échantillon. Le troisième paramètre à considérer quant à la justesse du

rapport molaire concerne l’orientation moléculaire. Les films épais préparés par

évaporation de solvant des étalons sont isotropes tandis que les films minces préparés par

déposition Langmuir-Blodgett sont anisotropes. Puisqu’en spectroscopie ATR l’amplitude

des champs électriques n’est pas égale dans toutes les directions, l’absorption de la

radiation ne sera pas équivalente pour les étalons et pour l’échantillon.

67

1300 1250 1200 1150 1100 1050 1000 950

dA30

Abs

orba

nce

Nombre d'onde (cm-1)

AMP

10901072

νs PO

2

-

Δ 18 cm-1

Figure 4-6 Spectres ATR comparatifs de la région du groupement phosphate de films isotropes d’AMP et de dA30.

4.3 XPS

Tout comme avec la spectroscopie ATR, la spectroscopie photoélectronique à

rayons X nous a permis d’abord d’étudier de façon qualitative, puis quantitative, des films

du complexe DODAB-ADN sur support solide. On a pu établir précédemment le rapport

molaire DODAB/thymine dans des films de complexes transférés sur un cristal de

germanium. Toutefois, comme il a été mentionné, quelques facteurs ont pu contribuer à une

certaine erreur sur la valeur obtenue. La spectroscopie de photoélectrons X a donc été

utilisée pour confirmer le résultat obtenu par ATR. L’approche préconisée pour obtenir

cette information consiste à calculer le rapport du pourcentage des concentrations

atomiques d’azote et de phosphore en tenant compte que l’atome d’azote est contenu dans

chacun des constituants du complexe. Ce rapport peut également être calculé en utilisant

seulement le pourcentage atomique de l’azote. Il est nécessaire dans ce cas que les deux

espèces d’azote typiques du DODAB et de l’ADN soient bien résolues. Les structures

moléculaires présentées à la Figure 4-7 montrent que le DODAB et la désoxythymidine

68

nstituants, principalement ceux qui sont métalliques car une couche

d’oxyde les recouvre.

4-7 Structures moléculaires (A) du surfactant DODAB et (B) de l’oligonucléotide dT30.

4.3.1 Choix du substrat

A

monophosphate, l’unité monomérique de dT30, sont composés de carbone, d’hydrogène et

d’azote. Le surfactant a un atome de brome qui lui est unique tandis que le nucléotide a un

atome de phosphore, des atomes d’oxygène et du sodium. Le brome ne peut pas être utilisé

ici pour calculer le rapport molaire étant donné que sa concentration est faible, soit un seul

atome par molécule de DODAB. De plus, comme il a été mentionné précédemment le

DODAB se dissocie complètement lorsqu’il est étalé sur une sous-phase d’eau. Il est donc

très peu probable que les films contiennent le contre-ion Br-. Pour cette même raison, le

contre-ion de l’acide nucléique, Na+, ne peut pas être considéré. Toutefois, il aurait été

intéressant de vérifier si ces dissociations sont complètes par l’acquisition de spectres XPS

à haute résolution dans la région du Br 3d et du Na 1s. De même, l’atome d’oxygène ne

peut pas être utilisé pour l’étude quantitative puisque plusieurs types de substrats ont cet

élément parmi leurs co

Figure

B

Avant de procéder aux analyses des échantillons par XPS, il a été nécessaire de faire

une brève étude de différents substrats afin déterminer celui qui se prêtait le mieux à nos

69

n diverses procédures et qui ont aussi été recouverts par des monocouches

organiques.

Lamelle de verre

comme la silice pure ou le Vycor® (96 % SiO2) aurait peut-être aidé à contrer

ce problème.

Silicium

analyses. En premier lieu, le substrat ne doit pas comporter d’éléments qui sont étudiés

dans les échantillons ou encore qui possèdent une énergie de liaison proche de celles

étudiées. Des analyses ont été réalisées avec des substrats de différentes compositions,

nettoyés selo

La lamelle de verre est l’un des substrats étudiés. Qu’elle soit ou non nettoyée, la

lamelle contient beaucoup de contaminants alcalins, métalliques et métalloïdes. Il y a

également présence de zinc dont le niveau électronique 3s induit un pic vers 140 eV, valeur

proche de la position attendue pour le niveau 2p du phosphore de l’ADN. En forte

concentration il pourrait nuire à l’exploitation du P 2p. Les contaminants sont bien des

éléments constitutifs du verre, du moins dans la profondeur sondée, puisque leur

concentration apparente ne varie pas ou très peu en fonction de l’angle d’analyse, soit 0° et

75° par rapport à la normale à la surface de l’échantillon. L’utilisation d’un verre de plus

grande pureté

Le silicium cristallin et amorphe présente entre autres un pic situé entre 99 et

103 eV attribué au niveau 2p. Bien que ce pic se situe à bonne distance du P 2p, il présente

une structure de perte d’énergie qui vient modifier le fond de la zone où le pic P 2p

apparaît. C’est pour cette raison que nous avons tenté de recouvrir des substrats de silicium

pour en masquer la surface; tout d’abord par un film de chrome d’une épaisseur de 100 Å

suivi par 1500 Å d’or, tous deux préparés par évaporation. Une deuxième tentative de

recouvrement impliquait le dépôt d’une monocouche d’arachidate de cadmium par la

technique Langmuir-Blodgett. L’ion Cd2+ permet de ponter deux ions arachidate

(CH3(CH2)18COO-) et par conséquent de créer un film compact et stable à l’interface. Les

propriétés de surface du silicium sont modifiées par le dépôt d’or, celle-ci n’est plus du tout

hydrophile. Il donc impensable d’effectuer un transfert LB par émersion. Lorsqu’un dépôt

70

que

malgré la trainée d’énergie du Si 2p, la région du P 2p peut être exploitée avec succès.

4.3.2 Préparation des échantillons

ais sera de nouveau employé dans cette section en opposition au

film Langmuir-Blodgett.

méthode linéaire et de Shirley. Le logiciel CasaXPS a permis

le traitement de ces spectres.

LB est tenté sur un substrat recouvert d’une monocouche d’acide gras, celle-ci se redépose

à la surface de l’eau. Il s’agit d’un phénomène de « peeling-off ». Nous avons donc choisi

d’utiliser des substrats de silicium cristallin sans aucun recouvrement et sans nettoyage

particulier pour éviter tout risque de contamination. Les résultats obtenus ont montré

Les échantillons de complexe ont été préparés par transferts LB sur des substrats de

silicium cristallin (100) achetés chez Montco Silicon Technologies (Spring City, PA,

USA). Le surfactant a été étalé sur une sous-phase à 20 °C et suite à une période

d’évaporation de 10 minutes, le film a été comprimé à 10 mm/min jusqu’à la pression de

surface cible de 30 mN/m. Avant d’amorcer le transfert, une période d’attente de quelques

minutes a permis au film de se stabiliser. La vitesse de transfert est de 2 mm/min. Pour le

DODAB, le transfert a débuté avec le substrat immergé dans la sous-phase et cinq couches

ont été déposées, sans toutefois optimiser les taux de transfert. Une seule couche de

complexe DODAB-dT30 a été déposée et dans ce cas-ci le substrat a été conservé à

l’extérieur de la sous-phase pendant l’incubation et la compression. Pour la préparation du

film épais d’oligonucléotide, quelques microlitres d’une solution de dT30 (317 nmole/ml)

ont été déposés directement sur le substrat et le séchage s’est fait par évaporation du

solvant. Le terme film ép

Les échantillons ont été analysés avec un faisceau de rayons X d’une puissance de

225 W et à un angle d’incidence de 75° par rapport à leur normale. L’énergie de passage

dans l’analyseur est de 160 eV pour les balayages larges (1150-0 eV) et 20 eV pour les

régions analysées à meilleure résolution. Un balayage étroit a été effectué pour les régions

N 1s et P 2p. Le canon de neutralisation a été utilisé pour les analyses de dT30 puisque les

films étaient chargés. L’échelle d’énergie de liaison des spectres a été corrigée par rapport à

la valeur du carbone aliphatique qui a été fixée à 285 eV. La correction de la ligne de base a

quant à elle été réalisée par la

71 4.3.3 Film ultramince de DODAB

Un spectre de survol du surfactant seul a tout d’abord été enregistré à une résolution

plus faible que pour les spectres obtenus à haute résolution (Figure 4-8). Il permet avant

tout de déterminer les éléments qui ont une bonne sensibilité ou encore qui sont en teneur

assez importante dans l’échantillon. À des énergies de liaison inférieures à 600 eV, on

remarque la présence d’oxygène, de carbone et de silicium alors que les pics Auger sont

situés à des énergies supérieures. La photo-ionisation conduit à l’émission de deux

électrons, soit un photoélectron et un électron Auger. La présence d’oxygène peut être

expliquée par l’existence d’une couche d’oxyde (SiO2) à la surface du substrat de silicium

cristallin. Malgré l’angle d’analyse de 75° par rapport à la normale à l’échantillon, on

observe la présence de silicium provenant du substrat. Cette observation indique que le film

est entièrement traversé par la radiation, soit parce qu’il est mince ou encore parce qu’il

n’est pas uniforme sur toute sa surface. Ainsi, même si le film est inhomogène dans son

épaisseur, ce résultat confirme que l’analyse est faite sur toute sa profondeur. Il est possible

de connaître la composition atomique relative de chacun des éléments présents dans le film,

à partir des spectres de survol, et pour les éléments moins abondants, à partir des spectres

de haute résolution (Tableau 4-2).

1000 800 600 400 200 00

5

10

15

20

25

30

35

O 1

s

CP

S

Énergie de liaison (eV)

x103

C 1

s

OA

ug

er

Si 2

pSi 2

s

O 2

s

Figure 4-8 Spectre XPS de survol d’un film ultramince de DODAB.

72 Tableau 4-2 Composition atomique relative des éléments dans un film ultramince de DODAB.

Région XPS Composition atomique relative (%)

(±0,2)

C 1s 66,8

O 1s 15,0

N 1s 0,8

Si 2p 17,4

Azote

Comme nous l’avons mentionné précédemment, nous voulons établir le rapport

atomique entre l’azote et le phosphore pour confirmer le rapport molaire DODAB/ADN

établi par spectroscopie ATR. Il est donc primordial d’évaluer la composition relative de

ces éléments à meilleure résolution. On a constaté que l’azote n’apparaissait pas sur le

spectre de survol, toutefois à haute résolution il est possible de le détecter. Une seule

composante située à 402,5 eV est mise en évidence dans cette région du spectre (Figure

4-9). Il s’agit bien de l’amine quaternaire N+ du surfactant puisque l’énergie de liaison

obtenue s’inclut à la gamme des valeurs citées dans la littérature pour un sel

d’ammonium.48

Phosphore

Le spectre à haute résolution dans la région du phosphore, c’est-à-dire entre environ

138 et 124 eV, confirme l’absence de pic dans cette zone d’énergie pour le DODAB

(Figure 4-10). On remarque aussi que la ligne de base de cette zone n’est pas linéaire en

raison de la trainée d’énergie du silicium 2p comme il a été discuté précédemment.

73

408 406 404 402 400 39856

60

64

68

72

CP

S

Énergie de liaison (eV)

x 101

N+

402,5

Figure 4-9 Spectre XPS à haute résolution dans la région N 1s d’un film ultramince de DODAB.

140 138 136 134 132 130 128 126 1249

10

11

12

CP

S

Énergie de liaison (eV)

x 102

Figure 4-10 Spectre XPS à haute résolution dans la région P 2p d’un film ultramince de DODAB.

74 4.3.4 Film épais de dT30

Pour permettre une meilleure évaluation du spectre du complexe et surtout pour

apprécier l’apport propre à l’ADN, nous avons enregistré les spectres d’un film épais

d’oligonucléotide dT30. De la même façon que pour l’étude du surfactant cationique, un

spectre de survol a d’abord été enregistré (Figure 4-11). On voit que malgré la formation

d’un film épais, le silicium est toujours détecté. Il faut se rappeler que la technique

Langmuir-Blodgett permet de déposer sur le support des films ultraminces, uniformes et

homogènes contrairement à la méthode employée ici par évaporation de solvant. Nous

croyons qu’un dépôt à la tournette aurait certainement amélioré la qualité du film. La

concentration atomique relative de chacun des éléments composant l’échantillon est donnée

au Tableau 4-3.

1000 800 600 400 200 00

5

10

15

20

25

30

CP

S

Énergie de liaison (eV)

x 103

C 1

s

N 1

s

O A

ug

er

Si 2

pSi 2

s

O 2

s

P 2

p

O 1

s

P 2

s

Figure 4-11 Spectre XPS de survol d’un film épais de dT30

75 Tableau 4-3 Composition atomique relative des éléments d’un film épais de dT30.

Éléments Composition atomique relative (%) (±0,2)

C 1s 66,7

O 1s 20,5

N 1s 7,5

P 2p 1,9

Si 2p 3,4

Azote

La Figure 4-12 présente la fenêtre d’énergie spécifique à la région N 1s. Celle-ci

comporte deux pics centrés à 400,8 et 400,0 eV. Leur concentration atomique relative est

de 46,5 % et 53,5 %, respectivement. L’analyse XPS de l’ADN a déjà été rapportée dans la

littérature. Certains chercheurs n’attribuent qu’une seule composante N 1s pour la thymine

en mentionnant que cette dernière n’a que des atomes d’azote non conjugués avec un

environnement équivalent.49,50 D’autres par contre obtiennent deux composantes comme

c’est le cas pour notre étude.51,52 Puisque la thymine est une molécule conjuguée, la

délocalisation des électrons a comme conséquence qu’elle existe sous différentes formes de

résonance (Figure 4-13). La composante à plus haute énergie de liaison proviendrait du

groupement amide (N1) où l’azote est non conjugué (sp3), tandis que la seconde découle du

groupement carbamide (N3) où il y a conjugaison par la formation de la forme énol (sp2).

