Possíveis alternativas para vacinas contra Moraxella spp.

Adil K. Vaz PhDFormer Research Professor,

University at Buffalo,School of Medicine,

Department of Microbiology and Immunology

adilvaz@gmail.com

Queratoconjuntivite infecciosa bovina

• A doença ocular de bovinos mais comum no mundo

• Fotofobia, lacrimejamento, úlcera de córnea, cegueira (temporária ou permanente)

• Perdas econômicas (U$ 150m/ano nos USA) pelo custo do manejo, tratamento e perda de produção.

• Fator predisponente a carcinoma ocular

• Uma das oito doenças priorizadas pelo PROCISUR para estudo no MERCOSUL

Queratoconjuntivite bovina

• Agentes mais comuns:

• Moraxella bovis

• Moraxella bovoculi

• Outros agentes:

• Thelazia spp.

• Branhamella ovis

• Mycoplasma sp.

• IBR

Quadro clínico

Lacrimejamento

Opacidade

Úlcera

Moraxella spp.

Bastonetes Gram negativos curtos ou cocobacilos, em forma de chama de vela, opostos pelas extremidades. Aeróbios e com estreita margem de hemólise. Isolados recentes podem causar uma depressão no ágar sob a

colônia. Exigentes quanto ao crescimento (ágar sangue, BHI, Todd-Hewitt...)

Epidemiologia

• Mais comum em animais jovens (desmame)

• Zebuínos menos afetados

• Transmissão:

• Moscas

• Contato direto

• Pastos altos

• Portadores

Estrutura antigênica

• Pili

• Toxina citotóxica

• Hemolisina

• Proteínas dependentes de ferro -78 e 104 KDa

Tratamento e Prevenção

• Antibióticos (em spray ou intrapalpebrais)

• Controle de moscas

• Pastagens baixas e controle de invasoras

• Vacinação com vacinas à base de pili

Eficácia das vacinas

Source: Coopers

Animal Health

Por que a baixa eficácia ?• Propostas várias classificações sorológicas há

mais de vinte anos (Gil Turnes & Araújo 1982)

• Os mesmos autores reconhecem que os sorotipos mudaram neste período

• Variabilidade antigênica dos pili faz com que as vacinas só sejam eficazes quando o sorotipo de campo está contido na vacina

• Isto levou à produção de vacinas autógenas (ou quase !)

• Dificuldade de cultivo de amostras ricas em pili

• Via de aplicação não favorece a imunidade de mucosas

Abordagens para melhorar as vacinas

•Buscar novos antígenos

•Estudar novas formas de administração

Novos antígenos

•Proteínas dependentes do ferro:

•Muitas bactérias expressam proteínas na membrana celular quando crescem na ausência do ferro. A quantidade de ferro disponível in vivo é muito baixa no organismo.

Proteínas dependentes do

ferro

Formação de biofilme

Pili tipo IV

• Filamentos curtos (1 a 4 µm) e finos (50-80 Å), mas flexíveis e resistentes

• Polímeros da proteína pilina, disposta de forma helicoidal

• Bons antígenos, existem em todas as bactérias Gram - e muitas Gram +

Sua presença confere:

•Adesão a superfícies

•Formação de micro-colônias

•Produção de biofilme

•Motilidade espasmódica

•Corrosão do ágar

•Capacidade aumentada de variação genética

Estrutura

PilQ

•Secretina responsável pela extrusão e recolhimento dos pili

•Necessária para a adesão

•Conservada

•Dependente do ferro ?

PilQ está exposta ma membrana celular

Estrutura da PilQ

PilQ serve no transporte de DNA

Trabalho em andamento

• Moraxella catarrhalis é um patógeno humano, muito mais estudado

• Seu genoma é conhecido e a sequência que codifica PilQ foi identificada

• M. bovis não foi integralmente genotipada

• Nos fragmentos (contigs) do genoma de M. bovis já conhecidos encontramos uma sequência de DNA semelhante à que codifica para PilQ em M. catarrhalis

Sequência:

PCR (Polymerase Chain

Reaction)

Sequenciamento e reinserção

•A sequência multiplicada o PCR foi sequenciada para verificar se estava correta

•Como estava correta, foi reinserida em um plasmídio juntamente com HIS-tag, e o plasmídio conjugado com Escherichia coli

•Esta E. coli passou a produzir PilQ e a proteína está sendo isolada e concentrada

Vias de aplicação• A via parenteral estimula a produção de

anticorpos do tipo IgG/IgM

• Anticorpos do tipo IgG podem ser suficientes para conferir imunidade

• A mucosa ocular é rica em IgA, cuja principal forma de atuação é bloquenado a adesão de antígenos às células

• Seria desejável que fosse utilizada uma via de aplicação que estimulasse a produção de IgA, mas aplicação de antígenos puros é ineficaz na maiori a dos casos

Adjuvantes para mucosas

•Adjuvantes podem auxiliar na resposta imune nas mucosas

•Os mais estudados são toxinas termosensíveis do cólera e de Escherichia coli (HLTs)

As cadeias Asão responsáveis pela toxicidade.

As cadeias B pelo efeito adjuvante

Adjuvantes de mucosas

•A cadeia B perde sua toxicidade se separada da cadeia A, mas mantém a adjuvanticidade

•Quando co-administrada com um antígeno, atua como adjuvante

•LT-IIb parece ser a que melhor estimula a produção de IgA, quando aplicada por via intranasal

•Vacinas intranasais já são utilizadas em bovinos e são práticas

Resumindo:

• Talvez possamos olhar para outros antígenos:

• PilQ, uma secretina que atua na exposição e retração dos pili e está presente na membrana bacteriana

• Proteínas dependentes do ferro provavelmente são expressas in vivo e podem ser bons antígenos

• Todas as vacinas disponíveis são aplicadas por via parenteral. E a via intranasal, ou ocular ?

• Adjuvantes podem auxiliar na resposta imune. LT-IIa e LT-IIb podem ser úteis.

Equipe•Prof. Anthony Campagnari, estrutura

antigênica de Moraxella sp.

•Prof. Terry D. Connell, toxinas como adjuvantes

•Dra. Natalie King-Lyons, biotecnologia

•Prof. Adil K. Vaz, responsável pelo projeto e experimentos com animais

Obrigado !

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