Razvoj metoda mikrorazmnožavanja i procjena genetičke...

AGRONOMSKI FAKULTET

Anita Mihovilović Bošnjak

Razvoj metoda mikrorazmnožavanja i

procjena genetičke stabilnosti triju vrsta

perunika (Iris spp.) razmnoženih in vitro

DOKTORSKI RAD

Zagreb, 2013.

FACULTY OF AGRICULTURE


Development of micropropagation methods

and estimation of genetic stability for three

Iris species (Iris spp.) propagated in vitro

DOCTORAL THESIS

Zagreb, 2013

AGRONOMSKI FAKULTET


Razvoj metoda mikrorazmnožavanja i

procjena genetičke stabilnosti triju vrsta


DOKTORSKI RAD

Mentor: prof. dr. sc. Snježana Kereša

Zagreb, 2013.

FACULTY OF AGRICULTURE


Development of micropropagation methods

and estimation of genetic stability for three


DOCTORAL THESIS

Supervisor: prof. dr. sc. Snježana Kereša

Zagreb, 2013

ŽIVOTOPIS MENTORA

Dr. sc. Snježana Kereša, izvanredna profesorica, zaposlena je u Zavodu za oplemenjivanje

bilja, genetiku i biometriku, Sveučilišta u Zagrebu Agronomskog fakulteta. Na Sveučilištu u

Zagrebu Agronomskom fakultetu je diplomirala (1994.), magistrirala (1997.) i doktorirala

(2002.). Istraživanja za magistarski rad iz područja sinteze umjetnih gena i njihova kloniranja,

i doktorski rad iz područja genetičkih modifikacija biljaka za otpornost na štetne kukce izvela

je na Sveučilištu Udine (Italija). Znanstveno se je usavršavala na Sveučilištu u Udinama i

Sveučilištu u Trstu u ukupnom trajanju od dvije godine.

Koordinatorica je modula Biljna biotehnologija (6 ECTS-a) na diplomskom studiju, te

Biotehnologija u oplemenjivanju bilja (3 ECTS-a) na poslijediplomskom doktorskom studiju

Poljoprivredne znanosti. Suradnica je u još pet modula na preddiplomskom, diplomskom i

poslijediplomskom doktorskom studiju. Bila je mentorica 14 diplomskih i dva završna rada.

U znanstveno-istraživačkom radu primarno se bavi regeneracijom i

mikropropagacijom različitih biljnih vrsta (pšenica, perunike, krizanteme, begonije, hrvatska

bresina, jabuka, Prunus voćne podloge) u kulturi biljnog tkiva. Ispituje i mogućnost indukcije

somaklonske varijabilnosti za tolerantnost na sušu u kulturi tkiva pšenice.

Bila je voditelj jednog bilateralnog (hrvatsko-talijanskog) projekta i suradnik u pet

nacionalnih znanstvenih projekata, a trenutno je voditelj nacionalnog znanstvenog projekta

Razvoj metoda mikrorazmnožavanja i uvođenje u hortikulturu endemičnih perunika (MZOS

RH) i suradnik na projektu Tajna starih sorata jabuke (Zaklada ADRIS).

Autorica je 25 znanstvenih radova od kojih je 10 referirano u ISI WoS. Koautorica je

jednog poglavlja u knjizi.

Članica je slijedećih hrvatskih i međunarodnih znanstvenih društava: Hrvatsko

genetičko društvo, Hrvatsko društvo za biljnu biologiju, Hrvatsko društvo za biotehnologiju,

European Association for Research on Plant Breeding (EUCARPIA), Pannonian Plant

Biotechnology Association.

Aktivno govori engleski, a pasivno se služi talijanskim jezikom.

Razvoj metoda mikrorazmnožavanja i procjena genetičke stabilnosti triju vrsta


SAŽETAK

Rod Iris ima preko 300 vrsta, i usprkos velikom hortikulturnom potencijalu Iridaceae

germplazme, do sada je mikropropagirano samo 40-ak vrsta iz 12 rodova ove porodice.

Razlog tome dijelom može biti u slabijoj regenerativnoj sposobnosti jednosupnica u

usporedbi s dvosupnicama. Bez obzira na teškoće, kultura tkiva perunika razvija se već 40

godina ponajviše zbog velike potražnje tržišta za biljkama perunika slobodnim od virusa.

Mnoge vrste iz ove porodice su endemi, rijetke i/ili zaštićene i većina ih još nije u uzgoju.

Hrvatske endemične perunike Iris adriatica Trinajstić ex Mitić, Iris illyrica Tomm. te Iris x

rotschildii Degen. su vrste veoma atraktivnih cvjetova i stoga zanimljive za komercijalnu

proizvodnju. Razmnožavaju se vegetativno, dijeljenjem rizoma, zbog čega je stopa umnažanja

niska pa mikropropagacija postaje zanimljiva kao metoda razvoja početne populacije koja će

služiti kao matičnjak biljaka.

U ovom radu je na temelju postojećih podataka o regeneraciji drugih vrsta perunika u kulturi

tkiva razvijen protokol regeneracije za spomenute tri hrvatske endemične vrste perunika. Za

indukciju kalogeneze i somatske embriogeneze korištene su najčešće upotrebljavanje

kombinacije i koncentracije auksina: 2,4-D (1 mg/L) sama ili u kombinaciji s NAA (1 mg/L)

ili pak sama NAA (2,5 mg/L). Sposobnost indukcije kalogeneze iz eksplantata baze listova

razlikovala se kod tri promatrane vrste perunika, a ovisila je o donorskoj biljci (genotipu) kod

jadranske i ilirske perunike, dok je kod Rotschildove perunike na indukciju kalusa značajno

utjecao tretman tj. sastav regulatora rasta u hranidbenoj podlozi. Genotipovi jadranske

perunike su bili najuspješniji u indukciji proembriogenih kalusnih struktura s uspješnošću do

43,40% dok su genotipovi ilirske i Rotschildove perunike embriogene kaluse razvili na

najviše 15,18% odnosno 12,03% induciranih kalusa. Na eksplantatim korijena nije induciran

niti jedan kalus ni na jednoj od tri promatrane vrste perunika, bez obzira na tretman.

Poznato je da je rast biljnih stanica in vitro i njihova regeneracija u čitave biljke vegetativan

proces koji uključuje samo mitotske diobe stanica i teoretski ne bi trebao uzrokovati nikakvu

varijabilnost. Ipak, u mnogim je istraživanjima dokazano da se promjene u somatskim

stanicama za vrijeme mitotske diobe povremeno događaju i mogu rezultirati varijabilnošću

razvijenog klonskog potomstva. Ovu pojavu nazivamo somaklonskom varijabilnošću (soma=

vegetativan, klon= identična kopija). Iako ovisi o brojnim faktorima, za sintetske auksine 2,4-

D i NAA se smatra da su povezani s njenom pojavom. Upravo su ti auksini najčešće nužni za

indukciju kalogeneze, a korišteni su i u ovom istraživanju. S druge strane, somatski embriji

nastaju iz meristematskih i nediferenciranih mladih tkiva biljke pa se može očekivati očuvanje

genetske stabilnosti embriogenih kalusa.

Biljke dobivene somatskom embriogenezom u ovom istraživanju, analizirane su s ciljem

utvrđivanja klonske vjernosti na fenotipskoj, citogenetičkoj i genskoj razini. Analizom

glavnih komponeneta (PCA) temeljenom na morfometrijskim izmjerama, razlikovane su

promatrane vrste dok su regeneranti pojedine donorske biljke većinom zadržali sličnost s

matičnom skupinom. Varijable koje su utjecale na razlikovanje vrsta, odnosno one s najvećim

vrijednostima u prvoj glavnoj komponenti svojstvenih (eigen) vektora bile su širina (0,38) i

dužina donjeg lista perigona (0,37), visina biljke (0,37) i širina gornjeg lista perigona (0,37).

Da bi se utvrdila klonska vjernost regeneranata na citogenetičkoj razini provedena je analiza

sadržaja jezgrine DNA protočnim citometrom. Protočna citometrija je brza i pouzdana

metoda, a u kratkom vremenu može analizirati reprezentativan broj jezgara. Promjena

ploidnosti zabilježena je samo kod jednog od 74 analizirana regeneranta Rotschildove

perunike što čini manje od 1,35%. Kod druge dvije vrste nije bilo odstupanja u razini

ploidnosti.

Deset kombinacija početnica korišteno je za provjeru klonske vjernosti na DNA razini AFLP

sustavom genskih biljega. AFLP se smatra posebno prikladnom metodom detekcije u

istraživanjima u kojima se očekuje mali stupanj genetske raznolikosti. Kod sve tri vrste je

većina regeneranata zadržala sličnost s matičnom skupinom. Kod jadranske perunike je Dice-

ov koeficijent sličnosti varirao od 95-97 %, kod ilirske perunike 91-96% dok je kod

Rotschildove perunike iznosio 87-94%. Regenerant koji se najviše razlikovao unutar pojedine

vrste dijelio je s ostalim regenerantima svoje skupine 81% sličnosti kod jadranske perunike,

92% kod ilirske perunike i 86,7% sličnosti kod Rotschildove perunike. Mantelovim testom

ustanovljeno je da nema korelacije između matrica udaljenosti dobivenih na osnovi

morfoloških i molekularnih podataka. Taj se podatak može objasniti utjecajem okolinskih i/ili

eventualnih epigenetskih faktora na fenotip biljke.

Dakle, biljke regenerirale u procesu somatske embriogeneze najvećim su dijelom ostale vrlo

vjerni klonovi matičnih biljaka. Očigledno su koncentracije sintetskih auksina 2,4-D i NAA

upotrebljene u ovom istraživanju bile ispod razine koja uzrokuju somaklonsku varijabilnost

kod istraživanih vrsta. Regeneracijski protokol razvijen u okviru ovog rada može se

preporučiti za mikropropagaciju jer osigurava genetsku vjernost razvijenih biljaka.

Ključne riječi: Iris spp., mikropropagacija, somatska embriogeneza, somaklonska

varijabilnost, aksilarno grananje, morfometrijska mjerenja, protočna citometrija, AFLP

Development of micropropagation methods and estimation of genetic stability for three


SUMMARY

The genus Iris includes over 300 species and despite of huge horticultural potential of

Iridaceae germplasm only 40 species belonging to 12 genera have been micropropagated so

far. One of the main reasons for that could be in lower regeneration capacity of

monocotyledons compared to dicotyledons. In spite all of the obstacles Iris tissue culture is

developing for more than 40 years, mainly because of high market demand for virus-free

plants. Many species belonging to Genus Iris are endemic, rare or endangered and most of

them are not yet commercially exploited. Croatian endemic Iris species Iris adriatica

Trinajstić ex Mitić, Iris illyrica Tomm. and Iris x rotschildii Degen. have very attractive

flowers and therefore have ornamental potential. They are propagated vegetatively by

dividing the rhizomes, but this method is slow. Therefore micropropagation becomes an

interesting method for development of the starting population.

The objective of this study was to develop the regeneration protocol for three croatian Iris

species, based on available/published data on regeneration of other Iris species. Three most

frequently used combinations and concentrations of auxines were used to induce callogenesis

and somatic embryogenesis: 2,4-D (1 mg/L) alone or in combination with NAA (1 mg/L) or

NAA (2.5 mg/L) alone. Three studied species differed in efficiency of callogenesis induction

from base leaf explants. The efficiency of callogenesis induction for Adriatic iris and Iliric iris

was dependent on donor plant/genotype, while in Rotschild iris it was dependent on the

treatment used. Adriatic iris was the most efficient in formation of proembriogenic callus

structures when compared to the number of induced calli (43.40%). Illiric and Rotschildii iris

formed proembriogenic callus structures with 15.18% and 12.03% efficiency, respectively.

No callus formation was observed on root explants, whichever species or treatment used.

It is well known that plant cells growth in vitro and regeneration of whole plants from plant

cells is a vegetative process. It includes mitotic divisions only and should not cause any

variability. Nevertheless, it has been proved in many experiments that during mitotic divisions

changes in somatic cells occasionally occur which can cause clonal progeny variability. This

phenomenon is called somaclonal variability (soma= vegetative, clon= identical copy).

Although it depends on many factors synthetic auxins (2,4-D and NAA) are most frequently

associated with its appearance. These auxines are commonly used for the callogenesis

induction and they are also used in this study. On the other hand, somatic embryos develop

from meristematic and undifferentiated young tissues. For this reason genetic stability

maintenance could be expected.

In order to assess clonal fidelity of somatic embryogenesis-derived plants phenotypic,

cytogenetic and molecular analyses were conducted. Principal component analysis (PCA)

based on morphometric data differentiated species while most of the regenerants kept

homogeneity with the parent group. Crucial variables for species differentiation were those

with the the biggest value of eigenvectors in the first component: width (0.38) and lenght

(0.37) of the lower perigon leaf, plant height (0.37) and width of the upper perigon leaf (0.37).

Cytogenetic fidelity of regenerants was assessed by flow citometry. Flow cyotmetry is fast

and reliable method by which a representative number of nuclei can be measured in the short

time. Change in ploidy level was observed in only one regenerant of Iris x rotschildii, which

is less than 1.35% of changes. In other species no change in ploidy level was observed.

Ten AFLP primer combinations were used to assess genetic fidelity of regenerants at a

molecular level. AFLP is considered an appropriate method of detection when low genetic

variation is expected. The most of regenerants of the three investigated species have

maintained similarity with the parent group. Dice coefficient of similarity ranged from: 95-

97% for Adriatic iris, 91-96% for Illiric iris and 87-94% for Rotschild iris. In each examined

iris species the most distinct regenerant shared high similarity with other regenerants from the

same donor plant (81%, 92% and 86,7% for Adriatic iris, Illiric iris and Rotschild iris,

respectively). Mantel test showed that there is no correlation between morphological and

molecular distance matrices. This fact can be explained by the influence of environmental

and/or epigenetic factors on phenotype of the plant.

According to the all methods used to asses somaclonal variation plants regenerated via

somatic embryogenesis mostly remained clonal copies. Although sintetic auxins 2,4-D and

NAA are considered to cause changes in ploidy level, concentrations used in this experiment

were obviously beneath the level which could cause somaclonal variation in the three

examined iris species. In conclusion this regeneration protocol could be recommended for

micropropagation of Adriatic iris, Illiric iris and Rotschild iris because it ensures genetic

fidelity of regenerants.

Key words: Iris spp., micropropagation, somatic embryogenesis, somaclonal variation,

axillary branching, morphometric measurments, flow cytometry, AFLP

Sadržaj

1. UVOD ....................................................................................................................................................... 1

2. HIPOTEZA I CILJEVI ............................................................................................................................. 3

3. PREGLED LITERATURE ....................................................................................................................... 4

3.1. Opće značajke i klasifikacija roda Iris ................................................................................................... 4

3.2. Hrvatske endemične vrste roda Iris ........................................................................................................ 5

3.2.1. Iris adriatica Trinajstić ex Mitić – jadranska perunika ................................................................... 7

3.2.2. Iris illyrica Tomm. – ilirska perunika ............................................................................................. 8

3.3.3. Iris x rotschildii Degen – Rotschildova perunika ............................................................................ 9

3.3. Mikrorazmnožavanje perunika ............................................................................................................. 10

3.4. Provjera klonske vjernosti regeneranata ............................................................................................... 16

3.4.1. Metode procjene somaklonske varijabilnosti ................................................................................ 18

3.4.1.1. Procjena somaklonske varijabilnosti u kulturi perunika ..................................................... 18

3.4.1.2. Morfološke metode procjene somaklonske varijabilnosti ................................................ 19

3.4.1.2.1 . Morfološke analize u kulturi perunika ............................................................................... 19

3.4.1.3. Citogenetičke metode procjene somaklonske varijabilnosti............................................. 20

3.4.1.3.1. Citogenetičke analize u kulturi perunika ............................................................................ 21

3.4.1.4. Molekularne metode procjene somaklonske varijabilnosti .............................................. 22

3.4.1.4.1. Molekularne analize u kulturi perunika ............................................................................. 29

4. MATERIJALI I METODE ..................................................................................................................... 30

4.1. Kultura tkiva ......................................................................................................................................... 30

4.1.1. Biljni materijal ............................................................................................................................... 30

4.1.2. Uspostavljanje sterilne kulture baza listova .................................................................................. 30

4.1.3. Sastav hranidbenih podloga ........................................................................................................... 31

4.1.4. Uspostavljanje sterilne kulture korijenja ....................................................................................... 32

4.1.5. Uspostavljanje sterilne kulture vegetacijskih vršaka ..................................................................... 32

4.1.6. Uvjeti kulture tkiva ........................................................................................................................ 34

4.2. Analiza fenotipa ................................................................................................................................... 35

4.3. Veličina genoma ................................................................................................................................... 36

4.4. Molekularne analize ............................................................................................................................. 38

4.4.1. Izolacija DNA................................................................................................................................ 38

4.4.2. Procjena kvalitete i količine izolirane DNA .................................................................................. 40

4.4.3. AFLP analiza ................................................................................................................................. 42

4.4.3.1. Restrikcija i ligacija .......................................................................................................... 42

4.4.3.2. Predumnažanje (predamplifikacija) .................................................................................. 43

4.4.3.3. Selektivno umnažanje ....................................................................................................... 44

4.4.3.4. Razdvajanje i vizualizacija AFLP fragmenata ................................................................. 45

4.5. Statistička analiza ................................................................................................................................. 46

4.5.1. Kultura tkiva ........................................................................................................................ 46

4.5.2. Analiza fenotipa .................................................................................................................. 48

4.5.3. Veličina genoma .................................................................................................................. 48

4.5.4. Analiza biljega AFLP .......................................................................................................... 49

4.5.5. Mantelov test značajnosti i podudarnosti matrica ............................................................... 50

5. REZULTATI ........................................................................................................................................... 51

5.1. Kultura tkiva ........................................................................................................................... 51

5.1.1. Kalogeneza baza listova ...................................................................................................... 51

5.1.2. Kalogeneza eksplantata korijena ......................................................................................... 57

5.1.3. Somatska embriogeneza eksplanatata lista .......................................................................... 58

5.1.4. Regeneracija biljaka ............................................................................................................ 62

5.1.5. Multiplikacija izdanaka ....................................................................................................... 64

5.2. Morfološka analiza ................................................................................................................. 66

5.2.1. Analiza glavnih komponenata morfoloških svojstava ......................................................... 66

5.2.2. Procjena boje cvjetova ......................................................................................................... 69

5.3. Citogenetička analiza ............................................................................................................. 70

5.4. Molekularna analiza ............................................................................................................... 74

5.5. Usporedba rezultata morfoloških podataka i AFLP biljega Mantelovim testom ................... 83

6. RASPRAVA ............................................................................................................................................ 84

6.1.1. Kalogeneza i somatska embriogeneza eksplantata baze listova .......................................... 84

6.1.2. Multiplikacija izdanaka ....................................................................................................... 89

6.2. Detekcija somaklonske varijabilnosti ..................................................................................... 90

6.2.1. Morfometrijske analize, protočna citometrija i genetski biljezi .......................................... 91

7. ZAKLJUČCI ........................................................................................................................................... 96

8. POPIS LITERATURE ............................................................................................................................ 98

9. ŽIVOTOPIS .......................................................................................................................................... 108

1. UVOD

Rod Iris ima preko 300 vrsta od kojih su mnoge vrlo važne u hortikulturi kao rezano cvijeće,

uzgajaju se kao trajnice u vrtovima, a neke vrste koje akumuliraju esencijalna ulja važne su i za

kozmetičku industriju. Od velikog broja različitih perunika, mnoge su endemi, rijetke i/ili

zaštićene i većina ih još nije u uzgoju. U toj grupi su i hrvatske endemične perunike Iris adriatica

Trinajstić ex Mitić, Iris illyrica Tomm. te Iris x rotschildii Degen. Sve tri vrste imaju izuzetno

atraktivan cvijet, a razmnožavaju se vegetativno, dijeljenjem rizoma, zbog čega je stopa

umnažanja niska. Većina lukovičastih perunika ne proizvodi više od pet mladih lukovica godišnje

(Shibli i Ajlouni, 2000), dok se dijeljenjem rizoma može od jedne majčinske biljke dobiti

maksimalno 10 novih biljaka godišnje (Jéhan i sur. 1994). S druge strane, generativno

razmnožavanje perunika sjemenom nije lagano zbog slabog plodonošenja, niske stope klijavosti

sjemena (Simonet, 1932, prema Kim i sur. 2009), stranooplodnje i dugog juvenilnog perioda u

razvoju biljke (Boltenkov i sur. 2007). Iz tih razloga mikropropagacija postaje zanimljiva kao

metoda razvoja početne populacije koja će služiti kao matičnjak biljaka.

Iako se perunike kao jednosupnice teže regeneriraju u kulturi tkiva i s tog je aspekta izazov

postaviti uspješan protokol za regeneraciju, do sada je više različitih vrsta perunika razmnoženo

in vitro somatskom embriogenezom (Jevremović i sur. 2006, Shibli i Ajlouni 2000, Jéhan i sur.

1994) i/ili organogenezom (Laublin i sur. 1992, Gozu i sur. 1993, Jevremović i Radojević 2002).

Spomenute tri hrvatske endemične vrste perunika još nisu regenerirane u kulturi tkiva.

Regeneracija putem kalusa, kakva se uglavnom postiže kod jednosupnica, može dovesti do

somaklonske varijabilnosti, što je u smislu mikropropagacije u komercijalnoj proizvodnji

negativna pojava. Naime, u uvjetima in vitro kulture, biljke pod utjecajem egzogenih regulatora

rasta, puno brže prolaze ontogenetske stadije nego u prirodnim uvjetima što dovodi do indukcije

morfogenetskih promjena nadzemnih i podzemnih dijelova biljaka (Boltenkov i sur. 2007). S

druge strane, pojava somaklonova može u oplemenjivačkom smislu biti vrijedan izvor genetičke

varijabilnosti. U svakom slučaju, za svaki protokol mikropropagacije, osobito ako se primjenuje

u komercijalnoj proizvodnji, trebale bi biti razvijene i metode procjene somaklonske

varijabilnosti. Promjene nastale somaklonskom varijabilnošću pojavljuju se na kromosomskoj i

genskoj razini. Kromosomske mutacije koje se odnose na promjenu broja kromosoma

2

(poliploidije, aneuploidije) mogu se ustanoviti protočnom citometrijom ili brojanjem kromosoma,

dok se genske (pojedinačne promjene baze u nukleotidnoj sekvenci) i mutacije u strukturi

kromosoma poput inverzija, delecija ili translokacija mogu detektirati genskim biljezima.

3

2. HIPOTEZA I CILJEVI

Hipoteza ovog rada je da će najučinkovitiji način mikrorazmnožavanja (in vitro regeneracije)

perunika biti indirektna somatska embriogeneza, a razlike u regeneraciji ovisit će o vrsti

korištenih eksplantata i donorskoj biljci. Očekuje se da će in vitro regenerirane biljke uglavnom

biti vjerni klonovi matične biljke.

Ciljevi rada su bili sljedeći:

1. Razviti metode in vitro regeneracije za navedene tri vrste perunika, iz različitih vrsta

eksplantata te utvrditi iz kojih će eksplantata regeneracija biti uspješnija;

2. Utvrditi postoje li razlike u kalogenezi, somatskoj embriogenezi i regeneraciji biljaka

obzirom na donorsku biljku (genotip) i hranidbenu podlogu;

3. Utvrditi klonsku vjernost, odnosno eventualnu pojavu polimorfizma in vitro razmnoženih

biljaka na fenotipskoj, citogenetičkoj i molekularnoj razini;

4. Utvrditi odražava li se polimorfizam na molekularnoj i/ili citogenetičkoj razini na fenotip.

4

3. PREGLED LITERATURE

3.1. Opće značajke i klasifikacija roda Iris

Porodica Iridaceae obuhvaća 65 rodova i otprilike 2025 vrsta (Ascough i sur. 2009). Sam rod Iris

obuhvaća više od 300 vrsta višegodišnjih zeljastih biljaka. Rod Iris je široko rasprostranjen od

umjerenog do subarktičkog pojasa sjeverne polutke (Shibata 1998, prema Kim i sur. 2009). U

Hrvatskoj flori zastupljeno je 15 svojti od kojh su neke i endemične. Hrvatska se zbog svoje

geografske raznolikosti nalazi u području velike florističke raznolikosti koja je prisutna i kod

perunika (Mitić i Cigić, 2009).

Mitić i Cigić (2009) daju detaljan opis perunika. Perunike su jednosupnice sa zadebljalim

rizomom (podzemnom stabljikom). Nadzemna stabljika je uspravna, visoka od oko 10 cm kod

patuljastih, do preko jednog metra kod visokih oblika perunika. Listovi su bez peteljki, sabljastog

oblika i s izraženom paralelnom nervaturom. Cvjetovi su dvospolni, većinom krupni i živopisnih

boja, pojedinačni ili udruženi u cvat. Svaki cvijet ima uglavnom dva ovojna lista (spate), koji

mogu biti ili zeleni ili opnasti ili suhokožičasti, bijeli itd. te se njihov izgled često koristi u

razlikovanju vrsta perunika. S obzirom da su perunike jednosupnice, u njihovom cvijetu ne

razlikujemo lapove i latice već cvijet sačinjavaju listići koje nazivamo perigon (njih šest,

raspoređeni u dva kruga). Vanjski listići perigona su uglavnom povijeni prema van, na dolje, a na

njima se često nalaze brojne višestanične dlačice (tzv. brada), s kojih kukci skupljaju nektar.

Postojanje ili nepostojanje brade koristi se za odvajanje dviju skupina roda Iris: Apogon-Iris (bez

brade) i Pogon-Iris (s bradom). Unutrašnji listići perigona uzdignuti su prema unutrašnjosti

cvijeta. Svaki cvijet ima tri prašnika, smještena ispod proširenih režnjeva vrata tučka. Naime,

obojeni vrat tučka (bojom sličan boji perigona) cijepa se na tri široka režnja. Režnjevi su na vrhu

dvokrpasti, a s njihove donje strane nalazi se nježna krpasta njuška tučka, tvoreći ˝džep˝, kao ulaz

u plodnicu s tri odijeljena pretinca i brojnim sjemenim zamecima. Nakon oprašivanja i oplodnje

iz ovakve se plodnice razvija plod tobolac. U biološkom smislu cvijet perunika građen je iz tri

identične i biološki samostalne cjeline, a svaku cjelinu sačinjavaju: vanjski list perigona, prašnik,

prošireni obojeni vrat tučka s krpastom njuškom, te pripadajući pretinac plodnice sa sjemenim

5

zamecima. U procesu oprašivanja, svaka se cjelina cvijeta može oprašiti zasebno. S obzirom na

takvu građu cvijeta osigurana je stranooplodnja tj. oplodnja genetički vrlo raznolikim muškim

gametama, što rezultira i većom genetičkom varijabilnošću potomaka, te se osigurava i opstanak i

evolucija vrsta roda Iris. Sjemenke su relativno male, kuglaste, kruškaste ili spljoštene s glatkom

ili izbrazdanom površinom, tamnosmeđe do crvenkastosmeđe boje.

3.2. Hrvatske endemične vrste roda Iris

Mitić (2000, 2002, 2004) navodi ukupno 15 perunika Hrvatske flore, od kojih je 12 svojti1

samoniklo, te tri kultivirane vrste roda Iris:

1. Iris adriatica Trinajstić ex Mitić - endem

2. Iris croatica Horvat & M.D. Horvat - endem

3. Iris germanica L. (incl. I. florentina L.) - kultivirana

4. Iris graminea L.

5. Iris illyrica Tomm. - endem

6. Iris pallida Lam. - kultivirana

7. Iris pseudacorus L.

8. Iris pseudopallida Trinajstić - endem

9. Iris pumila L.

10. Iris reichenbachii Heuf. (sporna prisutnost u Hrvatskoj)

11. Iris x rotschildii Degen - endem

1 svojta je "neutralni" botanički termin koji označava bilo koju taksonomsku kategoriju

6

12. Iris x sambucina L. - kultivirana

13. Iris sibirica L. subsp. sibirica

14. Iris sibirica L. subsp. erirrhiza (Pospichal) Wraber

15. Iris variegata L.

Strogo endemične su svojte Iris adriatica (rasprostranjena na obali i otocima Srednje Dalmacije)

i hibrid I. x rotschildii (zabilježena samo na jednom lokalitetu na Velebitu). Endemične u širem

smislu, odnosno rasprostranjene i na nekim područjima izvan Hrvatske su Iris croatica, Iris

illyrica i Iris pseudopallida (Mitić i Cigić, 2009).