La faible séparation des composantes provient du fait que l’état chimique des deux types

d’azote est très similaire. Selon la structure moléculaire, théoriquement le rapport des

concentrations atomiques devrait être 1. Toutefois, la deuxième composante devrait être

présente dans des proportions inférieures puisque la forme énol est moins favorisée par

rapport à la forme céto. Expérimentalement, le rapport (–N=/>N–) obtenu est 1,2. Il est

difficile d’expliquer cette surabondance d’azote conjugué dans l’échantillon analysé.

76

406 404 402 400 398 396

40

60

80

100

120

140

160

CP

S

Énergie de liaison (eV)

x 101

(1)>N-

400,8

(2)-N=

400,0

Figure 4-12 Spectre XPS à haute résolution dans la région N 1s d’un film épais de dT30.

Figure 4-13 Formes tautomères de la thymine liée à un groupement R (pentose et groupement phosphate).

Phosphore

L’analyse de la région du phosphore 2p révèle un doublet en raison du couplage

spin-orbite (Figure 4-14). Ces pics proviennent du groupement PO4- composant le squelette

77 d’un brin d’ADN. Le P 2p1/2 est situé à 134,8 eV tandis que le P 2p3/2 se trouve à 133,9 eV.

Des énergies de liaison très similaires ont été obtenues par Vilar et al.50, soit 134,9 et 134,0

± 0,2 eV. Le rapport des concentrations atomiques relatives est bien 1:2 (66,7 %:33,3 %)

comme le prédit la mécanique quantique pour un doublet de l’état électronique p.53

140 136 132 128

10

20

30

(2)P 2p

3/2

133,9

CP

S

Énergie de liaison (eV)

x 101

(1)P 2p

1/2

134,8

Figure 4-14 Spectre XPS à haute résolution dans la région P 2p d’un film épais de dT30.

Le rapport atomique N/P calculé pour cet oligonucléotide, à partir des spectres de

haute résolution, est 3,61. La valeur théorique attendue pour un nucléotide de thymine est 2

(2 atomes d’azote/1 atome de phosphore). Vilar et al.50 ont également rapporté pour un

oligomère simple brin de thymine un rapport N/P largement supérieur à 2, plus exactement

de 3,9. On peut donc penser à une sous-estimation du phosphore en raison du faible rapport

signal sur bruit que cet élément affiche.

4.3.5 Film ultramince de complexe DODAB-dT30

Le spectre de survol du complexe électrostatique DODAB-dT30 montre la présence

de phosphore 2p (Figure 4-15). Cette observation confirme donc à nouveau qu’il y a bien

formation d’un complexe électrostatique à l’interface et que l’ADN est bien transféré sur le

78 support solide par la technique Langmuir-Blodgett, d’autant plus que le film comporte

1,2 % de cet élément (Tableau 4-4).

1000 800 600 400 200 00

5

10

15

20

25

30

35

CP

S

Énergie de liaison (eV)

x103

C 1

s

N 1

s

O A

ug

er

Si 2

pSi 2

s

O 2

sP 2

p

O 1

s

Figure 4-15 Spectre XPS de survol d’un film ultramince de complexe DODAB-dT30.

Tableau 4-4 Composition atomique relative des éléments d’un film ultramince de DODAB-dT30.

Composition atomique relative (%) Région XPS (±0,2)

C 1s 75,8

O 1s 10,7

N 1s 2,5

P 2p 1,2

Si 2p 9,9

79 Azote

Comparativement au spectre d’un film de DODAB, la région dédiée à l’azote 1s

d’un film de complexe DODAB-dT30 révèle un deuxième pic (Figure 4-16). La première

composante apparait à une énergie de liaison de 402,6 eV, ce qui correspond parfaitement à

la valeur obtenue précédemment pour l’azote quaternaire du surfactant qui est de 402,5 eV

(voir Figure 4-9). La composition atomique relative de ce type d’azote est de 33,9 %. Le

second pic se situe à une énergie de liaison de 400,6 eV et équivaut à une composition

relative de 66,1 %. Celui-ci est attribué aux atomes d’azote non chargés, N1 et N3, de

l’oligonucléotide. Puisque les deux états d’oxydation de l’azote sont bien résolus, il est

possible d’établir le rapport molaire DODAB/nucléotide à partir du rapport atomique

N+/N0. La valeur obtenue est 1,0. Elle est donc du même ordre de grandeur que celle qui a

été évaluée par nos études quantitatives en spectroscopie ATR.

406 404 402 400 398 396

64

72

80

88

CP

S

Énergie de liaison (eV)

x 101

(1)

N+

402,6

(2)

N0

400,6

Figure 4-16 Spectre XPS à haute résolution dans la région N 1s d’un film ultramince de complexe DODAB-dT30.

80 Phosphore

La région du phosphore 2p a dû être traitée de façon particulière. Comme il a été

montré à la Figure 4-10, le fond de cette zone n’est pas linéaire en raison d’une trainée

d’énergie du silicium 2p. Cette région du spectre a donc été enregistrée au même angle

d’analyse à partir d’un échantillon ne contenant pas de phosphore. Le modèle du fond est

extrait de ce spectre pour être ensuite appliqué à l’échantillon du complexe DODAB-dT30.

À la Figure 4-17, la composante 1 résulte donc de la trainée d’énergie due au substrat tandis

que la composante 2 correspond au signal provenant du phosphore 2p. Ce pic compose

61,3 % de la bande de la région P 2p et il se situe à une énergie de liaison de 133,5 eV.

140 136 132 128

8

9

10

11

12

(2)P 2p133,5

CP

S

Énergie de liaison (eV)

x 102

(1)Fond135,1

Figure 4-17 Spectre XPS à haute résolution dans la région P 2p d’un film ultramince de DODAB-dT30.

Puisqu’il est également possible de quantifier le phosphore dans cet échantillon, le

rapport molaire DODAB/nucléotide peut aussi être calculé à partir du rapport atomique

N+/P. De cette façon, la valeur calculée est 1,1 et correspond parfaitement aux rapports

molaires obtenus précédemment. On retrouve au Tableau 4-5 un résumé des données

spectrales XPS qui permettent de calculer les rapports atomiques et molaires.

81 Tableau 4-5 Paramètres expérimentaux des diverses composantes spectrales obtenues dans les régions N 1s et P 2p des échantillons de DODAB, dT30 et du complexe DODAB-dT30.

Région

XPS Échantillon

Composante spectrale

Énergie de

liaison (eV) ±0,2

LMH*

Concentration atomique

relative (%) ±0,2

Attribution

N 1s DODAB 1 402,5 1,21 100,0 N+

dT30 1 400,8 2,06 46,5 >N–

2 400,0 1,33 53,5 –N=

DODAB-dT30 1 402,6 1,14 33,9 N+

2 400,6 1,55 66,1 N0

P 2p DODAB - - - - -

dT30 1 134,8 1,84 33,3 P 2p1/2

2 133,9 1,84 66,7 P 2p3/2

DODAB-dT30 1 135,1 5,00 38,7 fond

2 133,5 2,05 61,3 P 2p

*Largeur à mi-hauteur

La spectroscopie de photoélectrons X a donc permis de contre-vérifier le rapport

molaire DODAB/nucléotide obtenu précédemment par ATR pour un film ultramince de

complexe de DODAB-dT30. Les résultats tirés de ces deux techniques d’analyse sont du

même ordre de grandeur. Dans le cas des données XPS, le rapport molaire

DODAB/nucléotide a été déterminé à partir de deux rapports atomiques différents. Les

valeurs obtenues correspondent parfaitement entre elles, soit 1,0 pour le rapport obtenu à

partir de N+/N0 et 1,1 pour celui obtenu avec N/P.

4.4 Microscopie à fluorescence

Les techniques spectroscopiques utilisées jusqu’à maintenant ont permis non

seulement de confirmer la présence d’ADN sur les supports solides mais également de le

quantifier. Nous nous sommes ensuite intéressés à la distribution des brins d’ADN sur le

substrat. Comme il a été mentionné précédemment, nos deux stratégies pour l’obtention

82 d’un polymère ADN-mimétique visent la polymérisation des monomères directement sur le

substrat une fois que ceux-ci sont hybridés à l’ADN. Pour obtenir un polymère

d’ADN-mimétique dont la séquence est bien complémentaire à celle du simple brin ayant

servi de gabarit, il est essentiel que la polymérisation soit indépendante pour chacun des

brins. Pour ce faire, les brins modèles se doivent d’être distribués uniformément sur le

support et bien distancés les uns des autres. Nous savons que l’ADN en solution adopte la

forme d’une pelote pouvant varier en taille et en forme en raison du mouvement brownien.

Mais qu’en est-il une fois transféré sur le support solide? La microscopie à fluorescence est

la technique qui nous semblait la mieux adaptée pour répondre à cette question.

En 1994, Bensimon et al.54 ont été les premiers à développer une technique

permettant d’étirer sur un substrat des molécules d’ADN afin d’en faire l’étude de façon

individuelle par microscopie à fluorescence. Cette méthode est appelée « molecular

combing » ou peignage en terme français. Elle implique l’utilisation de substrats

hydrophobes sur lesquels l’ADN peut s’ancrer à la surface par l’une ou ces deux

extrémités. Les molécules sont dépliées grâce au passage d’un ménisque lors de

l’évaporation de microgouttes. Plusieurs variantes de cette technique ont été développées au

fil des années. Entre autres, le groupe de Matsuo et al.55 ont développé quant à eux une

méthode permettant également d’étirer et d’immobiliser un double brin d’ADN sur un

substrat de verre en utilisant une monocouche de tensioactif à l’interface air-eau. Cette

approche est basée sur la technique Langmuir-Blodgett et ne requiert pas le traitement

chimique des substrats (Figure 4-18A). Un exemple d’image de fluorescence obtenue par

cette technique est montré à la Figure 4-18B et s’avère grandement intéressant pour nos

travaux. On constate que les brins sont bien distribués et bien distancés sur le substrat

solide. Ce sont les deux principales caractéristiques recherchées pour effectuer la

polymérisation des monomères une fois liés à l’ADN cible. Pour obtenir l’orientation du

film permettant de réaliser l’hybridation ADN-monomère, nous devons déposer deux

couches et non pas une monocouche comme l’ont fait Matsuo et ses collaborateurs.

Toutefois, l’étude présentée ici a été faite avec une seule couche de complexe.

83

Figure 4-18 (A) Illustration schématique du transfert d’un film de complexe polyionique sur un substrat de verre et (B) image de fluorescence de l’ADN lambda marqué avec le YOYO-1. L’échelle est de 10 µm. (56)

4.4.1 Préparation des échantillons

Nous avons donc voulu dans un premier temps reproduire les travaux du groupe de

Matsuo afin de nous assurer d’une bonne maîtrise de la technique et également de vérifier

la concordance des résultats, l’objectif étant ensuite d’appliquer cette méthode à notre

projet. La molécule cationique amphiphile qu’ils ont utilisée pour faire le film est identique

à celle choisie pour notre projet; il s’agit du DODAB. Toutefois, l’acide nucléique employé

par ce groupe est l’ADN lambda (ADNλ), un acide nucléique double brin dont la longueur

calculée est 16,5 µm. Ce type d’ADN est mieux adapté pour mettre au point la méthode

puisque les oligonucléotides utilisés dans notre projet ont une longueur de seulement

10,2 nm (0,34 nm/paire de bases), ce qui est inférieur à la résolution spatiale de l’appareil

qui est d’environ 0,2 µm. L’élément permettant la détection d’ADN est l’homodimère du

jaune d’oxazole dont l’acronyme est le YOYO-1 (Molecular Probe) qui est un intercalant

spécifique aux acides nucléiques (Figure 4-19). Ce composé très performant possède deux

groupements pouvant faire une intercalation entre les paires de bases. Ses maximums

d’absorption et d’émission sont respectivement à des longueurs d’onde de 489 et 509 nm

B A

84

57s’il est complexé à l’ADN double brin. Le coefficient d’extinction molaire, qui reflète la

probabilité d’absorption d’un photon, est de 98 900 cm-1·M-1 et le rendement quantique, qui

lui correspond au rapport entre le nombre de photons émis par la source et le nombre de

photons absorbés par la molécule est de 0,52. Ce fluorophore est principalement utilisé

pour les acides nucléiques de grande taille et à chaîne double. Toutefois, il peut aussi être

employé pour les homopolymères simple brin à chaîne courte.

Figure 4-19 Structure moléculaire du YOYO-1. (58)

La sous-phase a été préparée à partir d’une solution tampon TE (10 mM Tris-HCl,

1 mM EDTA, pH 8)34 stérilisée par autoclave dans laquelle de l’ADN lambda à une

concentration de 10 nM en paire de bases et du YOYO-1 à 5 nM ont été ajoutés. Le rapport

fluorophore/paire de bases est donc 1:2. Le DODAB est étalé sur cette sous-phase

maintenue à une température de 20 °C. Après 5 minutes d’attente, le film est comprimé à

une vitesse de 5,2 mm/min (2 x 10-2 nm2/molécule/min). Une fois que la pression de

surface a atteint 5 mN/m et 20 mN/m, la lame de verre ayant été préalablement insérée dans

la sous-phase est remontée à une vitesse de 4 mm/min. Matsuo et Ijiro59 se sont préoccupé

de l’adhésion non spécifique d’ADN sur le substrat et ont montré qu’un transfert effectué

sans monocouche de surfactant ne formait pas de motifs linéaires mais plutôt des agrégats.

Les lames à microscope utilisées sont standards et n’ont subi aucun traitement chimique

excepté qu’elles ont été nettoyées avec divers solvants organiques et ont été trempées dans

une solution oxydante de H2S04 et H2O2. Il faut éviter tout frottement sur la lame lors du

nettoyage, sans quoi il y a apparition de bruit de fond important sous forme de stries

fluorescentes très larges orientées dans la direction du frottement.

85 4.4.2 Étude par microscopie à fluorescence de films de complexe

DODAB-ADNλ

Les images du film de complexe DODAB-ADNλ obtenues par microscopie à

fluorescence diffèrent grandement de celles obtenues par Matsuo et ses

collaborateurs.55,56,59 Le film observé à la Figure 4-20A a été obtenu dans des conditions

pratiquement identiques à celles données dans la littérature pour le cas présenté à la Figure

4-18B. Toutefois dans les travaux de ces chercheurs, le rapport utilisé YOYO/paire de

bases est 1:10 et la vitesse de transfert est 2 mm/min alors que nous avons utilisé un rapport

YOYO/pb plus élevé puisque nous voulions maximiser l’intensité de fluorescence. Le

choix de la vitesse de transfert utilisée est basé sur des résultats publiés en 2006 par ce

même groupe qui montrent que plus la vitesse de transfert est grande, plus l’espace entre

les lignes est étroit et régulier.59 Il faut noter que des transferts antérieurs ont été réalisés

avec le même rapport YOYO/paire de bases et la même vitesse de transfert que ce qui est

donnés dans les travaux de Matsuo. Aucune structure fluorescente n’a pourtant été observée

lors de ces expérimentations, d’où pourquoi des essais subséquents ont été faits en

modifiant ces deux paramètres. Les premiers essais ont été étudiés avec le microscope LSM

310 de Zeiss qui, contrairement au second, a un objectif à immersion dans l’huile. Les

images présentées dans ce chapitre et résultant de la deuxième série d’essais ont quant à

elles été observées avec un microscope UM-2 de Nikon. Cette différence entre les appareils

est peut-être en cause dans les résultats des premiers essais. Aussi, puisque les paramètres

expérimentaux fournis dans la littérature étaient peu détaillés, plusieurs essais ont dû être

réalisés afin de mettre au point les différents protocoles, dont le lavage des lames, la

préparation de la sous-phase ainsi que les conditions d’observations. Il aurait donc été

intéressant de reproduire les résultats de la littérature avec le deuxième microscope et les

protocoles bien établis, et ce, avec les conditions identiques à celles utilisées par Matsuo et

ses collègues, plus précisément en utilisant un rapport YOYO/paire de base de 1:10.

86

50 µm 250 µm 250 µm

B C A

Figure 4-20 Images de fluorescence de films LB de complexe DODAB-ADNλ; (A) d’une monocouche transférée sur une lame de verre à 5 mN/m, (B) à 20 mN/m et (C) d’une multicouche transférée sur une lame de verre à 20 mN/m.

L’image 4-20A montre la présence de grosses structures linéaires qui en raison de

leur taille importante indiquent qu’il s’agit d’agrégats de plusieurs brins d’ADN. Ce résultat

nous porte à nous questionner à savoir si la distribution obtenue par ces autres chercheurs

est bien uniforme sur tout le substrat ou bien si elle est localisée. D’autant plus qu’aucune

image à plus faible grossissement que 10 µm n’est présentée. On peut également se

demander si le rapport YOYO/pb utilisé lors de nos essais était trop élevé. Il a été démontré

par Larsson et al.60 qu’à un rapport inférieur à 1:8, la bi-intercalation est le mode de

fixation prédominant alors qu’à un rapport supérieur, il y a contribution importante d’un

deuxième mode par fixation externe. Le YOYO étant un ligand cationique, une

concentration trop importante de cette molécule peut diminuer la charge négative de l’ADN

et par conséquent engendrer l’agrégation entre les brins d’acides nucléiques. La Figure

4-20B présente un film ayant été transféré à une pression de surface plus élevée (20 mN/m).

L’ADN y est mieux dispersé sur le substrat mais il est encore sous forme agrégée. Des

résultats semblables ont déjà été publiés.59 Enfin, on voit clairement sur la Figure 4-20C la

présence d’une structure alignée. Dans ce cas-ci, ce sont six cycles de transfert qui ont été

faits. On sait qu’il ne s’agit pas d’une molécule individuelle, car la longueur correspond à

plus de 700 µm, près de 43 fois la longueur d’un brin d’ADN lambda. La fixation d’un

agent intercalant demande de l’espace et il en résulte donc une distorsion locale et une

augmentation de la distance entre chacune des paires de bases. La séparation entre les bases

87 d’un site d’intercalation peut passer de 3,4 à 6,8 Å.61 Donc, si l’on fait l’hypothèse que tous

les sites sont occupés par un fluorophore, la molécule d’ADN lambda peut doubler de

taille, mais elle ne pourra jamais atteindre une longueur de plusieurs centaines de

micromètres.

Les résultats obtenus par microscopie à fluorescence sont en désaccord avec les

conclusions tirées des analyses par BAM, XPS et ATR qui font état d’un film dense et

homogène dont le rapport molaire DODAB/ADN est pratiquement égal à l’unité.

L’agrégation observée par microscopie à fluorescence est vraisemblablement provoquée

par la présence du fluorophore qui est absent dans les autres techniques d’analyse. Les

images obtenues ne sont donc pas représentatives de la morphologie des films

monomoléculaires formés par les complexes surfactant-ADN. En réponse à ces résultats

contradictoires et pour appuyer l’hypothèse avancée, nous avons procédé à l’analyse in situ

à l’interface air-eau du film de complexe DODAB-ADNλ. La microscopie à l’angle de

Brewster a clairement révélé que la présence du YOYO dans la sous-phase modifie la

morphologie du film, et ce, en créant des agrégats à l’interface.

4.5 Hybridation entre monomères et ADN ayant été déposé sur un substrat par transfert LB d’un film de complexe DODAB-ADN

Bien que la microscopie à fluorescence n’ait pas montré la distribution escomptée

des molécules d’ADN sur le substrat, nous avons quand même procédé à quelques tests

préliminaires d’hybridation sur le support solide entre monomères et acides nucléiques. La

spectroscopie ATR a été choisie ici pour les observations, puisque l’association entre les

constituants est facilement confirmée par l’apparition de bandes IR.

4.5.1 Préparation des échantillons

La première étape consiste à faire le dépôt de monocouches du complexe

DODAB-ADN par transfert LB sur un cristal de germanium. En premier lieu,

88 l’oligonucléotide est injecté avec une microseringue dans la sous-phase d’eau pure dans un

rapport de concentration molaire 11:1 (oligo/monomère). Le film de monomère est ensuite

déposé, puis une période d’attente de 15 minutes est laissée avant d’amorcer la

compression à une vitesse de 10 mm/min (7,62 x 10-2 nm2/molécule/min) jusqu’à la

pression cible de 30 mN/m. Le dépôt de deux monocouches est nécessaire pour obtenir

l’orientation du film qui permet l’hybridation du monomère et de l’ADN. Le monomère

utilisé pour ces essais découle de la troisième génération de monomères étudiés dans le

cadre de ce projet. Une étude plus approfondie de ces composés sera présentée

ultérieurement à la section 5.3. Leur structure moléculaire est présentée à la Figure 4-21.

Une solution de chacun de ces monomères, M-C12-Thy et M-C12-Adé, a été préparée dans

l’hexane à une concentration respective de 47 µg/ml et 60 µg/ml.

B A

Figure 4-21 Structures moléculaires des deux monomères de la troisième génération (A) M-C12-Adé et (B) M-C12-Thy.

L’enregistrement des spectres ATR comporte plusieurs étapes. Le spectre du film de

DODAB-ADN est enregistré en premier. Ensuite, le cristal est trempé pendant 2 minutes

dans la solution de monomère complémentaire ou non complémentaire à l’acide nucléique

présent dans le film. On élimine tout surplus de monomères non hybridé en rinçant le

cristal dans l’hexane pur. La quatrième étape est celle de l’enregistrement du spectre ATR

du film de DODAB-ADN-monomère. Finalement, le cristal est nettoyé par des lavages

89 successifs d’eau, de méthanol et de chloroforme. Le spectre de référence peut ainsi être

obtenu. Puisque les composés utilisés ne sont pas répertoriés dans la littérature, nous avons

jugé bon d’effectuer une étude ATR des monomères seuls avant de procéder à

l’hybridation. Ces deux spectres ont été enregistrés à partir de films épais obtenus par

évaporation de solvant.

4.5.2 Étude ATR des monomères

Le spectre ATR d’un film épais de M-C12-Adé révèle plusieurs bandes dont celle

située à 3307 cm-1 qui est attribuée à l’élongation du lien N-H de l’amine primaire de

l’adénine (Figure 4-22). La vibration d’élongation des liens C-H d’un cycle aromatique

absorbe la radiation à 3155 cm-1 alors que la vibration de déformation angulaire hors du

plan crée une bande à 844 cm-1. Cette dernière peut recouvrir une seconde bande de forte

intensité située entre 870 et 760 cm-1 qui est causée par le balancement du groupement

Si-CH3.62 Le groupe Si(CH3)3 est responsable de deux autres bandes, la déformation

angulaire symétrique cause une bande très étroite à 1248 cm-1 tandis que l’élongation du

lien Si-C se situe plutôt à 761 cm-1. On sait que le balancement des groupements CH2

(ρ CH2) apparaît à une fréquence similaire, on peut donc penser à une superposition des

bandes. Plusieurs bandes sont causées par les vibrations des liens C-H aliphatiques. Les

élongations antisymétriques et symétriques montrent les bandes aux fréquences

habituelles : 2924 et 2853 cm-1. Le cisaillement de ces groupements apparaît à 1466 cm-1

(δs CH2) tandis que la déformation symétrique des méthyles crée une bande à 1375 cm-1

(δs CH3). Le cycle aromatique du monomère a deux substituants éther (C-O-C). La réponse

caractéristique de cet aryle alkyle éther est la bande à 1214 cm-1 (élongation

antisymétrique) et celle à 1047 cm-1 (élongation symétrique). Les élongations des liens

C=C et C=N du cycle purique donnent deux bandes, l’une de forte intensité à 1642 cm-1 et

l’autre moins intense à 1597 cm-1. La bande située à 2154 cm-1 est très spécifique au

monomère, il s’agit de la vibration d’élongation de l’alcyne bisubstitué (C≡C). Il est

impossible d’observer sur le spectre la bande d’élongation du lien C-I puisque sa fréquence

est d’environ 550 cm-1. Cette valeur ne fait pas partie de la gamme de fréquences balayées

par le spectromètre (650 à 4000 cm-1).

90

3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08γ C-H

ν C=C C=N

ν C C

δsCH

3

δsCH

2

ν Si-Cν C-H

ν N-H

1375A

bsor

banc

e

Nombre d'onde (cm-1)

844

3307

2924

3155

2154

1642

14661214

1047

159

7

2853

761

νas

CH2

νsCH

2

νas

C-O

νsC-O

Figure 4-22 Spectre ATR d’un film épais de M-C12-Adé préparé sur un cristal de germanium.

3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

δsCH

3

ν C-H

νas

CH2

ν C=O

ν Si-C

δsCH

2

γ C-Hν

asC-O

νsC-O

3179

3055

2854 759

1371

Abs

orba

nce

Nombre d'onde (cm-1)

8552925

2155

16851466

1214

1037

ν N-H

νsCH

2

ν C C

Figure 4-23 Spectre ATR d’un film épais de M-C12-Thy préparé sur un cristal de germanium.

Le spectre du film épais de M-C12-Thy présenté à la Figure 4-23 est semblable à

celui de l’autre monomère, M-C12-Adé, à l’exception de quelques bandes. Entre autres, on

91 remarque que la bande de l’élongation des liens N-H et celle des liens C-H aromatiques

sont à plus basse fréquence, soit 3179 et 3055 cm-1. Cette diminution de la fréquence

découle de la présence d’un amide secondaire comparativement à une amine primaire. La

principale différence avec le spectre précédent est cette bande très intense située à

1685 cm-1. Elle résulte de l’élongation du lien C=O du groupement thymine et elle est aussi

appelée la bande amide I.

4.5.3 Hybridation des monomères

La présence du monomère sur le substrat est clairement confirmée par la présence

de la bande de l’élongation C≡C à 2155 cm-1. La Figure 4-24 montre la variation d’intensité

de cette bande lors de l’hybridation des monomères M-C12-Thy et M-C12-Adé sur le film de

DODAB-dT30. On remarque l’existence d’une bande de faible intensité pour le film de

surfactant-ADN (ligne pleine). On explique mal la présence de cette bande alors que le

monomère n’est pas présent et qu’aucun composé dans le film ne possède une fonction

alcyne. Toutefois, cette bande augmente considérablement d’intensité lors de l’association

des bases azotées complémentaires (ligne pointillée).

2220 2200 2180 2160 2140 2120 2100 2080

0,0000

0,0001

0,0002

0,0003

0,0004 DODAB-dT

30

DODAB-dT30

et M-C12

-Thy

DODAB-dT30

et M-C12

-Adé

Abs

orb

ance

Nombre d'onde (cm-1)

Figure 4-24 Évolution de la bande alcyne pour des spectres ATR d’un film LB ultramince de DODAB-dT30 seul (––), associé au monomère non complémentaire (---) et ensuite au complémentaire (····).

92

Il faut savoir qu’une quantité relativement importante d’environ 14 % du complexe

DODAB-ADN est perdue lors du trempage dans les solutions d’hexane. Le matériel est

perdu sous forme de complexe puisque le rapport DODAB/ADN demeure constant sur les

spectres. Pour normaliser la perte d’ADN durant l’expérimentation, le rapport

monomère/surfactant a été calculé grâce au rapport d’intensité de la bande du lien C≡C à

2155 cm-1 et de celle des groupements CH2 à 2925 cm-1. Ces valeurs sont résumées au

Tableau 4-6, et précisons que plus la valeur du rapport d’intensité est élevée, plus la

quantité de monomères associés est importante.

Tableau 4-6 Rapports d’intensité de la bande de l’élongation du lien alcyne à celle de l’élongation antisymétrique des méthylènes pour des films LB ultraminces de DODAB-dT30 seul ou hybridé à un monomère.