7

3.2.1. Iris adriatica Trinajstić ex Mitić – jadranska perunika

Jadranska perunika je patuljasta vrsta, izrazito niske stabljike (do 5 cm), koja uvijek nosi samo

jedan cvijet. Listovi su nježni srpasti ili šiljasti. Duži su od stabljike, duljine do 10 cm i širine do

jedan centimetar. Ovojni listovi (spate) su zelenkasti. Cvjetovi su žuti, ljubičasti ili crvenkasti, te

nadvisuju listove. Imaju žutu ili modru bradu. Broj kromosoma je 16. Cvate u ožujku i travnju

(Mitić i Cigić, 2009).

Jadranska perunika je opisana 2002. godine (Mitić 2002) kao zasebna vrsta unutar kompleksa

srodnih patuljastih perunika panonsko-balkansko-apeninskog rasprostranjenja i izdvojena od

vrsta s kojima se prije pogrešno poistovjećivala (panonska vrsta Iris pumila, talijanska vrsta Iris

pseudopumila ili grčka vrsta Iris attica).

Usko je endemična vrsta, rasprostranjena samo u Srednjoj Dalmaciji (u okolici gradova Zadar,

Šibenik, Drniš i Unešić te na otocima Čiovu, Braču, Viru i Kornatima). Raste na mediteranskom i

submediteranskom tipu kamenjarskih pašnjaka (Mitić i Cigić, 2009). Njena staništa su ugrožena

zbog zaraštavanja te je uvršena u Crvenu knjigu vaskularne flore Hrvatske (Nikolić 2008) u

kategoriju NT (gotovo ugrožene biljke).

Slika 1. Jadranska perunika: a) crvenkasti, b) žuti, c) ljubičasti cvijet. (Foto: A. Mihovilović

Bošnjak)

8

3.2.2. Iris illyrica Tomm. – ilirska perunika

Ilirska perunika je višegodišnja biljka s razgranjenom podzemnom stabljikom (rizomom).

Nadzemna stabljika je uspravna i pri vrhu razgranjena, visine od 30 do 70 cm. Listovi su niži od

stabljike, sabljastog oblika, nježni sa slabo izraženom nervaturom. Spate su u vrijeme cvatnje

suhokožičaste, prozirne, prljavo smeđe boje. Cvjetovi su krupni s kratkom stapkom, uglavnom ih

ima tri do pet. Listovi perigona su violetne do ljubičaste boje, koja može varirati od svjetlih do

tamnih nijansi, po rubu sa svjetlo smeđim do crvenkasto ljubičastim žilicama. Brada je

intenzivno žute boje, plodnica trobridna. Plod je zaobljen trobridni tobolac, a sjemenke su

crvenkastosmeđe, sitne i bez bridova. Cvate od travnja do lipnja (Mitić i Cigić, 2009).

Prema Crvenoj knjizi vaskularne flore Hrvatske (Nikolić 2008) nalaze se u kategoriji LC

(najmanje zabrinjavajuće biljke).

Ova endemična kvarnersko - liburnijska perunika rasprostranjena je duž sjevernog dijela Jadrana

te uz talijansku i slovensku obalu zbog čega je smatramo subendemom (Mitić i Cigić, 2009).

Slika 2. Ilirska perunika (Foto: A. Mihovilović Bošnjak)

9

3.3.3. Iris x rotschildii Degen – Rotschildova perunika

Rotschildova perunika je jedini prirodni samonikli križanac perunike u flori Hrvatske (Degen

1936). Roditeljske vrste su joj ilirska perunika (I. illyrica) i šarena perunika (I. variegata). Ova

perunika također ima podzemnu stabljiku, visoka je do 40 cm te nosi nekoliko šarenih cvjetova.

Listovi su srpasto savijeni, široki 1-3 cm, nježni kao kod ilirske perunike, ali s izraženim žilama

kao kod šarene perunike. Ovojni listovi spate su pri dnu zeleni kao kod šarene perunike, a pri

vrhu suhi kao kod ilirske perunike. Vanjski listovi perigona su ljubičastožućkasti, a unutrašnji

mutno žuti ili svijetlo ljubičaste boje. Čak i režnjevi tučka pokazuju značajke obaju roditelja, po

sredini su žuti, a po rubovima ljubičasti. Brada je uglavnom žuta (Mitić i Cigić, 2009).

Rotschildova perunika raste na Srednjem Velebitu, na vrhovima iznad Karlobaga.

Slika 3. Rotschildova perunika (Foto: A. Mihovilović Bošnjak)

10

3.3. Mikrorazmnožavanje perunika

Mikrorazmnožavanje (mikropropagacija) ubrzano postaje vrijedan alat oplemenjivačima

ukrasnog bilja jer omogućava: 1. poboljšanje kvalitete postojećih kultivara, 2. pronalaženje novih

načina upotrebe već postojećih kultivara i 3. razvoj slabo poznatih vrsta u nove komercijalne

kulture (Niederwieser i sur. 2002, prema Ascough i sur. 2009). Usprkos velikom potencijalu

germplazme Iridaceae, do sada je mikropropagirano samo 40 vrsta iz 12 rodova ove porodice

(Ascough i sur. 2009). Razlog tome, dijelom može biti u slabijoj regenerativnoj sposobnosti

jednosupnica u usporedbi s dvosupnicama (Kamo i sur. 1990; Wang i Nguyen, 1990, prema

Boltenkov i sur. 2007). Čak i u usporedbi s drugim porodicama reda Asparagales kao što su

Amaryllidaceae i Liliaceae, porodica Iridaceae ima manju sposobnost regeneracije u kulturi tkiva

(Hussey, 1975; prema Boltenkov i sur. 2007). Bez obzira na teškoće, kultura tkiva perunika

razvija se već 40 godina. Razlog za to je prije svega velika potražnja tržišta za biljkama perunika

slobodnim od virusa (Shibli, 2000). Naime, među biljnim vrstama, perunike su najosjetljivije na

virusne infekcije, koje se obično prenose biljnim ušima (Shibli, 2000).

3.3.1. Utjecaj vrste eksplantata i upotrebljenih regulatora rasta na uspostavljanje

kulture in vitro

Mikrorazmnožavanje perunika prvi se put spominje sa spašavanjem embrija (Randolph, 1945,

prema Ascough i sur. 2009). Proizvodnju od virusa oslobođenog materijala kulturom apikalnih

meristema prvi su postigli Baruch i Quak (1966) (prema Ascough i sur. 2009), dok su o

somatskoj embriogenezi i regeneraciji perunika iz eksplantata korijena prvi izvjestili Laublin i

sur. (1991.). O izboru početnog eksplantata ovisi uspješnost uspostavljanja in vitro kulture. Ova

tvrdnja posebice vrijedi za jednosupnice čije stanice rano i brzo diferenciraju te time gube

mitotsku i morfogenetsku sposobnost (Krishnaraj i Vasil, 1995). Samo dijelovi biljke blizu

meristematskih tkiva in vivo mogu regenerirati u in vitro uvjetima. Razlog ranog gubitka

totipotentnosti jednosupnica nije poznat, ali je vjerojatno povezan s gubitkom aktivnosti gena koji

11

reguliraju sintezu i metabolizam endogenih regulatora rasta. Embriogene stanice se formiraju

blizu diferenciranog vaskularnog tkiva koje ima visoku razinu endogenih regulatora rasta (Vasil

1987). Upravo zato regenerativni kalus lakše i češće formiraju meristemi izdanka, baze mladih

listova, nezreli cvjetovi, nezreli i zreli embriji, a rijeđe dijelovi korijena (Jevremović, 2008).

Međutim, Laublin i sur. (1991) su postigli kalogenezu iz eksplantata korijena s uspješnošću od 11

- 37% na hranidbenoj podlozi MS (Murashige i Skoog, 1962) uz dodatak 1 mg/L 2,4-D (2,4-

dikorofenoksioctena kiselina), 1 mg/L NAA (1-naftalenoctena kiselina) i 0.1 mg/L Kin (kinetin),

odnosno 5 - 26% kod tretmana koji se od spomenutog razlikovao samo po većoj koncentraciji

2,4-D (5 mg/L) u hranidbenoj podlozi. U pokusu s eksplantatima raznih dijelova cvijeta: latica,

lapova, cvjetne stapke, prašnika, plodnice i sjemenog zametka vrsta I. pseudacorus, I. setosa i I.

versicolor (Laublin i Cappadocia, 1992) za kalogenezu su se najboljim pokazali eksplantati

plodnice. Uspjeh kalogeneze je varirao od 29 do 43%, ovisno o vrsti. Eksplantati prašnika su jako

slabo kalusirali (uglavnom ne više od 5%), dok niti na jednoj drugoj vrsti eksplantata nije

formiran kalus. Eksplantate plodnice tučka i baza listova koristili su Kereša i sur. (2009) za

regeneraciju jadranske perunike – I. adriatica. Uspješnost indukcije kalusa iznosila je 18,9%

odnosno 27,3% za eksplantate baza listova i plodnice tučka. U pokusu s tri vrste perunika: I.

petrana, I. atrofusca i I. vartanii su kalusirali eksplantati baza cvjetova (s uspješnošću od 0 -

58%, ovisno o vrsti), a stotine eksplantata latica i lapova, od sve tri vrste nisu dali niti jednog

kalusa (Al-Gabbiesh i sur. 2006). S druge strane, u opsežnom istraživanju o regeneraciji I.

germanica i I. pallida ispitana je prikladnost eksplantata raznih dijelova biljke: plodnice, cvjetne

stapke, prašnika, lapova, korijenja, baze listova i pupova (Jéhan i sur. 1994). Kao najpogodniji tip

eksplantata ocjenili su eksplantate nezrelih cvjetova, najvjerojatnije zbog njihovog juvenilnog

stanja, ali i stoga što je kod drugih tipova eksplantata bilo problema sa sterilizacijom. Kalogenezu

su inducirali na MS hranidbenim podlogama uz dodatak 1 mg/L 2,4-D, 1 mg/L NAA i 0.1 mg/L

Kin ili 1 mg/L 2,4-D i 1 mg/L Kin. Uspješnost indukcije kalogeneze iznosila je 50%.

Kim i sur. (2009) su kalogenezu uspjeli potaknuti na eksplantatima lukovice i korijena. Na

hranidbenoj podlozi uz dodatak 1 mg/L 2,4-D, 87% eksplantata lukovice je formiralo kalus.

Uspješnost indukcije embriogenih kalusa iz istih eksplantata iznosila je 38,9%. Na kalusima

razvijenim iz eksplantata korijena nije bilo formiranja somatskih embrija. O vrlo uspješnoj

kalogenezi apikalnih dijelova izoliranih embrija (više od 90%) kod vrste perunika I. ensata,

12

izvjestili su autori Boltenkov i sur. (2007). Koristili su medije s 1 - 2 mg/L 2,4-D i 0.2 - 0.5 mg/L

Kin. Međutim, ti su kalusi u daljnjim supkulturama izgubili sposobnost proliferacije i započeli

organogenezu. Razvoj adventivnih izdanaka iz morfogenih kalusa I. ensata, zahtijevao je

uklanjanje 2,4-D iz medija. Kalusi su premješteni na svjetlo i kultivirani na 2 mg/L IAA (indolil-

3-octena kiselina) i 1 mg/L Kin. Nakon 20 dana, 5 cm visoki izdanci su se pojavili na 75%

kalusa. Prisutnost citokinina je preduvjet za regeneraciju biljaka u kulturi in vitro iz razloga što su

ovi fitohormoni potrebni za ekspresiju gena odgovornih za diferencijaciju pupova (Howell i sur.

2003; prema Boltenkov i sur. 2007). Tako su i kod autora Boltenkov i sur. (2007), za regeneraciju

vrste I. ensata citokinini važniji od auksina. Uz to i vrsta citokinina je važna. Naime na

regeneracijsku sposobost perunika najjače utječe BAP (6-benzilaminopurin, Le i sur. 1998;

Zhong i sur. 1998; prema Boltenkov i sur. 2007; Shibli i Ajlouni 2000).

3.3.2. Tipovi kalusa i somatska embriogeneza perunika

Detaljan opis tipa kalusa perunika induciranih iz eksplantata baza listova vrste I. pallida dali su

Gozu i sur. (1993). U uvjetima mraka se prvo razvije žuti kalus na kojem se potom, prenošenjem

na 16 satni fotoperiod počinje razvijati djelomično organizirano bijelo tkivo. Takvi, mješoviti

kalusi su rasli puno brže nego žuti kalusi, a morfološke karakteristike mješovitih kalusa nisu se

mijenjale u supkultivacijama tokom nekoliko godina. Oba tipa kalusa: žuti i mješoviti, mogli su

rasti na hranidbenim podlogama uz dodatak 2,4-D, IBA (indolil-3-maslačna kiselina), IAA i

NAA. Među ovim auksinima, 2,4-D je djelovao najbolje na razvoj žutog kalusa. Dodatak 0,1

mg/L kinetina lagano je stimuliralo rast kalusa dok GA3 (giberelinska kiselina), nije utjecala na

rast kalusa. Kada su bijela embriogena tkiva odstranjena sa žutog kalusa, niti jedan od tih djelova

nije nastavio rasti i obje vrste tkiva su postale nekrotične. Samo su u kombinaciji dobro rasli.

Jevremović (2008) također opisuje različite vrste kalusa koji se stvaraju kod različitih vrsta

perunika (I. halophila, I. setosa, I. sibirica i I. pumila) na hranjivim medijima s većim

koncentracijama 2,4-D. Bijeli embriogeni kalus, žuti nodularni neembriogeni kalus i zeleni

organogeni kalus. Kod I. setosa 6% eksplantata je formiralo bijeli embriogeni kalus na mediju s 5

mg/L 2,4-D i 1 mg/L Kin, a smanjenjem koncentracije 2,4-D na 1 mg/L u prisustvu kinetina

13

(1mg/L) došlo je do povećanja frekvencije embriogenih kultura (39%). Smanjenje koncentracije

2,4-D s 5 na 1 mg/L dovela je do diferencijacije kalusa u smislu formiranja embriogenog,

organogenog i neembriogenog kalusa, te do formiranja somatskih embrija (SE) na embriogenom

kalusu. Sličnu povezanost indukcije somatske embriogeneze s 2,4-D već su ranije opisali Reuther

(1977) za vrstu I. germanica te Radojević i sur. (1987) za vrstu I. pumila, dok formiranje bijelih

globularnih struktura sličnih somatskim embrijima, nakon prenošenja na hranidbenu podlogu bez

auksina opisuju Laublin i sur. (1991). Jedino Jéhan i sur. (1994) izvještavaju o razvoju somatskih

embrija na hranidbenoj podlozi koja je sadržavala ili 0,1 mg/L Kin ili 0,1 mg/L IBA (indolil

maslačne kiseline) uz dodatak prolina. Na ovoj hranidbenoj podlozi su se nakon tri tjedna pojavili

prvi somatski embriji, a naknadnim supkultiviranjem na ovu podlogu, nastavili su producirati

embrije. U najboljem slučaju 2 - 4% kalusa je uspjelo proizvesti embrije. Ostatak kalusa ili nije

diferencirao ili su postali rizogeni. Kao povoljne eksplantate za somatsku embriognezu, ocjenili

su sve isprobane, osim zelenih dijelova biljke (lista). Općenito, za jednosupnice vrijedi da

somatski embriji nastaju iz pojedinačne stanice, često indirektno kroz formiranje proembriogene

mase. Embrije karakterizira zatvoren vaskularni sustav (Krishnaraj i Vasil 1995).

Prisutnost fitohormona 2,4-D u hranidbenoj podlozi je najvažniji faktor za rast kalusne kulture I.

ensata (Boltenkov i sur. 2004). Kombinacija od 1 mg/L 2,4-D i 0,5 mg/L BAP bila je optimalna

za rast u pojedinačnim supkultivacijama i dugoročno. Bilo koja promjena u faktorima dovela je

do smanjenog rasta kalusa kao i do povećane stope rizogeneze i tamnjenja kalusa. Isti autori

zabilježili su pojavu abnormalnog korijenja koja je već bila primjećena i opisana u kalusnoj

kulturi ječma (O'Hara i Street 1978, prema Boltenkov i sur. 2004) i pšenice na hranjivim

podlogama s malom koncentracijom ili bez 2,4-D (Orton 1979, prema Boltenkov i sur. 2004).

Kalusno tkivo I. ensata je na sličan način reagiralo pri promjenama sastava regulatora rasta u

mediju. Razvoj korjenolikih struktura primjećen je na mediju sa smanjenom koncentracijom 2,4-

D (ispod 1 mg/L) ili u prisustvu nekog drugog auksina, jednako kao i kad je vrijeme

supkultivacije produženo na 60 dana (Boltenkov i sur. 2004). Strukture slične embrijima

pojavljuju se nakon prenošenja rastresitih kalusa na medij s 1 mg/L 2,4-D, 1 mg/L NAA i 0,1

mg/L Kin, s dodatkom prolina (Shibli i Ajlouni, 2000). Ovi su autori pokušali inducirati

embriogenezu na sličnom mediju, ali bez 2,4-D. Međutim, kao i Radojević i Subotić (1992),

utvrdili su da je prisustvo 2,4-D nužno za indukciju embriogeneze. Međutim, za daljnji razvoj

14

embrija, embriogene kaluse je bilo nužno prenjeti na medij za regeneraciju s povećanim

koncentracijama citokinina. Najbolje rezultate je dao BAP u koncentraciji 1 mg/L (Radojević i

Subotić 1992).

Najčešći tip embriogenih kultura opisanih kod jednosupnica su kalusne kuture na agarnom

mediju. Embriogeni kalusi su kompaktni, organizirani, najčešće bijele boje i rastu sporo. Sastoje

se od malih, meristematskih stanica s puno citoplazme, bez vakuola, bogatih lipidima i škrobom.

Embriogene kulture su heterogene prirode i sadrže i neke neembriogene stanice. Potonje nastaju

najvjerojatnije iz staničnih dioba neinduciranih stanica originalnog eksplantata. Brze supkulture i

osobito odvajanje neembriogenih stanica za vrijeme supkultivacija, korisno je za održavanje

embriogene kulture (Krishnaraj i Vasil 1995).

Prema Kim i sur. (2009) za proizvodnju somatskih embrija ključno je održavanje embriogenog

potencijala kalusa. Somatski embriji vrste I. pseudacorus su se pojavili (64,7%) nakon šest

tjedana, nakon što su embriogeni kalusi s formiranim ranim globularnim embrijima supkultivirani

na hranidbenu podlogu s 1 mg/L 2,4-D. Međutim, za daljnji razvoj somatskih embrija, 2,4-D je

bio poguban. Isprobali su razne koncentracije 2,4-D (0,1, 0,2 i 0,5 mg/L), ali samo kad se SE u

globularnom stadiju prenesu na medij bez 2,4-D, 66,4% njih nastavi razvoj do skutelarnog stadija

u sljedeća četiri tjedna. U prisustvu 2,4-D SE su abnormalno nabubrili i povećali se. Formiranje

multiplih ili sraslih kotiledona i slab razvoj meristema izdanka ili korijena čest je problem

povezan sa somatskom embriogenezom jednosupnica in vitro (Krishnaraj i Vasil 1995). Prema

Shibli i Ajlouni (2000) razvoj somatskih embrija moguć je samo na mediju bez hormona, pri

slabom osvjetljenju. Poznato je da na zriobu somatskih embrija djeluje koncentracija saharoze.

Kod vrsta Picea mariana i P. glauca (Iraqi i Tremblay 2001, prema Kim i sur. 2009), 6%

saharoze je pozitivno utjecalo na zriobu somatskih embrija. Kod Iris nigricans, 6% saharoze bila

je optimalna koncentracija za zriobu SE (Shibli i Ajlouni 2000), kao i kod I. pseudacorus (Kim i

sur. 2009).

15

3.3.3. Utjecaj genotipa na formiranje somatskih embrija

Učestalost formiranja somatskih embrija razlikovala se među genotipovima vrsta I. pseudacorus,

I. setosa i I. versicolor (Laublin i sur. 1991). U prijašnjim je istraživanjima opisano da čak i tip

regeneracije ovisi o genotipu (Abe i Futsuhara 1984, prema Laublin i sur. 1991). Wenzel i Uhrig

(1982) (prema Laublin i sur. 1991) su radeći na kulturi krumpira, primjetili da genotipovi koji su

sposobni za regeneraciju, imaju dobru stopu regeneracije na bilo kojem mediju, dok su oni koji

su bili ˝zahtjevni˝ u kulturi tkiva, propustili regenerirati na bilo kojem isprobanom mediju. Al-

Gabbiesh i sur. (2006) također izvještavaju da spremnost na kalogenezu i embriogenezu ovisi o

vrsti/genotipu. Istraživanje su proveli na tri vrste perunika: I. vartanii, I. atrofusca i I. petrana.

Kod I. vartanii nije uopće došlo do kalogeneze, dok su druge dvije vrste kalusirale 43 i 58%.

Stopa pojave struktura nalik na embrije iznosila je 0% za I. vartanii, 1,6% za I. atrofusca i 0,9%

za I. petrana. Prema Jéhan i sur. (1994), uspješnost somatske embriogeneze, kao i konverzije

somatskih embrija u biljke varirala je između vrsta u pokusu, ali ovisila je i o upotrebljenim

klonovima/genotipovima. U jedinom objavljenom istraživanju kulture tkiva na jadranskoj

perunici I. adriatica (Kereša i sur. 2009) genotip (donorska biljka) je ocjenjen kao najvažniji

faktor za uspjeh kalogeneze (koja je varirala između 4,2% do 51,1%) kao i na formiranje

embriogenih kalusa (0% do 38%).

Laublin i Cappadocia (1992) su potvrdili prijašnja istaživanja (Laublin i sur. 1991) o utjecaju

genotipa na uspjeh kulture tkiva vrsta I. pseudacorus i I. setosa. Od ukupno 45 testiranih

genotipova, samo 22 su uspjela regenerirati. Osim toga, uspjeh je ovisio i o vrsti. Naime, jedino

su kod vrste I. pseudacorus svi genotipovi kalusirali i regenerirali na svim testiranim medijima,

dok su pak svi genotipovi vrste I. setosa imali jako mali stupanj kalogeneze.

16

3.4. Provjera klonske vjernosti regeneranata

Rast biljnih stanica in vitro i njihova regeneracija u čitave biljke je vegetativan proces koji

uključuje samo mitotske diobe stanica i teoretski ne bi trebao uzrokovati nikakvu varijabilnost

(Bairu i sur. 2010). Upravo iz tog razloga se kultura tkiva primarno smatrala sofisticiranom

metodom kloniranja željenog genotipa odnosno vegetativnog razmnožavanja s velikom stopom

umnažanja. Međutim, s vremenom je sve češće primjećivana fenotipska varijabilnost

regeneranata. Varijabilnost u broju kromosoma, kromosomske, morfološke i enzimatske

promjene te sporiji rast nekih biljaka prvi put je primjećen kod šećere repe razvijene iz staničnih

kultura u eksperimentalnoj stanici havajskog Udruženja uzgajivača šećerne repe 1969. godine.

Takvu varijabilnost su Larkin i Scowcroft nazvali somaklonskom varijabilnošću 1981. godine.

Somaklonska varijabilnost (soma= vegetativan, klon= identična kopija) se najjednostavnije može

definirati kao promjena u somatskim stanicama koja se događa za vrijeme mitotske diobe i

rezultira varijabilnošću razvijenog klonskog potomstva (Rodriguez-Enriquez i sur. 2011). Od

tada je poznato da široki spektar promjena jezgrinih i citoplazmatskih genetičkih elemenata

pridonosi opaženim fenotipskim promjenama (Mohan Jain 2001).

Pojavu somaklonske varijabilnosti moguće je očekivati u prisutnosti visokih razina regulatora

rasta (Larkin i Scowcroft, 1981). Općenito se za sintetske auksine 2,4-D i NAA smatra da su

povezani sa somaklonskom varijabilnošću (Karp 1989, Phillips i sur. 1994). S obzirom da su ti

auksini najčešće nužni za indukciju kalogeneze jasno je da će često korištene metode regeneracije

kao što su indirektna somatska embriogeneza i organogeneza rezultirati povećanom vjerojatnošću

pojave somaklonske varijabilnosti. Detaljnije objašnjenje pojave somaklonske varijabilnosti u

procesu somatske embriogeneze dali su Lo Schiavo i sur. (1989) prema kojima je za indukciju

embriogeneze u somatskim stanicama, potrebno postojeći obrazac genske ekspresije promijeniti

ili zamjeniti s embriogenim. Taj proces uključuje utišavanje pojedinih gena odnosno metilaciju

DNA koja je pod utjecajem endogenih auksina. Dakle, bilo koji stimulator koji je sposoban

pobuditi somatsku embriogenezu mora biti sposoban promijeniti, najčešće povećati razinu

endogenih auksina i posljedično metilirati DNA. Pod ovom hipotezom, DNA metilacija izgleda

kao nužan proces iniciranja somatske embriogeneze, ali istovremeno vodi do pojave nepoželjne

17

somaklonske varijabilnosti (Lo Schiavo i sur. 1989). Zato je moguće očekivati razlike u stupnju

somaklonske varijabilnosti ovisno o vrsti eksplantata, odnosno stupnju njihove diferencijacije.

Diferencirana tkiva kao što su listovi, korijenje i stabljika načelno produciraju veći stupanj

varijabilnosti nego eksplantati s postojećim meristemima kao što su aksilarni pupovi ili vrhovi

izdanka (Sahijram i sur. 2003). Indukcija kalusa praćena formiranjem izdanaka i korijena prekida

normalnu staničnu funkciju i može aktivirati transpozonske elemente (Pietsch i Anderson, 2007).

Chuang i sur. (2009) su organogenezom iz lisnih eksplantata regenerirali biljke s određenim

stupnjem varijabilnosti za koji smatraju da može biti uzrokovan tipom početnih eksplantata. U

prilog ovoj tezi govore i Prado i sur. (2007) koji izvještavaju da je genetska varijabilnost pod

većim utjecajem tipa eksplantata nego upotrebljene hranjive podloge. Tako su izdanci dobiveni iz

različitih tipova eksplantata (lisnih baza i peteljki) imali 73% sličnosti dok su izdanci regenerirani

iz istog tipa eksplantata na dvije različite hranjive podloge imali su 81 - 84% sličnosti. Uz to,

somaklonska varijabilnost je karakteristika genotipa i njen stupanj varira između i unutar vrste

(de la Puente i sur. 2008). Zbog toga je vrlo važno znati njenu učestalost te razumjeti mehanizam

nastanka kod svake vrste i kultivara koji se razmnožavaju u kulturi tkiva.

Bez kontinuiranog uvođenja novih gena napredak i poboljšanje agronomskih svojstava nije

moguć (Larkin i Scowcroft, 1981). Somaklonska varijabilnost pokazala se kao korisna metoda u

oplemenjivanju nekih kultura, primjerice banana (Garcia i sur. 2002, prema Martin i sur. 2006).

Pérez i sur. (2009) navode više autora koji izvještavaju o razvoju novih, agronomski poželjnih

somaklonova u kulturi tkiva pasiflore, riže, raži i ananasa (Kawata 1995, King i sur. 2002,

Rakoczy 2002, Feuser i sur. 2003).

S druge strane, u mikropropagaciji je najvažnije dobiti identične klonove majčinske biljke i stoga

je svaka varijabilnost nepoželjna. Da bi kultura tkiva postala poželjna i sigurna metoda u

komercijalnom vegetativnom razmnožavanju biljaka potrebno je razviti metode za eliminaciju

pojave somaklonske varijabilnosti (Sahijram i sur. 2003). Stoga je procjena somaklonske

varijabilnosti od velike važnosti za proizvodnju biljaka in vitro u komercijalne svrhe. Važno je

znati frekvenciju pojave somaklonske varijabilnosti, distribuciju unutar genoma, mehanizam i

faktore koji utječu na nju (Polanco i Ruiz, 2002). Promjene nastale somaklonskom varijabilnošću

pojavljuju se na kromosomskoj i genskoj razini. Kromosomske mutacije koje se odnose na

promjenu broja kromosoma (poliploidije, aneuploidije) mogu se ustanoviti protočnom

18

citometrijom ili brojanjem kromosoma, dok se genske (pojedinačne promjene baze u

nukleotidnoj sekvenci) i mutacije u strukturi kromosoma poput inverzija, delecija ili translokacija

mogu detektirati genskim biljezima.

3.4.1. Metode procjene somaklonske varijabilnosti

Kultura tkiva može djelovati kao mutagen jer kultivirane stanice moraju proći reprogramiranje za

vrijeme regeneracije što može rezultirati širokim spektrom epignetske i genetske varijabilnosti

kod regeneriranih biljaka (Mohan Jain, 2001). McClintok (1984) je predložila objašnjenje da

stanice suočene s traumom preslože genomsku ekspresiju i namjerno restrukturiraju genom što

može rezultirati raznim fenotipskim promjenama regeneriranih biljaka. Potrebno je razumjeti

molekularnu osnovu somaklonske varijabilnosti da bi metoda mikropropagacije mogla biti

upotrebljena bez straha od gubitka genetskih svojstava u bankama gena i pri komercijalnom

razmnožavanju (Mohan Jain 2001, Lakshamanan Venkatachalam i sur. 2007). Pri provjeri

genetske vjernosti formiranih izdanaka, a time i pouzdanosti protokola za mikropropagaciju

možemo koristiti neku od tehnika koje se mogu podijeliti na: morfološke, citološke i molekularne

(Bairu i sur. 2010).

3.4.1.1. Procjena somaklonske varijabilnosti u kulturi perunika

Iako je razmjerno velik broj vrsta unutar roda Iris kultiviran u in vitro uvjetima u posljednjih 40

godina, saznanja o stopi pojave somaklonske varijabilnosti perunika u kulturi tkiva su oskudna.

Autori su genetsku stabilnost regeneranata najčešće provjeravali brojanjem kromosoma

(Radojević i sur. 1987, Laublin i sur. 1991, Laublin i Cappadocia 1992, Radojević i Subotić

1992, Kozyrenko i sur. 2002) ili procjenom fenotipa (Shibli i Ajlouni 2000, Jevremović i sur.

2006) dok je procjena somaklonske varijabilnosti na genetskoj razini bila rijeđa (Kozyrenko i sur.

2002).

19

3.4.1.2. Morfološke metode procjene somaklonske varijabilnosti

Opis morfoloških karakteristika najstariji je način identifikacije biljnih vrsta, rodova i porodica.

Iako se neki somaklonovi u kulturi tkiva mogu lako uočiti prema razlikama u morfologiji lista i

pigmentaciji (Israeli i sur. 1991, prema Bairu i sur. 2010), morfološke karakteristike su

ograničene brojem, ovise o razvojnom stadiju biljke i često su podložne utjecaju okoline te ne

odražavaju nužno genetsku konstituciju biljke. Primjerice, značajne genomske promjene koje su

posljedica in vitro kulture ne moraju nužno biti vidljive na fenotipu i obrnuto (Bairu i sur. 2010).

Nadalje, procjena morfoloških karakteristika regeneranata izvodljiva je najčešće tek kod potpuno

razvijenih biljaka u polju ili plasteniku što uzrokuje dodatne troškove. Tako je somaklonove

krumpira moguće vizualno procjeniti mjerenjem morfoloških osobina: visine biljke, pred

desikaciju - 110 dana nakon sadnje i mjerenjem broja i težine gomolja, odnosno uroda po biljci

14 dana nakon desikaciije (Sharma i sur. 2007). Bouman i De Klerk (2001) koriste morfološke

metode za ocjenu jesu li promjene nastale u kulturi tkiva somaklonske ili fiziološke. Kvalitativne

fenotipske promjene (patuljaste biljke, abrnormalna prožiljenost) smatrane su somaklonskima

kada su se zadržale u drugom ciklusu direktne regeneracije iz lisnih eksplantata, a za neke biljke

taj je postupak ponovljen i u trećem ciklusu regeneracije. Ducos i sur. (2003) koriste morfološka i

agronomska svojstva za procjenu klonske vjernosti stabala kave (Coffea canephora Pierre var.

Robusta) dobivenih somatskom embriogenezom u tekućem mediju. Iako morfološki biljezi imaju

ograničenu mogućnost uporabe, oni i dalje nalaze primjenu primjerice za opis svojstava primki u

bankama gena u svrhu njihovog razlikovanja i klasificiranja. Koriste se i pri opisu svojstava

novonastalih kultivara, a imaju i znatnu ulogu u oplemenjivačkim programima u svrhu kontrole

križanja (Šatović, 1999).

3.4.1.2.1 . Morfološke analize u kulturi perunika

Shibli i Ajlouni (2000) na temelju morfoloških opažanja regeneranata I. nigricans nastalih

somatskom embriogenezom objavljuju da nije bilo pojave somaklonske varijabilnosti.

Jevremović i Radojević (2006) su iz kalusne kulture i stanične suspenzije somatskom

20

embriogenezom regenerirali biljke I. pumila. Regenerantima su mjerili listove, utvrđivali broj

listova i broj korijenja te su na osnovi tih morfoloških svojstava procjenili da su svi regeneranti

bili jednaki donorskim biljkama.

3.4.1.3. Citogenetičke metode procjene somaklonske varijabilnosti

Proučavanje promjene ploidnosti, broja ili strukture kromosoma je, baš kao i promjena u sadržaju

DNA ili RNA, važna metoda procjene somaklonske varijabilnosti (Bairu i sur. 2010). S obzirom

da je utvrđivanje kromosomskih aberacija mikroskopskim tehnikama dugotrajno i mukotrpno,

sve se češće upotrebljava metoda protočne citometrije (Doležel i sur. 2004). Protočna citometrija

je brza i pouzdana metoda, a u kratkom vremenu može analizirati reprezentativan broj jezgara.

Sadržaj jezgrine DNA može se izmjeriti velikom preciznošću s koeficijentima varijacije krivulje

DNA od 1 do 5% (Doležel i sur. 2007). Iz tih je razloga upotrebljena kao metoda procjene

somaklonske varijabilnosti kod raznih biljnih vrsta, primjerice krumpira (Sharma i sur. 2007),

pamuka (Jin i sur. 2008) i vinove loze (Prado i sur. 2010).

Ova je metoda posebice poželjna kao dopunska metoda analizama na razini DNA. Naime,

genetski biljezi mogu otkriti visok stupanj polimorfizma između regeneranata i majčinske biljke,

a da pritom niti jedan od upotrebljenih biljega ne ukaže na biljke s promjenjenim brojem

kromosoma. Prema tome, eventualna odsutnost polimorfizma gledana samo genetskim biljezima

ne može jamčiti stvarnu genetsku stabilnost kao što su u slučaju pamuka pokazali Jin i sur.

(2008). Naime, oni su na biljkama pamuka regeneriranim somatskom embriogenezom in vitro,

procjenili somaklonsku varijabilnost pomoću molekularnih biljega (RAPD, SSR) i protočne

citometrije. Molekularni biljezi nisu ukazali na pojavu somaklonske varijabilnosti, a broj

kromosoma i stupanj ploidnosti bio je stabilan gotovo u svim regeneriranim biljkama; ipak, dva

od ukupno 67 analiziranih regeneranata izgubilo je po četiri, odnosno pet kromosoma iz seta što

je utvrđeno protočnom citometrijom. Prema Phillips i sur. (1994), promjene ploidnosti su

najčešći tip genetske varijabilnosti u kulturi tkiva, a zbog malog udjela genoma koji je testiran

genetskim biljezima ne može se isključiti pojava somaklonske varijabilnosti čak i kada tim

analizama nije utvrđena. S druge strane, bez obzira na relativnu jednostavnost protočne

21

citometrije kao metode za brzu detekciju promjena u sadržaju jezgrine DNA te razine ploidnosti,

ova metoda ne može detektirati suptilne mutacije u jezgrinoj ili citoplazmatskoj DNA. Prema

tome, u svrhu procjene eventualne somaklonske varijabilnosti biljnog materijala, poželjno je

nadopunjavanje metode protočne citometrije s drugim citološkim, molekularnim, fenotipskim i/ili

kemijskim analizama (Alan i sur. 2007).

Promijenjeni kariotip somaklonova uključuje kromosomske preraspodjele kao i aneuplodije i

euploidije. Aneuploidija može biti uzrokovana nerazdvajanjem kromosoma, aberacijama

diobenog vretena, zaostajanjem kromosoma i/ili kromosomskim lomovima (Mohan Jain 2001).

Zbog kompleksnosti problema somaklonske varijabilnosti, za procjenu njene pojave je potrebno

upotrijebiti više različitih pristupa/metoda. O pojavi aneuploida, euploida (3X i 4X) i

miksoploida u kulturi Hypericum perforatum izvještavaju Burtovská i sur. (1998), o pojavi

aneuploida, euploida (3X i 4X) i miksoploida papaje regeneriranih somatskom embriogenezom

Clarindo i sur. (2008), dok su o pojavi tetraploidnih biljaka hmelja razvijenih organogenezom

izvjestili Šuštar – Vozlič i sur. (1999). S druge strane, Yang i sur. (2008) na 14 biljaka vinove

loze regeneriranih somatskom embriogenezom nisu detektirali promjene u sadržaju DNA kao ni

Loureiro i sur. (2007) koji su analizu protočne citometrije proveli na mikropropagiranim biljkama

Juniperus phoenicea L. Čak ni dugo razdoblje u kulturi in vitro nije proizvelo abnormalnosti kao

što je miksoploidija ili poliploidija kod Scutellaria baicalensis Georgi. (Alan i sur. 2007).

3.4.1.3.1. Citogenetičke analize u kulturi perunika

Radojević i sur. (1987) su brojanjem kromosoma kod regeneranata I. pumila nastalih somatskom

embriogenezom, ustanovili da nije došlo do mutacija u broju kromosoma ili u stupnju ploidnosti.

Laublin i Cappadocia (1992) su utvrdili da je kod svih analiziranih regeneranata I. pseudacorus,

I. setosa i I. versicolor broj kromosoma ostao specifičan vrsti. Za usporedbu, među 80

analiziranih individua I. pseudacorus regeneriranih somatskom embriogenezom, nađene su dvije

tetraploidne biljke (Laublin i sur. 1991). Brojanjem kromosoma deset biljaka nastalih

organogenezom i kod pet proklijalih somatskih embrija vrste I. setosa Radojević i Subotić

(1992) su izvjestili da je u svim ispitanim slučajevima, broj kromosoma ostao diploidan.

22

Kozyrenko i sur. (2002) su na kalusima i donorskim biljkama šest vrsta roda Iris ( I. setosa, I.

ensata, I. oxypetala, I. pseudacorus, I. pumila i I. laevigata) pratili broj kromosoma koji u

prirodnim uvjetima varira unutar vrste. Brojenjem kromosoma otkrili su da je kod proučavanih

vrsta u prirodnim uvjetima, in vivo, česta pojava miksoploidije uz prevlast diploidnog

kromosomskog seta (35-60%). Velika je učestalost pojave aneuploidnih stanica (28-54%) što je

osobina vrsta koje se vegetativno razmnožavaju i apomiktičnih vrsta. Varijabilnost broja

kromosoma unutar vrste služi kao obrambeni mehanizam pri nepovoljnim okolišnim uvjetima pa

je koristan i za jedinku i za populaciju. Bez obzira na neke promjene, struktura stanične

populacije kalusnih kultura uglavnom je ostala jednaka donorskoj biljci.

3.4.1.4. Molekularne metode procjene somaklonske varijabilnosti

Sve do nedavno, procjena je li neka biljka vjerni klon matične biljke oslanjala se na fenotipska

opažanja i/ili kariotipske analize. Razvoj molekularnih genetičkih tehnika omogućio je izradu

genomskog profila i time uvid u promjene na razini DNA (Sharma i sur. 2007). Prednost

molekularnih tehnika je u mogućnosti primjene vrlo rano u razvoju biljke, dok je ona još u kulturi

tkiva, a time se smanjuje vrijeme i trošak regeneracije (Bairu i sur. 2010). Da bi se dobro

procjenila somaklonska varijabilnost, potrebno je nasumično i ujednačeno analizirati DNA

(Polanco i Ruiz, 2002). Genetski biljezi se često koriste za procjenu somaklonske varijabilnosti

jer iziskuju manji napor te su puno precizniji u usporedbi s kariotipskim i fenotipskim analizama

(Polanco i Ruiz, 2002). Osim toga, osjetljive i pouzdane molekularne tehnike su vrlo korisne u

otkrivanju specifičnih genomskih promjena, identificiranju malih razlika među genotipovima i

usporedbu in vitro inducirane i prirodne molekularne genetske varijabilnosti (Patzak 2003).

Najčešće korištene molekularne tehnike sa svrhom procjene somaklonske varijabilnosti, koje ne

zahtjevaju prethodno poznavanje sekvence DNA što je čest slučaj kod slabije istraženih i

komercijalno manje isplativih vrsta su ˝Slučajno amplificirana polimorfna DNA˝ (Random

Amplified Polymorphic DNA – RAPD) i ˝Razlika duljine amplificiranih ulomaka˝ (Amplified

Fragment Length Polymorphism – AFLP). Obje tehnike pokazale su se korisnima u procjeni

somaklonske varijabilnosti (Lakashmanan Venkatachalam i sur. 2007), a temelje se na lančanoj

23

reakciji polimerazom (Polymerase Chain Reaction – PCR). U reakciji PCR se željeni odsječak

DNA eksponencijalno umnožava uz pomoć termostabilnog enzima DNA- polimeraze.

Slučajno amplificirana polimorfna DNA (RAPD)

Identifikacija RAPD-biljega podrazumjeva upotrebu slučajno odabranih početnica (ulomak DNA

obično dužine 10 slučajno odabranih nukleotida) što rezultira mnogobrojnim umnoženim

regijama (Šatović, 1999). Polimorfizam se očituje u broju i veličini umnoženih regija koje se

razdvajaju u agaroznom gelu i vizualiziraju bojanjem etidij-bromidom (Williams i sur. 1990).

RAPD-biljezi su upotrebljeni kao metoda procjene somaklonske varijabilnosti kod krizanteme

(Miñano i sur. 2009), pamuka (Jin i sur. 2008) i banane (Martin i sur. 2006). Međutim

procjenjeni su kao neadekvatni za utvrđivanje somaklonske varijabilnosti kod nekih vrsta.

Primjerice, RAPD-biljezima nije otkrivena somaklonska varijabilnost begonije regenerirane iz

eksplantata lista tretiranih s povećanim koncentracijama mutagena - nitrosometiluree (Bouman i

DeKlerk 2001) kao ni kod hmelja prije i nakon termoterapije (Patzak, 2003). Fourré i sur. (1997)

izvještavaju da analiza RAPD nije dokazala somaklonsku varijabilnost unatoč velikom uzorku

DNA i velikom broju korištenih početnica te važnim morfološkim i citogenetičkim

varijabilnostima uočenim kod embriogenih klonova Picea abies. Munthali i sur. (1996)

analizirali su regenerante šećerne repe s 5607 RAPD-biljega od kojih su samo tri (0.05%) bila

polimorfna. I druga istraživanja ukazuju na nemogućnost detekcije somaklonova upotrebom

RAPD-tehnike (Tablica 1.).

Karakteristika RAPD biljega je manja ponovljivost (Jones i sur. 1997) i manja informativnost u

odnosu na AFLP biljege, a odsutnost RAPD-polimorfnih fragmenata među klonovima ne jamči

genetsku stabilnost jer morfološke, genomske ili kromosomske mutacije mogu ostati prikrivene

(Raimondi i sur. 2001). Iz tog su razloga s vremenom analize RAPD zamijenjene informativnijim

biljezima kao što su AFLP i SSR (Prado i sur. 2007). Međutim, RAPD-biljezi ostaju zanimljivi

istraživačima jer je njihova cijena razmjerno manja od cijene AFLP i SSR-biljega (Belaj i sur.

2003), pa se i dalje koriste, ali ne sami već dopunjeni s SSR-biljezima i citogenetičkim analizama

(Jin i sur. 2008). S obzirom da je somaklonska varijabilnost vrlo kompleksan fenomen koji

zahtjeva različite pristupe da bi se ispravno procjenio, za razumijevanje načina i mjesta na kojem

24

dolazi do genetskih varijabilnosti u genomu biljke, potrebno je kombinirati razne tehnike analize

DNA (Raimondi i sur. 2001).

Razlika duljine amplificiranih ulomaka (AFLP)

AFLP protokol osmislili su Vos i suradnici (1995) da bi premostili problem ponovljivosti do tada

korištene metode RAPD (Agarwal i sur. 2008). Tehnika se sastoji od nekoliko faza. Najprije se

genomska DNA cijepa pomoću dva restrikcijska enzima (jedan čija se mjesta restrikcije

pojavljuju rijetko u genomu – najčešće EcoRI, i drugi čija se restrikcijska mjesta pojavljuju često

– primjerice MseI), a zatim se na krajeve restrikcijskih ulomaka spajaju oligonukleotidni adapteri.

Sljedeći korak je umnažanje restrikcijskih ulomaka pomoću početnica komplementarnih adapteru

i restrikcijskom mjestu u reakciji PCR i ponavlja se dva puta. Potom se fragmenti razdvajaju na

gelu, te se vizualiziraju bojanjem srebrom ili radioaktivnim sondama. Teoretski gledano, ovom

tehnikom se mogu otkriti polimorfizmi uzrokovani točkastim mutacijama u restrikcijskim

mjestima ili mjestima nalijeganja početnica (rezultat je odsutnost traka) ili pak pojavom

umetanja/insercije ili gubitaka/delecije unutar fragmenta (što rezultira razlikama u duljinama

fragmenata). Iako je tehnika nazvana polimorfizmom dužine amplificiranih ulomaka kasnije je

uočeno da je uglavnom moguće uočiti i analizirati polimorfizme u nazočnosti ili odsutnosti trake

(Šatović, 1999).

Prednosti AFLP-biljega svakako su u tehničkoj jednostavnosti, brzini rada, relativno niskoj

cijeni, visokoj razlučivosti na niskim taksonomskim razinama i velikom broju biljega koji

proizvode bez potrebe za ranijim poznavanjem DNA (Safner, 2005). Međutim zbog svoje

dominantnosti nemoguće je razlikovati homozigote od heterozigota u promatranom lokusu.

AFLP-biljege identificirmo njihovom dužinom, a ne sekvencom, što može rezultirati

homoplazijom, dakle, preklapanjem različitih fragmenata iste dužine.

AFLP je tehnika prikladna za otkrivanje specifičnih genomskih promjena povezanih s

varijacijama u kulturi tkiva i identifikaciju genotipova koji se vrlo malo razlikuju (Polanco i

Ruiz, 2002). Njome se testira polimorfizam kroz čitav genom, ne zahtjeva poznavanje sekvence

genoma i relativno je neosjetljiva na početnu koncentraciju DNA, ali zahtjeva veliku čistoću

25

DNA da bi restrikcija bila potpuna (Blears i sur. 1998, prema Kjos i sur. 2010). AFLP-biljezi su

često korišteni za procjenu somaklonske varijabilnosti (Tablica 1.).

Kjos i sur. (2010) otkrili su razlike u AFLP-profilima meristema iz kulture tkiva i reznica in vivo,

ali udio fragmenata specifičnih za kulturu tkiva ili reznica bio je relativno nizak. Veliki stupanj

polimorfizma uočen u ovom eksperimentu potvrđuje veliku diskriminatorsku moć metode AFLP

već spomenutu od drugih autora (Chuang i sur. 2009, de la Puente i sur. 2008, Kumar Sharma i

sur. 2007, Prado i sur. 2007). Međutim, diskriminatorska sposobnost AFLP-a ovisila je o

upotrebljenim kombinacijama početnica.

Procjenom somaklonske varijabilnosti raži tehnikom RAPD koja ima manju rezoluciju od

tehnike AFLP, pola regeneriranih biljaka je pokazalo polimorfizam (Linacero i Vazquez 1992,

1993, prema de la Puente i sur 2008). U njihovom je pak istraživanju, pomoću biljega AFLP

ustanovljen polimorfizam kod 95% regeneriranih biljaka iste stanične linije. Međutim, broj

mutacija po biljci je bio jako promjenjiv. Iznosio je od 2 do 90 polimorfnih fragmenata/biljega s

tim da je većina polimorfnih biljega nađena kod nekoliko biljaka. Takva nejednaka raspodjela

somaklonske varijabilnosti detektirana biljezima AFLP već je ranije opisana za Arabidopsis

thaliana (Polanco i Ruiz 2002).

Kako niti jedan opisani sustav biljega nema sve osobine idealnog, odabir sustava ovisi

prvenstveno o cilju istraživanja i vrsti za koju se koristi. Dominantni biljezi AFLP i RAPD se

zbog svoje sekvence intenzivno koriste u analizi bioraznolikosti slabije istraženih i gospodarski

manje isplativih vrsta, često divljih srodnika kultiviranog bilja (Safner, 2005). Neovisno o

korištenoj tehnici, moguće je istražiti samo mali djelić genoma (manje od 1%). Među

spomenutim tehnikama (AFLP, RAPD, RFLP), AFLP je najinformativniji s prosječno 50-100

lokusa po paru početnica. Za ove lokuse se smatra da su većinom slučajno raspoređeni kroz čitav

genom i stoga je AFLP među najboljim tehnikama za procjenu promjena induciranih u kulturi

tkiva (Sharma i sur. 2007). Štoviše, AFLP je jedna od najrobusnijih molekularnih tehnika za

identifikaciju kultivara i procjenu varijabilnosti (Hale i Miller 2005, prema Sharma i sur. 2007).

26

Tablica 1. Pregled vrsta na kojima su korišteni biljezi RAPD i AFLP u svrhu detekcije

somaklonske varijabilnosti s brojem korištenih početnica (RAPD) odnosno parova početnica

(AFLP) te detektiranim stupnjem polimorfizma

Vrsta Tip regeneracije Tip

biljega

Broj

početnica

(RAPD)/

parova

početnica

(AFLP)

Detektirani polimorfizam/

broj polimorfnih fragmenata Referenca

Picea abies

Somatska

embriogeneza kod

tri različita klona

RAPD

Ovisno o

pokusu 3 do

29 početnica

Razlikovali klonove, ali ne i

varijabilnost unutar klonova bez

obzira što su neki regeneranti

bili kimere i trisomici

Fourré i sur 1997

Humulus

lupulus L.

(hmelj)

Organogeneza,

adventivnim

izdancima

RAPD 22 0% polimorfizma među

regenrantima

Šuštar – Vozlič i sur.

(1999)

Begonia x

hiemalis

(Fotsch .)

(begonija)

organogeneza, 20

normalnih, 20

aberantnih biljaka

RAPD 18 0% polimorfizma Bouman i DeKlerk

(2001)

Asparagus

officinalis L.

(šparoga, 2

elitna

genotipa)

77 biljaka

regeneriranih

somatskom

embriogenezom iz

2 donorske biljke

RAPD 17

45 fragmenata (28%)

polimorfno između 2 genotipa

0% polimorfizma između

regeneranata

Raimondi i sur. (2001)

Glycine max

L.

(soja,

2 kultivara)

Somatska

embriogeneza RAPD 20

polimorfizam 4.5% i 3.57% po

kultivaru Gesteira i sur. (2002)

Castanea

sativa x C.

crenata

(podloge

kestena, 4

hibrida)

Mikropropagacija RAPD 21

20 polimorfnih biljega (17%)

između jednog od 4 početna

hibrida, polimorfizam između

regeneranata 0%

Carvalho i sur. (2004)

Iris setosa, I.

ensata, I.

oxypetala, I.

seudocorus, I.

pumila, I.

laevigata

(perunika)

kalusi RAPD 7

271 polimorfni biljeg (45%),

prosječno po vrsti od 26% do

65%

Kozyrenko i sur. 2002

Humulus

lupulus

(hmelj)

kultura meristema RAPD 32

razlikovali 1 od 5 klonova:

Jaccardov koeficijent sličnosti

0.965

Patzak (2003)

27


biljega

Broj

početnica

(RAPD)/

parova

početnica

(AFLP)



Citrus

paradisi

(grejp)

8 kalusnih linija

grejpa RAPD 102 0% polimorfno Hao i sur. (2004)

Phoenix

dactylifera

mikropropagacija

tri kultivara RAPD 37 0% polimorfno Saker i sur. (2006)

Gossypium

hirsutum

(pamuk)

Somatska

embriogeneza 28

embriogenih

staničnih linija

RAPD 51 sličnost među biljkama u kulturi

tkiva 90-99% Jin i sur. (2008)

Echinacea

purpurea

organogeneza iz 5

kalusnih linija RAPD 10 0% polimorfno Chuang i sur. 2008

Vitis vinifera

(vinova loza)

14 biljaka

regeneriranih

somatskom

embriogenezom

RAPD 8 0% polimorfno Yang i sur. (2008)

Arabidopsis

thaliana organogeneza AFLP 12

polimorfno 1-36 fragmenata

(0.1% - 5.2%) po grupi Polanco i Ruiz (2002)

Humulus

lupulus

(hmelj)

kultura meristema AFLP 5

polimorfizam kod svakog

regeneranta i donorske biljke.

Jaccardov koeficijent sličnosti

od 0.824 do 0.993

Patzak (2003)

Solanum

lycopersicum

(rajčica)

15 regeneranata

od 5 donorskih

biljaka

AFLP 2 0% polimorfno Bhatia i sur. (2005)

Phoenix

dactylifera

mikropropagacija

tri kultivara AFLP 13

polimorfizam po kultivarima:

0.79%, 1% i 2.6% Saker i sur. (2006)

Hordeum

vulgare

(ječam)

regeneranti iz 2

kalusne linije AFLP 18

74 (9.33%) polimorfnih

fragmenata Li i sur. (2007)

Actindia

deliciosa

(kivi)

Organogeneza, 9

genotipova, duži

period u kulturi

AFLP 15 71 – 100% polimorfnih Prado i sur. (2007)

Solanum

tuberosum

(krumpir)

4 kategorije

biljaka:

1. razmnožene

somatskom

embriogenezom

2.mikropropagira

ne

3. razmnožene

mikrogomoljima

4. nastale iz

pravog sjemena

samooplodnjom

AFLP 2

Bez polimorfizma (0%) za prve

3 kategorije, 31% za nastale iz

pravog sjemena

samooplodnjom

Sharma i sur. (2007)

Secale cereale Somatska AFLP 9 9 (1%) do 113 (13%) De la Puente i sur.

28


biljega

Broj

početnica

(RAPD)/

parova

početnica

(AFLP)



(raž) embriogeneza iz 5

staničnih linija

polimorfnih po staničnoj liniji (2008)

Ananas

comosus (L.)

Merr. (ananas)

organogenezom

nastala 2

somaklona

AFLP 3 7 polimorfnih fragmenata (5%)

po svakom od klonova Pérez i sur. (2009)

Echinacea

purpurea

Organogeneza, iz

5 donorskih

biljaka

AFLP 8

ukupno 301 polimorfan

fragment (9,4%), po grupama

14 – 156 polimorfnih

fragmenata (1.87-19.8%)

Chuang i sur. (2009)

Vitis vinifera

(vinova loza)

Mikropropagacija

sorata Müller

Thurgau i

Riesling

AFLP 15 2.1% polomorfizma za Riesling

i 1.7% za Müller Thurgau Baránek i sur. (2009)

Eucalyptus

globulus

Organogeneza iz

7 kalusa AFLP 13

4.05 – 28.36% po paru

početnica, 1-22 polimorfna

fragmenta po regeneriranoj

biljci ; 66.7% regeneranata

imalo bar 1 polimorfan biljeg u

usporedbi s biljkama razvijenim

iz istog kalusa

Mo i sur. (2009)

Arabidopsis

thaliana

Utjecaj 4 različite

koncentracije

kanamicina na

kaluse

AFLP 4 0% polimorfizma Bardini i sur. (2009)

Argyanthemu

m frutescens

Kultura

meristema 43

kultivara

AFLP 5

17 polimorfnih (6,4%) između

izdanaka u kulturi meristema i

izdanaka razmnoženih

reznicama, a između kultivara

190 polimorfnih (72%)

Kjos i sur. (2010)

29

3.4.1.4.1. Molekularne analize u kulturi perunika

Među autorima koji izvještavaju o in vitro regeneraciji perunika, prvi su proveli genetičke analize

radi provjere klonske vjernosti Kozyrenko i sur. (2002). Oni su na kalusima i donorskim biljkama

šest vrsta roda Iris ( I. setosa, I. ensata, I. oxypetala, I. pseudacorus, I. pumila i I. laevigata)

proveli RAPD i citogenetičku analizu. Najveću genetsku sličnost imali su kalusi razvijeni od iste

donorske biljke dok je najmanja sličnost primjećena među biljkama različitih rodova. Koristili su

sedam početnica već ranije korištenih na perunikama za razlikovanje vrsta roda Iris (Zhuravlev i

sur. 1998) odnosno detektiranje somatskih hibrida razvijenih u kulturi protoplasta (Shimizu i sur.