Film analysé Rapport d’intensité

2

C C

as CH

νν

≡

(x 10-4)

DODAB-dT30 24

DODAB-dT30—M-C12-Adé 592

DODAB-dT30 18

DODAB-dT30—M-C12-Thy 36

DODAB-dT30—M-C12-Thy suivi de M-C12-Adé 148

DODAB-dA30 13

DODAB-dA30—M-C12-Adé 34

DODAB-dA30—M-C12-Adé suivi de M-C12-Thy 48

Ces résultats montrent bien qu’il y a hybridation entre les monomères et le brin

d’ADN complémentaire puisque les rapports d’intensité sont plus élevés que la valeur

initiale (DODAB-ADN). Des essais de contrôle ont aussi été effectués avec des brins non

complémentaires et, contrairement aux attentes, une hybridation a été observée, mais de

bien moindres importances que celle qui a lieu entre des brins complémentaires. On réalise

93 que l’hybridation entre dT30 et M-C12-Adé semble mieux fonctionner que celle entre dA30

et M-C12-Thy. Une différence de solubilité des monomères dans l’hexane pourrait

expliquer ce comportement. En effet, si le monomère est moins soluble, il peut se déposer

sur la surface et se manifester sur le spectre sans que l’appariement de bases soit en cause.

Une étude avec différents solvants pourrait s’avérer très intéressante. Elle permettrait entre

autres de juger si les résultats obtenus sont biaisés par la solubilité et permettrait également

de trouver un solvant qui ne retire pas le complexe DODAB-ADN de la surface. La

composition des couches a peut-être aussi un effet sur ce dernier élément. Le film de

complexe a été déposé selon l’orientation présentée à la Figure 4-25A et où les charges du

film de complexe sont neutralisées à la surface du cristal. On peut donc penser qu’une

première couche de surfactant cationique seul suivie d’une monocouche de complexe

pourrait diminuer la perte de matériel (Figure 4-25B). Le solvant non polaire ne

s’infiltrerait pas entre le cristal et la couche chargée positivement.

B A

Figure 4-25 (A) Composition de chacune des couches des échantillons étudiés et (B) composition envisagée pour de futures analyses afin de minimiser la perte de complexe lors du trempage dans l’hexane.

Chapitre 5

Étude de la reconnaissance moléculaire entre monomères/nucléolipides et l’ADN

Ce chapitre présente les résultats expérimentaux obtenus avec la deuxième stratégie

proposée pour l’obtention d’un polymère ADN-mimétique laquelle a été décrite à la

section 1.3.2. Rappelons que cette stratégie vise l’utilisation de monomères fonctionnalisés

directement à l’interface air-eau. Ces monomères doivent absolument être des molécules

amphiphiles et former des films de Langmuir pour permettre ainsi la reconnaissance

moléculaire avec l’ADN présent dans la sous-phase. De telles molécules ne sont pas

offertes commercialement. Elles ont été synthétisées au laboratoire de la professeure

Hanadi Sleiman du département de chimie de l’Université McGill.

5.1 Première génération de molécules synthétiques

La première génération de molécules qui ont été synthétisées consiste en deux

monomères : THY et DAP ainsi que deux nucléolipides : C4-THY et C6-THY. Les figures

5-1 et 5-2 présentent respectivement les structures moléculaires des monomères et des

nucléolipides.

95

A

B

Figure 5-1 Structures moléculaires des monomères de la première génération (A) THY et (B) DAP.

A B

Figure 5-2 Structures moléculaires des nucléolipides de la première génération (A) C4-THY et (B) C6-THY.

La fonction polymérisable des monomères est un dérivé du norbornène (exo-7-

oxabicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboximide). Cette unité permet une polymérisation par

métathèse par ouverture de cycle (Ring-opening metathesis polymerization, ROMP). Cette

méthode permet d’obtenir des polymères avec une distribution étroite des masses molaires.

Puisqu’il s’agit d’une polymérisation vivante, elle permet aussi d’obtenir des copolymères

blocs. Sleiman et al.63 ont réalisé pour la première fois en 2002 la synthèse d’un

96 homopolymère et d’un copolymère bloc contenant un groupement dicarboximide par une

réaction vivante de métathèse par ouverture de cycle. L’unité de dicarboximide est un

analogue à la thymine, il peut donc se lier sélectivement à l’adénine par la création de liens

hydrogène spécifiques comme le font les acides nucléiques. Toutefois, puisque dans ce

projet la reconnaissance moléculaire a lieu à l’interface air-eau, ces composés doivent avoir

des propriétés amphiphiles. Le dicarboximide n’est donc pas une molécule à retenir ici. Il

est possible de fonctionnaliser ce groupement grâce à une déprotonation suivie d’une

substitution nucléophile. C’est de cette façon que le groupe de Sleiman a créé des

monomères avec différents groupes fonctionnels.64,65 Ceux utilisés pour nos études sont

fonctionnalisés avec une base azotée, la thymine (Figure 5-1A) et un groupement

diacétamidopyridine (Figure 5-1B), un analogue à l’adénine qui se lie par trois liens

hydrogène au lieu de deux à la thymine.

5.1.1 Étude in situ à l’interface air-eau

Balance de Langmuir

La formation de films à l’interface air-eau est évidemment le premier élément à

vérifier avec ces composés. Malheureusement, aucune des molécules de la première

génération ne forme des films de Langmuir sur une sous-phase d’eau pure. On n’observe

aucune élévation de la pression de surface lors de la compression. L’analyse de la structure

de ces composés permet de conclure qu’il n’y a pas formation de monocouche en raison

d’un mauvais ancrage à l’interface. La tête hydrophile (thymine ou diacétamidopyridine)

est relativement peu soluble dans l’eau à cause de son caractère aromatique. Pour contrer ce

problème, nous avons envisagé d’ioniser la fonction thymine en espérant que la charge

négative ainsi créée augmente la solubilité.

Les bases azotées ont un fort caractère aromatique et sont riches en électrons. Ces

caractéristiques leur donnent la possibilité de prendre deux formes tautomères en fonction

du pH. Les tautomères céto et énol sont aussi appelés respectivement forme lactame et

forme lactime (Figure 5-3). À pH physiologique, les bases azotées se retrouvent

97 majoritairement sous la forme lactame. Les valeurs de pKa sont importantes, car elles

déterminent si les atomes d’azote des cycles aromatiques des bases peuvent former des

liaisons hydrogène, soit comme accepteur ou receveur d’électrons. Puisque les composés de

la première génération de molécules (monomère THY, C4-THY, C6-THY) sont formés de

thymine, nous allons nous attarder principalement à la déprotonation de cette base. Les

étapes d’ionisation sont résumées à la Figure 5-3. La constante de déprotonation (pK1) de la

thymine liée à un groupement R à 20 °C est 9,96.66

Figure 5-3 Formes tautomères et forme déprotonée de la thymine.

Une sous-phase aqueuse fortement basique, à un pH de 14, a été préparée par l’ajout

de NaOH. Malgré ce changement marqué du pH, aucun des composés (monomère THY,

nucléolipides C4-THY et C6-THY) n’a encore formé de monocouche à l’interface. Ce

résultat montre que même si la tête de la molécule est plus soluble grâce à l’ionisation de la

thymine, celle-ci ne s’ancre pas bien à l’interface.

Suite à ce résultat, pour faire opposition à la première supposition, nous avons donc

présumé une trop grande solubilité des composés. Tout d’abord, un dépôt mixte de deux

constituants a été fait, soit celui d’acide myristique et du nucléolipide THY puisqu’il est

connu que les acides gras ont comme propriété de stabiliser les films. Toutefois, l’ajout du

monomère semble déstabiliser la monocouche d’acide gras. L’isotherme est déplacé vers

des aires moléculaires plus faibles alors qu’on s’attend à un décalage vers des aires

moléculaires supérieures en raison du plus grand nombre de molécules présentes à

98 l’interface. Pour certains des composés, c’est plutôt une sous-phase contenant 150 mM de

chlorure de sodium qui a été utilisée, l’ajout de sel a pour effet de diminuer la solubilité des

molécules étalées. On appelle ce phénomène « salting out ». Ces essais ne se sont

malheureusement pas avérés concluants.

L’ajout d’oligonucléotides complémentaires dans la sous-phase est un autre élément

pouvant améliorer l’ancrage des molécules à l’interface. Pour évaluer l’effet de cet ajout, le

monomère THY a été étalé à l’interface et des oligonucléotides complémentaires d’adénine

(dA30) ont été injectés préalablement dans la sous-phase. De cette façon, nous espérions que

la formation de liaisons hydrogène entre les oligonucléotides et le monomère permettraient

à ce dernier de bien s’ancrer à l’interface et de former une monocouche. Encore une fois,

même avec la présence d’acide nucléique dans la sous-phase, aucun film de Langmuir n’a

été formé par le monomère THY.

5.2 Deuxième génération de molécules synthétiques

5.2.1 C6-EG-THY

Pour contrer le manque de solubilité de la base azotée, qui constitue la tête

hydrophile des molécules amphiphiles de la première génération et qui est essentielle au

processus de reconnaissance moléculaire, une fonction éthylène glycol a été ajoutée entre la

base azotée et la chaîne hydrophobe. On sait que l’éthylène glycol est une molécule

miscible avec l’eau. La structure moléculaire du nucléolipide C6-EG-THY est présentée à la

Figure 5-4.

Figure 5-4 Structure moléculaire du nucléolipide C6-EG-THY.

99

5.2.1.1 Étude in situ à l’interface air-eau

Balance de Langmuir et microscopie à l’angle de Brewster

Les premières études à l’interface air-eau avec ce nouveau nucléolipide ont montré

que le C6-EG-THY ne forme pas de monocouche sur une sous-phase d’eau pure à 20 °C. Il

n’y a aucune montée de la pression de surface lors de la compression ni aucune variation du

niveau de gris n’est détectée par les observations en microscopie à l’angle de Brewster.

L’expérimentation a donc été répétée, mais cette fois avec une sous-phase contenant

500 mM de NaCl et dans laquelle des oligonucléotides dA30 ont été ajoutés. Comme il a été

mentionné précédemment, la présence d’un sel a pour effet de diminuer la solubilité du

polyélectrolyte dans la sous-phase et ainsi d’augmenter la probabilité qu’il y ait hybridation

entre la thymine du nucléolipide étalé à l’interface air-eau et l’adénine dissoute dans la

sous-phase. Pour favoriser davantage l’interaction du nucléolipide avec l’acide nucléique,

une période d’incubation de 90 minutes a été laissée avant d’amorcer la compression.

Différents rapports molaires adénine:thymine ont été étudiés, 2:1, 5:1 et 14:1. Dans les trois

cas, l’isotherme π-A ne montre aucune augmentation de pression de surface suite à la

compression. Néanmoins, la microscopie à l’angle de Brewster révèle la formation

d’agrégats à l’interface air-eau à de petites aires moléculaires (8-9 Å2/molécule). Les

images présentées à la Figure 5-5 montrent bien que des molécules sont présentes à

l’interface lorsque l’oligonucléotide est largement en excès dans la sous-phase. Deux

conclusions sont toutefois possibles, soit qu’il s’agisse des molécules de C6-EG-THY qui

sont localisées à l’interface mais qui ne sont pas suffisamment ancrées pour former un film

stable ou encore, soit qu’il s’agisse d’ADN agrégé.

100

A C B

Figure 5-5 Images de microscopie à l’angle de Brewster du nucléolipide C6-EG-THY sur une sous-phase aqueuse d’oligonucléotides dA30 de rapports molaires adénine:thymine (A) 2:1, (B) 5:1 et (C) 14:1.

L’ADN dans l’eau ultrapure ou en milieu faiblement ionique ne forme pas de film et

ne s’agrège pas à l’interface air-eau. Cependant, en présence d’ions multivalents ou à haute

concentration en sels monovalents, il y a formation d’un film de Gibbs.41 L’ajout de sel

permet de blinder les interactions ion-dipôle entre l’ADN et l’eau et entraîne ainsi la

diminution de la solubilité du polyélectrolyte. La concentration de surface et le taux

d’adsorption augmentent en fonction de la teneur en sel dans la sous-phase, mais aussi en

fonction de la concentration d’ADN. Ce phénomène a été étudié en détail par Frommer et

Miller67 en 1968. Pour s’assurer que les agrégats observés par microscopie à l’angle de

Brewster n’étaient pas causés par l’ADN, mais bien par l’interaction entre le C6-EG-THY

et l’acide nucléique, des essais de contrôle ont été effectués. Des isothermes de

compression ont donc été repris sans toutefois étaler le nucléolipide à l’interface. La

concentration d’oligonucléotide dA30 est la même que celle utilisée pour l’essai dont le

rapport molaire adénine:thymine était 14:1 (Figure 5-5C), puisque c’est pour ce rapport que

la présence d’agrégats a été la plus importante. Tous les paramètres de compression ont été

identiques, soit 60 x 500 mm pour la taille de la cuve et 30 cm2/molécule pour la vitesse des

barrières. On peut voir à la Figure 5-6 que le nombre d’agrégats est infime

comparativement à ce qui a été observé lorsque le nucléolipide C6-EG-THY était présent à

l’interface. On peut ainsi confirmer pour l’essai précédent qu’il y a bien présence d’un film

101 de nucléolipide à des rapports molaires A:T de 5:1 et 14:1. Il faut cependant noter que ce

film n’est pas stable à l’interface air-eau.

B A

Figure 5-6 Images de microscopie à l’angle de Brewster d’une sous-phase aqueuse d’oligonucléotides dA30 pour des aires moléculaires correspondantes à (A) 9 et (B) 8 Å2/molécule s’il y avait présence d’une monocouche de C6-EG-THY.

On peut penser que le problème d’ancrage du C6-EG-THY provient de la chaîne

hydrophobe puisque théoriquement l’ajout du groupement éthylène glycol rend la tête bien

hydrophile. Le groupement hexyle n’est peut-être pas adéquat pour assurer un bon équilibre

entre le caractère hydrophile et hydrophobe de la molécule. Il est bien connu que la stabilité

d’un film varie grandement avec la longueur de la chaîne. Par exemple, les acides gras

doivent contenir plus de 13 atomes de carbone pour être étalés et former une monocouche

sur une sous-phase dont le pH est assez bas pour éviter la formation de l’ion carboxylate.23

Il a aussi été montré que les surfactants cationiques à une seule chaîne, du type sel de

bromure d’ammonium sont insolubles dans l’eau à partir de 18 atomes de carbone.68

5.2.2 C12-EG-THY

Un nouveau nucléolipide avec une chaîne alkyle formée de 12 atomes de carbone au

lieu de 6 a été synthétisé par le groupe de la professeure Sleiman et il a été identifié comme

suit : C12-EG-THY. Sa structure est pratiquement identique au nucléolipide précédent, le

C6-EG-THY, à l’exception de la chaîne qui est allongée (Figure 5-7).