1999). Broj polimorfnih lokusa kod kalusnih kultura u odnosu na donorsku biljku varirao je među

vrstama i iznosi 26% za I. setosa, 37% za I. ensata, 25% za I. oxypetala, 33% za I. pseudacorus,

63% za I. pumila i 65% za I. laevigata. Sedam korišenih početnica produciralo je ukupno 273

lokusa. Kalusne linije nekih vrsta zadržale su veliku sličnost s donorskim biljkama (95 % kod

vrsta I. ensata i I. pseudacorus). Međutim kod nekih je vrsta varijabilnost kalusa u odnosu na

donorsku biljku veća čak i od varijabilnosti među vrstama (46% varijabilnosti kod vrste I. pumila

i 49 % I. laevigata). Tu pojavu objašnjavaju genomskim promjenama koje prate dugotrajnu

kulturu tkiva, te zaključuju da intenzitet pojave somaklonske varijabilnosti ovisi o vrsti.

Analizu regeneranata I. pumila nastalih somatskom embriogenezom u svrhu provjere genetske

vjernosti donorskoj biljci, izoenzimskim biljezima su proveli Radojević i sur. (1987). Međutim,

taj tip analize ne pripada u genetičke već u biokemijske analize somaklonske varijabilnosti.

30

4. MATERIJALI I METODE

4.1. Kultura tkiva

4.1.1. Biljni materijal

Kao početni materijal korištene su biljke Iris adriatica, Iris illyrica i Iris x rotschildii sakupljene

na prirodnim staništima tijekom 2001. i 2007. godine, nakon čega su uzgajane u plasteniku

Agronomskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu.

4.1.2. Uspostavljanje sterilne kulture baza listova

Nasumično je odabrano najmanje 12 donorskih biljaka (genotipova) od svake vrste s kojih su

potom u rano proljeće izrezani mladi, tek potjerali izdanci. Izdanci su prvo prani pod tekućom

vodom, a potom uronjeni u 70% etanol dvije minute te na 10 minuta u 5% natrijev hipoklorit s

dodatkom 0.1% okvašivaća Tween 20. Nakon što su dva puta isprani sterilnom vodom, s

izdanaka su uklonjeni vanjski listovi i skraćeni su na duljinu 2 centimetra. Nakon toga su

ponovno dezinficirani 70% etanolom u trajanju 1 minute te 1.5% natrijevim hipokloritom u

trajanju 25 minuta, također uz dodatak 0.1% okvašivaća Tween 20. Završno su izdanci tri puta

isprani sterilnom destiliranom, deioniziranom vodom. Baze listova mladih izdanaka izrezivane su

u 6 do 9 mm2 velike eksplantate koji su postavljeni na hranjive podloge s različitm

koncentracijama hormona. Svaka kombinacija tretmana i genotipa postavljena je u tri Petrijeve

posude promjera 60 mm, pri čemu je svaka od njih sadržavala deset eksplantata.

31

4.1.3. Sastav hranidbenih podloga

Za indukciju kalogeneze korištene su hranidbene podloge MS (Murashige i Skoog, 1962)

(Tablica 2.a). Tretmani su se međusobno razlikovali u sastavu regulatora rasta (Tablica 2.b). U

svim podlogama pH je prilagođen na 5,7. Podloge su sterilizirane autoklaviranjem pri 121° C i

100 kPa u trajanju 20 minuta.

Tablica 2.a. Sastav osnovne hranidbene podloge (A0) za indukciju kalogeneze

Komponenta Koncentracija (mg L-1

)

MS-mineralne soli puna koncentracija

MS-vitamini: Tiamin hidroklorid

0,1

Piridoksin hidroklorid 0,5

Nikotinska kiselina 0,5

Glicin 2

saharoza 50 000

myo inozitol 100

kazein hidrolizat 200

prolin 290

phytagel 4000

Tablica 2.b. Sastav hranidbenih podloga/tretmana za indukciju kalogeneze

Tretman Koncentracija (mg L-1

) Koncentracija (M)

A1 A0 +1 mg L

-1 2,4-D + 1 mg L

-1 NAA +

0,1 mg L-1

Kin

A0 + 4,52 M 2,4-D + 4,83

M NAA + 0,46 M Kin

A2 A0 +1 mg L-1

2,4-D + 1 mg L-1

Kin A0 + 4,52 M 2,4-D + 4,6

M Kin

A3 A0 + 2,5 mg L-1

NAA + 0,5 mg L-1

Kin

A0 + 13,4M NAA +

2,3M Kin

2,4-D - diklorofenoksioctena kiselina

NAA - naftalen octena kiselina

Kin - kinetin

32

Eksplantati su supkultivirani na svježe hranidbene podloge svaka četiri tjedna. Broj induciranih

kalusa je procijenjen u odnosu na broj postavljenih eksplantata, dok je broj embriogenih kalusa

procijenjen u odnosu na broj induciranih i/ili postavljenih eksplantata. Zbog daljnjeg razvoja,

embriogeni kalusi su supkultivirani na medij za regeneraciju koji je sadržavao MS-soli i MS-

vitamine, 3,5% saharoze, 200 mg L-1

kazein hidrolizata, 0,1 mg L-1

2,4-D, 1 mg L-1

BAP i 0,1 mg

L-1

IBA. Na tom su mediju embriogeni kalusi nastavljali razvoj od formiranja globularnih

embrija do nastanka klastera torpednih somatskih embrija. Formirani somatski embriji u

torpednoj fazi razvoja, odvajani su iz klastera embrija i supkultivirani na MS-medij uz dodatak

0,25% phytagela, 2% saharoze i 200 mg L-1

kazein hidrolizata, a bez dodatka regulatora rasta. Na

tom su se mediju razvili u izdanke spremne za aklimatizaciju.

4.1.4. Uspostavljanje sterilne kulture korijenja

Eksplantati korijenja dužine 5 mm bili su pripremljeni od in vitro zakorijenjenih izdanaka

dobivenih od vegetacijskih vršaka šest donorskih biljaka svake vrste perunika i postavljeni

također na tri hranidbene podloge istog sastava fitohormona kao i za baze listova (Tablica 2.a i

2.b), u tri Petrijeve posude promjera 60 mm, pri čemu je svaka od njih sadržavala deset

eksplantata.

Daljnji postupak indukcije kalogeneze bio je identičan kao u slučaju s eksplantatima baza listova

što je opisano u poglavlju 4.1.3.

4.1.5. Uspostavljanje sterilne kulture vegetacijskih vršaka

Kao zaseban pokus izolirani su vegetacijski vršci iz mladih pupova koji se tek pojavljuju na

rizomima. Po svakoj od tri vrste perunika, korišteno je šest donorskih biljaka. Sa svake biljke

odrezana su dva do tri mlada izdanka, ovisno o rasploživosti po biljci, a da se pritom ne uništi

33

matična biljka. Nakon sterilizacije pupova, po identičnom postupku kao što je već opisano u

poglavlju 4.1.2., izolirani su vegetacijski vršci.

Vegetacijski vršci su tada postavljeni na MS-hranidbene podloge (Murashige i Skoog 1962). U

svim podlogama pH je prilagođen na 5,7. Podloge su sterilizirane autoklaviranjem pri 121°C i

100 kPa u trajanju 20 min.

Tablica 3.a. Sastav osnovne hranidbene podloge (B0) za multiplikaciju izdanaka

Komponenta Koncentracija (mg L-1

)

MS mineralne soli puna koncentracija

saharoza 35 000

myo inozitol 100

bacto agar 8000

Tablica 3.b. Sastav hranidbenih podloga/tretmana za multiplikaciju izdanaka

Tretman Koncentracija (mg L-1

) Koncentracija (M)

B1 B0 +1 mg L

-1 BA+ 0,1mg L

-1 NAA + MS

vitamini

B0 + 4,4 M BA+ 0,54 M + MS

vitamini

B2 B0 +1 mg L

-1 BA+ 0,1mg L

-1 NAA + 0,1

mg L-1

GA3 + MS vitamini

B0 + 4,4 M BA+ 0,54M NAA + 0,29

M GA3 + MS vitamini

BA- benzilaminopurin

GA3- giberelinska kiselina

Vegetacijski vršci su supkultivirani svaka četiri tjedna na svježe hranidbene podloge, a stopa

multiplikacije je procjenjena nakon pet ciklusa.

34

4.1.6. Uvjeti kulture tkiva

Nakon postavljanja u kulturu tkiva, daljnji uzgoj je bio kontroliran u komorama rasta gdje postoji

regulacija jačine svjetlosti, temperature i fotoperiodizma. Kalogeneza je poticana u mraku, pri

24°C neovisno o vrsti eksplantata. Svi daljnji koraci u razvoju somatskih embrija,

zakorijenjivanje kao i razvoj vegetacijskih vršaka te mikropropagacija su bili inducirani pri

temperaturi od 24°C, osvjetljenju bijelom svjetlošću jakosti 40-45 µmol m-2

s-1

i fotoperiodu 16

sati svjetla i 8 sati mraka.

Regenerirane biljke su bile premještene na podlogu za zakorjenjivanje, a nakon zakorijenjivanja

presađene u posude s odgovarajućim supstratom, aklimatizirane u komori rasta i prenešene u

plastenik.

35

4.2. Analiza fenotipa

Dvije godine nakon regeneracije, na procvalim biljkama su bila opažana i mjerena sljedeća

morfološka svojstva uporabom modificiranih deskriptora prema Arafeh i sur. (2002):

na cvijetu: visina cvijeta mjerena od baze cvijeta do vrha gornjeg lista perigona, širina

donjeg lista perigona mjerenog u visini polinacijskog tunela, dužina donjeg lista perigona,

širina te visina gornjeg lista perigona

listu: dužina i najveća širina najdužeg lista, dužina i najveća širina najmanjeg lista

stabljici: visina do cvijeta

Boja cvijeta bila je procijenjena prema karti boja RHS (Royal Horticultural Society).

U analizu fenotipa bile su uključene ukupno 142 biljke, od čega za vrstu I. adriatica 4 donorske

biljke i njihovih 39 regeneranata, za vrstu I. illyrica 3 donorske biljke i njihovih 78 regeneranata

te za I. x rotschildii 4 donorske biljke i njihovih 25 regeneranata. Regeneranti koji nisu cvali nisu

mogli biti analizirani.

36

4.3. Veličina genoma

Veličina genoma mjerena je u Laborotoriju za žlahtljenje rastlin in genetiko, Biotehniška

fakulteta Univerza v Ljubljani.

Analiza veličine genoma rađena je na uzorcima mladih listova, biljaka regeneriranih u kulturi

tkiva iz eksplantata baza listova. Uzorci listova za analizu su uzeti u rano proljeće, godinu dana

nakon regeneracije i aklimatizacije u plasteniku. U analizu je bilo uključeno ukupno 167 biljaka,

od čega za vrstu I. adriatica 4 donorske biljke i njihovih 22 regeneranta, za vrstu I. illyrica 3

donorske biljke i njihov 71 regenerant te za I. x rotschildii 4 donorske biljke i njihovih 74

regeneranta.

Za obojanje jezgrine DNA u ovom su istraživanju korištene dvije boje PI (propidij jodid) i 4',6-

diamidino-2-fenilindolom (DAPI). ). Propidij jodid se veže na dvolančanu DNA, ali i na

dvolančanu RNA pa je pogodna za određivanje apsolutnih količina DNA, ali uz prethodno

otklanjanje RNA pomoću RN-aze. S druge strane DAPI je također vrlo često korištena boja jer

rezultira histogramima visoke rezolucije i ne zahtjeva otklanjanje RNA.

U slučaju izoliranih jezgara obojenih s PI, veličina genoma mjerena je pomoću protočnog

citometra prema metodi po Doležel i sur. (1989). List svake analizirane biljke nasjeckan je

zajedno s listom boba (Vicia faba L.) u 2-3 ml LB01 pufera, nakon toga je sve procijeđeno kroz

najlonsku membranu promjera 30 µm,obojano sa 25 µg/ml PI te je na kraju dodano 50 µg/ml

ribonukleaze.

Veličina genoma jezgara obojenih s DAPI mjerena metodom prema Bohanec (2003). List svake

analizirane biljke nasjeckan je zajedno s listom boba (Vicia faba L.) u Otto I puferu, nakon toga

je sve procijeđeno kroz najlonsku membranu promjera 30 µm. Ovisno o količini filtrirane

suspenzije, dodano je tri do pet volumena Otto II pufera.

37

Sastav Otto I pufera (za 100 ml otopine)

0,1M monohidrat limunska kiselina 2,1 g

0,5% (v/v) Tween 20 0,5 ml

Sastav Otto II pufera (za 100 ml otopine)

0,4M Na2HPO4 x 12H2O 7,1 g

DAPI 0,4 mg

Uzorci su analizirani na protočnom citometru Partec PAS (Münster, Njemačka) s argonskim

laserom podešenim na 488 nm uu slučaju obojenja s PI, odnosno 372 nm kod obojenja s DAPI.

Zrake su mjerene pomoću optičkog filtera RG 590. Prosječno je mjereno 7000 jezgara po uzorku.

Za izračunavanje pozicija G0/G1 vrhova krivulja korišten je softver FLOMAX (Partec, Münster).

Bob (Vicia faba L.) koji ima 26.90 pg DNA po jezgri (Doležel i sur. 2007) korišten je kao

standard. 2C tj. količina DNA perunika izračunata je prema formuli:

STD

STD

xx C

GG

GGC 2

/

/2

10

10

2Cx – veličina genoma uzorka

2CSTD – veličina genoma standarda

(G0/G1) x – pozicija vrha krivulje uzorka

(G0/G1)STD – pozicija vrha krivulje standarda

38

4.4. Molekularne analize

Izolacija DNA i analiza AFLP provedene su u Laboratoriju za biotehnologiju Zavoda za

oplemenjivanje bilja, genetiku i biometriku Agronomskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu.

Molekularna analiza je rađena na DNA biljaka regeneriranih u kulturi tkiva iz eksplantata baza

listova. Uzorci listova za analizu sakupljeni su u rano proljeće, treću godinu nakon regeneracije i

aklimatizacije u plasteniku. U analizu je bilo uključeno ukupno 125 biljaka, od čega za vrstu I.

adriatica 4 donorske biljke i njihovih 24 regeneranta, za vrstu I. illyrica 3 donorske biljke i

njihovih 36 regeneranata te za I. x rotschildii 4 donorske biljke i njihovih 54 regeneranta.

4.4.1. Izolacija DNA

Neposredno prije izolacije DNA, uzorci mladih listova su osušeni u liofilizatoru (Christ, Beta 1-

8), postupkom hladnog sušenja pod vakumom da bi se spriječilo oštećenje DNA. Po uzorku je

korišteno 40 mg osušenog tkiva za izolaciju DNA koje je prvo samljeveno u oscilatornom mlinu

(T Verter, N2 series) u fini prah koji se koristio u daljnjem postupku izolacije DNA.

Izolacija DNA provedena je pomoću komercijalnog kompleta za izolaciju DNA GenElute Plant

Genomic MiniPrep Kit (Sigma-Aldrich) prema uputi proizvođača.

Procedura izolacije DNA izvedena je na sljedeći način:

1. Odvagano je 40 mg liofiliziranog i fino samljevenog biljnog materijala.

2. Dodano je 350 L Lysis Solution (Part A) i 50 L Lysis Solution (Part B) i dobro promiješano

pomoću laboratorijske tresilice i inkubirano na 65°C 15 minuta.

3. U smjesu je dodano 130 L Precipitation Solution, promiješano inverznim okretanjem rukom i

stavljeno na led 5 minuta. Zatim je centrifugirano pet minuta pri brzini od 15300 rfc.

39

4. Supernatant iz 3. koraka pažljivo je otpipetiran u plavu filter-kolonu (GenElute Filtration

Column), koja je prethodno smještena u priloženu sakupljačku tubicu volumena 2 ml te je sve

zajedno centrifugirano jednu minutu na 12000 rpm.

5. Plavi dio kolone je bačen, te je u tubicu, direktno u filtriranu smjesu, dodano 700 L Binding

Solution te je promiješano inverznim okretanjem rukom.

6. 500 L Column Preparation Solution pipetirano je u GenElute MiniPrep Binding kolonu (s

crvenim o-prstenom), koja je također prethodno smještena u sakupljačku tubicu volumena 2 ml te

je centrifugirano jednu minutu na 12000 rfc. Filtrirana otopina je izlivena iz sakupljačke tubice te

je filter-kolona vraćena u sakupljačku tubicu.

7. 700 L smjese iz 5. koraka je otpipetirano u filter kolonu pripremljenu u 6. koraku i

centrifugirano jednu minutu na 15300 rfc. Filtrirana otopina je izlivena iz sakupljačke tubice te je

u tubicu vraćena već korištena filter-kolona. Pažljivo je pipetirana preostala količina smjese iz

koraka 5. u filter kolonu i ponovno centrifugirana jednu minutu na 15300 rfc. Nakon

centrifugiranja je filtrirana otopina bačena zajedno sa sakupljačkom tekućinom.

8. GenElute MiniPrep Binding kolona je stavljena u novu sakupljačku tubicu volumena 2 ml. U

kolonu je otpipetirano 500 L prethodno razrijeđenog Wash Solution (u Wash Solution je

prethodno dodano 330 ml 95-100% etanola) i centrifugirano jednu minutu na 12000 rpm.

Filtrirana otopina je izlivena i kolona je vraćena u istu tubicu.

9. U GenElute MiniPrep Binding kolonu je pipetirano novih 500 L Wash Solution i

centrifugirano tri minute na 15300 rfc da se kolona osuši. Nakon centrifugiranja filtrirana otopina

ne smije doći u kontakt s kolonom.

10. GenElute MiniPrep Binding kolona je prebačena u novu Eppendorf-sakupljačku tubicu

volumena 2 ml. U kolonu je otpipetirano 100 L na 65°C prethodno zagrijanog Elution Solution i

centrifugirano dvije minute na 15300 rfc čime je sakupljena eluirana DNA. Potom je još jednom

u istu tubicu otpipetirano 100 L na 65°C prethodno zagrijanog Elution Solution i centrifugirano

dvije minute na 15300 rfc.

Na ovaj način dobiveni su uzorci DNA koji su čuvani na -20 °C.

40

4.4.2. Procjena kvalitete i količine izolirane DNA

4.4.2.1. Procjena kvalitete dobivene DNA elektroforezom

Kakvoća i koncentracija izolirane DNA provjerena je pomoću elektroforeze na 0.8%-tnom

agaroznom gelu uz obojenje etidij bromidom. DNA je vizualizirana pod UV svjetlom pomoću

sustava za fotografiranje i analizu gela GelDoc XR, Bio-Rad.

4.4.2.2. Procjena količine izolirane DNA flourimetrom

Uzorcima za koje je elektroforezom utvrđeno da je izolirana DNA odgovarajuće kvalitete

izmjerena je količina DNA (ng L-1

) flourimetrijski pomoću flourimetra VersaFlour ver. 170-

2402EDU, Bio-Rad. Za pripremu uzoraka i standardne DNA korišten je komplet (kit)

Flourescent DNA Quantitation Kit, Bio-Rad. Flourimetrom je izmjerena isključivo količina

izolirane DNA jer se prethodno dodana flourescentna boja, fluorokrom Hoechst 33258, veže

isključivo za DNA. Bijela svjetlost prolazi kroz ekscitacijski filter, emitira zrake valne duljine

365 nm koje prolaze kroz uzorak i pri tom pobuđuju fluorokrom vezan na DNA. Tako pobuđena

boja emitira zrake valne duljine 460 nm čija se emitirana količina pomoću emisijskog filtera

mjeri i nakon usporedbe s emisijom valne duljine 460 nm utvrđene standardnom DNA određuje

koncentracija DNA u uzorku.

Koncentracija izolirane DNA se mjeri pomoću svježe pripremljene radne otopine koja se sastoji

od 10x TNE pufera (100 mM Tris, 10 mM EDTA pH 7,4, 2 mM NaCl) i HSS boje - Hoechst

33258 i dH2O.

Postupak se sastojao od sljedećih faza:

1. Fluorimetar je uključen 30 minuta ranije

2. Kad se aparat ugrijao, namještene su opcije MED i RANGE na 00000. Flourimetar je baždaren

pomoću sedam različitih, unaprijed određenih, koncentracija standardne calf thymus-DNA čije

izmjere su korištene za kreiranje standardne krivulje (Tablica 4.). Najprije je u aparat stavljena

41

kiveta u kojoj nema DNA te je pritisnuta tipka ZERO, te se na monitoru pokazala vrijednost 0.

Nakon toga je izmjerena vrijednost za svaku od koncentracija standardne DNA (20 – 1000 ng).

Tablica 4. Koncentracije i količine standardne DNA potrebne za izradu radnih otopina za

kreiranje krivulje

Kiveta Ukupna DNA Standardna DNA (iz

´kita´)

Volumen DNA 0,1 l/ml Hoechst

33258 1 1000 ng 100 l/ml 10 l 2 ml

2 500 ng 100 l/ml 5 l 2 ml

3 200 ng 100 l/ml 2 l 2 ml

4 100 ng 10 l/ml 10 l 2 ml

5 50 ng 10 l/ml 5 l 2 ml

6 20 ng 10 l/ml 2 l 2 ml

7 0 - - 2 ml

3. Na temelju dobivenih vrijednosti standardnih koncentracija DNA, definirana je formula

krivulje pomoću koje je kasnije izračunata koncentracija izolirane DNA:

bmxY

Y – RFU vrijednost

x – koncentracija DNA

m – formula slope iz excella

b – odsječak na osi y

DNA radne koncentracije 20 - 40 ng DNA/µL korištena je za daljnje analize.

42

4.4.3. AFLP analiza

AFLP-analiza provedena je u Laboratoriju za biotehnologiju Zavoda za oplemenjivanje bilja,

genetiku i biometriku Agronomskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu.

Analiza AFLP se sastoji od restrikcije genomske DNA endonukleazama, ligacije ili spajanja

krajeva izrezanih fragmenata DNA oligonukleotidnim adapterima, predumnažanja fragmenata

(predamplifikacija), selektivnog umnažanja fragmenata (selektivna amplifikacija) te razdvajanje

fragmenata DNA nakon selektivne amplifikacije kapilarnom elektroforezom. AFLP-analiza je

provedena prema metodi Vos i sur. (1995), modificiranoj prema Bolarić (interni protokol

Laboratorija za biotehnologiju Zavoda za oplemenjivanje bilja, genetiku i biometriku).

4.4.3.1. Restrikcija i ligacija

U konačnom volumenu od 40 µL, 100 ng genomske DNA razrezali smo pomoću 5 jedinica

restrikcijskih endonukleaza EcoRI i MseI u otopini 1x NEB EcoRI pufera i 1x BSA. Restrikcija

se odvijala tri sata pri temperaturi od 37°C u aparatu ThermostatPlus, a završena je povećanjem

temperature na 70°C u trajanju od 15 minuta radi inaktivacije enzima.

Tablica 5. Sekvence adaptera korištenih u ligaciji

Početnica Slijed baza (5` - 3`)

EcoRI -

EcoA1- adapter CTC GTA GAC TGC GTA CC

EcoA2 - adapter AAT TGG TAC GCA GTC

MseI -

MseA1 - adapter GAC GAT GAG TCC TGA G

MseA2 - adapter TAC TCA GGA CTC AT

Ligacijska smjesa pripremljena je iz EcoA-adaptera konačne koncentracije 0,33 µM, MseA-

adaptera konačne koncentracije 3,33 µM, 0,033 jedinice T4 DNA ligaze po uzorku, 0,67 µM

adenozin trifosfata (ATP) u otopini 1x T4 pufera. Za ligaciju je korišteno 35 µL digestirane DNA

te 15 µL ligacijske smjese po uzorku. Ligacija se odvijala pri temperaturi od 37°C u aparatu

43

ThermostatPlus u trajanju od tri sata. Nakon ligacije, smjesa je razrijeđena sa 150 µL T10E0.1

puferom.

4.4.3.2. Predumnažanje (predamplifikacija)

Postupak predumnažanja uključuje prvo selektivno umnažanje DNA u PCR-reakciji, pri čemu se

koriste početnice od kojih svaka ima po jednu selektivnu bazu, u ovom slučaju EcoRI + A, a

MseI + C (Tablica 7.). Predamplifikacijska reakcijska smjesa pripremljena je u konačnom

volumenu od 20 µL, a sadržavala je 5 µL uzorka DNA nakon restrikcije i ligacije, 3 mM MgCl2,

0,2 mM dNTP, po 0,25 mM E01 i M02 početnice i 0,5 jedinica Taq polimeraze po uzorku.

Postupak predumnažanja je proveden u aparatu Thermalcycler Verity (Applied Biosystems) prema

sljedećem PCR protokolu:

oC min broj ciklusa

72 2:00 1

94 0:20

20 56 0:30

72 2:00

60 30:00 1

4 ∞

Nakon predumnažanja 20 µL otopine umnoženih fragmenata DNA je razrijeđen u T10E0.1 puferu

u omjeru 1:25.

Tablica 6. Sekvence početnica korištenih u predumnažanju

Početnica Slijed baza (5` - 3`)

E01 GAC TGC GTA CCA ATT CA

M02 GAT GAG TCC TGA GTA AC

44

4.4.3.3. Selektivno umnažanje

Reakcijska smjesa za selektivno umnažanje pripremljena je u konačnom volumenu od 20 µL i

sadržavala je: 5 µL razrijeđene DNA iz predumnažanja, 3 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP, 0,25 µL

EcoRI-početnice s tri selektivne baze, 0,25 µL MseI-početnice s tri selektivne baze u otopini 1x

PCR pufera te 0,5 jedinice Taq-polimeraze po uzorku. Na manjem broju genotipova (šest) je

provedeno ispitivanje početnica (primer scereening) u kome je korištena 21 kombinacija

početnica među kojima je izabrano deset kombinacija koje su potom korištene na ukupnom setu

uzoraka (Tablica 7.).

Tablica 7. Lista kombinacija početnica korištenih u selektivnom umnažanju

Kombinacije početnica (Exx/Mxx) Redoslijed nukleotida Flourescentna boja

E35/M49 E+ATA/M+CAG 6FAM

E35/M61 E+ATA/M+CTG 6FAM

E37/M47 E+ACG/M+CAA 6FAM

E37/M61 E+ACG/M+CTG 6FAM

E37/M62 E+ACG/M+CTT 6FAM

E39/M47 E+AGA/M+CAA VIC

E39/M49 E+AGA/M+CAG VIC

E39/M61 E+AGA/M+CTG VIC

E32/M61 E+AAC/M+CTG VIC

E40/M47 E+AGC/M+CAA VIC

Postupak selektivnog umnažanja je proveden u aparatu Thermalcycler Verity (Applied

Biosystems) u prema sljedećem PCR protokolu:

°C min broj ciklusa

94 2:00 1

94 0:20

11

66→56*

0:30

72 2:00

94 0:20

20

56 0:30

72 2:00

60 30:00 1

* sa svakim ciklusom temperatura nalijeganja početnica opadala je za jedan stupanj celzijev

45

4.4.3.4. Razdvajanje i vizualizacija AFLP fragmenata

Za razdvajanje i vizualizaciju AFLP-fragmenata korišten je četverokapilarni genetički analizator

Genetic Analyzer 3130 (Applied Biosystems, SAD). Taj uređaj omogućava automatsku detekciju

flourescentno označenih DNA molekula odvojenih elektroforezom. Za razdvajanje je korišten

polimer POP – 7 (Applied Biosystems) i standard veličine GeneScan 600-LIZ (Applied

Biosystems).

Nakon završene elektroforeze, DNA fragmenti su analizirani pomoću softverskog paketa Gene

Mapper 4.0. (Applied Biosystems)

46

4.5. Statistička analiza

4.5.1. Kultura tkiva

4.5.1.1. Logistička regresija - usporedbe između modela

Utjecaj donorske biljke (genotipa), tretmana (hranidbene podloge) te njihove interakcije na

kalogenezu odnosno somatsku embriogenezu analiziran je logističkom regresijom u statističkom

programu SAS (SAS Institute Inc., 2004). Zavisne varijable (uspjeh kalogeneze/embriogeneze)

su bile binarnog karaktera: (0 i 1) ovisno o tome je li kalogeneza i somatska embriogeneza

inducirana ili ne za svaki postavljeni eksplantat na svaki medij. Akaike kriterij (Akaike

Information Criterion, AIC) upotrebljen je za usporedbu nultog modela (model bez nezavisnih

varijabli) i predloženog modela (model koji sadrži nezavisne varijable). Model sa najmanjom

AIC vrijednošću odabran je kao najpovoljniji te je za njega procijenjen statistički značaj

nezavisnih varijabli.

Logistička regresija opisuje se modelom koji izražava odnos između binarnog ishoda i jednog ili

više faktora utjecaja (nezavisnih varijabli)

log (p / 1-p) = b0 + bi xi

Gdje su: b0 i b1 – regresijski koeficijenti

p – vjerojatnost za kalogenezu / somatsku embriogenezu

xi – nezavisna varijabla (tretman / genotip)

Logistička regresija testira hipoteze o individualnim koeficijentima. Wald statistika je test koji se

koristi u logističkoj regresiji, a omogućava procjenu utjecaja svakog koeficijenta (genotip, medij)

na predviđenu vjerojatnost događaja (kalusiranje, embriogeneza). Njena interpretacije jednaka je

interpretaciji F ili t vrijednosti koje se koriste za ocjenu statističkog značaja testiranih regresijskih

koeficijenata.

47

Waldovom statistikom testirana je nulta hipoteza da je vrijednost regresijskih koeficijenata bila

nula. Analiza podataka obavljena je statističkim paketom SAS (SAS Institute Inc., 2004). Kao

statistički značajne uzete su p-vrijednosti manje od pet posto (p<0,05).

Za nezavisne varijable (faktore) koje su se pokazale statistički značajnima, procijenjeni su i

testirani omjeri vjerodostojnosti najuspješnije razine sa svim ostalim razinama.

4.5.1.2. Analiza varijance (ANOVA)

Statistička analiza broja multipliciranih izdanaka perunika, izvedena je analizom varijance

(ANOVA) i Duncan-testom u statističkom programu SAS (SAS Institute Inc., 2004).

48

4.5.2. Analiza fenotipa

4.5.2.1. Analiza glavnih komponenata (PCA engl. Principal component analysis)

Opažaji i izmjere morfoloških svojstava statistički su obrađeni analizom glavnih komponenata

(PCA). Analiza glavnih komponenata je tehnika koja omogućuje redukciju velikog broja ulaznih

varijabli na manji broj sintetskih varijabli uz minimalni gubitak informacija. Sintetske varijable

su dakle, linearne složenice - kombinacije izvornih varijabli, a predstavljene su PC osima.

Rezultati su prikazani tablično i pomoću grafikona prvih dviju PC osi.

Suma varijanci svih izvornih varijabli je ukupna varijanca. Dio te ukupne varijance objašnjen

jednom glavnom komponentom naziva se svojstvena vrijednost ili latentni korijen (eigenvalue).

Svojstvena vrijednost je najveća u prvoj glavnoj komponenti i u svakoj sljedećoj njena je

vrijednost sve manja. Suma svih svojstvenih vrijednosti jednaka je ukupnoj varijanci. Svojstveni

ili latentni vektori (eigenvectors) u geometrijskom smislu su, u dvodimenzionalnoj strukturi,

sinusi i cosinusi kuteva novih osi, tj. glavnih komponenata. Vrijednosti svojstvenih vektora

prikazuju stupanj povezanosti svake od izvornih varijabli sa svakom glavnom komponentom.

Cilj analize je izdvajanje tek nekoliko prvih glavnih komponenata koje objašnjavaju čim veći dio

ukupne varijance što se uobičajeno izražava u kumulativnim postocima ukupne varijance, i time

reduciramo broj izvornih varijabli. Analiza glavnih komponenata provedena je korištenjem

softverskog paketa R (R software, 2008).

4.5.3. Veličina genoma

Za analizu podataka veličine genoma upotrebljen je FlowMax software (Partec). Više od 7 000

jezgara je analizirano po uzorku u tri neovisna ponavljanja za svaku analiziranu biljku.

49

4.5.4. Analiza biljega AFLP

Amplificirani fragmenti AFLP-molekularnih markera analizirani su kao dominantni markeri.

Temeljem elektroforegrama napravljene su binarne matrice pri čemu je prisutnost amplificiranog

fragmenta označena kao 1 odnosno odsutnost kao 0.

Genetska sličnost između parova regeneranata izračunata je korištenjem koeficijenta sličnosti

prema Dice-u (Dice, 1945 ; Nei i Li, 1979) prema formuli:

yxxy

xy

Dnnn

nS

222

2

gdje 2nxy predstavlja ukupan broj slučajeva u kojima genotip x i genotip y imaju zajednički

marker, nx predstavlja ukupan broj slučajeva u kojima genotip x ima marker kojeg nema genotip

y, ny predstavlja ukupan broj slučajeva u kojima genotip y ima marker kojeg nema genotip x.

Na osnovu SD vrijednosti između svih parova regeneranata konstruirana je matrica sličnosti koja

je korištena za klaster analizu pomoću UPGMA algoritma i programa NTSYSpc ver. 2.20b

(Rohlf, 2005.), potprogramskog paketa SAHN. Skupine proizašle iz hijerarhijskog grupiranja

prikazane su u obliku dendrograma.

U svrhu analize molekularne raznolikosti za svaki od korištenih parova početnica izračunat je

Shannonov informacijski indeks (Shannon i Weaver, 1949) prema formuli:

A

pp

I

A

a

M

m

mm

a

1 1

2log

gdje je pm frekvencija nazočnosti/odsutnosti biljega, Ma ukupni broj stanja biljega (0 ili1) po

analizi, A = ukupan broja analiza.

50

4.5.5. Mantelov test značajnosti i podudarnosti matrica

Matrice genetske udaljenosti na osnovu morfoloških podataka i AFLP-biljega o ispitivanim

genotipovima su uspoređene za svaku vrstu perunika zasebno kako bi se utvrdila korelacija

između dobivenih rezultata. Usporedba je provedena koristeći Mantelov test značajnosti i

podudarnosti matrica (Mantel, 1967), a koeficijent poveznosti je testiran na bazi 1000

permutacija. Za provedbu analize korišten je statistički program NTSYSpc 2.21L (Rohlf, 2008).

51

5. REZULTATI

5.1. Kultura tkiva

5.1.1. Kalogeneza baza listova

Kalogeneza baza listova (Slika 4.) inducirana je na MS mediju s tri različita sastava regulatora

rasta. Glavni cilj bio je utvrditi je li je neki od tih medija bio pogodniji za indukciju kalogeneze

ili je pak neka od donorskih biljaka/genotipova bila spremnija za kalogenezu od ostalih

genotipova iste vrste. Kako je naša zavisna varijabla, uspjeh kalogeneze, dihotomnog karaktera,

za statističku obradu podataka koristili smo se metodom logističke regresije. Cilj ove metode jest

pronaći najprikladniji model kojim bismo opisali odnos zavisne varijable i nekog seta prediktora.

Logističkom regresijom zapravo se procjenjuje vjerojatnost pojave nekog događaja.

Slika 4. Početak kalogeneze vidljiv na vaskularnom tkivu eksplantata baze lista. (Foto: A.

Mihovilović Bošnjak)

Sposobnost indukcije kalogeneze razlikovala se kod tri promatrane vrste perunika. Donorske

biljke jadranske perunike su bile najuspješnije u indukciji kalusnih struktura s uspješnošću od

21%, dok su donorske biljke ilirske i Rotschildove perunike kaluse razvile na najviše 8,33%

odnosno 9,55% postavljenih eksplantata (Tablica 9.b, 11.b i 13.b). Vrste su se razlikovale i u

brzini induciranja kalusa. Tako su se kalusi i proembriogene strukture na eksplantatima baza

listova jadranske perunike pojavili već nakon četiri tjedna od postavljanja kulture dok su

eksplantati ilirske i Rotschildove perunike kalusirali tek nakon 8-10 tjedana. Uz to, eksplantati

52

ove dvije vrste su često nekrotizirali. Nekroze su se prvo pojavljivale uz rub eksplantata. Kod

najvećeg dijela eksplantata koji nikada nisu formirali kaluse uzrok je bio upravo u tamnjenju

odnosno nekrozi tkiva. Međutim, čak se i kasnije kod već formiranih kalusa nastavila pojava

nekroze s učestalošću od 7-12% (ovisno o tretmanu) kod Rotschildove perunike te 14-39%

(ovisno o tretmanu) kod ilirske perunike. Iako se rijetko može s pouzdanošću govoriti o uzrocima

tamnjenja eksplantata, ono je vrlo često povezano s polifenolnim tvarima prisutnim u biljnom

tkivu. Upravo činjenica da na eksplantatima jadranske perunike nije dolazilo da tamnjena

eksplantata može objasniti veći uspjeh induciranja kalusa i proembriogenih struktura kod te vrste

u odnosu na druge dvije vrste u ovom istraživanju.

5.1.1.1. Iris adriatica

Kod vrste Iris adriatica, pojavu kalogeneze najbolje opisuje potpuni model, tj. onaj koji uključuje

donorsku biljku (genotip) i tretman i njihovu interakciju. Unutar ovog modela, utjecaj donorske

biljke na kalogenezu je signifikantan, dok tretman nije imao značajnog utjecaja na uspjeh

kalogeneze (Tablica 8.). U tablici 9a su prikazani omjeri vjerojatnosti kalusiranja za svaku

donorsku biljku u odnosu na onu koja je zadana kao referentna što je u našem slučaju bila IA 12

koja je imala najveću stopu kalusiranja. Samo se dvije donorske biljke nisu signifikantno

razlikovale po vjerojatnosti kalusiranja (IA 14 i IA 5), dok je u usporedbi s bilo kojom drugom

donorskom biljkom, IA 12 bila signifikantno bolja. Svih 12 donorskih biljaka proizvelo je kaluse,

barem na jednom od tri korištena tretmana (hranidbene podloge), ali s različitim uspjehom.

Modelom predviđena vjerojatnost kalusiranja eksplantata, prosječno na sva tri tretmana, kretala

se od 51,1% (IA 12) do 11,7% (IA 8) (Tablica 9.b).

Tablica 8. Rezultati analize utjecaja faktora na kalogenezu jadranske perunike

Faktor DF Waldov χ2 Pr > χ

2

Tretman 2 0,0012 0,99

Donorska biljka 11 21,61 0,027

Don. bilj. x tretman 22 13,61 0,91

Vrijednosti Pr > χ2 manje od 0,05 se signifikantno razlikuju

53

Tablica 9.a. Usporedba vjerojatnosti kalusiranja za različite donorske biljke jadranske perunike

Omjeri vjerojatnosti kalusiranja

Usporedba donorskih biljaka Waldov χ2 Pr > χ2

IA 12 - IA 14 2,583 0,11

IA 12 - IA 5 3,126 0,08

IA 12 - IA 10 6,981 0,01

IA 12 - IA 13 8,584 0,00

IA 12 - IA 3 9,661 0,00

IA 12 - IA 6 9,52 0,00

IA 12 - IA 4 9,896 0,00

IA 12 - IA 1 10,514 0,00

IA 12 - IA 8 12,961 0,00

IA 12 - IA 2 13,313 0,00

IA 12 - IA 11 11,507 0,00


Tablica 9.b. Prosjeci modelom predviđenih vjerojatnosti kalusiranja po donorskim biljkama i

tretmanima jadranske perunike

donorska

biljka

prosjek po tretmanima (%) prosjek za

donorske biljke

(%) A1 A2 A3

IA 12 42 50 62 51,1

IA 14 36 46 10 30,8

IA 5 0 38 50 29,2

IA 10 17 27 21 21,6

IA 13 20 7 27 18,1

IA 3 7 33 13 17,8

IA 6 23 20 8 16,9

IA 4 15 13 21 16,7

IA 1 8 36 0 14,7

IA 11 27 14 0 13,9

IA 2 36 0 0 11,9

IA 8 7 14 14 11,7

Prosjek 20 25 19 21

54

5.1.1.2. Iris illyrica

Kod vrste Iris illyrica, pojavu kalogeneze najbolje opisuje model koji uključuje donorsku biljku i

tretman. Unutar ovog modela, utjecaj donorske biljke na kalogenezu je signifikantan, dok tretman

nije imao značajnog utjecaja na uspjeh kalogeneze (Tablica 10.). Zato su za donorske biljke

procijenjeni i testirani omjeri vjerojatnosti kalusiranja za svaku od njih u odnosu na najuspješniju

donorsku biljku (koja je zadana kao referentna) što je u našem slučaju bila II 14 (Tablica 11.a).

Tablica 10. Rezultati analize utjecaja faktora na kalogenezu ilirske perunike


2

Tretman 2 4,62 0,099



Tablica 11.a. Usporedba omjera vjerojatnosti kalusiranja donorskih biljaka ilirske perunike


Usporedba

donorskih

biljaka Wald χ2 Pr > χ2

II 14 – II 9 0,00 0,96

II 14 – II 15 29,39 0,09

II 14 – II 2 50,09 0,02

II 14 – II 6 50,09 0,02

II 14 – II 1 61,99 0,01

II 14 – II 3 61,99 0,01

II 14 – II 10 61,99 0,01

II 14 – II 8 61,99 0,01

II 14 – II 12 73,69 0,01

II 14 – II 13 79,26 0,01

II 14 – II 16 79,26 0,00

II 14 – II 11 82,32 0,00

II 14 – II 4 82,32 0,00

II 14 – II 7 84,18 0,00


55

Samo se dvije donorske biljke nisu signifikantno razlikovale po vjerojatnosti kalusiranja (II 9 i II

15), dok je u usporedbi s bilo kojom drugom donorskom biljkom II 14 bila signifikantno bolja.

Od ukupno 15 donorskih biljaka, 14 je proizvelo kaluse, na sva tri korištena tretmana (hranidbene

podloge), ali s različitim uspjehom. Modelom predviđena vjerojatnost kalusiranja eksplantata,

prosječno na sva tri tretmana, kretala se od 29% (II 14) do 2% (II 13, II 16) (Tablica 11.b).

Tablica 11.b. Prosjeci modelom predviđenih vjerojatnosti kalusiranja za donorske biljke ilirske

perunike

Donorska

biljka


donorske biljke

(%) A1 A2 A3

II 14 32,67 20,07 34,76 29

II 15 16,55 9,31 17,89 15

II 9 16,95 9,55 18,31 15

II 2 11,86 6,51 12,88 10

II 6 11,86 6,51 12,88 10

II 1 9,51 5,15 10,34 8

II 10 9,51 5,15 10,34 8

II 3 9,51 5,15 10,34 8

II 12 7,14 3,83 7,79 6

II 11 4,77 2,52 5,21 4

II 4 4,77 2,52 5,21 4

II 8 4,66 2,46 5,09 4

II 13 2,39 1,25 2,61 2

II 16 2,39 1,25 2,61 2

II 7 0,00 0,00 0,00 0

prosjek 9,63 5,42 10,42 8,33

56

5.1.1.3. Iris rotschildii

Kod vrste Iris rotschildii, pojavu kalogeneze najbolje opisuje model koji uključuje donorsku

biljku i tretman pri čemu je signifikantan utjecaj na kalogenezu imao tretman, dok donorska

biljka nije imala utjecaja na uspjeh kalogeneze (Tablica 12.). Iz tog razloga su procijenjeni i

testirani omjeri vjerojatnosti kalusiranja za sva tri tretmana. Tretmani A1 i A3 bili su

signifikantno bolji od tretmana A2 u vjerojatnosti kalusiranja (Tablica 13.a).

Tablica 12. Rezultati analize utjecaja faktora na kalogenezu Rotschildove perunike


2

Tretman 2 15,53 0,0004



Tablica 13.a. Usporedba vjerojatnosti kalusiranja Rotschildove perunike ovisno o tretmanima


Usporedba tretmana Waldov χ2 Pr > χ2

A 1 - A 2 154.293 <.0001

A 1 - A 3 0.3772 0.5391

A 2 - A 3 129.439 0.0003


Od ukupno 12 genotipova, 11 je formiralo kaluse na sva tri korištena tretmana (hranidbene

podloge), ali s različitim uspjehom. Modelom predviđena vjerojatnost kalusiranja eksplantata,

prosječno na sva tri tretmana, kretala se od 20,83% (IR 4) do 2,08% (IR 33) (Tablica 13.b).

57

Tablica 13.b. Prosjeci modelom predviđenih vjerojatnosti kalusiranja po tretmanima i donorskim

biljkama za Rotschildovu peruniku


donorske biljke

(%) donorska

biljka A1 A2 A3

IR 4 31,30 3,81 27,38 20,83

IR 2 28,30 3,32 24,63 18,75

IR 3 19,12 2,02 16,36 12,50

IR 19 16,00 1,63 13,62 10,42

IR 23 16,00 1,63 13,62 10,42

IR 27 16,00 1,63 13,62 10,42

IR 1 16,00 1,63 13,62 10,42

IR 10 12,85 1,27 10,88 8,33

IR 5 9,68 0,92 8,15 6,25

IR 8 6,48 0,60 5,42 4,17

IR 33 3,25 0,29 2,71 2,08

IR 29 0,00 0,00 0,00 0,00

prosjek 14,58 1,56 12,50 9,55

5.1.2. Kalogeneza eksplantata korijena

Na eksplantatima korijena nije induciran niti jedan kalus ni na jednoj od tri promatrane vrste

perunika, bez obzira na tretman.

58

5.1.3. Somatska embriogeneza eksplanatata lista

Pojava somatskih embrija (Slika 5.a) na induciranim kalusima nije bila sinhronizirana; na nekim

kalusima započela je već nakon 4 tjedna, a na drugima kasnije. Također, u istom embriogenom

kalusu nalazli su se somatski embriji u različitim fazama razvoja (Slika 5.c). Kod jednosupnica

faze razvoja somatskih embrija kreću od proembriogenih struktura koje se sastoje od 6 do 8

stanica. U globularnoj fazi razvoja somatski embriji jednosupnica jako podsjećaju na meristeme

izdanka. Međutim, daljnjim razvojem nastaju prvo globularna tijela (Slika 5.b) koja rastući

razvijaju strukture koje nalikuju na skutelum i koleoptile. Nakon razvoja koleoptile slijedi faza

torpednog embrija (Slika 5.d), razvoja korijena i na poslijetku klijanje embrija (Slika 5.e). Iako se

kod mnogih kultura proizvede velik broj somatskih embrija, najčešće samo mali dio njih proklija

i rezultira biljkama.

Uspješnost somatske embriogeneze s obzirom na kalusirale eksplantate, niti kod jedne od

promatrane tri vrste, nije bila značajno ovisna niti o jednom od faktora (tretman, donorska biljka).

Ipak, primjetna je bitna razlika u prosječnom formiranju embriogenih kalusa među različitim

vrstama, osobito između jadranske perunike i druge dvije vrste (Tablica 14.). Eksplantati

jadranske perunike formirali su embriogene strukture na prosječno 43,40% induciranih kalusa, a

eksplantati ilirske i Rotschildove perunike na prosječno 15,18 i 12,03% induciranih kalusa.

Tablica 14. Prosječno formiranje embriogenih kalusa s obzirom na broj induciranih kalusa po

vrsti i po hranidbenoj podlozi

A1 A2 A3 Prosjek (%)

(%) I. adriatica 48,58 50,67 30,95 43,40

I. illyrica 22,20 13,33 10,00 15,18

I. rotschildii 13,86 8,33 13,89 12,03

59

Slika 5. Faze somatske embriogeneze kod

perunika. a) početak formiranja somatskih

embrija na kalusu, b) formirani globularni

embriji, c) klaster somatskih embrija u

različitim fazama razvoja, d) somatski

embriji u torpednoj fazi razvoja, e) klijanje

somatskog embrija. (Foto: S. Kereša)

60

Obzirom na postavljene eksplantate, kod vrste Iris adriatica, pojavu somatske embriogeneze

najbolje opisuje potpuni model, tj. onaj koji uključuje donorsku biljku i tretman i njihovu

interakciju, ali samo je donorska biljka imala značajan utjecaj na rezultat (Tablica 15.).

Tablica 15. Rezultati analize utjecaja faktora na somatsku embriogenezu jadranske perunike


2

Tretman 2 5,774 0,055

Donorska biljka

biljka

11 21,124 0,032

U tablici 16.a prikazani su omjeri vjerojatnosti formiranja somatskih embrija za svaku donorsku

biljku u odnosu na onu koja je zadana kao referentna što je u našem slučaju bila IA 12 koja je

imala najveći uspjeh formiranja somatskih embrija u odnosu na postavljene eksplantate.

Donorske biljke IA 14 i IA 5 nisu se signifikantno razlikovale po vjerojatnosti formiranja

somatskih embrija od najbolje IA 12. Sve ostale imale su signifikantno manju vjerojatnost

formiranja somatskih embrija od referentne donorske biljke. Modelom predviđena vjerojatnost

formiranja embriogenih kalusa u odnosu na postavljene eksplantate, prosječno na sva tri

tretmana, kretala se od 38,1% (IA 12) do 0% za donorske biljke IA8 i IA13 (Tablica 16.b).

Tablica 16.a. Omjeri vjerojatnosti formiranja somatskih embrija jadranske perunike u odnosu na

postavljene eksplantate.

Omjeri vjerojatnosti formiranja somatskih embrija

Usporedba donorskih biljaka Waldov χ2 Pr > χ

2

IA 12 - IA 14 0,00 0,96

IA 12 - IA 5 0,00 0,96

IA 12 - IA 3 2,84 0,02

IA 12 - IA 1 2,82 0,02

IA 12 - IA 6 5,17 0,01

IA 12 - IA 4 5,23 0,01

IA 12 - IA 2 8,07 0,00

IA 12 - IA 11 8,31 0,00

IA 12 - IA 10 8,66 0,00

IA 12 - IA 13 8,64 0,00

IA 12 - IA 8 9,21 0,00


61

Tablica 16.b. Prosjeci modelom predviđenih vjerojatnosti formiranja embriogenih kalusa u

odnosu na postavljene eksplantate, za donorske biljke jadranske perunike

prosjek za

donorske biljke

(%) donorska

biljka

IA 12 38,1

IA 14 19,9

IA 5 19,4

IA 3 15,5

IA 1 14,9

IA 6 9,5

IA 4 9,4

IA 2 9,1

IA 11 7,6

IA 10 7,2

IA 13 0

IA 8 0

prosjek (%) 12,55

U slučaju Iris illyrica i Iris x rotschildii, na pojavu somatske embriogeneze s obzirom na

postavljene eksplantate niti jedan od promatranih faktora kao ni njihova interakcija nisu imali

značajan utjecaj. U tablici 17. ipak je prikazana prosječna indukcija embriogenih kalusa i za ove

dvije vrste.

Iako je utjecaj tretmana u slučaju jadranske perunike graničan (Tablica 15.), iz tablice 17. je

vidljivo da je tretman A2 bolji od prosjeka za tu vrstu dok tretman A3 ima vrijednost nižu od

prosjeka. Druge dvije vrste su formirale embriogene kaluse sa znatno manjom uspješnošću.

Tablica 17. Prosječna indukcija embriogenih kalusa po vrsti i tretmanima, u odnosu na postavljene

eksplantate

A1 A2 A3 Prosjek (%)

(%) I. adriatica 12,15 16,72 8,71 12,53

I. illyrica 2,05 0,82 2,52 1,79

I. rotschildii 4,08 0,52 2,50 2,37

62

5.1.4. Regeneracija biljaka

Broj regeneriranih biljaka s obzirom na broj razvijenih kalusa niti kod jedne od promatranih vrsta

nije značajno ovisio niti o jednom od faktora. Biljke regenerirane i zakorijenjene u kulturi tkiva

(Slika 6.a) su posađene u male lonce, promjera 10 cm, aklimatizirane u komori rasta kroz 4 tjedna

(Slika 6.b) te prenešene u plastenik.

Slika 6. a) Zakorijenjene biljke, b) razvijene aklimatizirane biljke u komori rasta

Broj regeneriranih, zakorijenjenih (i aklimatiziranih) biljaka za svaku donorsku biljku u

istraživanju prikazan je u tablici 18. (Foto: S. Kereša)

63

Tablica 18. Broj regeneriranih i zakorijenjenih biljaka po vrsti i donorskoj biljci

Jadranska perunika Ilirska perunika Rotschildova perunika Donorska

biljka

Broj regeneriranih

zakorijenjenih

biljaka

Donorska

biljka

Broj regeneriranih

zakorijenjenih

biljaka

Donorska

biljka

Broj regeneriranih

zakorijenjenih

biljaka

IA3 8 II3 11 IR 4 5

IA12 5 II1 27 IR 2 10

IA14 4 II6 1 IR 1 39

IA1 10 II8 0 IR 27 2

IA4 9 II14 0 IR 3 9

IA6 3 II2 13 IR 23 3

IA5 0 II10 0 IR 10 0

IA2 8 II15 0 IR 8 4

IA11 3 II16 0 IR 19 0

IA10 2 II4 0 IR 5 0

IA13 2 II7 0 IR 29 0

IA8 1 II9 0 IR 33 0

II11 0

II12 0

Zanimljivo, donorske biljke sve tri vrste perunika od kojih je regeneriran najveći broj biljaka nisu

one koje su imale najveću uspješnost indukcije kalogeneze i somatske embriogeneze. Za tu

pojavu može postojati nekoliko objašnjenja. Najizglednije rješenje je u sekundarnoj somatskoj

embriogenezi jer bez obzira na mali početni broj embriogenih kalusa, ukoliko se postigne velika

proliferacija somatskih embrija, moguće je postići i velik broj regeneranata (Tablica 18.). Drugo

moguće objašnjenje je u manjoj sklonosti aberacijama somatskih embrija nekih genotipova čime

su regenerirali veći broj biljaka. Kod vrste I. adriatica, usprkos velikom broju početno

regeneriranih biljaka, većina se nije uspjela zakorijeniti i/ili aklimatizirati.

64

5.1.5. Multiplikacija izdanaka

Vegetacijski vršci su izolirani iz matičnih biljaka u proljeće i kultivirani na dva medija za

multiplikaciju izdanaka. Multiplikacija je bilježena kroz osam supkultivacija.

Za vrstu I. adriatica početno su u kulturu postavljeni izdanci 6 donorskih biljaka. Analizom

varijance je ustanovljeno da tretmani i donorske biljke signifikantno utječu na aksilarno grananje

(Tablica 19.). Uspješnost multiplikacije perunika izražena je pomoću indeksa multiplikacije pod

kojim podrazumjevamo broj novih izdanaka razvijenih u jednoj supkultivaciji po jednom

izdanku. Indeks multiplikacije bio je najveći na tretmanu s 1 mg/L BAP (B1). Varirao je od 3,28

do 9,02 ovisno o donorskoj biljci (Tablica 20.). Ujedno je taj tretman bio signifikantno bolji od

druga dva tretmana u pokusu. Od donorskih biljaka se kao značajno bolja izdvojila biljka IA 23

čija je stopa multiplikacije izdanaka na oba tretmana s citokininima bila veća u usporedbi s druge

četiri donorske biljke u pokusu (Tablica 21.).

Tablica 19. Utjecaj tretmana i genotipa na aksilarno grananje jadranske perunike

Tablica 20. Indeks multiplikacije donorskih biljaka po tretmanima i razlike među tretmanima u

uspješnosti multiplikacije jadranske perunike

Donorska

biljka

Tretman

B0 B1

B2

IA 23 1,12 9,02 5,04

IA 8 1,23 6,14 3,12

IA 21 1,80

3,81

2,61

IA 18 1,56

3,97

2,81

IA 22 1,46 3,28 2,66

IA 3 1,05 3,60 2,12

Prosjek 1,41c 4,56a 2,92b

Vrijednosti označene s istim slovima signifikantno se ne razlikuju pri p=0.05, prema Duncan

testu

DF F vrijednost Pr > F


Tretman 2 36,74 < 0,0001

Donorska biljka x tretman 10 2,66 0,0066

65

Tablica 21. Razlike među donorskim biljkama u uspješnosti multiplikacije, prosjek svih

teretmana

Donorska biljka Prosjek indeksa multiplikacije na sva tri tretmana

IA 23 4,48 a

IA 8 3,29 b

IA 21 2,68 b

IA 18 2,67 b

IA 22 2,44 b

IA 3 2,32 b

Vrijednosti označene s istim slovima signifikantno se ne razlikuju pri p=0.05, prema Duncan

testu

Kod vrsta I. illyrica i I. x rotschildii su također početno u kulturu postavljeni izdanci od 6

donorskih biljaka. Međutim, čak i nakon višekratnih supkultivacija pojava aksilarnih izdanaka

bila je sporadična i nezadovoljavajuća.