102

Figure 5-7 Structure moléculaire du nucléolipide C12-EG-THY.

5.2.2.1 Étude in situ à l’interface air-eau

Balance de Langmuir et microscopie à l’angle de Brewster

Les modifications apportées à la chaîne hydrophobe du nucléolipide se sont avérées

efficaces étant donné que le composé C12-EG-THY forme des films de Langmuir à

l’interface air-eau. Les isothermes de compression présentés à la Figure 5-8 le confirment.

L’isotherme indique une bonne compressibilité du film puisque la variation d’aire

moléculaire est grande par rapport à la montée de la pression de surface. L’absence d’un

plateau nous laisse donc supposer que la monocouche est formée d’une seule phase. Cet

élément sera confirmé plus tard par la microscopie à l’angle de Brewster. L’ajout

d’oligonucléotides dans la sous-phase n’a pas induit de changements de pente dans la

courbe de l’isotherme du C12-EG-THY. Les décalages observés à la Figure 5-8 peuvent en

fait provenir de l’erreur sur la mesure du volume de la quantité étalée à l’interface. Des

essais supplémentaires ont été réalisés avec une sous-phase ayant une forte concentration en

sel, cependant aucun changement notable n’a été observé pour ces expérimentations. Bien

que les résultats ne soient pas présentés ici, le temps d’incubation et le type d’ADN dissous

sont deux paramètres additionnels qui ont été étudiés. L’hybridation entre ce nucléolipide,

le C12-EG-THY et l’ADN ne peut donc pas être confirmée par le tracé de l’isotherme. On

ne peut non plus l’infirmer, il est possible que l’hybridation ait lieu sans qu’il y ait

modification de l’isotherme.

103

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

0

8

16

24

32

40

48 eau ultrapure eau ultrapure et 500 mM NaCl dA

30

dA30

et 500 mM NaCl

Pre

ssio

n de

sur

face

(m

N/m

)

Aire moléculaire (Å2/molécule)

Figure 5-8 Isothermes de compression de monocouches de C12-EG-THY sur différentes sous-phases.

Puisque le C12-EG-THY est un nouveau composé non offert commercialement, il

est intéressant d’en connaître certaines caractéristiques, dont sa stabilité à l’interface air-

eau. Comme il a déjà été mentionné pour les études de stabilité du DODAB, cette

information nous permet entre autres de mieux choisir la pression de surface à laquelle

auront lieu les transferts Langmuir-Blodgett. La Figure 5-9 présente les isothermes de

relaxation de monocouches de C12-EG-THY sur une sous-phase d’eau pure. Rappelons

qu’un isotherme de relaxation correspond au tracé du rapport de l’aire moléculaire au temps

t (A) en fonction de l’aire moléculaire initiale lors de l’atteinte de la pression de surface

cible (A0). Les monocouches de nucléolipide ont été comprimées à une vitesse constante de

1,93 x 10-1 nm2/molécule/min jusqu’à l’atteinte des pressions de surface cibles qui ont été

maintenues pendant 600 secondes.

104

0 100 200 300 400 500 600

0,55

0,60

0,65

0,70

0,75

0,80

0,85

0,90

0,95

1,00

5 mN/m 10 mN/m 15 mN/m 20 mN/m 25 mN/m

A/A

0

Temps (sec)

Figure 5-9 Isothermes de relaxation d’une monocouche de C12-EG-THY sur une sous-phase d’eau pure.

On peut voir à la Figure 5-9 que plus la pression de surface cible est élevée, plus la

décroissance de l’aire moléculaire est rapide. À une pression de surface de 5 mN/m, après

600 secondes d’attente, le rapport A/A0 est égal à 0,93, à 10 mN/m le rapport devient 0,83;

et à 15, 20 et 25 mN/m, le rapport passe à 0,78, 0,71 et 0,58, respectivement. Il faut noter

ici qu’à 25 mN/m la durée de l’étude est de 425 secondes et non pas de 600 secondes, car la

décroissance de l’aire est très rapide et que l’aire de surface minimale permise par la cuve

utilisée a été atteinte. Notons aussi qu’une monocouche de C12-EG-THY ne montre pas une

aussi bonne stabilité que le surfactant cationique choisi pour la première stratégie du projet.

Toutefois, la stabilité est suffisante pour effectuer des transferts sur supports solides. Pour

certaines pressions de surface cibles, des isothermes de relaxation ont été réalisés avec une

sous-phase ayant une concentration de 5 µg/ml d’ADN et en laissant cette fois 1 heure

d’incubation avant de débuter la compression. Malheureusement, aucun changement

notable sur la stabilité des films n’a été observé en présence d’acide nucléique dans la sous-

phase. Ces résultats n’ont pas été portés en graphique dans ce mémoire.

105

La Figure 5-10 montre les images acquises par microscopie à l’angle de Brewster du

film de C12-EG-THY sur une sous-phase d’eau à 20 °C. On constate avant tout

l’homogénéité du film et également qu’il y a formation de petits agrégats à faible pression

(A-B). Remarquons aussi que le niveau de gris augmente à peine lors de la compression.

C’est donc dire que le film est mince ou encore que sa densité est faible. On peut aussi

supposer que l’indice de réfraction du film est bas ce qui expliquerait la faible réfringence.

A

A B C

Figure 5-10 Images de microscopie à l’angle de Brewster d’une monocouche de C12-EG-THY sur une sous-phase d’eau pure à des pressions de surface de (A) 5 mN/m, (B) 15 mN/m et (C) 35 mN/m.

5.2.2.2 Étude sur support solide

Étude du dépôt Langmuir-Blodgett

Afin de connaître le type de dépôt que fait le nucléolipide C12-EG-THY, plusieurs

cycles de transfert ont été réalisés sur un substrat de germanium. La pression de surface

choisie pour le transfert est 10 mN/m et la vitesse des barrières pour comprimer le film à

cette pression est de 10 mm/min. La vitesse du transfert se fait à 2 mm/min. Le dépôt est du

type z, le transfert a lieu seulement lors de la montée du substrat. On a également noté une

importante instabilité du film lors des transferts, les barrières continuent leur compression

même lorsque le cristal est hors de la sous-phase. Ceci peut être une indication que les

106 molécules sont faiblement ancrées à la surface et qu’elles se solubilisent dans la sous-

phase. On doit donc tenir compte de cette instabilité dans le calcul du taux de transfert.

Cette dérive des barrières doit être soustraite du taux de transfert par calcul mathématique.

De plus, lors de l’étape d’insertion du substrat dans la sous-phase suite à un premier dépôt,

il y a redéposition de la couche. On appelle ce phénomène « peeling-off », c’est-à-dire que

les molécules se désorbent du cristal et se redéposent à l’interface air-eau.69 Plusieurs

facteurs peuvent contribuer à minimiser ce phénomène, soit une vitesse de transfert

supérieure, une pression de surface plus élevée, un temps de séchage plus grand entre

chaque dépôt ou encore l’utilisation d’un substrat présentant moins de défauts de surface.

Des transferts ont été effectués avec une vitesse d’immersion du substrat plus rapide

(100 mm/min) et ce changement ne s’est pas avéré efficace. L’étude sur support solide

n’avait toutefois pas comme objectif d’optimiser le transfert de multicouches mais plutôt de

connaître sommairement le comportement du C12-EG-THY pour ensuite vérifier s’il y a

effectivement hybridation entre celui-ci et l’acide désoxyribonucléique. Ainsi, même si

l’étude à l’interface air-eau n’a pas permis de confirmer une interaction entre les deux

composés, nous avons tout de même tenté d’effectuer le transfert de ces films sur support

solide.

ATR

La Figure 5-11 présente des spectres ATR de monocouches de C12-EG-THY étalées

sur des sous-phases d’eau ultrapure contenant ou non des acides nucléiques pour la région

de 850 à 1800 cm-1. Les paramètres de transfert sont les mêmes que ceux décrits

précédemment dans cette section.

107

1800 1600 1400 1200 1000

0,000

0,001

0,002

0,003

0,004

0,005 eau ultrapure ADN dA

30

dT30

Abs

orba

nce

Nombre d'onde (cm-1)

ν C=O

δ CH2

νs C-O

δs CH

3

ν C=NC=C

Figure 5-11 Spectres ATR de monocouches de C12-EG-THY transférées sur des substrats de germanium à partir de sous-phases d’eau pure contenant ou non différents acides nucléiques.

Bien qu’il n’y ait aucune bande supplémentaire qui apparaît avec l’ajout d’acide

nucléique, les bandes situées autour de 1100 cm-1 (νs C-O) peuvent dissimuler la bande

causée par l’élongation symétrique des groupements PO2-. Pour vérifier cet élément, le

rapport d’intensité entre la bande de l’élongation antisymétrique des groupements CH2

située à 2925 cm-1 et celle de l’élongation symétrique du lien C-O (νas CH2/νs C-O) a été

calculé. Les spectres IR de la région de l’élongation antisymétrique des groupements CH2

ne sont pas présentés ici. Le rapport d’intensité des bandes obtenu pour le spectre du

nucléolipide sur l’eau pure est 2,4, tandis que ce rapport est 2,3 lorsque dT30 est présent

dans la sous-phase. On note que le rapport d’intensité des bandes est plus faible lorsque les

oligonucléotides d’adénine ou l’ADN d’environ 2000 paires de bases sont ajoutés à la sous-

phase. Il devient alors respectivement 1,6 et 0,9. L’intensité de la bande νs C-O étant donc

plus élevée laisse supposer qu’il y a chevauchement avec celle des groupements PO2-, d’où

la présence d’acide nucléique complémentaire dans les films analysés.

108

5.3 Troisième génération de molécules synthétiques

La troisième génération de molécules étudiées correspond en fait aux monomères

utilisés précédemment à la section 4.5 lors des essais d’hybridation avec le film de

complexe DODAB-ADN. La structure de ces molécules a déjà été montrée à la Figure

4-21. Nous présenterons ici les résultats obtenus avec la deuxième stratégie de ce projet,

soit l’étude de ces monomères déposés directement à l’interface air-eau. Comme il a été fait

pour les autres monomères et nucléolipides, la première étape consiste à vérifier qu’il y a

bien formation d’une monocouche à l’interface air-eau. Les isothermes de compression

montrent que ces deux monomères forment bien des films stables à l’interface (Figure 5-12

et 5-13). La balance de Langmuir et la microscopie à l’angle de Brewster ont été utilisées

en parallèle afin de mettre en évidence l’association des monomères avec l’ADN. Ces deux

techniques sont faciles d’utilisation et permettent l’étude directement à l’interface air-eau.

La section 5.3.2 décrira l’étude de ces films transférés sur un support solide.

5.3.1 Étude in situ à l’interface air-eau

5.3.1.1 Préparation des films de Langmuir

Les dimensions de la cuve utilisée pour former les films de Langmuir sont

100 x 700 mm. Le monomère M-C12-Adé a été dissous dans le chloroforme HPLC à une

concentration de 0,69 mg/ml tandis que le M-C12-Thy à une concentration de 1,56 mg/ml.

Les volumes étalés sont respectivement 76 µl et 38 µl. Pour les films contenant des acides

nucléiques, ils sont ajoutés avant l’étalement des monomères avec un rapport molaire des

bases azotées monomère/oligonucléotide de 1:10. L’oligomère d’adénine a une

concentration de 253,2 µM et celui de thymine de 260 µM. Les volumes injectés de ces

deux oligonucléotides sont d’environ 100 µl pour un film de M-C12-Adé et d’environ

115 µl pour celui de M-C12-Thy. Après l’étalement de la solution de monomère, une

période de 15 minutes a été laissée avant de faire la compression. Toutefois, lorsque des

oligonucléotides sont injectés préalablement dans la sous-phase, c’est une période de

109 60 minutes qui est allouée. Les films ont été comprimés à une vitesse de barrières de

29 cm2/min, ce qui correspond à 5,4 x 10-2 nm2/molécule/min.

5.3.1.2 Isotherme de compression

Pour le monomère M-C12-Thy dont l’isotherme de compression est présenté à la

Figure 5-12, on ne dénote aucune différence dans la forme de l’isotherme, qu’il y ait ou non

présence d’oligonucléotides. Pour le second monomère, celui-ci montre une légère

différence au niveau du collapse (Figure 5-13). La pression de surface à laquelle il survient

est augmentée et la courbe change de forme. Ce changement est observable aussi bien lors

de l’ajout du brin complémentaire que de celui qui est non complémentaire, mais l’effet est

un peu moins prononcé dans ce dernier cas.

0 20 40 60 80 100 120 140

0

10

20

30

Pre

ssio

n de

sur

face

(m

N/m

)

Aire moléculaire (Å2/molécule)

eau ultrapure dA

30

dT30

Figure 5-12 Isothermes de compression du M-C12-Thy étalé sur une sous-phase d’eau ultrapure (––); sur une sous-phase contenant le nucléotide complémentaire (---) et le nucléotide non complémentaire (····).

110

0 20 40 60 80 100 120 140 160

0

10

20

30

40

50

60

Pre

ssio

n de

sur

face

(m

N/m

)

Aire moléculaire (Å2/molécule)

eau ultrapure dA

30

dT30

Figure 5-13 Isothermes de compression du M-C12-Adé étalé sur une sous-phase d’eau ultrapure (––); sur une sous-phase contenant le nucléotide complémentaire (····) et le nucléotide non complémentaire (---).