66

5.2. Morfološka analiza

5.2.1. Analiza glavnih komponenata morfoloških svojstava

Izmjere 12 morfoloških svojstava na procvalim biljkama, dvije godine nakon regeneracije

statistički su obrađene analizom glavnih komponenata. Tabelarni rezultati pokazuju da prve dvije

PC osi objašnjavaju najveći udio ukupne varijabilnosti (Tablica 22.). Analiza glavnih

komponenata u dvije dimenzije pokazuje udaljenost i odnose regeneranata i donorskih biljaka,

koji su vjerno predstavljeni geometrijskim udaljenostima točaka na grafikonu. Grupiranje točaka

na grafikonu pokazuje grupe morfološki sličnog materijala.

Statističkom analizom su obuhvaćene samo donorske biljke/genotipovi koji su imali najmanje

sedam regeneranata koji su cvali. U slučaju vrste I. adriatica analizom glavnih komponenata

obuhvaćena četiri genotipa: IA 1 s donorskom biljkom i 10 regeneranata, IA 2 i IA 3 s 8

regeneranata svaki te IA 4 s donorskom biljkom i 9 regeneranata. Kod vrste Iris illyrica to su tri

genotipa (II 1, II 2, II 3) svaki s donorskom biljkom i 41, 20 odnosno 15 regeneranata, dok je od

vrste I. x rotschildii obuhvaćen je samo jedan genotip (IR 1) s donorskom biljkom i 13

regeneranata..

Tablica 22. Postotak ukupne varijabilnosti objašjen s jednom, dvije ili tri osi, za svaku grupu

regeneranata

Genotip/

donorska

biljka

Os1 objašnjava %

varijabilnosti

Os 2 objašnjava

% varijabilnosti

Os 3 objašnjava

% varijabilnosti

Kumulativno učešće u ukupnoj

varijanci (%)

IA 1 44,81 23,73 13,65 82,20

IA 2 41,05 31,51 12,47 85,03

IA 3 44,27 31,07 10,90 86,26

IA 4 58,50 19,48 8,42 86,40

II 1 24,18 18,18 16,71 58,98

II 2 29,57 20,78 16,55 66,90

II 3 29,08 22,61 14,30 65,99

IR 1 33,37 23,86 17,02 74,27

67

U grafikonu 1. prikazane su prve dvije glavne komponente (PC1 i PC2) 4 majčinske biljkei

regeneranata I. adriatica, triju majčinskih biljaka i regeneranata vrste Iris illyrica, 1 majčinske

biljke s regenerantima vrste I. x rotschildii. Uočljivo je da su se tri vrste perunika, donorske

biljke sa svojim regenerantima, jasno razdvojile u tri zasebne skupine na osnovu izmjera i

opažanja morfoloških svojstava.

Radi otkrivanja stupnja povezanosti između varijabli na osnovu kojih su genotipovi razvrstani

(Grafikon 1.) analizirane su prve tri glavne komponente za sve tri istraživane vrste. Rezultati

svojstvenih (eigen) vrijednosti, udjela varijance, kumulativne varijance kao i svojstvenih (eigen)

vektora za varijable prikazani su u tablicama 23.a i 23.b.

Grafikon 1. Prikaz vrijednosti prvih dviju glavnih komponenata regeneranata od 8

genotipova/donorskih biljaka

68

Tablica 23.a. Svojstvene (eigen) vrijednosti prve tri glavne komponente svih regeneranata

uključenih u analizu

Glavna

komponenta

Svojstvena

(eigen) vrijednost

Udio

varijance (%)

Kumulativna

varijanca (%)

PC1 5,82 48,54 48,54

PC2 1,46 12,20 60,75

PC3 1,26 10,55 71,30

Tablica 23.b. Svojstveni (eigen) vektori prve tri glavne komponente svih regeneranata uključenih

u analizu

Izvorna varijabla Svojstveni (eigen) vektori

PC1 PC2 PC3

visina biljke (cm) 0,372 -0,149 -0,139

dužina DLP(cm) 0,375 -0,212 0,123

širina DLP (cm) 0,381 -0,156 0,071

dužina GLP (cm) 0,356 -0,209 0,185

širina GLP (cm) 0,371 -0,113 0,171

dužina NVL (cm) 0,273 0,467 -0,153

širina NVL (cm 0,265 0,407 -0,516

dužina NML (cm) 0,108 0,437 0,763

širina NML (cm) 0,194 0,487 -0,017

dužina CS do prvog cvijeta 0,339 -0,195 -0,154

DLP- donji list perigona, GLP- gornji list perigona,

NVL- najveći list na biljci, NML-najmanji list na biljci, CS-cvjetna stapka

Promatrano za sve tri vrste perunika zajedno, prva glavna kompnenta objasnila je 48,54% ukupne

varijabilnosti, druga glavna komponenta 12,20%, a treća 10,55% dok kumulativna varijanca za

prve tri glavne komponente iznosi 71,30% (Tablica 23.a).

U tablici 23b prikazane su vrijednosti svojstvenih (eigen) vektora koji prikazuju stupanj

povezanosti svake od izvornih varijabli sa svakom glavnom komponentom. Prvoj glavnoj

komponenti najviše pridonose varijable širina i dužina donjeg lista perigona koje imaju najveće

vrijednosti svojstvenih (eigen) vektora (0,38 i 0,37), potom slijede visina biljke (0,37) i širina

gornjeg lista perigona (0,37). U drugoj glavnoj komponenti najveći udio u njenom formiranju

69

imaju varijable širina najmanjeg lista (svojstveni vektor iznosi 0,49) i dužina najvećeg lista

(svojstveni vektor iznosi 0,47).

5.2.2. Procjena boje cvjetova

Boja perunika procijenjena prema Royal Horticultural karti boja varirala je kod jadranske

perunike između svijetlo žute boje donjeg (1B, 1C) i gornjeg lista perigona (1B, 1C) do

ljubičastih (N79A-donji list perigona i N79B- gornji list perigona) i grimizno-purpurnih nijansi

(N187C, N199A). Kod žutih cvjetova kod nekih biljaka postoji sekundarno obojenje na donjem

listu perigona koje je maslinasto-smeđe boje (N199A), a boja „brade“ je svijetlo žuta, dok je kod

ljubičasto grimiznih cvjetova i brada tamnije boje.

Kod svih analiziranih biljaka ilirske perunike boja je bila jednaka. I donji i gornji list perigona su

dubokih ljubičastih nijansi (86A, odnosno 86B). Cvjetovi Rotschildove perunike su

najatraktivniji jer se donji i gornji list perigona znatnije razlikuju u boji. Boja donjeg lista

perigona je uglavnom od dubokih ljubičasto- purpurnih nijansi (N87A ili N77A i N81A) dok je

gornji list perigona svjetlije, sjajne lila boje (N87B). Boja „brade“ je žuta.

70

5.3. Citogenetička analiza

Metodom protočne citometrije analizirano je ukupno 167 biljaka (22 regeneranta od četiri

donorske biljke jadranske perunike, 71 regenerant dobiven od tri donorske biljke ilirske perunike

i 74 regeneranata od četiri donorske biljke Rotschildove perunike). Ukupan sadržaj DNA

regeneranata varirao je od 11.019 0.076 pg prema DAPI metodi za Rotschildovu peruniku,

odnosno 12.766 0.077 pg prema PI metodi, do 11.795 0.032 pg i 13.882 0.076 pg za

jadransku peruniku prema DAPI, odnosno PI metodi (Tablica 24.).

Tablica 24. Sadržaj DNA mjeren PI i DAPI metodom za tri vrste perunika

Vrsta PI (pg/2C) DAPI (pg/2C)

I. adriatica 13.882 0.076 11.795 0.032

I. illyrica 12.936 0.038 11.151 0.027

I. rotschildii 12.766 0.077 11.019 0.076

Na profilu protočne citometrije prikazanom na slici 7 uočljiv je signal na kanalu 200 koji

predstavlja sadržaj DNA izmjeren u jezgrama perunike dok slike 8 i 9 osim tog signala prikazuju

i signal na kanalu 400 koji predstavlja sadržaj DNA izmjeren u jezgrama boba (Vicia faba) koji je

služio kao standard u mjerenju. Sadržaj jezgrine DNA boba iznosi 26,90 pg. Povezanost stupnja

ploidnosti i sadržaja jezgrine DNA čini protočnu citometriju pogodnom za utvrđivanje razine

ploidnosti i detekciju miksoploida, a pod određenim okolnostima čak i aneuploida.

71

Slika 7. Profil protočne citometrije diploidne biljke perunike (mjereno DAPI metodom)

Slika 8. Profil protočne citometrije diploidne biljke perunike i boba koji je služio kao standard

(mjereno DAPI metodom)

72

Slika 9. Profil protočne citometrije za vrstu Iris illyrica, mjereno PI metodom, prikazuje

diploidnu biljku perunike i boba koji je služio kao standard

Kod jednog regeneranta (IR 2-4b) vrste I. x rotschildii je utvrđena pojava miksoploidnosti,

odnosno drugačija količina DNA (Slika 10.). Količina DNA kod tog regeneranta iznosila je

13,755 pg po jezgri.

Dakle, pojava promjenjene ploidnosti kod ove tri vrste perunika iznosila je 0% za jadransku

peruniku i ilirsku peruniku i 1,35 % za Rotschildovu peruniku.

73

Slika 10. Profil protočne citometrije miksoploida vrste Iris x rotschildii (mjereno DAPI

metodom)

74

5.4. Molekularna analiza

Elektroforegrami proizašli iz AFLP analize za svaku od tri vrste perunika su očitani u binarne

matrice. Na temelju binarnih matrica je izračunat Dice koeficijent sličnosti i pomoću UPGMA

algoritma napravljena klaster analiza za svaku vrstu. Dendrogrami temeljem UPGMA algoritma

prikazani su na Grafikonima 2, 3. i 4. Na člancima dendrograma su prikazane vrijednosti

bootstrap veće od 50% za pojedine podskupine. Te vrijednosti predstavljaju udio dendrograma iz

1000 poduzoraka u kojima se pojavljuje ista podskupina regeneranata određena tim člankom.

5.4.1. Iris adriatica

U AFLP-analizi pomoću deset kombinacija fluorescentno označenih početnica ukupno je

amplificirano 1632 fragmenta. Broj amplificiranih fragemenata s obzirom na kombinaciju

početnica iznosio je od 105 do 194. Ukupno je između regeneranata Iris adriatica detektirano

463 polimorfnih fragmenata (Tablica 25.).

Analizom dendrograma otkrivaju se četiri skupine (cluster) regeneranata koje potječu od četiri

različite donorske biljke. Međusobna sličnost regeneranata pojedine skupine iznosila je najmanje

95 - 97%. Jedino je regenerant IA 3-2 odvojen od svoje matične skupine s kojom dijeli 81%

sličnosti. Kod genotipova/donorskih biljaka IA 2 i IA 3 je uočljivo odvajanje svih regeneranata

od početne/majčinske biljke. Dakle, varijabilnost među regeneranatima je manja od varijabilnosti

između regeneranata i majčinske biljke.

Grafikon 2: UPGMA klaster analiza za vrstu I. adratica bazirana na koeficijentu sličnosti prema Dice-u na bazi AFLP podataka

Tablica 25. Prikaz ukupnog broja fragmenata i broja polimorfnih fragmenata amplificiranih po

kombinaciji početnica upotrebljenoj u AFLP analizi regeneranta vrste I. adratica

Kombinacija

početnica

Monomorfni

fragmenti

Polimorfni

fragmenti Ukupno P%

E35/M49 85 20 105 52,27

E35/M61 75 42 117 44,29

E37/M47 110 84 194 21,46

E37/M61 153 35 188 23,89

E37/M62 125 47 172 26,18

E39/M47 122 54 176 26,05

E39/M49 88 32 120 31,82

E39/M61 136 56 192 21,31

E32/M61 138 39 177 24,68

E40/M47 136 54 190 16,67

Ukupno 1169 463 1632 28,39

77

5.4.2. Iris illyrica

U AFLP analizi pomoću deset kombinacija fluorescentno označenih početnica ukupno je

amplificirano 1529 fragmenata. Broj amplificiranih fragemenata s obzirom na kombinaciju

početnica varirao je od 119 do 183. Ukupno je između regeneranta vrste Iris illyrica detektirano

462 polimorfna fragmenata (Tablica 26.). Analizom dendrograma otkrivaju se četiri skupine

(cluster) regeneranata koje potječu od tri različite donorske biljke. Međusobna sličnost

regeneranata pojedine skupine prema Dice koeficijentu sličnosti iznosi najmanje 91 - 96%.

Kod ilirske perunike je samo u slučaju matične biljke II 1 primjetno grupiranje regeneranata u

skupinu izdvojenu od matične biljke, dok kod druge dvije matične biljke nema vidljivog

odvajanja početne biljke od regeneranata.

Grafikon 3: UPGMA klaster analiza za vrstu I. illyrica bazirana na koeficijentu sličnosti prema Dice-u na bazi AFLP podataka


kombinaciji početnica upotrebljenoj u AFLP analizi regeneranta vrste I. illyrica

Kombinacija

početnica Monomorfni

fragmenti Polimorfni

fragmenti Ukupno P%

E35/M49 84 47 131 39,91

E35/M61 81 45 126 40,00

E37/M47 99 70 169 31,30

E37/M61 150 33 183 25,91

E37/M62 106 58 164 31,38

E39/M47 83 60 143 39,66

E39/M49 98 21 119 32,00

E39/M61 112 60 172 29,22

E32/M61 121 36 157 36,44

E40/M47 133 32 165 27,31

Ukupno 1067 462 1529 33,20

80

5.4.3. Iris x rotschildii

U AFLP analizi pomoću deset kombinacija fluorescentno označenih početnica ukupno je

amplificirano 1125 fragmenata. Broj amplificiranih fragemenata s obzirom na kombinaciju

početnica iznosio je od 72 do 148. Ukupno je između regeneranata Iris x rotschildii detektirano

364 polimorfnih fragmenata (Tablica 27.).

Analizom dendrograma otkrivaju se četiri skupine (cluster) regeneranata koje potječu od četiri

različite donorske biljke (IR 1, IR 2, IR 3, IR 4). Međusobna sličnost regeneranata pojedine

skupine iznosi najmanje 87 do 94%. Time je kod Rotschildove perunike akumulirana najveća

stopa genetske varijabilnosti među promatranim vrstama. Uz to, kod ove je vrste primjetan trend

blagog razdvajanja svih ili gotovo svih regeneranata od matične biljke. Odnosno, varijabilnost

među regenerantima je manja od varijabilnosti između regeneranata i matične biljke. Osim u

slučaju genotipa IR2 kod kojeg u analizi nije bilo matične biljke.

Grafikon 4: UPGMA klaster analiza za vrstu Iris x rotschildii bazirana na koeficijentu sličnosti prema Dice-u na bazi AFLP podataka


kombinaciji početnica upotrebljenoj u AFLP analizi regeneranta vrste I. x rotschildii

Kombinacija

početnica

Monomorfni

fragmenti

Polimorfni

fragmenti Ukupno P%

E35/M49 85 32 117 50,00

E35/M61 44 38 82 62,04

E37/M47 77 54 131 45,64

E37/M61 60 51 111 55,42

E37/M62 71 34 105 58,00

E39/M47 89 45 134 43,22

E39/M49 55 17 72 59,09

E39/M61 108 40 148 38,59

E32/M61 83 40 123 51,00

E40/M47 89 13 102 50,41

Ukupno 761 364 1125 51,86

83

5.5. Usporedba rezultata morfoloških podataka i AFLP biljega Mantelovim testom

U ovom istraživanju, na temelju AFLP sustava genskih biljega i analizom genoma protočnom

citometrijom utvrđena je vrlo mala stopa genetske varijabilnosti regeneranata. S druge strane,

ukupna varijabilnost na morfološkoj razini je puno veća što je sasvim očekivano s obzirom na niz

faktora koji utječu na fenotip biljke. Regeneranti različitih donorskih biljaka razlikovani su na

temelju AFLP biljega (Grafikon 2., 3., 4.), dok je analiza glavnih komponenata temeljena na

morfološkim izmjerama odvojila vrste, ali ne i regenerante donorskih biljaka iste vrste (Grafikon

1.).

Korelacija između matrica udaljenosti dobivenih na osnovi morfoloških i molekularnih podataka

nije bila statistički opravdana, osim u slučaju Rotschildove perunike (Tablica 28.). Ovaj se

rezultat može objasniti spomenutom razlikom između varijabilnosti na genetskoj i morfološkoj

razini.

Tablica 28. Korelacija između matrica udaljenosti dobivenih na osnovi morfoloških i

molekularnih podataka za tri vrste perunika

Vrsta p < Z Vrijednost korelacije

Jadranska perunika 0.4598 -0,01

Ilirska perunika 0.1328 -0,07

Rotschildova perunika 0.0232 -0,24

Vrijednosti p<0,05 se signifikantno razlikuju

84

6. RASPRAVA

6.1.1. Kalogeneza i somatska embriogeneza eksplantata baze listova

U ovom istraživanju su u svrhu indukcije kalogeneze i somatske embriogeneze korišteni

eksplantati baze listova i eksplantati korijena, međutim, samo eksplantati baze listova su uspješno

formirali kaluse i somatske embrije. Izbor početnog eksplantata se pokazao presudan za uspjeh

kulture tkiva. To osobito vrijedi za jednosupnice jer kod njih do diferencijacije tkiva dolazi brzo,

u ranoj fazi razvoja, a praćena je gubitkom mitotskog i morfogenetskog potencijala. Zato su kod

jednosupnica samo nediferencirane stanice razvojno sposobne za diobe kojima formiraju kalus i

održavaju morfogenetski potencijal (Krishnaraj i Vasil 1995). Krishnaraj i Vasil (1995) navode

tipove tkiva korištenih u svrhu somatske embriogeneze kod jednosupnica. To su nediferencirana i

meristematska tkiva primjerice nezreli embriji ili sjemenke, baze listova (Gramineae),vegetacijski

vršci (Orchidaceae) te eksplantati lukovice ili postrani pupovi (Liliaceae). Iako i Jevremović

(2008) navodi da perunike regenerativni kalus lakše i češće formiraju iz meristema izdanka, baze

mladih listova, nezrelih cvjetova te nezrelih i zrelih embrija u usporedbi s dijelovima korijena,

kod nekih vrsta perunika je kalogeneza inducirana upravo na eksplantatima korijena. Kim i sur.

(2009) su postigli kalogenezu iz eksplantata korijena vrste I. pseudacorus, ali na tim kalusima

nije došlo do formiranja somatskih embrija. Laublin i sur. (1991) su inducirali nastanak

embriogenih kalusa iz eksplantata korijena vrste I. pseudacorus I. setosa i I. versicolor, te su

eksplantate korijena ocjenili kao povoljnije u odnosu na eksplantate lista. S druge strane,

eksplantate korijena je kao nepovoljne ocijenio Jéhan (1994).

Kombinacije regulatora rasta korištene u ovom istraživanju (Tablica 2.b) ujedno su najčešće

korišteni tretmani u kulturi tkiva perunika. Općenito, najčešće korištena kombinacija regulatora

rasta kod perunika za indukciju kalogeneze je 2,4-D i kinetin (Jevremović i sur. 2006). Krishnaraj

i Vasil (1995) su također izvjestili da somatska embriogeneza može biti inducirana jakim

auksinima kao što je 2,4-D, a ponekad i pomoću jakih koncentracija citokinina. U ovom

istraživanju je 2,4-D u koncentraciji 1 mg/L isproban u A2 tretmanu, u A3 tretmanu je izvor

auksina predstavljala NAA (2,5 mg/L) dok je u A1 tretmanu korištena kombinacija oba

85

spomenuta auksina (1 mg/L 2,4-D i 1 mg/L NAA). Od citokinina, uvijek je korišten kinetin, ali u

različitim koncentracijama: 0,1 mg/L u A1 tretmanu, 1 mg/L u A2 tretmanu i 0,5 mg/L u A3

tretmanu.

Prema Boltenkov i sur. (2004), 2,4-D ima presudnu ulogu u rastu kalusne kulture. Kalogenezu su

uspješno inducirali na hranidbenoj podlozi s 2,4-D (1-2 mg/l) ili NAA (2 mg/l) uz citokinine:

BAP (0,5 mg/l) ili kinetin (0,2 mg/l). Kombinaciju auksina: 2,4-D i NAA (svakog po 1 mg/L) uz

0,1 mg/L Kin kao u našem tretmanu A1 koristili su i Jéhan i sur. (1994), Shibli i Ajlouni (2000),

Al-Gabbiesh i sur. (2006) i Kereša i sur. (2009). Kombinacija regulatora rasta kakvu smo koristili

u tretmanu A2 bila je gotovo identična onoj koju su koristili Jéhan i sur. (1994) i Laublin i

Cappadocia (1992) koji su na takvom mediju zabilježili najveću indukciju kalogeneze iz

eksplantata plodnice tučka. Jéhan i sur. (1994) su izvjestili da su ove dvije kombinacije regulatora

rasta (kao u A1 i A2 tretmanu) omogućile formiranje nediferenciranog kalusa na 50% eksplantata

cvjetova. Kombinaciju regulatora rasta kao u A3 tretmanu, Kamo i sur. (1990) su ocjenili kao

povoljnu za indukciju kalogeneze.

Bez obzira na različite koncentracije regulatora rasta korištene u ovom istraživanju, jedino je kod

Rotschildove perunike statistički dokazan utjecaj tretmana na kalogenezu. Kod ove vrste,

tretmani A1 i A3 su bili značajno bolji za indukciju kalogeneze od A2 tretmana koji se odlikovao

najmanjom količinom auksina (1 mg/L 2,4- D) i najvećom količinom citokinina (1 mg/L Kin).

U slučaju jadranske perunike i ilirske perunike dokazan presudan utjecaj same donorske biljke na

indukciju kalogeneze. Kod dviju vrsta perunika, ilirske i Rotshildove bilo je genotipova kod kojih

nije uspjela indukcija kalogeneze niti na jednom od ispitanih tretmana. Do sličnih rezultata došli

su i Wenzel i Uhrig (1982) koji su na kulturi krumpira primjetili da genotipovi koji su sposobni

za regeneraciju, imaju dobru stopu regeneracije na bilo kojem mediju, dok su oni koji su bili

˝zahtjevni˝u kulturi tkiva, propustili regenerirati na bilo kojem isprobanom mediju. Ovisnost

indukcije kalogeneze o genotipu je i na primjeru perunika više puta opisana u literaturi. Naime,

za vrste I. pseudacorus, I. setosa, I. versicolor (Laublin i sur. 1991) i I. adriatica (Kereša i sur.

2009) objavljena je ovisnost indukcije kalogeneze o genotipu. Laublin i Cappadocia (1992)

također potvrđuju utjecaj vrste i genotipa na uspjeh kulture tkiva. U njihovom istraživanju, od

86

ukupno 45 testiranih genotipova, samo 22 su uspjela regenerirati, od čega su kod vrste I.

pseudacorus svi genotipovi kalusirali i regenerirali na svim testiranim medijima, dok su pak svi

genotipovi vrste I. setosa imali jako mali stupanj indukcije kalogeneze. Razlike u kalogenezi

donorskih biljaka može uvjetovati različito fiziološko stanje biljaka, ali kako su perunike

stranooplodne vrste, biljke uzete iz prirodnih staništa, kao u našem slučaju, vrlo vjerojatno su

genotipski različite. To potvrđuje i grupiranje u dendrogramima za one biljke koje su bile

uključene u analizu AFLP. Također, prije uzimanja biljnog tkiva za postavljanje in vitro kulture

biljke su uzgajane u plasteniku u identičnim uvjetima uzgoja što smanjuje pojavu fizioloških

razlika među biljkama.

U ovom istraživanju, kod sve tri promatrane vrste perunika, kalogeneza je poticana u mraku pri

čemu se prvo razvijao žuti kalus na kojem se potom, u istim uvjetima počinje razvijati

djelomično organizirano bijelo tkivo. Kalusi s bijelim nodularnim strukturama se smatraju

embriogenim kalusima. Radi regeneracije takve je kaluse potrebno supkultivirati na hranidbenu

podlogu s citokininima (BAP) pri čemu nastaju globularni embriji. Njihovim prenošenjem na

hranidbenu podlogu bez regulatora rasta i 16 satni fotoperiod dolazilo je do daljnje

diferencijacije. Međutim, dio žutih kalusa se jako sporo razvijao i na njima nisu nikada formirani

somatski embriji, dok su kalusi sa bijelim nodularnim strukturama brže rasli, bili su rahli i

stvarali su somatske embrije.

Iako unutar pojedine vrste nije bilo značajnog utjecaja niti tretmana niti genotipa na formiranje

somatskih embrija u odnosu na inducirane kaluse, primjetna je bitna razlika među različitim

vrstama, osobito između jadranske perunike i druge dvije vrste. Najveći postotak embriogenih

kalusa u odnosu na formirane kaluse, postignut je kod jadranske perunike (43,40%), dok su

ilirska i Rotschildova perunika formirale embriogene kaluse s uspješnošću od 15,18% odnosno

12,03% (Tablica 14.).

Ipak, uspješnost somatske embriogeneze s obzirom na broj postavljenih eksplantata kod

jadranske perunike, značajno je ovisila o donorskoj biljci (Tablica 15.). Prosječna indukcija

embriogenih kalusa u odnosu na inducirane kaluse kretala se od 88,33% (za IA 3) do 0 (za IA 8 i

IA 13); dakle neke od donorskih biljka su postigle nizak, a druge visok stupanj somatske

embriogeneze što se podudara s ranije spomenutom povezanošću kulture tkiva i genotipa. Kod

87

druge dvije vrste zbog malog uspjeha embriogeneze nije moguće zaključivati o utjecaju tretmana

ili donorske biljke. S druge strane, kod jadranske perunike imamo dovoljno velik uzorak da

možemo primjetiti da se tretmani razlikuju (s 94,5% sigurnošću). Tretman A3 se odlikovao

najvećim sadržajem auksina (2,5 mg NAA), međutim, u odnosu na prva dva tretmana, nije

sadržavao 2,4-D što je bilo presudno za somatsku embriogenezu (Tablica 15. b). Ovi se rezultati

podudaraju s opažanjima Vasil (1987) i Boltenkov i sur. (2004) koji su primjetili da je prisutnost

fitohormona 2,4-D u hranidbenoj podlozi najvažniji faktor za rast kalusne kulture dok su

Radojević i Subotić (1992) te Shibli i Ajlouni (2000) utvrdili da je prisutnost 2,4-D u hranidbenoj

podlozi preduvjet za formiranje somatskih embrija kod perunika. Suprotno ovome, kod

Rotschildove perunike za formiranje kalusa je tretman sa samom 2,4-D bio statistički značajno

lošiji od tretmana s NAA samom ili 2,4-D u kombinaciji s NAA, što je vrijedilo (iako bez

statističke opravdanosti) i za kasniju somatsku embriogenezu. U skladu s ovim su i opažanja Kim

i sur. (2009) prema kojima kombinacija 2,4-D i kinetina nije bila povoljna za somatsku

embriogenezu vrste I. pseudacorus. Ipak, ovi rezultati su u suprotnosti s izvještajima većine

drugih autora. Naime, vrlo često je za poticanje SE upotrebljavana upravo kombinacija 2,4-D i

kinetina (Jéhan i sur. 1994, Jevremović i Radojević 2002). O važnosti 2,4-D za kalogenezu

cvjetnih organa više vrsta roda Iris izvještavaju Boltenkov i Zarembo (2005). Boltenkov i sur.

(2004) su na kalusnom tkivu I. ensata primjetili da pri smanjenoj koncentraciji 2,4-D (ispod 1

mg/L) ili u prisustvu nekog drugog auksina dolazi do razvoja korjenolikih struktura. Do iste

pojave dolazilo je i kad je vrijeme supkultivacije produženo na 60 dana.

Donorske biljke sklone stvaranju somatskih embrija, što je osobito bilo uočljivo kod jadranske

perunike, stvorile su embriogene kaluse u relativno kratkom roku od postavljanja eksplantata

baza listova u kulturu tkiva. U većini slučajeva već u toku prve supkultivacije, dakle, nakon 4 do

5 tjedana. Stvoreni kalusi su bili vrlo mali, svijetlo žute boje s vidljivim klasterima globularnih

somatskih embrija. Kalusi su se najprije počeli formirati uz vaskularno tkivo eksplantata baze

listova. Ta je pojava tipična za kalogenezu jednosupnica kod kojih se bez obzira na tip

eksplantata, prve stanične diobe počinju blizu prokambijalnog/vaskularnog tkiva. Ta je pojava

vjerojatno povezana s prisutnošću visokih razina regulatora rasta i hranjiva u takvim tkivima

(Vasil 1987). Kada su klasteri somatskih embrija odvajani s takvih kalusa, oni su nastavili

producirati nove embrije. Embriogeni kalusi jednosupnica su karakteristično kompaktni, najčešće

88

organizirani, bijele do svijetlo žute boje. Somatski embriji kao i njihovi zigotski pandani nastaju

ili izravno iz pojedinačnih stanica ili nakon prethodnog formiranja mase proembriogenih stanica.

U embriogenim kalusima najčešće postoji određena kompeticija među stanicama. Također,

prirodna tendencija za kontinuiranom staničnom proliferacijom i slabo ili nikakvo opredjeljenje

za razvoj, onemogućava mnoge somatske embrije u daljnjem razvoju i zriobi. Naime,

meristematske embriogene stanice sadrže bogat izvor regulatora rasta koji nameće kontinuiranu i

aktivnu staničnu proliferaciju (Vasil 1987). Somatske embrije koji se formiraju izravno na već

nastalim somatskim embrijima ili na dijelovima mladih biljaka nastalih od proklijalih somatskih

embrija nazivamo adventivnim ili sekundarnim embrijima. Ova je pojava dokaz da je

embriogeneza karakteristika embriogeno determiniranih tkiva. Često sekundarni embriji nastaju

na istoj hranidbenoj podlozi na kojoj su nastali i primarni embriji, a ponekad kultivacija na neku

drugu hranidbenu podlogu poveća stopu embriogeneze (George 1993).

I u ovom istraživanju, bez obzira što je kod određenih donorskih biljaka početno nastao velik broj

embriogenih kalusa, somatski embriji na njima su često srastali, proliferirali, postajali abnormalni

i nikada nisu isklijali i razvili biljke. Na problem klijanja somatskih embrija ukazali su Kim i sur.

(2009). Prema njihovom izvješću klijanje somatskih embrija je značajno poboljšano

supkultiviranjem zrelih somatskih embrija na polovični MS medij, kao i njihovim razdvajanjem

iz klastera. Pokušali su razdvojene SE na klijanje potaknuti hladnim tretmanom (4 °C, 2 tjedna)

ili kultivirati na medij s 14,43 µM GA3, ali ti postupci nisu povećali stopu klijavosti somatskih

embrija. U ovom istraživanju je također primjećeno formiranje aberantnih somatskih embrija, a

klijanje somatskih embrija se nastojalo potaknuti upotrebom apscizinske kiseline i hladnim

tretmanom, ali bez uspjeha (rezultati nisu prikazani). Također, kod odvajanja somatskih embrija

od embriogenog kalusa, često je dolazilo do nekroze i kalusa i somatskih embrija. Sličnu pojavu

su primjetili i Gozu i sur. (1993). Prema njihovom iskustvu, nakon odstranjivanja bijelih

embriogenih tkiva sa žutog kalusa, niti jedan od tih djelova ne nastavlja rasti i obje vrste tkiva

postaju nekrotične. Ove bi se pojave dijelom mogle objasniti vrlo kratkim periodom u razvoju

embrija, cvjetnih organa i listova jednosupnica u kojem oni imaju sposobnost stvaranja

embriogenih kultura. U tom su stanju stanice eksplantata još uvijek meristematske i samo

djelomično diferencirane. Eksplantati uzeti prije ili poslije ovog perioda najčešće formiraju samo

ne-morfogene ili ne-embriogene kaluse (Vasil 1978).

89

6.1.2. Multiplikacija izdanaka

U ovom istraživanju, kultura vegetacijskih vršaka uspješno je uspostavljena samo kod jadranske

perunike. Izdanci druge dvije vrste su vegetirali u kulturi vegetacijskih vršaka i usprkos redovnim

supkultivacijama i pokušajima poticanja aksilarnog grananja s povećanim koncentracijama

citokinina (2 mg/L BAP) i rejuvenilizacije izolacijom meristema iz tih izdanaka, formiranje

postranih izdanaka je bilo samo sporadično. Za vrstu I. adriatica je Duncan-ovim testom

ustanovljeno da su i tretmani i genotipovi značajno utjecali na uspjeh multiplikacije. Od tretmana

je signifikantno bolji tretman s 1 mg/ L BAP, u odnosu na kontrolni tretman (bez regulatora

rasta) i tretman s BAP i GA3. Indeks mikropropagacije na tretmanu s 1 mg/L BAP iznosio je 3,28

do 9,02 ovisno o genotipu.

O multiplikaciji izdanaka (aksilarnom grananju) kao metodi mikropropagacije perunika nije puno

izvještavano. Ipak, Shibli (2000) spominje mikropropagaciju I. nigricans u cilju dobivanja

početnog broja biljaka koje koristi za daljnje pokuse krioprezervacije. Jevremović (2008)

izvještava o multiplikaciji izdanaka pet vrsta perunika. U skladu s našim rezultatima, za indeks

multiplikacije je kao najpovoljniji ocijenjen tretman s malom količinom auksina (NAA) i s

citokininom BAP. Općenito BAP se smatra najpogodnijim citokininom za regenereaciju perunika

(Le i sur. 1998; Zhong i sur. 1998; prema Boltenkov i sur. 2007; Shibli i Ajlouni 2000).

Giberelinska kiselina se u hranidbene podloge za multiplikaciju izdanaka dodaje najčešće iz

razloga da poveća izduživanje izdanaka koji su u takvim kulturama često mali i kratki (Saharan

2010, Brondani i sur. 2011). Međutim, u ovom istraživanju je visina izdanaka bila stabilna,

podjednaka na svim isprobanim tretmanima te zbog toga nije posebno bilježena, pa dodavanje

giberelinske kiseline u tom smislu nije bilo potrebno.

90

6.2. Detekcija somaklonske varijabilnosti

Uzroci somaklonske varijabilnosti nisu u potpunosti razjašnjeni, ali pretpostavljeni mehanizam

uključuje kromosomske i točkaste mutacije, somatske rekombinacije, izmjene dijelova

sestrinskih kromatida, aktivnost transpozonskih elemenata, nestabilnost sekvenci tandemnih

ponavljanja kao i epigenetske procese kao što je DNA metilacija (Philips i sur. 1994, prema de la

Puente i sur. 2008). Učestalost pojave somaklonske varijabilnosti teško je predvidjeti zato što

ovisi o brojnim faktorima kao što su vrsta, tip i starost eksplantata i genotip donorske biljke.

Osim toga, broj supkultura, duljina perioda supkultivacije, kemijske i fizikalne karakteristike

hranidbene podloge mogu također dovesti do somaklonske varijabilnosti (Mohan Jain 2001,

Etienne i Bertrand 2003, Bhatia i sur. 2005, Alan i sur. 2007). Također i upotreba nekih od

regulatora rasta za indukciju somatske embriogeneze kao što je 2,4-D može izravno ili neizravno

utjecati na somaklonsku varijabilnost (Gesteira i sur. 2002). Kako u ovom istraživanju, tako i

općenito za poticanje somatske embriogeneze perunika često se koristi 2,4-D. Bez obzira na tu

činjenicu, do sad nije rađena procjena stupnja somaklonske varijabilnosti regeneranata perunika

niti na razini genoma, niti na DNA razini.

S obzirom da somatski embriji nastaju iz meristematskih i nediferenciranih tkiva mladih listova i

cvjetova ili pak nezrelih embrija, može se očekivati očuvanje genetske stabilnosti embriogenih

kalusa. Naime, oni bi, bez obzira na privremeno odvajanje, trebali predstavljati nastavak

embrionalne faze razvoja (Vasil 1987). Moguće je da citološka organizacija embrionalnih stanica

i njihove brze stanične diobe koje su slične onima u stanicama meristema te bogat izvor biljnih

regulatora rasta koji sadrže, osiguravaju isti tip genetske stabilnosti koji postoji u meristematskim

stanicama. Prema tome, može se očekivati da embriogene stanice budu većim dijelom genetski

uniformne (Vasil, 1987). Bez obzira što je teško postići čistu embriogenu kulturu i najčešće se

embriogeni kalusi sastoje od mješanih stanica (i embriogenih i neembriogenih), somatski embriji

ipak najčešće nastaju samo iz normalnih ili gotovo normalnih stanica. Naime, poznato je da

somatski embriji koji potječu iz stanica s velikim kromosomskim aberacijama najčešće ne

regeneriraju jer se ne uspiju razviti dalje od ranog stadija razvoja, ne dostignu zrelost pa se time

niti ne razviju u biljke. Općenito, odbacivanje embrija s kromosomskim aberacijama je poznat

fenomen i u biljnom i životinjskom svijetu (Vasil 1987).

91

Među hipotezama ovog istraživanja stoga je stajalo da se očekuje da će in vitro regenerirane

biljke uglavnom biti vjerni klonovi matične biljke. U svrhu provjere klonske vjernosti

regeneranta korištene su: morfometrijske analize fenotipa, na razini genoma korištena je metoda

protočne citometrije, a za provjeru na razini DNA - AFLP sustav genetskih biljega.

6.2.1. Morfometrijske analize, protočna citometrija i genetski biljezi

Iako su najstariji tip identifikacije kultivara, morfometrijske analize se i dalje koriste za opis

svojstava i kultivara kako kod ratarskih tako i kod ukrasnih vrsta. Iako su jednostavni i

nezamjenjivi, morfološki deskriptori imaju i mnoge nedostatke kao što su utjecaj okoline na

ekspresiju svojstva, epistatske interakcije i pleiotropski efekti (Pragya i sur. 2010). Morfološke

izmjere u ovom istraživanju obuhvatile su 15 svojstava biljaka, od kojih su sva osim boje donjeg

i gornjeg lista perigona te boje brade bili analizirani kao kvalitativna svojstva te je provedena

analiza glavnih komponenata (PCA). Poznato je da je na temelju mjera listova perigona moguće

razlikovati vrste perunika (Fisher, 1936) što je i u ovom istraživanju potvrđeno. Na grafikonu 1.

je vidljivo da su prve dvije osi u analizi glavnih komponenata jasno razdvojile sve tri istraživane

vrste. Ovom metodom nisu utvrđene značajne razlike među regenerantima različitih donorskih

biljaka. Slične rezultate navode Shibli i Ajlouni (2000) i Jevremović i Radojević (2006) koji

također nisu opazili promjene na fenotipu regeneranata Iris nigricans odnosno I. pumila.

Da bi se što je više moguće umanjila pogreška pokusa, sve biljke su mjerene u trenutku pune

cvatnje. Morfološkim izmjerama 12 svojstava biljaka (navedena u poglavlju 4.4.), prve tri osi

analize glavnih komponenata (PCA) objasnile su od 82,20% do 86,24% ukupne varijabilnosti

regeneranata jadranske perunike, 58,98% do 66,90% ukupne varijabilnosti regeneranata za ilirsku

peruniku i 74,27% za regenerante Rotschildove perunike . Na Grafikonu 1. koji prikazuje

morfološku varijabilnost regeneranata svih osam genotipova obuhvaćenih ovom analizom,

vidljivo je da poneki regenerant odstupa od ostalih regeneranata iste grupe. Međutim, kao što je

dokazano Mantelovim testom, varijabilnost na fenotipskoj razini nije korelirana s varijabilnošću

na genetskoj razini. Taj se podatak može objasniti utjecajem okolinskih i/ili eventualnih

epigenetskih faktora na fenotip biljke što pruža još jedan dokaz o pouzdanosti istraživanog

protokola mikropropagacije.

92

Somaklonska varijabilnost može uzrokovati promjene u broju kromosoma (Bhatia i sur. 2005).

Te promjene moguće je detektirati brojanjem kromosoma ili protočnom citometrijom. Na

primjeru perunika, Kozyrenko i sur. (2002) su utvrđivali varijabilnost kalusnog tkiva brojanjem

kromosoma te pomoću RAPD genetskih biljega. Utvrdili su da je kod dvije od šest proučavanih

vrsta perunika postojala signifikantna razlika između majčinske biljke i kalusa dok je broj

kromosoma kalusnog tkiva svih vrsta uglavnom ostao isti kao kod majčinske biljke.

Razina unutarklonske varijabilnosti otkrivena metodom protočne citometrije u ovom istraživanju

iznosi 0% za jadransku i ilirsku peruniku, odnosno 1,35% za Rotschildovu peruniku.

Jednaka ploidnost majčinske biljke i regeneranata, usprkos dokazanoj somaklonskoj

varijabilnosti staničnih linija na razini DNA, može se objasniti vjerojatnom smanjenom

sposobnošću regeneracije staničnih linija s promijenjenim brojem kromosoma (Jin i sur. 2008). U

istraživanju na pamuku (Jin i sur. 2008), RAPD i SSR genetski biljezi su otkrili visok stupanj

polimorfizma između regeneranata i majčinske biljke, ali niti jedan od upotrebljenih biljega nije

ukazao na biljke s promjenjenim brojem kromosoma, tako da eventualna odsutnost polimorfizma

gledana samo RAPD i SSR biljezima ne može jamčiti stvarnu genetsku stabilnost. I Fourré i sur.

(1997) su također došli do zaključka da RAPD i drugi genetski biljezi mogu propustiti detektirati

važnu pojavu varijabilnosti kao što su genomske mutacije ili drastične morfološke mutacije kao

što je patuljavost. Iz tog razloga je preporučljivo analize na razini DNA nadopuniti s

citogenetičkim analizama (Raimondi i sur. 2001).

Molekularna analiza je pokazala vrlo veliku homogenost regeneranata. Unutar pojedine skupine

regeneranta stupanj sličnosti mjeren Dice-ovim koeficijentom iznosio je minimalno 96% – 97%

kod jadranske perunike, 91,5% – 95,5% kod ilirske perunike i 86,5% – 94% kod regeneranata

Rotschildove perunike. Kod dva genotipa Rotschildove perunike (IR 3 i IR 4) AFLP-om je

detektirana nešto veća stopa genetske varijabilnosti, ali zbog malog broja regeneranata nisu mogli

biti uključeni u analizu glavnih sastavnica pa je ostala nepoznata eventualna povezanost

varijabilnosti na razini DNA i na razini fenotipa. Moguće je pretpostaviti da je upravo sklonost

mutacijama razlog slabije regenerativne sposobnosti ovih genotipova.

S obzirom da se mutacije smatraju rijetkim događajima, pojava da se pojedini regeneranti

znatnije razlikuju dok većina zadržava gotovo jednak molekularni profil kao početna biljka je

93

česta i očekivana. Takva nejednaka raspodjela somaklonske varijabilnosti detektirana AFLP

biljezima već je ranije opisana za vrstu Arabidopsis thaliana (Polanco i Ruiz 2002). Li i sur.

(2007) su primjetili da je većina regeneranata ječma (68,18%) imala samo 2 - 3 polimorfna

fragmenta dok je najveći broj polimorfnih fragmenata bio akumuliran kod manjeg broja

regeneranata. Također, kod raži je broj mutacija po biljci bio jako promjenjiv (de la Puente i sur.

2008). Iznosio je od 2 do 90 polimorfnih fragmenata/biljega s tim da je većina polimorfnih

biljega nađena kod nekoliko biljaka. Pregled većeg broja istraživanja dan je u Tablici 1.

Genetski bijezi omogućuju brzo i efikasno otkrivanje mutacija nastalih u kulturi tkiva . Oni nisu

pod utjecajem okolinskih faktora, pouzdani su i generiraju ponovljive rezultate (Bhatia i sur.

2005). Među ostalim tehnikama genetskih biljega, AFLP je više puta proglašen prikladnim za

procjenu klonske vjernosti biljaka regeneriranih u kulturi tkiva i smatra se pouzdanijim sustavom

od RAPD-biljega (Pejić i sur. 1998). AFLP-biljezi su upotrebljeni za promatranje genetske

varijabilnosti kod različitih biljnih vrsta zbog njihove velike ponovljivosti i zbog povoljnog

omjera broja lokusa u odnosu na broj korištenih parova početnica (Saker i sur. 2006, Zhang i sur.

2006, prema Mo i sur. 2009). Prosječno produciraju 50-100 lokusa po paru početnica za koje se

smatra da su većinom slučajno raspoređeni kroz čitav genom i stoga je AFLP među najboljim

tehnikama za procjenu promjena induciranih u kulturi tkiva (Sharma i sur. 2007). Uz to, prednost

ove tehnike je i što ne zahtjeva prethodno poznavanje sekvence genoma, a u usporedbi s drugim

sustavima genetskih biljega pokriva puno širi spektar genoma (Bhatia i sur. 2005). Također, ni

RAPD sustav biljega ne zahtjeva prethodno poznavanje sekvence, ali se smatra tehnikom koja

ima manju rezoluciju od AFLP-a te je u većem broju istraživanja ocijenjen nedostatnim za

razlikovanje unutarklonske varijabilnosti (Tablica 1.). Naime, procjenom somaklonske

varijabilnosti raži RAPD-tehnikom pola regeneriranih biljaka je pokazalo polimorfizam

(Linacero i Vazquez 1992, Linacero i Vazquez 1993, prema de la Puente i sur. 2008) dok je

pomoću AFLP-biljega ustanovljen polimorfizam kod 95% regeneriranih biljaka iste stanične

linije. Razumljivo, diskriminatorska sposobnost AFLP-a ovisi o upotrebljenim kombinacijama

početnica (Kjos i sur. 2010). Jednako tako i u ovom je istraživanju postotak polimorfnih biljega

varirao od 16,67% do 62,04% ovisno o vrsti. Kod ilirske i Rotschildove perunike je najveći

polimorfizam ostvaren s kombinacijom početnica E+ATA/M+CTG (40% i 62,04%), dok su kod

jadranske perunike kombinacije početnica E+ATA/M+CAG (52,27%) i E+ATA/M+CTG

94

(44,29% ) ostvarile najveći polimorfizam biljega. Iako do sada AFLP-tehnika nije korištena za

procjenu somaklonske varijabilnosti perunika, korištena je u istraživanju Lamote i sur. (2002) za

procjenu genetske varijabilnosti prirodnih populacija perunika. Oni su upotrijebili četiri

kombinacije početnica od kojih su tri (E+ACG/M+CAA, E+ACG/M+CTG, E+ACG/M+CTT),

između ostalih, korištene i u ovom istraživanju. Korištenjem tih početnica generirano je 21,46%

do 58% polimorfnih biljega, ovisno o vrsti i kombinaciji početnica. Ostale su početnice odabrane

na temelju polimorfizma koji su producirale u prethodnoj preliminarnoj provjeri (primer

screening) većeg većeg broja početnica na manjem broju uzoraka. Među proučavane tri vrste,

najveći stupanj polimorfizma imala je Rotschildova perunika. Prosjek za svih deset kombinacija

početnica za ovu vrstu iznosio je 51,86% polimorfnih biljega. Jadranska i ilirska perunika imale

su prosječno 28,39% odnosno 33,2% polimorfnih biljega. Veliki stupanj polimorfizma uočen

unutar vrste se većim dijelom odnosi na razlike između matičnih biljaka, a ne između

regeneranata. Ovaj rezultat potvrđuje veliku diskriminatorsku moć AFLP-metode već spomenutu

od drugih autora (Kjos i sur. 2010, Chuang i sur. 2009, de la Puente i sur. 2008, Kumar Sharma i

sur. 2007, Prado i sur. 2007).

Za svaku od analiza u ovom istraživanju, nije uzet uvijek isti set biljaka jer su morfološke analize

rađene samo na procvalim regenerantima dok su moleklarne analize rađene na setu biljaka koji je

preživio tri godine nakon aklimatizacije. Iz tog razloga primjerice regenerant Rotschildove

perunike s varijabilnošću u broju kromosoma nije obuhvaćen DNA analizom. Međutim, kao što

je ranije navedeno, Mantelovim testom je dokazano da razlike na fenotipskom nivou nisu u

korelaciji s genetskom udaljenošću. Razlog leži u činjenici da je neovisno o korištenom sustavu

genetskih biljega, moguće istražiti samo mali djelić genoma (manje od 1%), a istovremeno

fenotip biljke uvelike ovisi o okolinskim čimbenicima.

Bez obzira što neki autori smatraju 2,4-D regulatorom rasta koji može utjecati na pojavu

somaklonske varijabilnosti regeneranata, to u ovom istraživanju nije potvrđeno. Ovaj rezultat se

može objasniti i time da ukoliko 2,4-D uzrokuje promjene ploidnosti, očigledno su doze

upotrebljene u ovom istraživanju bile ispod razine štetnosti. Primjerice, u komercijalnoj

proizvodnji sadnica kave (Coffea arabica) somatskom embriogenezom, stopa somaklonske

95

varijabilnosti uočena na sadnicama u poljskim uvjetima iznosi 0,74%. To se smatra niskom

stopom varijabilnosti i osigurava profitabilnu proizvodnju (Baobadilla Landey i sur. 2013). U

bilo kojem mikropropagacijskom programu 3-5% fenotipske varijabilnosti može se smatrati

prihvatljivim uz izuzetak banane kod koje je prag tolerancije višlji i iznosi 10% (Skirvin i sur.

1994, Côte i sur. 2000, Sahijram i sur. 2003). Dakle, regeneracijski protokol istražen u okviru

ovog rada može se preporučiti za mikropropagaciju jer osigurava genetsku vjernost razvijenih

biljaka.

96

7. ZAKLJUČCI

Temeljem rezultata prikazanih u ovom radu moguće je zaključiti:

1. Vrste jadranska, ilirska i Rotschildova perunika razlikuju se međusobno u sposobnosti

induciranja kalusa i proembriogenih struktura.

2. Sposobnost formiranja kalusa za vrste jadranska i ilirska perunika ovisila je o donorskoj

biljci/genotipu, a kod vrste Rotschildova perunika o tretmanu, odnosno kombinaciji

upotrebljenih auksina.

3. Za indukciju kalogeneze povoljnim su se pokazali eksplantati baza listova, dok

eksplantati korijena nisu uopće kalusirali.

4. Zadovoljavajuća multiplikacija izdanaka postignuta je samo kod jadranske perunike, a

ovisila je i o donorskoj biljci i o tretmanu. Indeks multiplikacije, ovisno o donorskoj

biljci, varirao je od 3,28 do 9,02. Najpogodniji je bio tretman s 1 mg/L BAP.

5. Analizom glavih komponenata (PCA) temeljenoj na morfometrijskim izmjerama,

razlikovane su promatrane vrste, ali ne i genotipovi unutar pojedine vrste dok su

regeneranti pojedine donorske biljke većinom zadržali sličnost s matičnom skupinom.

Varijable koje su utjecale na razlikovanje vrsta, odnosno one s najvećim vrijednostima u

prvoj glavnoj komponenti svojstvenih (eigen) vektora bile su širina (0,38) i dužina donjeg

lista perigona (0,37), visina biljke (0,37) i širina gornjeg lista perigona (0,37).

6. Klonska vjernost regeneranata na citogenetičkoj razini utvrđena je analizom sadržaja

jezgrine DNA protočnim citometrom. Promjena ploidnosti zabilježena je samo kod

jednog od 74 analizirana regeneranta Rotschildove perunike što čini 1,35%. Kod druge

dvije vrste nije bilo odstupanja u razini ploidnosti.

97

7. Provjera klonske vjernosti AFLP sustavom genskih biljega pokazala je da je kod sve tri

vrste perunika većina regeneranata zadržala sličnost s matičnom skupinom. Kod jadranske

perunike je Dice-ov koeficijent sličnosti varirao od 95-97 %, kod ilirske perunike 91-96%

dok je kod Rotschildove perunike iznosio 87-94%.

8. Mantelovim testom nije utvrđena korelacija između matrica morfološke i genetske

udaljenosti među regenerantima promatranih vrsta. Razlog tome je u maloj genetskoj

varijabilnosti u usporedbi s bitno većom morfološkom varijabilnošću.

9. Biljke regenerirale u procesu somatske embriogeneze najvećim su dijelom ostale vrlo

vjerni klonovi matičnih biljaka. Regeneracijski protokol istražen u okviru ovog rada može

se preporučiti za mikropropagaciju jer osigurava genetsku vjernost razvijenih biljaka.

98

8. POPIS LITERATURE

1. Abe T., Futsuhara Y. (1984). Varietal difference of plant regeneration from root callus tissues

in rice. Japan J Breed 34: 147-155.

2. Alan A., Zeng H., Assani A., Shi W., McRae H., Murch S., Saxena P. (2007). Assessment of

genetic stability of the germplasm lines of medicinal plant Scutellaria baicalensis Georgi

(Huang-qin) in long-term, in vitro maintained cultures. Plant Cell Rep 26: 1345-1355.

3. Al-Gabbiesh A., Hassavi D. S., Afifi F. U. (2006). In vitro propagation of endangered Iris

species. J Biol Sciences 6: 1035-1040.

4. Ammirato P. V. (1974). The effects of abscisic acid on the development of somatic embryos

from cells of caraway (Carum carvi L.). Bot Gaz 135: 328-337.

5. Arafeh R., Sapir Y., Shmida A., Iraki N., Fragman O., Comes, H. P. (2002). Patterns of

genetic and phenotypic variation in Iris haynei and I. atrofusca (Iris sect. Oncocyclus = the

royal irises) along an environmental gradient in Israel and the West Bank. – Mol Ecol 11: 39-

52.

6. Ascough GD, Erwin JE, Van Staden J (2009). Micropropagation of iridaceae-a review. Plant

Cell Tiss Org 97: 1-19.

7. Bairu M., Aremu A. O., Staden J. (2011). Somaclonal variation in plants: causes and

detection methods. Plant Growth Regul 63: 147-173.

8. Bobadilla Landey R., Cenci A., Georget F., Bertrand B., Camayo G., Dechamp E., Herrera J.

C., Santoni S., Lashermes P., Simpson J., Etienne H. (2013). High Genetic and Epigenetic

Stability in Coffea arabica Plants Derived from Embryogenic Suspensions and Secondary

Embryogenesis as Revealed by AFLP, MSAP and the Phenotypic Variation Rate. PLoS ONE

8: e56372.

9. Bohanec B. (2003). Ploidy determination using flow cytometry. In: Maluszynski M, Kasha

KJ, Forster BP and Szarejko I [eds.], Doubled Haploid Production in Crop Plants, 397–403.

Kluwer Academic Publishers, Dordrecht

10. Baránek M., Raddová J., Krizan B., Pidra M. (2009). Genetic changes in grapevine genomes

after stress induced by in vitro cultivation, thermotherapy and virus infection, as revealed by

AFLP. Genet Mol Biol 32: 834–839.

http://link.springer.com/journal/11240


99

11. Baruch E., Quak F. (1966). Virus free plants of Iris ˝Wedgewood˝obtained by meristem

culture. Neth J Plant Pathol 71: 270-273.

12. Belaj A., Šatović Z., Cipriani G., Baldoni L., Testolin R., Rallo L., Trujillo I. (2003).

Comparative study of the discriminating capacity of RAPD, AFLP and SSR markers and of

their effectiveness in establishing genetic relationship in olive. Theor Appl Genet 107: 736-

744.

13. Bhatia P., Ashwath N., Senaratna T., Krauss, S. L. (2005). Genetic analysis of cotyledon

derived regenerants of tomato using AFLP markers. Curr Sci 88: 280-284.

14. Blears M. J., De Grandis S. A., Lee H., Trevors J. T. (1998). Amplified fragment length

polymorphism (AFLP): a review of the procedure and its applications. J Ind Microbiol Biot

21: 99-114.

15. Boltenkov E. V., Zarembo E. V. (2005). In vitro regeneration and callogenesis in tissue

culture of floral organs of the genus Iris (Iridaceae). Biol bull 32: 138-142.

16. Boltenkov E. V., Mironova L. N., Zarembo E. V. (2007). Effect of phytohormones on plant

regeneration in callus culture of Iris ensata Thunb. Biol bull 34: 446-450.