5.3.1.3 Microscopie à l’angle de Brewster

Les images de microscopie à l’angle de Brewster montrées dans cette section ne

concernent que le monomère M-C12-Adé. Celles obtenues avec le monomère M-C12-Thy

sont comparables. Aussi, en raison du changement noté en présence d’ADN au niveau de

l’isotherme du M-C12-Adé, les études subséquentes sur supports solides se sont concentrées

principalement sur ce dernier monomère. Le but premier de l’utilisation de la microscopie à

l’angle de Brewster a été encore une fois ici de démontrer l’hybridation. La Figure 5-14

présente les images obtenues pour une monocouche de monomère étalé sur une sous-phase

d’eau pure, tandis que la Figure 5-15 se rapporte à une monocouche sur une sous-phase

contenant des oligonucléotides complémentaires. On peut voir que la morphologie du film

n’est aucunement modifiée par la présence d’acide nucléique.

111

Figure 5-14 Images de microscopie à l’angle de Brewster d’une monocouche de M-C12-Adé sur une sous-phase d’eau pure à des aires moléculaires de (A) 129, (B) 97, (C) 78, (D) 53 et (E) 45 Å2/molécule.

Figure 5-15 Images de microscopie à l’angle de Brewster d’une monocouche de M-C12-Adé sur une sous-phase aqueuse de dT30 à des aires moléculaires de (A) 112, (B) 97, (C) 79, (D) 54 et (E) 46 Å2/molécule.

A B C

ED

A B C

ED

112 Comme le montrent ces images, le film est très homogène et le niveau de gris

augmente considérablement tout au long de la compression. Même à une pression de

surface nulle (images A, B et C), le signal réfléchi est important. Cette observation indique

que l’indice de réfraction effectif est élevé. Ceci peut-être causé par un film dense ou un

film épais. L’augmentation du niveau de gris n’est pas graduelle comme l’indique le

graphique à la Figure 5-16. On constate un saut très important dans la courbe et selon les

essais l’aire moléculaire à laquelle il survient varie. La Figure 5-15B montre bien le

phénomène observé pour les deux films. Il semble que ce soit des « plaques » de film dense

qui se placent devant l’objectif. On peut donc supposer que les plaques coalescent pour

former un film uniforme, d’où l’observation d’un plateau suite à l’augmentation brusque et

soudaine de la courbe du niveau de gris. La densité du film augmente ensuite

progressivement jusqu’à la saturation de la caméra CCD.

0 20 40 60 80 100 120 140 1600

50

100

150

200

250

Niv

eau

de g

ris

Aire moléculaire (Å2/molécule)

eau pure dT

30

Figure 5-16 Variation du niveau de gris en fonction de l’aire moléculaire pour une monocouche de M-C12-Adé sur une sous-phase d’eau pure avec et sans dT30.

Puisque la balance de Langmuir et le BAM ont montré la formation de films de

monomères à l’interface air-eau, nous avons procédé à une étude sur des supports solides

par la spectroscopie ATR, l’AFM et le XPS. Nos efforts ont été concentrés sur le

113 monomère M-C12-Adé puisque c’est celui-ci qui a présenté un changement dans la forme

de son isotherme de compression.

5.3.2 Étude sur support solide

5.3.2.1 Préparation des films de Langmuir-Blodgett

Les échantillons ont été préparés par des transferts Langmuir-Blodgett sur des

substrats de silicium pour les analyses AFM et XPS et sur un cristal de germanium pour les

études ATR. Les dimensions de la cuve utilisée pour ces transferts sont 80 x 480 mm. Un

volume de 50 µl du monomère M-C12-Adé dont la concentration est 0,69 mg/ml a été étalé

sur une sous-phase d’eau pure à 20 °C. Pour les films contenant des oligonucléotides, ceux-

ci sont ajoutés avant l’étalement du monomère avec un rapport molaire des bases azotées

monomère/oligonucléotide de 1:12, ce qui correspond à un volume d’environ 81 µl pour

dA30 (253,2 µM) et 79 µl pour dT30 (260 µM). Après une période d’évaporation du solvant

de 15 minutes ou encore d’incubation de 60 minutes lorsque des oligonucléotides sont

ajoutés dans la sous-phase, le film a été comprimé à une vitesse de 10 mm/min

(5,2 x 10-2 nm2/molécule/min) jusqu’à l’atteinte de la pression de surface cible de

20 mN/m. Une fois cette pression obtenue, une période de 15 minutes a été allouée pour

que le film se stabilise avant de débuter le transfert. Le substrat a été maintenu à l’extérieur

de la sous-phase pour éviter l’adsorption d’ADN. Les supports utilisés sont hydrophiles, la

déposition du film débute donc lors de la première émersion. Toutefois, pour éviter tout

risque de dépôt, le substrat a été introduit dans la sous-phase à grande vitesse (20 mm/min).

Une fois son insertion complétée, une période de 2 minutes a été laissée pour permettre au

film de se stabiliser à nouveau. Après quoi, cinq couches ont été déposées à une vitesse de

1 mm/min pour les analyses XPS tandis qu’une seule couche a été transférée pour les

observations ATR et AFM. À titre de référence pour les études de spectroscopie à

photoélectrons X, le film de l’oligomère d’adénine a été préparé par évaporation de solvant.

114

5.3.2.2 ATR

Nous avons déjà présenté les spectres ATR de films épais de chacun de ces

monomères (section 4.5.2). Nous montrons ici les spectres ATR de monocouches du

M-C12-Adé transférées sur un cristal de germanium à partir de différentes sous-phases, soit

d’eau pure, de solutions aqueuses de l’oligonucléotide non complémentaire dA30, et

également complémentaire dT30 (Figure 5-17).

1850 1650 1450 1250 1050 850

0,000

0,002

0,004

0,006

0,008 eau pure dA

30

dT30

Abs

orba

nce

Nombre d'onde (cm-1)

Figure 5-17 Spectres ATR d’une monocouche de M-C12-Adé transférée sur un cristal de germanium à partir d’une sous-phase d’eau pure (––), d’une solution aqueuse d’oligonucléotides dA30 (---) et de dT30 (····).

On peut déduire par ce spectre qu’il y a hybridation entre le monomère M-C12-Adé

et dT30. La présence du brin complémentaire est montrée par la bande à 1641 cm-1. Ce sont

les groupements amide (HNC=O) de la thymine qui sont responsables de cette bande. On

ne peut toutefois pas confirmer que l’association est spécifique à l’oligomère

complémentaire puisqu’il y a aussi un changement dans le spectre du M-C12-Adé en

présence de dA30. La bande située à 1094 cm-1 peut être attribuée aux groupements PO2- de

l’acide nucléique.

115

5.3.2.3 AFM

La microscopie à force atomique a été utilisée afin d’obtenir de l’information sur la

morphologie des films Langmuir-Blodgett du monomère M-C12-Adé. Nous avons étudié les

films LB de ce monomère transféré à partir d’une sous-phase d’eau mais également d’une

sous-phase contenant l’oligonucléotide non complémentaire, le dA30 et le complémentaire

dT30. Les images AFM de ces films sont présentées à la Figure 5-18 pour une zone de

balayage du scanneur de 0,5 µm sur les axes xy et à la Figure 5-19 pour une zone de

balayage de 5 µm.

A C B

Figure 5-18 Images AFM d’une monocouche de M-C12-Adé transférée sur un substrat de silicium à partir (A) d’une sous-phase d’eau pure, d’une sous-phase contenant des oligonucléotides (B) dA30 et (C) dT30. La zone de balayage en xy est de 0,5 µm.

A C B

Figure 5-19 Images AFM d’une monocouche de M-C12-Adé transférée sur un substrat de silicium à partir (A) d’une sous-phase d’eau pure, d’une sous-phase contenant des oligonucléotides (B) dA30 et (C) dT30. La zone de balayage en xy est de 5 µm.

Les films de M-C12-Adé déposés sur des substrats de silicium sont uniformes et très

lisses. Il est à remarquer que l’échelle de hauteur n’est que de 2 nm. On ne dénote aucune

différence dans la morphologie des trois films, qu’il y ait ou non présence d’ADN. Ce

116 résultat appuie l’observation faite en microscopie à l’angle de Brewster lors des études in

situ à l’interface. Les films ont été transférés à une pression de surface de 20 mN/m et le

BAM a montré qu’à cette pression les films sont déjà très denses et qu’ils ne présentent

aucun domaine (Figure 5-14D et 5-15D). Cette morphologie du film est donc conservée

une fois transféré sur un support solide.

Parmi les techniques utilisées pour étudier les films de monomères sur support

solide, l’ATR a permis de montrer de façon qualitative une interaction entre le monomère

et l’ADN complémentaire et non complémentaire. La spectroscopie photoélectronique à

rayon X est la troisième technique envisagée pour étudier ces films. Elle permettra à son

tour non seulement de confirmer l’appariement du type Watson-Crick et du type non

standard, mais également de les quantifier.

5.3.2.4 XPS

Les échantillons ont été analysés par XPS avec un faisceau d’une puissance de

225 W et avec un angle d’incidence de 0° par rapport à la normale du plan des échantillons.

L’énergie de passage dans l’analyseur est de 160 eV pour les balayages larges (1150-0 eV)

et 40 eV pour les régions analysées à meilleure résolution. Un balayage étroit a été effectué

pour les régions N 1s, I 3d et P 2p. Afin de limiter le problème de la dégradation de

l’échantillon, les temps d’acquisition ont été réduits et la résolution légèrement sacrifiée.

De plus, pour gagner en sensibilité, seul le pic à plus faible énergie, I 3d5/2, du doublet de la

région I 3d a été enregistré. Les spectres ont été corrigés par rapport au carbone aliphatique

qui doit se situer à 285 eV et la correction de la ligne de base a été réalisée par la méthode

Shirley. Le logiciel CasaXPS a permis de traiter les spectres.

Pour maximiser le signal, il était nécessaire de réaliser les mesures XPS sur des

échantillons multicouches contrairement aux études ATR et AFM qui ont eu lieu sur une

seule couche de film. Pour connaître sommairement le comportement du monomère

M-C12-Adé lors du dépôt de multicouches, cinq couches d’un film étalé sur l’eau pure ont

été déposées sur un substrat de silicium. Ce dépôt a révélé que la déposition

Langmuir-Blodgett du M-C12-Adé se fait selon le type Y, c’est-à-dire dans les deux

117 directions. Le film est d’autant plus très stable à l’interface, les barrières ne compriment

que pour effectuer le transfert.

Film épais de dA30

Puisque le monomère est composé d’adénine, il a été utile d’étudier un oligomère

composé de ce nucléotide afin de bien attribuer les bandes ultérieurement. Le spectre à

haute résolution de la région de l’azote 1s est montré à la Figure 5-20. Cette bande a été

décomposée selon deux composantes, l’une à 401,1 eV attribuée à la présence d’azote non

conjugué et l’autre à 399,4 eV causée par l’azote conjugué de la purine. Un pic satellite de

shake-up est également visible à 405,5 eV. Sans aller dans le détail ici, ce dernier résulte de

transitions multiélectroniques.

408 406 404 402 400 398 396 394

20

40

60

80

100

120

CP

S

Énergie de liaison (eV)

x 102

(1)>N-

401,1

(2)-N=

399,4

shake-up

Figure 5-20 Spectre XPS à haute résolution dans la région N 1s d’un film épais de dA30.

Le spectre XPS de la région du phosphore 2p à la Figure 5-21 montre bien la

présence du doublet attendu, soit le pic de P 2p1/2 à 134,4 eV et celui de P 2p3/2 à 133,6 eV.

Ces valeurs correspondent à celles que l’on retrouve dans la littérature.50

118

140 138 136 134 132 130 128

5

10

15

20

25

(2)P 2p

3/2

133,6

CP

S

Énergie de liaison (eV)

x 102

(1)P 2p

1/2

134,4

Figure 5-21 Spectre XPS à haute résolution dans la région P 2p d’un film épais de dA30.

Le rapport atomique N/P calculé à partir des spectres à haute résolution de ces deux

régions élémentaires pour l’oligomère d’adénine est de 5,55. Dans ce cas-ci, N/P théorique

calculé à partir de l’architecture moléculaire équivaut à 5. Comme nous l’avions observé

pour l’oligomère de thymine (section 4.3.4) la valeur obtenue est supérieure à la valeur

théorique attendue. Pour dT30, cette valeur était de 81 % supérieure, tandis qu’ici pour dA30

la valeur obtenue n’est que de 11 % supérieure. Cette différence serait, d’après nous,

attribuable au meilleur signal enregistré pour chacun de ces deux éléments, soit environ 100

fois plus intense lors de l’étude de dA30. C’est principalement le faible rapport signal sur

bruit du phosphore qui mène à la surestimation du rapport N/P. Dans la littérature, un

rapport N/P aussi élevé que 8,2 a même été rapporté pour des oligomères simple brin

d’adénine.50

Film ultramince de M-C12-Adé

Un spectre XPS de survol d’un film ultramince de M-C12-Adé a d’abord été

enregistré (Figure 5-22). Tous les éléments constitutifs de ce monomère sont présents sur le

spectre à l’exception du palladium à 338 eV qui est un résidu de synthèse. La présence de

119 silicium indique également que l’échantillon est analysé sur toute son épaisseur. On

retrouve au Tableau 5-1 la composition atomique relative des constituants du film tirée des

données des spectres XPS.

1000 800 600 400 200 00

5

10

15

20

25

30

35

N A

ug

er

I 3s P

d 3

d

I 4p

I 4s

I 4d

I 3d

5/2

I 3p

1/2

I 3p 3

/2

I Au

ger

CP

S

Énergie de liaison (eV)

x104

C 1

s

N 1

s

O e

t I A

ug

er

Si 2

p

Si 2

s

O 1

s

I 3d 3

/2

Figure 5-22 Spectre XPS de survol d’un film ultramince de M-C12-Adé.

Tableau 5-1 Composition atomique relative des éléments d’un film ultramince de M-C12-Adé.