17. Boltenkov E. V., Rybin V. G., Zarembo E. V. (2004). Specific features of cultivation of Iris

ensata Thunb. callus tissue. App bioch microbiol 40: 206-212.

18. Borchert T., Fuchs J., Winkelmann T., Hohe A. (2007). Variable DNA content of Cyclamen

persicum regenerated via somatic embryogenesis: rethinking the concept of long-term callus

and suspension cultures. Plant Cell Tiss Org 90: 255–263.

19. Bouman H., DeKlerk G. J. (2001). Measurment of the extent of somaclonal variation in

begonia plants regenerated under various conditions. Comparison of three assays. Theor Appl

Genet 102: 111-117.

20. Carvalho L., Goulão L., Oliveira C., Gonçalves J., Amâncio S. (2004). RAPD Assessment for

Identification of Clonal Identity and Genetic Stability of in vitro Propagated Chestnut

Hybrids. Plant Cell Tiss Org 77: 23-27.

21. Chuang S. J., Chen C. L., Chen J. J., Chou W. Y., Sung J. M. (2009). Detection of

somaclonal variation in micro-propagated Echinacea purpurea using AFLP marker. Sci

Hortic 120: 121-126.

22. Clarindo W., de Carvalho C., Araújo F., de Abreu I., Otoni W. (2008). Recovering polyploid

papaya in vitro regenerants as screened by flow cytometry. Plant Cell Tiss Org 92: 207-214.

100

23. Côte F.X., Folliot M., Domergue R., Dubois C. (2000). Field performance of embryogenic

cell suspension-derived banana plants (Musa AAA, cv. Grande naine). Euphytica 112: 245-

251.

24. de la Puente R., González A., Ruiz M., Polanco C. (2008). Somaclonal variation in rye (

Secale cereale L.) analyzed using polymorphic and sequenced AFLP markers. In Vitro Cell

Dev- Pl 44: 419-426.

25. Degen A. (1936). Flora Velebitica 1, Budapest, 644-647.

26. Doležel J., Binarová P., Lucretti S. (1989). Analysis of nuclear DNA content in plant cells by

flow cytometry. Biol Plantarum 31: 113–120.

27. Doležel J., Greilhuber J., Suda J. (2007). Estimation of nuclear DNA content in plants using

flow cytometry. Nat Protocols 2: 2233-2244.

28. Doležel J., Kubaláková M., Bartoš J., Macas J. (2004). Flow cytogenetics and plant genome

mapping. Chrom Res 12: 77-91.

29. Ducos J. P., Alenton R., Reano J. F., Kanchanomai C., Deshayes A., P´etiard V. (2003).

Agronomic performance of Coffea canephora P. trees derived from large-scale somatic

embryo production in liquid medium. Euphytica 131: 215-223.

30. Feuser S., Meller K., Daquinta M., Onodari R. (2003). Genotypic fidelity of micropropagated

pineapple (Ananas comosus) plantlets assessed by isozyme and RAPDs. Plant Cell Tiss Org

72: 221–227.

31. Fisher R. A. (1936). The Use of Multiple Measurements in Axonomic Problems, Ann

Eugenics 7: 179-188.

32. Fourré J.-L., Berger P., Niquet L., André P. (1997). Somatic embryogenesis and somaclonal

variation in Norway spruce: morphogenetic, cytogenetic and molecular approaches. Theor

Appl Genet 94: 159-169.

33. Garcia L. R., Pérez P. J., Bermudez I. C., Orellana P. P., Veitia N. R., Padron Y. M., Remero

C. Q. (2002). Comparative study of variability produced by induced mutation and tissue

culture in banana (Musa sp.) cv. ‘Grande Naine’. Infomusa 11: 4–6.

34. George E. F. (1993). Plant Propagation by Tissue Culture, 2nd Ed., Exegetics Ltd.

35. Gesteira A. S., Otoni W. C., Barros E. G., Moreira M. A. (2002). RAPD-based detection of

genomic instability in soybean plants derived from somatic embryogenesis. Plant Breeding

121: 269-271.

36. Gozu Y., Yokoyama M., Nakamura M., Namba R.,Yomogida K., Yanagi N., Nakamura S.

(1993). In vitro propagation of Iris pallida. Plant Cell Rep 13: 12-16.

http://academic.research.microsoft.com/Author/25016464/jon-a-l-fourre

http://academic.research.microsoft.com/Author/53759089/philip-h-berger

http://academic.research.microsoft.com/Author/25885174/l-niquet

http://academic.research.microsoft.com/Author/52628098/p-m-andre

http://libra.msra.cn/Journal/9373/theor-appl-genet-theoretical-and-applied-genetics

http://libra.msra.cn/Journal/9373/theor-appl-genet-theoretical-and-applied-genetics

101

37. Hale A. L., Miller J. C. (2005). Suitability of AFLP and microsatellite marker analysis for

discriminating intraclonal variants of the potato cultivar Russet Norkotah. J Am Soc Hortic

Sci 130: 624–630.

38. Howell S. H., Lall S., Che P. (2003). Cytokinins and shoot development. Trends Plant Sci 8:

453-459.

39. Hussey G. (1975). Totipotency in tissue explants and callus of some members of the

Liliaceae, Iridaceae, Amaryllidaceae. J Exp Bot 26: 253-262.

40. Iraqi D. and Tremblay F. M. (2001). The role of sucrose during maturation of black spruce

(Picea mariana) and white spruce (Picea glauca) somatic embryos. Physiol Plant 111: 381-

388.

41. Israeli Y., Reuveni O., Lahav E. (1991). Qualitative aspects of somaclonal variations in

banana propagated by in vitro techniques. Sci Hortic 48: 71-88.

42. Jéhan H., Courtois D., Ehret C., Lerch K., Pétiard V. (1994). Plant regeneration of Iris

pallida Lam. and Iris germanica L. via somatc embryogenesis from leaves, apices and young

flowers. Plant Cell Rep 13: 671-675.

43. Jevremović S. (2008). Kultura tkiva perunika – Iris sp. (ur. Andrejević K.), Zadružbina

Andrejević, Beograd.

44. Jevremović S., Radojević LJ. (2002). Plant regeneration from suspension cultures of Iris

pumila L. Acta Hort 572: 59-65.

45. Jevremović S., Radojević LJ. (2006). Establishment of efficient regeneration protocol from

leaf explants of Iris pumila shoots cultured in vitro. Sci Hortic 108: 100-103.

46. Jevremović S., Subotić A., Radojević Lj. (2006). In Vitro Morphogenesis of Dwarf Irises. In:

Floriculture, Ornamental and Plant Biotechnology: Advances and Topical Issues (1st

Edition). Jaime A. Teixeira da Silva (ed), Global Science Books, London, UK, Vol. II, pp.

551-557.

47. Jin S., Mushke R., Zhu H., Tu L., Lin Z., Zhang Y., Zhang X. (2008). Detection of

somaclonal variation of cotton ( Gossypium hirsutum ) using cytogenetics, flow cytometry

and molecular markers. Plant Cell Rep 27: 1303-1316.

48. Jones C. J., Edwards K. J., Castaglione S., Winfield M. O., Sala F., van de Wiel C.,

Bredemeijer G., Vosman B., Matthes M., Daly A., Brettschneider R., Bettini P., Buiatti M.,

Maestri E., Malcevschi A., Marmiroli N., Aert R., Volckaert G., Rueda J., Linacero R.,

Vazquez A., Karp A. (1997). Reproducibility testing of RAPD, AFLP and SSR markers in

plants by a network of European laboratories. Mol breeding 3: 381-390.

http://waesearch.kobv.de/authorSearch.do;jsessionid=B11B9DF1427CB56634463ED986A186AA?query=Jones%2c+C.J.&pageid=1343824867599-9376134457878016

http://waesearch.kobv.de/authorSearch.do;jsessionid=B11B9DF1427CB56634463ED986A186AA?query=Edwards%2c+K.J.&pageid=1343824867600-11482170237092049

http://waesearch.kobv.de/authorSearch.do;jsessionid=B11B9DF1427CB56634463ED986A186AA?query=Castaglione%2c+S.&pageid=1343824867600-5559612987254957

http://waesearch.kobv.de/authorSearch.do;jsessionid=B11B9DF1427CB56634463ED986A186AA?query=Winfield%2c+M.O.&pageid=1343824867600-272971444923642

http://waesearch.kobv.de/authorSearch.do;jsessionid=B11B9DF1427CB56634463ED986A186AA?query=Sala%2c+F.&pageid=1343824867600-9409936203036983

http://waesearch.kobv.de/authorSearch.do;jsessionid=B11B9DF1427CB56634463ED986A186AA?query=van+de+Wiel%2c+C.&pageid=1343824867600-04584084863773674

http://waesearch.kobv.de/authorSearch.do;jsessionid=B11B9DF1427CB56634463ED986A186AA?query=Bredemeijer%2c+G.&pageid=1343824867600-34089613027825816

http://waesearch.kobv.de/authorSearch.do;jsessionid=B11B9DF1427CB56634463ED986A186AA?query=Vosman%2c+B.&pageid=1343824867600-69151689126734

http://waesearch.kobv.de/authorSearch.do;jsessionid=B11B9DF1427CB56634463ED986A186AA?query=Matthes%2c+M.&pageid=1343824867600-09766370273254188

http://waesearch.kobv.de/authorSearch.do;jsessionid=B11B9DF1427CB56634463ED986A186AA?query=Daly%2c+A.&pageid=1343824867600-21657461151665403

http://waesearch.kobv.de/authorSearch.do;jsessionid=B11B9DF1427CB56634463ED986A186AA?query=Brettschneider%2c+R.&pageid=1343824867600-19221978864382516

http://waesearch.kobv.de/authorSearch.do;jsessionid=B11B9DF1427CB56634463ED986A186AA?query=Bettini%2c+P.&pageid=1343824867600-7351829014325666

http://waesearch.kobv.de/authorSearch.do;jsessionid=B11B9DF1427CB56634463ED986A186AA?query=Buiatti%2c+M.&pageid=1343824867600-8611723010839595

http://waesearch.kobv.de/authorSearch.do;jsessionid=B11B9DF1427CB56634463ED986A186AA?query=Maestri%2c+E.&pageid=1343824867600-08215532252034796

http://waesearch.kobv.de/authorSearch.do;jsessionid=B11B9DF1427CB56634463ED986A186AA?query=Malcevschi%2c+A.&pageid=1343824867600-07044771363232694

http://waesearch.kobv.de/authorSearch.do;jsessionid=B11B9DF1427CB56634463ED986A186AA?query=Marmiroli%2c+N.&pageid=1343824867600-8507261997931581

http://waesearch.kobv.de/authorSearch.do;jsessionid=B11B9DF1427CB56634463ED986A186AA?query=Aert%2c+R.&pageid=1343824867600-4756238178646157

http://waesearch.kobv.de/authorSearch.do;jsessionid=B11B9DF1427CB56634463ED986A186AA?query=Volckaert%2c+G.&pageid=1343824867600-8256408083335591

http://waesearch.kobv.de/authorSearch.do;jsessionid=B11B9DF1427CB56634463ED986A186AA?query=Rueda%2c+J.&pageid=1343824867600-9884393075499437

http://waesearch.kobv.de/authorSearch.do;jsessionid=B11B9DF1427CB56634463ED986A186AA?query=Linacero%2c+R.&pageid=1343824867600-7216669518031845

http://waesearch.kobv.de/authorSearch.do;jsessionid=B11B9DF1427CB56634463ED986A186AA?query=Vazquez%2c+A.&pageid=1343824867600-8843619498746076

102

49. Kamo K., Chen J., Lawson R. (1990). The establishment of cell suspension cultures of

gladiolus that regenerate plants. In Vitro Cell Dev Biol-Plant 26: 425-430.

50. Karp A. (1989). Can genetic instability be controlled in plant tissue cultures? Int Assoc Plant

Tiss Cult Newsl 58: 2–11.

51. Karp A., Steele S. H., Parmar S., Jones M. G. K., Shewry P. R., Breiman A. (1987). Relative

stability among barley plants regenerated from cultured immature embryos. Genome 29:

405–412.

52. Kawata K. (1995). Micropropagation of passion fruit from subcultured multiple shoot

primordia. J Plant Physiol 147: 281–284.

53. Kereša S., Mihovilović A., Ćurković-Perica M., Mitić B., Barić M., Vršek I., Marchetti S.

(2009). In vitro regeneration of Croatian endemic species Iris adriatica Trinajstić ex Mitić.

Acta biol cracov bot 51: 7-12.

54. Kim T. D., Ahn C. H., Bae K. H., Choi Y. E. (2009). The embryogenic competency and

morphological changes during somatic embryogenesis in Iris pseudacorus. Plant Biotechnol

Rep 3: 251–257.

55. King D., Liang C., Ma A., Chen M. (2002). Fertile revertants from somaclones of male sterile

plants derived from somatic cell culture of indica rice. Rice Genet Newsl 5: 53–57.

56. Kjos M., Fjellheim S., Rognli O. A., Hvoslef-Eide A. K. (2009). Amplified fragment length

polymorphism (AFLP) markers for fingerprinting of Argyranthemum frutescens cultivars. Sci

Hortic 124: 506-510.

57. Kozyrenko M. M., Artiukova E. V., Lauve L. S., Boltenkov E. V. (2002). The analysis of

genetic variability of callus cultures of several species of Iris L. Genus. Biotekhnologiya 18:

38-48.

58. Krishnaraj S., Vasil I. K. (1995). Somatic embrogenesis in herbaceous monocots. In: Thorpe

TA (ed) In Vitro Embryogenesis in Plants, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht pp 417-

470.

59. Lamote V., Roldán-Riuz I., Coart E., De Loose M., Van Bockstaele (2002). A study of

genetic variation in Iris pseudacorus populations using amplified fragment lenght

polymorphisms (AFLPs). Aquat Bot 73: 19-31.

60. Larkin P., Scowcroft W. (1981). Somaclonal variation - a novel source of variability from

cell cultures for plant improvement. Theor Appl Genet 60: 197 – 214.

61. Laublin G. and Cappadocia M. (1992). In vitro ovary culture of some apogon garden irises

(Iris pseudacorus L., I. setosa Pall., I. versicolor L.) Bot Acta 105: 319-322.

103

62. Laublin G., Saini H., Cappadocia M. (1991). In vitro plant regeneration via somatic

embryogenesis from root culture of some rhizomatous irises. Plant Cell Tiss Org 27: 15-21.

63. Le B. V., Jeanneau M., My N. T. D. et al. (1998). Rapid regeneration of whole plants in large

crabgrass (Digitaria sanguinalis L.) using thin cell laer culture. Plant Cell Rep 18: 166-172.

64. Li X., Yu X., Wang N., Feng Q., Dong Z., Liu L., Shen J., Liu B. (2007). Genetic and

epigenetic instabilities induced by tissue culture in wild barley (Hordeum brevisubulatum

(Trin.) Link). Plant Cell Tiss Org 90: 153-168.

65. Linacero R., Vázquez A. M. (1992). Somatic embryogenesis in polyembrionic Secale cereale

L. Plant Cell Rep 12: 26–28.

66. Linacero R., Vázquez A. M. (1993). Somaclonal variation in rye. Mutat Res 302: 201–205.

67. LoSchiavo F., Pitto L., Giuliano G., Torti G., Nuti-Ronchi V. et al. (1989). DNA methylation

of embryogenic carrot cell cultures and its variation as caused by mutation, differentiation,

hormones and hypomethylating drugs. Theor Appl Genet 77: 325-331.

68. Loureiro J., Capelo A., Brito G., Rodriguez E., Silva S., Pinto G., Santos C. (2007).

Micropropagation of Juniperus phoenicea from adult plant explants and analysis of ploidy

stability using flow cytometry. Biol Plantarum 51: 7-14.

69. Martin K. P., Pachathundikandi S. H., Zhang C. – L., Slater A., Madassery J. (2006). RAPD

analysis of a variant of banana (Musa sp.) cv. Grande Naine and its propagation via shoot tip

culture. In Vitro Cell Dev Biol—Plant 42: 188–192.

70. McClintock B. (1984). The significance of responses of the genome to challenge. Science

226: 792–801.

71. Miñano H. S., González-Benito M. E., Martίn C. (2009). Molecular characterization and

analysis of somaclonal variation in chrysanthemum cultivars using RAPD markers. Sci

Hortic 122: 238–243.

72. Mitić B. (2000). Iridaceae. U: Nikolić T. (ur.): Index Florae Croaticae. Pars 3. Nat. Croat. 9,

Suppl.1, pp 159-162

73. Mitić B. (2002). Iris adriatica (iridaceae), a new species from Dalmatia (Croatia). Phyton

(Horn, Austria) 42: 305-314.

74. Mitić B. (2004). Iridaceae. U: Bogdanović S, Nikolić T. (ur.): Notulae et Indicem Florae

Croaticae, 4. Nat Croat 13: 415-418.

75. Mitić B., Cigić P. (2009). Hrvatski vrt perunika i poučna botanička staza u Donjoj Stubici.

Izdavač: Hrvatsko botaničko društvo, Zagreb



104

76. Mo X. Y., Long T., Liu Z., Lin H., Liu X. Z., Yang Y. M., Zhang H. Y. (2009). AFLP

analysis of somaclonal variations in Eucaliptus globulus. Biologia plantarum 53: 741-744.

77. Mohan Jain S. (2001). Tissue culture-derived variation in crop improvement. Euphytica 118:

153-166.

78. Munthali M., Newbury H., Ford-Lloyd B. (1996). The detection of somaclonal variants of

beet using RAPD. Plant Cell Rep 15: 474 – 478.

79. Murashige T., Skoog F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with

tobacco tissue cultures. Physiol Plantarum 15: 473-497.

80. Niederwieser J. G., Kleynhans R., Hancke F. L. (2002). Development of a new flower bulb

crop in South Africa. Acta Hortic 570: 67-71.

81. Nikolić T. (ed.) (2008).: Flora Croatica Database. On- line (http:/hirc.botanic.hr/fcd).

Botanički zavod, Prirodoslovno-matematički fakultet, Sveučilište u Zagrebu.

82. O'Hara J. F., Street H. E. (1978). Ann Bot 42: 1029-1038.

83. Orton T. J. (1979). Environ Exp Bot 19: 319-323.

84. Patzak J. (2003). Assessment of somaclonal variability in hop (Humulus lupulus L.) in vitro

meristem cultures and clones by molecular methods. Euphytica 131: 343–350.

85. Pérez G., Yanes E., Isidrón M., Lorenzo J. C. (2009). Phenotypic and AFLP characterisation

of two pineapple somaclones derived from in vitro culture. Plant Cell Tiss Org 96: 113-116.

86. Phillips R. L., Kaeppler S. M., Olhoft P. (1994). Genetic instability of plant tissue cultures:

breakdown of normal controls. Proc Natl Acad Sci USA 91: 5222–5226.

87. Pietsch G. M., Anderson N. O. (2007). Epigenetic variation in tissue cultured Gaura

lindheimeri. Plant Cell Tiss Org 89: 91–103.

88. Polanco C., Ruiz M. L. (2002). AFLP analysis of somaclonal variation in Arabidopsis

thaliana regenerated plants. Plant Sci 162: 817-824.

89. Prado M., Gonzalez M., Romo S., Herrera M. (2007). Adventitious plant regeneration on leaf

explants from adult male kiwifruit and AFLP analysis of genetic variation. Plant Cell Tiss

Org 88: 1-10.

90. Prado M., Rodriguez E., Rey L., Gonz, lez M., Santos C., Rey M. (2010). Detection of

somaclonal variants in somatic embryogenesis-regenerated plants of Vitis vinifera by flow

cytometry and microsatellite markers. Plant Cell Tiss Org 103: 49-59.

91. Pragya, Bhat K. V., Misra R. L., Ranjan J. K. (2010). Analysis of diversity and relationships

among Gladiolus cultivars using morphological and RAPD markers. Indian J Agr Sci 80:

766-772.





105

92. R Development Core Team (2008). R: A language and environment for statistical computing.

R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0, URL

http://www.R-project.org.

93. Radojević LJ., Sokić O., Tucić B. (1985). Somatic embryogenesis in tissue culture of iris

(Iris pumila L.). In: Proc. Symp. In vitro problems related to mass propagation of

horticultural plants, Gembloux, p. 25

94. Radojević LJ., Sokić O., Tucić B. (1987). Somatic embryogenesis in tissue culture of iris

(Iris pumila L.). Acta Hort 212: 719-723.

95. Radojević LJ., Subotić A. (1992). Plant regeneration of Iris setosa Pall. through somatic

embryogenesis and organogenesis. J Plant Physiol 139: 690-692.

96. Raimondi J. P., Masuelli R. W., Camadro E. L. (2001). Assessment of somaclonal variation

in asparagus by RAPD fingerprinting and cytogenetic analyses. Sci Hortic 90: 19-29.

97. Rakoczy R. (2002). The effects of growth regulator on somaclonal variation in rye (Secale

cereale L.) and selection of somaclonal variants with increased agronomic traits. Cell Mol

Biol Lett 7: 1111–1120.

98. Randolph L. F. (1945). Embryo culture of Iris seed. Bull Am Iris Soc 98: 33-45.

99. Reuther G. (1977). Embryoide differenzierungsmuster im kallus der gattungen Iris und

Asparagus. Ber Deutsch Bot Ges 90: 417-437.

100. Rodriguez-Enriquez J., Dickinson H. G., Grant-Downton R. T. (2011). MicroRNA

misregulation: an overlooked factor generating somaclonal variation? Trends Plant Sci 16:

242-248.

101. Rohlf F.J. (2008). NTSYSpc: Numerical Taxonomy System, ver. 2.20. Exeter Publishing,

Ltd.: Setauket, NY.

102. Safner T. (2005). Upotreba dominantnih biljega u analizi bioraznolikosti,magistarski rad

103. Sahijram L., Soneji J., Bollamma K. (2003). Analyzing somaclonal variation in

micropropagated bananas (Musa spp.). In Vitro Cell Dev Biol - Plant 39: 551-556.

104. Saker M. M., Adawy S. S., Mohamed A. A., El-Itriby H. A. (2006). Monitoring of cultivar

identity in tissue culture-derived date palms using RAPD and AFLP analysis. Biol Plantarum

50: 198-204.

105. SAS Institute (2004). SAS/STAT software: User’s Guide. Version 8.02. SAS Inst., Cary, NC.

106. Shannon C. E. (1948). A mathematical theory of communication. Bell Systems Tech J27:

379–423, 623–656.

http://www.r-project.org./

106

107. Sharma S. K., Bryan G. J., Winfield M. O., Millam S. (2007). Stability of potato (Solanum

tuberosum L.) plants regenerated via somatic embryos, axillary bud proliferated shoots,

microtubers and true potato seeds: a comparative phenotypic, cytogenetic and molecular

assessment. Planta 226: 1449-58.

108. Shibata K. (1998). A encyclopedia of usful plants and plants products. Hokuryukan, Tokyo,

pp 514-519.

109. Shibli R. A. (2000). Cryopreservation of black iris (Iris nigricans) somatic embryos by

encapsulation-dehydration. CryoLetters 21: 39-46.

110. Shibli R. A., Ajlouni M. M. (2000). Somatic embryogenesis in the endemic black iris. Plant

Cell Tiss Org 61: 15-21.

111. Shimizu K., Miyabe Y., Nagaike H., Yabuya T., Adachi T. (1999). Production of somatic

hybrid plants between Iris ensata Thunb. and I. germanica. Euphytica 107: 105-113.

112. Simonet M. (1932). Recherches Cytologicques et genetiques ches les Iris. Bull Biol Fr Belg

66: 255-444.

113. Skirvin R.M., McPheeters K.D., Norton M. (1994). Sources and frequency of somaclonal

variation. Hort Sci 29: 1232-1237.

114. Šatović Z. (1999). Genetski biljezi i njihova uporaba u biljnoj genetici, oplemenjivanju i

sjemenarstvu. Sjemenarstvo 16: 1-18.

115. Šustar-Vozlič J., Javornik B., Bohanec B. (1999). Studies of somaclonal variation in hop

(Humulus lupulus L.). Phyton aust 39: 283-287.

116. Vasil I. K. (1987). Developing cell and tissue culture system for the improvment of cereal

and grass crops. J Plant Physiol 128: 193-213.

117. Venkatachalam L., Sreedhar Reddampalli V., Bhagyalakshmi N. (2007). Molecular analysis

of genetic stability in long-term micropropagated shoots of banana using RAPD and ISSR

markers. Electronic Journal of Biotechnology 10 (1). Available from Internet:

http://www.ejbiotechnology.info/content/vol10/issue1/full/12/index.html.

118. Vos P., Hogers R., Bleeker M., Reijans M., van de Lee T., Hornes M., Frijters A., Pot J.,

Peleman J., Kuiper M. (1995). AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic

Acids Res 23: 4407 – 4414.

119. Wang W. C., Nguyen H. T. (1990). A novel approach for efficient plant regeneration from

long-term suspension culture of wheat. Plant Cell Rep 8: 639-642.

120. Wenzel G., Uhrig H. (1981). Breeding for nematode and virus resistance in potato via anther

culture. Theor Appl Gen 59: 333-340.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sharma%20SK%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bryan%20GJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Winfield%20MO%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Millam%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17668235



http://spogli.cib.unibo.it/cgi-ser/start/it/spogli/df-s.tcl?prog_art=6894678&language=ITALIANO&view=articoli

http://spogli.cib.unibo.it/cgi-ser/start/it/spogli/df-s.tcl?prog_art=6894678&language=ITALIANO&view=articoli

http://www.ejbiotechnology.info/content/vol10/issue1/full/12/index.html

107

121. Williams J. G. K., Kubelik A. R., Livak K. J., Rafalski J. A., Tingey S. V. (1990). DNA

polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids

Res 18: 6531-3535.

122. Yang X., An L., Xiong Y., Zhang J., Li Y., Xu S. (2008). Somatic embryogenesis from

immature zygotic embryos and monitoring the genetic fidelity of regenerated plants in

grapevine. Biol Plantarum 52: 209-214.

123. Yu-Jin Haoa, Xiao-Peng Wen, Xiu-Xin Deng (2004). Genetic and epigenetic evaluations of

citrus calluses recovered from slow-growth culture, J Plant Physiol 161: 479-484.

124. Zhong H., Wang W. L., Sticklen M. (1998). In vitro morphogenesis of Sorghum bicolor (L.)

Moench: Efficient plant regeneration from shoot apices. J Plant Physiol 153: 719-726.

125. Zhuravlev Y. N., Kozyrenko M. M., Artiukova E. V., et al. (1998). DNA-Typing of the Far

Eastern Species of Iris L. Genus by RAPD-PCR Technique. Genetika 34: 368–372.

108

9. ŽIVOTOPIS

Rođena sam 30. svibnja 1983. u Zagrebu. 3. opću gimnaziju sam završila 2001. godine u

Zagrebu. Diplomirala sam na Agronomskom fakultetu Sveučilišta u Zagrebu na smjeru

Voćarstvo, vinogradarstvo i vinarstvo 2007. godine.

Tijekom studija sudjelovala sam dva puta u programu razmjene studenata. U travnju 2006. u

sklopu programa CEEPUS u Češkoj, te sam iste godine u lipnji i srpnju stručnu praksu odradila u

„Hellenic Sugar Industry S.A., 590 32 Platy“, u Grčkoj, u organizaciji Hrvatske udruga za

međunarodnu razmjenu studenata prirodnih i tehničkih znanost (IAESTE).

Od veljače 2008. do danas zaposlena sam na Agronomskom fakultetu Sveučilišta u Zagrebu u

zvanju znanstveni novak-asistent. Poslijediplomski doktorski studij „Poljoprivredne znanosti“

upisala sam također 2008. godine. Surađujem na nacionalnom znanstvenom projektu „Razvoj

metoda mikrorazmnožavanja i uvođenje u hortikulturu endemičnih perunika“ pod vodstvom prof.

dr. sc. Snježane Kereša te na projektu „Tajna starih sorata jabuke“ pod vodstvom dr. sc. Kristine

Batelja Lodeta. U nastavi sudjelujem u izvođenju vježbi iz modula Genetika i Biljna

biotehnologija. Sudjelovala sam na nekoliko domaćih i međunarodnih znanstvenih skupova

genetičara i agronoma. Kao autor ili koautor imam objavljenih 6 radova, od čega četiri u

kategoriji A1 i dva u kategoriji A2.

Razvoj metoda mikrorazmnožavanja i procjena genetičke...

Documents

Transcript of Razvoj metoda mikrorazmnožavanja i procjena genetičke...