Composition atomique relative (%) Éléments (±0,2)

C 1s 68,9

O 1s 9,9

N 1s 8,5

I 3d 1,6

Si 2p 10,8

Pd 3d 0,3

120

La région de l’azote 1s est l’une des régions enregistrées avec un balayage étroit

pour permettre une meilleure analyse des pics (Figure 5-23). Le pic est constitué de deux

composantes distinctes, la première est située à 400,7 eV et correspond à 27,9 % de l’azote

total alors que la seconde à 399,0 eV correspond à 72,1 %. Ces deux valeurs d’énergie de

liaison obtenues ici correspondent parfaitement aux deux composantes observées avec un

film épais de dA30 et qui ont été présentées à la sous-section précédente. Répétons que l’on

observe à plus haute énergie, l’azote non conjugué (–NH2 et >N–) alors qu’à plus faible

énergie, on y voit l’azote conjugué (–N=).

406 404 402 400 398 396 39415

20

25

30

35

40

CP

S

Énergie de liaison (eV)

x 103

(1)>N- et -NH

2

400,7

(2)-N=

399,0

Figure 5-23 Spectre XPS à haute résolution dans la région N 1s pour un film ultramince de M-C12-Adé.

Le pic à plus basse énergie du doublet de I 3d a également été enregistré à meilleure

résolution (Figure 5-24). On observe également sur ce spectre la présence de deux

composantes, alors qu’on ne s’attend qu’à une seule. La composante majoritaire (621,0 eV;

94,1 %) est causée par l’iode du composé M-C12-Adé, tandis que la composante à 619,0 eV

(5,9 %) serait attribuable d’après nous à un phénomène de dégradation. Nous avons

d’ailleurs étudié la cinétique de l’apparition de cette forme réduite d’iode.

121

626 624 622 620 618 616

20

30

40

50

60

70

80

90

100

CP

S

Énergie de liaison (eV)

x 103

(1)I

621,0

(2)

I-

619,0

Figure 5-24 Spectre XPS à haute résolution dans la région I 3d5/2 d’un film ultramince de M-C12-Adé.

Dégradation de l’iode et de l’azote

Pour mieux évaluer la dégradation de l’iode dans le temps pour un échantillon de

M-C12-Adé, nous avons procédé à une analyse cinétique quantitative. Selon nous, il ne

semble y avoir aucun groupe de recherche qui discute de la dégradation de l’iode ou encore

de la formation d’une espèce réduite de cet élément. La dégradation a été étudiée selon

deux échelles de temps sur la même zone de l’échantillon. La Figure 5-25 montre

l’évolution des deux composantes en fonction du temps d’exposition aux rayons X. Le

premier spectre d’iode 3d5/2 enregistré est identifié t0, puis le spectre d’azote 1s est

enregistré, et à nouveau l’iode 3d5/2 (t0-1). Le carbone 1s servant à la correction de l’échelle

d’énergie est obtenu, puis suivi du troisième spectre de l’iode (t0-2). Ces trois spectres de

l’iode 3d constituent la première séquence d’acquisition. Une exposition de 12 minutes aux

rayons X suit cette séquence. Et ensuite, une série de spectres identiques à la première

séquence a été enregistrée : iode (t12), azote, iode (t12-1), carbone, iode (t12-2). Le cycle de

12 minutes d’exposition suivi de l’acquisition a été refait à deux autres reprises (t24 et t36).

122

626 624 622 620 618 616

20

30

40

50

60

70

80

90

100 t

0

t0-1

t0-2

t12

t12-1

t12-2

t24

t24-1

t24-2

t36

t36-1

t36-2

CP

S

Énergie de liaison (eV)

x 103

(1)I

621,0

(2)

I-

619,0

Figure 5-25 Spectre XPS à haute résolution de la région I 3d5/2 pour un film ultramince de M-C12-Adé montrant l’évolution des deux composantes en fonction du temps d’exposition aux rayons X.

C’est à partir de ces spectres que nous avons pu faire l’étude quantitative de la

formation d’un deuxième état d’oxydation de l’iode. Chacun des spectres a été décomposé

selon deux composantes comme il a été exposé précédemment à la Figure 5-24. La

première attribuée à l’atome d’iode du monomère et la seconde à la forme réduite. Le

Tableau 5-2 montre qu’à l’intérieur d’une même séquence d’enregistrement l’intensité du

pic de I 3d5/2 varie peu. La diminution d’intensité maximale notée est de 3,7 % (I24-2/I24 =

0,963). Il semble qu’après une très courte exposition (260 secondes), il y a augmentation de

l’intensité du pic jusqu’à 10,6 % (I0-2/I0 = 1,106) de sa valeur initiale.

123 Tableau 5-2 Évolution des rapports des concentrations atomiques apparentes d’iode 3d5/2

selon différents temps d’exposition aux rayons X pour une même séquence d’enregistrement.

Évolution du rapport des concentrations atomiques apparentes d’iode

I0-1/I0 1,057

I0-2/I0 1,106

I12-1/I12 0,989

I12-2/I12 0,985

I24-1/I24 1,006

I24-2/I24 0,963

I36-1/I36 0,974

I36-2/I36 0,988

Le Tableau 5-3 montre quant à lui la variation d’intensité du pic de I 3d5/2 entre

chacune des séquences d’enregistrement. La décroissance du pic est nettement plus

marquée dans ce cas-ci, elle peut même atteindre une valeur de 13 %. Toutefois, après la

première exposition de 12 minutes, il y a augmentation de l’intensité de la composante de

près de 7 % (I12/I0). Il est difficile d’expliquer ces augmentations et diminutions de

l’intensité en cours d’analyse. Bien qu’il y ait modification de l’état d’oxydation, la

concentration atomique relative de l’iode total est assez stable pour qu’on puisse établir des

rapports molaires monomère/nucléotide à partir de cet élément chimique.

Tableau 5-3 Évolution des rapports des concentrations atomiques apparentes d’iode 3d5/2

selon différents temps d’exposition aux rayons X pour des séquences d’enregistrement différentes.

Évolution du rapport des concentrations atomiques apparentes d’iode

I12/I0 1,067

I24/I0 0,962

I36/I0 0,870

124

Le même type d’étude cinétique a été refait pour vérifier cette fois le comportement

de l’azote. Cet atome a montré lui aussi un changement d’état chimique et c’est sa

composante à plus haute énergie de liaison qui augmente. Dans ce cas-ci par contre, la

concentration atomique relative de l’azote total n’est pas stable. On voit par le rapport

N36/N0 qu’elle peut augmenter à près de 26 % après une exposition de 3040 secondes

(Tableau 5-4). Nous en déduisons donc qu’il est important d’enregistrer les spectres le plus

rapidement possible afin d’éviter tout changement d’état d’oxydation et de biaiser ainsi les

rapports molaires obtenus. Nous jugeons fort intéressante cette observation pour

l’exploitation future de ces spectres.

Tableau 5-4 Évolution des rapports des concentrations atomiques apparentes d’azote 1s selon différents temps d’exposition aux rayons X pour des séquences d’enregistrement différentes.

Évolution du rapport des concentrations atomiques apparentes d’azote

N12/N0 1,205

N24/N0 1,224

N36/N0 1,259

Film ultramince de M-C12-Adé et dT30

Les spectres XPS ont également permis de confirmer l’hybridation du monomère

M-C12-Adé avec l’oligonucléotide complémentaire (dT30). Ce sont les mêmes éléments qui

ont été analysés à haute résolution, soit l’azote, l’iode et le phosphore. Le spectre XPS de la

région de l’azote 1s présente les deux composantes attendues (Figure 5-26). Les valeurs

d’énergie de liaison, de la largeur à mi-hauteur ainsi que de la concentration atomique

relative sont comparables à celles précédemment obtenues pour un film mince de

M-C12-Adé seul. La première composante, qu’on attribue à l’azote non conjugué, a une

énergie de liaison de 400,6 eV et une concentration atomique relative de 36,5 %. Pour

l’azote conjugué, ces valeurs sont 399,1 eV et 63,5 %, respectivement.

125

404 402 400 398 396

20

24

28

32

36

40

44

CP

S

Énergie de liaison (eV)

x 103

(1)>N- et -NH

2

400,6

(2)-N=

399,1

Figure 5-26 Spectre XPS à haute résolution dans la région N 1s d’un film ultramince de M-C12-Adé et dT30.

Pour l’iode, nous observons à nouveau le phénomène de dégradation, deux

composantes sont visibles sur le spectre à haute résolution de l’iode 3d5/2 (Figure 5-27). La

formation du second type d’iode est faible puisque la concentration atomique relative de

l’espèce réduite n’est que de 2,7 %. Les énergies de liaison sont identiques à celles notées

pour M-C12-Adé seul, soit 621,0 et 619,0 eV.

Quant à la région du phosphore, elle a été traitée de façon semblable au procédé

élaboré précédemment pour les films de DODAB-dT30. Tout d’abord, un spectre de cette

zone a été enregistré sur un substrat de silicium vierge au même angle d’incidence que celui

des échantillons, soit 0° (Figure 5-28). Comme il a déjà été mentionné, cette région n’est

pas linéaire en raison d’une trainée d’énergie du silicium 2p. Ainsi, deux composantes ont

été extraites de ce modèle de fond pour ensuite être appliquées au spectre des échantillons

de films minces.

126

626 624 622 620 618 616

20

30

40

50

60

70

80

90

100

CP

S

Énergie de liaison (eV)

x 103

(1)I

621,0

(2)

I-

619,0

Figure 5-27 Spectre XPS à haute résolution dans la région I 3d5/2 d’un film ultramince de M-C12-Adé et dT30.

142 140 138 136 134 132 130 128 12655

60

65

70

75

(2)Fond

CP

S

Énergie de liaison (eV)

x 102

(1)Fond

Figure 5-28 Spectre XPS à haute résolution dans la région P 2p d’un substrat de silicium vierge à un angle d’analyse de 0°.

127

La Figure 5-29 présente le spectre XPS de la région du phosphore pour le film

ultramince de M-C12-Adé et dT30. Les composantes identifiées 1 et 2 proviennent du

modèle de fond de silicium tandis que la composante 3 est bel et bien attribuée au signal du

phosphore 2p. Il équivaut à 41,7 % de la surface globale du pic. L’énergie de liaison est

située à 133,5 eV et correspond tout à fait à celle que l’on retrouve dans les bases de

recherche de référence.70 Cette bande confirme donc la présence d’ADN complémentaire

dans le film transféré sur le support solide. C’est un apport important que permet une fois

de plus la spectroscopie XPS.

142 140 138 136 134 132 130 128 126

55

60

65

70

75 (3)P 2p133,5

(2)Fond

CP

S

Énergie de liaison (eV)

x 102

(1)Fond

Figure 5-29 Spectre XPS à haute résolution dans la région P 2p d’un film ultramince de

M-C12-Adé et dT30.

Film ultramince de M-C12-Adé et dA30

Afin de vérifier si l’hybridation du monomère M-C12-Adé est bien spécifique, c’est-

à-dire que l’appariement n’a lieu qu’entre des bases complémentaires, nous avons procédé

à un contrôle. Pour ce faire, un film de M-C12-Adé a été préparé à partir d’une sous-phase

contenant des oligonucléotides dA30 et ensuite déposé sur un substrat de silicium. Aucun

changement n’est détecté sur les spectres des régions de l’azote et de l’iode. Le spectre XPS

à haute résolution dans la région N 1s présente les deux composantes habituelles (Figure

128 5-30), la première à 400,6 eV (29,1 %) et la deuxième à 399,0 eV (70,9 %). Les attributions

sont les mêmes que celles qui ont été faites pour les composés précédents. On retrouve à

plus haute énergie l’azote non conjugué et à plus faible l’azote conjugué.

404 402 400 398 39615

20

25

30

35

40

45

CP

S

Énergie de liaison (eV)

x 103

(1)>N- et -NH

2

400,6

(2)-N=

399,0

Figure 5-30 Spectre XPS à haute résolution dans la région N 1s d’un film ultramince de M-C12-Adé et dA30.

Le spectre XPS de l’iode 3d5/2 pour le film de M-C12-Adé et dA30 montre lui aussi

les deux composantes attribuées ultérieurement (Figure 5-31). Les énergies de liaison sont

identiques à celles obtenues précédemment pour cet élément, 621,0 et 619,0 eV. Les

concentrations atomiques relatives sont aussi comparables, soit 96,9 et 3,1 %.

129

626 624 622 620 618 616

20

30

40

50

60

70

80

90

100

CP

S

Énergie de liaison (eV)

x 103

(1)I

621,0

(2)

I-

619,0

Figure 5-31 Spectre XPS à haute résolution dans la région I 3d5/2 d’un film ultramince de M-C12-Adé et dA30.

Le spectre XPS à haute résolution dans la région du phosphore 2p présenté à la

Figure 5-32 confirme la présence de phosphore dans ce film formé sur une sous-phase

d’oligomère d’adénine. Encore ici les composantes identifiées 1 et 2 sont attribuées à cette

trainée d’énergie du silicium 2p observée sur le modèle du fond. La troisième composante

dont la concentration atomique relative est de 53,3 % et qui se présente à une valeur

d’énergie de liaison de 133,4 eV est reliée à P 2p. Malheureusement, la présence de

phosphore démontre que l’hybridation du monomère M-C12-Adé n’est pas spécifique aux

acides nucléiques complémentaires puisqu’il y a appariement entre deux bases d’adénine.

130

142 140 138 136 134 132 130 128 126

55

60

65

70

75 (3)P 2p133,4

(2)Fond

CP

S

Énergie de liaison (eV)

x 102

(1)Fond

Figure 5-32 Spectre XPS à haute résolution dans la région P 2p d’un film ultramince de M-C12-Adé et dA30.

L’appariement entre deux bases d’adénine est un phénomène qui peut survenir.

L’appariement de base dans l’ADN est souvent considéré seulement en terme de liaison

hydrogène Watson-Crick. Il existe toutefois plusieurs autres arrangements possibles, et ce,

même si ceux-ci sont moins favorables. Donohue71 fut le premier à reconnaitre l’existence

de ces liaisons non standards. Selon Burkard et al.72, en plus des 2 paires de bases du type

Watson-Crick, il y aurait 27 autres structures qui impliquent au moins deux liaisons

hydrogène. Plusieurs de ces paires de bases ont été observées expérimentalement tandis que

d’autres sont issues de calculs théoriques. In vivo, il se produit naturellement des

mésappariement de bases lors du processus de réplication de l’ADN. Toutefois, des

mécanismes de réparations sont en place afin de détecter et corriger ces erreurs. Si des

défauts perdurent, ceux-ci conduisent à l'introduction de mutations dans les cellules filles et

des conséquences importantes comme des cancers et des maladies génétiques peuvent en

découler.

Plusieurs chercheurs étudient les causes des différents types de

mésappariements.73,74 Certains assemblages non Watson-Crick peuvent être expliqués en

invoquant un changement de formes tautomères (céto-énol et amino-imino) ou par une

131 isomérisation (anti-syn) ou encore pour certaines paires de bases, les groupements

fonctionnels impliqués dans les liaisons hydrogène diffèrent, on l’appelle appariement

Wobble.

Les paires de bases peuvent être classées en quatre différentes catégories soit,

purine-pyrimidine, purine-purine (homo et hétéro) et pyrimidine-pyrimidine. La classe qui

nous intéresse ici concerne les liaisons homopurine puisque nous avons observé des liens

entre deux molécules d’adénine. Voici quatre arrangements possibles de paires de bases

d’adénine71,72,73 :

Figure 5-33 Quatre mésappariements possibles de deux bases azotées d’adénine.

Nos expérimentations ne font pas intervenir une double hélice, mais plutôt une

chaîne d’oligonucléotides avec des unités monomériques formées d’une base azotée.

Contrairement à la double hélice où les mésappariements déstabilisent la structure, on peut

penser que dans notre système ces liaisons non Watson-Crick n’ont pas d’impact sur la

stabilité. De plus, le monomère M-C12-Adé a beaucoup plus de liberté et de flexibilité

132 puisqu’il ne fait pas partie d’une chaîne, cela lui permet de se réorienter et de créer des

liaisons hydrogène avec les nucléotides. On peut donc croire qu’un changement au niveau

de la structure du monomère M-C12-Adé pourrait permettre de lui conférer une rigidité ou

amener des contraintes stériques, et ainsi défavoriser les liaisons avec l’adénine. Aussi,

puisque les formes tautomères semblent rendre possible les liaisons A-A (Figure 5-33D),

un changement de pH s’avèrerait peut-être utile pour contrer l’appariement non spécifique.

Les tableaux qui suivent résument les données expérimentales tirées des spectres

XPS. Le Tableau 5-5 concerne les échantillons à composé unique; celui du film mince de

M-C12-Adé, le film épais de dA30 et celui de dT30. Le Tableau 5-6 donne quant à lui les

paramètres expérimentaux pour les films de complexes monomère-oligonucléotide;

complémentaire et non complémentaire.

Tableau 5-5 Paramètres expérimentaux des diverses composantes spectrales XPS obtenues dans les régions N 1s, P 2p et I 3d5/2 pour des échantillons de M-C12-Adé, dA30 et dT30.

Région

XPS Échantillon

Composantespectrale

Énergie de liaison

(eV) ±0,2

LMH*

Concentration atomique

relative (%) ±0,2

Attribution

N 1s M-C12-Adé 1 400,8 1,51 27,9 >N– et –NH2

2 399,1 1,39 72,1 –N=

dA30 1 401,1 1,96 48,6 >N– et –NH2

2 399,4 1,34 49,9 –N=

dT30 1 400,8 2,06 46,5 >N–

2 400,0 1,33 53,5 –N=

P 2p M-C12-Adé - - - - -

dT30 1 134,8 1,84 33,3 P 2p1/2

2 133,9 1,84 66,7 P 2p3/2

dA30 1 134,4 1,23 33,3 P 2p1/2

2 133,6 1,23 66,7 P 2p3/2

I3d5/2 M-C12-Adé 1 621,0 1,28 94,1 I 3d5/2

2 619,0 1,33 5,9 I 3d5/2

*Largeur à mi-hauteur

133 Tableau 5-6 Paramètres expérimentaux des diverses composantes spectrales XPS obtenues dans les régions N 1s, P 2p et I 3d5/2 pour des échantillons de complexes M-C12-AdédT30 et M-C12-AdédA30.

Région

XPS Échantillon

Composantespectrale

Énergie de liaison

(eV) ±0,2

LMH

Concentration atomique

relative (%) ±0,2

Attribution

N 1s M-C12-AdédT30 1 400,6 1,54 36,5 >N–

2 399,1 1,40 63,5 –N=

M-C12-AdédA30 1 400,6 1,48 29,1 >N–

2 399,0 1,43 70,9 –N=

P 2p M-C12-AdédT30 2 133,5 1,82 41,7 P 2p

M-C12-AdédA30 2 133,4 1,89 53,3 P 2p

I 3d5/2 M-C12-AdédT30 1 621,0 1,29 97,3 I

2 619,0 1,36 2,7 I-

M-C12-AdédA30 1 619,0 1,53 3,1 I

2 621,0 1,29 96,9 I-

L’étude XPS présentée dans cette section démontre qu’il y a bien hybridation entre

les bases azotées complémentaires du monomère M-C12-Adé et dT30. Toutefois, le

phénomène se produit également en présente d’acide nucléique non complémentaire. Il est

intéressant de constater qu’on peut évaluer quantitativement ces deux types d’hybridation.

Ce sont deux rapports atomiques différents qui ont été utilisés pour y parvenir. Dans un

premier temps, nous souhaitions comparer le rapport I/N théorique par rapport à celui

obtenu avec les valeurs expérimentales. Le rapport théorique se calcule tout simplement en

utilisant la proportion des atomes dans la structure moléculaire des composés formant le

film. Pour M-C12-Adé, le rapport théorique I/N est 0,20 (1/5), pour un film de M-C12-Adé

et dT30 la valeur est 0,14 (1/7) et pour un film de M-C12-Adé et dA30 le rapport attendu est

0,10 (1/10). Lorsque des oligonucléotides sont présents dans le complexe, le calcul se fait

en considérant la proportion 1:1 (monomère/nucléotide). Les valeurs expérimentales tirées

des spectres sont très cohérentes avec les valeurs attendues (Tableau 5-7). C’est pour cette

raison que l’on croit que l’hybridation complémentaire ou non complémentaire selon le cas

134 a lieu dans des rapports molaires se rapprochant de l’unité (1 monomère/1 nucléotide). Il

est possible de calculer précisément la proportion molaire monomère/nucléotide grâce aux

valeurs expérimentales du rapport. Les valeurs obtenues correspondent très bien à celles

prédites, soit 1,2 pour un film de M-C12-Adé et dT30 et 1,9 pour un film de M-C12-Adé et

dA30. Bien que ces deux valeurs soient du même ordre de grandeur, on dénote toutefois que

l’hybridation dans le cas de l’acide nucléique complémentaire est légèrement meilleure

puisque le rapport monomère/nucléotide se rapproche plus de l’unité.

Tableau 5-7 Valeurs théoriques et expérimentales des rapports atomiques I/N et N/P obtenus par la spectroscopie de photoélectrons X pour des films ultraminces de M-C12-Adé seul, avec dT30 et dA30. Valeurs des rapports molaires monomère/nucléotide calculés à partir des rapports atomiques expérimentaux.

I/N N/P

Valeur théorique

Valeur expérimentale

monomère/nucléotide

Valeur théorique

Valeur expérimentale

monomère/nucléotide

M-C12-Adé 0,20 0,18 - - - -

M-C12-Adé dT30

0,14 0,15 1,2 7 23,63 4,33

M-C12-Adé dA30

0,10 0,13 1,9 10 23,81 3,76

À titre comparatif, nous avons aussi évalué de façons théorique et expérimentale le

rapport atomique N/P. On remarque cette fois une différence importance entre les valeurs

attendues et celles obtenues. En utilisant la valeur expérimentale de ce rapport, nous avons

à nouveau calculé le rapport molaire monomère/nucléotide. Pour l’échantillon M-C12-Adé

et dT30, la proportion des deux composantes est 4,33, alors que pour le complexe contenant

dA30 le rapport molaire est 3,76. Encore une fois ces deux valeurs sont du même ordre de

grandeur. Cependant, la composition molaire des complexes est près de quatre fois

supérieure à ce qui a été évalué avec le rapport atomique I/N pour le film contenant dT30 et

deux fois plus élevée pour dA30. Ceci vient selon nous ajouter une preuve supplémentaire

au fait que le signal du phosphore est sous-évalué même avec les précautions prises au

niveau du fond du spectre de la région P 2p. C’est cette même tendance qui a été discutée

135 plus tôt concernant la surévaluation du rapport N/P dans le cas des films épais de dT30 et

dA30.

L’analyse des données tirées des spectres XPS, tel que nous les avons enregistrées,

nous permet de conclure qu’il y a hybridation complémentaire et non complémentaire du

monomère M-C12-Adé et ce, dans les mêmes proportions. Il nous semble également évident

que le rapport atomique I/N est un meilleur choix pour évaluer le rapport molaire

monomère/nucléotide lors de la formation de ces complexes en vue bien sûr d’en arriver un

jour à un polymère d’ADN-mimétique.

Conclusion

Ce projet de recherche avait comme but ultime d’assembler des monomères

fonctionnalisés synthétiques selon une séquence dictée par un brin d’ADN gabarit pour en

faire un polymère « ADN-mimétique ». L’information génétique d’un brin d’ADN modèle

pourrait ainsi être enregistrée dans un polymère synthétique. La reconnaissance

moléculaire, ou plus précisément l’appariement entre les bases complémentaires, est le

phénomène qui permet l’association des monomères au gabarit d’ADN.

Comme il a été décrit, deux stratégies ont été envisagées pour obtenir un polymère

ADN-mimétique. La première utilise des surfactants cationiques pour conduire les brins

monocaténaires d’ADN sur un support solide pour ensuite y faire l’assemblage des

monomères fonctionnalisés selon l’ordre dicté par la séquence d’ADN. La deuxième

méthode que nous avons expérimentée vise plutôt l’utilisation des monomères

fonctionnalisés directement à l’interface air-eau.

La formation d’un complexe électrostatique entre le surfactant DODAB et des

oligonucléotides a pu effectivement être démontrée. La spectroscopie infrarouge de

réflexion totale atténuée et la spectroscopie de photoélectrons X ont permis de déterminer

que cette interaction se fait dans un rapport DODAB/nucléotide de 1:1. La microscopie à

fluorescence a montré par ailleurs que l’ADN n’est pas distribué uniformément sur le

substrat mais se présente plutôt sous la forme d’agrégats. Toutefois, comme nous l’avons

mentionné la microscopie à l’angle de Brewster a nettement montré que la présence du

fluorophore dans la sous-phase modifie la morphologie du film, et ce, en créant des

agrégats à l’interface. C’est pourquoi malgré cette agglomération des brins d’ADN,

l’association avec les monomères M-C12-Adé et M-C12-Thy a tout de même été réalisée et

suivie par ATR. Il y a eu appariement entre les bases complémentaires mais également une

hybridation non spécifique. Une évaluation quantitative à partir de rapports d’intensité a

permis de déterminer que l’appariement des bases non complémentaires se fait toutefois

dans une moindre mesure.

Pour cette première stratégie, il serait maintenant intéressant d’optimiser la

distribution des acides nucléiques sur le support solide lorsque le film est transféré. Une

137

voie possible pour y arriver, selon nous, serait d’ajouter une molécule « séparatrice » dans

la sous-phase pour empêcher l’agrégation des brins d’ADN et ainsi augmenter la distance

qui les sépare. De cette façon, la polymérisation se ferait selon la séquence dictée par le

brin gabarit. De plus, il serait important d’optimiser l’hybridation afin de ne favoriser que

l’appariement Watson-Crick. Et bien évidemment, pour mener à terme ce projet, l’étape

subséquente serait de polymériser les monomères et de vérifier par diverses techniques

d’analyse que le polymère obtenu a bien la séquence complémentaire au brin modèle. Si

cette avenue s’avère positive, il faudra refaire toutes les étapes pour une séquence réelle

contenant les quatre bases azotées.

La deuxième stratégie a exigé en premier lieu d’établir la structure moléculaire des

monomères ou encore des nucléolipides afin qu’ils forment une monocouche à l’interface

air-eau. La première génération de molécules synthétisées comportait deux monomères :

THY et DAP et deux nucléolipides : C4-THY et C6-THY. Parmi ces quatre molécules,

aucune n’a formé de film de Langmuir à l’interface, et ce, même en modifiant la

composition de la sous-phase. Deux nouveaux nucléolipides ont fait partie de la seconde

génération de composés. Le premier, le C6-EG-THY ne possédait pas de chaîne

hydrophobe assez longue pour permettre à la molécule de bien s’ancrer à l’interface air-eau

et de former un film de Langmuir. Le deuxième, le C12-EG-THY, avec l’augmentation de la

longueur de la chaîne hydrophobe s’est avéré efficace pour la formation de monocouche.

Les spectres obtenus par ATR montrent qu’il y a présence d’acide nucléique

complémentaire dans le film transféré. C’est la troisième génération qui a montré le plus de

potentiel. Les deux monomères, M-C12-Adé et M-C12-Thy forment des films de Langmuir

très stables et démontrent un appariement de bases avec les acides nucléiques.

Malheureusement, cette reconnaissance moléculaire ne se révèle pas sélective pour les

bases complémentaires. Le rapport molaire monomère/nucléotide se situe entre 1 et 2

environ, un rapport comparable à celui déjà obtenu pour l’interaction électrostatique de

notre première stratégie. Encore une fois ici, il serait nécessaire d’optimiser les conditions

expérimentales pour obtenir un appariement de bases complémentaires seulement, avant de

procéder à la polymérisation envisagée.

138

Les différentes approches expérimentales que nous avons évaluées au cours de ce

projet, de même que les résultats que nous avons tirés ou encore les observations qu’elles

ont permises, laissent présager beaucoup d’espoir de voir dans l’avenir rapproché des

polymères ADN-mimétiques disponibles.

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